JP5536650B2 - 自己干渉蛍光顕微鏡検査のためのシステムと方法、及び、それに関連するコンピュータがアクセス可能な媒体 - Google Patents

Description

本発明は、光学イメージングのためのシステムと方法、及び、それに関連するコンピュータがアクセス可能な媒体に関する。具体的には、試料から放射される光ビームを用いて、放射された光を、空間位相遅延光学部を通過させて、ビームに自己干渉を起こさせ、自己干渉によって高分解能の顕微鏡イメージングを行うことができる。

＜関連出願の相互参照＞
本発明は、参照により全ての開示内容が本明細書の一部として援用される、２００７年８月３１日に出願の米国仮出願第６０／９６９，３９６号に関連する。

複数の光学的方法が、回折限界を超えた顕微鏡分解能を実現している。どれもが蛍光標識化を必要とする、これらの方法は、ＳＮＯＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（走査型近接場光顕微鏡））（Ｈｏｒｓｈ ｅｔ ａｌ．「Ａ ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」、Ｐｈｏｔｏｎｓ ａｎｄ Ｌｏｃａｌ Ｐｒｏｂｅｓ，ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ Ｅ：３００：１３９（１９９５）を参照）、ＳＴＥＤ（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（誘導放出制御））（Ｓ．Ｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｂｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ − ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ．１９：４９５（１９９５）を参照）、及びＧＳＤ（Ｇｒｏｕｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（空乏化））（Ｓ．Ｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｇｒｏｕｎｄ−Ｓｔａｔｅ− Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ − ａ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ」，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｂ．６０：７８０（１９９４）を参照）、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（蛍光顕微鏡），ｐｈｏｔｏ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＰＡＬＭ（光活性化局在性顕微鏡法））（Ｅ．Ｂｅｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．「Ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｎａｎｏｍｅｔｅｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：１６４２（２００６）を参照）、ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＳＴＯＲＭ（推計光学再構成顕微鏡法））（Ｍ．Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．「Ｓｕｂ−ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＳＴＯＲＭ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：７８３（２００６）を参照）、ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＳＩＭ（構造化照明））（Ｂ．Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｘｉａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｂｙ Ｓｔａｎｄｉｎｇ− Ｗａｖｅ Ｅｘｉｔａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４４（１９９３）、Ｍ．Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ 「Ｓｕｒｐａｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｂｙ ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｔｗｏ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ １９８：８２（２０００）、及びＭ．Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ「Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ： Ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ ｕｎｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」ＰＮＡＳ １０２：１３０８１（２００５）を参照）を含む。さらに、線形蛍光顕微鏡法及び二光子顕微鏡法（Ｗ．Ｄｅｎｋ ｅｔ ａｌ．「２−Ｐｈｏｔｏｎ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７３（１９９０）を参照）において、点広がり関数（Ｒ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．「Ｐｒｅｃｉｓｅ ｎａｎｏｍｅｔｅｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ」，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ８２：２７７５（２００２）を参照）を適合させることによって、回折限界を超えて、位置精度を向上することも可能である。

光コヒーレンストモグラフィー、スペクトル領域ＯＣＴ、及び、光周波数領域イメージングは、基準の光ビームと、試料から反射されて戻り、検出されたビームとの間の干渉を計測する特定のイメージング技術を含む。従来の時間領域ＯＣＴのシステムの詳細については、Ｄ．Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．による「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１１７８（１９９１）に記載されている。スペクトル領域ＯＣＴ及び光周波数領域干渉分光システムの典型的な詳細については、米国特許出願第１０／５０１，２７６号及び第１０／５７７，５６２号にそれぞれ記載されている。

回折限界を超えた分解能を得ることができる他の代表的な技術として、いわゆる自己干渉蛍光顕微鏡法（ＳＩＦＭ）をあげることができる。この代表的な技術は、Ｋ．Ｄｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．「Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｆｒｏｎｔ ｏｆ ａ ｍｉｒｒｏｒ」，Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７３：９１（１９８９）及び、Ｓｗａｎ ｅｔ ａｌ．「Ｔｏｗａｒｄ ｎａｎｏｍｅｔｅｒ−ｓｃａｌｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｓｅｌｆ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」，ＩＥＥＥ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ９：２９４（２００３）に記載のものに関連する。反射表面の前方に局在する蛍光色素分子の位置を、放射された蛍光光と表面からの反射との自己干渉を分析することによって、ナノメートルの分解能で決定することができることが実演されている。代表的な技術は、ＯＣＰＭ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｐｈａｓｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）に関連し、他の技術は、ＯＣＴから導かれる（Ｃ．Ｊｏｏ， ｅｔ ａｌ．「Ｓｐｅｃｔｒａｌ−ｄｏｍａｉｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｐｈａｓｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｉｍａｇｉｎｇ」，Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０：２１３１（２００５）； ａｎｄ ｓｅｅ Ｃ．Ｊｏｏ， ｅｔ ａｌ．「Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３２：６２３（２００７）を参照）。ここでは、試料と基準アームとの間の干渉の位相を用いて、（サブ）ナノメートルの長さのスケールの動きを決定している。

ＯＣＰＭでは、外部光源を用いて、この光を細胞の内部で、又は組織の構造体によって散乱させる。ＯＣＰＭは、２５ピコメートルに相当する位相感度を実演した。ＳＩＦＭでは、光源は、励起光源によって励起された、蛍光色素分子自体である。異なる方向から放射された蛍光光を捕獲し、空間位相遅延光学的部を透過させた後に、それ自身と干渉させる。干渉は、分光計でスペクトル分解することによって、位相遅延部を透過した光が通過した経路長の差違に相当する周期性で干渉パターンを生成することができる。スペクトル分解された干渉をフーリエ変換することによって、蛍光帯域幅によって決定される点広がり関数を用いたＳＤ−ＯＣＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）におけるもののようなプロフィールを生成してもよい。変換式の位相の項を用いることによって、蛍光色素分子を、回折限界より大幅に優れた分解能で位置を特定（ｌｏｃａｌｉｚｅ：局在化）することができる。この代表的な手法は、一般的に、放射された光をエピ方向（ｅｐｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）に高い開口数をもって受光し、ビームを、三次元三角測量のために、各々が異なる遅延を有する４つの部分に分割する、単一の顕微鏡レンズと特別に設計された波長板とを用いて行うことができる。

上述の従来の構成部及び方法に関連する特定の課題を解決する必要が存在する。

かかる課題に対処、及び／又は、解決するため、本発明の代表的な実施の形態を提供することができる。

一般的に、本発明に係る代表的な実施の形態のシステム及び方法は、レンズによって蛍光色素分子の放射を集光し、光を平行化してビームとし、ビームの波面にわたって、複数の、区別可能な波長依存の位相遅延を与える位相素子を透過させることによって、高分解能イメージングを容易とすることができる。このビームは、続いて、プリズム、回折格子、又はその他の分散素子によって波長分散され、分光計に合焦される。例えば、ビームの個々の波長成分が分光計のある点に合焦されると、それらの波面の位相遅延された成分がお互いに干渉し合い、波長依存の、蛍光自己インターフェログラムを生成しやすくなる。この自己インターフェログラムを、フーリエ変化によって分析して、サブ回折の分解能情報を抽出することができる。サブ回折の限界情報は相対位相に含まれており、干渉の複素フーリエ成分から決定してもよい。

本発明の一代表的な実施の形態によると、完全三次元局在性は，無限遠に平行な対物レンズを用いて実現することができる。かかる光学系では、焦点軸中心に局在する蛍光色素分子が、対物レンズ背面開口に平行ビームを生じさせることができる。蛍光色素分子が軸中心の上方又は下方に局在する場合、出力ビームは、それぞれに対応して僅かに収束又は分散することができる。本発明の代表的な実施の形態に基づくと、位相板は、分散の変化によって生じる経路長の変化を、軸方向の蛍光色素分子の局在性に変換するための、追加の位相遅延領域を備えることができる。

このように、それを用いて、試料の少なくとも一つの部分に関連する情報を提供することができる代表的な装置、及び／又は、方法を提供することができる。例えば、試料の少なくとも一つの部分から受けた少なくとも一つの電磁放射を、複数の第１の放射に、複数の第１の放射の一つが有する位相遅延が、複数の第１の放射の他が有する位相遅延と異なるように、分離することができる。さらに、複数の第１の放射の少なくとも一つを受けて、受けた複数の第１の放射の少なくとも一つの波長に従って、複数の第２の放射に分離することができる。さらに、複数の第２の放射を検出し、試料の少なくとも一つの部分の位置に関する情報を、複数の第１の放射の少なくとも一つの干渉の少なくとも一つの特徴の関数として生成することができる。

本発明の他の代表的な実施の形態によると、複数の第１の放射は、自己干渉することができる。さらに、複数の第２の放射を検出し、試料の少なくとも一つの部分の位置に関する情報を、複数の第１の放射の自己干渉の少なくとも一つの特徴の関数として生成することができる。位置の情報は、少なくとも一つの部分の横方向の位置、及び／又は、深さの少なくとも一つを含むことができる。少なくとも一つの特徴は、自己干渉の位相、及び／又は、自己干渉の強度の少なくとも一つを含むことができ、情報は、複数の第１の放射の自己干渉のスペクトル変調に基づいて生成してもよい。

本発明のさらなる代表的な実施の形態によると、少なくとも二つの光学的要素であって、
少なくとも二つの光学的要素は、少なくとも二つの光学的要素の他方の第２の経路長の差違とは異なる、少なくとも二つの光学的要素の一方の第１の経路長の差違に影響を与える光学的厚さを有する、少なくとも二つの光学的要素を用いることができる。少なくとも二つの光学的要素のいずれかの間の光学的経路長の差違は、複数の第１の放射の自己干渉のスペクトルの変調の概略の整数を生成することができる。整数は、光学的要素の間の経路長の差違の任意の組み合わせとは異なることができる。少なくとも一つの電磁放射を生成するための励起放射を提供することもできる。励起放射を受けて、励起放射に基づいて試料の少なくとも一つの部分の異なる位置に関連する放射を提供することができる。

本発明のさらなる代表的な実施の形態によると、空間フィルタは、ピンホール、ピンホールアレイ、光ファイバ、及び／又は、ファイバアレイを含むことができる。光ファイバは、単一モードのファイバであってもよく、ファイバアレイは、単一モードの複数のファイバを含むことができる。試料の少なくとも一つの部分の異なる位置と関連する放射を提供することもできる。かかる放射は、走査ミラーを用いて提供することができる。少なくとも一つの電磁放射は、試料の複数の部分から提供される複数の放射を含むことができる。さらに、試料の複数の部分に関連する複数の第２の放射の複数のスペクトルを検出することができる。さらに、複数の第１の放射は干渉をすることができる。

他の代表的な実施の形態によると、複数の第１の放射に関連するデータを取得して、データに基づいて試料の少なくとも一つの部分の位置に関する情報を生成する、システム、方法、及びコンピュータがアクセス可能な媒体を提供することができる。かかる情報は、試料の少なくとも一つの部分に関連する複数の第２の放射を、複数の第２の放射の少なくとも一つの波長に従って、分離することによって、データに基づいて生成することができる。例えば、複数の第２の放射の一つは、複数の第２の放射の他の一つの位相遅延とは異なる位相遅延を有することができ、複数の第２の放射は干渉してもよい。

さらに代表的な実施の形態によると、複数の第２の放射は自己干渉することができる。情報は、データのフーリエ変換を実行することによって生成することができる。フーリエ変換は、複数の第２の放射の少なくとも一つの干渉の位相又は振幅の少なくとも一つを生成するために実行してもよい。例えば、情報は、複数の第２の放射の少なくとも一つの干渉の位相、及び／又は、振幅に基づいて生成してもよい。さらに、情報は、少なくとも一つの部分の位置情報を含むことができる。

本発明のこれらの目的及び他の目的、特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲と併せて、以下の本発明の実施の形態の詳細な説明を読むに従って明らかになる。

本発明のさらなる他の目的、特徴及び利点は、本発明の例示的な実施の形態を示した添付の図面を参照して、以下の本発明の実施の形態の詳細な説明から明らかになる。

分光計の構成を有する、本発明の第１の代表的な実施の形態のシステムの図である。 本発明の代表的な実施の形態の二次元イメージングのための位相板（３０）の図である。 （ａ）〜（ｄ）は、図２に示す代表的な実施の形態の位相板からの干渉プロフィールの一例の図であり、領域間の干渉から生じるインターフェログラムパターンを示す。 （ａ）は、図１に示す代表的な実施の形態の代表的な適用と図２に示す代表的な実施の形態の位相板による、図３（ａ）〜３（ｄ）に図示したインターフェログラムのフーリエ変換から得られる、代表的な実施の形態のパワースペクトルのプロフィールの図であり、（ｂ）は、図１に示す代表的な実施の形態の代表的な適用と図２に示す代表的な実施の形態の位相板による、図３（ａ）〜３（ｄ）に図示したインターフェログラムのフーリエ変換から得られる、代表的な実施の形態の位相のプロフィールの図である。 （ａ）は、第４の位相板要素を用いて、４部の位相板によって焦点外の光を識別する、本発明の代表的な実施の形態のシステムの図であり、（ｂ）は、第４の位相板を用いて焦点外の光を識別して、三次元イメージングを実行する、第４の位相板要素を用いた、本発明の代表的な実施の形態のシステムの図である。 （ａ）は、図５に示す代表的な実施の形態からの代表的なインターフェログラムのグラフであり、（ｂ）は、図６（ａ）に示すインターフェログラムのフーリエ変換から得られる、代表的なパワースペクトルのグラフであり、（ｃ）は、図６（ａ）に示すインターフェログラムのフーリエ変換から得られる、代表的な位相プロフィールのグラフである。 本発明の第３の代表的な実施の形態のシステムの図である。 本発明の第４の代表的な実施の形態のシステムの図である。 本発明の第５の代表的な実施の形態のシステムの図である。 本発明の第６の代表的な実施の形態のシステムの図である。 本発明の第７の代表的な実施の形態のシステムの図である。 本発明の第８の代表的な実施の形態のシステムの図である。 相対的光学的厚さを有する代表的な実施の形態の第４要素位相板を示す図である。 図１３に示す代表的な実施の形態の位相板を用いた、代表的な自己干渉スペクトルのシミュレーションを示す図である。 図１４に示すスペクトルの代表的なパワースペクトル（例えば、複素フーリエ変換）のグラフである。 図１５に示すパワースペクトルのピークで決定された代表的な位相のグラフである。

図面全般において、特に断りのない限りにおいて、同一の参照番号及び記号は、図示の実施の形態の同様の特徴、要素、成分又は部分を示す。本発明を、以下、図面を参照して例示的な実施の形態とともにより詳細に説明する。本書に記載の実施の形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない限りにおいて、変更及び修正を行うことが可能である。

本発明の代表的な実施の形態は、試料から放射された光を用いて、サブ回折限界の情報にアクセスすることができる、イメージングシステム、方法を提供することができる。さらに、本発明の代表的な実施の形態のシステムは、かかるデバイスで取得された信号の異なる走査及び検出方式、及び、かかるデータを処理する代表的な方法を提供する。

図１に示す本発明の第１の代表的な実施の形態は、試料（１０）から放射された光を、位相素子ＰＥ（３０）と分散素子ＤＥ（４０）を介して、光学的に処理し、高分解能イメージングを実現する。具体的には、光源（１０）からの蛍光放射は対物レンズ（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）（２０）によって集光され、位相素子（３０）を透過した後、分散素子（４０）によって波長分散され、レンズ（５０）によって、オプションの空間マスク（６０）を透過した後、分光計（７０）に合焦される。

位相素子の代表的な配置が、自己インターフェログラムの性質、及び、その分析から抽出可能な情報を決定する。例えば、検出器配列（７０）の前の空間マスク（６０）は、位相感度を向上させることができる。二次元で局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ：位置を特定）するためには、図２の例に示すように、例えば、３つの要素を有する位相板（例えば、位相素子ＰＥ（３０））が好ましい。図２に示すように、位相板の領域の各々は固有の厚さを有し、位相ランプ（ｐｈａｓｅ ｒａｍｐ）を波長の関数として促進することができる。インターフェログラムは、異なる領域を透過した光から実現することができる。

ビームがこの位相板を透過する際、例えば、波面の各部分は異なる板領域を透過する。これらの位相板の領域により、生成される経路長の差異が、図３（ａ）〜（ｄ）に示すように、干渉によるスペクトルの変調を生成する。具体的には、図３（ａ）は、領域１と領域２との間の、図３（ｂ）は、領域２と領域３との間の、図３（ｃ）は、領域１と領域３との間の干渉によって生じたインターフェログラムパターンを示す。図（ｄ）は、分光計に集光された、図３（ａ）〜３（ｃ）の代表的な合計インターフェログラムを表す。例えば、放射スペクトラムは、図３（ａ）〜３（ｃ）に示すようにガウス分布とすることができる。これらの代表的な図では、領域１は遅延がなく、領域２はＬの厚さを有するため、波長範囲にわたって、単一の２πの位相ランプを生じ、領域３は３Ｌの厚さを有するため、波長範囲にわたって、６πの位相ランプを生じる。

図３（ａ）〜３（ｄ）の一以上に示すインターフェログラムから重要な位相情報を得るため、代表的な実施の形態によると、領域の各々の厚さを、好ましくは、直交する干渉パターンを生成するように設定することができる。干渉変調の周期は、蛍光色素分子の放射スペクトラムにわたり、整数分だけ異なることができる。直交性が好ましく、例えば、多変量解析によるなどして、異なる位相板領域からの寄与が相互に異なるようにしてもよい。インターフェログラムの複素フーリエ変換は、図４に示すように、強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）情報と相対位相情報の両方を含むことができる。

例えば、図４は、それぞれ、図１に示す代表的な実施の形態、及び、図２に示す代表的な実施の形態の位相板（３０）の代表的な適用に従って、図３（ａ）〜３（ｄ）に示すインターフェログラムのフーリエ変換から得られた、代表的な実施の形態のパワースペクトルのプロフィール及び位相のプロフィールのグラフを示す。３つの干渉ピークの相対位相と対物レンズの開口数及び倍率（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を知ることによって、空間的局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）情報を得ることができる。図５に示す４要素板を使用することによって、局在化の３次元を得ることができる。

具体的には、図５は、４部の位相板（３０）を用いて焦点外の光を識別して（図５（ａ）参照）、の三次元イメージングを実行する（図５（ｂ）参照）、例えば、第４の位相板要素を用いた、代表的な実施の形態のシステムを示す図である。対物レンズ（２０）の正確な軸焦点中心に局在する代表的な蛍光色素分子（１０）は、例えば、完全に平行な出力を生成することができる。蛍光色素分子が、焦点の上方又は下方に局在する場合、出力分散は変化する可能性がある。例えば、位相板に第４の領域を、図５（ｂ）に示す軸の位置に設けることができる。

位相板要素の間の追加的な干渉を、図６（ａ）〜（ｃ）に示す、軸方向高分解能イメージングの相対位相情報を生成することができる。具体的には、図６（ａ）は、図５（ａ）及び（ｂ）に示す代表的な実施の形態からの代表的なインターフェログラムのグラフである。図６（ｂ）は、図６（ａ）に示すインターフェログラムのフーリエ変換から得られた代表的なパワースペクトルプロフィールのグラフである。図６（ｃ）は、図６（ａ）に示すインターフェログラムのフーリエ変換から得られた代表的な位相プロフィールのグラフである。

図７に示す本発明の他の実施の形態のシステムでは、光が透過回折格子ＴＧ（４０）を透過して、イメージングレンズ（５０）によって検出器（７０）に合焦される前に、リレーレンズ群（３１／３９）とピンホールＰＨ（６０）を用いて光に空間フィルタリングを行う。具体的には、図７の代表的なシステムは、空間フィルタリングを行うためのピンホール又は（単一モード）光ファイバ（６０）と、リレーレンズシステム（３１、３９）と、光スペクトルを分散させる透過回折格子ＴＧ（４０）と、合焦レンズ（５０）と、電荷結合素子又は光電子増倍管アレイなどの分光計アレイ（７０）と、を含む。さらに、システムは、ダイクロイックミラーと位相板ＰＰ（３０）を含む。

図８は、本発明の他の実施の形態のシステムを示す図である。この代表的なシステムは、図７に示す代表的なシステムと類似しているが、位相板（３０）の前に、さらなるピンホール２７と、空間フィルタリングを行うためのリレーレンズシステム（２６、２９）とを追加している。図８では、ダイクロイックミラーＤＭ（２５）と、ピンホールＰＨ又は（単一モード）光ファイバ（２７、６０）と、位相板（３０）と、透過解析格子ＴＧ（４０）と、合焦レンズ（５０）と、分光計アレイ（７０）とが示されている。具体的には、図８に示すように、２つのリレーレンズ群（２６、２９）及び（３１、３９）を用いて、位相板（３０）と透過回折格子（４０）とを対物レンズ（２０）背面開口の共役面に配置することができる。

この代表的な構成は、焦点面の蛍光色素分子（１０）の任意の動きを容易にし、例えば、位相板（３０）と透過回折格子（４０）における、ビーム変位の代わりに、ビーム角度のみを変更可能とすることができる。二光子又は紫外線ランプ励起のために蛍光ポンプ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｕｍｐｉｎｇ）を用いることもできるが、この代表的な実施の形態では、蛍光色素分子を二光子励起させるためにパルスＩＲ（ｐｕｌｓｅｄ ＩＲ）光源を用いてもよい。例えば、ダイクロイックミラー（２５）を用いて、励起ビームから落射蛍光を分離することができる。ピンホール（２７）は、対物レンズの焦点面と共役な第１の面において、面外（ｏｕｔ−ｏｆ− ｐｌａｎｅ）蛍光と散乱光の共焦点拒絶（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）のために用いてもよい。分光計（７０）は、電荷結合素子アレイ、及び／又は、マルチアノード光電子倍増管でもよい。

図９に、本発明の他の代表的な実施の形態のシステムを示す。具体的には、図９の代表的なシステムは、ピンホール又は（単一モード）光ファイバ（２７）を含み、組み合わせられた位相板と透過回折格子要素（３０／４０）と、オプションの空間マスク（６０）を用いることができる。例えば、検出アレイ（７０）の前方にオプションの空間マスク（６０）を設けると、位相感度を向上することができる。

図１０に、本発明の他の代表的な実施の形態のシステムを示す。例えば、図１０の代表的なシステムは、試料にわたって励起ビームをラスタ走査して、蛍光放射を逆走査（ｄｅｓｃａｎ）するための走査ミラー群ＳＭ（２３）を含むことができる。図１０に示す要素２１、２２、２６、２９は、リレーレンズであってもよい。具体的には、励起レーザビームは、例えば、検流ミラーなどの走査ミラー（２３）を用いて、角度走査することができる。走査及び筒レンズ（２１、２２）は、ビームを対物レンズに導くことができ、角度走査は、焦点面にわたる位置走査に変換することができる。焦点で生成された光は、照明経路に沿って戻ることができ、走査ミラー（２３）を通過することによって、固定ビームに逆走査されてもよい。ダイクロイックミラー（２５）を用いて蛍光ビームを励起ビームから分離してもよい。ピンホール（２７）を、散乱光又はその他の焦点外の光から焦点から蛍光を分離するため、又は、共焦点検出のために用いることができる。代表的なシステムは、位相板（３０）及び透過回折格子（４０）を用いて、自己インターフェログラム（ｓｅｌｆ−ｉｎｅｒｆｅｒｏｇｒａｍ）を生成することができる。

図１１に、本発明のさらなる代表的な実施の形態を示す。例えば、図１１の代表的なシステムは、マルチレンズアレイ（８１）と、試料にわたって、焦点線を走査する走査ミラーシステム（２３）と、を含むことができる。この代表的なシステムは、空間フィルタとしてピンホールアレイ（９０）と、検出のための二次元ＣＣＤカメラ（７０）と、を有してもよい。具体的には、試料にわたって複数の励起焦点を走査して、イメージングレートを高めることができる。例えば、単一の点を走査する代わりに、点を結んだ線を一度に走査することによって、データ取得の速度を向上することができる。マルチレンズアレイ（８１）によって生成されたビームレットの各々は、異なる試料の位置にわたって走査することができ、走査ミラー（２３）を介して戻ることができる放射光のビームレットを生成する。

位相板（３０）と分散素子（４０）は、対物レンズ（２０）の背面開口（２４）と共役な面に配置することができ、例えば、全てのビームレットについて、共通の位相板と分散素子の組を使用することを容易にしている。位相板と分散素子の間では、ピンホールアレイ（又は、空間マスク）（９０）が光の空間フィルタリングを行うことができる。ビームレットの各々は、この共役面で区別可能な角度を有し、透過回折格子の後部に配置されたレンズは、垂直軸に沿って離間したビームレットごとに個々のインターフェログラムを生成することができる。ＣＣＤチップ（１００）などの二次元アレイを用いて、かかるインターフェログラムを集光して、高速な走査速度で複数ポイントＳＩＦＭを容易にすることができる。

以下、自己干渉測定の例示的な数値シミュレーションについて説明する。ここで引用する光学的構成要素は、図１２に示す本発明の他の代表的な実施の形態のシステムに関するものである。例えば、図１２の代表的なシステムは、背面開口（２４）を有する対物レンズ（２０）と、空間フィルタリングのためのピンホールＰＨ又は（単一モード）光ファイバ（６０）と、リレーレンズシステム（３１、３９）と、光スペクトルを分散するための透過回折格子（４０）と、合焦レンズ（５０）と、分光計アレイ（７０）、例えば、電荷結合素子又は光電子倍増管アレイと、を含むことができる。この代表的なシステムのダイクロイックミラーＤＭ（２５）、位相板ＰＰ（３０）、透過回折格子ＴＧ（４０）も、図１２に示されている。具体的には、図１２に示す対物レンズ瞳（２４）における複素電場分布Ｅ_ｐ（ｘ、ｙ、λ）＝Ｉ（ｘ、ｙ、λ）ｅ^{ｉφ（ｘ、ｙ、λ）}を定義することができる。顕微鏡対物レンズ（２０）の焦点の点光源（１０）について、強度関数と位相関数の両方は、
Ｅ_ｐ（ｘ、ｙ、λ）＝Ｉ_０（λ）ｅ^ｉφ _０ ^（λ）
とフラット（ｆｌａｔ）とすることができる。位相板（３０）は場（ｆｉｅｌｄ）を遅延させて、位相の異なる複数の部分にすることができる。

図１３に、異なる部分の光学的厚さを表す数字（０、１、３、７）を付した、模擬的な４要素位相板の代表的な実施の形態を示す。例えば、遅延された場、すなわち、
Ｅ_ｒ（ｘ、ｙ、λ）＝Ｅ_ｐｅ^{ｉφ（ｘ、ｙ、λ）}
を位置（ｘ、ｙ）及び波長λにおける波長板の光学的厚さから決定することができる。図１２の代表的な実施の形態のシステムに示すように、レンズ（３１）は、場を受け入れるファイバの先端／空間フィルタ（６０）に合焦する。受け入れるファイバの先端／空間フィルタ（６０）における場Ｅ_ｆ（ｘ、ｙ、λ）の分布は、Ｅ_ｓのフーリエ変換によって決定することができる。遅延されていない場Ｅ_ｒ０のこの代表的な場の分散Ｅ_ｆ０は、受け入れるファイバのモードとして定義することができる。剪断された場とファイバモードパターンとの間の場カップリング効率は、重なり積分として定義してもよい。

パワーカップリングは、場カップリングの絶対値の二乗とすることができる。

波長λごとにパワーカップリングを決定することにより、図１４に示す、模擬自己干渉スペクトルを導くことができる。このスペクトルをフーリエ変換することによって、自己干渉変調のパワースペクトルと位相を導くことができる（それぞれ、図１５、１６に示す）。点光源の位置は、これらの代表的な変調の位相から得ることができる。（ｘ、ｙ）面において光源（１０）が対物レンズ（２０）の焦点から離れる動きは、線形位相ランプを場Ｅ_ｐに追加することによってシミュレーションを行うことができる。光源（１０）が対物レンズ（２０）の焦点からｚ軸に沿って離れる動きについて、球面位相の項を場Ｅ_ｐに追加することによるシミュレーションを行うことができる。本書で説明した代表的なシミュレーションでは、例えば、約６４度の受光角度、例えば、約０．１８ｍｍの焦点距離を有する対物レンズ（例えば、薄いレンズとしてモデル化）の使用を想定することができる。蛍光色素分子の変位は、例えば、ｘ方向及びｙ方向の両方に約６０ｎｍとすることができる。この代表的な変位は、図１６のグラフで示される明確な位相シフトを提供することができる。焦点の蛍光色素分子については、例えば、全ての位相をゼロとすることができる。

上述の説明は本発明の原理を例示するものにすぎない。本書の教示を鑑みれば、当業者であれば、本書で説明した実施の形態に様々な修正及び変形が想起される。事実、本発明の代表的な実施の形態の構成、システム及び方法は、イメージングシステムとともに使用することができ、例えば、引用により本書に援用される、２００４年９月８日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９１４８号、２００５年１１月２日出願の米国特許出願第１１／２６６７７９号、及び、２００４年７月９日出願の米国特許出願第１０／５０１２７６号に記載のものとともに使用することができる。当業者であれば、本書に明示的に提示、又は記載されていなくとも、本発明の原理を具現化する、すなわち、本発明の趣旨と範囲に属する、様々なシステム、構成及び方法を考案できることは明らかである。さらに、上述の記載において従来技術の知識が参照により明示的に援用されていない範囲まで、その全体が本書に含まれる。本書が引用するオーストラリア公報も、参照によりその全体が含まれる。

Claims (26)

1. 試料の少なくとも一つの部分から少なくとも一つの電磁放射を取得するように構成された装置であって、該装置は、
   前記少なくとも一つの電磁放射を、互いに異なる断面を有する複数の第１の放射に分離するように構成された、少なくとも一つの第１の構成部であって、前記複数の第１の放射の他の一つ、の断面にわたる位相遅延とは異なる、前記複数の第１の放射の一つ、の断面にわたる位相遅延を与えるように構成された、少なくとも一つの第１の構成部と、
   前記複数の第１の放射の少なくとも一つを受光し、前記受光した前記複数の第１の放射の少なくとも一つを、前記受光した前記複数の第１の放射の少なくとも一つ、の波長に従って、第２の放射に分離するように構成された、少なくとも一つの第２の構成部と、
   前記複数の第１の放射又は前記第２の放射の少なくとも一つに空間フィルタリングを行うように構成された、少なくとも一つの第３の構成部と、
   前記第２の放射を検出し、前記試料の少なくとも一つの部分の位置に関する情報を、前記複数の第１の放射の自己干渉の少なくとも一つの特性の関数として生成するように構成された、少なくとも一つの第４の構成部と、を備えた装置。
2. 前記位置の情報は、前記少なくとも一つの部分の横方向の位置又は深さの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項１記載の装置。
3. 前記少なくとも一つの特性は、前記自己干渉の位相又は前記自己干渉の強度の少なくとも一つを含み、
   前記情報は、前記複数の第１の放射の前記自己干渉のスペクトル変調に基づいて生成されることを特徴とする、請求項１記載の装置。
4. 前記少なくとも一つの第１の構成部は少なくとも二つの光学的要素を有し、
   前記少なくとも二つの光学的要素は、前記少なくとも二つの光学的要素の他方の第２の経路長の差違とは異なる、前記少なくとも二つの光学的要素の一方の第１の経路長の差違に影響を与える光学的厚さを有する、請求項１記載の装置。
5. 前記少なくとも二つの光学的要素のいずれかの間の光学的経路長の差違は、前記複数の第１の放射の自己干渉のスペクトルの変調の整数を生成する、請求項４記載の装置。
6. 前記整数は、前記少なくとも二つの光学的要素の間の経路長の差違の任意の組み合わせごとに異なる、請求項５記載の装置。
7. 前記少なくとも一つの電磁放射を生成するための励起放射を提供するように構成された少なくとも一つの第５の構成部をさらに備えた、請求項１記載の装置。
8. 前記励起放射を受光し、前記励起放射に基づいて前記試料の少なくとも一つの部分の異なる位置に関連する放射を提供するように構成された、少なくとも一つの第７の構成部をさらに備えた、請求項７記載の装置。
9. 前記少なくとも一つの第３の構成部は、ピンホール、ピンホールアレイ、光ファイバ、ファイバアレイの少なくとも一つを含む、請求項１記載の装置。
10. 前記光ファイバは、単一モードのファイバであり、前記ファイバアレイは、単一モードの複数のファイバである、請求項９記載の装置。
11. 前記試料の少なくとも一つの部分の異なる位置と関連する放射を提供するように構成された、少なくとも一つの第６の構成部をさらに備えた、請求項１記載の装置。
12. 前記少なくとも一つの第６の構成部は、走査ミラーを含む、請求項１１記載の装置。
13. 前記少なくとも一つの電磁放射は、前記試料の複数の部分から提供される複数の放射を含む、請求項１記載の装置。
14. 前記少なくとも一つの第３の構成部は、ピンホールアレイを含み、
    前記試料の複数の部分に関連する前記第２の放射の複数のスペクトルを検出するように構成された特定の二次元の構成部をさらに備える、請求項１３記載の装置。
15. 試料の少なくとも一つの部分に関連する情報を生成するように構成された装置であって、該装置は、
    第１の放射に関連するデータを取得し、前記データに基づいて前記試料の少なくとも一つの部分の位置に関する情報を生成するように構成された、少なくとも一つの処理構成部を備え、
    前記第１の放射は、前記試料の少なくとも一つの部分に関連する第２の放射を、前記第２の放射の少なくとも一つ、の波長に従って分離することによって、生成され、
    前記第２の放射は、前記試料から提供される放射を、（ｉ）互いに異なる断面と、（ｉｉ）前記第２の放射の他の一つ、の断面にわたる位相遅延とは異なる、前記第２の放射の一つ、の断面にわたる位相遅延と、を有するように分割することによって生成され、
    前記第２の放射は自己干渉し、
    前記第１の放射又は前記第２の放射の少なくとも一つに空間フィルタリングを行うように構成された、少なくとも一つのさらなる構成部を備えた、装置。
16. 前記少なくとも一つの処理構成部は、前記データのフーリエ変換を実行することによって、前記情報を生成するように構成された、請求項１５記載の装置。
17. 前記少なくとも一つの処理構成部は、前記第２の放射の少なくとも一つの干渉の位相を生成するためにフーリエ変換を実行するように構成され、
    前記位相は、前記試料の少なくとも一つの位置に関連する、請求項１６記載の装置。
18. 前記情報は、前記第２の放射の前記少なくとも一つの干渉の前記位相又は前記振幅の少なくとも一つに基づいて生成される、請求項１７記載の装置。
19. 前記情報は、前記少なくとも一つの部分の位置情報を含む、請求項１８記載の装置。
20. 試料の少なくとも一つの部分に関連する情報を提供する方法であって、該方法は、
    前記試料の少なくとも一つの部分から受光した少なくとも一つの電磁放射を、互いに異なる断面を有する複数の第１の放射に分離し、前記複数の第１の放射の他の一つ、の断面にわたる位相遅延とは異なる、前記複数の第１の放射の一つ、の断面にわたる位相遅延を与えるステップと、
    前記複数の第１の放射の少なくとも一つを受光し、前記受光した前記複数の第１の放射の少なくとも一つを、前記受光した前記複数の第１の放射の少なくとも一つ、の波長に従って、第２の放射に分離するステップと、
    前記複数の第１の放射又は前記第２の放射の少なくとも一つを空間フィルタリングするステップと、
    前記第２の放射を検出し、前記試料の少なくとも一つの部分の位置に関する情報を、前記複数の第１の放射の自己干渉の少なくとも一つの特性の関数として生成するステップと、を含む、方法。
21. 試料の少なくとも一つの部分に関連する情報を提供する方法であって、該方法は、
    第１の放射に関連するデータを取得するステップと、
    前記第２の放射の少なくとも一つ、の波長に従って前記試料の少なくとも一つの部分に関連する第２の放射を分離することによって、前記データに基づいた前記試料の少なくとも一つの部分の位置に関する情報を生成するステップを含み、
    前記生成するステップでは、前記第２の放射は、前記試料から提供される放射を、（ｉ）互いに異なる断面と、（ｉｉ）前記第２の放射の他の一つ、の断面にわたる位相遅延とは異なる、前記第２の放射の一つ、の断面にわたる位相遅延と、を有するように分割することによって生成され、前記第２の放射は、自己干渉し、前記第１の放射又は前記第２の放射の少なくとも一つは、空間フィルタリングが行われる、方法。
22. 試料の少なくとも一つの部分に関連する情報を提供するソフトウェアのプログラムを含む、コンピュータがアクセス可能な媒体であって、
    前記ソフトウェアが、処理構成部によって実行されるとき、
    前記処理構成部は、
    第１の放射に関連するデータを取得する工程と、
    前記第２の放射の少なくとも一つ、の波長に従って前記試料の少なくとも一つの部分に関連する第２の放射を分離することによって、前記データに基づいた前記試料の少なくとも一つの部分の位置に関する情報を生成する工程を含む手順を実行し、
    前記生成する工程では、前記第２の放射は、前記試料から提供される放射を、（ｉ）互いに異なる断面と、（ｉｉ）前記第２の放射の他の一つ、の断面にわたる位相遅延とは異なる、前記第２の放射の一つ、の断面にわたる位相遅延と、を有するように分割することによって生成され、前記第２の放射は、自己干渉し、前記第１の放射又は前記第２の放射の少なくとも一つは、空間フィルタリングが行われる、コンピュータがアクセス可能な媒体。
23. 前記少なくとも一つの第１の構成部はさらに、前記複数の第１の放射を略同一の方向に沿って伝播するように構成される、請求項１記載の装置。
24. 前記少なくとも一つの処理構成部はさらに、前記第２の放射を略同一の方向に沿って伝播するように構成される、請求項１５記載の装置。
25. 前記複数の第１の放射は、前記少なくとも一つの電磁放射のそれぞれの幾何学的部分に対応する、請求項１記載の装置。
26. 前記複数の第１の放射は、前記少なくとも一つの電磁放射のそれぞれの幾何学的部分に対応する、請求項２０記載の装置。

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