ITUB20154591A1 - Apparato di microscopia confocale e relativo procedimento di acquisizione ed elaborazione di immagini - Google Patents

Description

APPARATO DI MICROSCOPIA CONFOCALE E RELATIVO PROCEDIMENTO DI

ACQUISIZIONE ED ELABORAZIONE DI IMMAGINI

La presente invenzione concerne la microscopia in fluorescenza, in particolare la microscopia confocale, e riguarda un apparato di microscopia confocale, ed il relativo procedimento di acquisizione ed elaborazione di immagini, che combina l'uso di un disco rotante {spinning disk) con illuminazione strutturata, il quale apparato consente di ridurre grandemente il rumore presente nelle immagini acquisite, in particolare il livello del rumore di fondo dovuto alla fluorescenza dei piani fuori fuoco ed alla torbidità del campione, aumentando di conseguenza la risoluzione delle immagini acquisite in modo semplice, efficiente, affidabile, ed economico.

Negli ultimi decenni la microscopia a fluorescenza, chiamata anche microscopia a campo scuro, è diventata uno strumento fondamentale per l'attività di ricerca in campo biologico. L'uso di coloranti sintetici e, successivamente, delle proteine fluorescenti verdi o GFP (Green Fluorescent Protein) ha permesso di visualizzare con estrema risoluzione l'interno delle cellule sia per analisi morfologiche che funzionali, in quanto le GFP permettono la microscopia in fluorescenza anche in vivo.

Poiché le applicazioni in fluorescenza sono quelle attualmente più numerose e interessanti per la microscopia di volume, nel seguito della descrizione verrà fatto principalmente riferimento a tali applicazioni di microscopia confocale. Si deve, tuttavia, tenere presente che l'invenzione può essere applicata in settori differenti della microscopia confocale, come ad esempio la microscopia a trasmissione e la microscopia a riflessione.

Le tecniche confocali, principalmente microscopia confocale a scansione laser (CLSM: Confocal Laser Scanning Microscopy) e microscopia confocale a disco rotante (SDCM: Spinning Disk Confocal Microscopy), e le tecniche di superrisoluzione, quali la microscopia a luce strutturata e le tecniche basate sulla ridotta popolazione di cellule fluorescenti, come ad esempio la microscopia di localizzazione fotoattivata {PALM: Photo-Activated Localization Microscopy) e la microscopia a ricostruzione ottica stocastica {STORM: Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), hanno permesso un ulteriore passo avanti, dando la possibilità di migliorare la risoluzione laterale "x-y" {nel piano ortogonale all'asse ottico, per cui si assume che gli assi x e y giacciono nel piano del campione) e la risoluzione assiale "z" {lungo l'asse ottico che è ortogonale al piano del campione), e quindi hanno offerto la possibilità di effettuare delle ricostruzioni 3D della cellula con un elevatissimo dettaglio {con risoluzioni che possono arrivare sino a decine di nanometri).

In particolare, le tecniche di microscopia a luce strutturata si basano sull'illuminazione del campione {che causa l'eccitazione della fluorescenza) non in modo uniforme, bensì secondo un arrangiamento o pattern ben definito, in modo da ottenere informazioni spaziali aggiuntive dovute all'interazione tra il pattern di illuminazione ed il campione in esame. Acquisita una singola immagine di interazione {i.e. un sub-frame), questa viene memorizzata e viene spostato il pattern di illuminazione in una posizione successiva. Si procede così all'acquisizione di sub-frame successivi sino alla copertura totale del campione, e si procede poi alla composizione dei sub-frame in un'immagine finale del piano in esame mediante l'uso di algoritmi di deconvoluzione che dipendono specificamente dal tipo di pattern utilizzato.

Tuttavia tali tecniche confocali e di super-risoluzione presentano alcuni inconvenienti.

Innanzitutto, lo spessore del campione è limitato {generalmente è difficile effettuare misure su campioni spessi più di 20 micrometri) a causa degli effetti di diffusione dovuti alla torbidità del campione ed al fondo di fluorescenza dovuto ai piani fuori fuoco.

Inoltre, capacità di risoluzione limitata dal rapporto segnale-a-rumore o S/N, in cui al rumore totale contribuiscono sia il rumore proprio della strumentazione di acquisizione dell'immagine e del rumore dell'ambiente al contorno, sia il rumore del fondo di fluorescenza dovuto ai piani fuori fuoco. In particolare, questo rapporto limita l'utilizzazione di ordini elevati nelle polinomiali che costituiscono l'algoritmo di deconvoluzione utilizzato nei metodi di super-risoluzione in luce strutturata.

Infine, soprattutto le tecniche di super-risoluzione comportano elevati tempi di acquisizione che ne rendono difficile l'uso su cellule vive.

Facendo riferimento alle tecniche di microscopia a luce strutturata, il numero di sub-frame necessari per l'acquisizione dell'intero piano del campione ed il tipo di algoritmo di deconvoluzione si basano principalmente su due possibili classi di soluzioni: quelle che utilizzano un pattern quasi sinusoidale, come descritto da M.G.L. Gustafsson in Surpassing thè lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy, Journal of Microscopy, Voi.

198 (Pt. 2), pp 82-87, May 2000, e quelle che usano una matrice di punti, come descritto ad esempio nel documento WO2013144891.

La prima soluzione offre tempi di acquisizione minori in quanto, a seconda del processo di acquisizione deN'immagine e dell'algoritmo di deconvoluzione utilizzato, necessita tipicamente di un numero di sub-frame variabile da 3 a 12.

La seconda soluzione necessita di un numero di sub-frame molto più elevato, dipendente dal rapporto tra la dimensione del singolo punto e la spaziatura tra di essi, e può arrivare a richiedere anche oltre 100 sub-frame per singolo piano del campione.

Sebbene la prima soluzione offra prestazioni migliori in termini di velocità, tuttavia è più limitata nello spessore massimo del campione osservabile {fino a circa 20 micrometri) ed ha un limite di risoluzione dimostrato pari alla metà del limite di risoluzione ottico {dipendente dalla lunghezza d'onda e dall'obiettivo utilizzati).

La seconda soluzione, a scapito del maggior tempo di acquisizione, offre una maggior capacità di penetrazione {anche superiore a 100 micrometri) ed una risoluzione che sembra raggiungere valori migliori di 80 nanometri, secondo alcune fonti di letteratura.

Tuttavia, entrambe le tecniche sono limitate dal rumore presente nel segnale e, quindi, dal livello dì rumore di fondo dovuto alla fluorescenza dei piani fuori fuoco ed alla torbidità del campione. Inoltre poiché la fluorescenza dei piani fuori fuoco ha la stessa dipendenza del segnale dalla luce di eccitazione, l'aumento dell'intensità dell'eccitazione o del tempo di esposizione non può migliorare le prestazioni oltre il limite dovuto alla saturazione del sensore di acquisizione, e.g. un sensore a CCD o sCMOS (scientific CMOS).

In questo contesto, viene ad inserirsi la soluzione proposta secondo la presente invenzione che consente di risolvere i succitati problemi delle soluzioni della tecnica anteriore.

Lo scopo della presente invenzione è, pertanto, quello di aumentare il segnale di throughput (i.e. il segnale utile), di esaminare anche campioni molto spessi, di migliorare il rapporto segnale-a-rumore deN'immagine permettendo l'uso di ordini elevati negli algoritmi di analisi dell'immagine, aumentando così la risoluzione delle immagini acquisite secondo la tecnica della microscopia confocale in modo semplice, efficiente, affidabile, ed economico.

Forma oggetto specifico della presente invenzione un apparato di microscopia confocale, comprendente:

un componente di generazione di luce strutturata configurato per essere illuminato da un fascio luminoso di base e per generare un fascio di luce strutturata focalizzato su un primo piano;

uno spinning disk configurato per ricevere detto fascio di luce strutturata e per trasmettere un fascio risultante di eccitazione ad un'ottica di un microscopio focalizzata su un piano di un campione, in cui lo spinning disk giace su un secondo piano e comprende un substrato a forma di disco composto da un materiale otticamente trasparente, il substrato dello spinning disk comprendendo una prima superficie planare ed una seconda superficie planare contrapposta ed una maschera con pattern disposta su una tra la prima superficie e la seconda superficie e comprendente almeno un settore provvisto di una o più aperture a fenditura continua a spirale, in cui la maschera con pattern od una sua superficie esterna è composta da un materiale altamente nero opaco alla luce;

un alloggiamento configurato per alloggiare su un terzo piano un sensore di acquisizione configurato per rilevare un fascio fluorescente emesso da detto piano del campione;

un insieme di lenti relay configurato per coniugare otticamente il primo piano, il secondo piano e detto piano del campione al terzo piano; mezzi ottici configurati per trasmettere detto fascio di luce strutturata dal componente di generazione di luce strutturata a detto piano del campione e detto fascio fluorescente emesso da detto piano del campione a detto alloggiamento configurato per alloggiare il sensore di acquisizione; e mezzi di movimentazione configurati per movimentare il componente di generazione di luce strutturata, in modo da spostare il fascio di luce strutturata nel primo piano, e lo spinning disk nel secondo piano.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione, il componente di generazione di luce strutturata può comprendere un substrato di generazione di luce strutturata provvisto di almeno un settore avente una maschera di materiale opaco alla luce secondo un pattern geometrico provvisto di una pluralità di aperture in materiale otticamente trasparente configurate per far passare detto fascio luminoso di base in modo tale da ottenere un fascio a luce strutturata, per cui il primo piano è il piano su cui giace il substrato di generazione di luce strutturata.

Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, il substrato di generazione di luce strutturata può essere realizzato nel materiale otticamente trasparente avente un rivestimento opaco alla luce provvisto di dette aperture.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell'invenzione, il materiale otticamente trasparente in cui può essere realizzato il substrato di generazione di luce strutturata può essere vetro.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione, il rivestimento opaco alla luce del substrato di generazione di luce strutturata può essere realizzato in materiale a base di cromo.

Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, dette aperture di cui è provvisto il rivestimento possono essere realizzate mediante fotolitografia.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell'invenzione, dette aperture di cui è provvisto il rivestimento possono essere selezionate dal gruppo comprendente:

- aperture lineari parallele, e

- fori circolari (250) disposti secondo un pattern a matrice.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione, quando dette aperture di cui è provvisto il rivestimento sono aperture lineari parallele, possono avere larghezza variabile da 10 micrometri a 30 micrometri ed una distanza mutua variabile da 50 micrometri a 300 micrometri.

Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, quando dette aperture di cui è provvisto il rivestimento sono fori circolari disposti secondo un pattern a matrice, i fori circolari possono avere diametro variabile da 10 micrometri a 30 micrometri.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell'invenzione, quando dette aperture di cui è provvisto il rivestimento sono fori circolari disposti secondo un pattern a matrice, i fori circolari possono essere disposti ai vertici di parallelogrammi uguali contigui, opzionalmente rombi, più opzionalmente quadrati, ed ogni foro circolare può distare dai quattro fori circolari più vicini per una stessa distanza opzionalmente variabile da 50 micrometri a 300 micrometri.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione, il componente di generazione di luce strutturata può comprendere un array di microlenti di generazione di luce strutturata, comprendente un substrato provvisto su una faccia di una pluralità di microlenti configurate per generare detto fascio a luce strutturata focalizzato su un piano focale.

Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, dette microlenti possono essere selezionate dal gruppo comprendente:

microlenti generalmente cilindriche lineari configurate per focalizzare il fascio di luce strutturata sul piano focale secondo linee parallele, e

mi ero lenti generalmente semicircolari configurate per focalizzare il fascio di luce strutturata sul piano focale secondo spot circolari disposti secondo un pattern a matrice.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell'invenzione, quando dette microlenti sono microlenti generalmente cilindriche lineari, queste possono essere configurate per focalizzare il fascio di luce strutturata sul piano focale secondo linee parallele aventi larghezza variabile da 10 micrometri a 30 micrometri ed una distanza mutua variabile da 50 micrometri a 300 micrometri.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione, quando dette microlenti sono microlenti generalmente semicircolari, queste possono essere configurate per focalizzare il fascio di luce strutturata sul piano focale secondo spot circolari aventi diametro variabile da 10 micrometri a 30 micrometri.

Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, quando dette microlenti sono microlenti generalmente semicircolari, queste possono essere configurate per focalizzare il fascio di luce strutturata sul piano focale secondo spot circolari disposti ai vertici di parallelogrammi uguali contigui, più opzionalmente rombi, ancora più opzionalmente quadrati, per cui ogni spot circolare può distare dai quattro spot circolari più vicini per una stessa distanza variabile da 50 micrometri a 300 micrometri.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell'invenzione, il substrato dell'array di microlenti può essere provvisto di un rivestimento opaco alla luce foto litografato secondo un pattern geometrico tale che il rivestimento manca in corrispondenza delle microlenti, per cui ogni microlente è otticamente allineata con una corrispondente apertura realizzata nel rivestimento.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione, il rivestimento opaco alla luce dì cui è provvisto il substrato dell'array di microlenti può essere realizzato in materiale a base di cromo.

Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, il componente di generazione di luce strutturata può comprendere un dispositivo digitale a microspecchi.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell'invenzione, detto insieme di lenti relay può comprendere una prima lente relay, una seconda lente relay ed una terza lente relay, e detti mezzi ottici possono comprendere un filtro dicroico, in cui la prima lente relay è configurata per essere attraversata da detto fascio a luce strutturata, il filtro dicroico è configurato per riflettere detto fascio di luce strutturata proveniente dalla prima lente relay verso la seconda lente relay che è configurata per focalizzare detto fascio di luce strutturata sullo spinning disk, il filtro dicroico essendo altresì configurato per lasciar passare detto fascio fluorescente emesso proveniente dallo spinning disk verso detto alloggiamento configurato per alloggiare il sensore di acquisizione.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione, l'apparato può comprendere inoltre:

una sorgente luminosa configurata per emettere detto fascio luminoso di base;

un sensore di acquisizione alloggiato in detto alloggiamento e configurato per rilevare un fascio fluorescente emesso da detto piano del campione; ed

una unità centrale di elaborazione configurata per ricevere dal sensore di acquisizione una pluralità di acquisizioni parziali di detto piano del campione e per comporre tale pluralità di acquisizioni parziali in un'immagine finale di detto piano del campione mediante l'elaborazione di algoritmi di deconvoluzione di microscopia a luce strutturata.

Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, l'unità centrale di elaborazione può comprendere uno o più processori grafici o GPU.

Forma ancora oggetto specifico della presente invenzione un procedimento di acquisizione ed elaborazione di immagini in microscopia confocale a luce strutturata, comprendente le seguenti fasi:

A. far attraversare uno spinning disk da un fascio di luce strutturata ottenendo un fascio risultante di luce di eccitazione, in cui lo spinning disk comprende un substrato a forma di disco composto da un materiale otticamente trasparente, il substrato dello spinning disk comprendendo una prima superficie planare ed una seconda superficie planare contrapposta ed una maschera con pattern disposta su una tra la prima superficie e la seconda superficie e comprendente almeno un settore provvisto di una o più aperture a fenditura continua a spirale, in cui la maschera con pattern od una sua superficie esterna è composta da un materiale altamente nero opaco alla luce;

B. focalizzare il fascio risultante di eccitazione su un piano di un campione, C. acquisire una pluralità di acquisizioni parziali di detto piano del campione, e

D. comporre tale pluralità di acquisizioni parziali in un'immagine finale di detto piano del campione mediante l'elaborazione di algoritmi di deconvoluzione di microscopia a luce strutturata.

L'invenzione è basata sull'utilizzazione congiunta di un disco rotante {spinning disk) provvisto di almeno un pattern a fenditura continua e dell'illuminazione strutturata con pattern a punti o a barre, in cui vengono applicate tecniche di elaborazione di immagini acquisite in microscopia confocale con illuminazione strutturate, come ad esempio quelle descritte dal documento WO2013144891 o quelle descritte da R. Heintzmann in Structured illumination methods, in Ha nd hook of Biological Confocal microscopy, capitolo 13, J.B. Pawley editor, New York, 2006.

Ciò consente di ottenere significativi vantaggi rispetto alla tecnica anteriore, e.g. permettendo di utilizzare la funzione della luce strutturata per migliorare grandemente le prestazioni in termini di risoluzione spaziale, mentre lo spinning disk permette di ridurre il rumore di fondo, in quanto le componenti dovute ai piani fuori fuoco vengono bloccate dalla configurazione a fenditura continua del pattern dello spinning disk.

In particolare, la configurazione a fenditura continua del pattern dello spinning disk permette di ottenere un elevato valore di segnale di throughput {i.e. di segnale utile), migliorando di conseguenza il rapporto Segnale/Rumore e quindi permettendo l'uso dì algoritmi di analisi {i.e. algoritmi di deconvoluzione) di ordine elevato e, in generale, diminuendo il rumore nella ricostruzione finale dell'immagine dell'intero piano del campione.

L'apparato di microscopia confocale secondo l'invenzione, ed il relativo procedimento di acquisizione ed elaborazione di immagini, consente, tramite l'eliminazione delle componenti di rumore {precisamente il rumore del fondo fluorescente e diffondente) dovuto ai piani fuori fuoco, di aumentare la profondità di penetrazione (Le. lo spessore dei campioni esaminabili) e di utilizzare un'illuminazione più intensa senza l'effetto di saturazione del rilevatore (i.e. del sensore di acquisizione) dovuto ai contributi indesiderati dei piani fuori fuoco, in quanto fisicamente schermati dal pattern dello spinning disk.

La presente invenzione verrà ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue preferite forme di realizzazione, con particolare riferimento alle Figure dei disegni allegati, in cui:

la Figura 1 mostra una vista schematica della porzione di acquisizione di una prima forma di realizzazione dell'apparato di microscopia confocale secondo l'invenzione;

la Figura 2 mostra una vista schematica della porzione di acquisizione di una seconda forma di realizzazione dell'apparato di microscopia confocale secondo l'invenzione;

la Figura 3A mostra una vista in pianta dall'alto del componente di generazione di luce strutturata della porzione di acquisizione dell'apparato di Figura 1, e la Figura 3B mostra un particolare ingrandito del componente di Figura 3A;

la Figura 4A mostra una vista in pianta dall'alto di una versione alternativa del componente di generazione di luce strutturata della porzione di acquisizione dell'apparato di Figura 1, e la Figura 4B mostra un particolare ingrandito del componente di Figura 4A;

la Figura 5 mostra una vista in sezione trasversale di un particolare del componente di generazione di luce strutturata della porzione di acquisizione dell'apparato di Figura 2;

la Figura 6A mostra una vista in pianta dall'alto dello spinning disk della porzione di acquisizione dell'apparato di Figura 1, e la Figura 6B mostra un particolare ingrandito dello spinning disk di Figura 6A;

la Figura 7 mostra una vista schematica in sezione trasversale dello spinning disk di Figura 6A; e

la Figura 8 mostra una vista schematica della porzione di elaborazione dell'apparato di Figura 1.

Nelle Figure numeri di riferimento identici saranno utilizzati per elementi analoghi.

La Figura 1 mostra schematicamente una prima forma di realizzazione dell'apparato di microscopia confocale secondo l'invenzione, indicata in generale con il numero di riferimento 100. Si può osservare che l'apparato 100 di microscopia confocale comprende una sorgente luminosa 1 a LED o laser che, tramite una fibra ottica 14, invia un fascio luminoso di base ad un gruppo ottico 12, comprendente una o più lenti. Il gruppo ottico 12 fa passare la luce raccolta dalla fibra ottica 14 (i.e. il fascio luminoso di base) attraverso un substrato 2 di generazione di luce strutturata provvisto di due settori aventi maschere con arrangiamenti (pattern) geometrici aventi aperture per il passaggio della luce in modo tale da ottenere un fascio a luce strutturata; in altre parole, il substrato 2 opera da componente di generazione di luce strutturata. Le caratteristiche del substrato 2, che è realizzato in un materiale otticamente trasparente, opzionalmente vetro che viene foto -litografato per ottenere le maschere di generazione di luce strutturata, sono descritte in maggiore dettaglio più avanti.

Il fascio a luce strutturata attraversa una prima lente relay 4a (che, come noto, è un gruppo ottico formato da una o più lenti convenzionali e/o da un dispositivo ottico acromatico), che può essere spostata lungo l'asse longitudinale del ramo del percorso ottico del fascio a luce strutturata in cui si trova la prima lente relay 4a (per cui la prima lente relay 4a può essere avvicinata al od allontanata dal substrato 2), e prosegue fino ad un filtro dicroico 5 che lo riflette verso una seconda lente relay 4b, che può essere spostata lungo l'asse longitudinale del ramo del percorso ottico del fascio a luce strutturata in cui si trova la seconda lente relay 4b (per cui la seconda lente relay 4b può essere avvicinata al od allontanata dal filtro dicroico 5). Il fascio a luce strutturata attraversa la seconda lente relay 4b che lo focalizza su un disco rotante {spinning disk) 7, il quale trasmette un fascio risultante di eccitazione ad un'ottica di un microscopio 15, comprendente lente(lenti) 8 di tubo ed un obiettivo 9, la quale a sua volta trasmette il fascio di eccitazione focalizzandolo su un piano di un campione 10.

Il campione 10 emette a sua volta un fascio fluorescente che torna indietro, attraversando l'ottica del microscopio 15, lo spinning disk 7 e la seconda lente relay 4b, verso il filtro dicroico 5, che lo lascia passare verso un filtro 6 di emissione che a sua volta lascia passare il fascio fluorescente emesso in modo selettivo. Opzionalmente, il filtro 6 di emissione può comprendere due o più porzioni ognuna delle quali è configurata per essere attraversata solo da fascio fluorescente avente un corrispondente range di lunghezza d'onda {i.e. un corrispondente range di frequenza); in tal caso, il filtro 6 di emissione può essere vantaggiosamente montato su un selettore di lunghezza d'onda, quale una ruota motorizzata (non mostrata) e/o dispositivi piezoelettrici e/o altri dispositivi motorizzati, che consente la selezione automatica (computerizzata) di una specifica porzione del filtro 6 attraversabile solo da fascio fluorescente avente un desiderato range di lunghezza d'onda. Dopo aver attraversato il filtro 6 di emissione, il fascio fluorescente emesso filtrato attraversa una terza lente relay 4c che lo focalizza su un sensore 11 di acquisizione, opzionalmente un sensore a CCD od un sensore a sCMOS. La terza lente relay 4c può essere spostata lungo l'asse longitudinale del ramo del percorso ottico del fascio fluorescente emesso in cui si trova la terza lente relay 4c (per cui la terza lente relay 4c può essere avvicinata al od allontanata dal filtro 6 di emissione).

In particolare, la prima lente relay 4a, la seconda lente relay 4b e la terza lente relay 4c formano un insieme di lenti relay che coniuga otticamente i piani ottici su cui giace il substrato 2 (piano 3a, i.e. il piano su cui è focalizzato il fascio di luce strutturata), su cui giace lo spinning disk 7 (piano 3b), ed il piano che viene acquisito del campione 10 al piano 3c su cui giace il sensore 11 di acquisizione.

Allo scopo di poter acquisire un'immagine di un intero piano del campione 10, è necessario scansionare quest'ultimo movimentando, nel piano perpendicolare all'asse ottico, sia il componente di generazione di luce strutturata (Le., il substrato 2) che lo spinning disk 7, tramite rispettivi gruppi automatizzati di movimentazione, e.g. comprendenti dispositivi piezoelettrici e/o altri dispositivi motorizzati.

La Figura 2 mostra schematicamente una seconda forma di realizzazione dell'apparato di microscopia confocale secondo l'invenzione, indicata in generale con il numero di riferimento 200. L'apparato 200 di Figura 2 differisce dall'apparato 100 di Figura 1 per il fatto che, invece del substrato 2 di generazione di luce strutturata, è presente un array 13 di microlenti di generazione di luce strutturata, comprendente un substrato provvisto su una faccia (vantaggiosamente sulla faccia configurata per trasmettere il fascio di luce strutturata che è rivolta verso la prima lente relay 4a) di microlenti. In tal caso, il gruppo ottico 12 fa passare la luce raccolta dalla fibra ottica 14 (i.e. il fascio luminoso di base) attraverso l'array 13 di microlenti di generazione di luce strutturata, provvisto di due settori aventi caratteristiche geometriche delle microlenti differenti, in modo tale da ottenere un fascio a luce strutturata che è focalizzato su un piano focale 3a leggermente distanziato dal piano su cui giace l'array 13 di microlenti. Pertanto, nell'apparato 200 di Figura 2 l'array 13 di microlenti, che è realizzato in un materiale otticamente trasparente, opzionalmente vetro, opera da componente di generazione di luce strutturata. In tal caso, la prima lente relay 4a, la seconda lente relay 4b e la terza lente relay 4c formano un insieme di lenti relay che coniuga otticamente il piano ottico, i.e. il piano focale 3a, dell'array 13 di microlenti (i.e. il piano su cui è focalizzato il fascio di luce strutturata), il piano su cui giace lo spinning disk 7 (piano 3b), ed il piano che viene acquisito del campione 10 al piano 3c su cui giace il sensore 11 di acquisizione.

La Figura 3A mostra una vista in pianta del substrato 2 di generazione di luce strutturata dell'apparato 100 di Figura 1 che comprende un primo settore 20A ed un secondo settore 20B aventi maschere con pattern geometrici simili. In proposito, la Figura 3B mostra un particolare ingrandito del primo settore 20A, in cui è visibile che il substrato 2 ha un rivestimento 210 opaco alla luce, opzionalmente realizzato in materiale a base di cromo (i.e., materiali a base di ossido di cromo (Cr203) od a base di una miscela di Cr203ed altre specie come cromo (Cr) e biossido di silicio (Si02)), su cui sono realizzate mediante foto litografia delle aperture lineari parallele 200, aventi una medesima larghezza {opzionalmente variabile da 10 micrometri - μιτι - a 30 micrometri) ed una distanza mutua costante {opzionalmente variabile da 50 micrometri a 300 micrometri), attraverso le quali può passare la luce. In generale, le dimensioni della larghezza e/o della distanza tra le aperture lineari parallele di uno dei due settori sono differenti da quelle dell'altro settore; ad esempio, nel substrato 2 di generazione di luce strutturata di Figura 3A, le dimensioni della larghezza e della distanza tra le aperture lineari parallele 200 del primo settore 20A sono maggiori delle dimensioni, rispettivamente, della larghezza e della distanza tra le aperture lineari parallele del secondo settore 20B. Inoltre, in altre forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, il substrato 2 di generazione di luce strutturata può comprendere un numero di settori differente da due, ad esempio uno, o quattro, od un numero di settori pari ad una potenza di 2; ogni settore ha rispettive caratteristiche geometriche del pattern, ed il limite sull'area del singolo settore è dato dall'area desiderata dell'immagine acquisita. Ovviamente, il numero di settori e le caratteristiche geometriche dei relativi pattern influenzano la modalità di acquisizione dell'immagine, ovvero la scansione {gli spostamenti necessari) del substrato 2 sul piano ortogonale all'asse ottico.

La Figura 4A mostra una vista in pianta dall'alto di una versione alternativa del substrato 2 di generazione di luce strutturata dell'apparato 100 di Figura 1 che comprende un primo settore 25A ed un secondo settore 25B aventi maschere con pattern geometrici simili. In proposito, la Figura 4B mostra un particolare ingrandito del primo settore 25A, in cui è visibile che il substrato 2 ha un rivestimento 260 opaco alla luce, opzionalmente realizzato in materiale a base di cromo {i.e., materiali a base di ossido di cromo {Cr203) od a base di una miscela di Cr203ed altre specie come cromo {Cr) e biossido di silicio (Si02)), su cui sono realizzate medìante foto litografi a una pluralità di fori circolari 250 attraverso i quali può passare la luce. In particolare, la pluralità di fori circolari 250 {il cui diametro è opzionalmente variabile da 10 micrometri a 30 micrometri) è disposta secondo un pattern a matrice, in cui i fori circolari sono opzionalmente disposti ai vertici di parallelogrammi uguali contigui, più opzionalmente rombi, ancora più opzionalmente quadrati, per cui ogni foro circolare 250 dista dai quattro fori circolari 250 più vicini per la stessa distanza {opzionalmente variabile da 50 micrometri a 300 micrometri). In generale, il diametro di ogni foro circolare e/o la sua distanza dai quattro fori circolari più vicini in uno dei due settori sono differenti, rispettivamente, dal diametro di ogni foro circolare e dalla sua distanza dai quattro fori circolari più vicini nell'altro settore; ad esempio, nel substrato 2 di generazione di luce strutturata di Figura 4A, il diametro di ogni foro circolare 250 e la sua distanza dai quattro fori circolari 250 più vicini del primo settore 25A sono maggiori, rispettivamente, del diametro di ogni foro circolare e della sua distanza dai quattro fori circolari più vicini del secondo settore 25B. Anche in questo caso, il substrato 2 di generazione di luce strutturata può comprendere un numero di settori, ognuno provvisto di una rispettiva pluralità di fori circolari disposti secondo un pattern a matrice, differente da due, ad esempio uno, o quattro, od un numero di settori pari ad una potenza di 2; ogni settore ha rispettive caratteristiche geometriche del pattern, ed il limite sull'area del singolo settore è dato dall'area desiderata dell'immagine acquisita. Ovviamente, il numero di settori e le caratteristiche geometriche dei relativi pattern influenzano la modalità di acquisizione dell'immagine, ovvero la scansione {gli spostamenti necessari) del substrato 2 sul piano ortogonale all'asse ottico.

Analogamente ai pattern geometrici mostrati nelle Figure 3A, 3B, 4A e 4B per i substrati 2 di generazione di luce strutturata dell'apparato 100 di Figura 1, l'array 13 di microlenti di Figura 2 può essere provvisto, sulla sua faccia rivolta verso la prima lente relay 4a (i.e. sulla faccia planare che focalizza il fascio di luce strutturata sul piano focale 3a mostrato in Figura 2), di microlenti generalmente cilindriche {lineari) tali da realizzare un pattern geometrico simile a quello delle Figure 3A e 3B, dove tali microlenti generalmente cilindriche sostituiscono le aperture lineari parallele, o di microlenti generalmente semisferiche tali da realizzare pattern geometrico simile a quello delle Figure 4A e 4B, dove tali microlenti generalmente semisferiche sostituiscono i fori circolari. Mediante questa configurazione, il fascio di luce strutturata viene focalizzato sul piano focale 3a di Figura 2 secondo linee parallele simili al pattern geometrico delle Figure 3A e 3B o secondo spot circolari simili al pattern geometrico delle Figure 4A e 4B. In tal caso il substrato dell'array 13 può avere, sulla faccia planare contrapposta a quella rivolta verso la prima lente relay 4a {i.e. sulla faccia planare che riceve il fascio luminoso di base), un rivestimento opaco alla luce, opzionalmente realizzato in materiale a base di cromo, foto litografato secondo un pattern geometrico tale che il rivestimento manca in corrispondenza delle micro lenti, per cui tale rivestimento opaco alla luce è simile al rivestimento 210 di Figure 3A e 3B quando le microlenti sono microlenti generalmente cilindriche, oppure è simile al rivestimento 260 di Figure 4A e 4B quando le microlenti sono microlenti generalmente semisferiche; tuttavia, si deve tenere presente che tale rivestimento del substrato dell'array 13 non è una caratteristica essenziale e può anche non essere presente.

La Figura 5 mostra una vista in sezione trasversale di una porzione dell'array 13 di microlenti di Figura 2 in corrispondenza di una microlente generalmente cilindrica 596; si deve tuttavia tenere presente che, anche quando l'array 13 di microlenti di Figura 2 è provvisto di microlenti generalmente semisferiche, la sezione trasversale in corrispondenza di una microlente è simile {se non esattamente uguale) a quella mostrata in Figura 5.

Come detto, l'array 13 di microlenti include un substrato 590 avente, sulla faccia planare contrapposta a quella rivolta verso la prima lente relay 4a {i.e. sulla faccia planare che riceve il fascio luminoso di base), un rivestimento foto litografato 592 opaco alla luce, che non è presente in corrispondenza delle microlenti generalmente cilindriche, una delle quali, indicata dal numero di riferimento 596, è mostrata in Figura 5, di cui è provvista la faccia del substrato 590 rivolta verso la prima lente relay 4a {i.e. la faccia planare che focalizza il fascio di luce strutturata sul piano focale 3a mostrato in Figura 2). In altre parole, le microlenti generalmente cilindriche 596 sono posizionate in modo tale che ogni microlente generalmente cilindrica 596 è otticamente allineata con una corrispondente apertura lineare continua 576 realizzata nel rivestimento fotolitografato 592 opaco alla luce (così come le microlenti generalmente semisferiche sono posizionate in modo tale che ogni microlente generalmente semisferiche è otticamente allineata con una corrispondente apertura circolare realizzata nel rivestimento foto litografato opaco alla luce). Mediante questa configurazione, ogni microlente generalmente cilindrica 596 è posizionata direttamente attraverso lo spessore dell'array 13 in corrispondenza di una apertura lineare continua 576 del rivestimento 592. Quindi, qualsiasi luce trasmessa attraverso una data apertura lineare continua 576 del rivestimento 592 passa attraverso una corrispondente microlente generalmente cilindrica 596, che la focalizza sul piano focale 3a mostrato in Figura 2. Come mostrato in Figura 5, ogni microlente generalmente cilindrica 596 (così come ogni microlente generalmente semisferica) dell'array 13 ha una sezione trasversale generalmente semicircolare. Nel presente contesto, il termine "generalmente semicircolare" è assunto significare che non è necessario che la curvatura della superficie esterna della microlente generalmente cilindrica 596 (così come di una microlente generalmente semisferica) dell'array 13 in tutte le forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione corrisponda esattamente alla curva di un cerchio. Invece, la curvatura della microlente generalmente cilindrica 596 (così come di una microlente generalmente semisferica) può avere una eccentricità differente da un cerchio esatto. Come esempi non limitativi, la curvatura della microlente generalmente cilindrica 596 (così come di una micro lente generalmente semisferica) può essere ellittica, parabolica, iperbolica o addirittura asferica (Le. corrispondente ad una superficie conica con raggi di curvatura variabili). Per comodità, il termine "generalmente semicircolare" comprende tutte queste forme di realizzazione. Le microlenti dell'array 13 possono essere composte dallo stesso materiale del substrato 590, e possono essere formate integralmente sullo stesso substrato 590, ad esempio durante la sua fabbricazione. Ad esempio, possono essere formate mediante un processo di stampaggio od attacco.

Si deve tenere presente che altre forme di realizzazione dell'apparato di microscopia confocale secondo l'invenzione possono comprendere altri componenti di generazione di luce strutturata differenti dal substrato 2 di Figura 1 e dall'array 13 di microlenti di Figura 2, come ad esempio un dispositivo digitale a microspecchi (DMD - Digital Micromirror Device), rimanendo sempre neN'ambito di protezione dell'invenzione.

La Figura 6A è una vista in pianta dall'alto di un esempio di uno spinning disk 7 secondo alcune forme di realizzazione. Lo spinning disk 7 include generalmente una sezione centrale 264 ed una sezione esterna 268 che coassialmente circonda la sezione centrale 264. La sezione centrale 264 può essere configurata {e.g., come un mozzo) per fissare lo spinning disk 7 ad un albero per consentire la rotazione motorizzata dello spinning disk 7. L'albero può essere attaccato ad un lato della sezione centrale 264 e/o può passare attraverso un foro centrale 270 dello spinning disk 7. La sezione esterna 268 comprende una corona circolare esterna 272 a fenditure continue ed una corona circolare interna 278 a fenditure continue che pure circondano coassialmente la sezione centrale 264. Rispetto all'asse centrale dello spinning disk 7, ognuna delle corone circolari esterna 272 ed interna 278 ha un raggio interno ed un raggio esterno, e si estende per una distanza radiale dal raggio interno al raggio esterno, per cui il raggio esterno della corona circolare interna 278 è minore del raggio interno della corona circolare esterna 272; opzionalmente, la distanza radiale della corona circolare interna 278 è uguale alla distanza radiale della corona circolare esterna 272. Le corone circolari esterna 272 ed interna 278 a fenditure continue possono essere, o possono essere formate da, rispettive maschere con pattern come descritto più avanti. Ognuna delle corone circolari esterna 272 ed interna 278 a fenditure continue comprende una pluralità di aperture 276 arrangiate lungo una pluralità di percorsi a spirale sulla faccia planare dello spinning disk 7. Nell'esempio illustrato, la corona circolare esterna 272 include trentasei percorsi a spirale, mentre la corona circolare interna 278 include ventiquattro percorsi a spirale; si deve tuttavia tenere presente che il numero dei percorsi a spirale non è una caratteristica essenziale dell'invenzione, ed altre varianti dello spinning disk possono includere più o meno di trentasei e ventiquattro percorsi a spirale per le corone circolari a fenditure contìnue. I percorsi a spirale possono essere arrangiati adiacenti l'uno all'altro in un pattern a partenze multiple, tale che i percorsi a spirale partono ciascuno ad un primo raggio dello spinning disk 7 {e.g., il raggio interno della corona circolare esterna 272 ed il raggio interno della corona circolare interna 278) e finiscono ad un secondo raggio dello spinning disk 7 maggiore del primo raggio (e.g., il raggio esterno della corona circolare esterna 272 ed il raggio esterno della corona circolare interna 278). In alcune forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, i percorsi a spirale possono seguire (o sostanzialmente seguire) spirali archimedee che possono essere espresse con r = a b(&), in cui il raggio r e l'angolo tf sono le coordinate polari ed i parametri a e b sono numeri reali. In altre forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, i percorsi a spirale possono essere non-archimedei. Inoltre, in altre forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, lo spinning disk 7 può comprendere un numero di corone circolari a fenditure continue differente da due, ad esempio uno o quattro o una differente potenza di 2. Ovviamente, il numero di settori e le caratteristiche geometriche dei relativi pattern influenzano la modalità di acquisizione dell'immagine, ovvero la scansione (gli spostamenti necessari) dello spinning disk 7 sul piano ortogonale all'asse ottico. In altre forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, ciascuna apertura 276 dello spinning disk 7 è una fessura continua a spirale che si estende lungo un corrispondente percorso a spirale dall'inizio alla fine di quel percorso a spirale.

La Figura 6B mostra un particolare ingrandito 372 della corona circolare esterna 272 a fenditure continue dello spinning disk 7 di Figura 6A. Le aperture 276 sono fessure a spirale continua. Aperture adiacenti 276 sono distanziate tra loro di una distanza di separazione (o "passo" o "pitch") indicata come 380 in Figura 6B. Opzionalmente, la distanza 380 di separazione varia da 100 micrometri a 2 millimetri, più opzionalmente da 100 micrometri a 1 millimetro. In alcune forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, la distanza 380 di separazione è costante per l'intera estensione dei percorsi a spirale presi dalle aperture 276, mentre in altre forme di realizzazione la distanza 380 di separazione può variare. In alcune forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, la larghezza di ogni apertura 276 a spirale (la distanza tra bordi a spirale contrapposti dell'apertura 276, i.e., la dimensione trasversale dell'apertura 276) è dell'ordine dei micrometri, opzionalmente variabile da 10 micrometri a 100 micrometri, più opzionalmente da 20 micrometri a 70 micrometri. In generale, la distanza di separazione e/o le dimensioni della larghezza delle aperture a spirale continua di una delle due corone circolari esterna 272 ed interna 278 sono differenti da quelle dell'altra corona circolare; ad esempio, nello spinning disk 7 di Figura 5A, la distanza 380 di separazione e la larghezza delle aperture 276 a spirale continua della corona circolare esterna 272 sono maggiori di quelle della corona circolare interna 278. In alcune forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, la larghezza delle aperture a spirale continua è costante sull'intera lunghezza dell'apertura, mentre in altre forme di realizzazione la larghezza può variare. Lo spinning disk 7 può comprendere un numero di corone circolari, ognuna provvisto di rispettive aperture a fenditura continua arrangiate a spirale, differente da due, ad esempio uno, o quattro, od un numero di settori pari ad una potenza di 2; ogni corona circolare ha rispettive caratteristiche geometriche delle aperture a fenditura continua arrangiate a spirale, in funzione dell'area desiderata dell'immagine acquisita. Ovviamente, il numero di corone circolari e le caratteristiche geometriche dei relativi pattern influenzano la modalità di acquisizione dell'immagine, ovvero la scansione (gli spostamenti necessari) dello spinning disk 7 sul piano ortogonale all'asse ottico.

La Figura 7 è una vista schematica in sezione trasversale di uno spinning disk 416 secondo alcune altre forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione. Lo spinning disk 416 può includere un primo lato planare 456, un secondo lato planare contrapposto 460, ed un foro centrale 470. Lo spessore dello spinning disk 416 è definito tra il primo lato 456 ed il secondo lato 460. Lo spinning disk 416 può inoltre includere un substrato 490 a forma di disco che largamente detta le dimensioni complessive dello spinning disk 416, ed una maschera 492 con pattern. Il substrato 490 include una prima superficie planare ed una seconda superficie planare contrapposta corrispondenti al primo lato 456 ed al secondo lato 460, rispettivamente. Lo spessore del substrato 490 si estende dalla prima superficie alla seconda superficie lungo una direzione ortogonale alla prima superficie ed alla seconda superficie. In alcune forme dì realizzazione, lo spessore del substrato 490 è in un intervallo da 0,5 mm a 2 mm. Il substrato 490 può essere composto da qualsiasi materiale otticamente trasparente adatto per l'uso in un microscopio confocale. Esempi di materiali per il substrato 490 includono, ma non sono limitati a, vari vetri e quarzo (incluso quarzo fuso), nonché certi polimeri otticamente trasparenti. Un esempio non limitativo di vetro è vetro borosilicato, quali vetri BOROFLOAT<®>disponibili dalla SCHOTT North America, Ine., Louisville, Kentucky, USA. In alcune forme di realizzazione, il substrato 490 può includere una sezione centrale 464 che è distinta dal substrato 490 e può essere composta da un materiale differente. La maschera 492 con pattern include un pattern od arrangiamento a spirale di aperture 476 come descritto per lo spinning disk 7 mostrato in Figure 5A e 5B. La maschera 492 con pattern è disposta sulla prima superficie o sulla seconda superficie del substrato 490.

In generale, è desiderabile minimizzare la riflettanza della luce incidente sulla superficie della maschera 492 con pattern in modo da minimizzare la quantità di luce "fantasma" che contribuisce al rumore di fondo nelle immagini confocali catturate dal sensore 11 di acquisizione (Figure 1 e 2). In alcune forme di realizzazione, la maschera 492 con pattern può essere composta da un opportuno materiale otticamente nero (poco riflettente). Esempi di materiali neri includono, ma non sono limitati a, materiali a base di cromo, Le., materiali a base di ossido di cromo (Cr203) od a base di una miscela di Cr2C>3 ed altre specie come cromo (Cr) e biossido di silicio (Si02), pochi esempi essendo cromo nero e cromo blu. Altri composti inorganici o leghe che sono opportunamente neri possono pure essere utilizzati. In alcune forme di realizzazione, la maschera 492 con pattern può essere composta da un materiale che può essere caratterizzato come essere un materiale altamente otticamente nero (o più semplicemente "altamente nero"). Come esempio, un materiale altamente nero può avere una riflettanza emisferica inferiore al 5% per lo spettro di lunghezze d'onda contemplato dalla presente descrizione (e.g., da circa 350 a 750 nm). Come altro esempio, un materiale altamente nero può avere una riflettanza emisferica inferiore al 2% per lo spettro di lunghezze d'onda. Esempi di quest'ultimo materiale includono, ma non sono limitati a, i rivestimenti microstrutturati VACU UM BLACK™ e MAGIC BLACK™ disponibili in commercio da Acktar Ltd., Kiryat Gat-lsraele. In alcune forme di realizzazione, il materiale altamente nero della maschera 492 con pattern può essere un materiale microstrutturato od un materiale con una superficie o rivestimento esterni microstrutturati. Ad esempio, il materiale microstrutturato può avere una finitura dendritica quale un rivestimento comprendente picchi e/o creste neri ravvicinati. In un esempio specifico ma non limitativo, la caratteristica microstrutturata della finitura dendritica può consistere di nanotubi di carbonio (CNT) a parete singola od a parete multipla orientati verticalmente.

Nel presente contesto, il termine "riflettanza emisferica" o "totale riflettanza emisferica" è la riflettanza misurata di tutta la luce che è diffusa fuori di un campione di test a tutti gli angoli. Questa misura della riflettanza può essere effettuata secondo tecniche note. Ad esempio, la riflettanza emisferica può essere misurata usando una sfera di integrazione, in cui un fascio di luce entrante illumina un campione di test attaccato sulla sfera da una data direzione e la radiazione diffusa dal campione viene raccolta e rilevata, come descritto da Quijada et al., Hemispherical Reflectance and Emittance Properties of Carbon Nanotubes Coatings at Infra red Wavelengths, CRYOGENIC OPTICAL SYSTEMS AND INSTRUMENTS XIII, Conference on Cryogenic Optical Systems and Instruments XIII, Voi. 8150, DOI: 10.1117/12.894601, p. 11 (2011).

In alcune forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, la maschera 492 con pattern è uno strato sottile (o pellicola, rivestimento, ecc.) avente uno spessore dell'ordine di micrometri. Ad esempio, la maschera 492 con pattern può avere uno spessore in un intervallo da 0,1 micrometri a 0,3 micrometri. La maschera 492 con pattern può essere fabbricata mediante qualsiasi tecnica opportuna per la sua composizione e spessore. Ad esempio, la maschera 492 con pattern può essere prefabbricata e poi laminata sul substrato 490. Come altri esempi, la maschera 492 con pattern può essere formata sul substrato 490 mediante un processo di microfabbricazione quale, ad esempio, elettrodeposizione, deposizione sotto vuoto (deposizione chimica da vapore o CVD, deposizione fisica da vapore o PVD, ecc.), evaporazione, o mediante una tecnica di rivestimento umido (e.g., rivestimento a spruzzo, rivestimento per immersione, rivestimento per rotazione, ecc.). In alcune forme di realizzazione, la maschera 492 con pattern può essere formata dapprima depositando uno strato continuo e successivamente realizzando un pattern sullo strato per formare le aperture 476 mediante qualsiasi tecnica opportuna come la foto litografi a (e.g., mascheratura ed attacco).

In alcune forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, per abbassare ulteriormente la riflettività dello spinning disk 416, lo spinning disk 416 può includere uno strato o rivestimento anti- riflettente 494 che riveste (copre) in modo conforme il primo lato 456 ed il secondo lato 460. Lo strato anti -riflettente 494 può essere qualsiasi materiale o pila multistrato di materiali che presentano caratteristiche a nti - riflette nti efficaci per lo spettro di lunghezze d'onda contemplato dalla presente descrizione (e.g. da 350 nm a 700 nm, o da circa 350 nm a circa 700 nm). Esempi di materiali opportuni per l'uso come strati a nti -riflette nti includono, ma non sono limitati a, certi fluoruri metallici, ossidi metallici ed ossidi metalloidi, quali fluoruro di magnesio (MgF2), fluoruro di magnesio (MgF2), fluoruro di litio (LìF), fluoruro di calcio (CaF2), fluoruro di sodio (NaF), biossido di silicio (Si02), ossido di ittrio (Υ203), e ossido di afnio (Hf02), nonché combinazioni di due o più dei precedenti in strati alternati o periodici. In alcune forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione, lo strato anti-riflettente 494 è uno strato anti-riflettente ad alte prestazioni. Un esempio non limitativo di uno strato anti-riflettente ad alte prestazioni è un materiale avente una dilettanza media (Rav) inferiore od uguale a 0,3% (Rav < 0,3%) su un intervallo di lunghezze d'onda da 380 nm a 710 nm, ed una riflettenza massima (Rmx) inferiore od uguale a l% {Rmx < 1%) sull'intervallo di lunghezza d'onda da 380 nm a 710 nm. Lo strato anti-riflettente ad alte prestazioni può comprendere uno (od una combinazione di due o più dei) materiali dì fluoruri e/o materiali di ossidi indicati sopra.

Tipicamente, lo strato anti- riflettente 494 è uno strato sottile (dell'ordine dei micrometri) applicato mediante un processo di deposizione sotto vuoto. In alcune forme di realizzazione, lo strato anti -riflettente 494 può essere formato mediante applicazione del materiale anti -riflettente al substrato 490, seguita dalla formazione della maschera 492 con pattern, seguita dalla nuova applicazione del materiale anti -riflettente in modo da rivestire in modo conforme la maschera 492 con pattern. Come risultato, la maschera 492 con pattern è incorporata nel rivestimento anti -riflettente 494, come illustrato nella Figura 6. In altre forme di realizzazione, la maschera 492 con pattern può dapprima essere formata direttamente sul substrato 490, seguita dal l'applicazione del rivestimento anti -riflettente 494 in modo da coprire in modo conforme la maschera 492 con pattern e le superfici esposte del substrato 490.

Si deve comprendere che nei metodi di fabbricazione dello spinning disk qui descritti, prima di formare qualsiasi strato su una superficie sottostante, fasi aggiuntive possono essere effettuate come necessario per preparare la superficie sottostante quali, per esempio, pulizia, attacco, planarizzazione (e.g., lappatura o lucidatura), disidratazione, funzionalizzazione superficiale (e.g., promozione di adesione, passivazione, ecc.), ecc. Tali fasi aggiuntive possono o non possono risultare nella formazione di una pellicola sottile identificabile aggiuntiva sulla superficie sottostante. Tali pellicole sottili aggiuntive, se presenti in pratica, non sono specificamente mostrate nelle figure dei disegni.

Gli approcci sopra descritti adottati per ridurre la dilettanza dallo spinning disk 416 riducono la luce "fantasma" catturata dal sensore 11 di acquisizione (Figure 1 e 2). Ciò consente un incremento nel rapporto segnale-a-rumore (dove il rumore è il rumore di fondo) per un dato tempo di esposizione, od una riduzione del tempo di esposizione necessario per ottenere un desiderato rapporto segnale-arumore (dove il rumore è il rumore di fondo). Ridurre il rumore di fondo migliora il contrasto delle immagini e migliora i risultati dell'analisi. Ridurre il tempo di esposizione riduce il tempo di acquisizione dell'immagine e quindi aumenta la produttività dell'apparato di microscopia confocale secondo l'invenzione.

Facendo riferimento alla Figura 8, si può osservare che la porzione di elaborazione dell'apparato di Figura 1 comprende una unità centrale 16 di elaborazione che riceve dal sensore 11 di acquisizione l'insieme degli N sub-frame 700A, 700B, ..., 700N acquisiti del piano del campione 10; durante l'acquisizione, ogni sub-frame è vantaggiosamente memorizzato in una memoria 70, ed il componente di generazione di luce strutturata e lo spinning disk 7 sono movimentati per illuminare con il fascio a luce strutturata un'altra porzione del piano del campione 10 e così acquisire il sub-frame successivo. Si procede così fino all'acquisizione di sub-frame successivi sino alla copertura totale del piano del campione 10, e si procede poi alla composizione dei sub-frame in un'immagine finale 80 super-risolta del piano in esame grazie all'elaborazione effettuata dall'unità centrale 16 mediante l'uso di algoritmi di deconvoluzione di microscopia a luce strutturata, come ad esempio quelle descritte dal documento WO2013144891 o quelle descritte da R. Heintzmann in Structured illumination methods, in Ha nd hook of Biological Confocal microscopy, capitolo 13, J.B. Pawley editor, New York, 2006. Vantaggiosamente, l'unità centrale 16 comprende uno o più processori grafici o GPU (Graphics Processing Unit), opzionalmente una unità CU DA (Compute Unified Device Architecture) disponibile dall'azienda USA Nvidia Corporation, in modo da sfruttare il calcolo in parallelo, una o più memorie volatili e non-volatili per la memorizzazione dei dati, uno o più dispositivi di inserimento dati (e.g. tastiera, touch screen, mouse), uno o più dispositivi di interfaccia utente/elaboratore (e.g. monitor). Tuttavia, la presenza di processori per calcolo parallelo, in particolare GPU, non è essenziale per l'invenzione; infatti, altre forme di realizzazione dell'apparato secondo l'invenzione possono avere la porzione di acquisizione di Figura 1 o di Figura 2, e poi una porzione di elaborazione che esegue offline (non in tempo reale) l'elaborazione, i.e. senza alcuno specifico requisito di velocità di calcolo, sulle acquisizioni memorizzate.

L'unità centrale 16 controlla inoltre il funzionamento di tutti i componenti dell'apparato 100 di microscopia confocale secondo l'invenzione, in particolare i gruppi automatizzati di movimentazione {e.g. i dispositivi motorizzati) che consentono di spostare il componente di generazione di luce strutturata (Le., il substrato 2 o l'array 13 di microlenti) con spostamenti nel piano perpendicolare all'asse ottico, allo scopo di acquisire un'immagine di un intero piano del campione 10. L'unità centrale 16 controlla anche i gruppi automatizzati di movimentazione dello spinning disk 7 che viene ruotato.

Si deve tenere presente che la porzione di acquisizione dell'apparato di microscopia confocale, come quella mostrata in Figure 1 e 2 per la prima e la seconda forma di realizzazione dell'invenzione può essere fabbricata e commercializzata indipendentemente dalla porzione di elaborazione; inoltre, la porzione di acquisizione dell'apparato di microscopia confocale può essere fabbricata e commercializzata indipendentemente dalla presenza della sorgente luminosa (indicata con il numero di riferimento 1 nelle Figure 1 e 2), che potrebbe essere successivamente montata in corrispondenza di un relativo alloggiamento configurato per alloggiare una sorgente luminosa, e/o del sensore di acquisizione (indicata con il numero di riferimento 11 nelle Figure 1 e 2), che potrebbe essere successivamente montato in corrispondenza di un relativo alloggiamento configurato per alloggiare un sensore di acquisizione. In tal caso, la porzione di acquisizione potrebbe anche essere provvista di una unità elettronica di controllo del funzionamento dei componenti della stessa porzione di acquisizione, in particolare i gruppi automatizzati di movimentazione (e.g. i dispositivi motorizzati) che consentono di spostare il componente di generazione di luce strutturata (i.e., il substrato 2 o l'array 13 di microlenti) con spostamenti nel piano perpendicolare all'asse ottico, ed i gruppi automatizzati di movimentazione dello spinning disk 7 che viene ruotato; tale unità elettronica di controllo è configurata per essere connessa con un'unità centrale esterna che elabora le immagini acquisite dal sensore di acquisizione, eventualmente un sensore di acquisizione esterno alla porzione di acquisizione.

L' acquisizione deN'insieme dei sub-frame dell'intero piano del campione avviene ruotando lo spinning disk 7 nel cammino ottico di eccitazione ed emissione, mentre il componente di generazione di luce strutturata {i.e. il substrato 2 o l'array 13 di microlenti) è posto nel cammino ottico di eccitazione e spostato nel piano perpendicolare all'asse ottico, mentre il piano focale 3a del fascio di luce strutturata, il piano focale 3b del fascio dì eccitazione, ed il piano di cui acquisire le immagini del campione 10 sono otticamente coniugati al piano focale del sensore 11 di acquisizione.

In quel che precede sono state descritte le preferite forme di realizzazione e sono state suggerite delle varianti della presente invenzione, ma è da intendersi che gli esperti del ramo potranno apportare modificazioni e cambiamenti senza con ciò uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Apparato (100; 200) di microscopia confocale, comprendente: un componente (2; 13) di generazione di luce strutturata configurato per essere illuminato da un fascio luminoso di base e per generare un fascio di luce strutturata focalizzato su un primo piano (3a); uno spinning disk (7) configurato per ricevere detto fascio di luce strutturata e per trasmettere un fascio risultante di eccitazione ad un'ottica (8, 9) di un microscopio (15) focalizzata su un piano di un campione (10), in cui lo spinning disk (7) giace su un secondo piano (3b) e comprende un substrato (490) a forma di disco composto da un materiale otticamente trasparente, il substrato (490) dello spinning disk (7) comprendendo una prima superficie planare (456) ed una seconda superficie planare contrapposta (460) ed una maschera (492) con pattern disposta su una tra la prima superficie (456) e la seconda superficie (460) e comprendente almeno un settore provvisto di una o più aperture (476) a fenditura continua a spirale, in cui la maschera (492) con pattern od una sua superficie esterna è composta da un materiale altamente nero opaco alla luce; un alloggiamento configurato per alloggiare su un terzo piano (3c) un sensore (11) di acquisizione configurato per rilevare un fascio fluorescente emesso da detto piano del campione (10); un insieme di lenti relay (4a, 4b, 4c) configurato per coniugare otticamente il primo piano (3a), il secondo piano (3b) e detto piano del campione (10) al terzo piano (3c); mezzi ottici (5, 6) configurati per trasmettere detto fascio di luce strutturata dal componente (2; 13) di generazione di luce strutturata a detto piano del campione (10) e detto fascio fluorescente emesso da detto piano del campione (10) a detto alloggiamento configurato per alloggiare il sensore (11) di acquisizione; e mezzi di movimentazione configurati per movimentare il componente (2; 13) di generazione di luce strutturata, in modo da spostare il fascio di luce strutturata nel primo piano (3a), e lo spinning disk (7) nel secondo piano (3b).
2. 2. Apparato (100) secondo la rivendicazione 1, in cui il componente di generazione di luce strutturata comprende un substrato (2) di generazione di luce strutturata provvisto di almeno un settore {20A, 20B; 25A, 25B) avente una maschera {210; 260) di materiale opaco alla luce secondo un pattern geometrico provvisto di una pluralità di aperture {200; 250) in materiale otticamente trasparente configurate per far passare detto fascio luminoso di base in modo tale da ottenere un fascio a luce strutturata, per cui il primo piano {3a) è il piano su cui giace il substrato (2) di generazione di luce strutturata.
3. 3. Apparato {100) secondo la rivendicazione 2, in cui il substrato (2) di generazione di luce strutturata è realizzato nel materiale otticamente trasparente, opzionalmente vetro, avente un rivestimento (210) opaco alla luce, opzionalmente realizzato in materiale a base di cromo, provvisto di dette aperture {200; 250), opzionalmente realizzate mediante fotolitografia.
4. 4. Apparato (100) secondo la rivendicazione 2 o 3, in cui dette aperture sono selezionate dal gruppo comprendente aperture lineari parallele (200), aventi larghezza opzionalmente variabile da 10 micrometri a 30 micrometri ed una distanza mutua opzionalmente variabile da 50 micrometri a 300 micrometri, e fori circolari {250), aventi diametro opzionalmente variabile da 10 micrometri a 30 micrometri, disposti secondo un pattern a matrice, in cui i fori circolari (250) sono opzionalmente disposti ai vertici di parallelogrammi uguali contigui, più opzionalmente rombi, ancora più opzionalmente quadrati, per cui ogni foro circolare (250) dista dai quattro fori circolari (250) più vicini per una stessa distanza opzionalmente variabile da 50 micrometri a 300 micrometri.
5. 5. Apparato {200) secondo la rivendicazione 1, in cui il componente di generazione di luce strutturata comprende un array (13) di microlenti {596) di generazione di luce strutturata, comprendente un substrato (590) provvisto su una faccia di una pluralità di microlenti (596) configurate per generare detto fascio a luce strutturata focalizzato su un piano focale (3a).
6. 6. Apparato (200) secondo la rivendicazione 5, in cui dette microlenti (596) sono selezionate dal gruppo comprendente: microlenti generalmente cilindriche lineari configurate per focalizzare il fascio di luce strutturata sul piano focale (3a) secondo linee parallele, in cui dette linee parallele hanno larghezza opzionalmente variabile da 10 micrometri a 30 micrometri ed una distanza mutua opzionalmente variabile da 50 micrometri a 300 micrometri, e microlenti generalmente semicircolari configurate per focalizzare il fascio di luce strutturata sul piano focale (3a) secondo spot circolari disposti secondo un pattern a matrice, in cui detti spot circolari hanno diametro opzionalmente variabile da 10 micrometri a 30 micrometri, e sono opzionalmente disposti ai vertici di parallelogrammi uguali contigui, più opzionalmente rombi, ancora più opzionalmente quadrati, per cui ogni spot circolare dista dai quattro spot circolari più vicini per una stessa distanza opzionalmente variabile da 50 micrometri a 300 micrometri.
7. 7. Apparato (200) secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui il substrato (590) dell'array (13) di microlenti (596) è provvisto di un rivestimento (592) opaco alla luce, opzionalmente realizzato in materiale a base di cromo, foto litografato secondo un pattern geometrico tale che il rivestimento (592) manca in corrispondenza delle microlenti (596), per cui ogni microlente (596) è otticamente allineata con una corrispondente apertura (576) realizzata nel rivestimento (592).
8. 8. Apparato (100) secondo la rivendicazione 1, in cui il componente di generazione di luce strutturata comprende un dispositivo digitale a microspecchi.
9. 9. Apparato (100; 200) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto insieme di lenti relay comprende una prima lente relay (4a), una seconda lente relay (4b) ed una terza lente relay (4a), e detti mezzi ottici (5; 6) comprendono un filtro dicroico (5), in cui la prima lente relay (4a) è configurata per essere attraversata da detto fascio a luce strutturata, il filtro dicroico (5) è configurato per riflettere detto fascio di luce strutturata proveniente dalla prima lente relay (4a) verso la seconda lente relay (4b) che è configurata per focalizzare detto fascio di luce strutturata sullo spinning disk (7), il filtro dicroico (5) essendo altresì configurato per lasciar passare detto fascio fluorescente emesso proveniente dallo spinning disk (7) verso detto alloggiamento configurato per alloggiare il sensore (11) di acquisizione.
10. 10. Apparato {100; 200) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente inoltre: una sorgente luminosa (1) configurata per emettere detto fascio luminoso di base; un sensore (11) di acquisizione alloggiato in detto alloggiamento e configurato per rilevare un fascio fluorescente emesso da detto piano del campione (10); ed una unità centrale {16) di elaborazione configurata per ricevere dal sensore (11) di acquisizione una pluralità di acquisizioni parziali {700A, 700B, ..., 700N) di detto piano del campione (10) e per comporre tale pluralità di acquisizioni parziali {700A, 700B, ..., 700N) in un'immagine finale {80) di detto piano del campione (10) mediante l'elaborazione di algoritmi di deconvoluzione di microscopia a luce strutturata.
11. 11. Apparato {100; 200) secondo la rivendicazione 10, in cui l'unità centrale (16) di elaborazione comprende uno o più processori grafici o GPU.
12. 12. Procedimento di acquisizione ed elaborazione di immagini in microscopia confocale a luce strutturata, comprendente le seguenti fasi: A. far attraversare uno spinning disk {7) da un fascio di luce strutturata ottenendo un fascio risultante di luce di eccitazione, in cui lo spinning disk (7) comprende un substrato (490) a forma di disco composto da un materiale otticamente trasparente, il substrato (490) dello spinning disk (7) comprendendo una prima superficie planare (456) ed una seconda superficie planare contrapposta (460) ed una maschera {492) con pattern disposta su una tra la prima superficie (456) e la seconda superficie (460) e comprendente almeno un settore provvisto di una o più aperture (476) a fenditura continua a spirale, in cui la maschera {492) con pattern od una sua superficie esterna è composta da un materiale altamente nero opaco alla luce; B. focalizzare il fascio risultante di eccitazione su un piano di un campione (10), C. acquisire una pluralità di acquisizioni parziali (700A, 700B, ..., 700N) di detto piano del campione (10), e D. comporre tale pluralità di acquisizioni parziali (700A, 700B, ..., 700N) in un'immagine finale (80) di detto piano del campione (10) mediante l'elaborazione di algoritmi di deconvoluzione di microscopia a luce strutturata.