TW201718863A - 用於製造腐胺或鳥胺酸的微生物及使用該微生物用於製造腐胺或鳥胺酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露係一種用於製造腐胺或鳥胺酸的新穎之經修飾微生物，及使用該微生物用於製造腐胺或鳥胺酸的方法。
Description
本揭露係有關於一種用於製造腐胺或鳥胺酸的重組微生物、及使用該微生物用於製造腐胺或鳥胺酸的方法。
生物胺(biogenic amines,BAs)主要係以胺基酸之脫羧作用或者醛類及酮類之胺化作用及轉胺作用所製造之氮化合物。此類生物胺具有低分子量且可在微生物、植物、及動物之代謝過程中合成，因而已知為經常可在該等細胞中發現的組成成分。
其等之中，腐胺係見於格蘭氏陰性菌或真菌且以高濃度存在於多種物種中，因而預期腐胺在微生物的代謝作用中扮演重要的角色。一般而言，腐胺為用於合成聚胺尼龍-4,6的重要原料且主要藉由化學合成製造。該化學合成為3步驟過程，包含催化氧化反應、使用氰化物之反應及使用高壓氫之氫化反應。因此，對於涉及利用生質
之更為環境友善及能源有效的方法有需求。
在此狀況下，已揭示藉由轉形大腸菌(E.coli)及棒狀桿菌(Corynebacterium)屬微生物以高濃度製造腐胺的多種方法(國際專利公開WO 06/005603號；國際專利公開WO 09/125924號；Qian ZD et al.,Biotechnol.Bioeng.104(4)：651-662,2009；Schneider et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.88(4)：859-868,2010；Schneider et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.95：169-178,2012)。
另一方面，鳥胺酸係廣泛見於植物、動物、及微生物中的物質，並作為精胺酸、脯胺酸、及多胺之生合成之前驅物。同時，在高等有機體的體內代謝期間，由胺基酸或氨製造尿素及經由鳥胺酸循環之處置的路徑中，鳥胺酸扮演重要角色。鳥胺酸係有效於肌肉製造及減低體脂肪，且因此已使用作為營養補充品並亦作為改善肝硬化及肝功能不良的醫藥藥物。製造鳥胺酸之方法包含使用牛乳酪蛋白作為分解酶的方法及使用E.coli或棒狀桿菌屬微生物的方法(韓國專利第10-1372635號；T.Gotoh et al.,Bioprocess Biosyst.Eng.,33：773-777,2010)。
大腸菌與棒狀桿菌屬微生物在用於製造腐胺或鳥胺酸之生合成路徑為類似，惟亦顯示以下之差異。首先，棒狀桿菌屬微生物具有「循環路徑」，其中麩胺酸係經轉換成N-乙醯基-L-麩胺酸且N-乙醯基-L-鳥胺酸係藉由argJ(雙功能性鳥胺酸乙醯基轉移酶/N-乙醯基麩胺酸合成酶，EC 2.3.1.35)轉換成L-鳥胺酸。相對地，大腸菌係藉
由「線性路徑」涉及腐胺或鳥胺酸的生合成，其中argA(N-乙醯基麩胺酸合成酶，EC 2.3.1.1)及argE(乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶，EC 3.5.1.16)替代棒狀桿菌屬微生物中之argJ之角色。
在棒狀桿菌屬微生物中，已知乙醯基係在ArgJ中的鳥胺酸與麩胺酸之間再循環。然而，在大腸菌中，ArgA使乙醯基-輔酶A(acetyl-CoA)之乙醯基附接至麩胺酸，以製造N-乙醯基麩胺酸，以及ArgEN-乙醯基鳥胺酸分解N-乙醯基鳥胺酸以製造鳥胺酸及乙酸(Schneider et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.91,17-30,2011)。
特別地，pta-ackA(pta，磷酸轉乙醯酶；ackA，乙酸激酶)操縱子及乙醯基-輔酶A合成酶(acs)已知為使用乙酸合成乙醯基-輔酶A之基因。
本發明人等為改善棒狀桿菌屬微生物製造鳥胺酸及腐胺之能力，已進行許多努力，且結果發現將源自大腸菌之argA及argE導入棒狀桿菌屬微生物，可改善其製造鳥胺酸及腐胺之能力，因而完成本發明。
本揭露之目的在於提供一種可以高產率製造腐胺或鳥胺酸的重組微生物。
本揭露之另一目的在於提供一種使用上述微生物用於製造腐胺或鳥胺酸的方法。
確認本揭露之製造腐胺或鳥胺酸之棒狀桿菌屬微生物，在該微生物經以源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE導入時，以及酸利用路徑係經強化時，可改善腐胺或鳥胺酸之製造量。因此，就經濟及環境的觀點而言，本揭露之微生物可廣泛利用於製造腐胺或鳥胺酸，且亦可廣泛使用作為有效且以所期望手段以供應用於製造多種聚合物產物的原料，其中該腐胺或鳥胺酸係使用作為原料。
第1圖係說明棒狀桿菌屬微生物用於製造腐胺及鳥胺酸的生合成路徑(循環路徑)(第1圖A)以及大腸菌中用於製造腐胺及鳥胺酸的生合成路徑(線性路徑)(第1圖B)之示意圖。
第2圖係說明在表現argJ之狀態中，藉由將源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE導入棒狀桿菌屬微生物，其製造腐胺及鳥胺酸之能力經改善的生合成路徑之示意圖。
本揭露之一態樣提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中經導入源自大腸菌之N-乙醯基麩胺酸合成酶及源自大腸菌之乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶之活性。
本揭露之例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸
的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中源自大腸菌之N-乙醯基麩胺酸合成酶由SEQ ID NO：1之胺基酸序列所組成。
本揭露另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中源自大腸菌之乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶由SEQ ID NO：3之胺基酸序列所組成。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中棒狀桿菌屬之微生物為選自由麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、熱產氨棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)及醱酵乳短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)所成之群組。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子(pta-ackA操縱子)之活性進一步增強。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子係由SEQ ID NO：5或7之胺基酸序列所組成。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中進一步經導入源自大腸菌之乙醯基-輔酶A合成酶(acs)之活性。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中源自大腸菌之乙醯基-輔酶A合成酶(acs)係由SEQ ID NO：9之胺基酸序列所組成。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中進一步經導入鳥胺酸脫羧基酶(ODC)之活性。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，i)鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)、ii)麩胺酸輸出蛋白(exporter)、或iii)鳥胺酸胺甲醯基轉移酶及麩胺酸輸出蛋白之活性係進一步減弱。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，選自由乙醯基-γ-麩胺醯磷酸還原酶(ArgC)、乙醯基麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)、及乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)所成之群組之至少一種的活性係進一步增強。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，乙醯基轉移酶的活性係進一步減弱。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中乙醯基轉移酶係由SEQ ID NO：30或31之胺基酸序列所組成。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，腐胺輸出蛋白的活性係進一步增強。
本揭露又另一例示具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中腐胺輸出蛋白係由SEQ ID NO：26或28之胺基酸序列所組成。
本揭露另一態樣提供一種用於製造腐胺或鳥胺酸的方法，包含：i)於培養基培養製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物；及ii)由經培養的微生物或培養基回收腐胺或鳥胺酸。
本揭露之例示具體例中，該棒狀桿菌屬之經修飾微生物為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
以下，再詳細說明本揭露。
本揭露之具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中經導入源自大腸菌之N-乙醯基麩胺酸合成酶及源自大腸菌之乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶之活性。
如使用於本文，用語「N-乙醯基麩胺酸合成酶」意指調節由麩胺酸及乙醯基-輔酶A製造N-乙醯基麩胺酸的反應之酵素，且其所製造之N-乙醯基麩胺酸可使用作為鳥胺酸及精胺酸之前驅物。
本揭露中，N-乙醯基麩胺酸合成酶可包含，例如，具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列之蛋白質，以及與
上述胺基酸序列具有同源性為70%或更高，具體為80%或更高，更具體為90%或更高，又更具體為95%或更高，再更具體為98%或更高，最具體為99%或更高的任意蛋白質，只要該蛋白質具有N-乙醯基麩胺酸合成酶的實質活性，則無限制。
又，根據微生物之菌種及菌株，表現上述活性之蛋白質亦可在胺基酸序列顯示差異性。因此，本揭露中之N-乙醯基麩胺酸合成酶可為，例如，源自大腸菌者，但並不限定於此。
在序列與上述序列具有同源性時，若該胺基酸序列係具有與SEQ ID NO：1之蛋白質的生物活性實質上相同或相當者，顯而易見的為在部分序列具有刪除、修飾、取代或加成的胺基酸序列，亦包含於本揭露之範圍。
本揭露之編碼該N-乙醯基麩胺酸合成酶之多核苷酸可包含，但不限於，編碼具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質之多核苷酸，及具有與上述胺基酸序列之同源性為70%或更高，特別為80%或更高，更特別為90%或更高，又更特別為95%或更高，再更特別為98%或更高，最特別為99%或更高的任意蛋白質，只要該多核苷酸具有類似於N-乙醯基麩胺酸合成酶的活性，且例如可包含SEQ ID NO：2之多核苷酸序列。
如使用於本文，用語「乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶」意指藉由調節乙醯基鳥胺酸之水解而調節涉及乙酸及鳥胺酸製造的反應之酵素。
本揭露中，乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶可包含，但不限於，具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的蛋白質，以及與上述胺基酸序列之同源性為70%或更高，特別為80%或更高，更特別為90%或更高，又更特別為95%或更高，再更特別為98%或更高，最特別為99%或更高的任意蛋白質，只要該蛋白質具有由乙醯基鳥胺酸分離乙醯基及鳥胺酸的實質活性。
又，根據微生物之菌種及菌株，表現上述活性之蛋白質可於胺基酸序列顯示差異性。因此，本揭露中之乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶可為源自大腸菌者，但並不限定於此。在序列具有同源性時，若該胺基酸序列係具有與SEQ ID NO：3之蛋白質之生物活性實質上相同或相當者，顯而易見的為在部分序列具有刪除、修飾、取代或加成的胺基酸序列，亦包含在本揭露之範圍。
本揭露之編碼乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶的多核苷酸，只要該多核苷酸具有類似於乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶蛋白質之活性者，可包含具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的蛋白質，或編碼與上述胺基酸序列之同源性為70%或更高，特別為80%或更高，更特別為90%或更高，又更特別為95%或更高，再更特別為98%或更高，最特別為99%或更高的蛋白質的多核苷酸，例如，SEQ ID NO：4之多核苷酸序列。
又，本揭露之編碼N-乙醯基麩胺酸合成酶或乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶之多核苷酸可為在嚴格條件下經
與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之多核苷酸序列或者源自該多核苷酸序列之探針雜合，且其可為功能正常的N-乙醯基麩胺酸合成酶或乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶之經修飾型。上述中，用語「嚴格條件」意指多核苷酸之間可專一性雜合之條件。例如，參考文獻(例如，J.Sambrook et al.，同上)中具體揭示之嚴格條件。
上述中，用語「同源性」意指與給定之胺基酸序列或多核苷酸序列的同一性程度，且可以百分比表示。如使用於本文，與給定的多胜肽序列或多核苷酸序列具有相同或類似活性之同源序列，可以「同源性%」表示。例如，同源性%可使用標準軟體確認，亦即，BLAST 2.0，用以計算參數如分數、同一性、及類似性；或經由南方雜合試驗比較序列，可藉由本技術範疇之技術人員已知之方法決定欲界定之適當之雜合條件(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。
另一方面，本揭露之微生物可包含天然型及經修飾型，例如，屬於艾氏菌(Escherichia)屬、志賀桿菌(Shigella)屬、檸檬酸桿菌(Citrobacter)屬、沙門桿菌(Salmonella)屬、腸桿菌(Enterobacter)屬、耶氏桿菌(Yersinia)屬、克雷氏桿菌(Klebsiella)屬、伊文氏桿菌(Erwinia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、
乳桿菌(Lactobacillus)屬、月形單胞菌(Selenomanas)屬、弧菌(Vibrio)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、鏈黴菌(Streptomyces)屬、隱秘桿菌(Arcanobacterium)屬、產鹼桿菌(Alcaligenes)屬等之微生物。具體言之，本揭露之微生物可為屬於棒狀桿菌屬的微生物，更具體為選自麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、熱產氨棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)及醱酵乳短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)所成之群組之微生物，且更具體為麩胺酸棒狀桿菌，但並不限定於此。
具體地，如使用於本文，用語「製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物」意指可在自然狀態下製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物；或藉由對其無法製造腐胺或鳥胺酸的母株提供製造腐胺或鳥胺酸能力所製備之製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物。
經提供具有製造腐胺或鳥胺酸能力或可製造腐胺或鳥胺酸之微生物可具有經改善的製造鳥胺酸的能力，鳥胺酸係用作為腐胺生合成之原料，該微生物係藉由相較於內源性活性，修飾乙醯基麩胺酸合成酶(其轉換麩胺酸為N-乙醯基麩胺酸)、鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ，其轉換乙醯基鳥胺酸為鳥胺酸)、乙醯基麩胺酸激酶(ArgB，其轉換乙醯基麩胺酸為N-乙醯基麩胺醯磷酸)、γ-麩胺醯磷酸還原酶(ArgC，其轉換N-乙醯基麩胺醯磷
酸為N-乙醯基麩胺酸半醛)、及乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD，其轉換乙醯基麩胺酸半醛為N-乙醯基鳥胺酸)之活性為增加，以增加由麩胺酸至鳥胺酸的生合成路徑，但並不限定於此。
又，微生物可經修飾以相較於其等之內源性活性為減弱鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF，其涉及由鳥胺酸合成精胺酸)、麩胺酸輸出相關之蛋白質、及/或乙醯化腐胺之蛋白質的活性；及/或導入鳥胺酸脫羧基酶(ODC)之活性。
如使用於本文，用語「導入活性」可意指在微生物中不存在或弱的蛋白質之活性，於該對應微生物中係經重新導入或增強。具體地，其可包含插入或遞送不存在微生物中的編碼蛋白質之基因至欲於其中表現的微生物，或可包含誘發該蛋白質之修飾用增強該蛋白質的表現，該蛋白質於該微生物中不表現或幾乎不表現，但並不限定於此。
另一方面，本揭露中，如導入活性、增強活性、減弱活性等修飾，可藉由所謂轉形之過程而發生。如使用於本文，用語「轉形」意指將包含編碼特定蛋白質之多核苷酸或具有強或弱活性之啟動子序列等的載體導入至宿主細胞的過程，藉此使該核苷酸所編碼的蛋白質可以表現或誘發宿主細胞中染色體的修飾。再者，該多核苷酸包含編碼目標蛋白質的DNA及RNA。該多核苷酸可以該領域中的各種形態插入，只要其可經導入宿主細胞中表現且
在其中表現或誘發修飾。例如，該多核苷酸可以表現匣(expression cassette)形式經導入至宿主細胞，該表現匣係包含自表現所須要之所有必須元件的基因構築物。表現匣通常可包含可操作性地連接至多核苷酸之啟動子、轉錄終止訊息、核醣體結合域、及轉譯終止訊息，且可為能自複製之表現載體的形式。又，多核苷酸可以其原樣導入宿主細胞，且可操作性地連接至宿主細胞中對於其表現所必須之序列，但並不限定於此。
又，如使用於本文，用語「可操作性地連接」意指啟動子序列及基因序列之間的功能性連結，該啟動子序列係起始及參與編碼本揭露之特定蛋白質的多核苷酸的轉錄。
如使用於本文，用語「載體」意指包含編碼所欲之蛋白質的多核苷酸之核苷酸序列的DNA構築物，其中所欲之蛋白質係操作性地連結至適當之調控序列而使所欲之蛋白質在適當之宿主內表現。調控序列包含可起始轉錄之啟動子、用於調控轉錄之任意操縱子序列、編碼適當之mRNA核醣體結合域之序列、以及用於調控轉錄及轉譯之序列。載體，在經轉形至適當之宿主細胞後，可不受限於宿主之基因組而複製或作用，或者併入宿主之基因組本身。
本揭露中所使用之載體，只要該載體在宿主細胞中可複製，則無特別之限定，且可使用本技術範疇已知之任意之載體。載體之例可包含自然或重組之質體、黏
質體、病毒、及噬菌體。例如，可使用為噬菌體載體或黏質體載體，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon 4A、Charon 21A等；及可使用質體載體，其等係基於pBR、pUC、pBluescript II、pGEM、pTZ、pCL、pET等。本揭露中所使用之載體可無特別之限定且可使用本技術範疇已知之任意之載體。具體上，可使用載體pDZTn、pACYC 177、pACYC 184、pCL、pECCG 117、pUC 19、pBR 322、pMW 118、pCCIBAC等。
因此，編碼目標蛋白質的多核苷酸可使用用於在細菌內染色體插入之載體以經修飾之多核苷酸取代。多核苷酸至染色體的插入可使用本技術範疇已知之方法施行，例如，藉由同源重組，但並不限定於此。由於本揭露之載體可經由同源重組經插入染色體，可進一步包含用以確認插入染色體的篩選標記。篩選標記係用以選擇經轉形細胞，亦即，為了確認該目標多核苷酸是否已插入，且可使用提供可選擇之表現型的標記，該表現型如藥劑耐受性、營養要求性、細胞毒性藥劑之耐受性、及表面蛋白質的表現。在以選擇藥劑處理的情形下，只有表現篩選標記的細胞可存活或表現其他表現型性狀，且因此可容易地選擇經轉形細胞。
本揭露之棒狀桿菌屬微生物可為製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子(pta-ackA操縱子)之活性係進一步增強。
本揭露中，磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子(pta-ackA操縱子)係包含可逆性地調節代謝路徑之基因的操縱子，其中由葡萄糖或丙酮酸所製造之乙醯基-輔酶A經由乙醯基磷酸轉換為乙酸，以及相反方向之代謝路徑。
本揭露中，磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子可包含，但不限於，包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的胺基酸序列之蛋白質，或與上述蛋白質具有同源性為70%或更高，特別為80%或更高，更特別為90%或更高，又更特別為95%或更高，再更特別為98%或更高，最特別為99%或更高的任意蛋白質，只要該蛋白質實質上調節由乙酸製造乙醯基-輔酶A的反應。
又，由於表現活性之蛋白質的胺基酸序列可根據給定的微生物之菌種或菌株而變化，本揭露中之磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子並不限定於源自其來源者。顯而易見的，與上述序列具有同源性及具有與SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之蛋白質實質上相同或相當的生物活性的任意胺基酸序列，亦可屬於本揭露之範圍，即使該胺基酸序列可於部分序列中具有刪除、修飾、取代或加成。
本揭露之編碼磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子之多核苷酸可包含編碼SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的胺基酸之多核苷酸、或者編碼與上述胺基酸序列具有同源性為70%或更高，具體為80%或更高，更具體為90%或更高，又更具體為95%或更高，再更具體為98%或更高，最具體為99%或更高的蛋白質的多核苷酸，且具體為可含
有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8之多核苷酸序列。
如使用於本文，用語「活性的增強」不只包含汲取起因於新導入的活性或增加蛋白質本身之活性之較原始功能更高效果，亦包含增加內源性基因的活性以提高其活性、藉由內在或外在因子擴增內源性基因、刪除用於抑制基因表現之調控因子、增加基因複本數、由外部導入基因、表現調控序列之修飾，以及具體地，起因於基因中之啟動子及突變的置換或修飾而增加酵素活性等。
具體言之，本揭露中，活性的增加可藉由下述者進行：1)增加編碼酵素的多核苷酸之複本數、2)修飾表現調控序列用以增加多核苷酸的表現、3)修飾染色體之多核苷酸序列用以增加酵素之活性、或4)藉由其等組合之修飾但並不限定於此些方法。
多核苷酸複本數之增加(方法1)可下述形式進行，其中該多核苷酸係操作性地連接至載體、或藉由將多核苷酸插入宿主之染色體，但並不特別限定於此些方法。具體地，宿主細胞內染色體中的多核苷酸之複本數，可藉由不管宿主細胞而可複製及作用且本揭露之編碼該蛋白質的多核苷酸係操作性地連結至其之載體導入而增加；或者可藉由可將多核苷酸插入至宿主細胞的染色體且該多核苷酸係操作性地連結至其的載體導入至宿主細胞增加。
其次，用以增加多核苷酸之表現的表現調控序列的修飾(方法2)，可經由多核苷酸序列之刪除、插入、非保守性或保守性取代、或其組合而於序列誘發修飾以進一步增強表現調控序列的修飾，，或者以具有較強活性的多核苷酸序列置換該多核苷酸序列，但並不限定於此些方法。該表現調控序列，包含啟動子、操作子序列、編碼核醣體結合位點之序列、及調控轉錄及轉譯之終止之序列，但並不特別限定於此。
強力外源性啟動子，代替原始啟動子，可為連結至多核苷酸表現單元之上游區域。強力啟動子之實例，可為CJ7啟動子、lysCP1啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA或aceB啟動子等，且更具體地，該表現率可藉由操作性地連結至源自棒狀桿菌之lysCP1啟動子(WO 2009/096689)或CJ7啟動子(韓國專利第10-0620092號及WO 2006/096689)而改善，惟強力啟動子並不限定於此。
又，染色體上多核苷酸序列的修飾(方法3)，可經由多核苷酸序列之刪除、插入、非保守性或保守性取代、或其組合於表現調控序列所誘發的修飾，以進一步增強該多核苷酸的活性而進行，或者以具有強力活性的經改善之多核苷酸序列置換該多核苷酸序列而進行，但並不限定於此些方法。
具體地，本揭露中，磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子(pta-ackA操縱子)之活性可藉由選自下述所成群組之任一方法增強，增加細胞中操縱子之複本數之方
法、在操縱子之表現調控序列導入修飾之方法、以具有強力活性之序列置換操縱子之基因的表現調控序列之方法、在染色體上以經突變的基因置換編碼酵素之基因以增加構成操縱子的酵素之活性之方法、在染色體之基因上導入修飾以增加構成操縱子的酵素之活性之方法。具體言之，以具有較強活性之序列置換操縱子上基因之表現調控序列的方法，可藉由以CJ7啟動子、lysCP1啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA或aceB啟動子等置換乙醯基酶及乙酸激酶操縱子之內源性啟動子而達成，但該置換並不限定於該等。
如使用於本文，用語「內源性活性」意指酵素為微生物原始所擁有之非修飾狀態之活性狀態，及用語「相較於其內源性活性增強」意指在例如導入表現活性之基因或增加對應基因之複本數、刪除基因表現之抑制性調控因子、或者以如使用改善之啟動子之表現調控序列的修飾的操作之後，相較於操作之前微生物所擁有之活性，微生物所擁有之酵素的活性之增加狀態。
本揭露中，製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中源自大腸菌之乙醯基-輔酶A合成酶(acs)的活性可進一步導入其中。
本揭露中，乙醯基-輔酶A合成酶(acs)係參與由ATP、乙酸、及輔酶A製造乙醯基-輔酶A的反應的酵素。
本揭露中，乙醯基-輔酶A合成酶可包含，並
無特別之限定，具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的蛋白質，或具有與上述胺基酸序列之同源性為70%或更高，具體為80%或更高，更具體為90%或更高，又更具體為95%或更高，再更具體為98%或更高，最具體為99%或更高的任意蛋白質，只要該蛋白質具有參與乙醯基-輔酶A合成的實質活性。
又，由於表現活性的蛋白質之胺基酸序列可根據給定微生物之菌種或菌株而變化，本揭露之乙醯基-輔酶A合成酶(acs)並不限定其由來之來源，且例如可為源自大腸菌。顯而易見的為任意胺基酸序列，其與上述序列具有同源性且具有與SEQ ID NO：9之蛋白質實質上相同或相當的生物活性，亦包含於本揭露之範圍，然而該胺基酸序列於部分序列中可具有刪除、插入、取代或加成。
本揭露之編碼乙醯基-輔酶A合成酶(acs)之多核苷酸，可包含編碼SEQ ID NO：9胺基酸序列的蛋白質之多核苷酸，或者編碼與上述胺基酸序列具有同源性為70%或更高，具體為80%或更高，更具體為90%或更高，又更具體為95%或更高，再更具體為98%或更高，最具體為99%或更高的任意蛋白質之多核苷酸，最具體地其可包含SEQ ID NO：10之多核苷酸序列。
本揭露中之棒狀桿菌屬微生物，可為製造腐胺或鳥胺酸之棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中鳥胺酸脫羧基酶(ODC)之活性係進一步導入其中。
如使用於本文，用語「鳥胺酸脫羧基酶」意
指藉由參與鳥胺酸之脫羧基反應製造腐胺之酵素。雖然棒狀桿菌屬微生物缺乏腐胺生合成酵素，當由外部經導入鳥胺酸脫羧基酶(ODC)時，可合成腐胺並輸出至細胞外部。可由外部導入的鳥胺酸脫乙醯基酶可使用於本揭露中，只要其具有上述活性，無論該微生物源自何種來源，且具體地，可導入源自大腸菌者。
本揭露之棒狀桿菌屬微生物可為製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中，相較於其內源性活性，i)鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)、ii)麩胺酸輸出蛋白、或iii)鳥胺酸胺甲醯基轉移酶及麩胺酸輸出蛋白之活性係進一步減弱。棒狀桿菌屬之麩胺酸輸出蛋白可為NCg11221。
本揭露之棒狀桿菌屬微生物可為製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中，相較於其內源性活性，選自乙醯基-γ-麩胺醯磷酸還原酶(ArgC)、乙醯基麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)、及乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)所成之群組之至少一種的活性係進一步增強。
又，棒狀桿菌屬微生物可為製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中，相較於其內源性活性，乙醯基轉移酶的活性，具體上為NCg11469之活性係進一步減弱。
最後，棒狀桿菌屬微生物可為製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬之經修飾微生物，其中，相較於其內源
性活性，腐胺輸出蛋白的活性，具體上為NCg12522之活性，係進一步增強。
如使用於本文，「活性減弱」，不只包含汲取起因於蛋白質本身活性之降低或失活而較原功能之較低效果，亦包含藉由減低內源基因的活性、活化抑制基因表現的調控因子、降低基因複本數、表現調控序列之修飾，以及在具體上，起因於基因內之啟動子及突變之置換或修飾之酵素活性的失活或降低等而降低其活性。
具體地，本揭露中，活性的減弱可藉由下述者進行：1)刪除編碼蛋白質的部分或全部多核苷酸、2)修飾表現調控序列用以降低多核苷酸的表現、3)修飾染色體上之多核苷酸序列用以減弱蛋白質之活性、及4)選自其組合之方法，但並不限定於此些方法。
具體地，刪除編碼蛋白質的部分或全部多核苷酸之方法，可藉由以於多核苷酸序列具有部分刪除之多核苷酸或以使用用於細菌染色體插入的記號基因，置換染色體之編碼內源性目標蛋白質的多核苷酸而進行。如使用於本文，用語「部分」可根據多核苷酸的種類而變化，但其可具體意指1至300，更具體為1至100，又更具體為1至50。
又，修飾表現調控序列的方法，可藉由經由
多核苷酸序列之刪除、插入、非保守性或保守性取代、或其組合而藉由誘發表現調控序列的修飾以進一步減弱表現調控序列的活性而進行，或者藉由以具有較弱活性之多核苷酸序列置換該多核苷酸序列而進行。該表現調控序列包含啟動子、操作子序列、編碼核醣體結合位點之序列、及調控轉錄及轉譯的終止之序列。
又，修飾染色體之多核苷酸序列的方法，可經由多核苷酸序列之刪除、插入、非保守性或保守性取代、或其組合而誘發序列的修飾以進一步減弱酵素之活性而進行，或者以具有較強活性之經改善的多核苷酸序列置換該多核苷酸序列而進行。
又，刪除抑制酵素的多核苷酸表現之調控因子的方法，可以在多核苷酸序列聚有部分刪除的多核苷酸或標記基因置換用以表現抑制因子的多核苷酸而進行。如使用於本文，用語「部分」可根據多核苷酸的種類而變化，具體意指1至300，更具體為1至100，又更具體為1至50。
特別地，乙醯基-γ-麩胺醯磷酸還原酶(ArgC)、乙醯基麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)、乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)、涉及麩胺酸輸出之蛋白質及鳥胺酸脫羧基酶(ODC)，可各含有SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、或38之胺基酸序列，或為與上述胺基酸序列之同源性具體為70%或更高，更具
體為80%或更高，又更具體為90%或更高的任意胺基酸序列，但並不特別限定於此。又，乙醯化腐胺的蛋白質可包含SEQ ID NO：30或31之胺基酸序列，或者與上述之胺基酸序列之同源性為70%或更高，具體是80%或更高，更具體是90%或更高的任意胺基酸序列，但胺基酸序列並不特別限定於此。
又，本揭露中，腐胺輸出蛋白可包含SEQ ID NO：26或28之胺基酸序列，或者與上述之胺基酸序列之同源性為70%或更高，具體是80%或更高，更具體是90%或更高的任意胺基酸序列。
上述之蛋白質中，乙醯基-γ-麩胺醯磷酸還原酶(ArgC)、乙醯基麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)、乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)、鳥胺酸脫羧基酶(ODC)、及腐胺輸出蛋白之活性的增強，例如，可藉由選自下述方法達成：增加編碼蛋白質之多核苷酸的複本數、修飾表現調控序列用以增加多核苷酸的表現、修飾染色體之多核苷酸序列用以增強上述酵素的活性、刪除用以抑制上述酵素的多核苷酸表現之調控因子、或其組合。
又，鳥胺酸甲胺醯基轉移酶(ArgF)、涉及麩胺酸輸出之蛋白、及乙醯化腐胺之蛋白質的減弱，可藉由選自下述方法達成：刪除編碼蛋白質之多核苷酸的部分或全部、修飾表現調控序列以減低多核苷酸的表現、修飾染色體之多核苷酸序列以減弱蛋白質之活性、及其組合。
本揭露另外之實施態樣係在提供製造腐胺或鳥胺酸的方法，包含：i)於培養基培養製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物；及ii)由培養的微生物或培養基回收腐胺或鳥胺酸。
上述方法中，微生物可以本技術範疇所知之批式培養、連續培養、饋料-批式培養等培養，但並不特別限定於此。特別地，在培養條件方面，可使用鹼性化合物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、或氨水)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)，保持適當之pH(即最適pH5至9，具體為pH6至8，最具體為pH6.8)，但並不特別限定於此。又，可藉由對細胞培養加入氧氣或含氧氣之氣體混合物以保持好氧條件。培養溫度可保持為20℃至45℃，特別為25℃至40℃，微生物可培養約10小時至160小時。藉由上述培養所製造之腐胺或鳥胺酸可分泌至培養基或保留在細胞中。
又，培養基中，碳源，如糖類及碳水化合物類(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉、及纖維素)、油類及脂肪類(例如，大豆油、葵花籽油、花生油、及椰子油)、脂肪酸類(例如，棕櫚酸、硬脂酸、及亞麻油酸)、醇類(例如，丙三醇及乙醇)、及有機酸類(例如，乙酸)，可各別或組合使用，但並不限定於此；氮源，如含氮有機化合物類(例如，蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米浸液、大豆粉、及尿素)、或無機化合物類(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、及
硝酸銨)，亦可各別或組合使用，但並不限定於此；及鉀源，如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、或其對應之含鈉鹽，亦可各別或組合使用，但並不限定於此。又，在培養基中亦可含有其他之必須之生長促進物質，包含金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸、及維生素，但並不限定於此。
回收在本揭露培養中所製造之腐胺或鳥胺酸的方法，可以本技術範疇所知之培養方法進行，例如，如批式培養、連續培養、饋料-批式培養，且藉此可由培養物回收目標胺基酸。
以下，參照下述實施例進一步詳細說明本揭露。惟，該等實施例僅用於說明，本揭露並不受此些實施例之任何限定。
實施例1：以源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE導入製造腐胺之菌株及確認該菌株之腐胺製造能力
1-1.製作源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE同時經導入製造腐胺的ATCC13032系菌株的轉位子基因之菌株
為確定源自大腸菌之argA基因及源自大腸菌之argE基因經導入製造腐胺的ATCC13032系菌株是否改善腐胺製造能力，argA及argE基因經導入該菌株之轉位子基因。
作為於染色體內能使棒狀桿菌屬的微生物的
轉位子基因導入之用於轉形的載體，可使用pDZTn(WO 2009/125992)，並使用lysCP1啟動子(國際專利公開WO 2009/096689號，SEQ ID NO：39)作為啟動子。
具體言之，用於獲得argA ORF區域中的同源重組片段的引子對SEQ ID NOS：11及12係根據源自大腸菌之argA基因之多核苷酸序列(SEQ ID NO：2)製作，該源自大腸菌之argA基因編碼N-乙醯基麩胺酸合成酶。又，用於獲得argE ORF區域中的同源重組片段的引子對SEQ ID NOS：15及16係根據源自E.coli之argE基因之多核苷酸序列(SEQ ID NO：4)製作，該源自E.coli之argE基因編碼乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶，以及用於獲得lysCP1區域中的同源重組片段的引子對SEQ ID NOS：13及14係根據lysCP1(表1)之多核苷酸序列(SEQ ID NO：39)而製作。
首先，使用大腸菌W3110株之染色體為模板與引子對SEQ ID NO：11及12一起擴增大小約1.6kb的基因片段，以獲得argA基因。具體地，PCR係藉由30循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸1分鐘30秒而進行。以此獲得之片段，以0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，並溶洗出及純化所期望大小的條帶。
又，在lysCP1啟動子區域係使用KCCM10919P(國際專利公開WO 2009/096689號)菌株之染色體為模板與引子對SEQ ID NOS：13及14一起進行PCR，其藉由30循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸30秒。
pDZTn載體以XhoI處理然後所獲得之各PCR產物進行融合選殖。融合選殖係使用In-Fusion® HD選殖套組(Clontech公司)操作，並將由此獲得之質體命名為pDZTn-lysCP1-argA。
之後，為獲得argE基因，再以上述相同之方法擴增幅基因片段，使用大腸菌W3110株之染色體為模板與引子對SEQ ID NOS：15及16一起，獲得大小約1.4kb之PCR產物，然後與lysCP1啟動子區域進行融合選殖。由此獲得之質體，命名為pDZTn-lysCP1-argE。
之後，藉由電穿孔法將質體pDZTn-lysCP1-argA導入KCCM11240P(韓國專利申請公開案第10-2013-0082478號)株以獲得轉形株，且該轉形株經平板培養於含康黴素(kanamycin)(25μg/L)及X-gal(5-
溴-4-氯-3-吲哚啉-D-半乳醣苷)之BHIS平板培養基(腦心萃取液(37g/L)，山梨糖醇(91g/L)，及洋菜膠(2%))且培養至形成菌落。該等菌落中，篩選藍色菌落，且藉此篩選經導入質體pDZTn-lysCP1-argA的轉形株。
所篩選之菌株於CM培養基(葡萄糖(10g/L)，多蛋白腖(10g/L)，酵母萃取物(5g/L)，牛肉萃取物(5g/L)，NaCl(2.5g/L)，尿素(2g/L)，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)，並連續稀釋為10-4至10-10，平板培養於含X-gal之固體培養基且培養至形成菌落。於所形成之菌落中，篩選相對低比例之白色菌落且藉由二次交叉最後篩選經導入argA-編碼基因之菌株。最後篩選之菌株使用引子對SEQ ID NOS：12及13進行PCR且確認經導入argA-編碼基因，且該麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，命名為KCCM11240P Tn：lysCP1-argA。
為上述所製備之經導入argA之菌株的導入，以上述的相同之方法將上述所製作之pDZTn-lysCP1-argE轉形至KCCM11240P Tn：lysCP1-argA，並使用引子對SEQ ID NOS：13及16藉由進行PCR確認在最後篩選之菌株中之argE導入至轉位子。由此篩選之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，命名為KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE。
1-2.製作以源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE同時經導入轉位子基因的製造腐胺的ATCC13869系菌株的轉位子基因的菌株
DAB12-a Δ NCg11469(韓國專利申請公開案第10-2013-0082478號)，其係製造腐胺的麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869系菌株，經命名為DAB12-b，以及argA及argE經導入至轉位子基因以確認源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE基因的導入是否相關於所得菌株之腐胺製造能力的改善。
首先，以與實施例1-1相同之方法，將先前製作之pDZTn-lysCP1-argA轉形至麩胺酸棒狀桿菌DAB12-b株，並確認argA導入至轉位子。由此篩選之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株命名為DAB12-b Tn：lysCP1-argA。
然後，為了在經導入argA之菌株中導入argE，將先前製作之pDZTn-lysCP1-argE，以與實施例1-1相同之方法，轉形至DAB12-b Tn：lysCP1-argA，並確認argE導入至轉位子。由此篩選之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，命名為DAB12-b Tn：lysCP1-argE。
1-3.經以源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE導入至製造腐胺的棒狀桿菌屬菌株的腐胺製造能力的評估
比較在實施例1-1及1-2中所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株之腐胺製造能力，以確認源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE導入至腐胺製造菌株對於腐胺製造之效果。
具體地，將實施例1-1及1-2中所製作之2種不同之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株(KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE；DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE)、及2種不同之親代菌株(KCCM11240P及DAB12-b)，分別平板培養在含1mM精胺酸之CM平板培養基(1L中含1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母萃取物、0.5%牛肉萃取物、0.25% NaCl、0.2%尿素、100μL之50% NaOH、2%洋菜膠，pH 6.8)，並在30℃培養24小時。
然後由各培養菌株取約1白金環量，接種於25mL之力價培養基(1L中含8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸液、0.4%之(NH4)2SO4、0.1%之KH2PO4、0.05%之MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素(100μg)、鹽酸硫胺素(3mg)、泛酸鈣(3mg)、菸鹼醯胺(3mg)、5% CaCO3)，並在30℃以200rpm振盪培養98小時。然後所有菌株之培養物中，添加1mM精胺酸至培養基。培養完成時，測定各培養液中所製造之腐胺濃度且結果如下述表2所示。
如表2所示，同時經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE基因之麩胺酸棒狀桿菌之2種經修飾菌株，皆顯示腐胺製造增加9.8%或更高。
實施例2：經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE之製造腐胺的菌株中pta-ackA的增強以及確認該菌株之腐胺製造能力
2-1.來自具有製造腐胺的ATCC13032系棒狀桿菌菌株的pta-ackA啟動子的取代的菌株的製作
實施例1中所製作之經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE基因的製造腐胺的菌株，進一步增強其磷酸轉乙醯酶及乙酸激酶(pta-ackA)之活性，並檢討該菌株的腐胺製造能力之增強效果。
為此目的，染色體中pta-ackA操縱子之啟動子經以相較於其內源性啟動子為具有更強活性之啟動子取代，具體地，lysCP1啟動子(國際專利公開案第WO 2009/096689號)係經導入至pta-ackA操縱子之起始密碼子的上游。
首先，獲得同源重組片段，其包含lysCP1啟動子及該啟動子的兩末端具有染色體之原始pta-ackA序列。具體地，lysCP1啟動子之5'-末端區域，係使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032株之基因組DNA及引子對SEQ ID NOS：17及18一起藉由進行PCR獲得。具體地，PCR反應係30循環之以95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸30秒進行。
又，lysCP1啟動子區域，係使用引子對SEQ ID NOS：14及19，以相同之條件進行PCR獲得，lysCP1啟動子之3'-末端區域則使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032
之基因組DNA為模板及引子對SEQ ID NOS：20及21一起進行PCR獲得。獲得lysCP1啟動子所使用之引子對，如上述表1及下述表3所示。
上述所得之各PCR產物使用經以XbaI處理的pDZ載體進行融合選殖。融合選殖係使用In-Fusion® HD選殖套組(Clontech公司)進行且由此獲得之質體命名為pDZ-lysCP1-1’ pta-ackA。
上述所製作之質體pDZ-lysCP1-1’ pta-ackA，藉由電穿孔法，分別導入實施例1-1中所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株之KCCM11240P及KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：1ysCP1-argE菌株，以獲得轉形株，且該轉形株平板培養於含康黴素(25μg/mL)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚啉-D-半乳醣苷)之BHIS平板培養基(腦心浸液(37g/L)、
山梨醣醇(91g/L)、及洋菜膠(2%))且培養至形成菌落。該等菌落中，篩選藍色菌落且藉此篩選經導入質體pDZ-lysCP1-1’ pta-ackA的轉形株。
該所篩選之菌株於CM培養基(葡萄糖(10g/L)，多蛋白腖(10g/L)，酵母萃取物(5g/L)，牛肉萃取物(5g/L)，NaCl(2.5g/L)，尿素(2g/L)，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)，並連續稀釋為10-4至10-10，平板培養於含X-gal之固體培養基且培養至形成菌落。所形成之菌落中，篩選呈現相對低比例之白色菌落，且最後篩選其中之pta-ackA啟動子藉由二次交叉以lysCP1啟動子取代之菌株。
最後所篩選之菌株，使用引子對SEQ ID NOS：19及21進行PCR，且確認lysCP1啟動子經導入染色體中pta-ackA之啟始密碼組之上游。具體地，PCR反應係藉由30循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸1分鐘而進行。
由此篩選之Z麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，分別命名為KCCM11240P lysCP1-1’ pta-ackA及KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE lysCP1-1’ pta-ackA。
2-2.來自具有製造腐胺的ATCC13869系棒狀桿菌菌株之pta-ackA啟動子之取代之菌株的製作
為了確認源自於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869株的編碼pta-ackA之基因之序列及藉由實施例
2-1所揭示之方法由其所表現之蛋白質，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869的基因組DNA為模板與及引子對SEQ ID NOS：17及22(表3及4)一起進行PCR。具體地，PCR反應係皆由30循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸3分鐘而進行。
由此所獲得之PCR產物係藉由電泳分離並分析序列。其結果，確認源自於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869株之編碼pta-ackA之基因包含SEQ ID NO：8所示之多核苷酸序列，且該基因所編碼之蛋白質包含SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列。
另一方面，比較源自於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032株的pta-ackA之胺基酸序列(SEQ ID NO：5)及源自於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869株的pta-ackA之胺基酸序列之結果，確認其等具有99.4%之序列同源性。
首先，獲得同源重組片段，其包含lysCP1啟動子及該啟動子的兩末端具有染色體之原始pta-ackA序列。具體言之，lysCP1啟動子之5'-末端區域係使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869株之基因組DNA及引子對SEQ ID
NOS：17及23一起進行PCR而獲得。具體地，PCR反應係藉由30循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸30秒而進行。又，lysCP1啟動子區域係使用引子對SEQ ID NOS：14及19，以相同之條件進行PCR獲得，以及lysCP1啟動子的3'-末端區域係使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869株之基因組DNA為模板及引子對SEQ ID NOS：20及21一起，進行PCR獲得。在啟動子之取代中所使用之引子對係示於表1、3及4。
其所得之各PCR產物係使用經以XhoI處理之pDZTn載體進行融合選殖。融合選殖係以In-Fusion® HD選殖套組(Clontech公司)操作且由此所獲得之質體命名為pDZ-lysCP1-2’ pta-ackA。
上述所製作之質體pDZ-lysCP1-2’ pta-ackA，以實施例2-1之相同之方法，分別轉形入實施例1-2中之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株DAB12-b及DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE。其結果，確認lysCP1啟動子係經導入染色體中pta-ackA之起始密碼子的上游。該麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，分別命名為DAB12-b lysCP1-2’ pta-ackA及DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE lysCP1-2’ pta-ackA。
2-3.具有經增強的pta-ackA之菌株之腐胺製造能力的評估
為了確認以源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE經導入之製造腐胺的菌株中的pta-ackA的增強之
效果，比較於實施例2-1及2-2中所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株之間之腐胺製造能力。
具體地，分別將4種麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株(KCCM11240P lysCP1-1’ pta-ackA、KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE lysCP1-1’ pta-ackA、DAB12-b lysCP1-2’ pta-ackA、及DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE lysCP1-2’ pta-ackA)、及4種親代菌株(KCCM11240P、KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE、DAB12-b、及DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE)，分別平板培養於含1mM精胺酸之CM平板培養基(1L中含1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母萃取物、0.5%牛肉萃取物、0.25% NaCl、0.2%尿素、100μL之50% NaOH、2%洋菜膠，pH 6.8)，並在30℃培養24小時。由各培養菌株取約1白金環量，接種於25mL之力價培養基(1L中含8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸液、0.4%之(NH4)2SO4、0.1%之KH2PO4、0.05%之MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素(100μg)、鹽酸硫胺素(3mg)、泛酸鈣(3mg)、菸鹼醯胺(3mg)、5% CaCO3)，並在30℃以200rpm振盪培養98小時。在所有菌株培養物中，於培養基中添加1mM精胺酸。培養完成時，測定各培養液中所製造之腐胺濃度且結果示於下述表5。
如表5所示，在KCCM 11240P及DAB12-b分別增強pta-ackA時，腐胺製造量均為相同程度。然而，在2種不同之同時經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE基因之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株( )分別增強pta-ackA時，相較於親代菌株，腐胺製造量增加14.3%或更高。又，基於該經修飾菌株，腐胺製造量可增加4%或更高。
因此，本發明人等再命名棒狀桿菌屬之微生物(麩胺酸棒狀桿菌KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE：lysCP1-1’ pta-ackA)，其具有製造腐胺之經改善能力，係由藉由導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE之活性及增強麩胺酸棒狀桿菌KCCM 11240P菌株的pta-ackA活性而由麩胺酸棒狀桿菌KCCM 11240P製備，為CC01-1145株，並在2014年11月21日依據布達佩斯條約以登錄編號KCCM11606P，寄存於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)。
實施例3：以源自大腸菌之acs導入經以源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE導入至腐胺製造菌株及確認所得之菌株腐胺製造能力之確定
3-1.製作以源自大腸菌之acs導入至製造腐胺的ATCC13032系菌株的轉位子基因之菌株
使用lysCP1啟動子將acs導入轉位子基因，以確認以源自大腸菌之乙醯基-輔酶A合成酶(acs)基因，導入已導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE之製造腐胺的ATCC13032系菌株，是否可改善腐胺製造之能力。
具體地，依據編碼acs之基因之SEQ ID NO：10所揭示的多核苷酸序列，如上述之表1及下述之表6所示，製作引子對SEQ ID NOS：24及25用以獲得acs ORF區域附近之同源重組片段、及引子對SEQ ID NOS：13及14用以獲得之lysCP1啟動子區域附近之同源重組片段。
具體言之，使用大腸菌W3110株之染色體為模板及引子對SEQ ID NOS：24及25一起擴增a大小約2
kb之基因片段，用以獲得acs基因。具體地，PCR反應係藉由30循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸1分鐘30秒而進行。然後，由此獲得之PCR產物於0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，並溶洗及純化所期望之條帶。
又，lysCP1啟動子，係使用以KCCM10919P(國際專利公開案第WO 2009/096689號)菌株之染色體為模板及引子對SEQ ID NOS：13及14一起進行PCR而獲得，其藉由30循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸30秒而進行。
pDZ載體經XhoI處理且由此獲得之各PCR產物進行融合選殖。融合選殖係以In-Fusion® HD選殖套組(Clontech公司)操作。由此獲得之質體，命名為pDZTn-lysCP1-acs。
其次，藉由電穿孔法，將質體pDZTn-lysCP1-acs分別導入KCCM11240P及實施例1-1中所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE，以獲得轉形株，且該轉形株平板培養於含康黴素(25μg/mL)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚啉-D-半乳醣苷)之BHIS平板培養基(腦心浸液(37g/L)、山梨醣醇(91g/L)、及洋菜膠(2%))且培養至形成菌落。菌落中，篩選藍色菌落且藉此篩選導入質體pDZTn-lysCP1-acs的轉形株。
該所篩選之菌株於CM培養基(葡萄糖(10
g/L)，多蛋白腖(10g/L)，酵母萃取物(5g/L)，牛肉萃取物(5g/L)，NaCl(2.5g/L)，尿素(2g/L)，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)，並連續稀釋為I0-4至10-10，平板培養於含X-gal之固體培養基且培養至形成菌落。於所形成之菌落中，篩選呈相對低比例之白色菌落且最後篩選藉由二次交叉經導入acs編碼基因之菌株。最後篩選之菌株使用引子對SEQ ID NOS：13及25進行PCR，且確認導入acs編碼基因，該麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，分別命名為KCCM11240P Tn：lysCP1-acs及KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE Tn：lysCP1-acs。
3-2.製作以源自大腸菌之acs導入至製造腐胺的ATCC13869細菌株的轉位子基因之菌株
如實施例3-1，上述中所製作之pDZTn-lysCP1-acs，係以如實施例3-1之相同的方法，分別轉形至DAB12-b及實施例1-2中所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE，並確認acs經導入至轉位子基因。
該由此篩選之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株分別命名為DAB12-b Tn：1ysCP1-acs及DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE Tn：lysCP1-acs。
3-3.經導入源自大腸菌之acs之菌株之腐胺製造能力的評估
為了確認在以源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE經導入的腐胺製造菌株中的導入acs之效果，
比較實施例3-1及3-2中所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株之間的腐胺製造之能力。
具體言之，即將4種麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株(KCCM11240P Tn：lysCP1-acs、KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE Tn：lysCP1-acs、DAB12-b Tn：lysCP1-acs、及DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE Tn：lysCP1-acs)、及4種親代菌株(KCCM11240P、KCCMl1240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE、DAB12-b、及DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE)，分別平板培養在含1mM精胺酸之CM平板培養基(1L中含1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母萃取物、0.5%牛肉萃取物、0.25% NaCl、0.2%尿素、100μL之50% NaOH、2%洋菜膠，pH 6.8)，並在30℃培養24小時。然後由所培養之各菌株取約1白金環量，接種於25mL之力價培養基(1L中含8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸液、0.4%之(NH4)2SO4、0.1%之KH2PO4、0.05%之MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素(100μg)、鹽酸硫胺素(3mg)、泛酸鈣(3mg)、菸鹼醯胺(3mg)、5% CaCO3)，並在30℃以200rpm振盪培養98小時。在所有菌株培養物中，於培養基中添加1mM精胺酸。培養完成時，測定各培養液中所製造之腐胺濃度，結果示於下述表7。
如表7所示，在KCCM 11240P及DAB12-b中分別經導入acs時，腐胺製造量為相同程度。然而，在同時經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE基因之2種不同之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株(KCCM11240P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE；DAB12-b Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE)中，導入acs時，相較於親代菌株，腐胺製造量增加13.5%或更高。又，相較於上述之經修飾菌株，腐胺製造量增加3.4%或更高。
實施例4：具有源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE的導入以及來自具有經改善的腐胺輸出能力的製造腐胺菌株的pta-ackA操縱子的取代之菌株，以及該菌株之腐胺製造能力
4-1.自具有經改善的腐胺輸出能力的菌株製作具有源自大腸菌之argA、argE的導入以及pta-ackA操縱子的取代之菌株
製作菌株，基於具有經改善的腐胺輸出能
力的KCCM11401P(韓國專利申請公開第10-2014-0115244號)菌株，以檢測源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE的導入以及棒狀桿菌pta-ackA之活性的增強，是否可改善腐胺製造之能力。
具體地，以實施例1-1之相同之方法，將實施例1-1中所製作之pDZTn-lysCP1-argA轉形至KCCM11401P，且其結果，確認argA經導入至轉位子基因。由此篩選之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，命名為KCCM11401P Tn：lysCP1-argA。
又，為了在實施例1-1所製備之經導入argA之菌株導入argE，再以實施例1-1之相同之方法，以實施例1-1中所製作之pDZTn-lysCP1-argE轉形至KCCM11401P Tn：lysCP1-argA，並確認argE經導入至轉位子基因。由此篩選之經修飾菌株，命名為KCCM11401P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE。
然後，以實施例2-1之相同之方法，將實施例2-1中所製作之pDZ-lysCP1-1'pta-ackA，轉形至KCCM11401P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE，並確認lysCP1啟動子經導入至染色體中pta-ackA之起始密碼子之上游。上述之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，命名為KCCM11401P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE lysCP1-1’ pta-ackA。
4-2.自具有經改善的腐胺輸出能力的菌株製作具有源自大腸菌之argA、源自大腸菌之argE的導入及
pta-ackA啟動子的取代之菌株的評估
為了確認在具有經改善的腐胺輸出能力之製造腐胺的麩胺酸棒狀桿菌之源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE的導入及pta-ackA活性增強之效果，比較實施例4-1中所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株之間之腐胺製造能力。
具體地，即將麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株(KCCM11401P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE、KCCM11401P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE lysCP1-1'pta-ackA)、及親代菌株(KCCM11401P)，分別平板培養在含1mM精胺酸之CM平板培養基(1L中含1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母萃取物、0.5%牛肉萃取物、0.25% NaCl、0.2%尿素、100μL之50% NaOH、2%洋菜膠，pH 6.8)，並在30℃培養24小時。然後由所培養之各菌株取約1白金環量，接種於25mL之力價培養基(1L中含8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸液、0.4%之(NH4)2SO4、0.1%之KH2PO4、0.05%之MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素(100μg)、鹽酸硫胺素(3mg)、泛酸鈣(3mg)、菸鹼醯胺(3mg)、5% CaCO3)，並在30℃以200rpm振盪培養98小時。在所有菌株之培養物中，在培養基中添加1mM精胺酸。培養完成時，測定各培養液中所製造之腐胺濃度，且結果示於下述表8。
如表8所示，確認在具有經增強的腐胺輸出能力之KCCM11401P經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE的基因時，相較於親代菌株的腐胺製造量增加11.9%，且當該菌株以pta-ackA進一步增強時，相較於親代菌株的腐胺製造量增加16.1%。
實施例5：在製造鳥胺酸之菌株中導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE及確認該菌株的鳥胺酸製造能力
5-1.製作以源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE同時經導入製造鳥胺酸的KCCM1113P系菌株之轉位子基因的菌株
為確認在KCCM11137P(韓國專利申請公開第10-1372635號公報)菌株中，該菌株為製造鳥胺酸的ATCC13032系菌株，導入源自大腸菌之argA基因及源自大腸菌之argE基因，是否可改善鳥胺酸之製造能力，使用實施例1-1中所製作之載體將argA基因及argE基因導入該菌株之轉位子基因。
首先，以電穿孔法，將質體pDZTn-lysCP1-argA導入KCCM11137P菌株中，然後將轉形
株平板培養於含康黴素(25μg/mL)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚啉-D-半乳醣苷)之BHIS平板培養基(腦心浸液(37g/L)、山梨醣醇(91g/L)、及洋菜膠(2%))且培養至形成菌落。由菌落中，篩選藍色菌落且藉此篩選經導入質體pDZTn-lysCP1-argA的轉形株。
該所篩選之菌株，於CM培養基(葡萄糖(10g/L)，多蛋白腖(10g/L)，酵母萃取物(5g/L)，牛肉萃取物(5g/L)，NaCl(2.5g/L)，尿素(2g/L)，pH6.8)中振盪培養(30℃，8小時)，並連續稀釋為10-4至10-10，然後平板培養於含X-gal之固體培養基且培養至形成菌落。於所形成之菌落中，篩選相對低比例之白色菌落，最後篩選藉由二次交叉經導入argA編碼基因之菌株。該最後篩選之菌株使用引子對SEQ ID NOS：12及13進行PCR且確認經導入argA轉譯之基因，麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，命名為KCCM11137P Tn：lysCP1-argA。
為在上述所製作之經導入argA之菌株中導入argE，以實施例1-1的相同之方法，將實施例1-1中所製作之pDZTn-lysCP1-argE轉形至KCCM11137P Tn：1ysCP1-argA，且藉此確認argE經導入轉位子基因中。
該篩選之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株命名為KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE。
5-2.在製造鳥胺酸之棒狀桿菌菌株中經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE的鳥胺酸製造能力的評估
為確認源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE導入至製造鳥胺酸的菌株對鳥胺酸製造之效果，比較實施例5-1所製作之的麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株之間之鳥胺酸製造能力。
具體地，將1種麩胺酸棒狀桿菌之經修飾株(KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE)、及1種親代菌株(KCCM11137P)，分別平板培養在含1mM精胺酸之CM平板培養基(1L中含1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母萃取物、0.5%牛肉萃取物、0.25% NaCl、0.2%尿素、100μL之50% NaOH、2%洋菜膠，pH 6.8)，並在30℃培養24小時。由各培養菌株取約1白金環量，接種於25mL之力價培養基(1L中含8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸液、0.4%之(NH4)2SO4、0.1%之KH2PO4、0.05%之MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素(100μg)、鹽酸硫胺素(3mg)、泛酸鈣(3mg)、菸鹼醯胺(3mg)、5% CaCO3)，並在30℃以200rpm振盪培養98小時。所有菌株之培養物中，在培養基中添加1mM精胺酸。培養完成時，測定各培養液中所製造之腐胺濃度，結果示於下述表9。
如表9所示，確認在麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株經導入源自大腸菌之argA基因及源自大腸菌之
argE基因時，相較於親代菌株，鳥胺酸製造量增加14.1%。
實施例6：經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE的菌株之pta-ackA的增強及該菌株的鳥胺酸製造能力之確認
6-1.來自製造鳥胺酸的ATCC13032系菌株之pta-ackA啟動子之菌株的製作
為確認經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE之製造鳥胺酸的ATCC13032系菌株之pta-ackA活性增強是否可改善鳥胺酸製造之能力，再將lysCP1啟動子(WO 2009/096689)導入染色體之pta-ackA操縱子之起始密碼子的上游。
首先，以電穿孔法，將實施例2-1中製作之質體pDZ-lysCP1-1'pta-ackA，分別導入KCCM11137P及KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE菌株中，以獲得轉形株，然後將轉形株平板培養於含康黴素(25μg/mL)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚啉-D-半乳醣苷)之BHIS平板培養基(腦心浸液(37g/L)、山梨醣醇(91g/L)、及洋菜膠(2%))且培養至形成菌落。由菌落中，篩選藍色菌落且藉此篩選經導入質體pDZ-lysCP1-1’ pta-ackA的轉形株。
該所篩選之菌株於CM培養基(葡萄糖(10g/L)，多蛋白腖(10g/L)，酵母萃取物(5g/L)，牛肉萃取物(5g/L)，NaCl(2.5g/L)，尿素(2g/L)，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)，並連續稀釋為10-4至10-10，然後平板培養於含X-gal之固體培養基且培養至形成菌落。
於所形成之菌落中，篩選相對低比例之白色菌落，最後篩選藉由二次交叉之經以lysCP1啟動子取代pta-ackA啟動子之菌株。該最後所篩選之菌株使用引子對SEQ ID NOS：19及21進行PCR，且確認lysCP1啟動子經導入染色體之pta-ackA操縱子起始密碼子之上游。具體地，PCR反應，係藉由30循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒、及72℃延伸1分鐘而進行。
該篩選之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，分別命名為KCCM11137P lysCP1-1’ pta-ackA及KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE lysCP1-1’ pta-ackA。
6-2.具有增強之pta-ackA活性之菌株的鳥胺酸製造能力的評估
為確認在經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE之製造鳥胺酸之菌株中pta-ackA活性增強的效果，比較實施例6-1中所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株之間之鳥胺酸製造能力。
具體地，將2種不同之麩胺酸棒桿菌之經修飾菌株(KCCM11137P lysCP1-1’ pta-ackA、KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE lysCP1-1’ pta-ackA)、及2種不同之親代菌株(KCCM11137P、KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE)，分別平板培養在含1mM精胺酸之CM平板培養基(1L中含1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母萃取物、0.5%牛肉萃取物、0.25% NaCl、0.2%
尿素、100μL之50% NaOH、2%洋菜膠，pH 6.8)，並在30℃培養24小時。然後由各培養菌株取約1白金環量，接種於25mL之力價培養基(1L中含8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸液、0.4%之(NH4)2SO4、0.1%之KH2PO4、0.05%之MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素(100μg)、鹽酸硫胺素(3mg)、泛酸鈣(3mg)、菸鹼醯胺(3mg)、5% CaCO3)，並在30℃以200rpm振盪培養98小時。然後所有菌株之培養物中，在培養基中添加1mM精胺酸。培養完成時，測定各培養液中所製造之鳥胺酸之濃度，結果示於下述表10。
如表10所示，確認在KCCM11137P系菌株之pta-ackA活性經增強時，並未增加鳥胺酸製造量，然而在同時經導入源自大腸菌之argA基因及源自大腸菌之argE基因之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE菌株，與KCCM11137P菌株者相比較，鳥胺酸製造量增加20.5%，且與KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE菌株相比較，亦增加5.6%。
實施例7：在經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE之菌株中導入源自大腸菌之acs及該菌株的鳥胺酸製造能力之確認
7-1.製作由製造鳥胺酸之KCCM11137系菌株製造經導入源自大腸菌之acs至轉位子基因的菌株
使用lysCP1啟動子將acs導入轉位子基因，以確認以源自大腸菌之acs導入KCCM11137P(韓國專利第10-1372635號)菌株，該菌株為製造鳥胺酸之麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032系菌株，是否可改善鳥胺酸製造之能力。
首先，以電穿孔法，將實施例3-1中製作之質體pDZTn-lysCP1-acs分別導入KCCM11137P及KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE菌株中，以獲得轉形株，然後將轉形株平板培養於含康黴素(25μg/mL)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚啉-D-半乳醣苷)之BHIS平板培養基(腦心浸液(37g/L)、山梨醣醇(91g/L)、及洋菜膠(2%))且培養至形成菌落。由菌落中，篩選藍色菌落且藉此篩選經導入質體pDZTn-lysCP1-acs的轉形株。
該所篩選之菌株，於CM培養基(葡萄糖(10g/L)，多蛋白腖(10g/L)，酵母萃取物(5g/L)，牛肉萃取物(5g/L)，NaCl(2.5g/L)，尿素(2g/L)，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)，並連續稀釋為10-4至10-10，然後平板培養於含X-gal之固體培養基且培養至形成菌落。於由此所形成之菌落中，篩選相對低比例之白色菌落且最
後篩選藉由二次交叉經導入acs編碼基因之菌株。
該最後所篩選之菌株，使用引子對SEQ ID NOS：13及25進行PCR，且確認經導入acs編碼基因。該由此所篩選之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，分別命名為KCCM11137P Tn：lysCP1-acs及KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE Tn：lysCP1-acs。
7-2.經導入源自大腸菌之acs之菌株的鳥胺酸製造能力的評估
為確認acs導入對於經導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE之製造鳥胺酸的菌株之效果，比較實施例7-1所製作之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株之間的鳥胺酸製造之能力。
具體地，將2種不同之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株(KCCM11137P Tn：lysCP1-acs、KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE Tn：lysCP1-acs)、及2種不同之親代菌株(KCCM11137P、KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE)，分別平板培養在含1mM精胺酸之CM平板培養基(1L中含1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母萃取物、0.5%牛肉萃取物、0.25% NaCl、0.2%尿素、100μL之50% NaOH、2%洋菜膠，pH 6.8)，並在30℃培養24小時。然後由各培養菌株取約1白金環量，接種於25mL之力價培養基(1L中含8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸液、0.4%之(NH4)2SO4、0.1%之KH2PO4、0.05%之MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素(100μg)、鹽酸硫胺素
(3mg)、泛酸鈣(3mg)、菸鹼醯胺(3mg)、5% CaCO3)，並在30℃以200rpm振盪培養98小時。然後所有菌株之培養物中，在培養基中添加1mM精胺酸。培養完成時，測定各培養液中所製造之鳥胺酸濃度，結果示於下述表11。
如表11所示，確認在KCCM11137P菌株經導入acs時，並未增加鳥胺酸製造量，然而在KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE菌株，該菌株為中同時導入源自大腸菌之argA基因及源自大腸菌之argE基因之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株，相較於KCCM11137P菌株者為鳥胺酸製造量增加17.9%，且相較於KCCM11137P Tn：lysCP1-argA Tn：lysCP1-argE菌株，亦增加3.4%。
總結前述情形，確認在棒狀桿菌菌株中導入源自大腸菌之argA及源自大腸菌之argE，可增加腐胺及鳥胺酸之製造量，而且，確認棒狀桿菌菌株中pta-ackA基因之活性增強或導入源自大腸菌之acs，可進一步增加腐胺及鳥胺酸之製造量。
由上述內容，本發明相關技術範疇之技術者可以瞭解，本發明在不改變本發明之技術概念或基本特
徵之下，亦可包含其他之具體形態。因此，本發明所揭示之例示性具體例只在於說明本發明性目的，並不限定本發明之範圍。相反地，本發明不惟包含例示性具體例，在本發明之精神及申請範圍所述之範圍內，亦可包含各種變更、修改、均等物及其他具體例。
布達佩斯條約締約國所承認之專利手續上的微生物寄存的國際寄存機構根據布達佩斯條約第7.1條出具此證明
寄存者：CJ第一製糖股份有限公司
地址：大韓民國100-400首爾市 中區 東湖路330 CJ第一製糖中心
1.微生物之標示：：Corynebacterium glutamicum CC01-1145
受託編號：KCCM11606P
2.科學的性質及分類學上的位置
第1項的微生物檢附記載下述事項的文件
分類學上的位置
3.受領及受託
本局於2014年11月21日(原寄存日)受領第1項的微生物的受託。
4.國際寄託局：大韓民國微生物保存中心
中心長
地址：大韓民國120-861首爾市 西大門區 弘濟洞-2-1 45儒林大樓
2014年11月21日
<110> CJ第一製糖股份有限公司
<120> 用於製造腐胺或鳥胺酸的微生物及使用該微生物用於製造腐胺或鳥胺酸的方法
<130> OPA16079-TW
<150> KR10-2015-0102624
<151> 2015-07-20
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<170> KopatentIn 2.0
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<213> 大腸菌之N-乙醯基麩胺酸合成酶
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<213> 大腸菌之乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶
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<212> DNA
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<213> 大腸菌之乙醯基-輔酶A
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Claims (17)
- 一種製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌(Corynebacterium)屬之經修飾微生物，其中係經導入源自大腸菌之N-乙醯基麩胺酸合成酶及源自大腸菌之乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶之活性。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中該源自大腸菌之N-乙醯基麩胺酸合成酶係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中該源自大腸菌之乙醯基鳥胺酸脫乙醯基酶係由SEQ ID NO：3之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中該棒狀桿菌屬微生物為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子(pta-ackA操縱子)之活性係進一步增強。
- 如申請專利範圍第5項所述之經修飾微生物，其中該磷酸轉乙醯基酶及乙酸激酶操縱子係由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中進一步經導入源自大腸菌之乙醯基-輔酶A合成酶(acs)之活性。
- 如申請專利範圍第7項所述之經修飾微生物，其中該乙 醯基-輔酶A合成酶係由SEQ ID NO：9之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中進一步經導入鳥胺酸脫羧基酶(ODC)之活性。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，i)鳥胺酸甲胺醯基轉移酶(ArgF)、ii)麩胺酸輸出蛋白、或iii)鳥胺酸胺甲醯基轉移酶及麩胺酸輸出蛋白之活性係進一步減弱。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，選自乙醯基-γ-麩胺醯磷酸還原酶(ArgC)、乙醯基麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)、及乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)所成之群組之至少一種的活性係進一步增強。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，乙醯基轉移酶的活性係進一步減弱。
- 如申請專利範圍第12項所述之經修飾微生物，其中該乙醯基轉移酶係由SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之經修飾微生物，其中相較於其內源性活性，腐胺輸出蛋白的活性係進一步增強。
- 如申請專利範圍第14項所述之經修飾微生物，其中腐胺輸出蛋白係由SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28之胺基酸序列所組成。
- 一種製造腐胺或鳥胺酸的方法，包含：i)以培養基培養如申請專利範圍第1項至第15項中任一項所述之棒狀桿菌屬之經修飾微生物；以及ii)由該經培養的微生物或該培養基回收腐胺或鳥胺酸。
- 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該棒狀桿菌屬微生物為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
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