JP5527625B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、試料に照明光を照射して蛍光させて、この蛍光を検出して画像生成を行う顕微鏡装置に関し、特に試料の深部観察を行う顕微鏡装置に関するものである。

蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対してレーザ光を照射して試料を励起させる。これにより、試料は蛍光して、この蛍光に基づいて試料の画像取得を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。特に、試料の深部観察を行うときには、照明光を照射したときの焦点面以外からの戻り光の影響により、生成される画像のＳ／Ｎ比が劣化する。この劣化現象は共焦点顕微鏡を用いたとしても、十分に除去できるものではない。

このような問題を解決するために特許文献１が開示されている。特許文献１の技術では、可干渉性を有する照明光を２つに分離して、分離した少なくとも一方の照明光に対して変調を加える。そして、２つの照明光が重なった部分で生じる干渉光を検出することで、Ｓ／Ｎ比が向上した深部観察を行うことができる、という極めて高い効果を有する技術である。

特開２０１０−１９７９８６号公報

前述したように、特許文献１の技術では、Ｓ／Ｎ比が向上した深部観察を行うことができるが、戻り光を検出する検出手段に特定の周波数成分を抽出するバンドパスフィルタを設ける必要がある。このバンドパスフィルタにより特定の周波数成分を抽出することで、試料の深部観察を行っている。このために、バンドパスフィルタを顕微鏡装置の内部に具備させる必要があり、これが回路規模の複雑化を招来する。

また、試料の所定深度の観察を行うときに、照明光を試料に照射するが、このとき焦点面以外でも蛍光が発生し、これが散乱等することにより迷光成分が発生する。この迷光成分は試料の深部観察を行う上で画像のコントラストの劣化を招来する。これにより、試料の画像の正確性が低下する。

さらに、特許文献１の技術では、各焦点について干渉によって特定周波数の変調を加える必要がある。このために、各焦点において照明光を一定時間滞在させる必要がある。つまり、互いに異なる周波数で変調した光の干渉を発生させ、その差の周波数で交差領域のみで強度変調を加えているため、一定時間照明光を滞在させなければならない。これが原因で、画像生成速度の遅延化を生じさせる。

そこで、本発明は、簡単な回路構成で高速且つ正確に試料の深部観察を行うことを目的とする。

以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、
試料に照射する可干渉性を有する照明光を発振する光源と、前記試料に照射された照明光による蛍光を戻り光として検出する検出部と、少なくとも前記照明光の光路に配置され、前記照明光の位相分布を制御する位相分布制御手段と、前記位相分布を変化させるように前記位相分布制御手段を制御するコントローラと、前記位相分布を変化させる前と変化させた後との前記戻り光の差分を演算して、前記試料の画像生成を行う画像生成部とを備えた顕微鏡装置において、
前記コントローラは、前記光源から照射した前記照明光の全てに対して位相が等しくなるように前記位相分布制御手段を制御する第１の制御を行い、前記光源から照射した前記照明光の焦点に干渉を生じさせる位相分布に前記位相分布制御手段を制御する第２の制御を行い、
前記画像生成部は、前記第１の制御を行ったときの前記戻り光と前記第２の制御を行ったときの戻り光との差分を演算することにより前記画像生成を行い、
前記照明光を前記試料で焦点を結ばせる対物レンズの瞳位置もしくは瞳と等価な位置に前記位相分布制御手段を配置した
ことを特徴とする。

この顕微鏡装置によれば、位相分布制御手段により照明光の位相分布を変化させることができる。位相分布を変化させることにより焦点近傍で干渉が発生するが、位相分布を変化させる前後の画像の差分を行うことで、バンドパスフィルタのような回路を設けることなく、試料の所定深部の画像を生成することができる。画像の差分を演算することで迷光成分を除去することができ、照明光を滞在させることがないことから正確且つ高速に試料の深部の画像生成を行うことができる。

第１の制御を行ったときには等位相なので干渉を生じないが、第２の制御を行ったときには位相分布が変化することにより、照明光の焦点に干渉を生じる。これにより、第１の制御のときの画像と第２の制御のときの画像との差分を演算することで、焦点の所定深部の画像生成を行うことができる。

対物レンズの瞳位置に位相分布制御手段を配置することで、試料の所定深部の鮮明な画像を得ることができる。

また、前記コントローラは、前記照明光に対して円周方向に０から２πまで与える位相が連続的に変化するように前記位相分布制御手段を制御することを特徴とする。

第２の制御のときに位相分布制御手段は、前記のように与える位相が連続的に変化するように制御することで、試料の焦点で干渉させることができる。これにより、試料の所定深部のＸＹ方向の画像を正確且つ高速に得ることができる。

また、前記コントローラは、前記照明光に対して円周方向に０の位相と２πの位相とを交互に与える複数の領域を形成するように前記位相分布制御手段を制御することを特徴とする。

第２の制御のときに位相分布制御手段は、与える位相を前記のように形成することで、試料の焦点で干渉させることができる。これにより、試料の所定深部のＸＹ方向の画像を正確且つ高速に得ることができる。

また、前記コントローラは、前記照明光に対して与える位相が中心の円形領域はπであり、その周囲のリング状の領域が０となるように前記位相分布制御手段を制御することを特徴とする。

第２の制御のときに、位相分布制御手段が与える位相を前記のように形成していることで、試料の焦点で干渉させることができる。これにより、試料の所定深部のＺ方向の画像を正確且つ高速に得ることができる。

また、前記位相分布制御手段は空間光変調素子であり、この空間光変調素子は、前記光源から発振された前記照明光を前記試料に導くために、前記照明光の光路を９０度の反射角で反射させる反射型の空間光変調素子であることを特徴とする。

位相分布制御手段として反射型の空間光変調素子を用いることで、位相分布を制御する機能と光を反射させる機能とを１つの空間光変調素子に持たせることができる。これにより、使用する光学部品の削減を行うことができる。

また、前記位相分布制御手段は、前記照明光に対して、前記試料までの光路の媒質の屈折率と前記試料の媒質の屈折率との屈折率差により生じる球面収差を補正する位相を与えることを特徴とする。

試料までの光路と試料との間には媒質の屈折率差が存在しているため、球面収差が発生し、この球面収差により画像の精度が劣化する。このために、位相分布制御手段が屈折率差を補正する位相を照明光に与えることで、球面収差が補正された画像を得ることができる。

また、複数のマイクロレンズを螺旋状に多条に配列したマイクロレンズディスクと、このマイクロレンズディスクと離間した位置に設けられ、前記マイクロレンズと同じパターンで複数のピンホールを配列したピンホールディスクと、前記マイクロレンズディスクと前記ピンホールディスクとを一体的に回転させる回転部と、を備えたことを特徴とする。

ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡を用いることで、試料の深部観察を行うための画像を高速に生成することができる。

本発明は、位相分布制御手段により位相分布を変化させて、戻り光の差分を演算することで、バンドパスフィルタのような回路を設けることなく、試料の深部観察を行うことができる。また、戻り光の差分の演算を行っていることから迷光成分を除去でき、照明光を滞在させることがないことから、正確且つ高速に試料の深部観察を行うことができる。

実施形態の顕微鏡装置の概略構成図である。 マイクロレンズディスクおよびピンホールディスクを示した図である。 コントローラの構成を示すブロック図である。 実施形態の第１の制御のときの位相分布および強度分布の図である。 実施形態の第２の制御のときの位相分布および強度分布の図である。 実施形態の差分の演算を行ったときの強度分布の図である。 実施形態の試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌを示した図である。 変形例１の第２の制御のときの位相分布および強度分布の図である。 変形例２の第１の制御のときの位相分布および強度分布の図である。 変形例２の第２の制御のときの位相分布および強度分布の図である。 変形例２の差分の演算を行ったときの強度分布の図である。 変形例３の顕微鏡装置の概略構成図である。 変形例４の顕微鏡装置の概略構成図である。 変形例５の顕微鏡装置の概略構成図である。 変形例５で用いるピンホールアレイ７５の具体例図である。 変形例５で用いるピンホールアレイ７５のＡ−Ａ矢視断面図である。 変形例５でピンホールアレイ７５を用いたときの強度分布の図である。 変形例５で用いる空間光変調素子２１の位相分布変化説明図である。 変形例５で用いるピンホールアレイ７５の変形例図である。 変形例５で用いるピンホールアレイ７５の変形例図である。 ピンホールアレイ７５ｃを用いたときの照明光の強度分布の図である。 カメラ７８の受光面上の分布図である。 ピンホールアレイ７５ｃ全体を移動させる場合の説明図である。

以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。図１は本実施形態の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１は走査光学系２と顕微鏡光学系３とを有して構成している。ここでは、図１に示した顕微鏡装置１を用いて生体等の試料Ｓの深部観察を行う。図１ではニポウディスク方式の共焦点顕微鏡を適用しているが、これに限定されず、後述するミラー走査型顕微鏡を適用してもよい。

走査光学系２は、レーザ光源４と光ファイバ５とコリメータレンズ６とマイクロレンズディスク７とピンホールディスク８と連結ドラム９とモータ１０とダイクロイックミラー１１と第１リレーレンズ１２と反射ミラー１３と蛍光フィルタ１４と第２リレーレンズ１５とカメラ１６とコントローラ１７とディスプレイ１８とで構成されている。

レーザ光源４は生体等の試料Ｓが蛍光する波長を有する可干渉性のレーザ光Ｌ（照明光）を発振する。レーザ光源４と光ファイバ５とは接続されており、レーザ光Ｌは光ファイバ５に入射される。そして、光ファイバ５の出射端から出射されたレーザ光Ｌは拡散光となっており、このレーザ光Ｌの光路にコリメータレンズ６が配置されている。このコリメータレンズ６によりレーザ光Ｌは平行光になる。

コリメータレンズ６から出射したレーザ光Ｌは、マイクロレンズディスク７に入射される。図２に示すように、マイクロレンズディスク７は円盤状のディスクであり、多条（図中では４条）に且つ螺旋状にマイクロレンズ７Ｍを配列した回転ディスクである。

図２に示すように、ピンホールディスク８は円盤状のディスクであり、多条（図中では４条）に且つ螺旋状にピンホール８Ｐを配列した回転ディスクである。そして、ピンホール８Ｐはマイクロレンズ７Ｍと同一パターンで配列されている。ピンホール８Ｐは後述する試料Ｓの焦点面ＦＳの光のみを通過させることにより、顕微鏡装置１を共焦点顕微鏡として機能させている。

なお、同図において、撮影レンズ１９および対物レンズ２２を模式的に１枚のレンズで示しており、同様に第１リレーレンズ１２および第２リレーレンズ１５も模式的に１枚のレンズで示している。また、連結ドラム９とモータ１０とにより回転部が構成される。

マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８との間には所定の間隔が設けられており、連結ドラム９にモータ１０から回転力を付与することで、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とは一体的に回転を行う。マイクロレンズ７Ｍにはコリメータレンズ６により平行光にされたレーザ光Ｌが入射され、このマイクロレンズ７Ｍにより対応するピンホール８Ｐでレーザ光Ｌは焦点を結ぶ。

マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８との間にはダイクロイックミラー１１が配置されている。ダイクロイックミラー１１はレーザ光Ｌの波長域の光を透過し、試料Ｓを蛍光させたときの戻り光Ｒの波長域の光を反射する。従って、図１に示すように、戻り光Ｒは第１リレーレンズ１２により平行光に変換されて、反射ミラー１３により９０度光路が変換される。

戻り光Ｒの光路における反射ミラー１３の後段には、蛍光フィルタ１４が配置されている。この蛍光フィルタ１４は試料Ｓの蛍光の波長域の光のみを通過させる。蛍光フィルタ１４を経た戻り光Ｒは第２リレーレンズ１５に入射される。そして、第２リレーレンズ１５により収束された戻り光Ｒはカメラ１６で受光される。カメラ１６は受光面を有しており、戻り光Ｒの光量を光電変換して電気信号を生成する検出部として機能する。この電気信号はコントローラ１７に出力される。

コントローラ１７は、入力された電気信号に基づき試料Ｓの深部の画像データを生成する。この生成された画像データはディスプレイ１８に表示される。ディスプレイ１８に試料Ｓの深部の画像データが表示されることで、試料Ｓの深部観察を行うことができる。なお、生成した画像データは図示しない内部メモリに記憶するようにしてもよい。

次に、顕微鏡光学系３について説明する。顕微鏡光学系３は撮影レンズ１９と反射ミラー２０と空間光変調素子２１と対物レンズ２２とディッシュ２３とで構成されている。撮影レンズ１９はピンホール８Ｐで焦点を結んだレーザ光Ｌを平行光にする。反射ミラー２０は平行光となったレーザ光Ｌを９０度の角度で反射させる。

空間光変調素子２１はレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒに対して位相分布を変化させることが可能な位相分布制御手段であり、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの光路に配置されている。これにより、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの中で異なる位相を与えることができる。対物レンズ２２は空間光変調素子２１の作用を受けたレーザ光Ｌをディッシュ２３に搭載されている試料Ｓに焦点Ｆを結ばせる。なお、図中のＦＳは焦点面になる。

次に、図３を参照して、コントローラ１７の構成について説明する。コントローラ１７は、コントローラ制御部３１と光源制御部３２とモータ制御部３３と空間光変調素子制御部３４と入力部３５と画像生成部３６とで構成されている。コントローラ１７は例えばコンピュータであり、このコンピュータ上で動作するソフトウェアでコントローラ１７の各要素を機能させることができる。

コントローラ制御部３１はコントローラ１７の全体の制御を行う。光源制御部３２はレーザ光源４の制御を行っている。光源制御部３２は、少なくとも２回はレーザ光Ｌを発振させるようにレーザ光源４を制御している。このレーザ光源４が発振するレーザ光Ｌは試料Ｓを励起させる波長とする。

モータ制御部３３はモータ１０の制御を行っている。このモータ１０にモータ制御部３３が回転するように制御することで、モータ１０に回転力が付与される。これにより、連結ドラム９により一体的に構成されているマイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とが一体的に回転を行う。

入力部３５は、カメラ１６が受光した戻り光Ｒに基づいて検出した光量を光量データとして入力する。カメラ１６の受光面には戻り光Ｒが走査される。入力部３５は受光された戻り光Ｒの光量データが入力され、画像生成部３６に光量データが出力される。画像生成部３６は戻り光Ｒが走査されることにより発生する光量データに基づいて、試料Ｓの走査した領域の画像が生成される。これを画像データとする。

前述したように、レーザ光源４からはレーザ光Ｌが少なくとも２回発振される。画像生成部３６は１回目のレーザ光Ｌを走査したときに得られる画像データを第１の画像データとし、２回目のレーザ光Ｌを走査したときに得られる画像データを第２の画像データとする。そして、画像生成部３６は第１の画像データと第２の画像データとの差分を演算することにより、画像データを生成する。この画像データは試料Ｓの所定深部の画像を示しており、この画像データをディスプレイ１８に表示する。

次に、動作について説明する。前述したように、少なくとも２回はレーザ光Ｌを発振する。ここでは、レーザ光源４はレーザ光Ｌを２回発振するように光源制御部３２が制御を行う。１回目のレーザ光Ｌを発振して画像データを得る制御を第１の制御とし、２回目のレーザ光Ｌを発振して画像データを得る制御を第２の制御とする。

１回目（第１の制御）においては、空間光変調素子制御部３４は空間光変調素子２１の全体が等位相となるような位相分布に制御する。空間光変調素子２１にはレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒに対して位相分布の制御を行う。この位相分布の制御を行うことで、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの光路断面の位相分布を変化させることができる。ただし、１回目のレーザ光Ｌを発振するときには、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの全体の位相が全て等しくなるように（等位相）制御している。空間光変調素子２１がレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの光路断面を等位相に制御している状態を図４ａに示す。

レーザ光Ｌは光ファイバ５によりコリメータレンズ６に導光されて、コリメータレンズ６により平行光にされる。このとき、コントローラ１７のモータ制御部３３はモータ１０に回転力を付与して、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とを一体的に回転する。コリメータレンズ６により平行光にされたレーザ光Ｌはマイクロレンズディスク７のマイクロレンズ７Ｍにより対応するピンホール８Ｐで焦点を結ぶ。

そして、ピンホール８Ｐで焦点を結んだレーザ光Ｌは撮影レンズ１９により平行光にされ、反射ミラー２０により光路が９０度変換されて、空間光変調素子２１に入射される。前述したように、空間光変調素子２１はレーザ光Ｌの全てが等位相となるように制御している。よって、レーザ光Ｌは全ての領域で位相が等しくなる。

このとき、試料Ｓの焦点ＦのＸＹ平面におけるレーザ光Ｌの強度分布は対物レンズ２２の点像分布関数（ＰＳＦ）になる。この強度分布は、図４ｂに示すように、光軸中心の光量が最も高く、周辺領域の光量が低いガウシアン分布になっている。なお、図中の一点鎖線は光軸中心を示している。

このレーザ光Ｌが対物レンズ２２に入射して、対物レンズ２２の作用により試料Ｓの所定深度において焦点Ｆを結ぶ。試料Ｓはレーザ光Ｌが照射されて焦点Ｆを結ぶことにより励起され、蛍光が発生する。この蛍光が戻り光Ｒとなって、再び対物レンズ２２に入射する。対物レンズ２２により平行光となった戻り光Ｒは空間光変調素子２１に入射する。

戻り光Ｒのみについて着目すると、当該戻り光Ｒは空間光変調素子２１で等位相となるような作用を受ける。従って、このときの戻り光Ｒの強度分布は図４ｂに示すようなガウシアン分布となる。

本実施形態では、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとの両者について空間光変調素子２１の作用を受ける。よって、戻り光Ｒが空間光変調素子２１の作用を受けたときには、図４ｂの点像分布関数を乗算したものになる。これが図４ｃの強度分布になる。従って、図４ｂの強度分布の乗算を行った図４ｃの強度分布はＸＹ方向に高い分解能を有する。この図４ｃの強度分布の戻り光Ｒは、反射ミラー２０、撮影レンズ１９を経て、ピンホールディスク８のピンホール８Ｐに到達する。

ピンホール８Ｐにより焦点面ＦＳのみの戻り光Ｒが通過する。これにより、光軸方向に高い分解能を有する共焦点顕微鏡として機能させることができる。ピンホール８Ｐを通過した戻り光Ｒはダイクロイックミラー１１により反射し、蛍光フィルタ１４に入射する。蛍光フィルタ１４では試料Ｓを蛍光させたときの蛍光成分の波長域のみの光を通過させるため、戻り光Ｒから蛍光成分以外の光が除去される。蛍光フィルタ１４を通過した戻り光Ｒはカメラ１６の受光面で受光される。カメラ１６は受光した戻り光Ｒの光量を光電変換して、電気信号の光量データを生成する。この光量データはコントローラ１７の入力部２５から画像生成部３６に入力される。

図１および図２に示したように、コントローラ１７のモータ制御部３３がモータ１０を制御することで、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とが一体的に回転することから、レーザ光Ｌは試料Ｓを高速に走査する。従って、戻り光Ｒはカメラ１６の受光面を高速に走査する。これにより、試料Ｓの所定深部の所定領域の画像データが生成される。これが第１の画像データであり、画像生成部３６はこの第１の画像データを保持する。

次に、第２の制御を行う。空間光変調素子制御部３４は空間光変調素子２１の位相分布を変化させる。ここでは、図５ａのように、円周方向に位相が０から２πまで連続的に変化する位相差をレーザ光Ｌに与えるように制御する。そして、この後に、レーザ光源４から２回目のレーザ光Ｌの発振を行う。

１回目のレーザ光Ｌと同じく、レーザ光源４から発振したレーザ光Ｌはマイクロレンズ７Ｍやピンホール８Ｐを介して、空間光変調素子２１まで到達する。このレーザ光Ｌは空間光変調素子２１の作用を受ける。空間光変調素子２１は円周方向に位相が０から２πまで連続的に変化する作用をレーザ光Ｌに対して与える。

空間光変調素子２１の作用を受けたレーザ光Ｌは、対物レンズ２２により試料Ｓに所定深度で焦点Ｆを結ぶ。このとき、空間光変調素子２１の作用を受けたレーザ光Ｌを対物レンズ２２で集光すると、焦点面ＦＳの光軸中心においてはそれぞれ光軸を挟んで対向する成分の位相がπだけずれるため、干渉して光は弱め合う。一方、光軸中心から離間した円周上では位相がπから変化して、０または２πとなる位置では干渉した光が強め合う。これらの位相変化に伴う励起光の干渉は、焦点においてのみ生じる。

これにより、試料Ｓの焦点Ｆにおけるレーザ光Ｌの強度分布は、図５ｂに示すようになる。同様に、試料Ｓのレーザ光の焦点付近において一様に蛍光が発生して戻り光Ｒとなる場合を考えると、この戻り光Ｒも空間光変調素子２１の作用を受ける。焦点面ＦＳの光軸中心に発生した戻り光Ｒにおいてはそれぞれ光軸を挟んで対向する成分の位相がπだけずれるため、戻り光Ｒはピンホール８Ｐ上で干渉して光は弱め合う。一方、光軸中心から一定距離だけ離間した円周上からの戻り光Ｒはピンホール８Ｐ上で位相差がπから変化し、０または２πとなる位置からの戻り光Ｒは光が強め合う。従って焦点付近において一様に蛍光が発生して戻り光Ｒとなる場合、ピンホール８Ｐに到達する戻り光Ｒの強度分布も同様に干渉の影響で図５ｂのようになる。この蛍光の干渉も焦点付近から発生してピンホールに結像する蛍光においてのみ顕著に生じる。

従って、レーザ光Lによって試料Ｓを照明した際の焦点付近からの戻り光Ｒは図５ｂの強度分布を乗算した図５ｃのような分布になる。この戻り光Ｒは１回目の戻り光Ｒと同様にカメラ１６の受光面で受光され、光電変換されて光量データとして入力部２５に入力される。１回目と同様に、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とが一体的に回転しているため、レーザ光Ｌは試料Ｓの焦点面ＦＳを高速に走査し、戻り光Ｒはカメラ１６の受光面を高速に走査する。

これにより、試料Ｓの所定深度の所定領域の画像データが生成される。これが第２の画像データである。画像生成部３６は第１の画像データと第２の画像データとの差分の演算を行う。第１の画像データは図４ｃで示した分布となり、第２の画像データは図５ｃで示した分布となっているので、それらの差分を演算することにより、図６のような強度分布（点像分布）が得られる。この強度分布は通常の強度分布より幅が小さく、ＸＹ方向に高い分解能となっている。さらに第２の画像取得時に起きるレーザ光（励起光）の干渉は、焦点面ＦＳにおいてのみ生じる。また、干渉は、戻り光である蛍光のうち、焦点面ＦＳから発生してピンホールを通過する蛍光においてのみ顕著に生じる。これらの効果により、画像の差分を演算することで焦点面ＦＳの情報のみを感度良く抽出することができ、これにより試料Ｓの所定深度の所定領域の画像データが生成される。

従って、空間光変調素子２１の位相分布を変化させて、第１の画像データと第２の画像データとの差分を演算して試料Ｓの画像生成を行うことができる。コントローラ１７はコンピュータで動作するソフトウェアであり、顕微鏡装置１に必須の装置である。このコンピュータで動作するソフトウェアに図３の各部の機能を持たせることで、バンドパスフィルタのような格別な回路を設けることなく、試料Ｓの深部観察を行うことができる。

また、第１の画像データと第２の画像データとには、それぞれ焦点面ＦＳ以外で発生した蛍光のうち、散乱等によってピンホール８Ｐに入り込む迷光が発生する。この迷光は画像データを劣化させる要因となるが、第１の画像データと第２の画像データとの差分を演算することにより、迷光成分を除去できる。つまり、第１の画像データにも第２の画像データにも迷光成分が混入するが、両者の差分を演算することで迷光成分をキャンセルすることができ、正確に深部観察を行うことができる。

また、周波数変調を行って深部観察を行うときにはレーザ光Ｌを一定時間滞在させなければならないが、本実施形態では空間光変調素子２１により位相分布を変化させて、第１の画像データと第２の画像データとの差分により画像生成を行っているため、レーザ光Ｌを一定時間滞在させる必要がない。これにより、試料Ｓの深部観察を行うための画像を高速に生成できる。且つ、本実施形態では、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡を用いているため、高速に画像生成を行うことができる。

ところで、試料Ｓの深部を観察する場合、図７に示すように、試料Ｓに到達する前の媒質（つまり、対物レンズ２２とディッシュ２３との間の媒質：空気）と試料Ｓの中の媒質とは屈折率が異なる。この屈折率差によりレーザ光Ｌに球面収差が発生し、画像の劣化を生じさせる。

このとき、空間光変調素子２１はレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの位相をコントロールできる。そこで、空間光変調素子２１は前述したように、円周上に位相を０から２πまで変化させると同時に、球面収差を補正するような位相を与えるように制御する。これにより、前記の屈折率差に基づく球面収差が補正され、鮮明な画像を得ることができる。

次に、変形例１について説明する。本変形例１では、第２の画像データを生成するとき（つまり、第２の制御を行うとき）において、空間光変調素子２１がレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒに与える位相の一例を示している。このときの空間光変調素子２１は、図８ａに示すように、円周方向に０の位相差を与える領域とπの位相差を与える領域とが交互に配列されている。

この空間光変調素子２１を用いた場合、焦点近傍において位相が反転した光が重なり合うことにより、干渉によってレーザ光（励起光）は弱め合う。このとき、干渉によって弱め合う光はＸＹ平面内でほぼ打ち消し合うようになるため、強度分布は図８ｂのようになる。また、同様に、焦点からの戻り光（蛍光）もほぼピンホール上で打ち消し合うようになる。従って、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとが乗算されることにより、カメラ１６で受光される戻り光Ｒの強度分布は図８ｃのように弱いものとなる。これらの干渉によりレーザ光（励起光）が打ち消しあうのは焦点面ＦＳにおいてのみである。また、焦点面ＦＳから発せられてピンホールを通過する蛍光においてのみ干渉は顕著に生じる。

従って、第１の画像データと本変形例の第２の画像データとの差分を演算することにより、焦点面ＦＳの情報のみを感度良く抽出することができ、試料Ｓの深部観察を行うことができる。また、第１の画像データと第２の画像データとの差分を演算することで、迷光成分を除去することができる。さらに、レーザ光Ｌを一定時間滞在させないことから、高速に画像生成を行うことができる。

前述した実施形態および本変形例１では空間光変調素子２１が与える位相のパターンの一例を示している。これらの位相のパターンは、対物レンズ２２により集光されるレーザ光Ｌが焦点Ｆにおいて干渉を生じさせるものであり、位相分布を１回目と２回目とで変化させてその差分を演算すれば、試料Ｓの深部観察を行うことができる。

前述した実施形態および本実施例では、１回目は等位相となるようにしているが、１回目のレーザ光Ｌの照射と２回目のレーザ光Ｌの照射とで位相分布が変化すれば、１回目においても空間光変調素子２１が所定の位相を与えるものであってもよい。

次に、変形例２について説明する。前述した実施形態および変形例１は、試料ＳのＸＹ方向（つまり、光軸に直交する平面）に高い分解能の画像生成を行ったが、本変形例２はＺ方向（つまり、光軸方向）に高い分解能の画像生成を行う。本変形例２では図１の顕微鏡装置１の構成を用いるが、空間光変調素子２１が異なる。

変形例２でも、２回のレーザ光の照射を行う。１回目のレーザ光の照射を行うとき（第１の制御）の空間光変調素子２１は、図９ａに示すように、レーザ光Ｌの全てが等位相となるようにしている。この場合、焦点Ｆにおける光の強度分布は対物レンズ２２の点像分布関数となり、図９ｂのような強度分布になる。空間光変調素子２１はレーザ光Ｌと戻り光Ｒとの２つに作用をするため、ピンホール８Ｐに到達する戻り光Ｒの強度分布は図９ｂを乗算した分布になり、図９ｃのような強度分布になる。

そして、２回目のレーザ光の照射を行うとき（第２の制御）の空間光変調素子２１は図１０ａのように位相分布を変化させる。つまり、円形の中心領域が与える位相差がπで、この円形の周囲のリング状の領域が与える位相が０になる。このようなパターンの位相を与える空間光変調素子２１の作用をレーザ光Ｌが受ける。

この空間光変調素子２１を用いると、対物レンズ２２により集光したときに、焦点面ＦＳの光軸中心では位相差がゼロの成分と位相差がπの成分とが干渉するため、強度を弱め合う。一方、光軸中心から離間するに応じて強度が高くなり、位相差が０または２πの箇所で、干渉により最も強度が高くなる。これにより、図１０ｂのような強度分布となる。

空間光変調素子２１はレーザ光Ｌと戻り光Ｒとの両者に作用する。よって、図１０ｂの強度分布が乗算されることにより、ピンホール８Ｐに到達した戻り光Ｒの強度分布は図１０ｃのような強度分布となる。この戻り光Ｒがカメラ１６で受光され、光電変換される。これにより、第２の画像データが生成される。

画像生成部３６は第１の画像データと第２の画像データとの差分を演算して、試料Ｓの所定深部の画像データを生成する。図１１は第１の画像データと第２の画像データとの差分による画像データの強度分布を示しており、Ｚ方向に高い分解能となっている。また、第１の画像データと第２の画像データとの差分を演算することにより、深部観察において迷光を除去できる。また、レーザ光Ｌを一定時間滞在させることがないことから、高速に画像生成を行うことができる。

次に、変形例３について説明する。図１２は変形例３の顕微鏡装置４０を示している。図１に示した顕微鏡装置１はニポウディス方式の共焦点顕微鏡であったが、本変形例３ではミラー走査型の顕微鏡装置を示している。このミラー走査型の顕微鏡装置４０は、走査光学系４１と顕微鏡光学系４２とを備えている。このうち顕微鏡光学系４２は図１の顕微鏡装置１とほぼ同じものであり、空間光変調素子２１を備えていないものになる。

図１２に示すように、走査光学系４１は、レーザ光源４３とダイクロイックミラー４４と走査光学ユニット４５と瞳リレーレンズ４６と蛍光フィルタ４７と収束レンズ４８とピンホール４９と検出器５０とコントローラ５１とディスプレイ５２とを備えている。

レーザ光源４３は試料Ｓを励起して蛍光を発生させるレーザ光Ｌを発振出力する。このレーザ光Ｌはダイクロイックミラー４４で反射して、走査光学ユニット４５に導かれる。走査光学ユニット４５は１本の軸周りに回転可能な第１可変ミラー４５ａと第２可変ミラー４５ｂとを有していて、これら第１可変ミラー４５ａと第２可変ミラー４５ｂとの間には空間光変調素子２１が配置されている。

走査光学ユニット４５の第１可変ミラー４５ａと第２可変ミラー４５ｂとの角度調整を行うことで、レーザ光Ｌで試料Ｓを走査させる。第２可変ミラー４５ｂで反射したレーザ光Ｌの光路に瞳リレーレンズ４６を設けている。瞳リレーレンズ４６で収束されたレーザ光Ｌは撮影レンズ１９に入射し、反射ミラー２０により反射する。そして、対物レンズ２２により、試料Ｓに焦点Ｆを結ぶ。

レーザ光Ｌが試料Ｓに焦点を結ぶことで、試料Ｓに蛍光が発生し、この蛍光が戻り光Ｒとして対物レンズ２２に入射する。対物レンズ２２により平行光となった戻り光Ｒは反射ミラー２０により反射して、撮影レンズ１９、瞳リレーレンズ４６、走査光学ユニット４５を経て、ダイクロイックミラー４４に入射する。

ダイクロイックミラー４４はレーザ光Ｌの波長を反射し、戻り光Ｒの波長を透過する。ダイクロイックミラー４４を透過した戻り光Ｒは、蛍光フィルタ４７に入射する。蛍光フィルタ４７により蛍光成分以外の波長の光が除去されて、収束レンズ４８に入射する。収束レンズ４８により収束された戻り光Ｒはピンホール４９を通過する。これにより、焦点面以外の光が除去され、光軸方向に高い分解能を有する共焦点顕微鏡として機能させることができる。

ピンホール４９を通過した戻り光Ｒは検出器５０に入射する。検出器５０は戻り光Ｒの光量を光電変換し、光量データとしてコントローラ５１に出力する。コントローラ５１は図３に示したコントローラ１７とほぼ同じであるが、モータ制御部３３ではなく、走査光学ユニット４５を制御する走査光学ユニット制御部（図示せず）を備えている。

これにより、試料Ｓの所定領域を走査することができる。本変形例３の空間光変調素子２１は、第１可変ミラー４５ａと第２可変ミラー４５ｂとの間に配置されている。また、光を収束させる瞳リレーレンズ４６を配置することにより、対物レンズ２２の瞳は空間光変調素子２１の位置近傍にリレーされる。

空間光変調素子２１としては、図５ａ、図８ａ、図１０ａに示したような任意の位相分布を与えるものを適用できる。これにより、１回目にレーザ光Ｌを試料Ｓに照射したときには等位相になり、２回目にレーザ光Ｌを試料Ｓに照射したときにはレーザ光Ｌの位相分布が変化する。

コントローラ５１は、前述したように図１のコントローラ１７とほぼ同じ構成を採用しており、画像生成部３６が１回目の画像データと２回目の画像データとの差分を演算し、この演算結果が画像データとしてディスプレイ１８に表示される。

従って、ミラー走査型の顕微鏡装置４０においても、バンドパスフィルタのような格別な回路を設けることなく、試料Ｓの所定深度の観察を行うことができる。また、１回目の画像データと２回目の画像データとの差分を演算することで、迷光成分を除去することができる。そして、レーザ光Ｌを一定時間滞在させる必要がないことから、高速に画像生成を行うことができる。

なお、本変形例３では空間光変調素子２１を走査光学ユニット４５に配置したが、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの光路の任意の位置に配置できる。ただし、空間光変調素子２１を瞳リレーレンズ４６により対物レンズ２２の瞳位置にリレーさせる必要がある。

次に、図１３を用いて、変形例４について説明する。変形例４の顕微鏡装置は実施形態と同様のニポウディスク方式の共焦点顕微鏡になる。この顕微鏡装置６０は走査光学系２と顕微鏡光学系６１とを有している。走査光学系２は実施形態で説明した顕微鏡装置１と同じものであるので、説明を省略する。

顕微鏡光学系６１も基本的に顕微鏡装置１と同様であるが、図１で示した反射ミラー２０の位置に反射型の空間光変調素子６２を設けている。また、第３リレーレンズ６３と第４リレーレンズ６４とを追加している。第３リレーレンズ６３と第４リレーレンズ６４とにより対物レンズ２２の瞳位置は反射型の空間光変調素子６２に導かれる。

前述した実施形態、実施例１乃至実施例３の空間光変調素子２１は透過型を用いていたが、本変形例４の空間光変調素子６２は反射型を用いる。この空間光変調素子６２はレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの位相分布を変化させるものであり、１回目のレーザ光Ｌと２回目のレーザ光Ｌとで位相分布が変化している。これにより、１回目の画像データと２回目の画像データとの差分を演算することで、所定深部の画像データを得ることができる。

このとき、図１３にも示したように、走査光学系２から顕微鏡光学系６１に入射したレーザ光Ｌの光路を９０度の角度で反射しなければならない。このために、図１の例では、反射ミラー２０を使用していたが、本変形例４の反射型の空間光変調素子６２に反射ミラー２０の機能を持たせることができる。これにより、反射ミラー２０の部品点数が削減される。

次に、図１４を用いて、変形例５について説明する。変形例５の顕微鏡装置は実施形態と同様の顕微鏡光学系になる。この顕微鏡装置７０は、焦点投射光学系７１と顕微鏡光学系３とを有している。顕微鏡光学系３は実施形態で説明した顕微鏡装置１と同じものであるので、説明を省略する。

焦点投射光学系７１は、レーザ光源７２と光ファイバ７３とコリメータレンズ７４とピンホールアレイ７５とダイクロイックミラー７６と蛍光フィルタ７７とカメラ７８とコントローラ７９とディスプレイ８０とで構成されている。

レーザ光源７２は実施形態と同様に生体等の試料Ｓが蛍光する波長を有する可干渉性のレーザ光Ｌ（照明光）を発振する。レーザ光Ｌは光ファイバ７３によってコリメータレンズ７４に導かれ、平行光になる。

コリメータレンズ７４から出射したレーザ光Ｌはピンホールアレイ７５に入射する。ピンホールアレイ７５の一部には、図１５に示すように、例えば直径５μｍのピンホールが例えばピッチ６μｍで配列されている。図１６はこのピンホールアレイ７５のＡ−Ａ矢視断面図である。図１５、１６の塗りつぶし部分は光を遮蔽し、白色の部分が光を透過するように構成されている。

ピンホールアレイ７５のレーザ光Ｌの出射方向の先にはダイクロイックミラー７６が配置されている。ダイクロイックミラー７６はレーザ光Ｌの波長域の光を透過し、試料Ｓを蛍光させたときの戻り光Ｒの波長域の光を反射する。

戻り光Ｒの光路には蛍光フィルタ７７が配置されている。この蛍光フィルタ７７は試料Ｓの蛍光の波長域の光のみを通過させる。蛍光フィルタ７７を経た戻り光Ｒはカメラ７８で受光される。カメラ７８は受光面を有しており、戻り光Ｒの光量を光電変換して電気信号を生成する検出部として機能する。この電気信号はコントローラ７９に出力される。

コントローラ７９は、入力された電気信号に基づいて試料Ｓの深部の画像データを生成し保存する。なお、コントローラ７９とディスプレイ８０はコントローラ１７とディスプレイ１８と同様であり、説明を省略する。

次に、動作について説明する。前述したように、少なくとも２回はレーザ光Ｌを発振する。ここでは、レーザ光源７２はレーザ光Ｌを２回発振するようにコントローラ７９に設けられている図示しない光源制御部が制御を行う。１回目のレーザ光Ｌを発振して画像データを得る制御を第１の制御とし、２回目のレーザ光Ｌを発振して画像データを得る制御を第２の制御とする。

１回目（第１の制御）においては、コントローラ７９に設けられている図示しない空間光変調素子制御部は、空間光変調素子２１の全体が等位相となるような位相分布に制御するので、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの全体の位相が全て等しくなる。

レーザ光Ｌは光ファイバ７３によりコリメータレンズ７４に導光されて、平行光にされる。この平行光はピンホールアレイ７５に導かれ、各々のピンホールによって回折されて発散光に変換される。この発散光のうち、光軸中心付近の光を実線で示し、辺縁部の光を点線で示す。これらのレーザ光Ｌはダイクロイックミラー７５を透過して撮影レンズ１９に入射され、反射ミラー２０により光路が９０度変換されて、空間光変調素子２１に入射する。

前述したように、空間光変調素子２１はレーザ光Ｌの全てが等位相となるように制御されている。よって、レーザ光Ｌは全ての領域で位相が等しくなる。

空間光変調素子２１で位相を制御された光は、対物レンズ２２によって焦点Ｆを結ぶ。また、ピンホールアレイ７５を通過した光は、焦点面ＦＳ上に投影される。

ここで、対物レンズ２２としては、例えば倍率４０倍、ＮＡ０．９５のものを用いる。このとき、試料Ｓの焦点ＦのＸＹ平面におけるレーザ光Ｌの強度分布は対物レンズ２２の点像分布関数（ＰＳＦ）になる。この対物レンズ２２のエアリディスク半径は波長を４８８ｎｍとすると０．３１μｍ程度となる。

一方、ピンホールアレイ７５のピッチ６μｍは１/４０に縮小投影されるため、０．１５μｍとなる。従って、ピンホールアレイ７５を通過した各々の光は、焦点面において焦点の領域の一部が重なるように投影され、各々の光の強度分布は図１７に示すようになる。さらに、これらの光はほぼ等位相であるために互いに強め合い、実線で示すような強度分布になる。

これらの光で試料Ｓが励起され、蛍光が発生する。この蛍光が戻り光Ｒとなって、再び対物レンズ２２に入射する。対物レンズ２２により平行光となった戻り光Ｒは空間光変調素子２１に入射する。この戻り光Ｒは空間光変調素子２１で等位相のまま伝達され、反射ミラー２０、撮影レンズ１９を経てダイクロイックミラー７６で反射され、蛍光フィルタ７７において蛍光成分以外の光が除去される。

蛍光フィルタ７７を通過した戻り光Ｒはカメラ７８の受光面で受光される。カメラ７８は受光した戻り光Ｒの光量を光電変換して、電気信号の光量データを生成する。この光量データはコントローラ７９の図示しない入力部から画像生成部に入力される。

ここで、カメラ７８の撮像素子はそのピッチが例えば６μｍのものを用いる。図１７に示したように照明光は均一にはなっていない。この周期的な照明光による蛍光は、撮影光学系の点像分布の影響によって広がりをみせるが、ピッチはカメラ７８の撮影素子上では６μｍに投影されるため、撮像素子の画素ピッチとほぼ同等になる。このように撮像素子のピッチと周期的な照明光のピッチが同程度の場合には、周期的な照明光は素子上で平均化されるため、この周期的な照明の影響は小さい。

なお、撮像素子のピッチと周期的な照明光のピッチが近い値のためにモアレを起こす場合には、カメラの前面に光学的なローパスフィルタを挿入してもよい。

次に、第２の制御を行う。コントローラ７９に設けられている図示しない空間光変調素子制御部は、空間光変調素子２１の位相分布を変化させる。ここでは、図１８のように、各領域を細かく区切ってそれぞれの領域に０から３/２πの位相差をレーザ光Ｌに与えるように制御する。そして、この後に、レーザ光源７２から２回目のレーザ光Ｌの発振を行う。

１回目のレーザ光Ｌと同じく、レーザ光源７２から発振したレーザ光Ｌは空間光変調素子２１まで到達する。このレーザ光Ｌは空間光変調素子２１の作用を受ける。

空間光変調素子２１の作用を受けたレーザ光Ｌは、対物レンズ２２により試料Ｓに所定深度で焦点Ｆを結ぶ。このとき、空間光変調素子２１の作用を受けたレーザ光Ｌを対物レンズ２２で集光すると、それぞれの位相の成分が互いに干渉することにより焦点近傍においてのみレーザ光Ｌは打ち消される。従って焦点面ＦＳ近傍においてはレーザ光Ｌが打ち消されるため、この付近において蛍光は発生しなくなる。

この戻り光Ｒは、１回目の戻り光Ｒと同様に、カメラ７８の受光面で受光される。ここで、焦点面ＦＳに蛍光があったとしても、戻り光は空間変調素子２１の作用によってカメラ７８の撮像素子上で打ち消しあう。これら励起光、戻り光の相互の作用により、焦点面ＦＳからの信号は打ち消される。

そして、カメラ１８により光電変換されて光量データとして、コントローラ７９の図示しない入力部に入力される。これが第２の画像データである。

これら１回目及び２回目の画像データ取得時において、焦点面ＦＳ以外においても互いの光が干渉することが考えられる。しかしながら、各々の光は焦点から離れると急激にその強度が弱くなる上、複数の光が重なることにより平均化されて影響は微々たるものになる。

また、本変形例では位相分布のパターンを細かくしている上に、位相差も４種類にしているためとりうる干渉のパターンが場所によって様々に変化することになり、焦点面に比較的近い位置でも干渉の影響が平均化されるため画像に与える影響は小さくなる。

コントローラ７９の図示しない画像生成部は、第１の画像データと第２の画像データとの差分の演算を行う。第２の画像データは焦点面ＦＳ近傍の蛍光情報が無い画像データなので、差分をとることより、焦点面近傍の蛍光情報のみを抽出することができる。すなわち、共焦点に類似した画像を取得できる。また、これにより、試料Ｓの所定深度で所定領域における画像データが生成される。

本実施例においては、走査光学系を不要にしたため、より一層高速に撮影が行えるという効果がある。さらに本方式においては、撮影時に常時レーザ光が照射されているため、走査光学系を用いて間歇的レーザ光が照射される場合に比べて、試料にあたる単位時間あたりのレーザ光強度を弱くすることができる。このため、細胞などの試料にダメージを与えることが少なく、また蛍光色素の退色を減らすことができるという効果もある。

また、１回目の画像は通常の落射蛍光画像と同等の画像のため、同時に落射蛍光画像を取得できるという効果も有する。

図１９は、図１４で用いるピンホールアレイ７５の変形である。図１６のピンホールアレイ７５ａでは、ピンホール径が５μｍ程度の場合には大きな回折角となり、対物レンズ２２の瞳にその一部しか光が到達しないため効率が悪い。そこで図１９のピンホールアレイ７５ｂのように各ピンホールの出射面にマイクロレンズＭＬを配置し、レーザ光のほとんどが対物レンズ２２の瞳に投影される発散角になるように構成する。これにより、図１６のピンホールアレイ７５ａよりも効率良くレーザ光を用いることができる。

図２０も、図１４で用いるピンホールアレイ７５の変形である。図２０のピンホールアレイ７５ｃでは、図１９のピンホールアレイ７５ｂのように各ピンホールの出射面にマイクロレンズＭＬを配置するとともに、１個おきのピンホールの入射面には位相をπだけシフトする位相シフト膜ＰＳを設ける。なお、マイクロレンズＭＬは図１９と同様にその発散角が最適になるように構成されている。

図２０のピンホールアレイ７５ｃとしては、例えばピンホール径は１０μｍでピンホールピッチは１２μｍのものを用いる。この場合、対物レンズ２２として倍率１００倍、ＮＡ１．４のものを用いる。この対物レンズ２２のエアリディスク半径は波長を４８８ｎｍとすると０．２１μｍ程度となる。

一方、ピンホールアレイ７５のピッチ１２μｍは１/１００に縮小投影されるため、０．１２μｍとなる。また、本実施例ではカメラ７８の画素サイズは例えば４μｍのものを用いる。従って、ピンホールアレイ７５を通過した各々の光は、焦点面において焦点の領域の一部が重なるように投影される。

また、１回目の画像撮影時には、隣接する焦点の光は位相がπだけずれているので、互いに打ち消し合い、照明光の強度分布は図２１の実線で示すようになる。この照明光の強度の頂点となる場所にそれぞれ蛍光物体を置いて撮影した場合、蛍光は撮影光学系の点像分布の影響によって広がりをみせるが、カメラ７８の受光面上で図２２に示すような分布を示す。ここで蛍光の頂点のピッチはピンホールのピッチと同じ１２μｍになる。カメラの画素サイズは４μｍで蛍光の頂点のピッチ１２μｍの１/２よりも小さく、これらのピッチを計測するのに十分なサンプリングとなっている。

ここで、蛍光のピッチ０．１２μｍはエアリディスク半径の０．２１μｍよりも小さいので、従来の顕微鏡よりもＸＹ方向に分解能良く観察できることを意味している。この状態で２回目の撮影を行って差分を取得することにより、ＸＹ方向に分解能が優れた共焦点画像を取得できる。

また、ピンホールアレイ７５ｃ全体を図２３に示すように光軸に垂直な平面上でピンホールのピッチの１／２ずつ移動させた状態でＡ→Ｂ→Ｃ→Ｄ４枚の共焦点画像を取得し、ピッチ間の間の情報を取得して補完を行うことにより、さらに高分解能な画像を取得できる。

１ 顕微鏡装置
２ 走査光学系
３ 顕微鏡光学系
４ レーザ光源
７ マイクロレンズディスク
７Ｍ マイクロレンズ
８ ピンホールディスク
８Ｐ ピンホール
９ 連結ドラム
１０ モータ
１６ カメラ
１７ コントローラ
２０ 反射ミラー
２１ 空間光変調素子
２２ 対物レンズ
２４ ディッシュ
３１ コントローラ制御部
３２ 光源制御部
３３ モータ制御部
３４ 空間光変調素子制御部
３６ 画像生成部
６２ 空間光変調素子
Ｌ レーザ光
Ｒ 戻り光
Ｓ 試料

Claims (8)

1. 試料に照射する可干渉性を有する照明光を発振する光源と、前記試料に照射された照明光による蛍光を戻り光として検出する検出部と、少なくとも前記照明光の光路に配置され、前記照明光の位相分布を制御する位相分布制御手段と、前記位相分布を変化させるように前記位相分布制御手段を制御するコントローラと、前記位相分布を変化させる前と変化させた後との前記戻り光の差分を演算して、前記試料の画像生成を行う画像生成部とを備えた顕微鏡装置において、
   前記コントローラは、前記光源から照射した前記照明光の全てに対して位相が等しくなるように前記位相分布制御手段を制御する第１の制御を行い、前記光源から照射した前記照明光の焦点に干渉を生じさせる位相分布に前記位相分布制御手段を制御する第２の制御を行い、
   前記画像生成部は、前記第１の制御を行ったときの前記戻り光と前記第２の制御を行ったときの戻り光との差分を演算することにより前記画像生成を行い、
   前記照明光を前記試料で焦点を結ばせる対物レンズの瞳位置もしくは瞳と等価な位置に前記位相分布制御手段を配置した
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記コントローラは、前記照明光に対して焦点において光が打ち消しあう干渉をするように前記位相分布制御手段を制御すること
   を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
3. 前記位相分布制御手段は、前記照明光に対して、前記試料までの光路の媒質の屈折率と前記試料の媒質の屈折率との屈折率差により生じる球面収差を補正する位相を与えること を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
4. 前記焦点を光軸に垂直な平面上で走査させることによって画像生成を行うこと
   を特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
5. 前記焦点を光軸に垂直な平面上に多数投影することによって画像生成を行うこと
   を特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
6. 可干渉光をピンホールアレイを通過させることにより、複数の発散光を発生させると共に前記ピンホールアレイを投影することにより前記多数の焦点を光軸に垂直な平面上に投影することを特徴とする請求項５記載の顕微鏡装置。
7. 前記ピンホールアレイの各ピンホールはレンズ効果を有する光学素子と組み合わされていることを特徴とする請求項６記載の顕微鏡装置。
8. 前記ピンホールアレイのとなりあうピンホールの通過する光の位相を変化させる位相変化手段を前記ピンホールアレイに設けたことを特徴とする請求項７記載の顕微鏡装置。