JP5087925B2 - 新規癌抗原ペプチド及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトの癌に特異的なタンパク質及びその部分ペプチドの用途に関する。さらに本発明は、上記ペプチドによって刺激され誘導された活性化Ｔ細胞又は該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む抗原提示細胞を含む癌の治療及び／又は予防剤に関する。

癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。

近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１を参照）。１９９１年、ベルギーＬｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２を参照）。Ｂｏｏｎの報告後ＣＤ８陽性Ｔ細胞の認識する抗原としてｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ（非特許文献３を参照）、ＭＡＲＴ１／ＭｅｌａｎＡ（非特許文献４を参照）、ｇｐ１００（非特許文献５を参照）などの単離が行われた。

免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるタンパク質は、正常細胞には少なく、癌細胞に過剰に存在していることが望ましい。また抗原タンパク中に、抗原を発現した腫瘍を直接障害する抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導できるペプチド部分に加えて、細胞障害性Ｔ細胞の活性を補助する抗原特異的ヘルパーＴ細胞を誘導できるペプチド部分も含まれていることが望ましい。

最近、ＹＫＬ−４０がヒト悪性脳腫瘍に関連する血清中の腫瘍マーカーとして活用できる可能性が示唆されている。本タンパク質は、大部分のヒト悪性脳腫瘍に過剰に発現していると報告されている一方、本タンパク質は正常脳組織にはほとんど発現していない（非特許文献６を参照）。

秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１−５１９ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：１６４３−１６４７（１９９１） Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５４：３１２４−３１２６（１９９４） Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１（９）：３５１５−３５１９（１９９４） Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：６４５８−６４６２（１９９４） Ｍｅｅｎａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６２：４３６４−４３６８（２００２）

本発明の目的は、新規ペプチドの癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。さらに本発明の目的は、該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む抗原提示細胞、及びペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合するＴ細胞の、癌の治療及び／又は予防剤の用途を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する上記YKL-40中の特定の領域に存在する部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有し、このため、該ペプチドが癌の治療及び／又は予防であり、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列中の９個以上の連続したアミノ酸から成るペプチドであって配列番号２のaa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261又はaa326-354の領域内の連続するアミノ酸配列を有し免疫誘導活性を有するペプチド、又はこれらのいずれかのペプチドと９０％以上の同一性を有し免疫誘導活性を有する９〜３０アミノ酸残基のペプチド、又は前記いずれかのペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が１０〜３１であり、免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の癌の治療及び／又は予防剤に有効成分として含有される前記タンパク質又はペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む抗原提示細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の癌の治療及び／又は予防剤に有効成分として含有される前記タンパク質又はペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合するＴ細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤を提供する。

本発明により、癌の治療及び／又は予防や、そのための抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用な新規なペプチド及び医学分野における該ペプチドの各種用途が提供された。下記実施例において具体的に示されるように、本発明のペプチドにより活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＹＫＬ−４０を発現する癌細胞に対して優れた細胞障害活性を示す。従って、本発明のペプチドは、これをヒトに投与することにより、又はこれを用いてインビトロで活性化Ｔ細胞をヒトに投与することにより、癌の治療及び／又は予防に有効である。

ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２０１との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。 ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。 ペプチド特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞が該ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。 ペプチド特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞が癌細胞のライセートを貪食した樹状細胞に反応して増殖していることを示す図である。 ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２０１との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。 ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。 ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の癌細胞に対する障害活性を示した図である。

上記の通り、本発明のペプチドとしては、まず、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列（YKL-40のアミノ酸配列）中の７個以上の連続したアミノ酸から成るペプチドであって配列番号２のaa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261又はaa326-354の領域内の連続するアミノ酸配列を有し免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性部分ペプチド」と言うことがある）が挙げられる。

ここで、「aa」は、アミノ酸配列のＮ末端から数えて何番目のアミノ酸残基かを示す。例えば「aa10」は、Ｎ末端から数えて１０番目のアミノ酸残基であることを示し、「aa10-19の領域」は、Ｎ末端から数えて１０番目のアミノ酸残基から１９番目のアミノ酸残基までの１０個のアミノ酸残基から成る領域を示す。また、「免疫誘導活性」は、YKL-40を発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させる能力を意味し、具体的には、下記実施例に詳述する方法により測定される、ペプチドで刺激されたＴ細胞のIFN-γ産生能力及び／又はYKL-40発現癌細胞に対する細胞障害活性が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりも高く、かつ、ペプチドで刺激されたＴ細胞が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりもよく増殖することを意味する。増殖は、目視観察、顕微鏡下での細胞数計測、フローサイトメトリー、培地中のトリチウムチミジンの細胞内への取り込み量等により確認することができる。なお、下記実施例で採用したIFN-γ産生能力の測定は、例えばＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，ｐ２２５７，１９９５に記載されており、また、細胞障害活性の測定は、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：ｐ３１７，１９９４）に記載された^５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法に準拠している。

上記本発明のペプチドの好ましい例として、配列番号３から配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらのペプチドの配列番号、アミノ酸配列、配列番号２中の位置を下記表１に示す。なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」とは、Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gln Ser Arg Argのアミノ酸配列を持つ１７アミノ酸残基のサイズのペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」を「配列番号３のペプチド」と略記することがある。

上記本発明のペプチドにおいて、１個ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入され、元のペプチドと９０％以上の同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有する７〜３０アミノ酸残基のペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性修飾ペプチド」と言うことがある）も上記本発明のペプチドと同様に癌の治療及び／又は予防等に用いることができ、本発明の範囲に含まれる。ここで、アミノ酸配列の「同一性」とは、両者のアミノ酸配列残基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両アミノ酸配列を整列させ、一致のアミノ酸残基を、全アミノ酸残基数（両者の配列で全アミノ酸残基数が異なる場合には短い方の配列の全アミノ酸残基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出することができる。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、上記本発明の免疫誘導性部分ペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。

上記した本発明のペプチド（免疫誘導性部分ペプチド及び免疫誘導性修飾ペプチド）を部分配列として含み（すなわち、本発明のペプチドの一端又は両端に他のペプチドが付加されたもの）、アミノ酸残基数が８〜３１であり、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性付加ペプチド」と言うことがある）も上記本発明のペプチドと同様に癌の治療及び／又は予防等に用いることができ、本発明の範囲に含まれる。

上記した本発明のペプチドは、市販のペプチド合成機を用いて常法により容易に調製することができる。

本発明は、上記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはDNAでもRNAでもよい。YKL-40をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１に示すように公知である。従って、本発明の免疫誘導性部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列のうち、該免疫誘導性部分ペプチドをコードする領域の塩基配列を有するものであってよい。あるいは、その保存的置換塩基配列（コードするアミノ酸配列が同じで塩基配列が異なるもの）を用いることができる。なお、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、本発明の免疫誘導性修飾ペプチド及び免疫誘導性付加ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができる。これらのポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて常法により合成することができる。

本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含み、細胞中で該ポリヌクレオチドを発現することができる組換えベクターをも提供する。細胞は、哺乳動物細胞であっても、大腸菌や酵母菌のような原核又は真核微生物であってもよい。哺乳動物細胞に遺伝子導入するためのベクターとしては、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、これら自体は周知であり、種々のものが市販されているので、市販のベクターを利用することができる。市販のベクターのマルチクローニング部位に上記した本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより本発明の組換えベクターを得ることができる。

哺乳動物細胞に遺伝子導入するためのベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ組換えベクターは、癌の治療及び／又は予防のための遺伝子ワクチンとして利用することがきる。遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。

ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡ ウイルスまたはＤＮＡ ウイルスに本発明のＤＮＡ を組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。

その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。

本発明のペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。ｉｎ ｖｉｖｏ方法がより好ましい。

ｉｎ ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。ｉｎ ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のＤＮＡ を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のＤＮＡ を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。

一方、大腸菌や酵母菌などの微生物用のベクターも周知であり、種々のものが市販されている。微生物用のベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ組換えベクターは、本発明のペプチドを遺伝子工学的に大量生産するために用いることができる。微生物への組換えベクターの組み込みは周知の方法により行なうことができる。

下記実施例に具体的に記載されるように、本発明のペプチドは、免疫誘導活性を示す。すなわち、本発明のペプチドで刺激したＴ細胞は、YKL-40を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示し、増殖する。従って、本発明のペプチドを生体に投与することにより、癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。すなわち、本発明は、上記本発明のペプチドを有効成分として含有する医薬並びに上記本発明のペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤を提供する。

本発明の癌の治療及び／又は予防剤による対象の癌としては、YKL-40を発現している癌を挙げることができ、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺または子宮の腺癌、腎癌等を挙げることができる。また、投与対象は、哺乳動物であり、特にヒトが好ましい。

本発明のペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。また、投与量は、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよく、症状、使用目的等に応じて適宜選択されるが、通常、0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg 〜1000mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。

本発明のペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤は、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体及び／又は希釈剤を用いて製剤することができる。製剤方法及びそのための各種担体は、医薬製剤の分野において周知である。薬理学的に許容される担体又は希釈剤は、例えば、生理緩衝液のような緩衝液や、賦形剤（砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）であってよく、結合剤（シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等）等が適宜混合されていてもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などによる経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などによる非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。

上記した本発明のペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤は、ワクチンの形態であってよく、この場合には該有効成分に加えてアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得る。多数の種類のアジュバントが、当業界で周知である。具体例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Molecules and cells）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Kreig）、外７名、「ネイチャー（Nature）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。好ましくは、ペプチドは、ＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せと混合されて投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲でワクチン処方物中に存在する。その他のアジュバントが当業界で既知であり、本発明に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Goding）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice）」、第２版、１９８６年を参照）。ペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。

対象の免疫応答を刺激するその他の因子も、対象に投与され得る。例えばその他のサイトカインも、リンパ球刺激特性の結果として、予防接種プロトコルに有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８およびＦｌｔ３リガンドが挙げられる。投与される場合、本発明の治療用組成物は、製薬上許容可能な調製物中で投与される。このような調製物は、製薬上許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、補助免疫増強剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン、ならびに任意にその他の療法的作用物質をルーチンに含有し得る。

下記実施例において具体的に記載されるように、本発明のペプチドと、抗原提示細胞をインビトロで接触させることにより、本発明のペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、本発明は、上記本発明のペプチドを含む、抗原提示細胞の処理剤をも提供する。ここで、抗原提示細胞としては、ＨＬＡクラスI又はＨＬＡクラスII分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＨＬＡクラスI及びＨＬＡクラスII分子が同定されており、周知である。ＨＬＡクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。ＨＬＡクラスII分子としては、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DPを挙げることができる。

ＨＬＡクラスI又はＨＬＡクラスII分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％ＣＯ_２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜8週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。

本発明のペプチドと抗原提示細胞をインビトロで接触させる方法自体は周知の方法により行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。すなわち、抗原提示細胞を、本発明のペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、10^３細胞/mlから10⁷細胞/ml程度、好ましくは5x10^４細胞/mlから５x10⁶細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％CO₂雰囲気中で行なうことが好ましい。

上記したペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のHLA分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。本発明は、このような、本発明のペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞をも提供する。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ペプチドを提示し、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させる。

上記のようにして調製される、本発明のペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、抗原提示細胞をＴ細胞をインビトロで接触させることにより、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞/ml程度、好ましくは１００００〜１００万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％CO₂雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。なお、本明細書において、上記のように、本発明のペプチドを抗原提示細胞の表面に提示されるためにペプチドを抗原提示細胞の培養液に加えることを、「ペプチドで細胞をパルスする」と呼ぶことがある。また、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞とＴ細胞を接触させることを、「ペプチドでＴ細胞を刺激する」と呼ぶことがある。

上記の共存培養により、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。本発明は、このような、本発明のペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞をも提供する。

上記本発明のペプチドを提示する上記抗原提示細胞は、生体内においても該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、これを生体に投与することにより癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。また、本発明のペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、Ｔ細胞は、YKL-40を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示すので、該Ｔ細胞を生体に投与することによっても癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。従って、本発明は、上記本発明の抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤、並びに上記本発明のＴ細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤をも提供する。治療対象となる癌の例としては、当然ながら、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤の対象として上記した癌を挙げることができる。

生体に投与する抗原提示細胞又はＴ細胞は、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように本発明のペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。

抗原提示細胞又はＴ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。

本発明はさらに、上記本発明のペプチドを対応抗原とする抗体及びその抗原結合性断片を提供する。ここで、抗原結合性断片とは、抗体分子中に含まれるFab断片やF(ab')₂断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定等のためには、再現性の高いモノクローナル抗体が好ましい。ペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行なうことができる。例えば、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)やカゼイン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより該ペプチドに対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、本発明のペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から本発明のペプチドを対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることができる。なお、上記の方法は周知の常法である。

本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、YKL-40を発現する細胞や本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞を検出又は定量する免疫測定用試薬として用いることができる。免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等があり、フローサイトメトリーも免疫測定の１種と考えることができる。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、本発明の抗体又はその抗原結合性断片はこれらのいずれにも用いることができる。YKL-40を発現する細胞の検出又は定量に用いる場合には、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、癌の診断剤として機能する。癌の診断剤として用いる場合、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないサンドイッチELISAや凝集法が好ましい。なお、上記本発明のペプチドは、該ペプチドを発現する細胞を競合法で検出又は測定する場合の免疫測定用試薬として用いることもできる。

なお、下記実施例において、本発明のペプチドにより刺激されたＴ細胞が、YKL-40を発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示すことが明らかになったので、YKL-40は、癌特異的免疫誘導剤として生体に投与することができる。すなわち、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質であって免疫誘導活性を有するタンパク質を有効成分として含有する癌特異的免疫誘導剤をも提供する。この場合、生体への投与経路、投与量、製剤等は、上記したペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤の場合と同様でよい。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。

実施例１：ＹＫＬ−４０由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
（１）ヒトＹＫＬ−４０タンパク質のアミノ酸配列の情報をＧｅｎＢａｎｋから得た。ＨＬＡ−Ａ０２０１結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトＹＫＬ−４０タンパク質のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡクラスI分子に結合可能と予想されるペプチドを選択した。

（２）ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して１，５００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technololgies, Inc., Grand Island, NY）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。

一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。

（３）調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、選択したペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０^５細胞づつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０^６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０^５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０^５細胞づつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。

ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するＹＫＬ−４０由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
（１）上記で誘導した各穴のＴ細胞の内、本発明のペプチドである配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドで刺激されたＴ細胞が増殖していることが顕微鏡下における細胞数計測により確認された。本Ｔ細胞の配列番号３のペプチドに対する特異性を調べるために、ペプチドでパルスされた、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子を発現するＴ２細胞（文献及び入手先：Ｓａｌｔｅｒ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２１：２３５−２４６（１９８５）、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養）５×１０^４個に対して、５×１０^３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号３のペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において顕著なＩＦＮ−γ産生が確認された。（図１）。従って、配列番号３のペプチドは特異的にＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。同様にして、特異的にＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有する配列番号４から配列番号１７に記載の１４種のペプチドを同定した（図５）。

なお、図１中、縦軸の参照番号１は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドについての結果を示す。参照番号２はＹＫＬ−４０由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドＬＱＣＣＳＡＹＫＬ（配列番号１９）についての結果を示す（比較例１）。参照番号３はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例２）。また、図５中、横軸の参照番号１２から２５は、それぞれ、配列番号４から配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号２６はＹＫＬ−４０由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号１９のペプチドについての結果（比較例３）、横軸の参照番号２７はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例４）。

（２）次に、本発明のペプチドの１つである配列番号３のペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でＹＫＬ−４０を発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でＹＫＬ−４０を発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。ＹＫＬ−４０の発現が確認されている悪性脳腫瘍細胞株、Ｔ９８Ｇ（文献及び入手先：Ｓｔｅｉｎ ＧＨ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ９９：４３−５４（１９７９）、ＡＴＣＣより購入）を１０^５個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００mＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０^３個づつ添加し、さらにこれに後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁された１０^５、５ｘ１０^４、２．５ｘ１０^４および１．２５ｘ１０^４個の配列番号３のペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、配列番号３のペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を有することが判明した（図２）。従って、本発明のペプチドの１つである配列番号３のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でＹＫＬ−４０を発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。同様にして、配列番号４から配列番号１７に記載の１４種のペプチド各々で刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞はＴ９８Ｇに対して細胞障害活性を示した（図６）。さらに、配列番号３から配列番号１７に記載の１５種のペプチド各々で刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＹＫＬ−４０の発現が確認されている別の悪性脳腫瘍細胞株、Ｕ８７ ＭＧ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｈｅｒｅｄ．， ２１：２３８−２４１（１９７１）、ＡＴＣＣより購入）に対して細胞障害活性を示した（図７）。

なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明の各ペプチドで刺激誘導されたCD8陽性T細胞１０^５個とクロミウム５１を取り込ませた１０^３個の悪性脳腫瘍細胞株Ｔ９８Ｇ又はＵ８７ ＭＧとを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式^＊により算出したCD8陽性T細胞のＴ９８Ｇ又はＵ８７ ＭＧに対する細胞障害活性を示した結果である。^＊式：細胞障害活性（％）＝CD8陽性T細胞を加えた際のＴ９８Ｇ又はＵ８７ ＭＧからのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００

なお、図６中、横軸の参照番号２８〜４１は、それぞれ、配列番号４から配列番号１７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号４２はＹＫＬ−４０由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号１９のペプチドについての結果（比較例５）、横軸の参照番号４３はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例６）。また、図７中、横軸の参照番号４４〜５８は、それぞれ、配列番号３から配列番号１７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号５９はＹＫＬ−４０由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号１９のペプチドについての結果（比較例７）、横軸の参照番号６０はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例８）。

ＹＫＬ−４０由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導
（１）ＣＤ４陽性Ｔ細胞抗原エピトープ予測のため、SYFPEITHI アルゴリズム（ラメンセー著（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ），外４名，「イムノジェネティクス（Immunogenetics）」、１９９９年、第５０巻、ｐ．２１３−２１９）、ProPred アルゴリズム（（シン（Singh）,外１名、「バイオインフォマティクス（Bioinformatics）」、２００１年、第１７巻、ｐ．１２３６−１２３７）、およびRANKPEP アルゴリズム（（レイチェ（Ｒｅｃｈｅ），外２名，「ヒューマン・イムノロジー（Human immunology）の３つのコンピューター予測プログラムを用いてヒトＹＫＬ−４０タンパク質のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡクラスII結合ペプチドであると予想されるペプチドを選択した。

（２）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して１，５００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technololgies, Inc., Grand Island, NY）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。

一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。

（３）調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、選択したペプチドを１０mｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０^５細胞づつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０^６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０^５細胞づつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。

ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するＹＫＬ−４０由来ヘルパーＴ細胞抗原エピトープの決定
（１）上記で誘導した各穴のＴ細胞の内、本発明のペプチドである配列番号１８のペプチドで刺激されたＴ細胞が増殖していることが確認された。本ＣＤ４陽性Ｔ細胞の配列番号１８のペプチドに対する特異性を調べるために、各ペプチドでパルスされた、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４分子を発現するＴ２ＤＲ４細胞（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間培養）５×１０^４個に対して、５×１０^３個のＣＤ４陽性Ｔ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、配列番号１８のペプチドをパルスしたＴ２ＤＲ４細胞を用いた穴の培養上清において、１０００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＦＮ−γが産生されていた（図３）。一方、他のペプチドおよびペプチドをパルスしていないＴ２ＤＲ４細胞を用いた穴の培養上清においては、ほとんどＩＦＮ−γが産生は認められなかった（図３）。従って、配列番号１８のペプチドは特異的にＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。

なお、図３中、縦軸の参照番号４は配列番号１８の本発明のペプチドについての結果を示す。さらに、縦軸の参照番号５はＹＫＬ−４０由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号１９のペプチドについての結果（比較例７）、縦軸の参照番号６はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例８）。

（２）次に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性Ｔ細胞を増殖刺激させる能力を有する本ペプチドが、ＹＫＬ−４０タンパク質が抗原提示細胞内でナチュラルにプロセスされてＨＬＡ−ＤＲ上に提示されるエピトープであるかどうかについて検討した。ＹＫＬ−４０の発現が確認されている悪性脳腫瘍細胞株、Ｔ９８Ｇのライセートを未成熟樹状細胞に添加して消化させ、樹状細胞を成熟化させた後、本ペプチドで刺激されたＴ細胞が本樹状細胞によって刺激されるかを調べた。１．５×１０^６個のＴ９８Ｇ細胞のペレットを液体窒素および湯浴を用いて７回凍結融解を繰り返し、細胞ライセートを作製した。一方、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation mediumに重層して１，５００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する相間を収穫し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、ＰＢＭＣを得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２時間付着させ、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で６日間培養し、未成熟樹状細胞を作製した。作製した各細胞ライセートを５×１０^５個の未成熟樹状細胞に添加し、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中で２日間培養した。また同時に、未成熟樹状細胞に配列番号１８のペプチドを添加したもの、および未成熟樹状細胞にＰＢＭＣの細胞ライセート（１．５×１０^６個の細胞ペレットから作製）を添加したものをそれぞれ作製し、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２日間培養した。培養後の各樹状細胞をＸ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄後、１０％ヒトＡＢ血清を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、９６穴プレート１穴当りにそれぞれ３．３×１０^４個づつ添加した。これらに５×１０^４個のＹＫＬペプチドで刺激されたＴ細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で７２時間培養した。なお、培養開始から４８時間後にそれぞれの培養液に１mＣｉづつのトリチウムチミジンを添加した。培養後、細胞ハーベスターにて細胞をガラス濾紙上に回収し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その結果、図４に示すように、配列番号１８のペプチドで刺激されたＴ細胞は，Ｔ９８Ｇ細胞のライセートを添加した樹状細胞の刺激によって増殖していることが確認された。さらに、これらの反応は抗ＨＬＡ−ＤＲ中和抗体の添加によって阻害されていることから、配列番号１８の本発明のペプチドが、ＹＫＬ−４０タンパク質が抗原提示細胞内でナチュラルにプロセスされてＨＬＡ−ＤＲ上に提示されるエピトープであることが明らかになった。

なお、図４中、縦軸の参照番号７は配列番号１８の本発明のペプチドがパルスされたHLA-DRB1*04陽性の樹状細胞をＸ線照射したものと該ペプチドで刺激誘導されたHLA-DRB1*04陽性のCD4陽性T細胞を混合して10%ヒトAB血清を含むAIM-V培地中で４８時間培養後にトリチウムチミジンを加えさらに２４時間培養した後のCD4陽性T細胞におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示した結果を示す。参照番号８は、悪性脳腫瘍細胞株T98GのライセートをHLA-DRB1*04陽性の樹状細胞に取り込ませたものをＸ線照射したものと配列番号１８の本発明のペプチドで刺激誘導されたHLA-DRB1*04陽性のCD4陽性T細胞を混合して10%ヒトAB血清を含むAIM-V培地中で４８時間培養後にトリチウムチミジンを加えさらに２４時間培養した後のCD4陽性T細胞におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示した結果を示す。参照番号９は、悪性脳腫瘍細胞株T98GのライセートをHLA-DRB1*04陽性の樹状細胞に取り込ませたものをＸ線照射したものと配列番号１８の本発明のペプチドで刺激誘導されたHLA-DRB1*04陽性のCD4陽性T細胞を混合して10%ヒトAB血清と抗HLA-DR抗体を含むAIM-V培地中で４８時間培養後にトリチウムチミジンを加えさらに２４時間培養した後のCD4陽性T細胞におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示した結果を示す。参照番号１０は、HLA-DRB1*04陽性の健常人から分離した末梢血単核球のライセートをHLA-DRB1*04陽性の樹状細胞に取り込ませたものをＸ線照射したものと配列番号１８の本発明のペプチドで刺激誘導されたHLA-DRB1*04陽性のCD4陽性T細胞を混合して10%ヒトAB血清を含むAIM-V培地中で４８時間培養後にトリチウムチミジンを加えさらに２４時間培養した後のCD4陽性T細胞におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示した結果を示す。参照番号１１は、Ｘ線照射したHLA-DRB1*04陽性の樹状細胞と配列番号１８の本発明のペプチドで刺激誘導されたHLA-DRB1*04陽性のCD4陽性T細胞を混合して10%ヒトAB血清を含むAIM-V培地中で４８時間培養後にトリチウムチミジンを加えさらに２４時間培養した後のCD4陽性T細胞におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示した結果である。

本発明のペプチドは、癌の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用であり、また、癌の治療及び／又は予防剤として利用できる抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用である。

Claims (10)

1. 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列中の９個以上の連続したアミノ酸から成るペプチドであって配列番号２のaa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261又はaa326-354の領域内の連続するアミノ酸配列を有し免疫誘導活性を有するペプチド、又はこれらのいずれかのペプチドと９０％以上の同一性を有し免疫誘導活性を有する９〜３０アミノ酸残基のペプチド、又は前記いずれかのペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が１０〜３１であり、免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤。
2. 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列中の９個以上の連続したアミノ酸から成るペプチドであって配列番号２のaa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261又はaa326-354の領域内の連続するアミノ酸配列を有し免疫誘導活性を有するペプチド又は前記いずれかのペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が１０〜３０であり、免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する請求項１記載の癌の治療及び／又は予防剤。
3. 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列中の９個以上の連続したアミノ酸から成るペプチドであって配列番号２のaa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261又はaa326-354の領域内の連続するアミノ酸配列を有し免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する請求項２記載の癌の治療及び／又は予防剤。
4. 前記配列番号２のaa49-61の領域内の連続するアミノ酸配列を有するペプチドが、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の癌の治療及び／又は予防剤。
5. 前記配列番号２のaa96-117の領域内の連続するアミノ酸配列を有するペプチドが、配列番号３又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の癌の治療及び／又は予防剤。
6. 前記配列番号２のaa246-261の領域内の連続するアミノ酸配列を有するペプチドが、配列番号１１又は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の癌の治療及び／又は予防剤。
7. 前記配列番号２のaa326-354の領域内の連続するアミノ酸配列を有するペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する請求項１ないし６のいずれか１項に記載の癌の治療及び／又は予防剤。
8. 配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する請求項３記載の癌の治療及び／又は予防剤。
9. 請求項１ないし８のいずれか１項に記載の癌の治療及び／又は予防剤に有効成分として含有される前記タンパク質又はペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む抗原提示細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤。
10. 請求項１ないし８のいずれか１項に記載の癌の治療及び／又は予防剤に有効成分として含有される前記タンパク質又はペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合するＴ細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤。

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