JP5274253B2 - 組織保護ペプチド及びその使用 - Google Patents

Description

（1. 緒言）
本発明は、新規な組織保護ペプチドを対象とする。本発明の組織保護ペプチドは、組織保護受容体複合体に結合し得る。特に、本発明は、エリスロポエチン（EPO）を含むサイトカイン受容体リガンドの一部の共通配列に由来する又は該共通配列を共有する組織保護ペプチドに関し、これは該リガンドの該受容体複合体への結合、例えばEPO受容体ホモ二量体への結合には関与しない。したがって、本発明の組織保護ペプチドは一般的に、該受容体複合体の向かい側であるリガンドタンパク質領域上又は該タンパク質内に位置するサイトカイン受容体リガンド領域のアミノ酸配列に由来する。すなわち組織保護ペプチドは一般的に、該受容体複合体の外側に向いているリガンドタンパク質領域のアミノ酸配列に由来すると同時に、該リガンドは該受容体に結合する。本発明はさらに、合成保護ペプチドを設計することにおける使用のための共通配列を対象とする。これらの組織保護ペプチドは、組織保護受容体リガンド、例えばEPO内の重要なアミノ酸残基の空間的な局在を模倣して設計されたフラグメント、キメラ、並びにペプチドも含む。

本発明は、本発明の組織保護ペプチドを使用する、疾患又は障害の治療、予防若しくは改善のための方法、及び／又は組織負傷の治療、回復若しくは改善のための方法も含む。本発明は、本発明の組織保護ペプチドを使用する、興奮性組織機能を促進するための方法も含む。

（2. 本発明の背景）
エリスロポエチン（「EPO」）は一般にヘマトクリットの維持、より最近では、組織保護に関連する糖タンパク質ホルモンである。成熟ヒトEPOタンパク質は165アミノ酸を含み、該分子の重量の約40％に寄与するグリコシル残基を伴って34kDaの分子量を有する。EPO分子は、該疎水性ドメインを介して相互作用することで、水性環境内で球状構造を優勢的に形成する4つのヘリックスを含む（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる、Cheethamらの論文, 1998, Nat. Struct. Biol. 5:861-866）。本発明は、水性環境に面しているある種のアミノ酸（すなわち、疎水性の球状中心コアとは離れている）が組織保護を仲介するという発見に由来する。ペプチドは、本出願人によって同定されてきた組織保護領域の理解に由来する、又は該理解から設計することができる。

先に指摘したように、EPOは多能性である。そのホルモン的役割において、EPOは、赤血球前駆細胞の赤血球への成熟化におけるその役割を介してヘマトクリットを制御する。EPOは、赤血球前駆細胞の成熟化段階の間に抗アポトーシス作用物質として機能し、前駆細胞が赤血球へと成熟化することを可能にする。組織酸素レベルの低下（低酸素状態）は、腎臓によるエリスロポエチンの増強産生を誘発し、これは赤血球新生の増加をもたらす。腎臓が一般的に血清エリスロポエチンの大部分を産生することを考慮すると、慢性腎不全などの腎臓機能の欠損は、EPOの産生減少、及びしばしば貧血をもたらす。同様に、貧血は、ガンなどの他の慢性状態、又は化学療法などのEPOの産生を直接的に抑制するこれらの疾病に関連する治療にも起因する可能性がある。市販の組換えエリスロポエチンは、Ortho Biotech社, Raritan, NJから入手可能なPROCRITの商標で、及びAmgen社, Thousand Oaks, CAから入手可能なEPOGENの商標で利用可能であり、末期腎臓疾患から生じる貧血の治療、HIV感染患者におけるAZT（ジドブジン）を用いた療法、腫瘍学的患者、並びに化学療法に使用されている。現在では、高グリコシル化エリスロポエチンであるARANESP（商標）（Amgen社, Thousand Oaks, CA）が貧血の治療に使用できる。さらに、これらの化合物は、同種輸血の必要性を減少させるため、手術を受けている患者のヘマトクリットを増加させるのに使用されている。

最近、いくつかのラインの証拠は、EPOも局部的に、パラクライン-オートクライン様式で組織損傷を最小化させるのに機能することが示唆されている。例えば、EPOは、低酸素の細胞微小環境を改善し、代謝ストレスによって引き起こされるプログラム細胞死を減少させる。これらの活性の両方は、部分的にはエリスロポエチン受容体（「EPOR」）タンパク質を含む特定の細胞表面受容体とEPOとの相互作用を介して部分的に抑えられる。EPORはおよそ66kDaのタンパク質であり、かつ1型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。このファミリーは、それらの細胞外ドメインの共有されている相同性に基づいて互いにグループ化された受容体を含み、かつインターロイキンIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、白血病抑制因子（LIF）、繊毛様神経栄養因子（CNTF）、トロンボポエチン、成長ホルモン、及びプロラクチンに対する受容体を含む。これらの受容体の保存された細胞外ドメインはおよそ200アミノ酸の長さを有し、これには該アミノ末端領域において位置的に保存された4個のシステイン残基（Cys 294、Cys 283、Cys 248、及びCys 238であって、これらは該受容体の維持及び構造的完全性に不可欠であるとみられる（Murrayの文献, 1996, Harpers Biochemistry 第24版 524-526頁, Appilion & Lange社；Caravellaらの論文, 1996, Protein: Struct. Funct. Gen. 24:394-401。これらの各々はその全てが引用により本明細書に組み込まれる。））及び膜貫通ドメインの近くに位置するTrp-Ser-X-Trp-Ser (配列番号：58)モチーフを含む。

エリスロポエチンに関連して、EPORは同様の様式で、1型サイトカイン受容体ファミリー内の他の受容体に機能する。はじめに、受容体リガンド、例えばEPOは、予め形成されたEPORの二量体、すなわち(EPOR)₂に結合する。EPOは、該リガンド表面上の2つの異なる領域：高親和性受容体結合部位（部位1）及び低親和性結合部位（部位2）；を介して古典的(EPOR)₂ホモ二量体受容体の細胞外ドメインと相互作用することが測定されている。部位1と会合するEPOのアミノ酸配列は、配列番号：1のアミノ酸44〜49に対応するTKVNFY（配列番号：2）、及び配列番号：1のアミノ酸146〜151に対応するSNFLRG（配列番号：3）であって；部位2と会合する配列は、配列番号：1のアミノ酸11〜15に対応するVLERY（配列番号：4）及び配列番号：1のアミノ酸100〜104に対応するSGLRS（配列番号：5）である（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるCheethamらの論文,1998, Nature Structural Biology 5:861-866）。EPORホモ二量体活性は、EPORに会合するシグナル伝達タンパク質、例えばJak2のチロシンリン酸化を引き起こし、これが順次、ホスファチジルイノシトール（PI）3-キナーゼ経路、Ras/MAPキナーゼ経路、及び／又はSTAT経路を含む、いくつかの異なる経路を活性化し得る。これらの経路は、エリスロポエチンによって仲介される赤血球新生に必要な抗アポトーシス機能を誘発する（Kiritoらの論文, 2002, Blood 99:102-110；Livnahらの論文, 1999, Science 283:987-990；Narandaらの論文, 2002, Endocrinology 143:2293-2302；Remyらの論文, 1999, Science 283:990-993；及び、Yoshimuraらの論文, 1996, The Oncologist 1:33 7-339。これら各々の論文は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。）。

最近、本出願人は、EPOの組織保護特性が、EPORのみならず別の受容体タンパク質であるベータ共通受容体（「β_c」）を含む受容体によっても仲介されていることを発見した。EPOR/β_c受容体は、ホモ二量体(EPOR)₂とは対照的にヘテロ複合体（下記を参照されたい）であり、かつ興奮性組織の保護に役割を果たすことが知られている。例えば、WO 2004/096148、並びに2001年12月28日に出願されたPCT第PCT/US01/49479号、2000年12月29日に出願された米国特許出願第09/753,132号、及び2002年7月3日に出願された10/188,905を参照されたく、これら各々は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。本出願人は、該β_c受容体がこれら興奮性組織において組織保護経路の中心であることを確立していたが、該受容体の活性化リガンドの構造は依然として不明であった。

（3. 要旨）
本発明は、応答性細胞、組織又は器官において少なくとも1つの細胞保護活性を有する単離ポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、共通配列（ａ）H₁-N₁-(X)_n-N₂-H₂（該配列中、_nは0、1、2、3、4又は5）；（ｂ）H₁-N₁-(X)_n-N₂-L₁（該配列中、_nは0、1、2、3、4又は5）；（ｃ）L₁-N₁-(X)_n-N₂-H₁（該配列中、_nは0、1、2、3、4又は5）；（ｄ）H₁-N₁-(L)_n-P₁-H₂（該配列中、_nは0又は1）；又は、（ｅ）H₁-P₁-(L)_n-N₁-H₂（該配列中、_nは0又は1）；を含むアミノ酸モチーフを含み、該配列中、H₁及びH₂は疎水性アミノ酸、N₁及びN₂は負荷電アミノ酸、Xは任意のアミノ酸、L₁は極性アミノ酸、並びにP₁は正荷電アミノ酸である。ある実施態様において、本発明のペプチドは赤血球新生活性も欠失しており、例えば受容者はヘモグロビン又はヘマトクリットを増加させない。さらなる実施態様において、本発明の単離ポリペプチドは、10以下、15以下、20以下、又は30以下のアミノ酸からなる。他の実施態様において、単離ペプチドは、配列番号：1で説明される成熟ヒトエリスロポエチン（「EPO」）のアミノ酸配列の任意の部分に、90 %未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満又は20%未満の配列相同性を有し、ここでEPOの前記部分は前記ペプチドと同じ数のアミノ酸残基を含む。

本明細書において先に記載した本発明のある実施態様において、単離ポリペプチドは、構造モチーフ（ａ）H₁-N₁-(X)_n-N₂-H₂（該配列中、_nは0、1、2、3、4又は5）（以下に論じる配列識別子6〜11によってそれぞれ具体化される）；（ｂ）H₁-N₁-(L)_n-P₁-H₂（該配列中、_nは0又は1）（以下に論じる配列識別子24〜25によってそれぞれ具体化される）；又は、（ｅ）H₁-P₁-(L)_n-N₁-H₂（該配列中、_nは0又は1）（以下に論じる配列識別子26〜27によってそれぞれ具体化される）；を含み、H₁及びH₂は同じ疎水性アミノ酸であり得る。本明細書において先に記載した本発明の他の実施態様において、単離ポリペプチドは、構造モチーフ（ａ）H₁-N₁-(X)_n-N₂-H₂（該配列中、_nは0、1、2、3、4又は5）；（ｄ）H₁-N₁-(L)_n-P₁-H₂（該配列中、_nは0又は1）；又は、（ｅ）H₁-P₁-(L)_n-N₁-H₂（該配列中、_nは0又は1）；を含み、H₁及びH₂は異なる疎水性アミノ酸であり得る。他の実施態様において、本発明は、アミノ酸モチーフ（ａ）H₁-N₁-(X)_n-N₂-H₂（該配列中、_nは0、1、2、3、4又は5）；（ｂ）H₁-N₁-(X)_n-N₂-L₁（該配列中、_nは0、1、2、3、4又は5）；（ｃ）L₁-N₁-(X)_n-N₂-H₁（該配列中、_nは0、1、2、3、4又は5）；を含む単離ポリペプチドを提供し、ここではN₁及びN₂は同じ負荷電アミノ酸であり得るか又は異なる負荷電アミノ酸であり得る。

本発明は、本明細書において先に記載したアミノ酸モチーフを含む単離ポリペプチドを提供し、ここで前記モチーフは前記ポリペプチドの配列内のアミノ酸配列内の連続したアミノ酸によって形成されている。この実施態様に従う具体的実施例において、本発明は、アミノ酸モチーフH₁-N₁-N₂-H₂ (配列番号：6)、H₁-N₁-X-N₂-H₂ (配列番号：7)、H₁-N₁-X-X-N₂-H₂ (配列番号：8)、H₁-N₁-X-X-X-N₂-H₂ (配列番号：9)、H₁-N₁-X-X-X-X-N₂-H₂ (配列番号：10)、H₁-N₁-X-X-X-X-X-N₂-H₂ (配列番号：11)、H₁-N₁-N₂-L₁ (配列番号：12)、H₁-N₁-X-N₂-L₁ (配列番号：13)、H₁-N₁-X-X-N₂-L₁ (配列番号：14)、H₁-N₁-X-X-X-N₂-L₁ (配列番号：15)、H₁-N₁-X-X-X-X-N₂-L₁ (配列番号：16)、H₁-N₁-X-X-X-X-X-N₂-L₁ (配列番号：17)、L₁-N₁-N₂-H₂ (配列番号：18) 、L₁-N₁-X-N₂-H₂ (配列番号：19)、L₁-N₁-X-X-N₂-H₂ (配列番号：20)、L₁-N₁-X-X-X-N₂-H₂ (配列番号：21)、L₁-N₁-X-X-X-X-N₂-H₂ (配列番号：22)、L₁-N₁-X-X-X-X-X-N₂-H₂ (配列番号：23)、H₁-N₁-P₁-H₂ (配列番号：24)、H₁-N₁-L₁-P₁-H₂ (配列番号：25)、H₁-P₁-N₁-H₂ (配列番号：26)、又はH₁-P₁-L₁-N₁-H₂ (配列番号：27)を含む単離ポリペプチドを提供し、ここでH₁及びH₂は疎水性アミノ酸であり、N₁及びN₂は負荷電アミノ酸であり、Xは任意のアミノ酸であり、L₁は極性アミノ酸であり、及びP₁は正荷電アミノ酸である。この実施態様と一致するある態様において、単離ポリペプチドは、アミノ酸残基H₁及びH₂を有するモチーフを含み、H₁及びH₂は同じ疎水性アミノ酸であり得るか又は異なる疎水性アミノ酸であり得る。この実施態様と一致する他の態様において、単離ポリペプチドは、アミノ酸残基N₁及びN₂を有するモチーフを含み、N₁及びN₂は同じ負荷電アミノ酸であり得るか又は異なる負荷電アミノ酸であり得る。

他の実施態様において、本発明は、アミノ酸モチーフがポリペプチドの三次構造内のアミノ酸の空間的な組織化に起因して形成されている、すなわち該モチーフを形成するアミノ酸が該ポリペプチドの三次元構造、すなわち三次構造において互いに空間的に隣接しているが、該ポリペプチド鎖の一次アミノ酸配列内の1以上のアミノ酸で隔てられ得る単離ポリペプチドを提供する。この実施態様に従う具体的実施例において、先に論じられた配列番号：6に類似するアミノ酸残基H₁、N₁、N₂、及びH₂を含むアミノ酸モチーフは、採用された三次構造、すなわち例えば、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10又は配列番号：11を含むペプチドのタンパク質フォールディングの結果として形成される可能性があり、ここでN₁とN₂との間のアミノ酸残基、例えば(X)_nは、N₁及びN₂が直線的に隣接するように折り畳まれる。したがって、本発明は、アミノ酸モチーフH₁N₁N₂H₂；H₁N₁N₂L₁；L₁N₁N₂H₁；H₁N₁(L)_nP₁H₂（該配列中、nは0又は1）；又はH₁P₁(L)_nN₁H₂（該配列中、nは0又は1）を含む単離ペプチドを含み、該モチーフは前記ポリペプチドの三次構造の結果として形成される。関連する実施態様において、アミノ酸モチーフはN₁及びN₂を含み、該三次構造は、N₁とN₂とのカルボニル炭素間の距離が、約3Å〜約5Å、好ましくは約4Å〜約5Å、及びより好ましくは約4.4Å〜約4.8Åであるように形成する。他の実施態様において、アミノ酸モチーフはN₁及びN₂を含み、該三次構造は、N₁とN₂との間の距離が、その２つの電荷分離、例えば荷電側鎖が約6.5Å〜約9Åであるように空間的に制限されるように形成する。関連する実施態様において、N₁及びN₂はそれゆえ、アルファヘリックスの全て又は一部を形成するアミノ酸配列中に存在する結果として空間的に制限され、かつ前記ヘリックスを形成する前記アミノ酸配列中の1、2又は2以上のアミノ酸によって隔てられ得る。他の関連する実施態様において、アミノ酸モチーフはN₁及びP₁を含み、該三次構造は、N₁とP₁とのカルボニル炭素間の距離が、約3Å〜約5Å、好ましくは約4Å〜約5Å、及びより好ましくは約4.4Å〜約4.8Åであるように形成する。他の実施態様において、アミノ酸モチーフはN₁及びP₁を含み、該三次構造は、N₁とP₁との間の距離が、その２つの電荷分離、例えば荷電側鎖が約6.5Å〜約9Åであるように空間的に制限されるように形成する。関連する実施態様において、N₁及びP₁は、アルファヘリックスの全て又は一部を形成するアミノ酸配列中に存在する結果として空間的に制限され、かつ前記ヘリックスを形成する前記アミノ酸配列中の1、2又は2以上のアミノ酸によって隔てられ得る。ある実施態様において、前記ポリペプチドの三次構造内でモチーフを形成するアミノ酸は、前記ポリペプチドの直鎖的アミノ酸配列内のアミノ酸残基に介在するのに等しい数で互いに隔てられている。さらに他の実施態様において、前記ポリペプチドの三次構造内でモチーフを形成するアミノ酸は、前記ポリペプチドの直鎖的アミノ酸配列内のアミノ酸残基に介在するのに等しい数で互いに隔てられている。ある実施態様において、本発明の単離ポリペプチドは、標準的三次構造、例えばα-ヘリックス又はβ-プリーツシートを形成して、前記構造の表面には前記モチーフを含むアミノ酸が存在し、それゆえモチーフそれ自身がタンパク質構造及び水性環境の界面に、すなわち折り畳まれたポリペプチドの表面上にモチーフが現れる。好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドの三次構造は、生理的条件における水性環境、例えば37℃のPBS（13mM NaH₂PO₄, 137mM NaCl, pH 7.4）で形成する。

具体的実施態様において、本発明は、本明細書の先に記載されているアミノ酸モチーフ、例えばペプチド A (APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE、配列番号：32)、ペプチド C (NITVPDTKVNFYAWKRMEVG、配列番号：29)、ペプチド D (QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV、配列番号：30)、ペプチド E (GCAEHCSLNENITVPDTKVN、配列番号：31)、ペプチド F (RYLLUNITTGC、配列番号：33)、ペプチド G (QEQLERALNSS、配列番号：40)、ペプチド I (CSLNENIQEQLERALNSS、配列番号：43)、ペプチド J (QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR、配列番号：41)、ペプチド K (WEHVNAIQEARRLL、配列番号：35)、又はペプチド L (KIRSDLTALTESYVKH、配列番号：37) を含む単離ポリペプチドを提供する。

ある実施態様において、本発明は、本明細書に記載されている1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、又は6を超えるアミノ酸モチーフを含む単離ポリペプチドを提供する。この実施態様に従う本発明の具体的態様において、単離ポリペプチドは本明細書の先に記載のアミノ酸モチーフの少なくとも2つを含み、前記少なくとも2つのモチーフは同じモチーフであり得るか又は異なるモチーフであり得る。

ある態様において、本発明は、赤血球新生活性を欠失している単離ポリペプチド、例えば受容者においてヘモグロビンを増加させる活性を欠失している単離ポリペプチドを提供する。好ましくは、単離ポリペプチドは、血管作動性作用（例えば、血管収縮）、血小板の過剰活性化、前血液凝固活性（pro-coagulant activities）及び増殖刺激、並びに／若しくは血小板及び／又はエリスロポエチン依存性細胞の産生（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるColemanらの論文, 2006, PNAS 103:5965-5970を参照されたい。）を含むが、これらに限定されない他の活性を欠失している。他の態様において、本発明は、少なくとも1つの細胞保護活性を含む単離ポリペプチドを提供する。そのような細胞保護活性は、応答性の哺乳動物細胞、組織又は器官の機能若しくは生存率を保護、維持、強化あるいは回復させることを含むが、これらに限定されない。

したがって、一態様において、本発明は、応答性の哺乳動物細胞並びにそれらが関連する細胞、組織及び器官の機能又は生存率を保護、維持、強化あるいは回復させるための医薬組成物の調製に関する、本明細書に記載の単離ポリペプチドの使用を対象とする。関連する実施態様において、該組成物は、それを必要とする患者への投与用である。好ましい実施態様において、前記患者は哺乳動物、及び好ましくはヒトである。

他の態様において、本発明は、応答性組織の負傷に対する保護及び／又は該負傷の予防用、該組織の回復用、又は応答性組織並びに／若しくはそれを必要とする対象における応答性組織機能の若返り用の医薬組成物の調製に関する、本明細書に記載の単離ポリペプチドの使用を対象とする。ある特定の態様において、応答性哺乳動物細胞及びその関連細胞、組織又は器官は、堅固な内皮細胞障壁のおかげで脈管構造に対して遠位である。別の特定の態様において、細胞、組織又は他の身体部分は、移植を意図するものなどの哺乳動物体から単離される。非限定的な例示を目的として、応答性細胞又は組織は、神経細胞又は組織、眼の細胞又は組織（例えば、網膜細胞又は組織）、脂肪細胞又は組織、結合細胞又は組織、髪の細胞又は組織、歯の細胞又は組織、粘膜細胞又は組織、膵臓細胞又は組織、内分泌細胞又は組織、耳の細胞又は組織、上皮細胞又は組織、皮膚細胞又は組織、筋細胞又は組織、心臓細胞又は組織、肺細胞又は組織、肝臓細胞又は組織、腸細胞又は組織、副腎細胞又は組織（例えば、副腎皮質細胞又は組織、副腎髄質細胞又は組織）、毛管細胞又は組織、内皮細胞又は組織、精巣細胞又は組織、卵巣細胞又は組織、骨細胞又は組織、皮膚細胞又は組織、あるいは子宮内膜細胞又は組織であり得る。さらに、応答性細胞の非限定的例は、光受容体細胞（桿体細胞及び錐体細胞）、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞、プルキンエ細胞、心筋細胞、ペースメーカー細胞、洞房結節細胞、洞結節細胞、結合組織細胞、房室結節細胞、ヒス束、肝細胞、星状細胞、クッパー細胞、メサンギウム細胞、腎臓上皮細胞、管状間質細胞、杯細胞、腸腺細胞（腺窩）、腸内分泌細胞、球状細胞、束状帯細胞、網状帯細胞、クロム親和性細胞、周皮細胞、ライディッヒ細胞、セルトリ細胞、精細胞、グラフ卵胞、一次原始卵胞、ランゲルハンス島、α-細胞、β-細胞、γ-細胞、F-細胞、骨前駆細胞、破骨細胞、骨芽細胞、子宮内膜間質細胞、子宮内膜細胞、幹細胞及び内皮細胞を含む。応答性細胞のこれらの例は、単なる説明である。一態様において、応答性の細胞又はその関連細胞、組織又は器官は、興奮性の細胞、組織若しくは器官であり、あるいは優勢的に興奮性細胞又は組織を含む。本発明のある態様において、興奮性組織は、中枢神経系組織、末梢神経系組織、心臓組織、又は網膜組織である。別の態様において、応答性の細胞又はその関連細胞、組織又は器官は、興奮性の細胞、組織若しくは器官ではなく、優勢的に興奮性細胞あるいは組織を含むものでもない。

応答性細胞における本発明の単離ポリペプチドの赤血球新生活性及び／又は組織保護活性は、任意の本明細書に記載の方法並びに／若しくは当業者に既知の方法で評価及び／又は測定してよい。ある実施態様において、赤血球新生活性及び／又は細胞保護活性は、インビトロアッセイで測定する。他の実施態様において、赤血球新生活性及び／又は細胞保護活性は、インビボアッセイで測定する。関連する実施態様において、細胞保護活性は神経保護であり、本発明は、インビトロでの（ａ）初代海馬ニューロンの試験培養物をN-メチル-D-アスパラギン酸及び前記ペプチドと接触させること；及び（ｂ）前記接触の48時間後に細胞の生存率を測定すること；による前記活性の評価方法を提供し、これは段階（ｂ）での細胞生存率が前記ペプチドが存在しないコントロール培養よりも高い場合、該ペプチドは細胞保護活性を有する組織保護活性を有するようなものである。

特定の実施態様において、上記単離ポリペプチドが使用される哺乳動物細胞、組織又は器官は、該細胞、組織若しくは器官の生存率に対し不都合な少なくとも1つの状態下で、時間を費やしている又は費やすであろうものである。この実施態様に従って、本発明の単離ペプチドは、そのような状態から生じる組織の負傷に対する保護及び／又は予防を提供し、該組織の回復を提供し、又はそのような状態が生じる前、その間若しくはその後に、それを必要とする対象に組織及び／又は組織機能の若返りを提供する。そのような状態は、外傷障害性インサイチュウ低酸素状態又は代謝機能不全、外科的に生じたインサイチュウ低酸素状態又は代謝機能不全、あるいはインサイチュウ毒素曝露を含み、後者は化学療法又は放射線療法と関連し得る。他の実施態様において、本発明の単離ペプチドは、疾患又は障害から生じる組織負傷に対する保護及び／又は該負傷の予防を提供し、該組織の回復を提供し、あるいはそのような状態が起こる前、その間、又はその後に該ペプチドを必要とする対象において組織及び／又は組織機能の若返りを提供する。関連する実施態様において、前記負傷は、発作性障害、多発性硬化症、脳卒中、低血圧、心停止、虚血、心筋梗塞、炎症、加齢性の認知機能喪失、放射線損傷、脳性麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ミトコンドリア疾患、AIDS認知症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール依存症、気分障害、不安障害、注意欠陥障害、自閉症、クロイツフェルト-ヤコブ病、脳又は脊髄の外傷性障害若しくは虚血、心臓-肺バイパス、慢性心不全、黄斑変性症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肝炎、膵炎、緑内障、網膜虚血、網膜の外傷性障害、心血管系疾患、心肺疾患、呼吸疾患、腎疾患、泌尿器系の疾患、生殖器官の疾患、骨疾患、皮膚疾患、結合組織疾患、胃腸疾患、内分泌異常、代謝異常、又は中枢神経系若しくは末梢神経系の疾患若しくは障害によって引き起こされる。さらに他の実施態様において、不都合な状態は、特定の外科的手順に使用されるような心臓-肺バイパス（心臓-肺装置）の結果である。さらに他の実施態様において、前記負傷は認知機能障害である。特定の実施態様において、上記単離ペプチドが使用される哺乳動物細胞、組織又は器官はβc受容体を発現する。

ある実施態様において、本発明は医薬組成物も対象とし、該医薬組成物はそれを必要とする対象への投与用の上記単離ポリペプチドを含む。この実施態様に従う特定の態様において、本発明の医薬組成物はさらに医薬として許容し得る担体を含む。そのような医薬組成物は、経口投与、鼻腔内投与、眼球投与、吸入投与、経皮投与、直腸投与、舌下投与、膣投与、又は非経口投与用に製剤されてよく、あるいはエクスビボで細胞、組織又は器官の生存率を維持するための灌流液の形態であってよい。本発明の関連する実施態様において、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。

他の態様において、本発明は、その必要のある対象において内皮細胞障壁を介する分子のトランスサイトーシスを促進する方法を提供し、該方法は前記対象への組成物の投与を含み、該組成物は先に記載した本発明の単離ペプチドに会合する前記分子を含む。関連する実施態様において、会合は、前記分子に対する結合部位との不安定な共有結合、安定的共有結合、又は非共有結合的会合である。

本発明の別の態様によると、本明細書の先に記載したような本発明の単離ペプチドは、内皮細胞障壁を通過できる。関連する実施態様において、内皮細胞障壁は、血液-脳関門、血液-眼関門、血液-精巣関門、血液-卵巣関門、血液-胎盤関門、血液-心臓関門、血液-腎臓関門、血液-神経関門、血液-脊髄関門を含む。
本発明の一態様によると、本明細書の先に記載したような単離ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が提供される。

本発明の別の実施態様において、本明細書の先に記載したような本発明の単離ポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、cDNA、イントロンによって中断されるヌクレオチド配列、又はイントロンによって中断されないヌクレオチド配列）を含む単離核酸分子が提供される。一実施態様において、本発明の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞において最適な発現を促進する好ましいコドンを使用して合成される。そのような好ましいコドンは、植物、細菌、酵母、哺乳動物、真菌、又は昆虫の種の細胞での発現用に最適であり得る。

本発明は、核酸分子を含むベクターも提供する。本発明は、核酸分子を含みかつ該核酸分子に機能的に連結した少なくとも1つの制御領域を含む発現ベクターも提供する。別の実施態様において、本発明は、発現ベクターを含む細胞を提供する。さらに別の実施態様において、核酸分子を含む遺伝子改変細胞が提供される。

別の実施態様において、本発明は、本明細書の先に記載した本発明の単離ペプチドを組換え的に産生する方法を提供し、該方法は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する宿主細胞を前記ペプチドの発現に適した条件下、培地中で培養すること、並びに前記培地から発現されたポリペプチドを回収及び／又は単離することを含む。

（3.1 専門用語）
本明細書で使用する用語「約」又は「およそ」は、数と共に使用される場合、言及されている数の1、5又は10％以内の任意の数をいう。
本発明の方法の文脈における用語「との関連で投与される」は、疾患、障害又は状態の開始前、それと同時、及び／又はその後に化合物を投与することを意味する。

用語「アミノ酸」、又は特定のアミノ酸に対する全ての言及は、天然型タンパク質新生アミノ酸、並びにアミノ酸類似体などの非天然型アミノ酸を含むことを意味する。当業者は、この定義が、他に具体的に記載することなしに、天然型タンパク質新生(L)-アミノ酸、それらの光学(D)-異性体、ペニシラミン（3-メルカプト-D-バリン）などのアミノ酸類似体を含む化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどの天然型非タンパク質新生アミノ酸、及びアミノ酸で特徴づけられるべき当業者に既知の特性を有する化学合成タンパク質を含むことを理解するであろう。本明細書で使用するアミノ酸は、以下のようなそれらの3文字頭字語又は1文字記号による省略で表現される：アラニン=Ala又はA、アルギニン=Arg又はR、アスパラギン=Asn又はN、アスパラギン酸=Asp又はD、システイン=Cys又はC、グルタミン酸=Glu又はE、グルタミン=Gln又はQ、グリシン=Gly又はG、ヒスチジン=His又はH、イソロイシン=Ile又はI、ロイシン=Leu又はL、リジン=Lys又はK、メチオニン=Met又はM、フェニルアラニン=Phe又はF、プロリン=Pro又はP、セリン=Ser又はS、スレオニン=Thr又はT、トリプトファン=Trp又はW、チロシン=Tyr又はY、及び、バリン=Val又はV。さらに、用語「アミノ酸同等物」は、天然型アミノ酸の構造とは異なるが、実質的にアミノ酸の構造を有する化合物をいい、該同等物はペプチド内に置換することができ、該ペプチドはその置換にもかかわらずペプチドの生物活性を保持するようなものである。それゆえ、例えばアミノ酸同等物は、側鎖の修飾又は置換を有するアミノ酸を含むことができ、かつ関連する有機酸、アミドなども含む。用語「アミノ酸」は、アミノ酸同等物を含むことを意図する。用語「残基」は、アミノ酸及びアミノ酸同等物の両方をいう。アミノ酸は、一般当業者に既知であるような以下の群にも分類してもよい： (1) 疎水性 アミノ酸：His、Trp、Tyr、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala；(2) 中性親水性アミノ酸：Cys、Ser、Thr；(3) 極性アミノ酸：Ser、Thr、Asn、Gln；(4) 酸性/負荷電アミノ酸：Asp、Glu；(5) 荷電アミノ酸：Asp、Glu、Arg、Lys、His；(6) 正荷電アミノ酸：Arg、Lys、His；及び (7) 塩基性アミノ酸：His、Lys、Arg。

本明細書で使用する「興奮性組織」は、興奮性細胞を含む組織を意味する。興奮性細胞は、電気的刺激に活発に応答し、かつその細胞膜を介して電位差を有する細胞である。興奮性細胞は一般的に、活動電位を起こすことができる。そのような細胞は典型的には電位依存性チャネル、リガンド開口型チャネル、及びストレッチチャネルなどのチャネルを発現し、これらは膜を介してのイオン（カリウム、ナトリウム、カルシウム、クロライドなど）の流れを可能にする。興奮性組織は、神経組織、筋組織、及び腺組織を含む。興奮性組織は、末梢神経系（耳及び網膜）及び中枢神経系（脳及び脊髄）の組織などの神経組織；心臓及び関連神経の細胞などの心血管組織；及び、インスリンの分泌に関与する細胞間ギャップジャンクションに沿うT型カルシウムチャネルがある膵臓などの腺組織；を含むが、これらに限定されない。典型的な興奮性組織の一覧は、神経、骨格筋、平滑筋、心筋、子宮、中枢神経系、脊髄、脳、網膜、嗅覚系、聴覚系などを含む器官及び組織を含む。

本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、核酸分子で形質移入された特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫又は潜在的子孫をいう。そのような細胞の子孫は、宿主細胞ゲノムへの核酸分子の成功的産生又は組み込みで起こり得る変異若しくは環境的影響に起因して、前記核酸分子で形質移入した親細胞とは同一でない可能性がある。
「単離」又は「精製」ポリペプチドは、タンパク質又はポリペプチドが生成された細胞若しくは組織源からの細胞性物質又は他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成された場合に化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。用語「実質的に細胞性物質を含まない」はポリペプチドの調製を含み、そこで該ポリペプチドは、それが単離されるか又は組換え的に産生される細胞の細胞構成要素から分離される。それゆえ、実質的に細胞性物質を含まないポリペプチドは、異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」ともいう）の（乾燥重量に対して）約30%、20%、10%、又は5%未満を有するポリペプチドの調製を含む。ポリペプチドが組換え的に産生される場合にはまた、実質的に培地を含まない、すなわち、培地がタンパク質調製物の体積の約20%、10%、又は5%未満存在することが好ましい。ポリペプチドが化学合成によって産生される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、該タンパク質の合成に関与した化学的前駆体又は他の化学物質から該ポリペプチドが分離されていることが好ましい。したがって、そのようなポリペプチドの調製物は、関心のある抗体以外の化学的前駆体又は化合物の（乾燥重量に対して）約30%、20%、10%、5%未満を有する。好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは単離又は精製されている。

「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。さらに、cDNA分子などの「単離された」核酸分子は、他の細胞性物質を、又は組換え技術で産生した場合には培地を実質的に含まないことができ、あるいは化学合成された場合には化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないことができる。具体的実施態様において、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（複数可）は単離又は精製されている。

ポリペプチドの構造に関連して本明細書で使用するように、用語「モチーフ」は、該ポリペプチド鎖のアミノ酸配列内の連続するアミノ酸のセット、及び／又は前記ポリペプチドの三次構造のアミノ酸内内の直線的に隣接するアミノ酸のセットのいずれかをいう。モチーフはタンパク質フォールディングの結果として形成された全て又は一部であり得るので、記載されるモチーフに隣接するアミノ酸は、該ポリペプチドの直鎖状アミノ酸配列内において、0個、1以上、5以上、10以上、15以上又は20以上のアミノ酸で隔てられ得る。

本明細書で使用する用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は互換的に使用され、最も広い意味において、制約された（すなわち、例えばβターン又はβプリーツシートを開始させるアミノ酸の存在、あるいは例えばジスルフィド結合したCys残基の存在による環状化のような構造のいくつかの要素を有している）アミノ酸配列、又は非制約的（例えば直線状）アミノ酸配列をいう。ある実施態様において、本発明のペプチドは30個未満のアミノ酸からなる。しかしながら、本開示を読むことで、当業者は特定のペプチド長のみならず、その組織保護受容体に結合する能力及び／又は本発明のペプチドを識別する本明細書に記載のペプチドの結合に競合することを認識するであろう。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸同等物又は他の非アミノ酸群を含む化合物もいうと同時に、ペプチドの所望の機能的活性をさらに保持する。ペプチド同等物は、関連する有機酸（PABAなど）、アミノ酸などによる1以上のアミノ酸の置換、あるいは側鎖若しくは官能基の置換又は修飾によって、通常のペプチドとは異なり得る。

用語「疾患、障害、又は状態を予防する」は、そのような疾患、障害、又は状態の開始の遅延、進行の妨害、出現の妨害、それらに対する保護、発生の阻害又は除外、あるいは罹患率の減少を意味する。用語「予防」の使用は、予防的療法を施された患者集団内の全ての患者が、予防の標的とされた疾患、障害、又は状態を発現しないことを暗示することを意味するのではなく、むしろ該患者集団が、該疾患、障害、又は状態の罹患率の減少を示すであろうことを意味する。例えば、多くのインフルエンザワクチンは、該ワクチンを投与された対象においてインフルエンザを予防するのに100％の効果を有するわけではない。当業者は容易に患者を同定することができ、かつ予防的療法が有益であり得る対象、例えばこれらに限定されないが、外傷性障害及び負傷をもたらし得る活動に従事しているような人（例えば、軍事行動に従事する兵士、レースカードライバーなど）；手術が計画されている患者；遺伝性の疾患、障害又は状態の危険性のある患者；環境因子によって引き起こされる疾患、障害又は状態の危険性のある患者；又は、高齢者、乳児、若しくは免疫系が弱っているなどの特定の疾患、障害、又は状態の危険性のある集団の一部；あるいは疾患、障害又は状態に関する遺伝的又は他の危険因子を有する患者；に関する状況を特定できる。

本明細書で使用する用語「対象」及び「患者」は互換的に使用される。本明細書で使用する用語「対象（subject）」及び「対象（subjects）」は、動物、好ましくは非霊長類を含む哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス）及び非霊長類（例えば、サル又はヒト）、並びにより好ましくはヒトをいう。
本明細書で使用する用語「組織保護活性」又は「組織保護」は、細胞、組織又は器官の損傷を阻害若しくは遅延させる効果をいう。他に記載がない場合、細胞、組織又は器官の損傷又は死における「遅延」は、本発明のペプチドの不在下でのコントロール条件に比較して評価される。組織保護活性は、様々な条件、疾患、及び細胞、器官及び／又は組織の損傷、例えば5.3節に記載のものに有用である。組織保護活性は、中枢神経系組織（これには限定されない）などの、組織保護受容体を発現している組織、細胞及び／又は器官（すなわち、それぞれ、応答性の組織、細胞及び／又は器官）に特異的である。具体的実施態様において、応答性細胞は赤血球前駆細胞ではない。

本明細書で使用する用語「組織保護受容体複合体」は、少なくとも1つのエリスロポエチン受容体サブユニット及び少なくとも1つのベータ共通受容体サブユニットを含む複合体を意味する。組織保護受容体複合体は複数のエリスロポエチン受容体サブユニット及び／又はベータ共通サブユニット、並びに他の型の受容体若しくはタンパク質を含み得る。引用によりその全てが本明細書に組み込まれるWO 2004/096148を参照されたい。

2つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、該2配列を最適な比較目的用に並べる。その後、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。第1配列のある位置が第2配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基で占有されている場合、その結果該2分子は当該位置で同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、該2つの配列に共有されている同一位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一重複位置の数／位置の総数×100％）である。一実施態様において、2つの配列は同じ長さである。代替的実施態様において、該2つの配列は異なる長さであり、従って該パーセント同一性は、より長い配列の一部に対してより短い配列の比較をいい、ここで前記一部は前記より短い配列と同じ長さである。

（5. 発明の詳細な説明）
（5.1 組織保護ペプチド）
エリスロポエチン（「EPO」）の赤血球新生活性は、当該技術においてよく特徴づけられている（例えば、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるCheethamらの論文, 1998, Nat. Struct. Biol. 5;861-866を参照されたい。）。EPOは、予め形成されているエリスロポエチン受容体（EPOR）ホモ二量体（すなわち、(EPOR)₂）の細胞外部分に、個々のEPOR上の特定の位置の間に橋渡しをする様式で結合することによって赤血球新生を開始させる。EPOが(EPOR)₂に結合する場合、球状リガンドの大部分は結合領域から離れており、かつEPO及び(EPOR)₂の複合体から離れて水性培地へと外側を向いている。本出願人は、赤血球新生とは異なる、組織保護が(EPOR)₂以外の受容体を介して仲介されることを決定し、該受容体は別の受容体であるCD131（β-共通受容体サブユニット（β_c）としても知られる）と連結されたEPOR単量体からなる。EPOR及びβ_cは相互作用して受容体ヘテロ二量体であるEPOR-β_cを形成する。他のタンパク質がこの相互作用に関与するかについては現時点で不明である。本発明はEPOの三次元構造、特にEPOR結合部位から離れて面しているEPOの部分、すなわち古典的な赤血球新生EPORである(EPOR)₂ホモ二量体とは相互作用しない部分から導出された組織保護ペプチドを開示する。任意の特定の理論に束縛されることを望まずに、本出願人は、EPO分子の該当部分が該組織保護受容体と相互作用し、それにより組織保護を仲介すると考える。

EPOの三次元構造は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるCheethamらの論文, 1998, Nat. Struct. Biol. 5；861-866に記載されているとおりに、かつ配列番号：1（全米バイオテクノロジー情報センターのタンパク質データバンク（Protein Data Bank）に保存されているデータにおけるエントリー「1BUY」としても利用可能である）に示されているように認容されている。前記受容体に結合する場合、EPORホモ二量体の膜近位部分から外側に向く（すなわち、(EPOR)₂ホモ二量体が細胞表面で発現する場合に細胞膜から離れて）EPO分子の部分は、以下の二次構造からなる：ループAB（配列番号：1のアミノ酸29〜55に対応する）、ヘリックスB（配列番号：1のアミノ酸56〜82に対応する）、ループBC（配列番号：1のアミノ酸83〜92に対応する）、及びループCD（配列番号：1のアミノ酸112〜138に対応する）。本発明の一実施態様において、組織保護ペプチドは、EPO分子のこれらの特徴的な構造に対応するアミノ酸配列からなる。

任意の理論に束縛されることを望まずに、本出願人は、EPOとの相互作用に先立って、組織保護受容体が予め形成される、すなわちEPOR及びβ_cタンパク質サブユニットが機能的に会合すると考える。EPOは、I型サイトカインスーパーファミリーのメンバーである。1型サイトカインスーパーファミリーブランチのメンバーは、4つのヘリックスが疎水的に相互作用して、外部表面が水性培地と接しかつ「外側に面している」といわれる球状タンパク質を形成することで特徴づけられている。予期していなかったが、本出願人は、EPO分子の外側に面している部分由来の2種以上のペプチドが組織保護的であることを決定した。さらに驚くべき発見は、EPO:(EPOR)₂複合体内に埋まっているEPO分子の部分由来のペプチド、及び赤血球新生結合部位1又は2の部分をも含み得るペプチドも、組織保護において高度に効果的であることである。これらの発見に関する説明をするために、出願人は、組織保護受容体の成功的活性化は、該ペプチドリガンド内の適切な空間的に小型の電荷配置に起因することを提案する。さらに、この小型の電荷配置は、2つの異なる構造モチーフ：（1）互いに隣接し、かつ疎水性アミノ酸に挟まれている2つの負荷電アミノ酸；又は（2）互いに非常に近接しており、かつ1個の疎水性アミノ酸残基又は極性アミノ酸残基で挟まれている陽性アミノ酸及び陰性アミノ酸（すなわち、塩基性アミノ酸及び酸性アミノ酸）；で具体化される。これらの電荷の近接は、ペプチドの結合によって課される直線構造を介して起こり得る。すなわち該構造はポリペプチド鎖内の連続するアミノ酸で形成される可能性があるか、又はその代わりに、近接も、該タンパク質の三次構造、すなわち三次元構造によって課されるEPO分子（又は他の関連する1型サイトカイン分子）の異なる部分の間での空間的な関連性を介して起こり得る。任意の特定の理論に束縛されることを望まずに、出願人は、一般的にこの必要条件は、組織保護ペプチドが、荷電アミノ酸の対（すなわち、2つの負に荷電したアミノ酸並びに／若しくは陽性アミノ酸及び陰性アミノ酸）の所要の空間的な位置を提供する明確な三次構造（例えば、ヘリックス又はプリーツシート）を有することを決定付けると考える。単純な例外は直線状ペプチドであり、該ペプチド中のアミノ酸対は、該ペプチド骨格によって与えられる所要の硬さで、互いに非常に近接する。したがって、構造モチーフ（1）は、アミノ酸残基の直鎖状配列、例えばH₁-N₁-N₁-H₂ (配列番号：6)、又はN₁及びN₂が1、2、3、4、5、6、又はそれより多い介在残基、例えばH₁-N₁-X-X-X-X-X-N₁-H₂ (配列番号：11)で隔てられているアミノ酸残基の直線状配列によるものを含む。

組織保護に関して、荷電アミノ酸の対は、該カルボニル炭素が約3オングストローム（Å）〜約5Å離れている、好ましくは約4Å〜約5Å離れている、及びより好ましくは約4.4Å〜約4.8Å離れているような空間配向でなければならない。これは、例えば単純な直線状ペプチド（例えば、実施例2、及びペプチドG、配列番号：40、表1を参照されたい）内の隣接する荷電アミノ酸による、又はアルファヘリックスを形成することができ、荷電アミノ酸が介在アミノ酸残基によって隔てられているペプチド（例えば、実施例2及びペプチドG、配列番号：40、表1を参照されたい）に関する多くの方法で達成し得る。ペプチドが、細胞外-細胞表面膜界面などの特異的微小環境内にある場合、三次構造（例えば、両親媒性ペプチド内のアルファヘリックス）も与えられ得ることは留意されたい（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるSegrestの論文, 1990, Proteins 8:103-117を参照されたい。）。

さらに、組織保護活性は、荷電側鎖（正及び負、又は2つとも負のいずれか）が互いに約6.5Å〜約9Åのうちに空間的に制限されているような荷電アミノ酸の対を含むペプチドを予測する。これは、必要とされる約6.5Å〜約9Åの分離を有するヘリックスの同側よりも大きい又は小さい電荷を提供する1又は2個のアミノ酸で分離されている荷電対により、アルファヘリックス内に提供できる。そのようなペプチドの非限定的な例は、ペプチドF（実施例2、配列番号：33、表1を参照されたい。）に見出される。当業者は、荷電アミノ酸の適切な三次元位置を獲得するのに一般的に必要とされるペプチドの三次構造、並びに該ペプチド内の電荷分離を模倣する小分子のデザインを発明し得る。

任意のアミノ酸のカルバミル炭素間、又は任意の2つのアミノ酸の側鎖間の空間的距離は、当業者に既知であるか又は本明細書に記載の任意の方法で推定できる。例えば、タンパク質の三次元構造が既知である場合、前記タンパク質の関心部分内の2つの側鎖の電荷分離又は2つのカルバミル炭素間の空間的距離を、公開済みの、又はそうでなければ当業界で受け入れられている、前記関心部分内のアミノ酸残基の三次元座標に基づき計算することができる。タンパク質の三次元構造、及びそれゆえ関心部分が未知である場所、又は三次元構造が未知の完全合成ペプチドが本明細書の教示に基づいて構築される場合、前記ペプチド内の2つの側鎖の電荷分離又は2つのカルバモイル炭素間の空間的距離は、当業者に既知のタンパク質モデリングソフトウエアによって予測される三次元構造を使用して概算することができる。そのようなソフトウエアの非限定的例は、Chemical Computing Group社（Quebec, Canada）によるMOE（商標）、及びAccelrys社（San Diego, California）によるModelerである。このような予測ソフトウエアと同様に、先に記載した会社からのものと同様に小分子のデザインに関して利用可能なソフトウエアも当業者に既知であり、したがって当業者は本明細書の教示に基づき、開示された構造モチーフを模倣する小分子を作成できるであろう。

非天然型ペプチド又はキメラペプチドは、アミノ酸の直鎖状配列を介して本明細書の先に記載された重要な空間的近接性を模倣するように設計できる。本発明はそれゆえ、組織保護を誘発するこれらの構造モチーフを示すものを含む新規組織保護ペプチドを対象とする。
本発明は、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン-3（IL-3）、トロンボポエチン（TPO）、繊毛様神経栄養因子（CNTF）、及び白血病抑制因子（LIF）を含むがこれらに限定されない他の1型サイトカインの組織保護フラグメントの使用にも関し、これらは先に記載したEPOの外面に存在するアミノ酸配列と構造的に相同であり、及び／又は先に記載の構造モチーフを含む。

さらに、組織保護ペプチドは、先に記載の構造モチーフに基づき、非隣接構造エレメントと専ら表面に存在するアミノ酸とを組み合わせているキメラ化合物であってよい。特に、出願人は、先に記載の配列に対する両親媒性ペプチドヘリックスの付加が該ペプチドの有効性を高めることを決定した。
さらに、本発明の組織保護ペプチドは、2以上の先に記載のペプチドの組み合わせから生じる融合ペプチド、又は天然型EPO、インスリン又はレプチンに関連する若しくは関連しない高分子を含む。

（5.1.1 フラグメント）
（A. EPO由来ペプチドフラグメント）
本発明は、一実施態様において、EPOタンパク質の三次元構造から算出されたEPOのアミノ酸配列のフラグメントからなり、特に、該リガンド結合部位から外側に向いているEPOのそれらの領域及び／又はEPOR二量体の内部部分由来である新規組織保護ペプチドに関する。これらのフラグメントは、以下のEPO構造に由来する：（1）ループAB及びヘリックスBのN末端部分（配列番号：1のアミノ酸38〜57に対応する、NITVPDTKVNFYAWKRMEVG, 配列番号：29）；（2）ヘリックスBのC末端部分（配列番号：1のアミノ酸58〜82に対応する、QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV, 配列番号：30）；及び（3）スモールシステインループ及びβ-プリーツシートからなるA-Bループ部分（配列番号：1のアミノ酸28〜47に対応する、GCAEHCSLNENITVPDTKVN, 配列番号：31）。これらのペプチドフラグメントは全て、組織保護特性を示すことを実施例2において実証する（図1及び表1を参照されたい）。

予期していなかったが、埋まっているEPO分子の他の領域、及び(EPOR)₂に対する結合部位を含む他のペプチド由来のいくつかのペプチドも組織保護的である。例えば、EPOR結合部位2部分（下線部分）を含むヘリックスAのN末端部分からなるペプチド（配列番号：1のアミノ酸1〜23に対応する、APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE, 配列番号：32）は、組織保護的である（実施例2及び表1を参照されたい）。しかしながら、配列番号：1のアミノ酸14〜19からなるペプチド（RYLLEAKEAENITTGC, 配列番号：33）及び配列番号：1のアミノ酸11〜13を欠くペプチド（すなわち、VLE；EPOのEPOR二量体である(EPOR)₂への結合に必要とされる部位2のアミノ酸）もまた組織保護的である（実施例2及び表1、並びに引用によりその全てが本明細書に組み込まれるElliottらの論文, 1997, Blood 89:493も参照されたい）ので、部位2のアミノ酸の存在は組織保護活性の原因ではない。出願人は、赤血球新生を廃止させる赤血球新生結合部位内のそのような変異は、EPOの組織保護特性を修飾しないことを以前に示している（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるLeistらの論文. Science (2004) 305:239）。
当業者は、フラグメントは好ましくは30アミノ酸長未満であるが、様々な長さのフラグメントが組織保護ペプチドを形成し得ることを認識しているであろう。さらに、例えばD-アミノ酸又はポリエチレングリコールを含む他の分子の賢明な選択も組織保護ペプチドを選び出し、強化された生物学的半減期を有するであろう。

（A. 構造モチーフ）
具体的に、以下の構造モチーフを、組織保護受容体複合体を誘発するものとして同定した：
（a）負電荷配置（「構造モチーフA」）
この構造モチーフにおいて、該ペプチドは、疎水性アミノ酸に挟まれた最大で5アミノ酸で隔てられ得る2個の負荷電アミノ酸を有する。構造的には、これを以下のように表すことができる：
(a1) HNNH；
(a2) HNXNH；
(a3) HNXXNH；
(a4) HNXXXNH；
(a5) HNXXXXNH；又は
(a6) HNXXXXXNH；
式中、Hは疎水性アミノ酸（例えば、中程度疎水性アミノ酸：グリシン、プロリン、システイン、チロシン及びトリプトファン、好ましくは高度に疎水性のアミノ酸：アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン）を表し、Nはグルタミン酸又はアスパラギン酸などの負荷電アミノ酸を表し、及びXは好ましくは親水性アミノ酸であるが任意のアミノ酸を表す。ある実施態様において、隣接する疎水性アミノ酸は同じである。他の実施態様において、隣接するアミノ酸は異なる。

この構造モチーフの変化には、隣接するアミノ酸の１つを、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミンなどの極性アミノ酸で置換したペプチドを含む。
直鎖状配列内の2つの負電荷の相互近接を確立するペプチド結合に代わるものとして、必要な電荷近接も、本明細書の先に論じた三次元構造で達成してよい（5.1節）。例えば、負荷電アミノ酸は、ヘリックスの外部表面で空間的にきわめて近接し得るが、直鎖状ペプチドでは追加的アミノ酸で隔てられる。例えばEPOのヘリックスA（配列番号：1のアミノ酸10〜28に対応する）において、E18及びE21は、三次元構造上で近接しているが、直鎖状ペプチド配列内のそれらのアミノ酸間に2個の介在アミノ酸を有する。さらなる例において、ヘリックスB（配列番号：1のアミノ酸58〜82に対応するペプチドD、配列番号：30）のE62及びE72は、該ヘリックスの表面上で2個のアミノ酸（Q65及びL69）によって隔てられているが、直鎖状ペプチド内においてそれらのアミノ酸間には9個のアミノ酸を有する。ヘリックスA又はヘリックスBから構築されるペプチドは組織保護的である（以下の実施例2及び表1を参照されたい）。対照的に、適切な距離で2個の負電荷（下線部）を有するが隣接する疎水性アミノ酸を欠くペプチドB（NITTGCAEHCSLNE, 配列番号：34）は、組織保護的でない（以下の実施例2及び表1を参照されたい）。

（b）陰性/陽性アミノ酸配置（「構造モチーフB」）
この構造モチーフにおいて、ペプチドは陰性アミノ酸に隣接する陽性アミノ酸を有し、かつ両方の荷電アミノ酸は１個の疎水性アミノ酸で挟まれている。構造的には、これは以下のように表すことができる：
(b1) HNPH；又は
(b2) HPNH；
式中、Pはアルギニン、リジン又はヒスチジンなどの正荷電アミノ酸を表し、かつNは負荷電アミノ酸であるグルタミン酸又はアスパラギン酸を表す。前記第1モチーフを有する場合、該2つの反対の電荷の相互近接は三次元構造で達成され得る。例えば、正荷電アミノ酸及び負荷電アミノ酸はヘリックスの表面上で空間的に近接し得るが、直鎖状ペプチドでは1個以上のアミノ酸で隔てられる。例えば、ヘリックスB（配列番号：1のアミノ酸58〜82に対応する）のE72及びR76は、該ヘリックスの外部表面上で互いにきわめて近接しており、かつこのヘリックスから構築されたペプチドは組織保護的である（実施例2及び表1を参照されたい）。

この特定のモチーフの変化において、陰性アミノ酸及び陽性アミノ酸は、例えば、
(b3) HNLPH；
(b4) HPLNH；
（式中、Lはセリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミンなどの極性アミノ酸を表す）
のように極性アミノ酸で隔て得る。このモチーフの例はペプチドE（GCAEHCSLNENITVPDTKVN, 配列番号：34）であり、これは組織保護的である（実施例2及び表1を参照されたい）。

上記構造モチーフのコアが4アミノ酸長である場合、このコア構造モチーフのペプチドは組織保護受容体を誘発させ得る。ある実施態様において、本発明のポリペプチドは1個の構造モチーフを含む。代替的実施態様において、本発明のポリペプチドは、1個より多い、2個より多い、3個より多い、又は4個より多い構造モチーフを含む。ある実施態様において、ポリペプチドは少なくとも2個の構造モチーフを含み、該構造モチーフは同じである。代替的実施態様において、ポリペプチドは少なくとも2個の構造モチーフを含み、該構造モチーフは異なる。好ましくは、当業者が作成し得る本発明の複数のペプチドは、30アミノ酸長未満である。

当業者は、EPOの実際のアミノ酸配列とは対照的に、本発明において重要であるのは先に記載の構造モチーフであることを認識するであろう。それゆえ、当業者は、単離ペプチドが、配列番号：1にて説明している成熟ヒトエリスロポエチン（「EPO」）のアミノ酸配列の任意の部分と90 %未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、又は20%未満の配列相同性を有し得る（前記EPOの部分は、前記ペプチドと同数のアミノ酸残基を含む。）ことを認識するであろう。

さらに、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるO'Brienらによる米国特許第5,700,909号は、出芽、分化、神経保護、及び神経細胞死の予防を含む、NS20Y細胞, SK-N-MC細胞、及びPC12細胞において生物活性を生じさせる、EPOの17個のアミノ酸配列（O'Brienの配列番号：11）を開示する。O'Brienの配列番号：11（設計されたエポペプチドAB）は、赤血球新生活性を有することを予言的に開示しているが、実際には赤血球新生活性を欠き、結果的にインビボ活性を欠いていた。エポペプチドABをマウスの筋に注射した場合、隣接する筋における運動終板出芽の頻度は、繊毛様神経栄養因子によって誘導されるのに似た様式で増加した。これらのデータは、神経細胞（血液細胞ではないが）はEPO内のペプチド配列に応答し、かつEPOは神経栄養活性及び血液栄養活性に関して別々のドメインを有し得るという概念の内であると解釈される（Campanaらの論文, Int. J. Mol. Med. (1998) 1(1):235-241；1997年12月23日に公開されたJ. S. O'Brienの米国特許第5,700,909号；1996年11月5日に公開されたJ. S. O'Brienの米国特許第5,571,787号；1998年2月3日に公開されたJ. S. O'Brienの米国特許第5,714, 459号；及び、1997年12月9日に公開されたJ. S. O'Brien及びY. Kashimotoの米国特許第5,696,080号。しかしながら、O'Brienは、ペプチドの三次元構造における荷電アミノ酸の近接に基づく本構造モチーフを認識していなかった。

（C. 1型サイトカインフラグメント）
空間的に小型の電荷配置が組織保護受容体を活性化し得る場合、出願人は、特定の1型サイトカインのフラグメントが組織保護受容体と交差反応することが予想されることを開示している。このサイトカインファミリーは、インターロイキン(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、レプチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF),白血病抑制因子(LIF)、繊毛様神経栄養因子 (CNTF)、トロンボポエチン (TPO)、成長ホルモン、マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF)、エリスロポエチン (EPO)、及びプロラクチンを含むが、これらに限定されない。

EPOの二次構造の考察は、他の1型サイトカイン受容体リガンド、例えばGM-CSF及びIL-3（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるKannanの論文, 2000, Neuroimmunornod. 8:132-141）内に位置する相同アミノ酸由来のアミノ酸の空間的配置を介する候補組織保護ペプチドの調製に関する手引きを提供し、なかでも、主に出願人が考えるように組織保護受容体を刺激することに起因して、強力な神経栄養活性及び神経保護活性を有することが示されている。例えば、これらのI型サイトカインのヘリックスB：トロンボポエチン（TPO；タンパク質データバンク(PDB)アクセッション1V7M）内の相同アミノ酸を検討することは、D62、G65、T68、L69、E72、A76及びQ80を含み、ここでこれらのアミノ酸は直鎖状配置とは別のアミノ酸と空間的に隣接し；白血病抑制因子（LIF；PDBアクセッション1EMR）内の相同アミノ酸では、E61、R64、Y68、S72、N75、及びD79を含み；繊毛様神経栄養因子（CNTF；PDBアクセッション1CNT）内の相同アミノ酸では、E71 、E75 を含む。これら全ては先に記載したモチーフAの例であり（5.1.1節）、下線を引いたアミノ酸は負に荷電している。

本明細書の先に記載（5.1.1節）の構造的モチーフBを典型例とする1型サイトカイン由来のペプチドの例は、GM-CSFヘリックスAフラグメント、WEHVNAIQEARRLL (配列番号：35)；TPOヘリックスAフラグメント、LSKLLRDSHVLH (配列番号：36)；TPOヘリックスBフラグメント：E56、K59；CNTFヘリックスAフラグメント、KIRSDLTALTESYVKH (配列番号：37)；CNTFヘリックスBフラグメント:R89、E92. LIFヘリックスBフラグメント、GTEKAKLVELYRIVVYL (配列番号：38)；及び、インターロイキン3 (IL-3)ヘリックスAフラグメント SIMIDEIIHHLKRPPNPL (配列番号：39)を含むが、これらに限定されない。
これら上記アミノ酸は1型サイトカイン受容体を介するシグナル伝達するサイトカインスーパーファミリーのいくつかのメンバーからの単なる典型であり、サイトカインスーパーファミリーの他のメンバー上の相同領域は当業者によって容易に同定されるであろう。

（5.1.2 キメラ）
「キメラ」組織保護ペプチド、すなわちEPO分子の外側に面しているアミノ酸の非直鎖状構造エレメントを内包する直鎖状アミノ酸が先に記載の構造モチーフを示すペプチドも、本発明に含まれる。本発明のキメラ組織保護ペプチドは、離れているアミノ酸配列からなる構造エレメントを単一のペプチド内へと組み合わせることで構成してよい。換言すると、キメラ組織保護ペプチドは、配列番号：1の110〜115、133〜136及び160〜165のアミノ酸由来のフラグメントなどの、非線形ではないが隣接する構造エレメント由来のアミノ酸配列を含んでよく、該配列は、ヘリックスCのC末端部分及びループC-DのN末端部分、ループC-Dにおけるβ-プリーツシート、並びに単一のペプチドに含まれるべきEPOのC末端部分の構造エレメントを許容し得る。さらに、キメラ組織保護ペプチドを、特定の構造の重要な特徴、例えば特定の三次構造の外側に面しているアミノ酸を選び出すために使用してよい。それゆえ、キメラ組織保護ペプチドは、ヘリックスBのアミノ酸58、62、65、69、72、76、79、80、83、84及び85を含むフラグメント（例えば、ペプチドG、QEQLERALNSS、配列番号：40）、又は換言すれば、EPOのヘリックスBの外側に存在するアミノ酸の全てを含むフラグメントから構成してよい。このペプチドは、以下の実施例2で組織保護的であることを示している（表1を参照されたい）。

さらに、本組織保護ペプチドの効力は、両親媒性ペプチドヘリックスを連結することで増加し得る。両親媒性ペプチドヘリックスは当業者に周知の、例えばペプチドリガンドを細胞膜に局在化させるのに機能する、クラスB G-タンパク質共役受容体を介してシグナル伝達するペプチド（例えば、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるSegrestらの論文, 1990, Proteins 8:103）に由来する。そのようなヘリックスの例は、これらに限定されない：カルシトニン (ALSILVLLQAGS, 配列番号：48)；副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (VALLPCPPCRA, 配列番号：49)；ベータエンドルフィン (NAIIKNAYKKG, 配列番号：50)；グルカゴン (GSWQRSLQDTE, 配列番号：51)；セクレチン (GGSAARPAPP, 配列番号：52)；血管作用性腸ポリペプチド (NALAENDTPYY, 配列番号：53)；神経ペプチドY (GALAEAYPSKP, 配列番号：54)；ゴナドトロピン放出ホルモン (GCSSQHWSYGL, 配列番号：55)；副甲状腺ホルモン (VMIVMLAICFL, 配列番号：56)；膵臓ポリペプチド (LRRYINMLTRP, 配列番号：28)；及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド (LALSILVLYQA, 配列番号：57)（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるGraceらの論文, 2004, PNAS 101:12836に開示されている）；に由来する高度に疎水性の領域を含む。例えば、EPOのヘリックスBの表面荷電モチーフを有するペプチド（QEQLERALNSS, 配列番号：40）から作成したキメラペプチドを、キメラペプチド用に、該カルボキシ末端で、膵臓ポリペプチドの両親媒性ヘリックス（LRRYINMLTRP, 配列番号：28）に連結させた。その組織保護特性に影響を与えずに、さらなる修飾を該両親媒性ヘリックスのカルボキシ末端に導入してよい。それゆえ、配列TR（QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR, 配列番号：41）を有する上記キメラペプチドの末端プロリンを置換したは、さらなる実施例は、坐骨神経アッセイで実証されているように、強力な組織保護活性を有する分子を産生する（図1を参照されたい）。

さらに、先に記載のヘリックスの代わりに、他の三次構造を組織保護ペプチドに連結できる。例えば、ヘリックスBの外側に存在するアミノ酸を、EPOのABループ内に見出されるベータプリーツシート（CSLNENI, 配列番号：42）に連結させて、組織保護的である配列CSLNENIQEQLERALNSS (配列番号：43)を有するキメラペプチドを形成することができる（実施例2及び表1を参照されたい）。さらに、ヘリックスCの末端部分に存在するアミノ酸（配列番号：1のアミノ酸111、112、113、116及び118に対応する、ALGKA, 配列番号：44）を、ループCD部分（配列番号：1のアミノ酸112〜133に対応する、LGAQKEAISPPDAASAAPLRTI, 配列番号：45）の全て又は一部と組み合わせてよい。好ましくは、柔軟性を提供するために連結腕が融合ペプチド間に存在し、それゆえ該連結ペプチドは組織保護受容体複合体との結合に適した構造的配向をとることができる。そのような融合ペプチドは、組織保護受容体複合体との結合を促進させること、又は生物学的半減期を長くすることを介して個々に可能であることとは対照的に、より大きな組織保護効果を両方獲得する相乗効果を有し得る。
一般当業者は、そのような化合物の組織保護効果を最大化させるために、様々な所望の構造エレメントを1つのペプチドに結集させることの利点を認識するであろう。そのようなキメラは、アミノ酸ペプチド、及びリンカー又は架橋原子若しくは部分などの非アミノ酸エレメントを含んでよい。

（5.1.3 融合ペプチド）
本発明はさらに、2以上の先に記載の組織保護ペプチド、フラグメント由来又はキメラを、エリスロポエチン、アルブミンなどの関連タンパク質若しくは非関連タンパク質に連結してよいことを意図する。

（5.1.4 組織保護ペプチドの製造）
本発明の組織保護ペプチドは、当業者に周知の組換え又は合成技術を使用して作成してよい。特に、固相タンパク質合成は比較的短い組織保護ペプチドによく適しており、より高収率で一貫した結果物を提供し得る。さらに、固相タンパク質合成は、組織保護ペプチドの製造に関してさらなる柔軟性を与え得る。例えば所望の化学修飾を、合成段階で組織保護ペプチド内に組み込んでよい：ホモシトルリンをリジンに対してペプチド合成に使用し、それにより以降の合成において該ペプチドをカルバミル化する必要性を除去し得る。

合成
ペプチドの固相合成において、α-アミノ基及び側鎖保護の両方を有するアミノ酸を樹脂上に固定化する。例えば、Nilsson, B., Soellner, M., 及びRaines, R.の論文 『タンパク質の化学合成（Chemical Synthesis of Proteins）』, Annu. Rev. Biomol. Struct. 2005. 34:91-118；Meldal M.の論文 1997. 『固相支持体の特性（Properties of solid supports.）』Methods Enzymoi. 289:83-104、並びにSongster MF, Barany G.の論文 1997. 『固相ペプチド合成の操作（Handles for solid-phase peptide synthesis.）』Methods Enzymol. 289:126-74を参照されたい。典型的には、2つの型のα-アミノ酸保護基：酸感受性tert-ブトキシカルボニル(Boc)基、又は塩基感受性9-フルオレニルメチルオキシカルボニル (Fmoc)基；を使用する。Wellings DA, Atherton B.の論文 1997. 『標準Fmocプロトコル（Standard Fmoc protocols.）』Methods Enzymol. 289:44-67。これらのα-アミノ酸保護基の迅速かつ完全な除去の後、活性型カルボキシル基を有する別の保護化アミノ酸はそれから脱保護化樹脂結合アミンと共役し得る。過剰量の活性型可溶化アミノ酸を使用することにより、該共役反応を完了させる。脱保護及び共役のサイクルを、該配列が完了するまで繰り返す。側鎖の脱保護及び切断で、該樹脂は所望のペプチドを産生する。
Guy CA, Fields GB.の論文 1997. 『Fmoc化学後の樹脂結合ペプチドのトリフルオロ酢酸切断及び脱保護（Trifluoroacetic acid cleavage and deprotection of resin-bound peptides following synthesis by Fmoc chemistry.）』Methods Enzymol. 289:67-83、並びにStewart JM.の論文 1997.『Bocに基づく固相ペプチド合成後の切断方法（Cleavage methods following Boc-based solid-phase peptide synthesis.）』Methods Enzymol. 289:29-44。固相タンパク質合成を実施するためのさらなる方法は、Bang, D.及びKent, S.の論文 2004. 『クラムビンのワンポット全合成（A One-Pot Total Synthesis of Crambin.）』Angew. Chem. Int Ed. 43:2534-2538；Bang, D., Chopra, N.,及び Kentの論文, 5. 2004. 『クラムビンの全化学合成（Total Chemical Synthesis of Crambin.）』J. Am. Chem. Soc. 126:1377-1383；Dawson, P.らの論文. 1994. 『天然型化学的連結反応によるタンパク質合成（Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.）』Science. 266:776-779；Kochendoerferらの論文. 2003. 『相同重合体で修飾された赤血球新生タンパク質の設計及び化学合成（Design and Chemical Synthesis of a Homogenous Polymer-Modified Erythropoiesis Protein.）』Science. 299: 884-887 (この段落で列挙した各々の文献は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる)。

必要であれば、固相ペプチド合成由来のより小さなペプチドを、天然型化学的連結反応などのペプチド連結反応を介して連結してよい。この過程において、第1ペプチドのN末端システイン残基のチオレートは、第2ペプチドのC末端チオエステルを攻撃し、トランスチオエステル化に作用する。迅速なS→Nアシル転移の後、アミド結合を形成する。引用によりその全てが本明細書に組み込まれるDawson, P.らの論文. 1994. 『天然型化学的連結反応によるタンパク質合成（Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.）』Science. 266:776-779を参照されたい。

さらに一般当業者は、本発明の組織保護ペプチドは、ペプトイドなどの、ペプチド模倣薬、天然型アミノ酸及び非天然型アミノ酸を含むペプチドも含み得ることを理解するであろう。ペプトイドは、N-置換グリシン、グリコホリック酸（glycoholic acid）、チオプロニン（thiopronine）、サルコシン、及びチオルファンの重合体である。これらの構造は、側鎖として反応するR基を有する(-(C=O)-CH₂-NR-)_nの一般的構造を有することを意図する。そのようなペプトイドは、その各々が引用によりその全てが本明細書に組み込まれる、Simonらの論文, 『ペプトイド：創薬への分子的アプローチ（Peptoids: A molecular approach to drug discovery）』, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:9367-9371 (1992)、及びLiらの論文, 『ペプトイドのフォトリソグラフィー合成（Photolithographic Synthesis of Peptoids）』, J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 4088-4089のプロトコルに従う固相合成を使用して合成し得る。さらに本発明は、該鋳型ペプチドに類似する特性を有するペプチド模倣体又はペプチドの模倣体、非ペプチド薬の使用を含む。（Fauchere, J.の論文 (1986) Adv. Drug Res. 15:29；Veber及びFriedingerの論文 (1985) TINS 32頁；及び、Evansらの論文. (1987) J. Med. Chem 30:1229；これらは引用により本明細書に組み込まれる）。様々な型のペプチド模倣体の合成は、例えば、『有機化学の方法(Houben-Weyl)、ペプチド及びペプチド模倣薬の合成（Method of Organic Chemistry(Houben-Weyl), Sythesis of Peptides and Peptidemimetics）』、Workbench編、E22c巻 (編集長Goodman M.) 2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York、引用によりこの全ては本明細書に組み込まれる)の例に概説されている。

組換え技術
様々な宿主-発現ベクター系を利用して、本発明の組織保護ペプチドを産生してよい。そのような宿主-発現系は、関心のある組織保護ペプチドを産生させ、その後精製し得る媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又は形質移入した場合に、インサイチュウで修飾型エリスロポエチン遺伝子産物を提示し得る細胞も表す。これらは、組織保護ペプチドコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系（しかしこれには限定されない）などの、細菌、昆虫、植物、ヒト宿主系を含む哺乳動物の宿主-発現ベクター系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）で感染させた植物細胞系、若しくはエリスロポエチン関連分子コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；又は、例えばメタロチオネインプロモーターなどの哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター、若しくは例えばアデノウイルス後期プロモーター及びワクシニアウイルス7.5kプロモーターなどの哺乳動物ウイルス由来のプロモーターを含む発現構築物を含有する、例えばHT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3などのヒト細胞系を含む哺乳動物細胞系；を含むが、これらに限定されない。

さらに、所望の特定の様式で、挿入配列の発現を調節する、又は遺伝子産物を修飾及び加工する宿主細胞株を選択してよい。タンパク質産物のそのような修飾及び加工は、該タンパク質の機能に重要であり得る。一般当業者に知られているように、異なる宿主細胞は、タンパク質並びに遺伝子産物の翻訳後加工及び修飾に関して特有の機構を有する。発現させる外来タンパク質の正しい修飾及び加工を保証するための適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。この目的を達成するために、該遺伝子産物の一次転写、糖鎖付加及びリン酸化の適切な加工に関する細胞性機構を有する真核生物宿主細胞を使用してよい。ヒト宿主細胞を含むそのような哺乳動物宿主細胞は、HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、及びWI38を含むが、これらに限定されない。

長時間、組換えペプチドの多量産生を、安定的に発現するのが好ましい。例えば、組換え組織保護サイトカイン関連分子遺伝子産物を安定的に発現する細胞株を設計してよい。ウイルス性の複製開始点を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞を適切な発現調節エレメント、例えばプロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など、並びに選択可能マーカーによって制御されるDNAで形質転換できる。外来DNAの導入後、設計された細胞を強化培地中で培養することができ、その後選択培地に移してよい。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは該選抜に対する抵抗性を与え、該細胞が該プラスミドをその染色体中に安定的に組み込み、成長してフォーカスを形成することを可能にし、これは順次クローン化され細胞株へと拡張し得る。この方法を都合に合わせて使用して、組織保護産物を発現する細胞株を設計してよい。そのようにして設計された細胞株は特に、EPO関連分子遺伝子産物の内因活性に影響する化合物のスクリーニング及び評価に有用であり得る。

さらなる修飾
組織保護ペプチドに追加的修飾をすることができる。例えば、該ペプチドを1以上の(D)-アミノ酸で合成してよい。本発明のペプチドに(L)-又は(D)-アミノ酸を含ませることの選択は、部分的には、所望のペプチド特性に依存する。例えば、1以上の(D)-アミノ酸の組み込みは、インビトロ又はインビボでのペプチドの安定性の向上を与え得る。１以上の(D)-アミノ酸の組み込みは、例えば本明細書に記載のバイオアッセイ又は他の当業者に周知の方法を使用して決定されたようなペプチドの結合活性を増加又は減少させることもできる。

(L)-アミノ酸の配列の全て又は一部を、それぞれの配列の光学異性的(D)-アミノ酸で置換することは、該ポリペプチド鎖のそれぞれの部分に光学異性的構造を与える。(L)-アミノ酸の配列の全て又は一部の配列の反転は、該ペプチドのレトロ-類似体を与える。鏡像異性的（LからD、又はDからL）置換、及び該配列の反転の組み合わせは、該ペプチドのレトロ-インバーソ（inverso）-類似体を与える。鏡像異性的ペプチド、そのレトロ-類似体、及びそのレトロ-インバーソ-類似体は明らかに親ペプチドに対する位相的関連性を維持しており、特に高度の類似性はしばしば親ペプチド及びそのレトロ-インバーソ-類似体に得られることは、当業者に知られている。この関連性及び類似性は該ペプチドの生化学的特性、特に、受容体に対する個々のペプチド及び類似体の結合の度合いが高いことを反映し得る。ペプチドのレトロ-インバーソ類似体の特性の合成は、『有機化学の方法(Houben-Weyl)、ペプチド及びペプチド模倣薬の合成（Method of Organic Chemistry(Houben-Weyl), Sythesis of Peptides and Peptidemimetics）』、Workbench編、E22c巻 (編集長Goodman M.) 2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York)、及びその中で引用されている文献の例において議論されている。該文献のすべては、引用によりそれら全てが本明細書に組み込まれる。

アミノ酸「修飾」とは、非天然型アミノ酸を生産するための天然型アミノ酸の変更をいう。非天然型アミノ酸を有する本発明のペプチドの誘導体は、化学合成によって、又は生合成中におけるポリペプチドへの非天然型アミノ酸の部位特異的組み込みによって作成することができ、これは引用によりその全てが本明細書に組み込まれる、Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultzの論文, 1989 Science, 244:182-188に記載されている。

治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣体を使用して、同等の治療効果又は予防効果を提供してよい。一般的に、ペプチド模倣薬は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生化学特性又は薬理活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、当業者に既知の方法によって、--CH₂−NH--、--CH₂S--、--CH₂−CH₂--、--CH=CH−(cis及びtrans)、--COCH₂--、--CH(OH)CH₂--、及び−CH₂SOからなる群から選択される結合によって任意に置換された1以上のペプチド結合を有し、かつ以下の文献にさらに記載されている：『アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学並びに生化学（Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins）』中のSpatola, A.F.の文、B. Weinstein編, Marcel Dekker, New York, p 267 (1983)；Spatola, A.F.の論文, Vega Data (March 1983), 1巻. 3号, 『ペプチド骨格修飾（Peptide Backbone Modifications）』(一般的総説)；Morely, J.S.の文献, Trends Pharma Sci (1980) 463-468頁 (一般的総説)；Hudson, D.らの論文, (1979) Int J Pept Prot Re 14: 177-185 (--CH₂−NH--、--CH₂−CH₂--)；Spatola, A.F.らの論文, (1986) Life Sci 38:1243-1249 (--CH₂−S)；Hann, M. M.の論文, (1982) J Chem Soc Perkin Trans I 307-3 14 (--CH=CH--、cis及びtrans)；Almquist, R. G.らの論文, (1980) J Med Chem 23: 1392 (--COCH₂--)；Jennings-White, Cらの論文, (1982) Tetrahedron Lett 23:2533 (--COCH₂--)；Szelke, Mらの論文, European Appln. EP 45665 (1982) CA:97:39405 (1982) (--CH(OH)CH₂--)；Holladay, M. W.らの論文, (1983) Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (--C(OH)CH₂--)；及び、Hruby, V.J.の論文, (1982) Life Sci 31:189-199 (--CH₂−S--)；これらの各々は引用により本明細書に組み込まれる。

別の実施態様において、特に好ましい非ペプチド結合は、--CH₂NH--である。そのようなペプチド模倣体は、ポリペプチドの実施態様をこえて明らかに有利な利点を有する可能性があり、それらには例えば：より経済的な生産、より高い化学的安定性、強化された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、効率など）、特異性の変化（例えば生物活性の広域性）、抗原性の減少などが含まれる。

ペプチド模倣体に関しては様々な設計が可能である。例えば、必要な立体構造が非ペプチドで安定化されている環状ペプチドは、Loblらの米国特許第5,192,746号、Aversaらの米国特許第5,576,423号、Shashouaの米国特許第5,051,448号、及びGaetaらの米国特許第5,559,103号に具体的に考慮されており、引用によってこれら全てを組み込むことにより、そのような化合物を作成する複数の方法を記載する。ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物の合成も当業者に既知である。引用により本明細書に組み込まれるEldredらの論文, J. Med. Chem. 37:3 882 (1994)は、該ペプチド配列を模倣する非ペプチドアンタゴニストを記載する。同様に、Kuらの論文, J. Med. Chem 38:9 (1995)（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）はさらに、一連のそのような化合物の合成を解明している。

合成後、さらなる修飾を実施してよい。例えば、2003年4月17日に20030072737-A1として公開され、化学的に修飾されたEPOを開示する米国特許出願第10/188,905号、並びに2003年7月1日に出願された米国特許出願第10/612,665号、及び2000年12月29日に出願された米国特許出願第09/753,132号（これらは引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）に従って、組織保護ペプチドをさらに化学的に修飾、すなわちカルバミル化、アセチル化、スクシニル化などで化学的に修飾してよい。

さらに、組織保護ペプチドは、組換え組織保護ペプチド、すなわちムテイン（mutein）から構成され得る。本開示の突然変異は、置換、内部欠失を含む欠失、生成融合タンパク質の増加を含む付加、又は「静かな（silent）」変化をもたらす該アミノ酸配列内及び／又は該アミノ酸配列に近接するアミノ酸残基の保存的置換、及び非保存的アミノ酸変化、並びに大きな挿入及び欠失を含んでよく、これらは（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）『応答性の細胞、組織及び器官の保護、回復並びに強化用の組換え組織保護サイトカイン及びそのコード核酸（Recombinant Tissue Protective Cytokines and Encoding Nucleic Acids Thereof for Protection, Restoration, and Enhancement of Responsive Cells）』と題されたPCT/US03/20964ですでに開示されている。

保存的又は非保存的アミノ酸置換のいずれかを、1以上のアミノ酸残基で実施できる。保存的又は非保存的アミノ酸置換の両方を実施できる。保存的置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で実施されるものである。遺伝的にコードされているアミノ酸は、4つのファミリーに分類できる：(1) 酸性アミノ酸 = アスパラギン酸、グルタミン酸；(2) 塩基性アミノ酸 = リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3) 非極性 (疎水性)アミノ酸 ＝ システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、チロシン；及び、(4) 非荷電極性アミノ酸＝アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン。非極性アミノ酸は：強い疎水性アミノ酸 = アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、並びに中程度の疎水性アミノ酸 ＝ グリシン、プロリン、システイン、チロシン、トリプトファン；に細分化できる。代替的様式において、アミノ酸のレパートリーは：(1) 酸性アミノ酸 = アスパラギン酸、グルタミン酸；(2) 塩基性アミノ酸 = リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3) 脂肪族アミノ酸 = グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン。セリン及びスレオニンは脂肪族-ヒドロキシルアミノ酸として任意に分けてグループ化される；(4) 芳香族アミノ酸 ＝ フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；(5) アミドアミノ酸 = アスパラギン、グルタミン；並びに、(6) 硫黄-含有アミノ酸 = システイン及びメチオニン；としてグループ化できる（例えば、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるBiochemistiy, 第4版、L. Stryer編, WH Freeman and Co., 1995を参照されたい）。

あるいは、突然変異を、飽和突然変異などによって組織保護ペプチドのコード配列の全て又は一部に沿って無作為に導入することができ、かつその結果である突然変異体を生物活性に関して選別し、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、該コードペプチドを組換え的に発現させ、該組換え組織保護ペプチドの活性を測定することができる。
別の実施態様において、組織保護ペプチドの半減期を延長させる、又は該ペプチドの組織保護効果を強化するために、該組織保護ペプチドを、（ポリエチレングリコールなどの）重合体、糖、又は（融合構築物などの）付加的タンパク質の付加を介してさらに修飾してよい。そのような修飾の例は、WO/04022577 A3及びWO/05025606 A1に開示されており、これらは引用により本明細書に組み込まれる。

（5.2 組織保護ペプチドを試験するためのアッセイ）
（5.2.1 生物学的選別又はアッセイ）
本発明に従う組織保護ペプチドは、組織保護活性、例えば細胞、組織又は器官を保護することに関して試験してよい。保護活性は、インビトロ及びインビボのアッセイを使用してさらに試験してよい。組織保護活性を示すインビトロ試験は、例えば細胞増殖アッセイ、細胞分化アッセイ、又は組織保護受容体複合体、例えば組織保護サイトカイン受容体複合体、活性によって上方制御されるタンパク質又は核酸の存在、例えばヌクレオリン、ニューログロビン、サイトグロビン、又はフラタキシンを検出することを含む。ニューログロビンは例えば、酸素の輸送又は短期貯蔵を促進させることに関与し得る。それゆえ、酸素輸送及び貯蔵アッセイをアッセイとして使用し、組織保護活性を調節する化合物を同定又は選別してよい。

ニューログロビンは、低酸素状態又は虚血に応答して中枢神経系の細胞及び組織で発現し、負傷からの保護を提供し得る（Sunらの論文 2001, PNAS 98:15306-15311；Schmidらの論文, 2003, J. Biol. Chem. 276:1932-1935；これらの各々は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）。サイトグロビンは保護と同様な役割を果たし得るが、様々なレベルで種々の組織で発現している（Pesceらの論文, 2002, EMBO 3:1146-1151。これは引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）。本発明の一実施態様において、組織保護ペプチドを細胞に接触させる前及びその後で、細胞において上方制御されたタンパク質のレベルを測定することができる。ある実施態様において、細胞において組織保護活性と関連する上方制御されたタンパク質の存在は、ペプチドの組織保護活性を確認するために使用することができる。

ヌクレオリンは、損傷からタンパク質を保護し得る。ヌクレオリンは細胞内で非常に多くの役割を果たし、それらには、転写過程、配列特異的RNA結合タンパク質、細胞質分裂、核新生（nucleogensis）、シグナル転換、T-細胞により誘導されるアポトーシス、染色質リモデリング、又は複製の調節が含まれる。ヌクレオリンは、細胞表面受容体、DNA/RNAヘリカーゼ、DNA依存性ATPアーゼ、タンパク質シャトル、転写因子構成要素、又は転写リプレッサーとしても機能し得る（Srivastava及びPollardの論文, 1999, FASEB J., 13:1911-1922；並びに、Ginistyらの論文, 1999, J. Cell Sci., 112:761-772；これらの各々は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）。

フラタキシンはミトコンドリア性鉄代謝に関与するタンパク質であり、インビボ及びインビトロの両方で、EPOによって強く上方制御されることが以前に示されている（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるSturmらの論文. (2005) Eur J Clin Invest 35: 711）。
上方制御されたタンパク質の発現は、細胞内のタンパク質に対応するmRNAレベルを検出することで検出してよい。mRNAを、該上方制御タンパク質をコードする核酸を特異的に結合するプローブにハイブリダイズさせることができる。ハイブリダイゼーションは、例えばノーザンブロット、サザンブロット、アレイハイブリダイゼーション、アフィニティークロマトグラフィー、又はインサイチュウハイブリダイゼーションから構成されてよい。

本発明のポリペプチドの組織保護活性も、インビボ神経保護アッセイを使用して検出し得る。例えば、初代神経培養は、新仔ラット海馬からトリプシン処理で調製し、当業者に既知の任意の方法及び／又は本明細書に記載の方法、例えばMEM-II増殖培地（Invitrogen社, 20mM D-グルコース, 2mM L-グルタミン, 10% Nu-血清(ウシ；Becton Dickinson社, Franklin Lakes, NJ）、2% B27栄養補助剤(Invitrogen社), 26.2mM NaHCO₃, 100U/ml ペニシリン, 及び1mg/ml ストレプトアビジン（例えば、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるLeistらの論文, 2004, Science 305:239-242を参照されたい）で培養してよい。播種の翌日、 1μMのシトシンアラビノ-フラノシドを添加する。13日間培養物をそれから、用量を増加させたEPO又はCEPO（3〜3000pM）と共に24時間、プレインキュベートする。14日目に培地を取り除き、該培養物を、室温で300μM NMDA含有PBSに供する。5分後、調整前培地を該培養物に戻し、その後インキュベータに24時間戻す。該細胞をパラホルムアルデヒドで固定してHoechst 33342 (Molecular Probes社, Eugene, OR)で染色し、凝集アポトーシス核を計数してよい。NGF (50ng/ml)及びMK801 (1μＭ)をポジティブコントロールとして含ませる。

動物モデル系を使用して、化合物の組織保護活性を立証する、又は先に記載の本発明のスクリーニング方法によって同定される化合物の安全性及び有効性を立証することができる。該アッセイで使用される化合物はそれから、関心のある組織型、損傷、疾患、状態又は症候群用の動物モデルを使用して生物活性を試験することができる。これらは、トランスジェニックマウスなどの機能的読み出し系と共役した組織保護受容体複合体を含むように設計された動物を含む。

同定された化合物の細胞保護活性又は組織保護活性の有効性を試験するために使用できる動物モデルは、例えば、ルイスラットにおける急性実験的アレルギー脳脊髄炎（EAE；実施例12を参照されたい）の発病に対する保護；脳外傷性障害、脳虚血（「脳卒中」；実施例5）、又は興奮性毒素によって刺激される発作（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるBrinesらの論文, 2000, PNAS, 97:10295-10672）を受けた後のマウスにおける認知機能の減退からの回復又は保護；誘導された網膜虚血（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるRosenbaumらの論文, 1997, Vis. Res. 37:3443-51）からの保護；坐骨神経に対する負傷からの保護（実施例2を参照されたい）；及び、心臓に対する虚血-再灌流傷害（インビトロ心筋細胞研究、及びインビボ虚血-再灌流傷害。例えば、Calvilloらの論文, 2003, PNAS 100:4802-4806、及びFiordalisoらの論文, 2005, PNAS 102:2046-2051を参照されたく、これらの各々は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）からの保護；を含む。このようなアッセイは、その各々が引用によりその全てが本明細書に組み込まれる、Grassoらの論文 (2004) Med Sci Monit 10: BR1-3、又はＰＣＴ公開公報第WO02/053580号にさらに詳細に記載されている。本明細書に記載のインビボでの方法はEPOの投与に対して向けられているが、EPOの代わりに投与される組織保護タンパク質は同様の生物活性を示すことも同定されている（例えば引用によりその全てが本明細書に組み込まれるLeistらの論文. (2004) Science 305: 239-242を参照されたい）ペプチドを同様の試験用に置換してよい。ペプチドの組織保護活性を測定するための他のアッセイは当業者に周知である。

（5.2.2 細胞結合アッセイ）
択一的に、細胞結合アッセイを本発明のポリペプチドの評価とすることができる。例えば、関心のある組織保護ペプチドを、検出の容易化のために蛍光又は放射線マーカーなどの生物学的マーカーに結合させ、EPOR及び／又はβ_c受容体を発現している形質移入済BaF3細胞への結合を試験することができる。96ウェルプレートにおいて、増殖培地（RPMI 1640, 10% 胎児性ウシ血清, 1mM ピルビン酸ナトリウム, 2mM L-グルタミン）で、関心のある組織保護ペプチドの8種の1:2希釈系列を播く。ここで各々のウェルにおける最終容積が約100μlになるようにする。BaF3親株、及びEPOR及び／又はβ_c受容体で形質移入したBaF3細胞を増殖培地（上記参照）で3回洗浄し、沈殿物を増殖培地に再懸濁し、細胞を計数し、増殖培地中で5,000細胞/100μlに希釈することができる。100μlの希釈済細胞をそれから各ペプチド希釈物に添加する。その後、該アッセイプレートを37℃インキュベータ内で3〜4日間インキュベートする。プレート/細胞を洗浄し、その後該プレートを蛍光プレートリーダー、又は関心のある組織保護ペプチドの生物活性に関連するバイオマーカーのレベルを検出するのに適する他の方法で読み取る。

同様に、競合アッセイを利用して、組織保護ペプチドが組織保護的であるかどうかを測定することができる。競合アッセイにおいて、組織保護的であることが知られている化合物は、米国特許第10/188,905号及び第10/185,841号（これらの各々は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）に開示されるもののような、組織保護サイトカイン（しかしこれに限定されない）を含み、適切なバイオマーカーに結合することができる。

96ウェルプレートにおいて、適切な増殖培地で、既知の組織保護化合物/バイオマーカーの8種の1:2希釈系列、並びに同じ希釈系列の該既知の組織保護化合物/バイオマーカー及び関心のある組織保護ペプチドの過剰量を播く。各希釈の最終容積は約100μlになるようにする。もう一度BaF3を上記参照のように該プレート内に播き、インキュベートする。適切な時間が経過した後、該細胞を洗浄し、該プレートを蛍光プレートリーダー、又は当業者に既知の該バイオマーカーを検出する任意の他の適切な方法で読み取る。既知の化合物/バイオマーカー及び関心のある組織保護ペプチドを含むプレート並びに／若しくはウェルの読み取り値が、該既知の組織保護化合物/バイオマーカーのみを含むプレートの読み取り値未満である場合、該関心のある組織保護ペプチドは組織保護的である。

（5.2.3 サイトカイン及び細胞増殖/分化活性）
全ての既知のサイトカインを含む、今日までに発見された多くのタンパク質因子は、1以上の因子依存性細胞増殖アッセイに活性を示しており、それゆえこれらのアッセイはサイトカイン活性の便利な確認として役立つ。組織保護ペプチドの活性は、限定ではないが、32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e及びCMKを含む細胞株に関する、多くの通例的な因子依存的細胞増殖アッセイの任意の1つで証明することができる。これらの細胞を組織保護ペプチドの存在下又は不在下で培養し、細胞増殖を、例えば、トリチウム化チミジンの取込みを測定することによって、又は3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT)の代謝分解に基づく比色分析アッセイ（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるMosman, 1983, J. Immunol. Meth. 65:55-63）によって検出する。

（5.2.4 他のアッセイ）
組織保護ペプチドが組織保護活性を示す場合、当業者は、該ペプチドが、P-19及びPC-12細胞アッセイなど（しかしこれらには限定されない）の当業者に既知の神経保護アッセイ及び組織保護アッセイの1つを使用して結果を検証することに有益であり得ることを認識するであろう。さらに、脊髄負傷、虚血的脳卒中、末梢神経損傷、心臓、眼、腎臓などに関連する動物モデルなどの様々なインビボモデルは、該組織保護ペプチドをさらに特徴づけるのに有用であり得る。適切なインビトロ及びインビボアッセイは、米国特許出願第10/188,905号及び第10/185,841号に開示されており、これらの各々は引用により本明細書に組み込まれる。

（5.3 治療的使用）
当業者は、本発明の組織保護ペプチドが、様々な疾患、障害及び状態の治療又は予防用治療薬として有用であることを認識するであろう。当業者は、そのようなペプチドを使用して組織保護受容体複合体、例えば組織保護サイトカイン複合体の調節を達成し得ることも認識するであろう。例えば先に記載の発明的アッセイによって同定される化合物の治療的指標を評価するために使用し得るインビトロ及びインビボ技術の両方は、PCT出願番号第PCT/US01/49479号、米国特許出願第10/188,905号及び第10/185,841号に開示されており、これらは引用により本明細書に組み込まれる。

本発明の上記組織保護ペプチドは、主に、神経学的又は精神医学的症状、眼疾患、心血管系疾患、心肺疾患、呼吸疾患、腎臓、泌尿器及び生殖器疾患、骨疾患、皮膚疾患、結合組織疾患、胃腸疾患、並びに内分泌及び代謝異常を有する、ヒトの中枢神経系又は末梢神経系の疾患若しくは障害の阻止、治療的処置あるいは予防的処置に関して一般的に有用であり得る。使用の例は、これらに限定されないが、脳（虚血性脳卒中、鈍的外傷、くも膜下出血）、脊髄（虚血、鈍器力傷害）、末梢神経（坐骨神経負傷、糖尿病性神経障害、毛根管症候群）、網膜（黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、緑内障）、及び心臓（心筋梗塞、慢性心不全）に対する外傷性障害並びにそれらに対する炎症から生じる負傷に対する保護及び修復を含む。特にこれらのような疾患、傷害及び状態は、例えば脳、心臓又は網膜/眼などの中枢神経系組織、末梢神経系組織、又は心組織若しくは網膜組織中の興奮性組織などの応答性組織に悪影響を及ぼす低酸素状態を含む。それゆえ、本発明の組織保護ペプチドを使用して、様々な状態及び状況での低酸素状態から生じる、応答性組織に対する損傷の治療又は予防することができる。このような状態及び状況の非限定的例を、本明細書の以下にある表で提供する。

組織保護ポリペプチドは、幹細胞活性の調節においても関心がもたれる。組織保護活性を示すサイトカイン、例えばEPOは、幹細胞を動員すること、負傷領域への遊走の刺激、及び例えば再生的役割における修復過程の補助が可能であることが確立されている。例えば、実験的脳卒中において、EPOは、虚血的負傷領域への神経芽細胞の遊走を仲介し、回復期間中にニューロンを再生させる（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるTsaiらの論文, J. Neurosci (2006) 26:1269-74）。別の例にあるように、EPO及びCEPOは、内皮前駆細胞を骨髄から循環系に動員させる。これらの細胞はそれから離れた領域に向かい、新しい血管の形成に関与する（EPOの効果に関しては、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるBahlmannらの論文, 2003, Kidney Int. 64:1648-1652を参照されたい）。任意の理論に束縛されることは望まないが、本明細書に開示の単離ポリペプチドは、幹細胞の遊走に同様の効果を有すると考えられる。

本発明の組織保護ペプチドを使用して治療可能及び予防可能な神経組織病態の保護の例において、このような病態は、神経組織の酸素供給の減少に起因するものを含む。圧迫、損傷、及び最終的には神経細胞死により生じる、神経組織への酸素の安定供給を減少させる全ての状態は、本発明の組織保護ペプチドを使用して治療することができる。低酸素及び／又は虚血として一般的に好ましくは、これらの状態は、脳卒中、血管閉塞、出生前又は出生後酸素欠乏、窒息、息詰まり、溺水、一酸化炭素中毒、煙吸入、外科治療及び放射線治療を含む外傷性障害、仮死、癲癇、低血糖症、慢性閉塞性肺疾患、気腫、成人呼吸窮迫症候群、降圧性ショック、敗血性ショック、アナフィラキシーショック、鎌状赤血球クライシス、心停止、律動不整、窒素性ナルコーシス、及び心臓-肺バイパス処置で引き起こされる神経欠損から生じる、又はこれらを含む。

一実施態様において、例えば本発明的アッセイを使用して同定された本発明の組織保護ペプチドを単独で又は組成物の一部として投与し、外科的処置又は医学的処置前、該処置の間、若しくは該処置の後における、負傷又は組織損傷の危険から生じる負傷若しくは組織損傷を防ぎ得る。例えば外科的処置は腫瘍切除又は動脈瘤修復を含んでよく、医学的処置は分娩又は出産を含んでよい。本発明の組織保護ペプチドを使用して治療可能な低血糖により引き起こされる又はそれから生じる他の病態はインスリン過剰摂取を含み、医原性高インスリン血症、インスリノーマ、成長ホルモン欠乏症、低コルチゾン症、薬物過剰摂取、及び特定の腫瘍にも関する。

興奮性神経組織から生じる他の病態は、癲癇などの発作性障害、痙攣、又は慢性発作性障害を含む。他の治療可能な状態及び疾患は、これらに限定されないが、脳卒中などの疾患、多発性硬化症、心停止、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性麻痺、脳又は脊髄の外傷性傷害、AIDS認知症、加齢性の認知機能喪失、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、発作性障害、アルコール依存症、網膜虚血、緑内障から生じる視神経損傷、及びニューロンの欠損を含む。

本発明の特定の組織保護ペプチドを使用して、物理的又は化学的に誘導された炎症などの病態又は様々な外傷性傷害から生じる炎症を治療若しくは予防してよい。組織保護ペプチドは、これらに限定されないが、脳、脊髄、結合組織、心臓、肺、腎臓及び尿道、膵臓、眼、並びに前立腺を含む、1以上の器官又は組織での炎症状態の治療及び予防も意図する。そのような外傷性傷害の非限定的例は、腱炎、血管炎、慢性気管支炎、膵炎、骨髄炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、視神経炎、側頭動脈炎、脳炎、髄膜炎、横断性脊髄炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎、肝炎、及び壊死性腸結腸炎を含む。さらに組織保護サイトカインを、これらには限定されないが、アレルギー、リウマチ性疾患、スポーツ関連傷害；ウイルス性、真菌性及び細菌性を含む感染；を含む虚血及び費虚血状態から生じる炎症を治療又は予防することに使用してよい。該炎症は急性又は慢性であってよい。炎症領域におけるさらなる適用は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる、2004年9月29日に出願され、かつWO 2005/032467として公開されたPCT/US2004/031789に記載されている。

本発明の特定の組織保護ペプチドを、脱髄、又はミエリン鞘の欠損から生じる中枢神経系疾患及び末梢神経系疾患を治療するために使用してよい。これらの疾患は、ロイコジストロフィー、及び顕著な事由に起因する疾患などのミエリン形成不全疾患を例外として、未知起源の炎症性ミエリン鞘病変が主に関与する疾患として定義されている。多発性硬化症（MS）は脱髄性疾患において典型的な疾患であり、病理的には、主に炎症性の脱ミエリン化、及びグリオーシスなどの変化によって特徴づけられる。その病因が未知であるため、該診断はその臨床的特性、すなわち空間的多重度、及び中枢神経系病変の長期にわたる多重度に基づいて行われる。さらに、急性播種性脳脊髄炎（ADEM）、炎症性広汎性硬化症、急性及び亜急性の壊死性出血性脳脊髄炎、及び横断性脊髄炎は、脱髄性疾患に含まれる。また、末梢神経組織は、ミエリン鞘を維持するシュワン細胞に依存し、これらの細胞が傷害された場合、末梢脱髄性疾患が引き起こされる。

本発明の組織保護ペプチドは、虚血-再灌流傷害；うっ血性心不全；心停止；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化症、僧帽弁漏出、心房粗動、薬物（例えば、ドキソルビシン、ハーセプチン、チオリダジン、及びシサプリド）などの化合物によって引き起こされる心毒性；寄生感染（細菌、真菌、リケッチア、及びウイルス、例えば梅毒、慢性のトリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）感染）に起因する心臓損傷；劇症性心アミロイドーシス；心臓手術；心臓移植；血管形成、腹腔鏡手術、外傷性傷害的心臓負傷（例えば、貫通又は鈍器性の心臓負傷、及び大動脈弁破裂）、胸部大動脈瘤の外科的修復；副腎動脈瘤；心筋梗塞又は心不全に起因する心原性ショック；神経原性ショック；及びアナフィラキシー；を含む、心臓及び／又は心臓関連組織（例えば、心膜、大動脈、及び他の関連血管）が関与する全ての慢性又は急性の病理的事象を含む心臓の状態及び損傷を治療又は予防するために使用してよい。本発明の組織保護ペプチドを、心不全などの心疾患（すなわち、心臓が、代謝組織に必要される速度で血液を押し出すことができない、又は心臓が、充填圧の上昇のみでそのようにできる場合）の危険性のある個人を治療することにも使用してよい。そのような危険性のある患者は、心筋梗塞、冠動脈疾患、心筋炎、化学療法、心筋症、高血圧、心臓弁膜症（ほとんどの場合、僧帽弁閉鎖不全症、及び大動脈狭窄症）、及び毒素誘導性心筋症（例えば、エタノール、コカインなど）等を有する、又はその危険性のある患者を含み得る。

本発明の組織保護ペプチドは、眼、例えば網膜組織の状態及び損傷を治療又は予防するために使用してよい。そのような障害は、網膜虚血、黄斑変性症、網膜剥離、網膜色素変性症、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧、及び糖尿病性網膜症を含むが、これらに限定されない。
別の実施態様において、本発明の組織保護ペプチド、及び本発明の原理を使用して、応答性組織に対する放射線損傷から生じる負傷を予防又は治療してよい。本発明の組織保護ペプチドのさらなる利用は、神経毒中毒（例えば、ドーモイ酸貝中毒）、毒素（エタノール、コカインなど）等の中毒、放射線照射；ニューロラチリズム（neurolathyrism）；グアム病（Guam disease）；筋萎縮性側索硬化症；及びパーキンソン病の化学療法剤の結果としての中毒の治療においてである。

先に記載したように、本発明は、先に記載したような組織保護サイトカインの末梢投与によって、哺乳動物における応答性細胞、組織及び器官の組織機能を強化するための使用のための本発明の組織保護ペプチドも対象とする。様々な疾患及び状態は、この方法を使用する治療に受け入れられる。例えば、この方法は、認知機能に増加をもたらす興奮性組織での機能強化に有用であり、全ての状態又は疾患の不在下でさえ有用である。さらに、組織保護サイトカインは、創傷治癒の質の改善、治癒に必要とされる時間の短縮、治癒組織の質の改善、及び創傷により生じる癒着の発生率を減少させるのに有用である。引用によりその全てが本明細書に組み込まれる、2004年9月29日に出願されたPCT/US2004/031789、及びWO 2005/032467として公開された文献を参照されたい。本発明のこれらの使用を以下にさらに詳細に記載し、これはヒト、及びヒト以外の哺乳動物の両方での学習及び訓練の強化を含む。

中枢神経系を対象とする本発明の組織保護ペプチドを使用して治療可能又は予防可能な状態及び疾患は、気分障害、不安障害、うつ病、自閉症、注意欠陥多動性障害、及び認知機能障害を含むが、これらに限定されない。これらの状態は、神経機能の強化から恩恵を得る。本発明の教示に従って治療可能な他の障害は、不眠、例えば睡眠時無呼吸及び旅行関連障害；くも膜下出血及び動脈瘤出血、降圧性ショック、振盪性負傷、敗血性ショック、アナフィラキシーショック、並びに様々な脳炎及び髄膜炎、例えば狼瘡などの結合組織関連脳炎の後遺症を含む。他の使用は：ドーモイ酸貝中毒などの神経毒、ニューロラチリズム、及びグアム病による中毒、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病；塞栓性又は虚血性負傷の術後処置；全脳照射；鎌状赤血球クライシス；及び子癇；の予防又はこれらからの保護を含む。

本発明の組織保護ペプチドを使用して治療可能又は予防可能な状態のさらなる群は、先天的又は後天的性質のいずれかのミトコンドリア機能障害を含み、これは神経の負傷及び死によって類型化される様々な神経系疾患の原因である。例えば、Leigh疾患（亜急性壊死性脳症）は、神経脱落及びミオパシーに起因する進行的な失明及び脳症によって特徴づけられる。これらの場合において、欠損型ミトコンドリアの代謝は、十分に高エネルギーな基質を、興奮性細胞の代謝に供給することができない。組織保護ペプチドは、様々なミトコンドリア病における欠陥機能を至適化させる。先に記載したように、低酸素状態は、興奮性組織に悪影響を及ぼす。興奮性組織は、中枢神経系組織、末梢神経組織、及び心臓組織を含むが、これらに限定されない。先に記載の条件に加えて、本発明の組織保護ペプチドは、一酸化炭素及び煙吸入などの吸入中毒、重度の喘息、成人呼吸窮迫症候群、並びに息詰まり及び溺水の治療に有用である。低酸素状態を作り出す、又は他の手段によって興奮性組織などの応答性組織を誘導するさらなる状態は低血糖症を含み、これは不適切な用量のインスリン、又はインスリン産生腫瘍（インスリノーマ）で起こり得る。

興奮性組織損傷から生じることが記載されている様々な神経心理的障害は、本発明の組織保護ペプチドを使用して治療可能である。神経損傷が関与する、及び本発明が提供されることにより治療又は予防が可能な慢性障害は、中枢神経系及び／又は末梢神経系に関する障害を含み、これらには加齢性の認知機能喪失及び老衰認知症、慢性発作性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、結節硬化症、ウイルソン病、脳性及び進行性核上麻痺、グアム病、Lewy小体認知症；海綿状脳症など、例えばクロイツフェルト-ヤコブ病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、フリードリヒ失調症、及び他の失調症、並びにジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群などのプリオン病；癲癇及び慢性発作性障害などの発作性障害、脳卒中、脳又は脊髄の外傷性傷害、AIDS認知症、アルコール依存症、自閉症、網膜虚血、緑内障、高血圧及び睡眠障害などの自律神経機能障害、並びに：統合失調症、統合失調性感情障害、注意欠陥障害、気分変調性障害、大うつ病性障害、躁病、強迫性障害、向精神性物質使用障害、不安症、パニック障害、並びに単極性及び双極性感情障害を含むがこれらに限定されない精神神経障害、を含む。さらなる神経精神障害及び神経変性障害は、例えば『米国精神医学協会による精神障害の診断及び統計的マニュアル（American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders）(DSM)』に一覧化されているものを含み、該最も最新版は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。

本発明の組織保護ペプチドを使用して治療可能又は予防可能な状態のさらなる群は、急性及び慢性の腎不全などの腎疾患を含む。腎臓への血液供給は、血流を侵害する感染由来のショック（敗血症）、内出血又は外出血、重篤な下痢又は熱傷の結果としての身体からの流体損失、輸血に対する反応、心停止又は心不整脈、外科的外傷性傷害、及び腎臓移植を含むいくつかの原因に起因して中断され得る。上記の状態から生じる腎臓への血流の減少は、急性腎不全の進行を引き起こすのに十分多い時間で、危険なまでに低いレベルに血流を減少させ得る。低圧血流は、尿細管細胞が傷害されている腎臓における壊死、又は組織死も生じる。腎不全は、（間質性及び糖尿病性）疾患、ネフローゼ症候群、感染、（CPB-誘導性）負傷、（対照誘導性、化学療法誘導性、シクロスポリン）毒素、自己免疫性炎症（例えば、狼瘡、エリスロトーシス（erythrotosis）など）からも生じる。本発明の組織保護ペプチドは、急性腎不全を改善するためのこの損傷介助の修復又は予防を補助する。
以下の表は、上記組織保護ペプチドによる治療に受け入れられる様々な状態及び疾患に関しての、さらなる典型的な非限定的な適応症を一覧化する。

先に記載したように、これらの疾患、障害又は状態は、本発明の組織保護ペプチドによって提供される利益範囲の単なる説明に過ぎない。したがって、本発明は、一般的には、機械的損傷又はヒト疾患の結果の阻止的、治療的又は予防的処置を提供する。CNS及び／又は末梢神経系の疾患、障害若しくは状態の阻止的、治療的又は予防的処置を意図する。精神医学的構成要素を有する疾患、障害若しくは状態の阻止的、治療的又は予防的処置を提供する。眼性、心血管性、心肺性、呼吸器性、腎臓性、泌尿器性、生殖器性、胃腸性、内分泌性、又は代謝性の構成要素を有するが、これらに限定されない疾患、障害若しくは状態の阻止的、治療的又は予防的処置を提供する。

一実施態様において組織保護ペプチドを含むそのような医薬組成物を全身投与し、標的の細胞、組織又は器官を保護若しくは強化することができる。そのような投与は、吸入を介して非経口的に、又は経粘膜的に、例えば経口的に、経鼻的に、直腸的に、膣内的に、舌下的に、眼球的に、粘膜下的に、又は経皮的であり得る。好ましくは、投与は、例えば静脈内又は腹腔注射を介する非経口であり、並びにこれらには限定されないが動脈内、筋肉内、皮内及び皮下投与も含む。
灌流液、器官への注射、又は他の局部投与の使用によるものなどの他の投与経路に関して、同等レベルの先に記載の組織保護ペプチドをもたらす医薬組成物が提供されるであろう。約15pM〜30nMのレベルが好ましい。

本発明の医薬組成物は治療的有効量の化合物、及び医薬として許容し得る担体を含んでよい。具体的実施態様において、用語「医薬として許容し得る」は、連邦又は州政府の規制当局に承認されている、又は動物、及びより詳細にはヒトでの使用に関して、米国薬局方若しくは他の外国薬局方に一般的に認可されていることを意味する。用語「担体」は、投与される治療剤に伴う希釈剤、アジュバント、賦形剤又は媒体をいう。そのような医薬担体は、生理食塩水溶液及び石油由来、動物由来、植物由来又は合成由来の、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などを含む油などの滅菌液であり得る。生理食塩水溶液は、該医薬組成物が静脈的に投与される場合に好ましい担体である。生理食塩水溶液並びに水性ブドウ糖溶液及びグリセロール溶液も、特に注射可能溶液用の液体担体として使用可能である。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。該組成物は、所望であれば、定量の湿潤剤又は乳化剤、若しくはpH緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、粉末剤、徐放性製剤などの形態をとり得る。該組成物は、従来型の結合剤及びトリグリセリドなどの担体とともに、坐薬として製剤できる。本発明の組成物は、中性形態又は塩形態として製剤できる。医薬として許容し得る塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの遊離アミノ基を有し形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの遊離カルボキシル基を有し形成される塩を含む。適切な医薬担体の例は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるE.W. Martinによる文献『レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）』に記載されている。そのような組成物は、患者への投与に適した形態で提供するための適当量の担体と共に治療的有効量の化合物を含み、好ましくは精製形態である。該製剤は、投与方法に適切であるべきである。

長時間作用性組織保護ペプチドなどの経粘膜吸収を増加させるための製剤も本発明によって意図されている。経口投与用に適合化された医薬組成物は、カプセル又は錠剤として；粉末剤又は顆粒として；溶液、シロップ又は懸濁液（水性又は非水性の液体で）として；可食性発泡体又はホイップとして；若しくは乳剤として；提供してよい。錠剤又は硬質ゼラチンカプセルは、ラクトース、デンプン又はそれらの誘導体、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸、又はそれらの塩を含んでよい。軟質ゼラチンカプセルは、植物油、ワックス、脂肪、半固体、又は液体ポリオールなどを含んでよい。溶液及びシロップは、水、ポリオール及び糖を含んでよい。

経口投与用に意図される活性剤は、消化管での活性剤の崩壊及び／又は吸収を遅延させる材料で被覆してよく、又は該材料と混合してよい（例えば、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンを使用してよい）。それゆえ、活性剤の徐放を長時間にわたって達成してよく、必要であれば、該活性剤を胃での分解から保護できる。経口投与用医薬組成物を、特定のｐＨ又は酵素条件に起因して特定の胃腸部位で活性剤の放出を促進させるために製剤してよい。

経皮投与用に適合させた医薬組成物を、より長い時間、受容者の表皮に密接に接触させ続けることを意図する個別的なパッチとして提供してよい。局所投与用に適合させた医薬組成物を、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末剤、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又はオイルとして提供してよい。皮膚、口腔、眼、又は他の外部組織への局所投与に関しては、外用軟膏又はクリームが好ましく使用される。軟膏で製剤した場合、活性成分を、パラフィン混和性軟膏基材又は水混和性軟膏基材のいずれかを使用してよい。あるいは、活性成分を、水中油型基材又は油中水型基材を含むクリームで製剤してよい。眼への局所投与用に適合させた医薬組成物は、点眼剤を含む。これらの組成物において、活性化合物を適切な担体、例えば水性溶媒に溶解又は懸濁することができる。口腔での局所投与用に適合させた医薬組成物は、ロゼンジ（lozenge）、芳香錠（pastille）、及び口腔洗浄薬を含む。

鼻及び肺の投与用に適合させた医薬組成物は、粉末剤（好ましくは、20〜500ミクロンの範囲の粒子サイズを有する）などの固形担体を含み得る。粉末剤は、嗅ぐ様式、すなわち鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻を介して休息に吸入することによって投与できる。あるいは、鼻投与用に適合化させた組成物は、液体担体、例えば鼻内噴霧又は点鼻剤を含み得る。あるいは、肺への直接的な化合物の吸入は、マウスピースを介する中咽頭への深い吸入又は導入で達成してよい。これらの組成物は、活性成分の水性溶液又は油溶液を含み得る。吸入による投与用の組成物は、活性成分の既定投与量を提供するために構築可能な加圧エアロゾル、噴霧器又は吸入器を含むがこれらに限定されない装置に特に適合化されて供給してよい。好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物は、直接的に鼻腔へ投与されるか、又は鼻腔又は中咽頭を介して肺に投与される。
直腸投与用に適合化された医薬組成物を、坐薬又は浣腸として提供してよい。膣投与用に適合化させた医薬組成物を、膣坐薬製剤、タンポン製剤、クリーム製剤、ゲル製剤、ペースト製剤、泡製剤又はスプレー製剤として提供してよい。

非経口投与用に適合化させた医薬組成物は、水性及び非水性の滅菌注射注射液又は懸濁液を含み、これらには意図される受容者の血液に実質的に等張な組成物を与える酸化防止剤、緩衝液、静菌剤及び溶質を含み得る。そのような組織物中に存在し得る他の構成要素は、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油などを含む。非経口投与用に適合化させた組成物は、単位用量又は複数用量容器、例えば密封アンプル及びバイアル中に存在してよく、並びに使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用の滅菌生理食塩水溶液の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存してよい。即席注射液及び懸濁液を、滅菌粉末剤、顆粒及び錠剤から調製してよい。一実施態様において、組織保護ペプチドの注射液を含む自己注射器を、救急車、緊急治療室、及び戦場の状況による緊急的使用のため、及び特に芝刈り機の軽率的な使用などによる外傷性傷害的切断が起こり得る、ドメスティックセッティング（domestic setting）での自己投与用にさえも提供してよい。切断された脚又は足指の細胞及び組織が再接着した後に生存する可能性は、現地での医療関係者の到着前、又は緊急治療室に牽引された切断された足指を有する被災者の到着前でさえ、実施できる限り、切断部分の複数箇所に組織保護ペプチドを投与することで増加する可能性がある。

好ましい実施態様において、組成物を、人間への静脈内投与に適合された医薬組成物として、常法に従って投与する。典型的には、静脈内投与用組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、該組成物は、可溶化剤、及び注射部位の痛みを和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含んでよい。一般的には、該成分を、別々に；又は例えば乾燥凍結乾燥粉末として、又は多量の活性剤を含むアンプル又は小袋（sachet）などの密閉密封容器内の水不含濃縮物としての単位剤形中の共混合物；のいずれかで供給する。組成物を注入で投与すべき場合、該組成物を滅菌済医薬品グレード水又は生理食塩水を含む注入ボトルに分注できる。組成物を注射で投与する場合、該成分を投与前に混合し得るように、滅菌生理食塩水のアンプルを提供できる。

坐薬は一般的に、重量の0.5%〜10%の範囲で活性成分を含み；経口製剤は好ましくは10%〜95%の活性成分を含む。
灌流組成物を、移植器官浴槽での使用のために、インサイチュウの灌流用に、又は器官の回収前における器官提供者の脈管構造への投与用に提供してよい。そのような医薬組成物は、個人への急速投与、長期投与、局所投与又は全身投与には適さない組織保護ペプチドのレベル、又は組織保護ペプチドの形態を含んでよいが、一般循環系に処理済み器官又は組織を曝露若しくは戻す前の、該医薬組成物中に含まれる組織保護ペプチドのレベルを除去又は減少させるのに先立ち、死体、器官浴槽、器官灌流、又はインサイチュウ灌流において本明細書で意図される機能を果たす。

本発明は、本発明の医薬組成物の1以上の成分を充填した1以上の容器を含む医薬包装又はキットも提供する。そのような容器と任意に関連するのは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用若しくは販売を規制する政府機関により指示された形式で通知でき、この通知はヒト投与用の製造、使用又は販売の機関による承認を反映する。
別の実施態様において、例えば組織保護ペプチドを放出制御系で送達することができる。例えば、ペプチドは、静脈内注入、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、又は他の投与様式を使用して投与してよい。一実施態様においては、ポンプを使用してよい（Langerの論文, 上記参照；Seftonの論文, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwaldらの論文, 1980, Surgery 88:507；Saudekらの論文, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574；を参照されたく、これらの各々は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）。別の実施態様において、化合物は、小胞、特にリポソームで送達できる（Langerの論文, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatらの文献, 『感染性疾患及びガンの療法におけるリポソーム（Liposornes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer）』中, Lopez-Berestein及びFidler (編), Liss, New York, 353-365頁 (1989)；WO 91/04014；米国特許第4,704,355号；Lopez-Berestein, 同書, 317-327頁；一般的には同書を参照されたい）。別の実施態様において、高分子材料を使用できる（『放出制御型の医薬適用（Medical Applications of Controlled Release）』, Langer及びWise (編), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974；『制御型薬剤の生体利用効率、製剤設計及びパフォーマンス（Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）』, Smolen及びBall (編), Wiley: New York (1984)；Ranger及びPeppasの論文, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953；を参照されたく；また、Levyらの論文, 1985, Science 228:190；Duringらの論文, 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howardらの論文, 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照されたい。これらの各々は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）。

さらに別の実施態様において、放出制御系は、治療標的、すなわち標的細胞、組織又は器官の近くにさせることができ、それゆえ、全身用量のほんの一部のみを必要とする（例えば、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるGoodsonの文献, 115-138頁 『放出制御型の医薬適用』中, 2巻, 上記参照, 1984を参照されたい）。他の放出制御系は、Langerの論文（1990, Science 249:1527-1533。これは引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）の総説において議論されている。

別の実施態様において、適切に製剤された組織保護ペプチドを、鼻投与、経口投与、直腸投与、膣投与、眼球投与、経皮投与、非経口投与又は舌下投与で投与できる。
具体的実施態様において、本発明の組織保護ペプチドは、治療の必要がある領域に局部的に投与することが望ましい可能性がある；これは、これらの方法に限定するわけではないが、例えば手術の間の局部注入、例えば手術後の創傷包帯と併用しての局所適用、注射、カテーテルの手段、坐薬の手段、又は移植の手段で達成することができ、前記移植物は浸透性、非浸透性又はゼラチン性材料であり、シラスティック膜などの膜、又は繊維を含む。そのような実施態様の非限定的例は、本発明の組織保護ペプチドで被覆した冠動脈ステントであり得る。

好ましい有効量の選択は、一般当業者に既知のいくつかの因子を考慮することに基づき当業者によって容易に決定されるであろう。そのような因子は、組織保護ペプチドの特定の形態、及びその薬物動態学的変数、例えば生体利用効率、代謝、半減期などを含み、これらは医薬化合物に関する規制認可を得て実施される典型的な一般的開発手順の間に確立されるであろう。用量を考慮する上でのさらなる因子は、治療すべき状態又は疾患、あるいは健常人において達成されるべき利点、患者の体重、投与経路、投与が短期又は長期のいずれであるか、併用薬物、及び投与される医薬品の効果に影響を与えることが周知の他の因子を含む。それゆえ、正確な投与量は、施術者の判断に従って、及び各々の患者の状況、例えば各患者の状態及び免疫状態次第で、並びに標準的臨床技術に従って決定すべきである。

本発明の別の態様において、本発明に従う医薬組成物は、組織保護ペプチドを、組織保護機能を示す少なくとも1つの小分子を含む製剤中に含み得る。適切な小分子は、これらに限定されないが、ステロイド（例えば、ラザロイド（lazaroid）及びグルココルチコイド）、酸化防止剤（例えば、補酵素Q₁₀、アルファリポ酸、及びNADH）、抗分解酵素（例えば、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、合成触媒スカベンジャー、並びに模倣剤）、インドール誘導体（例えば、インドールアミン、カルバゾール、及びカルボリン）、硝酸中和剤、アデノシン/アデノシンアゴニスト、植物化学物質（フラバノイド）、ハーブ抽出物（イチョウ及びターメリック）、ビタミン（ビタミンA、E及びC）、オキシダーゼ電子受容体阻害剤（例えば、キサンチンオキシダーゼ電子阻害剤）、ミネラル（例えば、銅、亜鉛及びマグネシウム）、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、ナプロキセン、及びイブプロフェン）、及びこれらの組み合わせを含む。追加的作用物質は、これらに限定されないが、抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド、プレドニゾン及びヒドロコルチゾン）、グルココルチコイド、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、及びCOX-2阻害剤）、ベータ−アゴニスト、抗コリン作動性作用物質、及びメチルキサンチン）、免疫調節剤（例えば、小有機分子、T細胞受容体モジュレーター、サイトカイン受容体モジュレーター、T細胞枯渇剤、サイトカインアンタゴニスト、モノカインアンタゴニスト、リンパ球阻害剤、又は抗ガン剤）、金注射、スルファサラジン、ペニシラミン、抗血管新生作用物質（例えば、アンジオスタチン）、TNF-αアンタゴニスト（例えば、抗TNF-α抗体）、及びエンドスタチン）、ダプソン、ソラレン（例えば、メトキサレン及びトリオキサレン）、抗マラリア作用物質（例えば、ヒドロキシクロロキン）、抗ウイルス剤、及び抗生物質（例えば、エリスロマイシン及びペニシリン）を含み、これらは本医薬組成物と併せて使用してよい。

本発明の別の態様において、灌流又は灌流液を、移植用器官の灌流及び貯蔵用に提供し、該灌流液は応答性細胞及び関連する細胞、組織又は器官を保護するのに有効な組織保護ペプチド量を含む。移植は：器官（細胞、組織又は他の身体部分）が1人の提供者から回収され、かつ別の受容者に移植されることであって、該両者が同種である、同種異系移植；器官が摘出され得る手術台での外科的手順を含む、当該器官が身体のある部分から摘出されて別の部分に移され、一方エクスビボでは、切除、修復、又は腫瘍摘出などの他の操作をした後、元の場所に戻す、自己移植；又は組織又は器官若しくは種間で移植される異種移植；を含むが、これらに限定されない。一実施態様において、灌流液は、ウイスコンシン大学（UW）溶液であり(引用によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許第4,798,824号) 、これには、約1〜約25U/ml（10ng＝1U）の組織保護ペプチド、5% ヒドロキシエチルデンプン（約200,000〜約300,000の分子量を有し、かつエチレングリコール、エチレンクロロヒドリン、塩化ナトリウム 及びアセトンを実質的に含まない）；25mM KH₂PO₄；3mM グルタチオン；5mM アデノシン；10mM グルコース；10mM HEPES緩衝液；5mM グルコン酸マグネシウム；1.5mM CaCl₂；105mM グルコン酸ナトリウム；200,000単位 ペニシリン；40単位 インスリン；16 mg デキサメタゾン；12 mg フェノールレッド；が含まれ、かつ7.4〜7.5のｐＨ、及び約320 mOsm/lの重量モル浸透圧濃度を有する。該溶液を使用して、移植前に死体の腎臓及び膵臓を維持する。該溶液を使用することで、保存が、死体の腎臓保蔵で推奨されている30時間限界をこえて延長できる。この特定の灌流液は、有効量の組織保護ペプチドの含有による本発明の使用に適合し得る、多くのそのような溶液の単なる実例にすぎない。さらなる実施態様において、灌流液は、約1〜約500 ng/mlの組織保護ペプチド、又は約40〜約320ng/mlの組織保護ペプチド先に記載したように、組織保護ペプチドの全ての形態が本発明の態様に使用できる。

本明細書を通じての目的に関しての組織保護ペプチドの好ましい受容者はヒトであるが、本明細書の方法は、他の哺乳動物、特に飼育用動物、家畜、ペット、及び動物園動物にも等しく適用する。しかしながら、本発明はそれほど限定されておらず、その利便性は全ての哺乳動物に適用できる。
エクスビボでの発明のさらなる態様において、先に記載したがそれに限定されるものではない任意の組織保護ペプチドを使用してよい。

本発明の別の態様において、内皮細胞障壁による脈管構造から単離されない細胞、組織又は器官の生存率を高める方法及び組成物は、該細胞、組織又は器官を直接的に、組織保護ペプチドを含む医薬組成物に曝すことによって、又は組織保護ペプチドを含む医薬組成物を、該組織又は器官の脈管構造に投与若しくは接触させることによって提供される。治療した組織又は器官の応答性細胞の強化された機能は、好ましい効果に関与する。

エリスロポエチンに基づく他の組織保護化合物と同様に、本発明の組織保護ペプチドを、内皮細胞のタイトジャンクションを有する器官（例えば、脳、網膜及び精巣を含む）の毛細管の管腔表面から内皮細胞の基底膜表面に輸送し得ることが可能である。それゆえ、障壁を介する応答性細胞は組織保護ペプチドの有益な効果の感受性標的であり得、その中での全て又は一部の応答性細胞を含みかつ依存する他の細胞型又は組織若しくは器官は、本発明の方法の標的であり得る。任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、トランスサイトーシス後の組織保護ペプチドは、応答性細胞、例えば神経細胞、眼細胞（例えば、網膜細胞）、脂肪細胞、結合細胞、髪細胞、歯細胞、粘膜細胞、膵臓細胞、内分泌細胞、耳細胞、上皮細胞、皮膚細胞、筋細胞、心臓細胞、肺細胞、肝細胞、腎細胞、小腸細胞、副腎細胞（例えば、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞）、毛管細胞、内皮細胞、精巣細胞、卵巣細胞、又は子宮内膜細胞上の組織保護受容体と相互作用してよく、かつ受容体結合はシグナル転換カスケードを開始し、応答性細胞又は組織内の遺伝子発現プログラムの活性化をもたらし、これは毒素、化学療法、放射線療法、低酸素症などによる損傷からの細胞又は組織若しくは器官の保護をもたらし得る。別の実施態様において、組織保護ペプチドは、カルバミル化エリスロポエチンなどの障壁を通ることができる化合物に架橋結合させ、引用により本明細書に組み込まれるPCT出願番号 PCT/US01/49479、米国特許出願第10/188,905号及び第10/185,841号の教示に従って該障壁を通り移送することができる。それゆえ、応答性細胞を含む組織を、負傷又は低酸素ストレスから保護する方法、及びそのような組織の機能を強化する方法は、本明細書の以下に詳細に記載している。

本発明の一実施態様の実施において、哺乳動物患者は、放射線治療を含むガン治療用の全身化学療法を受けており、これは一般的に、神経、肺、心臓、卵巣、又は睾丸の損傷などの有害作用を有する。先に記載の組織保護ペプチドを含む医薬組成物の投与は、化学療法及び／又は放射線療法の前並びにその間に実施し、化学療法剤による損傷から様々な組織及び器官、例えば精巣を保護する。化学療法剤の循環レベルが、哺乳動物の身体に潜在的に危険なレベルより下になるまで治療を続けてよい。

本発明の別の実施態様の実施において、様々な器官を、多くの受容者への移植のために、自動車事故の犠牲者から回収することが計画され、そのうちのいくつかはより長い距離及び時間輸送する必要があった。器官の回収に先立ち、提供者に、本明細書に記載の組織保護ペプチドを含む医薬組成物を注入する。発送用の回収器官を、本明細書に記載の組織保護ペプチドを含む灌流液で灌流し、組織保護ペプチドを含む槽に保存する。本発明に従う組織保護ペプチドを含む灌流液を使用する拍動性灌流装置で、特定の器官を継続的に灌流する。輸送及び移植並びにインサイチュウでの器官再灌流の間、器官機能の最小限の劣化が起こる。

本発明の別の実施態様において、危険な活動の関与者は、応答性細胞、組織又は器官に対する負傷から生じる損傷の阻止（すなわち、阻害又は停止の開始を遅延させる）、保護、又は緩和のいずれかに十分な組織保護ペプチドを含む医薬組成物用量を摂り得る。特に、この治療方法は、これらに限定されないが、プロスポーツ選手（ダイバー、レースカードライバー、フットボール選手など）、軍人（兵士、落下傘降下兵）、救急隊員（警察官、消防員、EMS、及び災害救助員）、スタントマン、及び建設作業員などの、負傷に感受性の様々な専門的職業に用途を有してよい。さらに、組織保護ペプチドの予防的使用は、負傷の危険性のあるロッククライミング、懸垂下降、スカイダイビング、レーシング、サイクリング、フットボール、ラグビー、野球、及びダイビングを含む、そのような娯楽的活動を意図する。

本発明の別の実施態様において、心臓弁を修復する外科的処置は、一時的な心筋保護及び動脈閉塞を必要とする。手術に先立ち、患者に組織保護ペプチドを注入する。このような処置は、特に再灌流後の低酸素虚血性細胞損傷を防ぐ。さらに、本発明の医薬組成物を予防的に使用して、外科的処置に関連する外傷性傷害を限定することに努める手術、又は外科的処置からの個々人の回復の補助用にそれぞれ調製してよい。組織保護ペプチドを含む医薬組成物を使用する本方法の治療は外科的処置に関する予防的使用を提供するが、バイパス処置（冠動脈バイパス）、血管形成処置、切断及び移植、並びに脳などの応答性細胞、組織又は器官上で直接的に実施される事象、及び脊髄手術、並びに心臓切開処置を含むがこれらに限定されない、一時的虚血事象を誘導する処置に特に有用であり得る。そのような処置は、心肺（心臓 肺）バイパスの使用に関与し得る。

本発明の別の実施態様における、心肺バイパス手術などの任意の外科的処置において、本発明の組織保護ペプチドを使用できる。一実施態様において、先に記載の組織保護ペプチドを含む医薬組成物の投与を、バイパス処置の前、その間、及び／又はその後に実施し、脳、心臓及び他の器官の機能を保護する。
本発明の組織保護ペプチドが、エクスビボ用途、又は神経組織、網膜組織、心臓、肺、肝臓、腎臓、小腸、副腎皮質、副腎髄質、毛細管内皮、精巣、卵巣、又は子宮内膜の細胞若しくは組織などの応答性細胞を治療するためのインビボ用途に使用される上述の例において、本発明は、脈管構造の遠位の応答性細胞、組織又は器官の保護若しくは強化に適合化した投与量単位形態での医薬組成物を提供し、これは約0.01pg〜7.5mg、0.5pg〜6.5mg、1pg〜5mg、500pg〜5mg、1mg〜5mg、500ng〜5mg、1μg〜5mg、500μg〜5mg、又は1mg〜5mgの範囲の量の組織保護ペプチド、及び医薬として許容し得る担体を含む。好ましい実施態様において、組織保護ペプチドの量は、0.5pg〜1mgの範囲内である。好ましい実施態様において、製剤は、非エリスロポエチン性の組織保護ペプチドを含む。

さらなる本発明の態様において、組織保護ペプチドの投与を使用して、脳に外傷性傷害を受けた哺乳動物の認知機能を回復させてよい。5日又は30日の遅延の後、組織保護ペプチドの投与は、プラセボ処理した哺乳動物に比較して機能を回復させることができるはずであり、これは、脳の活性を再生又は回復させる該組織保護ペプチドの能力を示す。それゆえ、本発明は、負傷のかなり後の治療（例えば、3日、5日、一週間、一ヶ月、又はそれより長い期間）を含み、脳の外傷性傷害、及び他の認知機能障害の治療用医薬組成物の調製のための組織保護ペプチドの使用も対象とする。本発明は、有効量の組織保護ペプチドを投与することによる負傷後の認知機能障害の治療のための方法も対象とする。本明細書に記載の任意の組織保護ペプチドを、本発明のこの態様に使用してよい。

さらに、本発明のこの回復性の態様は、細胞、組織又は器官の機能障害の回復用の医薬組成物の調製に関する、本明細書の任意の組織保護ペプチドの使用を対象とし、治療は該機能障害に関与する最初の傷害後、及びそのかなり後に始める。さらに、本発明の組織保護ペプチドを使用する治療は、慢性期に加え、急性期の間の疾患又は状態の方向に及び得る。
本発明の組織保護ペプチドは、1投与あたり、約1ng〜約100μg/kg体重、好ましくは約5〜50μg/kg体重、最も好ましくは約10〜30μg/kg体重の投与量で全身投与してよい。この有効量は、投与後の血清で約80、120、又は160ng/mlよりも高い組織保護ペプチドの血清レベルを達成するのに十分であるはずである。このような血清レベルは、投与後、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10時間で達成してよい。このような投与量は、必要であれば繰り返してよく、例えば投与を臨床的に必要なだけ毎日繰り返してよい。又は適切な間隔、例えば1〜12週毎、好ましくは1〜3週毎の後に繰り返してよい。一実施態様において、有効量の組織保護ペプチド、及び医薬として許容し得る担体を、単一用量バイアル又は他の容器にまとめてよい。別の実施態様において、本明細書に記載の活性を発揮できるがヘモグロビン濃度又はヘマトクリットの増加をもたらさない組織保護ペプチドを使用する。そのような組織保護ペプチドは、本発明の方法が慢性的に提供されることが意図される場合に好ましい。

（5.4 トランスサイトーシス）
担体分子及び組織保護ペプチド
本発明はさらに、先に記載したように、担体ペプチド、エリスロポエチンなどの内皮細胞障壁を通ることのできるペプチドと共に組織保護ペプチドを含む組成物を投与することによって、哺乳動物における内皮細胞障壁を通る組織保護ペプチドの輸送を促進させるための方法を対象とする。体内の特定の器官の内皮細胞間のタイトジャンクションは、特定の分子の進入に対する障壁を生成する。障壁が設けられた器官内での様々な状態の治療に関して、組織保護ペプチドの通過を促進する手段が望まれ得る。

担体分子としての組織保護ペプチド
本発明の組織保護ペプチドは、血液脳関門、及び該ペプチドが通過できる他の同様の障壁を通って他の分子を送達するための担体として有用であり得る。組織保護ペプチドを用いて障壁を通ることを望む分子を含む組成物を調製し、該組成物の末梢投与は、該障壁を通る該組成物のトランスサイトーシスを生じる。障壁を通り移送されるべき分子と組織保護ペプチドとの間の会合は、不安定な共有結合であってよく、この場合に該分子は、該障壁を通った後に組織保護ペプチドとの会合から放出される。該分子の所望の薬理活性が、組織保護ペプチドとの会合によって維持される又は影響を受けない場合、そのような複合体を投与することができる。

当業者は、分子を、本発明の組織保護ペプチド並びに先に記載の他の作用物質と、共有結合的、非共有結合的、及び他の手段で会合させるための様々な手段を認識しているであろう。さらに、該組成物の有効性の評価は、実験系で容易に測定できる。組織保護ペプチドと分子との会合は、不安定な共有結合、架橋などを含むいくつもの手段で達成し得る。ビオチン/アビジン相互作用を使用してよい；例えば、本発明のビオチン化組織保護ペプチドを、アビジンと所望の移送分子との不安定な抱合体で複合体化してよい。先に記載したように、ハイブリッド分子を、組換え又は合成手段、例えば所望の薬理活性を有する分子のドメイン、及びペプチド組織保護受容体活性調節に関与するドメインの両方を含む融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドで調製してよい。プロテアーゼ切断部位を該分子に含ませてもよい。

分子は、多官能性分子、すなわち多官能性架橋剤を介して、本発明の組織保護ペプチドに連結してよい。本明細書で使用する用語「多官能性分子」は、2個以上の反応基を有する分子に加え、ホルムアルデヒドなどの、2回以上逐次的に反応し得る1つの反応基を有する分子を含む。本明細書で使用する用語「反応基」とは、分子（例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、特に内皮細胞障壁を介して送達されるべきホルモン、抗生物質、又は抗ガン剤）上の官能基と反応する架橋剤上の官能基をいい、これは架橋剤と該分子との間に共有結合を形成するためのものである。用語「官能基」は、有機化学におけるその標準的意味を保有する。使用することができる多官能性分子は、好ましくは生体適合性リンカーである、すなわち、該分子はインビボで、非発ガン性、非毒性かつ実質的に非免疫原性である。当業者に既知の及び本明細書に記載のものなどの多官能性架橋剤を動物モデルで簡単に試験し、その生体適合性を測定することができる。多官能性分子は、好ましくは二官能性である。本明細書で使用する用語「二官能性分子」とは、2個の反応基を有する分子をいう。二官能性分子は、ヘテロ二官能性又はホモ二官能性であってよい。ヘテロ二官能性架橋剤は、一方向的連結を可能にする。pH6〜8で緩衝化された水溶液などの水溶液中で起こる架橋反応に関しては、水中で十分に可溶性である多官能性分子が特に好ましく、その結果生じる連結物に関しては、より効果的な生体分布に関して水溶性を保有することが特に好ましい。典型的には、多官能性分子は、アミノ又はスルフヒドリル官能基と共有結合する。しかしながら、カルボン酸又はヒドロキシル基などの他の官能基と反応性の多官能性分子は、本発明に意図されている。

ホモ二機能性分子は、少なくとも2個の反応性官能基を有し、これらは同じ官能基である。ホモ二機能性分子上の反応性官能基は、例えばアルデヒド基及び活性エステル基を含む。アルデヒド基を有するホモ二官能性分子は、例えばグルタルアルデヒド及びスバルアルデヒド（subaraldehyde）を含む。架橋剤としてのグルタルアルデヒドの使用は、Poznanskyらの論文, Science 223, 1304-1306 (1984)に開示されていた。少なくとも2個の活性エステルユニットを有するホモ二官能性分子は、ジカルボン酸とN-ヒドロキシスクシンイミドとのエステルを含む。そのようなN-スクシンイミジルエステルのいくつかの例は、ジスクシンイミジルスベリン酸、及びジチオ-ビス-(スクシンイミジルプロピオン酸)、並びにそれらの可溶性ビス-スルホン酸、及びそれらのナトリウム塩及びカリウム塩などのビス-スルホン酸塩を含む。これらのホモ二官能性試薬は、Pierce社, Rockford, Illinoisから入手できる。

ヘテロ二官能性分子は、少なくとも2個の異なる反応基を有する。該反応基は、例えばペプチド及び分子上に存在する異なる反応基と反応する。ヘテロ二機能性架橋剤上の反応基と反応するこれらの2個の異なる反応基は通常：アミノ基、例えばリジンのエプシロンアミノ基；スルフヒドリル基、例えばシステインのチオール基；カルボン酸、例えばアスパラギン酸上のカルボン酸；又は、ヒドロキシル基、例えばセリン上のヒドロキシル基；である。

もちろん、本発明の様々な組織保護ペプチドのいくつかは、ある架橋剤との使用に利用できる適切な反応基をもたないかもしれない；しかしながら、当業者は、本発明の組織保護ペプチド中の架橋に利用可能な基に基づく架橋剤の選択を十分に認識しているであろおう。
ヘテロ二官能性分子の反応基がアミノ基と共有結合を形成する場合、該共有結合は通常、アミド結合又はイミド結合であろう。アミノ基と共有結合を形成する反応基は、例えば、活性型カルボン酸基、ハロカルボニル基、又はエステル基であり得る。好ましいハロカルボニル基は、クロロカルボニル基である。エステル基は、好ましくは例えばヒドロキシ-スクシンイミドエステル基などの反応性エステル基である。

他の官能基は、典型的には、チオール基、チオール基へと変換可能な基、又はチオール基と共有結合を形成する基のいずれかである。共有結合は通常、チオエーテル結合又はジスルフィドである。チオール基と共有結合を形成する反応基は、例えばチオール基又は活性型ジスルフィドと反応する二重結合であってよい。チオール基と反応し得る二重結合を含む反応基はマレイミド基であるが、アクリロニトリルなどの他の基も可能である。反応性ジスルフィド基は例えば、2-ピリジルジチオ基又は5,5'-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)基であってよい。反応性ジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性試薬のいくつかの例は、N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジル-ジチオ)プロピオン酸 (Carlsson,らの論文, 1978, Biochem J., 173:723-737)、S-4-スクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム、及び4-スクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチル-(2-ピリジルジチオ)トルエンを含む。N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸が好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応基を含むヘテロ二官能性試薬のいくつかの例は、スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、及びスクシンイミジル m-マレイミドベンゾアートを含む。

他のヘテロ二官能性分子は、スクシンイミジル 3-(マレイミド)プロピオナート、スルホスクシンイミジル 4-(p-マレイミド-フェニル)ブチラート、スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル-シクロヘキサン)-1-カルボキシラート、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルを含む。スクシンイミジル m-マレイミド安息香酸のスルホン酸ナトリウム塩が好ましい。上記のヘテロ二官能性試薬及びそれらのスルホン酸塩の多くは、Pierce Chemical社, Rockford, Illinois USAから入手できる。

可逆的又は不安定とすべきであるという上記連結に関する必要性は、当業者により容易に決定されてよい。連結は、所望の薬理活性に関してインビトロで試験してよい。該連結が両方の特性（結合した分子の特性、及び組織保護ペプチドの特性）を保持する場合には、その後にその適合性をインビボで試験してよい。該連結分子が、活性に関して組織保護ペプチドからの分離を必要とする場合、長時間作用性エリスロポエチン又は長時間作用性組織保護サイトカインとの不安定な結合若しくは可逆的会合が好ましい。不安定な特性も、インビボ試験前に標準的インビトロ手法を使用して試験してよい。

これら、並びに他の多官能性試薬の製造方法及び使用方法に関するさらなる情報は、下記出版物又は当業者が利用可能な他の出版物から得られ得る：
Carisson, J.らの論文, 1978, Biochem. J. 173:723-737；
Cumber, J.A.らの論文, 1985, Methods in Enzymoligy 112:207-224；
Jue, R.らの論文, 1978, Biochem 17:5399-5405；
Sun, T.T.らの論文, 1974, Biochem. 13:2334-2340；
Blattler, W.A.らの論文, 1985, Biochem. 24:15 17-152；
Liu, F.T.らの論文, 1979, Biochem. 18:690-697；
Youle, R.J.及びNeville, D.M. Jr.の論文, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77:5483-5486；
Lerner, R.A.らの論文, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3403-3407；
Jung, S.M.及びMoroi, Mの論文., 1983, Biochem. Biophys. Acta 761:162；
Caulfield, M.P.らの論文, 1984, Biochem. 81:7772-7776；
Staros, J.V.の論文, 1982, Biochem. 21:3950-3955；
Yoshitake, S.らの論文, 1979, Eur. J. Biochem. 101:395-399；
Yoshitake, S.らの論文, 1982, J. Biochem. 92:1413-1424；
Pilch, P.F.及びCzech, M.P.の論文, 1979, J. Biol. Chem. 254:3375-3381；
Novick, D.らの論文, 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487；
Lomant, A.J.及びFairbanks, G.の論文, 1976, J. Mol. Biol. 104:243-261；
Hamada, H.及びTsuruo, T.の論文, 1987, Anal. Biochem. 160:483-488；又は
Hashida, S.らの論文, 1984, J. Applied Biochern. 6:56-63。これらの各々は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。

さらに、架橋方法は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるMeans及びFeeneyの論文, 1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12に概説されている。
先に記載した本発明の方法及び組成物が通過する障壁は、血液脳関門、血液-眼関門、血液-精巣関門、血液-卵巣関門、血液-神経関門、血液-脊髄関門、及び血液-胎盤関門を含むが、これらに限定されない。
内皮細胞障壁を通る輸送の候補分子は、例えば通常では脳及び他の障壁が設けられている器官から除外されるような、成長ホルモンなどのホルモン、神経栄養因子、抗生物質、抗ウイルス剤、又は抗真菌剤、ペプチド放射線医薬品、アンチセンス薬、抗体、抗ウイルス剤、生物学的に活性な作用物質、医薬品、及び抗ガン剤を含む。そのような分子の非限定的な例は、成長ホルモンなどのホルモン、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、繊毛様神経栄養因子 (CNTF)、塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)、トランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1）、トランスフォーミング増殖因子β2（TGFβ2）、トランスフォーミング増殖因子β3（TGFβ3）、インターロイキン1、インターロイキン2、インターロイキン3及びインターロイキン6、AZT、腫瘍壊死因子に対する抗体、並びにシクロスポリンなどの免疫抑制剤を含む。さらに、診断用に、脳及び他の障壁が設けられている器官内の細胞、組織又は器官を可視化するために、色素又はマーカーを本発明の組織保護ペプチドに連結してよい。例として、患者におけるアルツハイマー病の進行を測定するために、脳内でプラークを可視化するために使用するマーカーを組織保護ペプチドに連結することができる。

本発明は、内皮細胞のタイトジャンクション障壁を通るトランスサイトーシスを介して輸送されるべき分子を含む組成物、及び先に記載したような組織保護ペプチドも対象とする。本発明はさらに、先に記載したような障壁を通る分子の送達に関する医薬組成物の調製のための、先に記載したような分子と組織保護ペプチドサイトカインとの間の連結の使用を対象とする。
神経保護及びトランスサイトーシスの様々な動物モデル及びインビトロ試験は、PCT/US01/49479（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）にて提供されており、本発明の組織保護ペプチドの有効性を証明している。トランスサイトーシスに関しては、本発明の長時間作用性エリスロポエチンに連結されたモデルタンパク質を、非経口投与後の脳への輸送について評価する。インビトロモデル及び動物モデルにおけるこれらの試験は、ヒトを含む他の哺乳動物種での本化合物の有効性を予測する。

本発明は、本発明の典型として提供される以下の非限定的な実施例を参照することにより、より理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより完全に説明するために提供される。しかしながらこれらは、本発明の広範な範囲を限定するものとして解釈されるべきでは決してない。

（6. 実施例）
（実施例1）：ペプチド合成法
A. ペプチドA（EPOのアミノ酸配列38〜57に対応する、配列番号：32）及びペプチドB（EPOのアミノ酸配列58〜82に対応する、配列番号：34）の合成
EPOのフラグメントである、ペプチドA（配列番号：32）及びペプチドB（配列番号：34）（表1を参照されたい）を、Band, D. , Chopra, N及びKent, S.の論文『クラムビンの全合成（Total Synthesis of Crambin）』J.AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 1377-1383（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）に記載されるように、「インサイチュウ中和」Boc化学段階的固相ペプチド合成を使用して合成した。手短に述べると、EPOのアミノ酸配列38〜57（ペプチドC：NITVPDTKVNFYAWKRMEVG、配列番号：29）及びEPOのアミノ酸配列58〜82（ペプチド D：QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV、配列番号：30）に対応する2本のフラグメントを、-OCH₂-Pam-樹脂（遊離^αカルボキシルペプチド）又はHSCH₂CH₂CO-Leu-OCH₂-Pam-樹脂（^αチオエステルペプチド）上で合成した。合成の間、各種アミノ酸の側鎖を以下のように保護した：Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(4-CH₃Bzl)又はCys(ACM)、Glu(OcHex)、Lys(2-Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Tyr(Br-Z)。ペプチド鎖を集めた後、該ペプチドを脱保護化すると同時にp-クレゾール含有無水HF（p-クレゾール：無水HF＝10：90、v/v）を用い、0℃で1時間処理することにより、樹脂支持体から切断した。減圧下でのHFの蒸発後、粗生成物を冷却ジエチルエーテルで沈殿させて粉砕し、該ペプチドを0.1％TFA含有50％水性アセトニトリルに溶かし、分取HPLCシステムで精製した。LC-MSを使用して、ペプチド組成物を確認した。

（実施例2）：ペプチド介在性組織保護の検証
坐骨神経アッセイを使用し、全ての組織保護活性に関して、組織保護ペプチドを試験した。スプレイグ・ダウリーラット（250〜300グラム）（1群につき6匹、コントロールを含む）を、イソフルラン（Baxter NPC 10019-773-60）及びテーブルトップラボラトリー麻酔システム（Table Top Laboratory Anesthesia System）（フローメータを55psiにて2〜3リットル／分に設定）を使用して少なくとも3分間麻酔した。その後、ラットの中心温度が手術中35〜37℃に維持されるのを確実にするために、該ラットを恒温ブランケット上に置いた。中心温度を直腸プローブでモニターした。四頭筋切開を介して、麻酔したラットの右の坐骨神経を大腿中部で露出させ；15ブレードのメスを用いて、皮膚に平行にかつ四頭筋上に2cmの切込を作り、1対の解剖ハサミを使用して四頭筋を切り、坐骨神経を露出させた。その後、坐骨神経を周囲の膜から開放した。2-0編蚕糸（Ethicon, 685-G）を該神経の下に通し、該縫合末端を該神経に対して垂直に維持したガイドを介して通した。その後、該縫合末端を非弾性の紐で結び、該非弾性の紐をプーリシステム（pulley system）（スタビライザーを有し、MTD1/4"B を支えるNYLプーリ (PO番号 04174-01)）の周りでひだを作り、該非弾性の紐に連結させた100グラムの重りをゆっくりと開放した。絹縫合を切断して重りを開放する前の1分間、該重りを吊ったままにした。

その後1/2ccのインスリン用注射筒を使用して、、289pmol/kg用量のカルバミル化エリスロポエチン、289pmol/kg用量のA〜Jシリーズ（表1を参照されたい）由来のペプチドの1つ、又はPBSを尾静脈内に注入した。先の教示には与えられていない、色素上皮由来成長因子（PEDF）に由来する20merのフラグメント（アミノ酸102〜121に対応する）をコントロールとして使用した。
その後、筋及び外科切開を閉じ、該ラットに乳酸加リンガー液を皮下注射した。回復の間、恒温ブランケットを使用して、ラットの中心温度を35〜37℃に維持した。

次の4日間にわたり、デジタルスキャナーのスキャン表面上に30cmの直径を有するアクリルチューブ内に該ラットを置き、斜めにした該ラットの後つま先を測定した。順応させるために5分間待った後、5本全ての足指をはっきりと移すラットの後足のスキャンをとった。各々のラットの3つの許容可能なスキャンをとった。該スキャンから、トースプレッド（第1足指の母指球と第5足指の母指球との間の距離）及び中間トースプレッド（第2足指の母指球と第4足指の母指球との間の距離）を測定した。その後、静的坐骨神経指数をS. Erbayraktarらの論文, 2003, Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6741-6746（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）に従って計算し、統計的解析を実施した。

B (配列番号：34)、H (配列番号：47)、及びPEDF誘導体を除く全てのペプチドは同等に保護的であり、約-0.57の静的坐骨神経指数（「SSI」）に対して、PBS/PEDFフラグメントに関しては約-67〜約-68のSSIを与えた（図2）。また、図2は、陽性ポリペプチドの効果が、カルバミル化エリスロポエチンの効果よりも改善されるとはいかないにしても、少なくとも同等であることも示す。

また、表1は、試験したペプチドのカルボニル炭素間のおおよその距離を示す。距離は、引用により本明細書に組み込まれるCheethamらの論文, 1998, Nat. Struct. Biol. 5:861-866により提供される三次元座標を使用して計算した。各々の組織保護活性が陽性であると試験されたペプチドは、約3Å〜約5Åの間のカルボニル炭素−カルボニル炭素距離／距離間隔を有していた。

（実施例3）組織保護ペプチドはエリスロポエチン性ではない
A. インビトロ評価：
UT-7epo、すなわちヒトエリスロポエチン依存性白血病細胞株を、ペプチドの赤血球新生潜在能力の測定に使用した。UT-7epo細胞（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen (DSMZ), カタログ番号ACC 363）を、10％FBS及び5ng/mlエリスロポエチンを含む完全RPMI-1640培地で培養した。エリスロポエチンに曝した細胞の増殖的生存（＝生存率増加）反応は、古典的赤血球型エリスロポエチン受容体により仲介され、該古典的エリスロポエチン受容体を刺激するエリスロポエチン変異型の能力の定量的尺度である。

UT-7epo細胞を、10％ドナー仔ウシ血清、4mM L-グルタミンを含有し、かつ5ng/mlの組換えヒトエリスロポエチンを補足した新鮮な完全RPMI 1640培地に移した。フラスコにつき20mlの培地を含む75cm²フラスコにて、5％ CO₂を有する37℃の加湿インキュベータ内で48時間、該細胞を維持した。アッセイ2日目、すなわち48時間目に、細胞をフラスコから50mlのコニカルチューブに移し、1,000rpmで5分間、室温にて遠心した。上清を捨て、細胞を10mlの飢餓培地（3％ドナー仔ウシ血清、4mM L-グルタミン）で2回洗浄した。その後、細胞を飢餓培地に再懸濁し、ピペットでの上下動を使用して単個細胞浮遊液を得た。4×10⁵細胞/mlの密度を得るために再懸濁した細胞を飢餓培地で希釈して、25cm²フラスコにつき10mlの合計培養容積で播種した。4時間のインキュベーションの後、細胞を再び50mlコニカルチューブに移した。コントロール細胞はその間中、5ng/mlのルー（rhu）-エリスロポエチンで維持した。

飢餓培地で細胞を200,000細胞/mlに希釈して96ウェルプレートに100μl/ウェルで播種し、様々な濃度のエリスロポエチン、カルバミル化エリスロポエチン、及びペプチドD（配列番号：30）に曝した。3％の血清を含有するRPMI 1640培地で10倍に希釈した系列を使用して、0.2pMから20nMのテスト化合物濃度を作成した。さらなる48時間のインキュベーションの後、15mlのWST-1細胞増殖試薬 (Roche社)の溶液を各ウェルに添加し、37℃で1時間 、CO₂の内でインキュベートした。1分間の混合の後、該プレートをプレートリーダーで読んだ（450nmで吸収を650nmでのバックグラウンド吸収から差し引いた）。
ペプチドDは、10,000pMと同等用量で、赤血球新生活性を示さなかった（図3）。好ましくは、該ペプチドは、1μg/mlより低い容量、及びより好ましくは10μg/mlより低い容量に関して赤血球新生活性を有しない。

B. インビボ評価：
組織保護ペプチドF（配列番号：33）又はペプチドG（先に議論した、ヘリックスBに存在する残基で構築されたペプチド、配列番号：40）の赤血球新生活性を評価するために、該ペプチドを、オスのスプレイグ・ダウリーラットに1週につき3回、0.8μg/kgで皮下投与した。投与スケジュールは、予め最大の赤血球新生を誘発することが測定されたEPOの同等用量（モル基準）に一致した。自動化分析器（Keska社）を使用して、ヘモグロビン濃度を一定時間ごとに測定した。

調査の経過全体において、ペプチドB又はペプチドCはいずれもヘマトクリットの増加を示さなかった（図4；比較のために、EPOの等モル投与量への反応を示している）。3週間後のEPOに関して記載されるヘモグロビンの減少は、赤血球無形成にをもたらす抗EPO中和抗体の産生に起因する。対照的に、ペプチドG又はペプチドFのいずれにおいても、中和抗体反応は見られなかった。

（実施例4）：ペプチドは組織保護アッセイで組織保護的である
任意の数のインビトロアッセイを使用して、ペプチドを組織保護に関して容易に評価できる。例えば、興奮毒性からの保護は、マウスの運動ニューロンのカイナイト（kainite）誘導死を使用して測定できる。脊髄は、すでに記載したように、15日齢のスプレイグ・ダウリーラットの胚から得られる（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるSirenらの論文, 2001, PNAS 98:4044）。前角をトリプシン化し、4％ BSAクッションを介して10分間、300×gで遠心した。細胞（混合ニューロン-グリア培養を表す）を、ポリ-DLオルニチン及びラミニンで予め被覆した24mmウェルプレート内に、2,000細胞／cm²の密度で播種した。運動ニューロンを免疫パニング（immunopanning）でさらに精製し、該細胞をポリ-DLオルニチン及びラミニンで予め被覆した24mmウェルプレート上に、完全培地（神経基底（Neurobasal）/B27 (2%)；0.5mM L-グルタミン；2% ウマ血清；25mM 2 メルカプトエタノール；25mM グルタミン酸；1% ペニシリン及びストレプトマイシン；1ng/ml BDNF）に含有させて、低密度（20,000細胞／cm²）で播種した。該培地（グルタミン酸不含）を再度添加し、4日及び6日培養した。

6日目に培養物をカイニン酸（混合ニューロン-グリア培養に関しては5mM；精製培養に関しては50mM）と共に48時間インキュベーションすることにより、細胞死を誘導した。ペプチドD（5ng/ml）又は媒体を、細胞死誘導の72時間前に培養物へ添加し、48時間処理し続けた。その後、培地を捨て、細胞を、4％(vol/vol)パラホルムアルデヒド含有40mMPBSで固定し、0.2% Triton X-100で透過処理し、10% (vol/vol) FCS含有PBSでブロッキングし、非リン酸化神経フィラメントに対する抗体（SMI-32；1:9,000）で一晩インキュベートし、及びジアミノベンジジンを用いるアビジン-ビオチン法を使用することにより可視化した。運動ニューロンの生存率は、カバーガラスの4つのスライドを介してSMI-32陽性細胞を数えることによって形態学的に評価し、アポトーシス体に関する染色はH33258で行った。
ペプチドD（配列番号：1のアミノ酸58〜82に対応する、配列番号：30）は、カイニン酸によって引き起こされる傷害から運動ニューロンを完全に保護した（図5）。

あるいは、ペプチドによって与えられる組織保護は、ニューロン様であってかつ血清を使用中止するとアポトーシスで死ぬ、マウスP19細胞を用いるアッセイを使用して測定できる。ペプチドD（配列番号：30）の組織保護を、すでに公開されているP19クローンP19S1801A1を使用するEPOの組織保護（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるSirenらの論文, 2001, PNAS 98:4044）と比較した。細胞を、2mM Lグルタミン；100単位/ml ペニシリンG；100mg/ml硫酸ストレプトマイシン(GIBCO社)；10% (vol/vol) FBS (HyClone社)を補足し、1.2 g/リットルのNaHCO₃及び10mM Hepes緩衝液を含有するDMEM（以下「完全培地」という）中で未分化に維持した。血清不含培地は、血清を削除し、かつ5 mg/mlのインスリン；100mg/mlのトランスフェリン；20nM プロゲステロン；100mM プトレッシン；30nM Na₂SeO₃ (Sigma社製)を添加した以外は、上記と同じ成分を含んだ。実験に関しては、50％集密細胞を、EPO又は媒体で一晩前処理し、トリプシンで剥がし、血清不含培地で洗浄し、血清不含培地又はEPOを添加した血清不含培地で終密度104細胞／cm²で、25cm²の組織培養フラスコ内に入れた。細胞生存率を、トリパンブルー排斥及びヘマトサイトメータで測定した。
p19細胞のアポトーシスを防ぐことにおいて、ペプチドC（配列番号：29、配列番号：1のアミノ酸38〜57に対応する）は、重量ベースで、EPOよりも少なくとも10倍強力であった（図6）。

（実施例5）：中大脳動脈閉塞モデル
オスCrl：体重250〜280gのCD(SD)BRラットを、Charles River社, Calco, Italyから入手した。Brinesらの論文, 2000, PNAS USA 97:10526-10531（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）の教示に従い、手術を実施した。手短にいうと、ラットを、クロラール水和物（400mg/kg-bw、腹腔内投与）で麻酔し、頚動脈を可視化し、該右の頚動脈を2つの縫合及び切断で塞いだ。右眼窩に隣接しかつ吻側の頭蓋穿孔は、鼻腔動脈の末端に焼灼された中大脳動脈（「MCA」）を可視化させた。この固定化されたMCA病変を囲むペナンブラ（周辺部）を作成するために、細密ピンセットでの牽引後、再び開くことによって、対側頚動脈を1時間閉塞させた。

スプレイグ・ダウリーラット（1群あたり8匹）を、先に記載のMCAOプロトコルに供した。閉塞の開放と同時に、該ラットに、PBS、カルバミル化エリスロポエチン（44ug/kg）、又はペプチドD（アミノ酸58〜82；4.4ug/kg）を投与した。さらに、分離群に対する閉塞後、ペプチドD（アミノ酸58〜82；4.4ug/kg）を、2時間間隔での4回投与にて投与した。負傷の評価に関しては、ラットを行動試験に供したか、又は先に記載のプロトコルに従い、病変の体積を、手術後24時間で実施する脳切片のテトラゾリウム染色により染色した。
図7Aは、MCAOプロトコルにより生じる病変の体積を示すグラフを表す。単回投与又は複数回投与のいずれかでのペプチドD（配列番号：30）を用いた処理は、MCAO手術から生じる病変体積を約２／３にまで減少させた：これはカルバミル化エリスロポエチンの組織保護効果に統計的に等価であった。

（b）組織保護サイトカインの治療濃度域
先に概要を示したMCAOプロトコルを、本実施例で繰り返した。閉塞手順に続く、頚動脈における再循環確立（すなわち、虚血開始後１時間）後すぐに、PBS、カルバミル化エリスロポエチン（44ug/kg、静脈内投与）又はペプチドD（配列番号：30）（4.4ug/kg）を該ラットに投与した。さらに、該閉塞後、ペプチドD（配列番号：30）を、2時間間隔での4回投与にて（各々4.4ug/kg-bw）投与した（1群あたり8匹のラット）。

（c）行動試験
分離群のラットも、フット・フォールト行動プロトコルで試験した。該ラットは、Markgrafらの論文, 1992, Brain Research 575:238-246（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）のプロトコルに従い、30mmの網目サイズを有する30cm×30cmの高架ステンレス網床で試験した。該網上に乗せたとき、ラットは動き回ろうと試み、しばしば足を網の上よりも網の開口部におく（フット・フォールト）。フット・フォールトの数を1分間測定した。

再灌流後にペプチドD（配列番号：30）で処理したラットは、PBSで処理したラットよりもフット・フォールトで苦しむことが少なかった（図7B）。ペプチドD（配列番号：30）の複数回投与後において、顕著な追加的利点は観察されなかった。フット・フォールトの平均数はペプチドの複数回投与を受けた群よりも少なかったが、観察されたこの差は、単回投与を受けた群とそれほど変わらなかった。

（実施例6）：糖尿病性神経障害
先に記載したように（引用によりその全てが本明細書に組み込まれるBianchiらの論文, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A 101, 823-828）、絶食ラットに60 mg/kg ipの単回投与にて投与されるストレプトゾシンを使用して、オスのスプレイグ・ダウリーラット（Charles River社, Calco, IT）に糖尿病を誘導した。血清グルコースレベルが、1デシリットルあたり300mg（mg％）よりも高いくなっていることにより、糖尿病を確認した（正常レベルは100mg％よりも低い）。その後、糖尿病動物を、ペプチドD（配列番号：30、4μg/kg）又は媒体で、1週間に5回腹腔内に処理した。糖尿病状態の誘導後2週間目に、尾側神経を使用して神経伝導速度を測定した。

図8Aに示すように、糖尿病動物は、尾側神経伝導速度において、約22m/s（正常）から約19m/sへの減少を示した。ペプチドD（配列番号：30）の投与は、約23m/sへの伝導速度の増加に関連していた。
さらに、「ホットプレート」試験で、足を引っ込めてかく時間を測定することにより、熱侵害受容体閾値を定量した。引っ込め潜時を、後足をホットプレート上に置いている時間と、後足を引っ込めてなめる時間との間の時間として定義した。各動物を、30分の休憩間隔で区切り2回試験した。後足の熱閾値はは、糖尿病の4週間後に測定した。ペプチドD（配列番号：30）は、糖尿病動物でのホットプレート上で過ごす潜時を短くした（図8B）。

（実施例7）：シスプラチン誘導性傷害からの坐骨神経及び腎臓の保護
引用によりその全てが本明細書に組み込まれるBianchiらの論文, 2006, Clin Cancer Res 12: 2607-2612に記載されるように、2mg/kgのシスプラチン（CDDT）を、オスのスプレイグ・ダウリーラットに週2回で5週間、腹腔内投与した。該動物を、各群6匹ずつに分けた。5週間のCDDT投与の間、動物に、0.4μg/kg-bwのペプチドG（配列番号：40）又はPBSも1週間に3回腹腔内投与した。コントロール群には、CDDTの代わりにPBSを投与した。ホットプレート潜時は、先の実施例6に記載したように決定した。

CDDT、及びPBSのみを受けた動物は、コントロールに比較して潜時の延長を示した：すなわち、CDDTは、障害性の熱感受性に関連していた。対照的に、前記ペプチドを受けた動物は、正常なホットプレート潜時を示した（図9A）。
ペプチドでの処理はまた、CDDT誘導性多尿症も抑制した（図9B）。具体的には、PBSを受けた動物は、1日の尿産生の約30mL/日から約47mL/日への顕著な増加を示した。対照的に、組織保護ペプチドを受けた動物は、CDDTの代わりにPBSを受けたコントロール動物とそれほど変わらなかった。

（実施例8）：糖尿病誘導性網膜血管漏出からの保護
高血糖誘導性網膜血管漏出における組織保護ペプチドの有益な効果は、糖尿病性網膜症のモデルラットを使用して測定できる。このモデルにおいて、Xuらの論文, 2001, Invest. Ophthal. Vis. Sci 42: 789-794（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）に記載されるように、エバンスブルーを使用して、血管から組織への漏出を測定する。エバンスブルーはアルブミンに強固に結合し、それゆえ非制御的糖尿病により引き起こされるものなどの血管壁の漏出が起こらない限り、血流内に保持されている。

このモデルにおいて、絶食しているオスのスプレイグ・ダウリーラットは、ストレプトゾトシンの単回投与（60mg/kg、腹腔内投与）を受ける。二日後に、糖尿病の進行の検証後（300mg％よりも大きな絶食血清グルコース）、動物を6匹ずつの群に分け、ストレプトゾトシンを受けていないコントロール群も同様にした。2つの糖尿病群に、4μg/kgのペプチドD（配列番号：30）を1週間に5日腹腔内投与するか、又は同スケジュールでPBSを投与した。非制御的糖尿病の3週間後、動物を麻酔してエバンスブルー色素（30mg/kg）を静脈投与し、2時間循環させた。その後、心臓穿刺を使用し、溶出液が透明になるまでPBSで動物を灌流し、それから4% パラホルムアルデヒドで灌流した。その後、眼を摘出し、網膜を注意深く眼球から解剖した。80℃で18時間ホルムアミド中で網膜をインキュベートすることにより、エバンスブルーの網膜含有量を測定した。その後、上清を取り出して解析用に確保し、網膜を完全に乾燥させて秤量した。該上清中のエバンスブルー濃度を分光光度計で測定し、ホルムアミド中に溶解しているエバンスブルーの標準曲線を確立した。
図10に示すように、ペプチドD（配列番号：30）の投与を受けた動物は、コントロールに比較し、網膜内のエバンスブルー色素に増加はなかった。対照的に、PBSのみを受けた糖尿病動物は、網膜のエバンスブルー含量に増加を示し、これは血管漏出が起きたことを示した。

（実施例9）：急性腎不全からの保護
組織保護ペプチドは、虚血の設定での腎臓に対する防ぐことにも効果的である。成オスウイスターラットを麻酔して腹部切開し、両方の腎動脈を可視化させる。外傷性傷害的血管鉗子を使用して両方の動脈を60分間圧迫し、腎臓の血流を完全に停止させた。その後、鉗子をはずして循環を回復させ、ペプチドF（配列番号：33）又はペプチドG（配列番号：40）を290pmol/kg-bwで静脈投与した。虚血を経験させたさらなる群には、PBSのみを静脈投与した。

再灌流の72時間後、該動物を麻酔し、パラホルムアルデヒドを使用する再灌流固定を実施した。固定化組織を矢状的に半分に分断し、10％ホルムアルデヒド中室温にて1日浸漬させることによりさらに固定した。腎臓の組織学的評価は、Sharplesらの論文, 2005, J Amer Soc Nephrol: 15: 2115（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）のプロトコルに従って実施した。手短にいうと、段階的にエタノールを使用することで脱水した後、腎臓断片をパラフィン内に包埋し、5マイクロメートルの切片に切り、スライドガラス上に乗せた。スライド上の切片をキシレンで脱パラフィン化し、ヘマトキシリン及びエオシンで対比染色して、光学顕微鏡下で調べた。各腎臓につき100視野を調べ、各々の管状外形に関して0〜3のスコアを与えた：0、組織学的に正常；1、管状細胞膨張、刷子縁損失、及び1/3以下の核損失を伴う核凝集；2、スコア1と同様であるが、核損失を示す管状外形が1/3より大きくかつ2/3未満である；及び、3、核損失を示す管状外形が2/3より大きい。各腎臓の組織学的スコアは、全てのスコアの加算で計算した（最高スコア300）。
ペプチドF（配列番号：33）又はペプチドG（配列番号：40）のいずれかの投与は、コントロールに比較し、負傷スコア（p＜0.05）の顕著な減少に関連していた。

（実施例11）：脳マラリアにおける組織保護ペプチドの効果
Kaiserらの論文, 2006, J. Infect. Dis. 193:987-995（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）に従い、脳マラリアの齧歯類モデルを開発した。メスのCBA/Jマウス7週齢を、20匹からなる群に分けた。各群を、プラスモジウム・ベルゲイ・アンカ（Plasmodium berghei Anka）（PbA）で感染させ、10⁶個のPbA感染赤血球用量で腹腔内投与した。マウスは、2.6μg/kgの用量での腹腔内注射として、4日目、5日目又は6日目に、PBS若しくはペプチドF（配列番号：33）のいずれかを受けた。フォローアップの間、臨床状態及び血液塗抹データを集めた（終点D30）。カプラン・マイヤー法に従って累積的な長期間の生存率を計算し、群をログランク試験で比較した。生存時間は従属的に可変であった。0.05より低いp値を有意とみなした。
図12に示すように、コントロール群（生理食塩水）の全てのマウスは、8日目に死亡した。対照的に、ペプチドF（配列番号：33）を受けたマウスは生存率の延長を示し、これはログランク試験を使用する、コントロール群（p＜0.005）とは明らかに異なる。

（実施例12）：マウス眼モデルにおける組織保護ペプチドの効果
引用によりその全てが本明細書に組み込まれるSavinoらの論文, 2006, J Neuroimmunol 172:27-37に従って、C57BL/6メスマウス（6〜8週齢）にて実験的自己免疫脳脊髄炎（「AEA」）を誘導した。8mg/mlのマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（H37RA株；Difco社, Detroit, MI, USA）を添加した不完全フロイントアジュバント（Sigma社, St. Louis, MO, USA）中の合計200μgのMOG35-55（Multiple Peptide Systems社, San Diego, CA, USA）を用いて、腹側部に皮下免疫することにより、EAEを誘導した。動物は、餌及び水に適宜アクセス可能な特定病原体不含条件で飼育した。マウスに500ngの百日咳毒素（Sigma社）を免疫と同時に、及び48時間後に静脈内投与した。体重及び臨床的スコアを毎日記録した（0＝健康、1＝尾部弛緩、2＝運動失調及び／又は後肢不全麻痺若しくは遅い正向反射,28C、3＝後肢の麻痺及び／又は前肢の不全麻痺、4＝前肢の不全対麻痺、5＝瀕死又は死）。固形飼料及び飲料水を、ケージの床の上のペトリ皿上に置き、病気マウスが飲食できるようにした。4.4マイクログラム/kg-bwの用量でペプチドE（配列番号：31）を毎日皮下投与した。これは免疫後4日目に開始した。
ペプチドE（配列番号：31）の投与は、処理動物において、AEAの臨床所見の経時変化及び重篤性の両方を顕著に減少させた（p＜0.01）（図13）。

本発明は、本発明の個々の態様の一説明として意図され記載されている特定の実施態様によって範囲を限定されるべきではなく、かつ機能的に等価な方法及び成分は本発明の範囲内である。実際に、上記の記載、及び添付の図面から、本明細書に示したもの及び本明細書に記載のものに加え、本発明の様々な修飾が当業者に明らかとなろう。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図する。
本明細書で引用した全ての文献は、全ての目的に関して、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。

（4. 図面の簡単な説明）
図1は、ペプチドJ（配列番号：41）の効果を、組織保護分子カルバミル化EPO（CEPO）に対して比較するためのインビボ坐骨神経傷害モデルの結果を示し、該図中、ペプチドJ（配列番号：41）は膵臓ポリペプチド（LRRYINMLTRP、配列番号：28）由来の両親媒性ヘリックスと連結させた、EPOのヘリックスBの外向アミノ酸（すなわち、ペプチドG、配列番号：40）からなるキメラペプチドである。

図2は、インビボ坐骨神経傷害モデルで試験した、本発明のペプチドの組織保護効果を示す。該アッセイにおいて、ラット（1群あたりn=6）の右坐骨神経を傷害し、該動物にすぐに、PBS、又は等モル濃度のEPO、EPOペプチドA（配列番号：32、配列番号：1のアミノ酸1〜23に対応する）、ペプチドD（配列番号：30、配列番号：1のアミノ酸58〜82に対応する）若しくはペプチドG（配列番号：40）を含有するPBSを投与した。ペプチドG（配列番号：40）は、EPO分子の球状中心から親水環境へと外向する、すなわち該ポリペプチドの表面に存在する、EPOのヘリックスB内のアミノ酸に基づいている。さらに、別の受容体を介して組織保護されるべきことが知られている色素上皮由来因子の領域から構築した20merを、ネガティブコントロールとして含ませた。次なる4日にわたる負傷からの回復は、ペプチドG（配列番号：40）及びペプチドD（配列番号：30）が、このインビボアッセイで、カルバミル化EPO（CEPO）と同等又はそれよりも高い組織保護効果を示すことを実証する。

図3は、赤血球新生活性に関してUT-7アッセイで試験した、ペプチドD（配列番号：30）、及び赤血球新生活性が欠如していることが既知のCEPOの赤血球新生効果を示す。このインビトロアッセイの結果は、ペプチドD（配列番号：30）又はCEPOのいずれも、10,000pMまでの用量で赤血球新生活性を示さないことを実証する。 図4は、ペプチドF（配列番号：33、配列番号：1のアミノ酸14〜29に対応する）及びペプチドG（配列番号：40）が赤血球新生的であるか、又はEPOに対する中和抗体を発現させるかどうかを測定するためのインビボアッセイの結果を示す。該結果は、130日の経過にわたり0.8μg/kgにて週3回、皮下的に投与（皮下投与）した場合、どちらのタンパク質も、該ラットでヘモグロビンレベルを増加させなかったことを実証する。さらに、EPOの投与とは対照的に、いずれのペプチドも抗体反応を惹起しない。

図5は、ペプチドD（配列番号：30）が、カイニン酸誘導死に対して運動ニューロンを保護することを実証する、インビトロ調査の結果である。 図6は、0.1ng/ml及び1ng/ml用量のペプチドD（配列番号：30）が、血清欠乏に関連するアポトーシスに対してP-19細胞を保護することを示す。 図7A〜Bは、ラットでの中大脳動脈閉塞アッセイの結果を示す。図7Aは、単回投与での4.4 ug/kgのペプチドD（配列番号：30、配列番号：1のアミノ酸58〜82に対応する）が、脳における梗塞の体積を、2時間離して投与される4.4 ug/kgの4回投与と同じくらい強力に減少させ得ることを実証するグラフを示す。図7Bは、中大脳動脈閉塞によって引き起こされる行動的欠陥を測定するためのフット・フォールトアッセイの結果を示す。図7Bは、単回投与スケジュール（1×4.4 ug/kg）及び複数回投与スケジュール（4×4.4 ug/kg）の両方でペプチドD（配列番号：30）を投与した場合に、ラットが行動的改善を明示したことを示す。

図8A〜Bは、糖尿病性神経障害のインビボアッセイの結果を示す。糖尿病は、ストレプトゾトシンを使用し、ラットで誘導する。糖尿病の誘導の検証後、ラットを、ペプチドD（配列番号：30）又はPBSで週5回、4 ug/kg-bwの用量で2週間腹腔内投与処理した。該ラットの神経伝導速度及びホットプレート潜時の両方を観察した。図8Aは、ペプチドD（配列番号：30）で処理したラットが、非処理ラットと比較して、伝導速度の向上を示したことを実証する。図8Bは、前記処理ラットのホットプレート潜時が非処理ラットに比較して短くなったことを実証し、さらに伝導速度の向上を実証する。

図9A〜Bは、シスプラチン誘導性神経障害、及びEPOヘリックスBキメラを用いた腎症の治療結果を示す。図9Aは、ペプチドG（配列番号：40、ヘリックスBキメラ）で処理した動物は、ホットプレート潜時アッセイで試験した場合に改善的結果を示したことを実証する。図9Bは、腎臓機能の尺度である尿産生が、ペプチドG（配列番号：40）処理動物において正常に維持されていたことを実証する。

図10は、糖尿病性網膜症に付随する網膜性漏出における、ペプチドD（配列番号：30）の効果を示す。この図は、ペプチドD（配列番号：30）が、該処理動物において網膜性漏出を実質的に減少させることができたことを示す。 図11は、腎臓の虚血-再灌流モデルにおける、ペプチドF（配列番号：33）又はペプチドG（配列番号：40）の結果を示す。この図は、72時間後に調査したときに、両方のペプチドが、60分の虚血-再灌流傷害から生じた負傷スコアを減少させたことを示す。

図12は、ペプチドF（配列番号：33）の投与が、マウスを実験的脳マラリアから保護することを示す。 ペプチドE（配列番号：31）で処理したマウスEAEモデルにおける臨床的スコア。図13は、実験的自己免疫脳脊髄炎を有するマウスにおける神経機能の臨床経過を示す。4.4μg/kgのペプチドEを毎日、腹腔内投与した。ペプチドEの投与は、コントロールに比べ、神経機能を顕著に改善した。臨床段階；1、尾部弛緩；2、運動失調及び／又は後肢不全麻痺若しくは遅い正向反射；3、後肢の麻痺及び／又は前肢の不全麻痺；4、前肢の不全麻痺；5＝瀕死又は死。

Claims (21)

1. アミノ酸配列QEQLERALNSS（配列番号：40）からなる単離ポリペプチド。
2. アミノ酸配列QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR（配列番号：41）からなる単離ポリペプチド。
3. アミノ酸配列CSLNENIQEQLERALNSS（配列番号：43）からなる単離ポリペプチド。
4. アミノ酸配列QEQLERALNSS（配列番号：40）からなる単離ポリペプチドであって、応答性細胞、組織又は器官の機能及び／又は生存率を保護、維持、強化あるいは回復させることなどの細胞保護活性を有し、配列番号：40の1個のアミノ酸残基が側鎖修飾又は側鎖置換を有するアミノ酸同等物で置換されている、前記単離ポリペプチド。
5. アミノ酸配列QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR（配列番号：41）からなる単離ポリペプチドであって、応答性細胞、組織又は器官の機能及び／又は生存率を保護、維持、強化あるいは回復させることなどの細胞保護活性を有し、配列番号：41の1個のアミノ酸残基が側鎖修飾又は側鎖置換を有するアミノ酸同等物で置換されている、前記単離ポリペプチド。
6. アミノ酸配列CSLNENIQEQLERALNSS（配列番号：43）からなる単離ポリペプチドであって、応答性細胞、組織又は器官の機能及び／又は生存率を保護、維持、強化あるいは回復させることなどの細胞保護活性を有し、配列番号：43の1個のアミノ酸残基が側鎖修飾又は側鎖置換を有するアミノ酸同等物で置換されている、前記単離ポリペプチド。
7. 請求項1〜3のいずれか1項記載の単離ポリペプチドのレトロ-インバーソ-類似体からなる単離ポリペプチド。
8. ポリエチレングリコールの付加により修飾されている、請求項1〜7のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
9. 受容者においてヘモグロビンを増加させない、請求項1〜8のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
10. 請求項1〜9のいずれかに記載の単離ポリペプチドを含む、医薬組成物。
11. 経口投与、鼻腔内投与、眼球投与、吸入投与、経皮投与、直腸投与、舌下投与、又は非経口投与用に製剤されている、請求項10記載の医薬組成物。
12. 灌流液として製剤されている、請求項10記載の医薬組成物。
13. 哺乳動物の身体から単離した神経細胞、組織若しくは器官、又は腎細胞若しくは組織の生存率を保護、維持又は強化するための方法であって、前記細胞、組織又は器官を請求項1〜9のいずれか1項記載の単離ポリペプチド又は請求項10〜12のいずれか1項記載の医薬組成物に曝すことを含む、前記方法。
14. 前記哺乳動物の身体がヒトの身体である、請求項13記載の方法。
15. その必要がある対象の腎疾患又は中枢神経系若しくは末梢神経系の疾患若しくは障害の予防、治療的処置又は予防的処置用の医薬組成物の製造のための、請求項1〜9のいずれか1項記載の単離ポリペプチドの使用。
16. 前記対象がヒトである、請求項15記載の使用。
17. 請求項1〜9のいずれか1項記載の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、単離核酸。
    
18. 請求項17記載の核酸を含むベクター。
19. 発現ベクターである、請求項18記載のベクター。
20. 請求項19記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
21. 単離ポリペプチドを組換え的に製造する方法であって、a）前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で、請求項20記載の宿主細胞を培地中で培養すること、及びb）前記培地から前記ポリペプチドを回収及び単離することを含む、前記方法。

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