JP5432524B2 - アスパラギン酸由来アミノ酸および化学物質の改善された生産のための改変グリオキシル酸シャント - Google Patents

Description

（優先権の主張）
本出願は、係属中の米国仮特許出願第６０／６９２，３４１号（出願日２００５年６月２０日）への優先権を主張する。上記出願は、あたかも本明細書に完全に再記載されているかのように参考として援用される。

（背景）
以下には、本発明を理解するのに有用な場合がある情報が含まれる。但し、本明細書に提供される情報の何れかが、本明細書において記載又は請求される発明の従来技術又は材料であることも、或いは具体的又は暗示的に言及される何れかの刊行物又は文書が従来技術であることも認めることはない。

本発明は、微生物学及び微生物遺伝学の分野に関するが、これに限定されるものではない。本発明は、例えば、新規の細菌株、新規のヌクレオチド配列、新規のアミノ酸配列、並びにＬ−スレオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ホモセリン及びＬ−イソロイシンを含むがこれらに限定されないアミノ酸を発酵生成するために、これらの細菌株、新規のヌクレオチド配列、及び／又は新規のアミノ酸配列を使用するプロセスに関する。好ましくは、Ｌ−スレオニンが生成されるのがよい。本発明は又、動物飼料添加物の生成にも関する。本発明は又、上に列挙したアミノ酸を含むがこれらに限定されない微小化学物質の発酵及び合成にも関する。

大腸菌では、アミノ酸であるＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−リシン及びＬ−メチオニンが、共通の生合成経路を介してアスパラギン酸塩（アスパラギン酸）から炭素原子の全て又は一部を誘導する（Ｇ． Ｎ． Ｃｏｈｅｎ， “Ｔｈｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ Ｌｙｓｉｎｅ， Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｎｄ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ”， ｐｐ．１４７−１７１ ｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ： Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， Ｋ． Ｍ． Ｈｅｒｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒ． Ｌ． Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ， ｅｄｓ．， Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｒｅａｄｉｎｇ， Ｍａｓｓ． （１９８３））。

そして、アスパラギン酸塩はオキサロ酢酸（ＯＡＡ）に由来する。Ｇｏｋａｒｎ等の特許文献１で報告されている通り、好気性発酵を使用して、オキサロ酢酸誘導アミノ酸を生成することができる。残念ながら、プロセスの収率は、炭素フローのストリンジェントな代謝調節によって制限される場合がある。一般的に、ＯＡＡに向かう炭素フラックスは、代謝システムへの摂動に関係なく、一定のままであると言われる（Ｊ． Ｖａｌｌｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４１：６３３， ６４６ （１９９３））。この代謝調節を克服することが、ＯＡＡ由来のアミノ酸及びその他の産物の生成を増大させるに当たって有利であると考えられる。

好気性細菌の代謝では、グルコースの炭素原子は、クエン酸サイクル又はクレブスサイクルとしても知られるトリカルボン酸サイクル（ＴＣＡ）において二酸化炭素に完全に酸化される場合がある。ＴＣＡサイクルは、ＯＡＡがアセチル−ＣｏＡと組み合わされてクエン酸塩を形成するときに始まる。細菌大腸菌における好気性代謝経路の一例が、図１に示されている。ＴＣＡサイクルにおける１次分子としての役割に加えて、ＯＡＡは、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ホモセリン、及びＬ−リシンを含めて、アミノ酸を合成する先駆物質として使用される場合がある。

ＴＣＡサイクルに対するＯＡＡの重要性が与えられると、アミノ酸の生合成に使用されるＯＡＡは、ＴＣＡサイクルが更に進行することを可能にするように置換されるべきである。従って、多くの有機体は、ＴＣＡサイクルにおいて使用される中間物を再生成する「アナプレロティック経路」を展開した。幾つかの植物及び微生物において等、幾つかの有機体では、ＴＣＡサイクル中間物は、「グリオキシル酸シャント」、又「グリオキシル酸塩バイパス」又は「グリオキシル酸塩サイクル」としても知られるアナプレロティック経路を介して、アセチル−ＣｏＡから形成される場合がある。大腸菌におけるグリオキシル酸シャントが、図２に示されている。

グリオキシル酸シャントにより、特定の基質（例えば、酢酸塩、脂肪酸、又は幾つかの長鎖アルカン）の上に成長する有機体が、そのＯＡＡを補充することが可能になる。このような機序は有用であるが、その理由は、このような基質は、ＴＣＡサイクルにおいて必要とされるＯＡＡを形成するためにカルボキシル化することができる３−炭素中間物を提供しないからである。ＴＣＡサイクルとグリオキシル酸シャントの間の炭素フラックスの分岐点は、イソクエン酸塩であると言われる（Ｋ． Ｗａｌｓｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：１５， ９６４６−９６５４（１９８４））。

グリオキシル酸シャントにおいて、ＴＣＡサイクル由来のイソクエン酸塩は、酵素イソクエン酸リアーゼによってグリオキシル酸塩及びコハク酸塩に開裂される。次いで、酵素リンゴ酸シンターゼが、グリオキシル酸塩をアセチル−ＣｏＡと組み合わせて、リンゴ酸塩を形成するために使用される。コハク酸塩及びリンゴ酸塩の両方が、ＴＣＡサイクルによりＯＡＡを生成するために使用される場合がある。一般的に、グリオキシル酸バイパス酵素をコードする遺伝子の発現は、厳密に制御されると言われ、それにより、これらの遺伝子は、特定の３−炭素化合物がＴＣＡサイクルにおいて利用可能である場合、抑制される場合がある。

以下の反応が観測される場合がある。

ａｃｅＡ、イソクエン酸リアーゼ：イソクエン酸塩＜・・・＞グリオキシル酸塩＋コハク酸塩
ａｃｅＢ、リンゴ酸シンターゼＡ：アセチル−ＣｏＡ＋Ｈ_２Ｏ＋グリコキシレート＜・・・＞リンゴ酸塩＋ＣｏＡ
ｇｌｃＢ、リンゴ酸シンターゼＧ：アセチル−ＣｏＡ＋Ｈ_２Ｏ＋グリコキシレート＜・・・＞リンゴ酸塩＋ＣｏＡ
大腸菌では、グリオキシル酸シャント酵素をコードする遺伝子は、ａｃｅＢＡＫオペロンに位置する。遺伝子は、例えば、ＩｃｌＲ（Ａ． Ｓｕｎｎａｒｂｏｒｇら、Ｊ． Ｂａｃｔ．， １７２：２６４２−２６４９ （１９９０））、ＦａｄＲ（Ｓ． Ｍａｌｏｙら、Ｊ． Ｂａｃｔ． １４８：８３−９０ （１９８１））、ＦｒｕＲ（Ａ． Ｃｈｉａら、Ｊ． Ｂａｃｔ．， １７１：２４２４−２４３４ （１９８９））、及びＡｒｃＡＢ（Ｓ． Ｉｕｃｈｉら、Ｊ． Ｂａｃｔ．， １７１：８６８−８７３ （１９８９））を含めて、幾つかの転写調節因子によって制御されると言われる。

ａｃｅＢＡＫオペロンは、ａｃｅＢの上流であるα^７０−タイプのプロモーターから発現することが報告されている（Ｅ． Ｒｅｓｎｉｋら、Ｊ． Ｂａｃｔ． １７８：９， ２７１５−２７１７ （１９９６））。大腸菌の菌株Ｋ−１２のａｃｅＢＡＫオペロンのヌクレオチド配列が、配列番号１において述べられている。Ｋｅｓｅｌｅｒ， Ｉ．Ｍ．ら、Ｎｕｅ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３３：Ｄ３３４−３５７ （２００５）。オペロンは、ｉｃｌＲから発現したリプレッサータンパク質によって調節され、酢酸塩又は脂肪酸の上に成長することによって活性化されると言われる（Ｅ． Ｒｅｓｎｉｋら、前掲）。ａｃｅＡ遺伝子（配列番号２）（Ｋｅｓｅｌｅｒ， Ｉ．Ｍ．ら、前掲）は、イソクエン酸リアーゼ（配列番号３（Ｋｅｓｅｌｅｒ， Ｉ．Ｍ．ら、前掲））をコードすることが報告されており、ａｃｅＢ遺伝子（配列番号４）（Ｋｅｓｅｌｅｒ， Ｉ．Ｍ．ら、前掲）は、リンゴ酸シンターゼＡ（配列番号５）（Ｋｅｓｅｌｅｒ， Ｉ．Ｍ．ら、前掲）を生成することが報告されている。ｇｌｃＤＦＧＢオペロンの最後の遺伝子（配列番号６）（Ｋｅｓｅｌｅｒ， Ｉ．Ｍ．ら、前掲）、ｇｌｃＢ（配列番号７）（Ｋｅｓｅｌｅｒ， Ｉ．Ｍ．ら、前掲）は、リンゴ酸シンターゼＧ（配列番号８）（Ｋｅｓｅｌｅｒ， Ｉ．Ｍ．ら、前掲）をコードすることが報告されており、これは、リンゴ酸シンターゼＡが欠如している場合に、グリオキシル酸シャントにおいてリンゴ酸シンターゼＡと置換する場合がある（Ｌ．Ｎ． Ｏｒｎｓｔｏｎら、Ｊ． Ｂａｃｔ．， ９８：２， １０９８−１１０８ （１９６９）； Ｗ． Ｆａｒｍｅｒら、Ａｐｐ． ＆ Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６３：８， ３２０５−３２１０ （１９９７）； Ｍ． Ｏｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７：１５， １３１７５−１３１８３ （２００２））。

大腸菌の野生型菌株の多くの特徴が報告されている。例えば、大腸菌の菌株Ｋ−１２のゲノムが、Ｆ．Ｒ． Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９７ Ｓｅｐ ５； ２７７（５３３１）：１４５３−７４で報告されている。何人かの著者が、炭素フローをＯＡＡに向かって逸らす試行を報告しているが、その理由は、ＯＡＡに向かう炭素のフローを増大させることにより、先駆物質としてＯＡＡで合成される場合がある生化学物質の生成が増大することが仮定されたからである。試行は、ａｃｅＢＡＫリプレッサーとして作用する遺伝子のノックアウト、又はａｃｅＢＡＫを阻害する遺伝子の促進を含んでいた（グリオキシル酸シャントの中への炭素フローを回避するため）。例えば、Ｒｉｅｐｉｎｇ等の特許文献２は、酵素リンゴ酸塩：キノリン酸化還元酵素を生成するｍｑｏ遺伝子の過剰発現による腸内細菌におけるスレオニンの生成の増大を報告している。

Ｐａｒｋ等の特許文献３は、ｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされている微生物を使用するＬ−スレオニンの生成を報告している。Ｒｉｅｐｉｎｇ等の特許文献４、及びＲｉｅｐｉｎｇ等の特許文献５は、ａｃｅＡ遺伝子又はａｃｅＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列が減衰又はスイッチオフされる腸内細菌の発酵を含むＬ−スレオニンを生成するプロセスを報告している。

Ｒｉｅｐｉｎｇ等の特許文献６は、何れもａｃｅＢＡＫオペロンの転写制御因子であるｆａｄＲ遺伝子産物及び／又はｉｃｌＲ遺伝子産物の活性レベルを向上させるように修正された細菌を使用してＬ−スレオニンを生成するプロセスを報告している。Ｈｅｒｍａｎｎの特許文献７は、ａｃｅＫ遺伝子産物の発現が減衰されるように修正されている腸内細菌ファミリの細菌の発酵を含むＬ−スレオニンを生成するプロセスを報告している。

細菌細胞の成長、隔離されたＤＮＡ分子の宿主細胞への導入、並びに隔離された核酸分子の隔離、クローン化及び配列化等の方法及び技法が、一般的には当業者に既知である場合がある。これらの方法及び技法は、以下に示す多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている：Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｈ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９７２）； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｈ．， Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９９２）； Ｓｉｎｇｅｒ Ｍ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｐ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ， Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ， Ｃａｌｉｆ． （１９９１）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）； Ｋａｕｆｍａｎ， Ｐ．Ｂ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ． （１９９５）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｌｉｃｋ， Ｂ．Ｒ． ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．Ｅ． ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ． （１９９３）； Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ， Ｐ．Ｆ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｔｈｅ Ｇｕｉｌｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）； Ｓｃｈｌｅｉｆ， Ｒ．Ｆ． ａｎｄ Ｗｅｎｓｉｎｋ， Ｐ．Ｃ． Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （１９８１）； Ｓｉｎｇｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｐ． Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ， Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９１）； Ｋａｕｆｍａｎ， Ｐ．Ｂ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ （１９９５）； Ｐｌａｓｍｉｄｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｈａｒｄｙ， Ｋ．Ｄ．ら、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９９３）； Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄａｔａ， Ｇａｃｅｓａ， Ｐ． ａｎｄ Ｒａｍｊｉ， Ｄ．Ｐ． ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９９４）； ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ．Ｗ． ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ， Ｇ．Ｓ． ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （１９９５）； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ．ら、ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｈａｎｇ， Ｄ．ら、ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９２）； Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｔｈｏｍａｓ， Ｃ．Ｍ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ （１９８９）； Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄｓ， Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｄ．Ｋ．， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ （１９９６）； Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｉｏｕｓ， Ｄｒｌｉｃａ， Ｋ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （１９９７）； Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｒ．Ｌ．ら、ｅｄｓ．， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ （１９８８）； Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ， Ｃｌｅｗｅｌｌ， Ｄ．Ｂ．， ｅｄｓ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ （１９９３）； Ｄｅｌ Ｓｏｌａｒ， Ｇ．ら、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｌａｓｍｉｄｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：４３４−４６４ （１９９８）； Ｍｅｉｊｅｒ， Ｗ．Ｊ．ら、Ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ： ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｐＴＡ１０１５， ｐＴＡ１０４０， ｐＴＡ１０５０ ａｎｄｐＴＡ１０６０， ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｒｏｍ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ２１：３３７−３６８ （１９９８）； Ｋｈａｎ， Ｓ．Ａ．， Ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｌａｓｍｉｄｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６１：４４２−４５５ （１９９７）； Ｂａｋｅｒ， Ｒ．Ｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７：５４１−５４６ （１９９６）； Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ．Ｃ．， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ａｃｈｉｅｖｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６０：５１２−５３８ （１９９６）； Ｎｉｃｈｏｌｌ， Ｄ．Ｓ．Ｔ．， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｄ ｅｄ．） ２００２； Ａｌｏｎｓｏ， Ｊ．Ｃ．ら、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｈｅｔａ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｓ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １４２：１−１０ （１９９６）； Ｍｉｒｏｕｘ， Ｂ．ら、Ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： ｍｕｔａｎｔ ｈｏｓｔｓ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６０：２８９−２９８ （１９９６）； Ｋｕｒｌａｎｄ， Ｃ．Ｇ． ａｎｄ Ｄｏｎｇ， Ｈ．， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２１：１−４ （１９９６）； Ｓａｋｉ， Ｈ． ａｎｄ Ｋｏｍａｎｏ， Ｔ．， ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｎｃＱ ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０：３７７−３８２ （１９９６）； Ｄｅｂ， Ｊ．Ｋ． ａｎｄ Ｎａｔｈ， Ｎ．， Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １７５：１１−２０ （１９９９）； Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｐ．， Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｒｇｅｓ ａｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：６１−８３ （１９８８）； Ｅｓｐｉｎｏｓａ， Ｍ．ら、Ｐｌａｓｍｉｄ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｔｒｏｌ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １３０：１１１−１２０ （１９９５）； Ｌａｎｋａ， Ｅ． ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂ．Ｍ．， ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：１４１−１６９ （１９９５）； Ｄｒｅｉｓｅｉｋｅｌｍａｎｎ， Ｂ．， Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｃｒｏｓｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５８：２９３−３１６ （１９９４）； Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ， Ｋ． ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， Ｅ．Ｇ．， Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９：２９４−３００ （１９９４）； Ｆｒｏｓｔ， Ｌ．Ｓ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆ ｓｅｘ ｆａｃｔｏｒ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５８：１６２−２１０ （１９９４）； Ｄｒｕｒｙ， Ｌ．， Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５８：２４９−２５６ （１９９６）； Ｄｏｗｅｒ， Ｗ．Ｊ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ： ａ ｇｅｎｅｒａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． ｌ２：２７５−２９５ （１９９０）； Ｎａ， Ｓ．ら、Ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１：１９３−１９８ （１９９５）； Ｐａｎｓｅｇｒａｕ， Ｗ．， Ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａＩ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＲＰ４ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ５’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｔ ｔｈｅ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｎｉｃｋ ｓｉｔｅ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１０６３７−１０６４４ （１９９０）； Ｂａｉｌｅｙ， Ｊ．Ｅ．， Ｈｏｓｔ−ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ａｄｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎ



ｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４８：２９−５２ （１９９３）； Ｆｕｎｋｈｏｕｓｅｒ， Ｊ．Ｄ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｗ．Ｄ．， Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｌｙｓｉｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４９：７５８０−７５８３ （１９７４）； Ｃｈａｓｓａｇｎｏｌｅ， Ｃ．ら、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５６：４３３−４４４ （２００１）； Ｒａｉｓ， Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５６：４２５−４３２ （２００１）； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、ｅｄｓ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． （１９９６）； ｄｅ Ｂｏｅｒ， Ｈ．Ａ．ら、Ｔｈｅ ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ： ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｂｒｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒｐ ａｎｄ ｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２１−２５ （１９８３）； Ｈａｗｌｅｙ， Ｄ．Ｋ． ａｎｄ ＭｃＣｌｕｒｅ， Ｗ．Ｒ．， Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：２２３７−２２５５ （１９８３）； Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖ Ａ． ａｎｄ Ｋｅａｓｌｉｎｇ， Ｊ．Ｄ．， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌａｃＹ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐｔａｃ ａｎｄ Ｐｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｄｕｃｅｒｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ｌ８：６７２−６７４ （２００２）； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｍ．Ｅ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｐａｃｅｒ ｌｅｎｇｔｈ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｔ ｔｈｅ ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：３５２９−３５３８ （１９８５）； Ｃｈｕｎｇ， Ｔ．ら、Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ Ｂｙｐａｓｓ Ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｐ． Ｊ． Ｂａｃｔ． １７０：３８６−３９２ （１９８７）； Ｊｕｒｇｅｎ Ｂｒｏｓｉｕｓら、Ｓｐａｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ −１０ ａｎｄ −３５ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：３５３９−３５４１ （１９８５）； Ｊｅｎｓｅｎ， Ｐ．Ｒ．， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒ， Ｋ．， Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ５８：１９１−１９５ （１９９８）； Ｐａｔｅｋ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｉｕｍ： ｃｌｏｎｉｎｇ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍｏｔｉｆ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １４２：１２９７−１３０９ （１９９６）； Ｓｈｉｎｅ， Ｊ． ａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ， Ｌ．， Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｃｉｓｔｒｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：３４−３８ （１９７５）； Ｓｈｉｎｅ， Ｊ． ａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ， Ｌ．， Ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ． Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ １６−Ｓ ＲＮＡ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：２２１−２３０ （１９７５）； Ｓｔｏｒｍｏ， Ｇ．Ｄ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：２９７１−２９９６ （１９８２）； ｄｅ Ｂｏｅｒ， Ｈ．Ａ．ら、Ａ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇｒａｎｏ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｓｙｍｐ． ４８：２３３−２４４ （１９８３）； Ｍｅｉｎｉｃｋｅ， Ｐ．ら、Ｏｌｉｇｏ ｋｅｒｎｅｌｓ ｆｏｒ ｄａｔａｍｉｎｉｎｇ ｏｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５：１６９ （２００４）； Ｂａｒｒｉｃｋ， Ｄ．ら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：１２８７−１２９５ （１９９４）； ｄｅ Ｂｏｅｒ， Ｈ．Ａ．ら、Ｔｈｅ ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ： ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｂｒｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒｐ ａｎｄ ｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２１−２５ （１９８３）； Ｌｉｔｈｗｉｃｋ， Ｇ． ａｎｄ Ｍａｒｇａｌｉｔ， Ｈ．， Ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １３：２６６５−２６７３ （２００３）； Ｍａｌｏｙ， Ｓ．Ｒ．ら、Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｓｈｕｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｆｏｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂａｃｔ． １４３：７２０−７２５ （１９８０）； Ｍａ， Ｊ．ら、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｏｐｅｒｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｊ． Ｂａｃｔ． １８４：５７３３−５７４５ （２００２）； Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｂ．Ｌ． Ｗａｎｎｅｒ， Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５ （２０００）； Ｏｒｎｓｔｏｎ， Ｌ．Ｎ． ａｎｄ Ｍ．Ｋ． Ｏｒｎｓｔｏｎ， Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２． Ｊ． Ｂａｃｔ． ９８：１０９８−１１０８ （１９６９）； Ａｌｅｘｅｙｅｖ， Ｍ．Ｆ．ら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ａｎｄ ｏｍｅｇａ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｌｅｔｉｏｎ／ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｇｅｎｅ １６０：６３−６７ （１９９５）； Ｃｒｅｍｅｒ， Ｊ．ら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏ １３４：３２２１−３２２９ （１９８８）； Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３−１４７４ （１９９７）。

以上の参考文献のそれぞれ、及び以下の説明における参考文献は、当業者が、本開示内容によって提供される更なる教示内容を理解又は実施するのを助けるのに必要な程度において、本明細書で参考として援用されている。
米国特許第６，４５５，２８４号明細書 米国特許第６，６３０，３３２号明細書 欧州特許出願公開第１４０８１２３号明細書 米国特許出願公開第０３／００５９９０３号明細書 国際公開第０２／０８１７２２号パンフレット 国際公開第０３／０３８１０６号パンフレット 国際公開第０３／００８６１６号パンフレット

培養可能であり、且つＬ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ホモセリン、及びＬ−イソロイシン等のアミノ酸の増大量を生成する微生物菌株が、当技術分野で依然として必要である。

（要旨）
本明細書に記載及び請求される本発明は、多くの属性を有し、この概要において述べられるものを非限定的に含めて、多くの実施形態を含む。本明細書に記載及び請求される本発明は、単に例示であって、限定を目的とせずに含まれているこの概要において識別される特徴又は実施形態に限定されず、或いはそれによって限定されるものではない。

本発明の一態様は、１つ以上のアミノ酸（例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ホモセリン、及び／又はＬ−イソロイシン）を大量に及び／又は高収率で効率的に生成する細菌を提供する。一般的に、本発明の細菌は、非通例的なアミノ酸栄養要件を有さないが、当然、非通例的な栄養要件（例えば、１つ以上のアミノ酸が供給されるという要件、或いは細菌が特定の媒地の上に成長するという要件を含む）が存在することができる。本発明の細菌は、大腸菌の菌株を含む属エシェキリアの細菌を含めて、ファミリ腸内細菌科からである場合がある。本発明の細菌は又、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フレバム、及びブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムの菌株を含む属コリネバクテリウム又はブレビバクテリウムの細菌を含めて、ファミリ・コリネバクテリアセエに由来する場合もある。コリネバクテリウムとブレビバクテリウムの違いは僅かであり、研究者の中には、これらの細菌は実際には同じ属であると主張する者もいる。その違いの精度は、アミノ酸を生成するために培養することができる細菌の任意の菌株で実施される場合がある本発明の態様には決定的ではない。

一態様において、本発明は、細菌の菌株を含み、菌株の少なくとも１つの染色体は、少なくとも１つの非天然プロモーターに操作可能に結合された少なくとも１つのｇｌｃＢ遺伝子、及び／又はａｃｅＡ遺伝子、並びに／或いはａｃｅＢ遺伝子を含み、菌株は、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、及び／又はＬ−リシンを過剰生成する。菌株は、大腸菌菌株Ｋ−１２等の大腸菌の野生型菌株によるＬ−スレオニン生成と比較して、及び／又は親株と比較して、Ｌ−スレオニンを過剰生成する場合がある。

本発明の他の態様において、大腸菌の菌株は、前記ａｃｅＢ、ａｃｅＡ、及び／又はｇｌｃＢ遺伝子、並びに前記非天然プロモーターに操作可能に結合された非天然リボソーム結合部位を更に含む。非天然リボソーム結合部位は、例えば、ｌａｃリボソーム結合部位、ｔｈｒＡリボソーム結合部位、ｆｏｌＡリボソーム結合部位、ａｒａＣリボソーム結合部位、ａｒａＢリボソーム結合部位、ｇａｌＥリボソーム結合部位、ｏｍｐＡリボソーム結合部位、ｔｒｐＥリボソーム結合部位、ｌａｍＢリボソーム結合部位、ＭＳ２コートリボソーム結合部位、及びＱＰコートリボソーム結合部位から選択される場合があるが、これらに限定されない。

本発明の一態様において、本発明において使用される非天然リボソーム結合部位は、大腸菌の菌株から選択される。例えば、非天然リボソーム結合部位は、大腸菌菌株ｓ４３７０−６９−２から選択される場合がある。リボソーム結合部位への言及は、コンセンサス配列、天然に見られる配列、及び突然変異配列を含む場合があるが、これらに限定されない。

非天然プロモーター及び／又は非天然リボソーム結合部位は、例えば、天然のａｃｅＢＡＫ又はｇｌｃＢプロモーター或いは結合部位を組み合わせる、又は突然変異生成することによって導入される場合がある。

本発明の他の態様において、以前に考察された非天然プロモーターは、例えばｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ラムダ−Ｐ_Ｌ−プロモーター、ラムダ−Ｐ_Ｒプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、及びｌｐｐ−ｌａｃプロモーターからなる群の少なくとも１つから選択される場合がある。プロモーターへの言及は、コンセンサス配列及び突然変異配列を含む場合があるが、これらに限定されない。当業者であれば、本開示内容の利益、並びにＢｒｏｓｉｕｓら、前掲及びＭｕｌｌｉｇａｎら、前掲の利益をもとに、同様の結果が、ｔａｃプロモーターの使用を教示する例においてｔｒｃプロモーターを使用して得られる場合があることを理解する場合がある。

一態様において、本発明は、Ｌ−アミノ酸を生成し、ａｃｅＢＡＫオペロンの遺伝子及びｇｌｃＢ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を細菌において過剰発現するように操作可能に構成された組換え核酸構築物を含む細菌を発酵媒地において成長させること、発酵媒地及び細菌の少なくとも一方においてＬ−アミノ酸を豊富にすること、並びに、Ｌ−アミノ酸産物を生成するために、発酵媒地及び細菌の少なくとも一方からＬ−アミノ酸を隔離することを含む、発酵によってＬ−アミノ酸産物を生成するプロセスを含む。本発明の他の態様において、上述の細菌の属は、エシェリキア、コリネバクテリウム、及びブレビバクテリウムからなる群から選択される。細菌は、例えば大腸菌である場合がある。

本発明の他の態様において、組換え核酸は、ａｃｅＢＡＫオペロンの少なくとも１つの遺伝子及び／又はｇｌｃＢ遺伝子の上流に非天然プロモーター配列を含み、非天然プロモーターは、ａｃｅＢＡＫオペロンの少なくとも１つの遺伝子及び／又はｇｌｃＢ遺伝子に操作可能に結合される。プロモーターは、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ラムダＰ_Ｌプロモーター、及びラムダＰ_Ｒプロモーター、又は本開示内容の利益を有する当業者であれば理解する他のプロモーターから選択される場合がある。

過剰発現した遺伝子は、ａｃｅＢ、ａｃｅＡ、及びｇｌｃＢから選択される場合がある。非天然プロモーターは、オペロンの天然プロモーターと置換する場合があり、天然プロモーターは、欠失される、中断される、又は部分的に欠失される、及び部分的に中断される。非天然プロモーターは、オペロンの天然プロモーターに加えて挿入される場合がある。

本発明の他の態様において、Ｌ−アミノ酸産物を生成するプロセスが上記のように提供され、ａｃｅＢＡＫ遺伝子産物及びｇｌｃＢ遺伝子産物の少なくとも一方は、微生物において過剰発現した唯一の遺伝子産物である。

本発明の他の態様において、Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−リシン、及びＬ−メチオニンからなる群から選択される。他の態様において、Ｌ−アミノ酸はＬ−スレオニンである。

他の態様において、本発明は、ａｃｅＢＡＫオペロンの少なくとも１つの遺伝子及びｇｌｃＢ遺伝子が過剰発現される細菌を含む。微生物の属は、エシェリキア、コリネバクテリウム、及びブレビバクテリウムからなる群から選択される場合がある。細菌は、大腸菌の菌株である場合がある。本開示内容の利益を有する当業者であれば、イソクエン酸リアーゼ及びリンゴ酸シンターゼＧ、並びに大腸菌においてそれらをコードする遺伝子に適用可能な本明細書の技法は、コリネバクテリウムのイソクエン酸リアーゼ及びリンゴ酸シンターゼＧに適用される場合があることを理解するであろう。コリネバクテリウム・グルタミカム菌株ＡＴＴＣ１３０３２（ｇｌｃＢ）のリンゴ酸シンターゼＧをコードする遺伝子は、配列番号２６において見られる。コリネバクテリウム・グルタミカム菌株ＡＴＴＣ１３０３２（ａｃｅＡ）のイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子は、配列番号２７において見られる。

本発明の他の態様において、細菌は、大腸菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・フレバム、又はコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株である。

本発明の他の態様において、細菌は、非天然プロモーターによって調節されるａｃｅＢＡＫオペロンの少なくとも１つの遺伝子、及び／又はｇｌｃＢ遺伝子を含む。他の態様において、本発明の細菌の非天然プロモーターは、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ラムダＰ_Ｌプロモーター、及びラムダＰ_Ｒプロモーターから選択される。本発明の他の態様において、非天然プロモーターは、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）である。

本発明の他の態様は、ａｃｅＢＡＫオペロンの天然プロモーターが、非天然プロモーターによって置換される、中断される、又は部分的に置換される、及び部分的に中断される細菌を含む。本発明の他の態様において、本発明の細菌は、ａｃｅＢＡＫオペロンの天然プロモーターを置換又は中断することなく、ａｃｅＢＡＫオペロンに挿入された非天然プロモーターを含む。本発明の他の態様において、本発明の細菌では、ｇｌｃＤＦＧＢオペロンの天然プロモーターは、ｇｌｃＢ遺伝子に操作可能に関連している非天然プロモーターによって置換又は中断されている。本発明の他の態様において、ｇｌｃＤＦＧＢオペロンの天然プロモーターを置換又は中断することなく、非天然プロモーターが、ｇｌｃＢ遺伝子と操作可能に関連しているｇｌｃＤＦＧＢオペロンに挿入されている、本発明の細菌が提供される。

本発明の他の態様は、２００５年５月１１日に寄託され、寄託番号ＮＲＲＬＢ−３０８４４、ＮＲＲＬＢ−３０８４５、ＮＲＲＬＢ−３０８４６、ＮＲＲＬＢ−３０８４７、ＮＲＲＬＢ−３０８４８、ＮＲＲＬＢ−３０８４９、ＮＲＲＬＢ−３０８５、及びＮＲＲＬＢ−３０８５１が付与された細菌株を提供する。実施形態は又、それらの寄託微生物の誘導体である細菌株をも提供する。例えば、当業者であれば、ａｃｅＢＡＫオペロン又はｇｌｃＢ遺伝子の過剰発現を減少させることなく、代謝流入の他の修正並びに栄養要件に対する変更を含めて、種々の修正が、寄託菌株について実施される場合があることを理解するであろう。

他の態様において、本発明は、細菌において大腸菌のａｃｅＡタンパク質、ａｃｅＢタンパク質、及びｇｌｃＢタンパク質の少なくとも１つをコードする遺伝子を過剰発現するように操作可能に構成された非天然プロモーターを含む組換え核酸であって、前記遺伝子は、
ａ）配列番号３、５、８からなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡ；
ｂ）配列番号９、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５の少なくとも１つによる核酸；
ｃ）ｂ）による核酸の遺伝子コードに関してのみ縮重している核酸；
ｄ）ａ）又はｂ）による核酸の非表現突然変異を含む核酸；
ｅ）ｂ）の核酸と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である核酸；及び
ｆ）ｂ）によるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
の少なくとも１つを含む、組換え核酸を含む。

更なる態様において、本発明は、先行段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）に記載した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

表１は、本文書に示す菌株の菌株数及び該当する遺伝子型を示す。表１には又、本文書に列挙する菌株を構築するために使用されるＤＮＡのＰＣＲ増幅において使用されるプライマー及びテンプレートも示す。

表２は、ｔａｃプロモーター融合を担持する種々の菌株のリンゴ酸シンターゼ（ＭＳ）及びイソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ）に特有の活性を列挙する。

表３、表４及び表５は、ｔａｃプロモーター融合菌株のスレオニンの力価及び収率を測定する振盪フラスコ実験の結果を列挙する。

（詳細な説明）
以下で考察する通り、本発明は、アスパラギン酸由来のアミノ酸及び化学物質を生成するための微生物菌株処理向上特性を提供する。このような菌株を作製する方法が提供される。これらの方法は、ａｃｅＢＡＫオペロン、ａｃｅＡ遺伝子、ａｃｅＢ遺伝子、ｇｌｃＢ遺伝子、又はその組み合わせの発現を変化させることを含む。発現の変化は、転写の増大、及び／又は天然転写制御の軽減により達成される場合がある。これらの遺伝子の天然プロモーターの置換も考慮される。例えば、その天然プロモーターが、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）によって置換される場合がある。ベクターを含めて、本発明の新規の特徴を提供する遺伝子構築物も提供され、このようなベクターは、プラスミド、コスミド、ウィルス、ファージ、トランスポゾン、又は微小染色体である場合があるが、これらに限定されない。

Ｉ．定義
本明細書で使用される特定の用語は、当業者によって使用され、このような者によって一般的に理解される通常の意味を有する。このような通常の意味の最も完全な範囲が、本明細書に包含されるものとして意図される。しかし、本明細書及び特許請求の範囲の用語に与えられる範囲を含め、これらの文書に対する理解を明確且つ一貫したものにするために、以下の定義が提供される。本明細書で提供される定義と競合する場合がある意味が主張された場合は、提供した定義が優先される。“ａ”又は“ａｎ”の冠詞を伴う実体は、その実体の１つ以上を指すことに留意されたい。例えば、“ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”という表現は、１つ以上のポリヌクレオチドを表すものとして理解される。従って、“ａ”、“ａｎ”、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書において交換可能に使用することができる。

染色体の統合：本明細書で使用される「染色体の統合」という用語は、外因性ＤＮＡ断片を宿主有機体の染色体に挿入することを指す。

構成：本明細書で使用される「構成」という用語は、発現し、且つ発現を完全に停止する調節を受けることが知られていない、即ち、常に「オン」であるプロモーターを指す。

内因性：本明細書で使用される「内因性」という用語は、有機体内で天然に生じている有機体内のＤＮＡ配列を指す。

ａｃｅＡ遺伝子：本明細書で使用される「ａｃｅＡ遺伝子」という用語は、イソクエン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を指す。イソクエン酸リアーゼは、グリオキシル酸サイクルにおけるグリオキシル酸塩及びコハク酸塩へのイソクエン酸塩の可逆開裂に触媒作用を及ぼす。ａｃｅＡ遺伝子の一例は、配列番号３によるタンパク質をコードする。種々の細菌株に由来するイソクエン酸リアーゼ遺伝子のその他の例には、配列番号２８〜３５によるタンパク質をコードするものが含まれる。Ａ遺伝子の通常の例には、配列番号２及び配列番号２７に列挙された核酸配列が含まれる。種々の細菌株に由来するａｃｅＡ遺伝子のその他の例には、配列番号３６〜４１によるものが含まれる。

ａｃｅＢ遺伝子：本明細書で使用される「ａｃｅＢ遺伝子」という用語は、リンゴ酸シンターゼＡ活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を指す。この活性は、アセチル−ＣｏＡがグリオキシル酸塩及び水とＳ−リンゴ酸塩及びＣｏＡを形成する反応に触媒作用を及ぼす。種々の細菌株に由来するａｃｅＢ遺伝子の例には、配列番号４２から４８によるタンパク質をコードするものが含まれる。ａｃｅＢ遺伝子の通常の例には、配列番号４及び配列番号２６に列挙された核酸配列が含まれる。種々の細菌に由来するａｃｅＢ遺伝子の他の通常の例には、配列番号４９から５３によるものが含まれる。

ｇｌｃＢ遺伝子：本明細書で使用される「ｇｌｃＢ遺伝子」は、リンゴ酸シンターゼＧ活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を指す。この活性も、アセチル−ＣｏＡがグリオキシル酸塩及び水と反応してＳ−リンゴ酸塩及びＣｏＡを形成する反応に触媒作用を及ぼす。ｇｌｃＢ遺伝子の一例は、配列番号８によるタンパク質である。リンゴ酸シンターゼＧ活性を有するタンパク質配列は、配列番号４２より配列番号８に対して優れたアミノ酸配列同一性を有することによって、リンゴ酸シンターゼＡ活性を有するものから区別される場合がある。種々の細菌株に由来するｇｌｃＢ遺伝子の通常の例には、配列番号７によるタンパク質をコードするものが含まれる。種々の細菌株に由来するｇｌｃＢ遺伝子のその他の通常の例には、配列番号５８から６０によるものが含まれる。

異種：本明細書で使用される「異種」という用語は、異なる供給源に由来する、又は同じ供給源内の異なる位置に由来する構造を指す。

誘導物質：本明細書で使用される「誘導物質」という用語は、誘導可能プロモーターからの転写を刺激するように作用する分子を指す。誘導物質の存在（常にではないが、通常、外部分子）は、転写を刺激する。

隔離されたポリヌクレオチド：本明細書で使用される「隔離されたポリヌクレオチド」という用語は、天然の環境から除去されたポリヌクレオチド、ＤＮＡ、又はＲＮＡを指す。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、隔離されていると見なされる。隔離ＤＮＡ分子の他の例には、異種宿主細胞において維持された組換えＤＮＡ分子、又は溶液の精製された（部分的に又は実質的に）ＤＡＮ分子が含まれる。混合クローンライブラリのメンバーであり、且つライブラリの他のクローンから隔離されていないメンバーであるクローン、或いは細胞又は細胞溶解産物から隔離又は除去されていない染色体に含まれる核酸分子は、「隔離」されていない。隔離されたＲＮＡ分子には、本発明に含まれるＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのＲＮＡの写しが含まれる。隔離されたＤＮＡには又、ＰＣＲの増幅によって生成されるＤＮＡも含まれる。

組換え核酸：本明細書で使用される「組換え核酸」という用語は、異種供給源に由来する核酸を共に融合するように操作されているポリヌクレオチド配列を意味する。

天然プロモーター：本明細書で使用される「天然プロモーター」という用語は、親株の遺伝子に操作可能に結合された内因性プロモーターを指す。

非天然プロモーター：本明細書で使用される「非天然プロモーター」という用語は、天然に見られるように微生物に操作可能に結合される遺伝子とは異なる遺伝子に操作可能に結合される内因性プロモーターであるプロモーターを指す。非天然プロモーターは又、異種プロモーターである場合もある。

非天然プロモーターは又、その配列が親株に関して変更、欠失、置換、及び／又は突然変異されているプロモーターである場合もある。このような変更、欠失、置換、及び／又は突然変異は、任意の機序により生じる場合がある。幾つかの可能な機序には、化学的突然変異、紫外線突然変異、組換え、又は当業者が認識するであろうその他の手段が含まれるが、これらに限定されない。非天然プロモーターは、１つ以上の変更、欠失、置換、又は突然変異によって創出される場合がある。非天然プロモーターは、一連の親株に対する複数の及び／又は連続する突然変異、変更、欠失、及び／又は置換によって創出される場合がある。

操作可能に結合：本明細書で使用される「操作可能に結合」、「操作可能に連結」、及び「操作可能に構成」という用語は、交換可能に使用され、機能関係における核酸要素の結合を指す。核酸配列は、他の核酸配列との機能関係に置かれるとき、他の核酸配列に「操作可能に結合」される。例えば、プロモーターは、ポリペプチドコード領域の転写に影響を与える場合、ポリペプチドコード領域に操作可能に結合される。操作可能に結合された核酸は、オペロンにおいてのように、通常、共に接近又は隣接し、必要、最適、又は有用である場合、２つのポリペプチドコード領域を連続して且つ共通の転写制御下において接合する。

オペロン：本明細書で使用される「オペロン」という用語は、ｍＲＮＡをコードする核酸配列の連続部分を指し、ポリペプチドをコードする２つ以上の開読取りフレームが、マルチシストロンメッセンジャーＲＮＡとして転写され、シス作用プロモーター及び可能であれば転写の分子制御について動作する他のシス作用調節配列によって制御される。

プロモーター：本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列の一部を表し、従って、細胞におけるコード化配列又は他の機能ＲＮＡの発現を促進することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、常にではないが、一般的に、ポリペプチドをコードする１つ以上の開読取りフレームの上流にある遺伝子の５’非コード化領域において見られる。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターの配列は、近位及びより遠位の上流要素の両方を含む場合がある。細菌プロモーターにおいて維持された近位要素の例には、転写開始点の上流にある、１０塩基３５塩基がそれぞれ配置された−１０領域及び−３５領域が含まれる。プロモーターは、例えば、構成的、誘導性、又は環境応答性である場合がある。

プロモーターは、天然遺伝子から完全に誘導される場合もあれば、ハイブリッドプロモーターである場合もある。ハイブリッドプロモーターは、天然に見られる異なるプロモーターから誘導された異なる要素からなり、及び／又は合成ＤＡＮセグメントを含む場合がある。

過剰生成：本明細書で使用される「過剰生成」という用語は、基準菌株によって生成される量より多い量で細胞によって化合物が生成されることを指す。基準菌株は、例えば、本発明の菌株を生成するために使用される親株である場合がある。基準菌株は又、野生型菌株である場合もある。

過剰発現：本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、遺伝子産物（ＲＮＡ及び／又はタンパク質）が、突然変異、交差、又は組換えＤＡＮの技法によって操作されている後代有機体において、そのように操作されていない野生型菌株又は親有機体に対して、過剰生成されることを意味する。

菌株：本明細書で使用される「菌株」という用語は、同一又はほぼ同一の表現型及び遺伝子型の特徴を有する特定の種の細菌を指す。特に指示がない限り、「菌株」及び「細胞」は、本明細書では交換可能に使用される。

サプレッサー及びリプレッサー。本明細書で使用される「サプレッサー」及び「リプレッサー」という用語は、抑制可能なプロモーターからの転写を遮断又は低減するように作用する異なるタイプの分子を指す。サプレッサーは、特定の種類の受容体タンパク質に結合する小分子であり、この結合により、遺伝子の発現が抑制される。リプレッサーは、プロモーターのシス作用転写調節要素に結合するタンパク質であり、この結合により、プロモーターからの転写が抑制される。サプレッサー及びリプレッサーは、宿主細胞内で生成されることが多い。サプレッサーは、宿主細胞が成長している、又は成長する媒質に追加される場合がある。

合成プロモーター。本明細書で使用される「合成プロモーター」という用語は、プロモーター活性を有し、且つ天然に見られることが知られていないヌクレオチド配列を意味する。

収率：本明細書で使用される「収率」という用語は、消費された粗材料の量に関する生成された産物の量を指す。微生物によって生成されたアミノ酸に関して、収率は、プロセスによって消費された粗材料の量に関する生成されたアミノ酸の量を指す。例えば、１００グラムのショ糖が、２５グラムのＬ−イソロイシンを生成する微生物によって消費されるとき、ショ糖に関するＬ−イソロイシンの収率は２５％である。

コスミド：本明細書で使用される「コスミド」という用語は、プラスミド配列及びバクテリオファージ・ラムダの粘着末端からなるハイブリッドベクターを指す。

外因性：本明細書で使用される「外因性」という用語は、有機体内で天然に生じていない有機体内のＤＮＡ配列を指す。

染色体外要素：本明細書で使用される「染色体外要素」という用語は、染色体に結合されていない要素を指す。本発明の染色体外要素には、例えば、ベクターが含まれるが、これに限定されない。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウィルス、ファージトランスポゾン、又は微小染色体である場合があるが、これらに限定されない。

相同：本明細書で使用される「相同」という用語は、同じ供給源に由来する構造、或いは同じ展開の構造又は機能を有する構造を指す。

相同組換え：本明細書で使用される「相同組換え」という用語は、２つのＤＮＡ分子間において相同又はほぼ相同の配列を交換することを指す。

親株：本明細書で使用される「親株」という用語は、本発明の菌株又は宿主細胞を提供するように突然変異、電気穿孔、又は変更されている菌株、或いは本発明の菌株又は宿主細胞を提供するように突然変異、電気穿孔、又は変更されている菌株に先行する菌株を指す。

プラスミド：本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、クローニングのベクターとして使用される場合がある円形染色体外要素を指す。

内因性プロモーター：本明細書で使用される「内因性プロモーター」という用語は、野生型の選択宿主微生物内の天然のプロモーター配列であるプロモーター配列を指す。

異種プロモーター：本明細書で使用される「異種プロモーター」という用語は、選択宿主微生物内の非天然のプロモーター配列であるプロモーター配列を指す。非天然のプロモーター配列は、任意の原核有機体又は真核有機体に由来する場合がある。

調節：本明細書で使用される「調節」という用語は、分子信号に応答して幾つかの遺伝子産物のレベルを上げる、及びレベルを下げることを指す。これらの遺伝子産物は、例えば、非限定的にタンパク質及びｍＲＮＡである場合がある。調節は、遺伝子産物が特定の環境下において増大する「正の調節」（「又は誘導」）である場合がある。調節は、遺伝子産物が特定の環境下において減少する「負の調節」（又は「抑制」）である場合がある。

リボソーム結合部位（ＲＢＳ）：本明細書で使用される「リボソーム結合部位」という用語は、転写を開始するためにリボソームと結合するｍＲＮＡの領域を指す。

ベクター：本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主有機体において複製することができるＤＮＡ分子を指す。

特に指示がない限り、本明細書に新たに記載する全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． のＭｏｄｅｌ３７３等）を使用して決定された。従って、当技術分野で既知の通り、この自動手法によって決定された任意のＤＮＡ配列について、本明細書で決定した任意のヌクレオチド配列が、同じエラーを含む場合がある。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、配列ＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、一般的には少なくとも約９０％同一であり、より一般的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。

ＩＩ．菌株及びヌクレオチド
本発明の態様は、１つ以上のアミノ酸を過剰生成する細胞を生成する方法、並びにそれらの方法によって生成された細胞、それらの細胞の子孫、及び同様の特徴を有する細胞の両方を含む。本発明は、Ｌ−スレオニンの生成の文脈において本明細書では考察されるが、本発明の方法、菌株、及び構成は、非限定的にＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ホモセリン、及びＬ−リシンを含めて、アスパラギン酸塩から誘導された他のアミノ酸又は化学物質を生成するために使用される場合がある。

本発明の細菌及び方法は、既存のプロモーター又は遺伝子の「ノックアウト」を有して、又は有さずに作製される場合がある。「ノックアウト」は、プロモーター又は遺伝子が非機能的であるように、挿入又は欠失によってプロモーター又は遺伝子を物理的に置き換える。非天然プロモーターがａｃｅＢＡＫオペロン又はｇｌｃＢ遺伝子に操作可能に結合される場合、天然プロモーターは、中断又は欠失される場合がある（全体又は一部において）。代替として、非天然プロモーターは、天然プロモーターの機能活性をノックアウトすることなく、非天然プロモーターが操作可能に結合される遺伝子の天然プロモーターの上流又は下流に配置される場合がある。しかし、このような場合、非天然プロモーターは、天然プロモーターとは無関係の方式で転写を促進するようにも機能する。

幾つかのプロモーターが、本発明に適している。これらには、例えば、プロモーターであるｔａｃ、ｔｒｃ、ｌａｃ、ｌｐｐ、ｔｒｐ、ラムダＰ_Ｌ、ラムダＰ_Ｒ、ｌａｃＵＶ５、ａｒａＢＡＤ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｔ３ｌａｃ、Ｔ−ｌａｃ、Ｔ４ｇｅｎｅ３２、ｎｐｒＡｌｌａｃ、ＶＨｂ、及びタンパク質Ａが含まれるが、これらに限定されない。ｔａｃプロモーター（配列番号９）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２１−２５、ｄｅ Ｂｏｅｒら）の例示的なヌクレオチド配列が、図５に示されている。他のプロモーターの配列は、当業者に既知であり、本発明におけるその使用は、本開示内容の利益を有することにより明らかになるであろう。

本発明の菌株の１つ以上の染色体は、２つ以上のａｃｅＢＡＫオペロン及び／又はｇｌｃＤＦＧＢオペロン若しくはｇｌｃＢ遺伝子を含む場合があり、各オペロン又は遺伝子は、オペロン又は遺伝子に操作可能に結合された非天然又は天然プロモーターを独立して有する場合がある。染色体において２つ以上のａｃｅＢＡＫオペロン、ｇｌｃＤＦＧＢオペロン、及び／又はｇｌｃＢ遺伝子が存在する場合、これらは、同じ又は異なる非天然プロモーターを含む場合がある。

少なくとも１つのａｃｅＢＡＫオペロン、ｇｌｃＤＦＧＢオペロン、及び／又はｇｌｃＢ遺伝子に操作可能に結合された天然のａｃｅＢＡＫオペロン、ｇｌｃＤＦＧＢオペロン、及び／又はｇｌｃＢ遺伝子のプロモーターではないプロモーターを含むことに加えて、本発明の菌株は、ａｃｅＢＡＫオペロン、ｇｌｃＤＦＧＢオペロン、及び／又はｇｌｃＢ遺伝子、並びに非天然プロモーターに操作可能に結合されたリボソーム結合部位を含む場合があり、リボソーム結合部位は、天然ａｃｅＢＡＫオペロン、ｇｌｃＤＦＧＢオペロン及び／又はｇｌｃＢ遺伝子リボソーム結合部位、或いは非天然リボソーム結合部位である。本発明において使用される非天然リボソーム結合部位は、ｌａｃ、ｔｈｒＡ、ｆｏｌＡ、ａｒａｃ、ａｒａＢ、ｇａｌＥ、ｏｍｐＡ、ｔｒｙｐＥ、ｌａｍＢ、ＭＳ２コート、及びＱＢコートに由来するリボソーム結合部位を含む。

本開示内容を通して、本発明において開示されるヌクレオチド配列及び／又はプロモーターは、それらの配列及び／又はプロモーターのコンセンサス、並びに本発明の幾つかの態様では、開示された配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列の両方を含むと解釈されなければならないことが理解されなければならない。

実際には、任意の特定のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヌクレオチド配列又は相補ヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるかは、従来から、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｌｔｄ．（英国オックスフォード）から入手可能なＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＯＭＩＧＡ（登録商標） Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０等、配列分析コンピュータプログラムを使用して決定することができる。ＯＭＩＧＡ（登録商標）は、２つのヌクレオチド配列の間で最適な整列を見つけるために、１０の開ギャップペナルティ及び５．０の拡張ギャップペナルティのデフォルトパラメータを有するスローフル動的プログラミング整列方法を使用するＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ整列アルゴリズムを使用する。特定の配列が例えば基準配列に９５％同一であるかを決定するために、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ又は別の配列整列プログラムを使用する場合、パラメータは、同一のパーセンテージが基準ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように設定される場合があり、それにより、基準配列におけるヌクレオチドの総数の最高で５％のギャップ、不整合、又は挿入が可能になる。当技術分野で既知の他の配列分析方法及びプログラムが、本発明において使用される場合がある。

本開示内容に記載の実験では、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標）から入手可能な配列決定プログラムである、ＧＣＧ（登録商標） Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３又は１１．１、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州サンディエゴ］；ＳｅｑＬＡｂの一部は、当初イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校微生物学科で開発され、ＧＣＧにライセンスが付与された“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＧＤＥ）”をベースとする）を使用した。使用したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）のエレメントには、ＧＡＰ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＦＡＳＴＡ、及びＢＬＡＳＴが含まれる。

Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国イリノイ州ピオリア）にて２００５年５月１１日に寄託され、それぞれ、寄託番号ＮＲＲＬＢ−３０８４４、ＮＲＲＬＢ−３０８４５、ＮＲＲＬＢ−３０８４６、ＮＲＲＬＢ−３０８４７、ＮＲＲＬＢ−３０８４８、ＮＲＲＬＢ−３０８４９、ＮＲＲＬＢ−３０８５０、及びＮＲＲＬＢ−３０８５１が付与された、細菌株ｓ４３９７−１８４−１、ｓ４４８０−１４０−５、ｓ４４８０−１４８−１、ｓ４４８０−１９９−１、ｓ４５３８−００３−１、ｓ４４８０−１９９−４、ｓ４３９７−１０９−２、及びｓ４５３８−００６−２は、本発明の種々の態様を実証する。例えば、ｓ４３９７−１８４−１では、ｔａｃプロモーターは、大腸菌のａｃｅＢＡＫオペロンに操作可能に結合されていた。この菌株は、振盪フラスコにて試験されるとき、野生型大腸菌におけるリンゴ酸シンターゼ活性及びスレオニン力価と比較して、リンゴ酸シンターゼＡ活性を増大させ、且つスレオニン力価を増大させることができる。これらの菌株の結果は、以下の例４及び例５においてより完全に述べられている。

尚更なる態様において、本発明は、ａｃｅＡ遺伝子、ａｃｅＢ遺伝子、及びｇｌｃＢ遺伝子の少なくとも１つに操作可能に結合された非天然プロモーターを含む核酸を含み、核酸は、イソクエン酸リアーゼ、リンゴ酸シンターゼＡ、又はリンゴ酸シンターゼＧの少なくとも１つをそれぞれコードする。ａｃｅＡ遺伝子に対応するポリペプチドの非限定的な例には、配列番号３及び配列番号２８から３５によるタンパク質が含まれる。ａｃｅＡ遺伝子の通常の例には、配列番号２及び配列番号２７において列挙された核酸配列が含まれる。種々の細菌株に由来するａｃｅＡ遺伝子のその他の例には、配列番号３６から４１によるものが含まれる。ａｃｅＢ遺伝子に対応するポリペプチドの非限定的な例には、配列番号４２から４８によるタンパク質が含まれる。ｇｌｃＢ遺伝子に対応するポリペプチドの非限定的な例には、配列番号８及び配列番号５４から５７によるタンパク質が含まれる。以上のポリヌクレオチドの非限定的な例は、配列番号９、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３６〜４１、配列番号４５〜５３、及び配列番号５８〜６０による核酸である。

ポリヌクレオチドは又、遺伝コードに関して縮重である選考ポリヌクレオチド配列の１つによるＤＮＡ、又は異常の配列の非表現突然変異を含むＤＮＡである場合もある。このような非表現突然変異は、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら、“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）で考察されている。ポリヌクレオチドは又、ＤＮＡと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるＤＮＡ、縮重変性を有するＤＮＡ、又は上で考察したような沈黙変性を有するＤＮＡ、或いは上で考察した何れかのＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである場合もある。本発明は又、本段落に記載のポリヌクレオチドの何れかを提供するベクターを含む場合もある。

ＩＩＩ．ＤＮＡ構築物
別の態様において、本発明は、天然ではない少なくとも１つのプロモーターに操作可能に結合された、ｇｌｃＢ遺伝子、ａｃｅＡ遺伝子、及び／又はａｃｅＢ遺伝子等、大腸菌ａｃｅＢＡＫオペロン及び／又はオペロンの少なくとも一部を含むＤＮＡ構築物（例えば、ベクター）を含む。本発明のＤＮＡ構築物は、ｌａｃリボソーム結合部位等、含まれている遺伝子の天然大腸菌遺伝子リボソーム結合部位ではないリボソーム結合部位を更に含む場合がある。本発明のＤＮＡ構築物は、当業者に既知の他の調節要素又は追加のＤＮＡ要素を含む場合がある。

本発明のＤＮＡ構築物は、１つ以上のベクターである場合がある。本発明のベクターは、少なくとも１つの調節要素を含む場合がある。例えば、調節要素は、プロモーター、オペレータ、活性化体、リプレッサー、及び／又はエンハンサーである場合がある。ベクターは又、１つ以上の開始配列、及び／又は１つ以上のリボソーム結合部位を含む場合もある。ベクターは、選択マーカーを更に含む場合がある。調節要素は、宿主細胞の染色体の上及び／又はその他のベクターの内部に配置される場合がある。

本発明の一態様において、大腸菌に異種の少なくとも１つのプロモーターに操作可能に結合されたａｃｅＡ遺伝子、ａｃｅＢ遺伝子、又はｇｌｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ構築物が提供される。本発明の更なる態様において、ＤＮＡ構築物は、ａｃｅＡ遺伝子、ａｃｅＢ遺伝子、又はｇｌｃＢ遺伝子に操作可能に結合された少なくとも１つのリボソーム結合部位、及び天然大腸菌ａｃｅＡ、ａｃｅＢ、又はｇｌｃＢプロモーターではないプロモーターを更に備え、前記少なくとも１つのリボソーム結合部位は、それらの遺伝子の天然大腸菌リボソーム結合部位ではない。

本発明のベクターは、プラスミド、コスミド、ウィルス、ファージ、トランスポゾン、又は微小染色体である場合があるが、これらに限定されない。本発明の更なる態様において、ＤＮＡ構築物においてａｃｅＡ遺伝子、ａｃｅＢ遺伝子、又はｇｌｃＢ遺伝子に操作可能に結合されたプロモーターは、例えば、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌａｃ、ｌｐｐ、ｔｒｐ、ラムダＰ_Ｌ、ラムダＰ_Ｒ、ｌａｃＵＶ５、ａｒａＢＡＤ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｔ３ｌａｃ、Ｔ−ｌａｃ、Ｔ４遺伝子３２、ｎｐｒＭｌａｃ， ＶＨｂ、及びタンパク質Ａである場合があるが、これらに限定されない。

本発明の更なる態様においては、本発明のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、例えば大腸菌を含めて、微生物である場合があり、当業者によって所望される場合がある他の修正又は包含を含む場合がある。宿主細胞は、Ｌ−スレオニンを生成する場合がある。一態様において、宿主細胞は、本発明の少なくとも１つのＤＮＡ構築物を担持しない親細胞より高い収率でＬ−スレオニンを生成する。

ＩＶ．アミノ酸を生成するための培養媒地及びプロセス
本発明は又、全般的にアミノ酸を生成する発酵プロセスにおいて上述され、且つ以下において請求される菌株及び宿主細胞を使用することも対象とする。このようなアミノ酸は、アスパラギン酸塩ファミリのアミノ酸を含む場合がある。スパラギン酸塩ファミリのアミノ酸は、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ホモセリン、及びＬ−リシンを含む場合がある。アミノ酸は、例えば、少なくとも１つの炭素供給源、少なくとも１つの窒素供給源、及び適切であれば無機塩、成長因子等を含む合成媒地又は天然媒地において本発明の菌株又は宿主細胞を培養することによって得られる場合がある。

適切な炭素供給源の例には、ブドウ糖、果糖、スターチ、ショ糖、スターチ加水分解産物、セルロース加水分解産物、及び糖蜜等の炭水化物；酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、及びフマル酸等の有機酸；並びにグリセロール及びエタノール等のアルコールが含まれるが、これらに限定されない。

適切な窒素供給源の例には、アンモニア気体及び水溶性アンモニアを含むアンモニア、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及び酢酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩；並びに肉エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解産物、大豆かす加水分解産物、及び酵母エキスを含む他の窒素包含物質が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の共に使用するのに適切な培養媒地には、以下の媒質が含まれるが、これらに限定されない。

１． 最小培地。デイビス最小培地（１リットル当たり、７．０ｇのリン酸二カリウム、２．０ｇのリン酸一カリウム、０．５ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、０．１硫酸マグネシウム、１．０ｇの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で、炭素供給源（通常はブドウ糖）が０．１％（ｗ／ｖ）に補足され、必要であればアミノ酸供給源（通常は０．１％カザミノ酸（ｗ／ｖ）又は０．１５％酵母エキス（ｗ／ｖ））が補足されている）。

２． ＬＢ（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）
３． ＢＴＹ２（１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１０．０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４０．８ｇ／ＬのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１５ ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、３２．５ｇ／Ｌのショ糖、及び１．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ ｐＨ７．０）
３． ＢＴＣ３（１．０ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、１０．０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４０．８ｇ／ＬのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、２０ｍ１／１の５０％固体コーンスティープリカー（Ｓｉｇｍａ）、２５．０ｇ／Ｌのショ糖、及び１．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、ｐＨ７．０で、必要であればアミノ酸供給源（通常は０．１％カザミノ酸（ｗ／ｖ）又は１．５％酵母エキス（ｗ／ｖ））が補足されている。

アミノ酸は、例えばバッチタイプ又は供給バッチタイプの発酵プロセス等において、本発明の菌株を使用して商用的に生成される場合がある。バッチタイプの発酵では、栄養源が、発酵の開始に追加される。供給バッチ又は拡張供給バッチのタイプの発酵では、１つ以上の栄養源が、（１）培養物に連続的に、（２）発酵の開始から、若しくは培養物がある年齢に到達した後、及び／又は（３）供給される栄養源が培養基から枯渇するとき、供給される。

供給バッチタイプ発酵の拡張バッチの変形形態は、反復供給バッチ発酵又は充填及び抽出発酵であり、発酵槽の含有物の一つが、栄養源の供給を続行しながら、特定の時間（例えば、発酵槽が満杯のとき）に除去される場合がある。このようにして、発酵は、このような方法が使用されないときと比較してより長い時間に延長することができる。

他のタイプの発酵である連続発酵又はケモスタット培養は、完全培地の連続供給を使用し、一方、培養物流体は、発酵槽のブロスの容積がほぼ一定であるように連続的又は半連続的に抽出される。連続発酵は、理論的には、無限の時間期間維持することができる。

バッチ発酵では、培養された有機体は、培地の本質的な栄養源の１つが枯渇するまで、又は発酵条件が不利益になる（例えば、ｐＨが微生物の成長を阻害する値に減少する）まで、成長する。供給バッチ発酵では、測定は、有益な成長条件を維持するように通常は行われ（例えば、ｐＨ制御を使用して）、１つ以上の栄養源の枯渇は、これらの栄養源を培養物に供給することによって防止される。培養された微生物は、通常、栄養源の供給率によって決定される率で成長し続ける。

幾つかの場合、単一の栄養源、非常にしばしば炭素供給源が、成長を限定する。同じ原理が、連続発酵中に当てはまり、培地供給の１つの栄養源が制限的である場合があり、且つ他の栄養源の全てが過剰である。微生物が成長を停止した後、制限栄養源は、一般的に、過度に低い濃度で培養物流体に存在する。

異なるタイプの栄養源の制限を使用することができるが、炭素源の制限が、最もしばしば使用される。制限栄養源の他の例には、窒素、硫黄、リン、微量金属、及び酸素の供給源が含まれる。ビタミン及びアミノ酸も、具体的には培養されている微生物が制限アミノ酸又は制限ビタミンについて栄養要求性である場合、制限栄養源である場合がある。

培養後、培養物ブロスにおいて累積したアミノ酸（例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−リシン、又はＬ−イソロイシン）は、種々の方法の１つ以上により、ブロスから部分的に又は完全に分離される場合がある。例えば、イオン交換樹脂が、米国特許第５，３４２，７６６号に記載された方法により、Ｌ−スレオニンを精製するために使用される場合があることが報告されている。この方法は、まず、遠心分離によって微生物を培養ブロスから除去し、次いで、塩酸を使用してブロスのｐＨを約２に調節することを含む。その後、酸性化された溶液は、強酸陽イオン交換樹脂を通過し、吸着剤が、希釈水性アンモニアを使用して溶出する。アンモニアは、真空下において蒸発によって除去され、得られた溶液は濃縮される。アルコールを追加し、その後冷却することにより、Ｌ−スレオニンの結晶が提供される。培養基からＬ−イソロイシンを精製する他の方法が、米国特許第５，４７４，９１８号で報告されている。

ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の幾つかの態様を単に代表するものである。当業者であれば、本明細書に記載の通り、本発明を種々の微生物及びプロモーターで実施できることを理解するであろう。本明細書で使用されるこれらの実施例及び菌株は、特許請求の範囲で明示的に言及していない何れかの方式で本発明を限定するものとして解釈してはならない。

（実施例１）
実施例１は、ａｃｅＢＡＫオペロンの遺伝子の発現を増大させる方式で、ａｃｅＢの上流の位置にｔａｃプロモーターを挿入することによって、リンゴ酸シンターゼ及びイソクエン酸リアーゼを過剰生成する菌株を生成することを記載する。

プラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性遺伝子をコードする線形ＤＮＡで菌株４３７０−６９−２を形質変換することによって、ｔａｃプロモーター（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９８３及び図５）を野生型ａｃｅＢ遺伝子の上流に挿入した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ， ２０００）（図３）。菌株４３７０−６９−２である親株には抗生物質耐性マーカーがない。これを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国イリノイ州ピオリア）にて２００５年５月１１日に寄託し、寄託番号ｒＮＲＲＬ−Ｂ−３０８４３を付与した。プライマーａｃｅＢＵＳ−ｋａｎ４（配列番号１０）及びプロモーター構築物特有プライマー（ｔａｃａｃｅＢ−ｋａｎ３（配列番号１１）、ｔａｃ（２）ａｃｅＢ−ｋａｎ３（配列番号１２）、又はｔａｃ（３）ａｃｅＢ−ｋａｎ３（配列番号１３））を使用するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）において、プラスミドｐＫＤ４をテンプレートとして使用した。全てのプライマー配列を図４に列挙する。代替として、プライマーａｃｅＢＵＳ−ｋａｎ４（配列番号１０）及びプロモーター構築物特有プライマー（ｔａｃ（４）ａｃｅＢ（配列番号１４）、ｔａｃ（５）ａｃｅＢ（配列番号１５）、又はａｃｅＢ−ｔａｃ＼ｌａｃｒｅｖ（配列番号１６））を使用するテンプレートとして、菌株ｓ４３９７−１８４−１（Ｐｔａｃ−ａｃｅＢＡＫ）（表１）の染色体ＤＮＡを使用した。これらのＰＣＲ産物は、菌株ＭＧ１６５５のａｃｅＢアレルの配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７）と相同の配列が側面に位置するカナマイシン耐性遺伝子を含み、ｔａｃプロモーターをａｃｅＢＡＫプロモーター（Ｃｈｕｎｇら、１９８８）の代用とした。ＰＣＲは、製造業者の指示に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ^ＴＭ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実施した。５０ｕｌの反応は、５μＬの１０Ｘ ＨＦ ＰＣＲ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ専売処方）、５μＬの１０Ｘ ＨＦ ｄＮＴＰミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ専売処方）、１μＬ ５０Ｘ Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦポリメラーゼミックス（これは、５０％のグリセロール、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２５％のＴｈｅｓｉｔ、１．１μｇ／μＬのＴａｑＳｔａｒｔ抗体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ専売量のＫｌｅｎＴａｑ−１ＤＮＡポリメラーゼ、専売量のＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ^ＴＭ ＤＮＡポリメラーゼからなる）、０．５μＬの各プライマー（１００ｐｍｏｌ／ｕ１）、及び１μＬのテンプレートＤＮＡ（１−５０ｐｇ／μＬ）を含んでいた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９７００サーモサイクラーにおいて、循環を以下のように実施した：９４℃にて４分の事前処置、次いで、９４℃にて１０秒、５５℃にて３０秒、及び６８℃にて９０秒の２５サイクル。

表１．８つの異なる過剰発現菌株の構成。各プロモーター遺伝子融合を導入するために使用されるプライマー及びテンプレート、並びに結果として得られる菌株の菌株名称を列挙する。

次いで、ＰＣＲ産物を使用して、以前に記載されたプロトコル（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ， ２０００）に従ってプラスミドｐＫＤ４６を担持する菌株ｓ４３７０−６９−２を形質変換したが、以下が修正されている：オービタルフラスコ上で３０℃にて成長するプラスミドｐＫＤ４６を担持する菌株ｓ４３７０−６９−２の５０ｍＬのＬＢ（Ｄｉｆｃｏ）培養物を２５０ｍＬバフル振盪フラスコにて０．４のＯＤ_６００に成長させた。次いで、０．５ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）アラビノースを追加し、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ （２０００）のプロトコルに従って細胞がエレクトロコンピテントになる時間である２．０時間、更に成長することを可能にした。１．０〜３．０μｇの沈殿したＰＣＲ産物を４５□のエレクトロコンピテント細胞に懸濁させ、混合物を０．１ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移送することによって、エレクトロポレーションを実施した。次いで、キュベットを、１．８ｋＶ、２５０Ｆ、及び２００ΩでＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標） ＩＩにおいてパルス化した。次いで、細胞を１ｍＬの２ＹＴ（Ｄｉｆｃｏ）において４時間３７℃で成長させ、１ｍＬ全体を５０□ｇ／ｍＬカナマイシンと共にＬＢアガー（Ｄｉｆｃｏ）の上に平板培養し、３７℃にて１〜２日培養した。Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ （２０００）に記載の通り、得られたカナマイシン耐性菌株をプラスミドｐＫＤ４６から除き、菌株ｓ４３９７−１８４−１（Ｐｔａｃ−ａｃｅＢＡＫ）、ｓ４４８０−１４０−５（Ｐｔａｃｐ−ａｃｅＢＡＫ）、ｓ４４８０−１４８−１（Ｐｔａｃ（３）−ａｃｅＢＡＫ）、ｓ４４８０−１９９−１（Ｐｔａｃ（４）−ａｃｅＢＡＫ）、ｓ４５３８−００３−１（Ｐｔａｃ（５）−ａｃｅＢＡＫ）、及びｓ４４８０−１９９−４（Ｐｔａｃ＼ｌａｃ−ａｃｅＢＡＫ）（表１）を得た。

（実施例２）
以下の実施例では、ｇｌｃＢ遺伝子産物の発現を増大させるように配置された大腸菌のｇｌｃＢの上流にｔａｃプロモーターを導入することによってリンゴ酸シンターゼを過剰生成する菌株の生成を説明する。

ｔａｃプロモーター（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９８３年及び図５）をｇｌｃＢ遺伝子の上流に挿入し、プラスミドｐＢＳＬ−１７５（Ａｌｅｘｅｙｅｖら、１９９５）に由来するスペクチノマイシン耐性遺伝子をコードする線形ＤＮＡで菌株ｓ４３７０−６９−２を形質変換することによって、ＧｌｃＢの発現を駆動する（図３）。プライマーｇＩｃＢＵＳ−ｓｐｃ２（配列番号１８）及びｔａｃ−ｇｌｃＢ−ｓｐｃｌ（配列番号１７）を使用するＰＣＲにおいて、プラスミドｐＢＳＬ１７５をテンプレートとして使用した（全てのプライマー配列を図４に列挙する）。このＰＣＲ産物は、ＭＧ１６５５（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７）のｇｌｃＢアレルの配列と相同の配列が側面に位置するスペクチノマイシン耐性遺伝子を含んでおり、ｔａｃプロモーターをｇｌｃＢ遺伝子のすぐ上流にあるＤＮＡの代用とした。製造業者の指示に従って、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ^ＴＭ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してＰＣＲを実施した。５０μＬの反応は、５μＬの１０Ｘ ＨＦ ＰＣＲ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ専売処方）、５μＬの１０Ｘ ＨＦ ｄＮＴＰ ミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ専売処方）、１μＬ ５０Ｘ Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦポリメラーゼミックス（これは、５０％のグリセロール、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２５％のＴｈｅｓｉｔ、１．１μｇ／μＬのＴａｑＳｔａｒｔ抗体、専売量のＫｌｅｎＴａｑ−１ＤＮＡポリメラーゼ、及び専売量のＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ^ＴＭ ＤＮＡポリメラーゼからなる）、０．５μＬの各プライマー（１００ｐｍｏｌ／ｕ１）、及びｌμＬのテンプレートＤＮＡ（１−５０ｐｇ／μＬ）を含んでいた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ９７００サーモサイクルラにおいて、循環を以下のように実施した：９４℃にて４分の事前処置、次いで、９４℃にて１０秒、５５℃にて３０秒、及び６８℃にて９０秒の２５サイクル。

次いで、ＰＣＲ産物を使用して、以前に記載したプロトコル（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ， ２０００）に従ってプラスミドｐＫＤ４６を担持する菌株ｓ４３７０−６９−２を形質変換したが、以下が修正されている：オービタルフラスコ上で３０℃にて成長するプラスミドｐＫＤ４６を担持する菌株ｓ４３７０−６９−２の５０ｍＬのＬＢ（Ｄｉｆｃｏ）培養物を（２５０ｍＬバフル振盪フラスコにて）０．４のＯＤ_６００に成長させた。次いで、０．５ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）アラビノースを追加し、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ （２０００）のプロトコルに従って細胞がエレクトロコンピテントになる時間である２．０時間、更に成長することを可能にした。１．０−３．０μｇの沈殿したＰＣＲ産物を４５□のエレクトロコンピテント細胞に懸濁させ、混合物を０．１ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移送することによって、エレクトロポレーションを実施した。次いで、キュベットを、１．８ｋＶ、２５□Ｆ、及び２００ΩでＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩにおいてパルス化した。次いで、細胞を１ｍＬの２ＹＴ（Ｄｉｆｃｏ）において４時間３７℃で成長させ、１ｍＬ全体を５０□ｇ／ｍＬカナマイシンと共にＬＢアガー（Ｄｉｆｃｏ）の上に平板培養し、３７℃にて２〜３日培養した。Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ （２０００）に記載の通り、得られたカナマイシン耐性菌株をプラスミドｐＫＤ４６から除き、菌株ｓ４３９７−１０９−２を得た。

（実施例３）
以下の実施例では、ｇｌｃＢ及びａｃｅＢＡＫ遺伝子産物を構成的に過剰発現するように配置された大腸菌のｇｌｃＢの上流及びａｃｅＢＡＫオペロンの上流にｔａｃプロモーターを導入することによって、リンゴ酸シンターゼ及びイソクエン酸リアーゼを過剰生成する菌株の生成を説明する。

プラスミドｐＫＤ４に由来するカナマイシン抵抗遺伝子をコードする線形ＤＮＡで菌株ｓ４３７０−６９−２を形質変換することによって、ｔａｃプロモーター（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９８３及び図５）を菌株ｓ４３９７−１０９−２の野生型ａｃｅＢ遺伝子の上流に挿入した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ）（図３）。プライマーａｃｅＢＵＳ−ｋａｎ４（配列番号１０）及びｔａｃａｃｅＢ−ｋａｎ３（配列番号１１）を使用するＰＣＲにおいて、プラスミドｐＫＤ４をテンプレートとして使用した（全てのプライマー配列を図４に列挙する）。このＰＣＲ産物は、ＭＧ１６５５（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７）に由来するｇｌｃＢアレルの配列と相同の配列が側面に位置するスペクチノマイシン耐性遺伝子を含んでおり、ｔａｃプロモーターをａｃｅＢＡＫプロモーターの代用とした（Ｃｈｕｎｇら、１９８８）。製造業者の指示に従って、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ^ＴＭ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してＰＣＲを実施した。５０μＬの反応は、５μＬの１０Ｘ ＨＦ ＰＣＲ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ専売処方）、５μＬの１０Ｘ ＨＦ ｄＮＴＰ ミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ専売処方）、１μＬ ５０Ｘ Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦポリメラーゼミックス（これは、５０％のグリセロール、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２５％のＴｈｅｓｉｔ、１．１μｇ／μＬのＴａｑＳｔａｒｔ抗体、専売量のＫｌｅｎＴａｑ−１ＤＮＡポリメラーゼ、及び専売量のＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ^ＴＭ ＤＮＡポリメラーゼからなる）、０．５μＬの各プライマー（１００ｐｍｏｌ／ｕＬ）、並びにｌμＬのテンプレートＤＮＡ（１−５０ｐｇ／μＬ）を含んでいた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ９７００サーモサイクルラにおいて、循環を以下のように実施した：９４℃にて４分の事前処置、次いで、９４℃にて１０秒、５５℃にて３０秒、及び６８℃にて９０秒の２５サイクル。

次いで、ＰＣＲ産物を使用して、以前に記載したプロトコル（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ， ２０００）に従ってプラスミドｐＫＤ４６を担持する菌株ｓ４３７０−１０９−１を形質変換したが、以下が修正されている：オービタルフラスコ上で３０℃にて成長するプラスミドｐＫＤ４６を担持する菌株ｓ４３７０−１０９−１の５０ｍＬのＬＢ（Ｄｉｆｃｏ）培養物を（２５０ｍＬバフル振盪フラスコにて）０．４のＯＤ_６００に成長させた。次いで、０．５ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）アラビノースを追加し、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ （２０００）のプロトコルに従って細胞がエレクトロコンピテントになる時間である２．０時間、更に成長することを可能にした。１．０−３．０μｇの沈殿したＰＣＲ産物を４５□Ｌのエレクトロコンピテント細胞に懸濁させ、混合物を０．１ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移送することによって、エレクトロポレーションを実施した。次いで、キュベットを、１．８ｋＶ、２５ＯＦ、及び２００ΩでＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標） ＩＩにおいてパルス化した。次いで、細胞を１ｍＬの２ＹＴ（Ｄｉｆｃｏ）において４時間３７℃で成長させ、１ｍＬ全体を５０□ｇ／ｍＬカナマイシンと共にＬＢアガー（Ｄｉｆｃｏ）の上に平板培養し、３７℃にて１〜２日培養した。

Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ （２０００）に記載の通り、得られたカナマイシン耐性菌株をプラスミドｐＫＤ４６から除き、菌株ｓ４５３８−００６−１を得た。

（実施例４）
以下の実施例は、構成的に高レベルのグリオキシル酸シャント酵素を提供するために、ｇｌｃＢ及びａｃｅＢＡＫオペロンの上流にｔａｃプロモーターを配置して、発現を駆動する使用法を示す。

リンゴ酸シンターゼ及びイソクエン酸リアーゼの酵素特有活性を測定することによって、グリオキシル酸シャント遺伝子の発現レベルを評価した。２４０ｒｐｍで３７℃のＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｇ５３振盪機で２５０ｍＬバッフルフラスコにおいて、０．１％（ｗ／ｖ）のカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）及び０．４％（ｗ／ｖ）ショ糖又は０．４％（ｗ／ｖ）グリセロールと０．４％酢酸ナトリウム（ｗ／ｖ）の組み合わせが補足された５０ｍＬデイビス最小培地（Ｄｉｆｃｏ）で酵素検定の培養物を成長させた。Ｏｒｎｓｔｏｎ ａｎｄ Ｏｒｎｓｔｏｎ （１９６９）の方法に従って、アセチル−ＣｏＡに由来する遊離ＣｏＡのグリオキシル酸塩依存放出を追跡することによって、リンゴ酸シンターゼのレベルを測定した。Ｍａｌｏｙ， ｅｔ ａｌ． （１９８０）の方法に従って、グリオキシル酸塩のイソクエン酸塩依存生成を追跡することによって、イソクエン酸リアーゼのレベルを測定した。表２は、野生型に対してショ糖又はグリセロール更に酢酸塩が補足されて成長したかに関係なく、ａｃｅＢ遺伝子の前にｔａｃプロモーターを導入することにより、リンゴ酸シンターゼ及びイソクエン酸リアーゼの両方の酵素レベルが上昇することを示す。表２は又、ｇｌｃＢ遺伝子の前にｔａｃプロモーターを導入することにより、リンゴ酸シンターゼのレベルは上昇するが、イソクエン酸リアーゼのレベルは変化しないことを示す。

表２：７つの過剰発現菌株並びに親株（ｓ４３７０−６９−２）のリンゴ酸シンターゼ及びイソクエン酸リアーゼ特有の活性。各菌株／培地の組み合わせを最小限６回検定し、平均を示す。０．１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）が補足されたデイビス最小培地（Ｄｉｆｃｏ）において、菌株を成長させた。炭素供給源は、０．４％ショ糖又は０．４％グリセロール＋０．４％酢酸ナトリウムであった。

（実施例５）
以下の実施例は、スレオニンの収率及びスレオニン生成菌株における力価を増大させるために、グリオキシル酸シャントの酵素を過剰発現させる有用性を示す。

培地ＢＴＣ３（１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１０．０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４０．８ｇ／ＬのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、２０ｍ１／１５０％固体コーンスティープリカー（Ｓｉｇｍａ）、２５．０ｇ／Ｌのショ糖、及び１．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４−７Ｈ２ＯｐＨ７．０）を使用して、過剰発現菌株の性能を振盪フラスコにて試験した。培地ＢＴＹ２（１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１０．０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４０．８ｇ／ＬのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１５ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、３２．５ｇ／Ｌのショ糖、及び１．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４−７Ｈ２ＯｐＨ７．０）（０．１ｍＬを２０ｍＬ ＢＴＹ２の中へ）を接種するために、能動的に成長するＬＢ（Ｄｉｆｃｏ）培養物を使用した。１８時間後、０．２５ｍＬのＢＴＹ２を２０ｍＬのＢＴＣ３の中に通した。２４時間後、ＢＴＣ３培養物を収穫し、スレオニン及びショ糖の濃度を決定した。２４０ｒｐｍで３７℃に設定されたＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｇ５３振盪機で２５０ｍＬバッフルフラスコにおいて、全ての培養物を成長させた。結果を表３、４、及び５に示す。

表３、表４及び表５：振盪フラスコにおける突然変異菌株のスレオニン生成。培養物を培地ＢＴＣ３において成長させ、スレオニン及びショ糖の濃度を決定した。示された代表的な実験は、各菌株の６つのフラスコの平均である。異なる表が同じ菌株を示すが、結果は、１週だけ離れている。

（実施例６）
実施例６は、大腸菌の天然ｇｌｃＢプロモーターに操作可能に結合されたｌａｃプロモーターを含むプラスミドを導入することによってリンゴ酸シンターゼＧを過剰生成する菌株の生成を含む。実施例６は、予測的な実施例である。実施例６の実験及び手順は実施されておらず、単に例示的なものとして意図される。

プラスミドのｌａｃプロモーターに操作可能に結合された大腸菌菌株ｓ４３７０−６９−２由来のｇｌｃＢ遺伝子を含むｐＵＣ系ラスミドを構築する。プラスミドの構築は、当業者に既知であり、且つ本開示内容の利益を有する方法によって実施される。エレクトロポレーションによってｌａｃ：：ｇｌｃＢプラスミドをｓ４３７０−６９−２親株に導入し、ｌａｃプロモーターの動作によってｇｌｃＢを過剰発現する菌株を生成する。プラスミドを含むことは、制約マッピング及びサザンブロット分析によって実証されている。

ｇｌｃＢの発現レベルを示すために、この実施例において生成された菌株を適切な培地において培養する。このような培地は、カザミノ酸及びショ糖又はグリセロールと酢酸ナトリウムの組み合わせが補足されたデイビス最小培地である場合があるが、これらに限定されない。リンゴ酸シンターゼＧのレベルは、２程度に低い比活性から親株における比活性より７５倍高い比活性によって実証されるように、親株での同様の実験に対して上昇する。

上述のＢＴＣ３等の成長培地における修正菌株の培養によって示される通り、リンゴ酸シンターゼＧのレベルの上昇により、親株におけるＬ−スレオニンの生成と比較して、修正菌株におけるＬ−スレオニンの生成が増大する。修正プラスミド包含菌株の培養のＬ−スレオニン収率は、親株の収率に対して１０％程度も増大する。

本明細書で参照又は言及される特許、特許出願、刊行物、科学論文、書籍、ウェブサイト、並びにその他の文書及び資料は、本発明が属する業界の当業者の技能レベルを示すものである。このように参照した文献及び資料はそれぞれ、全体が個別に参考として援用されるか、或いは全体が本明細書に記載又は翻刻される場合と同じように、参考として本明細書で援用される。更に、本出願における全ての請求、並びに元の請求を含むがこれらに限定されない全ての優先出願は、全体が本発明の記載された説明で援用されるか、又はその一部を形成する。出願者等は、このような特許、出願、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に利用可能な情報、及びその他の参考資料又は文書から引用した何れか全ての資料及び情報を本明細書で物理的に援用する権利を留保する。出願者等は、記載された説明の何れの部分も含め、記載された説明の何れの部分にも、何れの元の請求も含むがこれらの限定されない上述の請求を物理的に組み込む権利を留保する。

本明細書において本発明を広範且つ概略的に説明してきた。包括的な開示内容の範囲内に含まれるより狭い範囲の種及び亜族群もそれぞれ、これらの発明の一部を形成する。これには各発明の包括的な説明が含まれ、従ってこれには、実施された材料又は選択肢が本明細書で具体的に言及又は同定されているかにかかわらず、本発明のあらゆる請求項を含め、何れかの主題を属から削除するか、場合により削除することを可能にする但し書き又は否定的制限が含まれ、且つこのような変更全てが、本発明の記載された元の説明の一部を構成する。更に、本発明の特徴又は態様がＭａｒｋｕｓｈグループの観点から記載されている場合は、本発明が、Ｍａｒｋｕｓｈグループの個々のメンバー又はメンバーのサブグループの全て及び何れかの観点から記載されているものとして理解されなければならない。

本明細書に例示的に記載及び請求される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、又は本明細書に本質として記載されていない何れか１つ以上の要素、１つ以上の制限がない状態で適切に実施することができる。従って、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「例えば」等の用語は、拡張的且つ非限定的に読まなければならない。本発明の請求において、本発明者等は、何れかの変形的な句をその他何れかの変形的な句で代用する権利を留保しており、本発明は、このような代用した移行を含み、本発明の記載された元の説明の一部を構成することが理解されなければならない。従って、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「本質的に〜からなる」又は「からなる」という変形的な句の何れかで置き換えられる場合がある。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数冠詞“ａ”、“ａｎ”、及び“ｔｈｅ”は、特に文脈において明示的な指示がない限り、複数の言及を含む。

何れに場合にも、本特許は、本明細書に具体的に開示される特定の実施例又は実施形態又は方法に限定されるものとして解釈してはならない。又、何れに場合にも、本特許は、特許商標庁の何れかの調査官又はその他何れかの職員若しくは従業者による何れかの声明が、発行前に本特許を導き出した出願に具体的に関連する応答文書において出願人により具体的に、且つ制限又は留保なく明示的に採用されない限り、このような声明によって限定されるものとして解釈してはならない。

本明細書で使用される用語及び表現は、例示するものとして使用され、限定するものとして使用されておらず、このような用語及び表現又はそれらの何れか一部を使用するに当たって、現在既知であるか、今後開発される何れかの等価物が、本明細書に定められているか、示されているか、記載されているか、或いはこのような等価物が、予測可能であると見なされているかにかかわらず、このような等価物を除外することを意図することはなく、本発明の請求が何らかの理由で変更又は修正を伴って又は伴わずに発行されているかにかかわらず、種々の改変が、本発明の請求する適用範囲内に含まれることを理解されたい。従って、本発明を、好ましい実施形態及び任意の特徴を使用して具体的に開示してきたが、これらで実現された、又は本明細書に開示された本発明の改変及び変更は、当業者によって採用することができ、このような改変及び変更は、本明細書で開示及び請求された本発明の適用範囲内に含まれるものとして見なされる。

本明細書に記載の具体的な方法及び組成物は、好ましい実施形態を表し、例示的なものであり、本発明の適用範囲を限定するものとして意図されない。その他の目的、態様及び実施形態も、本明細書を考慮すると当業者が思い付くものであり、特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨の範囲内に包含される。実施例が提供される場合、説明はこれらの実施例を含むが、これらの実施例のみに限定するものではないと解釈されなければならない。又、本発明に開示された発明の種々の代用及び改変が、本明細書で例示的に述べられたものを含め、本発明の適用範囲及び趣旨から、並びに本発明の説明から逸脱することなく行われる場合があることが、当業者には容易に明らかになり、適用範囲から逸脱することなく本発明の概念を実施するために、種々の修正及び等価物を使用できることが明らかである。当業者であれば、本発明の趣旨及び適用範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の変更を行うことができることを理解するであろう。記載した実施形態は、何れの点においても例示するものとして見なされ、限定するものとしては見なされない。従って、例えば、更なる実施形態が、本発明の適用範囲内及び以下の特許請求の範囲内に含まれる。

大腸菌の図のトリカルボン酸サイクルを示す図である（Ｌ．Ｎ． Ｏｒｎｓｔｏｎら、Ｊ． Ｂａｃｔ．， ９８：２， １０９８−１１０８ （１９６９）から引用した図）。 大腸菌のグリオキシル酸シャントを示す図である（Ｋ． Ｗａｌｓｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ， Ｃｈｅｍ． ２５９：１５， ９６４６−９６５４ （１９８４）から引用し、修正した図）。 抗生物質マーカー及びｔａｃプロモーターを担持するＰＣＲ産物の染色体への統合を示す図である。相同組換えは、ａｃｅＢＡＫ及びｇｌｃＢ遺伝子を発現するのに使用されるプロモーターを交換するために使用される。ｓｐｃＲ＝スペクチノマイシン耐性カートリッジ、ｋａｎＲ＝カナマイシン耐性カートリッジ。右向きの矢印は、異種プロモーター（Ｐｔａｃ）の近似位置を示す。ｓｐｃＲ又はｋａｎＲ及びｔａｃプロモーターを含む線形ＰＣＲ産物（上部の線）が、染色体（中間線）に交差して、異種プロモーターを有する菌株をもたらし、異種プロモーター（下部の線）のすぐ上流にある抗生物質耐性遺伝子でａｃｅＢＡＫ又はｇｌｃＢの発現を駆動している。 本文書に列挙する菌株の構築に使用されるプライマーの５’−３’配列を示す。下線の残留物が、ａｃｅＢアレル又はｇｌｃＢアレルに対する配列相同性を提供し、相同組換えにより染色体に挿入することを可能にする。太字の残留物が、ｔａｃプロモーターをコードする。 ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）（配列番号９）の配列、及び囲んだ開始コドン（ＡＴＧ）を有する７種類のＰｔａｃ挿入構築物のプロモーター領域の配列を含む、ｔａｃプロモーター及び７種類のＰｔａｃ−遺伝子の融合を示す。Ｐｔａｃ−ａｃｅＢＡＫ（配列番号１９）は、菌株ｓ４３９７−１８４−１及び菌株ｓ４５３８−００６−１において見られる通りに示している。Ｐｔａｅ（２）−ａｃｅＢ（配列番号２０）は、菌株ｓ４４８０−１４０−５において見られる通りに示している。Ｐｔａｃ（３）−ａｃｅＢＡＫ（配列番号２１）は、菌株ｓ４４８０−１４８−１において見られる通りに示している。Ｐｔａｃ（４）−ａｃｅＢＡＫ（配列番号２２）は、菌株ｓ４４８０−１９９−１において見られる通りに示している。Ｐｔａｃ（５）−ａｃｅＢＡＫ（配列番号２３）は、菌株ｓ４５３８−００３−１において見られる通りに示している。Ｐｔａｃ＼ｌａｃ−ａｃｅＢＡＫ（配列番号２４）は、菌株ｓ４４８０−１９９−４において見られる通りに示している。Ｐｔａｃ−ｇｌｃＢ（配列番号２５）は、菌株ｓ４３９７−１０９−２及び菌株ｓ４５３８−００６−１において見られる通りに示している。

Claims (11)

1. 発酵によってＬ−アミノ酸産物を生成するためのプロセスであって、
   （ａ）該Ｌ−アミノ酸を生成し、ａｃｅＢＡＫオペロン内の遺伝子及びｇｌｃＢ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を細菌において過剰発現するように操作可能に構成された組換え核酸構築物を含む該細菌を、発酵培地において増殖させる工程；
   （ｂ）該発酵培地及び該細菌の少なくとも一方において該Ｌ−アミノ酸を富化させる工程；並びに
   （ｃ）該Ｌ−アミノ酸を該発酵培地及び該細菌の少なくとも一方から単離する工程を含み、
   ここで、該細菌が寄託番号ＮＲＲＬＢ−３０８４４を有する菌株である、プロセス。
2. 前記組換え核酸が、前記ａｃｅＢＡＫオペロンに対して非天然であるプロモーター配列を含む、請求項１に記載のプロセス。
3. 前記プロモーターが、ｔａｃプロモーターである、請求項２に記載のプロセス。
4. 前記少なくとも１つの遺伝子が、ａｃｅＢである、請求項２に記載のプロセス。
5. 前記非天然プロモーターが、前記ａｃｅＢＡＫオペロンの天然プロモーターと置き換わり、該天然プロモーターが中断される、請求項２に記載のプロセス。
6. 前記非天然プロモーターが、前記ａｃｅＢＡＫオペロンの天然プロモーターを欠失することなく挿入される、請求項２に記載のプロセス。
7. 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−スレオニンである、請求項１に記載のプロセス。
8. ａｃｅＢＡＫオペロン内の遺伝子及びｇｌｃＢ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を細菌において過剰発現するように操作可能に構成された組換え核酸を含む細菌であって、
   ここで、該細菌が寄託番号ＮＲＲＬＢ−３０８４４を有する菌株である、細菌。
9. 前記組換え核酸が、前記少なくとも１つの遺伝子の上流に操作可能に連結された前記ａｃｅＢＡＫオペロンに対して非天然であるプロモーター配列を含む、請求項８に記載の細菌。
10. 前記非天然プロモーターが、ｔａｃプロモーターである、請求項９に記載の細菌。
11. 前記ａｃｅＢＡＫオペロンの天然プロモーターが、前記非天然プロモーターによって置き換えられる、請求項９に記載の細菌。

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