JP4782565B2 - 新規味覚改変ポリペプチドｎａｓ、そのｄｎａ及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、新規味覚改変ポリペプチドＮＡＳ、そのＤＮＡ及びその用途に関し、詳しくは、ポリペプチドＮＡＳ、その遺伝子、当該タンパク質を含有する味覚改変活性を有する二量体タンパク質ネオクリン、並びにネオクリンを含有する味覚改変組成物に関する。

クルクリゴ・ラチフォリア（Curculigo latifolia）は、西マレーシアやタイ南部などに自生するユリ科に分類される植物であり、該植物に含有されるクルクリン同族体（アイソフォーム）（以下、クルクリンと称する。）は、これを食した後、水又は酸味物質を飲食すると、甘味を感じさせる味覚修飾物質として有用であるとされている。

従来知られているクルクリンを構成するサブユニットとしては、クルクリンＡ、クルクリンＢ等がある。
クルクリンＡについては、既に全アミノ酸配列が決定されている（例えば、特許文献１参照）。また、クルクリンＢについても、全アミノ酸配列ならびに塩基配列が開示されており、クルクリンＡとはアミノ酸組成において数個のアミノ酸が異なることが確認されている（例えば、特許文献２参照）。
これらのサブユニットは、いずれもホモダイマーとしてクルクリンを構成し、味覚修飾機能を有するとされていたが、これらの味覚修飾機能は食品に添加するには充分とは言えなかった。

しかし、本発明において、クルクリンとは異なり、ＮＡＳ及びＮＢＳの２種の異なるアミノ酸配列を有するサブユニットからなるヘテロダイマー構造を取る新規な二量体タンパク質を見出すことに成功し、該タンパク質をネオクリンと命名し、その結果を開示した（例えば、非特許文献１参照）。なお、ネオクリンは食品に添加するに充分な味覚修飾機能を有することは、本発明で初めて確認された知見である。

一方、ネオクリンの高効率生産を可能とするべく、ＮＡＳ及びＮＢＳの２種の異なるアミノ酸配列を有するサブユニットをコードする遺伝子を、原核生物である大腸菌において発現させた結果が開示されている（例えば、非特許文献２参照）。
しかし、この方法において、ＮＡＳ及びＮＢＳは、大腸菌菌体内にインクルージョンボディとして生産されるためと考えられるが、単に大腸菌で発現させただけでは味覚修飾活性を発揮できるような正しいＮＡＳ及びＮＢＳのヘテロダイマーはほとんど生産されなかった。
そして、味覚修飾機能を発揮させるためには、上記インクルージョンボディを回収した後、塩化グアニジンなどの溶解剤を用いて溶解した後、再構成する操作が必要であった。このような試薬を用いる必要があることは、作業上の煩雑さや生産コスト面での不利があるばかりでなく、生産されたネオクリンを食品用途に用いる際には、安全性の面から工業生産には不向きであった。

このような状況下、より実用性の高い、優れた味覚改変機能を有する物質の解明と、食品用途に耐えられる安全で効率的な生産方法の開発が求められていた。

特開平３−１９０８９９号公報 特開平６−１８９７７１号公報 「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotechnol．Biochem．）」、６８巻、６号、ｐ．１４０３−１４０７、２００４年 「フェブス・レターズ（FEBS Letters）」、５７３巻、ｐ．１３５−１３８、２００４年

本発明の目的は、上記のように、より優れた味覚改変機能を有する物質を見出し、該味覚改変物質の構造を決定すると共に、遺伝子レベルにおいても解明し、当該物質の一次構造、並びにこれをコードする遺伝子を取得するとともに、当該味覚改変物質を含むことを特徴とする新規な味覚改変組成物を提供することにある。

本発明者らは上記課題に基づき、鋭意検討を重ねた結果、クルクリゴ・ラチフォリア（Curculigo latifolia）の果実抽出物中に、優れた味覚改変活性を有し、クルクリンとは異なりヘテロダイマー構造を取る新規な二量体タンパク質を見出すことに成功し、該タンパク質をネオクリンと命名した。
このネオクリンは、飲食物の酸味、苦味又はえぐ味を顕著に低減すると共に、飲食物の嗜好性を高めるような活性、すなわち味覚改変活性を有し、クルクリンの味覚修飾作用よりも格段に優れ、実用性に優れていることを見出した。

すなわち、本発明者らはネオクリンを精製し、その構造を決定する過程で、ネオクリンは、従来知られていない新規サブユニットＮＡＳ（ｎｅｏｃｕｌｉｎ ａｃｉｄｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）と、クルクリンのサブユニットとして既知のクルクリンＡやＢといったサブユニットＮＢＳ（ｎｅｏｃｕｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）とのヘテロダイマーであることに着目した。
そこで、該新規サブユニットＮＡＳの構造解析を行った結果、ＮＢＳを構成する既知のクルクリンＡやＢ同士の相同性と比較して、相同性の低い新規なポリペプチドを得ることができた。
そして、ポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡの解析を行い、ネオクリンを遺伝子レベルにおいて解明した結果、ＮＡＳの成熟体タンパク質のほか、シグナルペプチド及び延長ペプチドを含む前駆体タンパク質（ＰＮＡＳ）の塩基配列をも見出した。
また、ネオクリンを実際に飲食物に添加して、味覚改変活性を有することを確認した。
更に、異種におけるネオクリンの発現系を検討した結果、ＮＡＳまたはＰＮＡＳ、及びＮＢＳをコードする遺伝子を宿主において発現させ、菌体外に味覚修飾機能を有するヘテロダイマーとしてネオクリンを分泌生産させることを可能とする発現系を確立した。
本発明は係る知見に基づくものである。

すなわち、請求項１に記載の本発明は、下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すポリペプチドＮＡＳである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
請求項２に記載の本発明は、マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン／フコース／キシロースの比が３／２／１／１で構成されるＮ結合型糖鎖が付加された請求項１に記載のポリペプチドＮＡＳである。

請求項３に記載の本発明は、下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
請求項４に記載の本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すＤＮＡである請求項３に記載の遺伝子のＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードするＤＮＡ。

請求項５に記載の本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドＰＮＡＳである。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
請求項６に記載の本発明は、マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン／フコース／キシロースの比が３／２／１／１で構成されるＮ結合型糖鎖が付加された請求項５に記載のポリペプチドＰＮＡＳである。

請求項７に記載の本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
請求項８に記載の本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すＤＮＡである請求項７に記載の遺伝子のＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７からなる塩基配列から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードするＤＮＡ。

請求項９に記載の本発明は、請求項１又は２に記載のポリペプチドＮＡＳと前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳとからなり、味覚改変活性を有することを特徴とする二量体タンパク質ネオクリンである。
請求項１０に記載の本発明は、請求項９に記載の二量体タンパク質ネオクリンを有効成分として含有することを特徴とする味覚改変組成物である。

請求項１１に記載の本発明は、請求項３又は４記載のＤＮＡ、若しくは請求項７又は８に記載のＤＮＡを含む組換えベクターである。

請求項１２に記載の本発明は、ベクターが、真核生物で機能するベクターである請求項１１記載の組換えベクターである。
請求項１３記載の本発明は、ベクターが、糸状菌で機能するベクターである請求項１１記載の組換えベクターである。
請求項１４記載の本発明は、ベクターが、麹菌で機能するベクターである請求項１１記載の組換えベクターである。

請求項１５記載の本発明は、請求項１１記載の組換えベクター、請求項１２記載の組換えベクター、請求項１３記載の組換えベクター、又は、請求項１４に記載の組換えベクターを含む形質転換体である。
請求項１６記載の本発明は、請求項１５に記載の形質転換体を培養することを特徴とする請求項９に記載のネオクリンの製造方法である。

本発明により、優れた味覚改変活性を有し、クルクリンとは異なりヘテロダイマー構造を取る新規な二量体タンパク質ネオクリンが提供され、当該タンパク質を用いて、食品等に実用可能な新規な味覚改変組成物を提供することが可能となった。
また、本発明により、当該タンパク質を構成するサブユニットのアミノ酸配列が提供され、このアミノ酸配列通りに、適当な合成方法によって当該タンパク質を提供することが可能となった。
さらには、本発明により、当該タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡが提供されたことで、適当な宿主を選び、特に麹菌を宿主として、遺伝子工学技術を用いて効率的に当該タンパク質を提供することが可能となった。

ネオクリン精製粉末を還元下又は非還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した時の図である。 ＮＡＳ及びＮＢＳの精製粉末をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した時の図である。 Ｓ−カルボキシアミドメチル化ＮＡＳのｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ消化ペプチドのＨＰＬＣ溶出パターンの図である。 Ｓ−カルボキシアミドメチル化ＮＡＳのｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ消化ペプチドのＨＰＬＣ溶出パターンの図である。 Ｓ−カルボキシアミドメチル化ＮＡＳのｔｒｙｐｓｉｎ消化により遊離したアミノ酸の定量分析の図である。 Ｓ−カルボキシアミドメチル化ＮＡＳ（１ｎｍｏｌ）のｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ａ消化により遊離したアミノ酸の定量分析の図である。 ＮＡＳのアミノ酸配列を示す。 ＮＡＳに付加された糖鎖の糖組成分析から推定された糖鎖構造を示す。 クルクリンを還元下又は非還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した時の図である。 ＮＡＳ発現ベクターの作製法の概略を示した図である。 ＮＢＳ発現ベクターの作製法の概略を示した図である。 形質転換株１２株の培養液を、還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ウェスタンブロッティング解析した結果を示した図である。 （ａ）フェニル疎水カラムクロマトグラフィーによる精製した際の溶出パターンと、（ｂ）それぞれの分画を還元下又は非還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ウェスタンブロッティング解析した結果を示した図である。 （ａ）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製した際の溶出パターンと、それぞれの分画を還元下又は非還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、（ｂ）ＣＢＢ染色及び（ｃ）ウェスタンブロッティング解析した結果を示した図である。

符号の説明

図７において、４行目のＮはＮ末端から決定したアミノ酸配列部分を示し、Ｃ１〜１４はｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ消化から得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示し、Ｄ１〜４は、ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ消化から得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示し、Ｔ１〜４はｔｒｙｐｓｉｎ消化から得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示す。また、←はＣ末端から得られた配列を示す。

（１）本発明の二量体タンパク質ネオクリン
本発明のネオクリンは、ポリペプチドＮＡＳと下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳとからなり味覚改変活性を有することを特徴とする二量体タンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
ポリペプチドＮＡＳ（ｎｅｏｃｕｌｉｎ ａｃｉｄｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）については、下記の（２）で説明するように、本発明者らが初めて報告するタンパク質である。また、ポリペプチドＮＢＳ（ｎｅｏｃｕｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）とは、（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドを意味するが、これも後述の（２）で詳細に説明するように、具体的には、既知のクルクリンＡやＢといったクルクリンのサブユニットを意味する。
両者は、糖鎖を持つＮＡＳと糖鎖を持たないＮＢＳが結合することにより安定なヘテロダイマーを形成する。

本発明のネオクリンは、例えば、ユリ科に属する植物であるクルクリゴ・ラチフォリアから公知の分離・精製法を適切に組み合わせて取得できる。
例えば、実施例１の（１）に記載するように、凍結乾燥したクルクリゴ・ラチフォリアの果実をホモジナイズして得た粉末を大量の純水で抽出し、遠心分離によって上清を廃棄することにより、不要物を除去する。残った沈殿をｐＨ２．０以下の酸性水溶液で抽出すると、ネオクリンが抽出液中に得られる。次いで、この抽出液を通常の処理方法（好ましくは非加熱処理）で中和、濃縮、脱塩、乾燥すると、十分に実用可能なタンパク質ネオクリンが得られる。
尚、下記の（２）で説明するポリペプチドＮＡＳを人工的に作成し、これに、ネオクリン或いは既知のクルクリンから抽出・精製して得られる、或いは人工的に合成して得られるポリペプチドＮＢＳを結合させることによっても得ることができる。更に、下記の（６）で説明する製造方法によって得ることもできる。

本発明のネオクリンは、味覚改変活性を有するものである。ここで、味覚改変活性とは、酸味、苦味又はえぐ味を顕著に低減すると共に、飲食物の嗜好性を高めるような活性を言う。すなわち、苦味を有する飲食物の苦味を抑える活性、えぐ味を有する飲食物のえぐ味を抑える活性、飲食物に甘味を付与する活性、酸味を呈する飲食物に甘味を付与する活性、酸味を呈する飲食物の酸味を抑える活性を意味する。

（２）本発明のポリペプチドＮＡＳ
本発明のポリペプチドＮＡＳは、下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すポリペプチドである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。

本発明の（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを構成するサブユニットの１つとして本発明者らが初めて見出したものである。
ポリペプチドＮＢＳ（ｎｅｏｃｕｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）とは、前記したように、（ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、或いは（ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチドを意味する。このようなポリペプチドＮＢＳとして、具体的には、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（クルクリンＢ）、該アミノ酸配列中７３番目のトリプトファンをアスパラギンに置換してなるポリペプチド（クルクリンＢ´と称する。）、該アミノ酸配列中、２８番目のリジン、７３番目のトリプトファン、７８番目のトリプトファン及び８１番目のアスパラギンを、それぞれアスパラギン、アスパラギン、システイン、及びアラニンに置換してなるポリペプチド（クルクリンＡ）を挙げることができる。

従って、本発明のポリペプチドＮＡＳは、（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよいが、該（Ａ）ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド、すなわち（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドであっても良い。

ポリペプチドＮＡＳは、ポリペプチドＮＢＳとの結合力が増し、結果的に安定性の高いネオクリンを形成することができる点で、糖鎖が付加されてなることが好ましく、特に、Ｎ結合型糖鎖が付加されてなることが好ましい。ここでＮ結合型糖鎖とは、タンパク質の一次構造に存するアスパラギン残基に結合したＮ−アセチルグルコサミン（N-acetyl glucosamine）を基点として伸長する糖鎖構造の総称を意味する。
Ｎ結合型糖鎖の中でも、特に、マンノース（mannose）／Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetyl glucosamine）／フコース（fucose）／キシロース（xylose）の比が３／２／１／１で構成されるＮ結合型糖鎖であることが好ましい。具体的には、図８に示す構造からなる糖鎖配列を挙げることができる。尚、図８に示す構造の一部に付加、欠如、置換、又は修飾があってもよい。
尚、ポリペプチドＮＡＳにおけるＮ結合型糖鎖の結合部位は、Ｎ結合型糖鎖の結合特性を考慮すると、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中８１番目のアスパラギンであるものと推測される。

本発明のポリペプチドＮＡＳは、ネオクリンを形成するサブユニットであるから、ネオクリンを含むクルクリゴ・ラチフォリアの果実から公知の分離・精製法を組み合わせて取得することができる。例えば、実施例１の（１）に記載した方法で所得したネオクリンを、実施例１の（２）及び（３）に記載するように公知のイオン交換クロマトグラフィー法を適切に組み合わせて精製すると共に、実施例２に記載するように、通常用いられる方法で陽イオン交換カラムに供すると、等電点が８．６であるポリペプチドＮＢＳはカラムに吸着され、ポリペプチドＮＡＳは非吸着画分に得られる。この非吸着画分を通常用いられる方法で、陰イオン交換カラムに供すると、等電点が４．７であるポリペプチドＮＡＳはカラムに吸着されるので、これを溶出し、脱塩、乾燥すればよい。
また、下記の（４）に示すＤＮＡを元にして遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。
一方、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドを、適当な合成方法、例えば、固相合成法、部分固相合成法、溶液合成法のほか、フルオレニルメチルオキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）、ｔ−ブチルオキシカルボニル法（ｔＢｏｃ法）等の化学合成法などによって製造することができる。また、（Ｂ）に示すポリペプチドは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列となるように、例えば部位特異的変異法によって改変することによっても取得され得る。

（３）本発明のポリペプチドＰＮＡＳ
本発明のポリペプチドＰＮＡＳは、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドである。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。

ここで、（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前記（２）において説明したポリペプチドＮＡＳのシグナルペプチド及び延長ペプチドを含むポリペプチドＮＡＳの前駆体として、本発明者らが始めて見出したものである。すなわち、（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの前駆体として植物細胞内で産生され、プロセシングによって、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとなるポリペプチドである。
従って、ＮＡＳ前駆体であるポリペプチドＰＮＡＳは、（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても良いが、該（Ａ）ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド、すなわち（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、ポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドであっても良い。
尚、ポリペプチドＮＢＳについては、前記（２）において説明した通りである。

ポリペプチドＰＮＡＳはプロセシングにより、シグナルペプチド部分（配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜２２記載のアミノ酸配列からなる部分）、及び延長ペプチド（配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３６〜１５８記載のアミノ酸配列からなる部分）が切断された後に得られるポリペプチドＮＡＳと、ポリペプチドＮＢＳとの結合力を増加させ、結果的に安定性の高いネオクリンを形成させることができる点で、糖鎖が付加されてなることが好ましく、特に、Ｎ結合型糖鎖が付加されてなることが好ましい。Ｎ結合型糖鎖の中でも、特に、マンノース（mannose）／Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetyl glucosamine）／フコース（fucose）／キシロース（xylose）の比が３／２／１／１で構成されるＮ結合型糖鎖であることが好ましい。具体的には、図８に示す構造からなる糖鎖配列を挙げることができる。尚、図８に示す構造の一部に付加、欠如、置換、又は修飾があってもよい。
尚、ポリペプチドＰＮＡＳにおけるＮ結合型糖鎖の結合部位は、Ｎ結合型糖鎖の結合特性を考慮すると、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列中１０３番目のアスパラギンであるものと推測される。

このようなポリペプチドＰＮＡＳは、ネオクリンを形成するサブユニットＮＡＳの前駆体であるから、下記の（４）に示すＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡを元にして遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。一方、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドを、適当な合成方法、例えば、固相合成法、部分固相合成法、溶液合成法のほか、フルオレニルメチルオキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）、ｔ−ブチルオキシカルボニル法（ｔＢｏｃ法）等の化学合成法などによって製造することができる。また、（Ｂ）に示すポリペプチドは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列となるように、例えば部位特異的変異法によって改変することによっても取得され得る。

（４）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記（２）で説明したポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡ、及び、上記（３）で説明したポリペプチドＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡである。

すなわち、第一に、ポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡは、前記（２）において説明したポリペプチドＮＡＳ、詳しくは以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。

このポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡは、具体的には、（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列を含むＤＮＡとして得ることができるが、これと実質的に同一の塩基配列、すなわち、（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードするＤＮＡとして得ることもできる。尚、ポリペプチドＮＢＳについては、前記（２）において説明した通りである。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば０．１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度にて６５℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。

このような、ポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡは、例えば、受粉から数週間後のクルクリゴ・ラチフォリアの果実から、ｍＲＮＡを抽出し、逆転写ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｃＤＮＡを合成し、ファージベクターにパッケージングする。これをファージに感染させｃＤＮＡライブラリーを得る。続いて、本発明によって明らかとなったポリペプチドＮＡＳのアミノ酸配列に基づいて作製したプローブをプラークハイブリダイゼーションさせて、目的とするＤＮＡを特定し、回収して取得することができる。
一方、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲによって得ることもできるほか、市販されている種々のＤＮＡ合成装置によっても、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示すＤＮＡを合成することができる。
また、（Ｂ）に示すＤＮＡは、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列に、部位特異的変異導入法等を用いて、適宜置換、欠失、挿入、又は付加変異を導入することで得ることができる。また、既知の突然変異処理によっても取得することが可能である。

また、第二に、ポリペプチドＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡは、前記（３）において説明したポリペプチドＰＮＡＳ、詳しくは以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、前記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。

このようなポリペプチドＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡは、具体的には、（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７からなる塩基配列を含むＤＮＡとして得ることができるが、これと実質的に同一の塩基配列、すなわち、（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７からなる塩基配列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、ポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードするＤＮＡとして得ることもできる。尚、ポリペプチドＮＢＳについては、前記（２）において説明した通りである。
「ストリンジェントな条件」については、ポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡの場合と同様である。

このような、ポリペプチドＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡは、例えば、受粉から数週間後のクルクリゴ・ラチフォリアの果実から、成熟体ポリペプチドＮＡＳの場合と同様にして取得することができる。また、該配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲや、市販されている種々のＤＮＡ合成装置によっても、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示すＤＮＡを合成することができる。
また、（Ｂ）に示すＤＮＡは、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７からなる塩基配列に、部位特異的変異導入法等を用いて、適宜置換、欠失、挿入、又は付加変異を導入することで得ることができる。また、既知の突然変異処理によっても取得することが可能である。

なお、本発明の２つのＤＮＡが、塩基配列の調整要素及び当該遺伝子の構造部分を含んでも良いことは、言うまでもない。

（５）本発明の味覚改変組成物
本発明の味覚改変組成物は、有効成分として、味覚改変活性を有する二量体タンパク質ネオクリンを含有することを特徴とするものである。ネオクリンについては、前記（１）において説明した通りである。
本発明の味覚改変組成物は、そのまま摂取してもよいが、野菜ジュース、グレープフルーツ等の果汁、すしネタ等各種料理用調味液をはじめとする飲食物又は薬剤等に適当量を配合して使用してもよい。この場合のネオクリンの配合量は、当該組成物が高度に精製されたネオクリン粉末を飲料に添加する場合を例に取ると、５〜５，０００μｇ／ｍｌ、特に５０〜５００μｇ／ｍｌが好ましい。
また、本発明の味覚改変組成物は、配合対象である飲食物又は薬剤等の性状に応じて、粉末状、溶液状、シート状、スプレー状、顆粒状、又は乳化物状等に加工して使用することができる。

（６）本発明の二量体タンパク質ネオクリンの製造方法
本発明においては、ネオクリンを構成する２種のサブユニットであるＮＡＳ及びＮＢＳをコードする各遺伝子、さらにはＰＮＡＳをコードする遺伝子が同定されている。
そこで本発明においては、これらの遺伝子を高効率に発現させ、ネオクリンの工業生産を可能とするための宿主−ベクター系として、ＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡ又はＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡを含む組換えベクターを提供すると共に、ＮＢＳをコードする遺伝子のＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。更に、本発明は、上記二種類の組換えベクターを組み合わせて含む形質転換体をも提供する。更にまた、本発明は、上記形質転換体を培養することを特徴とする味覚改変活性を有する二量体タンパク質ネオクリンの製造方法をも提供する。

本発明において、宿主−ベクター系を利用してネオクリンを製造するためには、上記した本発明の２種類の組換えベクター、すなわち、ＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡ（すなわち、請求項３又は４記載のＤＮＡ）あるいはＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡ（すなわち、請求項７又は８記載のＤＮＡ）を含む組換えベクター、及び請求項１１の（ａ）又は（ｂ）に示すＮＢＳをコードする遺伝子のＤＮＡを含む組換えベクターを、宿主に同時に導入する必要がある。
これは、ネオクリンがＮＡＳ及びＮＢＳという異なるサブユニットからなるヘテロダイマーであるので、ＮＡＳとＮＢＳの両方のサブユニットタンパク質が生産されることが必要だからである。

このような本発明の組換えベクターは、ＮＡＳをコードする遺伝子、或いはＮＢＳをコードする遺伝子を発現させるためのプロモーター機能を含む発現調節機能を備えている必要がある。
また、組換えベクターは、該ベクターに導入したＮＡＳ遺伝子やＮＢＳ遺伝子が宿主菌内において発現して生産されるＮＡＳやＮＢＳを、宿主菌体外に分泌生産させるための機能を備えていることが望ましい。具体的には、例えば、ＮＡＳやＮＢＳをコードする遺伝子のほかに、宿主が分泌するタンパク質、例えば、麹菌（アスペルギルス・オリゼなど）の場合、麹菌由来の分泌タンパク質α−アミラーゼをコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、ＮＡＳ及びＮＢＳ、並びにα−アミラーゼの融合タンパク質として発現させることにより、宿主菌の菌体外に分泌生産させることができる。尚、アミラーゼの代わりに、グルコアミラーゼ（ＧｌａＡ）を用いることもできる。
さらに、上述のようにして融合タンパク質として発現させる場合には、融合タンパク質をＮＡＳやＮＢＳ単独のタンパク質にするためのプロセシング機能も備えているのが望ましい。具体的には、例えば、麹菌のゴルジ体に存在するＫＥＸ２様プロテアーゼが認識するアミノ酸配列（Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，Ａｒｇ−Ｌｙｓ，Ａｒｇ−Ａｒｇ）をコードする塩基配列を利用して、該塩基配列をα−アミラーゼとＮＡＳ及びＮＢＳとの間に組み込んでこれを発現させ、後でＫＥＸ２様プロテアーゼを作用させることにより、組換えベクターが産生した融合タンパク質からα−アミラーゼを単離し、ＮＡＳ及びＮＢＳの二量体タンパク質を得ることができる。
更に、上記のようにしてＫＥＸ２により切断する場合には、ＫＥＸ２の認識配列付近の立体構造によって不正確になされることがあること、及び、ネオクリンはヘテロ２量体を形成し、切断部位付近の立体構造が複雑であると予想されることから、切断効率と切断の正確性の改良を行うことが好ましい。例えば、ＮＡＳ及びＮＢＳのＮ末端のＡｓｐの直前にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒなどのように分子量が小さく、側鎖も小さいために立体障害を生じ難いアミノ酸を３残基程度挿入することができる。
このような一連の操作は、ベクター構築キット（Multisite Gateway Three-Fragment Vector Construction Kit；Invitrogen社製）を利用することにより、より簡便に行うことができる。すなわち、該キットを利用して、（ａ）５’エントリークローンの作製、（ｂ）目的遺伝子エントリークローンの作製、（ｃ）３’エントリークローンの作製、（ｄ）３種類のエントリークローンとデスティネーション・ベクターとの組換え反応による組換えベクターの作製、の順でコンストラクションを行って、所望の組換えベクターを得ることができる。一方、常法に基づき、必要な遺伝子断片を切り出し、ベクター上の適切なサイトに導入することによっても、組換えベクターを作製することが可能である。

本発明の組換えベクターの具体例としては、ＮＡＳをコードする遺伝子を導入した組換えベクターとしてｐｇＦａ３ＧＮａＳＪ（図１０）、ＮＢＳ遺伝子を導入した組換えベクターとしてｐｇＦａ３ＧＮｂＴａ（図１１）などを挙げることができる。
一方、ＰＮＡＳをコードする遺伝子を導入する場合、例えば、ｐｇＦａ３ＧＮａＳＪ中のＮＡＳをコードする遺伝子、または、ｐｇＦａ３ＧＮｂＴａ中のＮＢＳをコードする遺伝子を、ＰＮＡＳをコードする遺伝子に代えたプラスミドが挙げられる。

また、本発明の形質転換体について説明する。本発明の形質転換体は、上記二種類の組換えベクターが適当な宿主に組み込まれてなるものである。
本発明の組換えベクターの宿主としては、真核生物が望ましい。大腸菌等の原核生物を宿主とした場合は、背景技術の欄で既に述べたように、菌体内にタンパク質がインクルージョンボディとして生産されるために、これを味覚修飾活性を発揮できる正しいヘテロダイマーとするために、該インクルージョンボディを構成するポリペプチドＮＡＳ及びＮＢＳを、塩化グアニジン等の溶解剤などを用いて一旦溶解した後、再構築（再構成）過程を経る必要があることから、好ましくない。これに対して、麹菌などの真核生物を宿主とすると、溶解剤などの試薬を用いる必要がない上に、再構築などの余分な過程を必要とせずに、味覚修飾活性を発揮することができるネオクリンとして分泌生産させることが可能である。

本発明の組換えベクターを導入するための宿主としては、真核生物の中でも糸状菌が好ましく、その中でさらに好ましいのは麹菌である。また、麹菌の具体的なものとしては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）が挙げられ、さらにその代表的なものとしてアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＮＳ４株が挙げられる。
このような形質転換体の例として、本発明者らは、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＮＳ４株にＮＡＳ及びＮＢＳをコードする遺伝子の組換えベクターを導入して、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＮＳ−ＮＡＢ２株を得た。このアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＮＳ−ＮＡＢ２株は、日本国茨城県つくば市中央第６の独立行政法人特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２０９として寄託されている。

本発明においては、上記形質転換体を培養することを特徴とする味覚改変活性を有する二量体タンパク質ネオクリンを製造することができる。
形質転換体の培養は、ＮＡＳをコードする遺伝子とＮＢＳをコードする遺伝子の発現割合が特定比率となるような条件で行うことが望ましい。発現量がどちらか一方に偏りがあると、ホモダイマーが形成されてＮＡＳとＮＢＳからなるヘテロダイマーの生産割合が低くなり、ネオクリンの生産効率が低下する。
本発明においては、形質転換操作に用いるＮＡＳをコードする遺伝子とＮＢＳをコードする遺伝子の割合を１：５の比率とした際に得られた形質転換体の中から、高い確率で高発現株を選抜できた。尚、高い生産効率を達成するためには、ｐＨ８．０前後の培地条件で培養を行うことが好ましい。
このようにして、本発明の組換えベクターや形質転換体味覚修飾活性を有するヘテロダイマーが効率的に生産可能である。
以下に、実施例を示す。

クルクリゴ・ラチフォリアの果実を、以下の手順に従い精製し、味覚改変活性を有する新規タンパク質の取得を試みた。

（１）粗抽出液の調製
凍結乾燥したクルクリゴ・ラチフォリアの果実（表１の果実凍結乾燥粉末）約１ｋｇに４０リッターの純水を加え、１５分間ホモジナイズした後、６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、上清（上清に味覚修飾活性は無い）を除去した。前述の操作を２回繰り返し、沈殿残渣を得た。
次に、この沈殿残渣に０．０５Ｎ硫酸を２０リッター加え、１０分間ホモジナイズした後、６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、上清を回収した。この操作を２回繰り返した。沈殿に味覚修飾活性はない。
次に、この抽出液に１Ｎ水酸化ナトリウムを２リッター加え、中和して、活性物質を含む粗抽出液（表１の０．０５Ｎ硫酸抽出液）を得た。

（２）Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ−５０カラムによる精製
（１）で得た粗抽出液約４０リッターを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ−５０カラム（オルガノ社製、直径８ｃｍ×３０ｃｍ）に流し、吸着させた。続いて、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）１リッターで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）１．５リッターで溶出したところ、味覚修飾活性を示す画分が得られた。この活性画分に６０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加し、活性物質を析出させ、６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。得られた沈殿は０．２Ｎ酢酸１００ｍｌに溶解し、活性物質溶液（表１のAmberlite IRC-50 Chromatography）として回収した。

（３）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムによる精製
（２）で得た活性物質溶液１００ｍｌを０．２Ｎ酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Amersham Biosciences社製、直径８ｃｍ×３０ｃｍ）に供し、脱塩した。この活性物質溶液を凍結乾燥することにより高度に精製されたネオクリン粉末（表１のSephadex G-25 Chromatography）が得られた。
上記の各精製ステップにおいて得られる物質のタンパク質含量、活性収率及び精製度を表１にまとめた。

（４）精製結果の確認
前記の（１）〜（３）で得たネオクリン精製粉末２．５μｇを、還元下又は非還元下でゲル濃度１５％でＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色を行ったところ、図１に示す通り、非還元下で２０ｋＤａの位置に単一バンドが見られ、還元下では１３ｋＤａ及び１１ｋＤａの位置に２本のバンドが見られた。このことから、得られたネオクリンが高度に精製されていることが確認でき、さらに、ネオクリンが１３ｋＤａ及び１１ｋＤａのサブユニット各１個からなる２量体であることが確認できたので、それぞれをｎｅｏｃｕｌｉｎ ａｃｉｄｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＮＡＳ）、ｎｅｏｃｕｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＮＢＳ）とした。

（５）味覚修飾活性の確認
さらに、前記の（１）〜（３）で得たネオクリン精製粉末１．１ｍｇを、６Ｍ尿素を含む１０％アクリルアミドゲルを用いて、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。得られたバンドを切り出し、ゲルから水で抽出した試料を凍結乾燥した。凍結乾燥後のサンプルを１５０μｌの水に懸濁し、パネラー２名がそれぞれ５０μlを口に含んだところ、当該サンプルが甘味を呈すること、さらに、サンプルを吐き出した後に口に含んだ０．０２Mクエン酸の酸味が甘味に変換されていることを確認し、味覚改変活性を有することを確認した。
さらに、回収したサンプルのうち１０００分の１量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して銀染色を行ったところ、２０ｋＤａの位置に単一バンドが見られ、味覚修飾活性本体がネオクリンであることが確認された。

実施例１において得られたネオクリンを、以下の手順に従い更に精製し、ネオクリンを構成する各サブユニットの解析を行った。

（１）ＨｉＴｒａｐ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムによる精製
実施例１で得たネオクリン粉末１００ｍｇを２０ｍｌのバッファーＡ（８Ｍ尿素、３０ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））に溶解し、全量をバッファーＡで平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Amersham Biosciences社製、直径１．６ｃｍ×２．５ｃｍ）に供した。続いて、バッファーＡ５０ｍｌで洗浄を行った。続いて、１Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＡ５０ｍｌで溶出を行い、精製されたＮＢＳ画分を得た。また、洗浄画分７０ｍｌはイオン交換水中で透析により１００ｍｌとなった。

（２）ＨｉＴｒａｐ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムによる２回目の精製
上記（１）で得られた洗浄画分１００ｍｌに８Ｍ尿素、３０ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を加え１５０ｍｌとし（全て終濃度）、これをバッファーＢ（８Ｍ尿素、３０ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５））で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Amersham Biosciences社製、直径１．６ｃｍ×２．５ｃｍ）に供した。続いて、バッファーＢ５０ｍｌで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＢ５０ｍｌで溶出を行った。また、洗浄画分２００ｍｌはイオン交換水中で透析により２５０ｍｌとなった。

（３）ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムによる精製
上記（２）で得られた洗浄画分２５０ｍｌに８Ｍ尿素、３０ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加え３５０ｍｌとし（全て終濃度）、これをバッファーＣ（８Ｍ尿素、３０ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０））で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Amersham Biosciences社製、直径１．６ｃｍ×２．５ｃｍ）に供した。続いて、バッファーＣ５０ｍｌで洗浄後，１Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＣ５０ｍｌで溶出を行ったところ、精製されたＮＡＳ画分を得た。

（４）精製結果の確認
（１）及び（３）で得られたＮＢＳ画分及びＮＡＳ画分をそれぞれ透析後、凍結乾燥し、精製粉末を得た。これらの精製粉末を１０μｇ用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、図２に示すように、ＮＡＳ画分、ＮＢＳ画分のそれぞれについて、１３ｋＤａ、１１ｋＤａの部分に単一バンドが見られ、各サブユニットが精製されていることが確認された。

実施例２において得られたネオクリンを構成するＮＡＳ画分のアミノ酸配列を、以下の手順に従い解析した。

（１）Ｎ末端アミノ酸配列解析
実施例２（１）〜（３）で得られた精製ＮＡＳ粉末７０μｇを二次元電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜と重ねて上下に電流を流すことにより転写した。転写したＰＶＤＦ膜を、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｔ ｓｔａｉｎ（Molecular Probes社製）で染色後、通常の方法でバンドを切り出し、アミノ酸シーケンサー（HP G1005A Protein Sequencing System）によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。すなわち、Ｎ末端部分の遊離アミノ基にフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を反応させ、フェニルチオカルバミル誘導体（ＰＴＣアミノ酸）とし、次いでトリフルオロ酢酸によってアニリノチアゾリノン−アミノ酸として遊離させ、さらに酸性下で安定なフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨアミノ酸）に変換して分析するものである。これによりＮ末端より４０残基のアミノ酸配列が決定された。

（２）内部アミノ酸配列解析
（ｉ）Ｓ−カルボキシアミドメチル化
実施例２（１）〜（３）で得られた精製ＮＡＳ粉末１０ｍｇを６Ｍ尿素、２０ｍＭ ＤＴＴを含む５００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌに溶解した。この溶液を５０℃、１時間静置した。ヨードアセトアミド１００ｍｇを添加して混合し、暗所、かつ室温で４５分間振盪した。反応液を透析後、凍結乾燥させ、Ｓ−カルボキシアミドメチル化したＮＡＳを得た。

（ｉｉ）ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎによる断片化
上記（ｉ）で得られたＳ−カルボキシアミドメチル化ＮＡＳのｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ消化を、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で３７℃、１６時間行った。タンパク質濃度は０．２ｍｇ／ｍｌで、酵素：基質比は１：２０とした。反応停止には１００℃で３分間処理した。

（ｉｉｉ）ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎによる断片化
上記（ｉ）で得られたＳ−カルボキシアミドメチル化ＮＡＳのｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ消化を、０．０１％ＳＤＳを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で３７℃、１６時間行った。タンパク質濃度は１．０ｍｇ／ｍｌで、酵素：基質比は１：１００とした。反応停止には１００℃で３分間処理した。

（ｉｖ）ｔｒｙｐｓｉｎによる断片化
上記（ｉ）で得られたＳ−カルボキシアミドメチル化ＮＡＳのｔｒｙｐｓｉｎ消化を、２Ｍ尿素を含む０．１Ｍ炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）中で３７℃、２４時間行った。タンパク質濃度は０．２ｍｇ／ｍｌで、酵素：基質比は１：２０とした。反応停止には１００℃で３分間処理した。

（ｖ）ペプチドの分離及び配列解析
上記（ｉｉ）〜（ｉｖ）の操作で得られたｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ消化ペプチド、ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ消化ペプチド及びｔｒｙｐｓｉｎ消化ペプチドを、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡカラム（東ソー社製、直径４．６ｍｍ×１５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣによって分離した。各ペプチドは０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法で溶出した。
２２０ｎｍの吸収によって検知されたｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ消化ペプチドのＨＰＬＣ溶出パターンを図３に、同様にして検知されたｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ消化ペプチドのＨＰＬＣ溶出パターンを図４に、ｔｒｙｐｓｉｎ消化ペプチドのＨＰＬＣ溶出パターンを図５に、それぞれ示す。
２２０ｎｍの吸収によって検知され、分取されたペプチドは乾燥後、アミノ酸シーケンサー（Procise 491cLC Protein Sequencing System又はProcise 492HT Protein Sequencing System）により内部アミノ酸配列を解析した。

（３）Ｃ末端アミノ酸配列解析
上記（２）（ｉ）で得られたＳ−カルボキシアミドメチル化ＮＡＳ １ｎｍｏｌのｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ａ消化を、０．１５％ＳＤＳを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で２５℃で行った。タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌで、酵素：基質比は１：４０とし、反応開始直後と６時間反応後にサンプリングした。反応停止には反応液に等量の１０％トリクロロ酢酸を添加し、０℃、３０分静置後、遠心分離して上清を回収した。
上清にある遊離したアミノ酸をＰＴＣ化し、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡカラム（東ソー社製、直径４．６ｍｍ×１５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣによって定量分析した。結果を図６に示す。
図６の結果に示すように、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、及びＳｅｒ以外のアミノ酸は遊離されなかった。Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ａは、ＰｒｏまたはＡｒｇを遊離する活性が著しく低いことから、Ｃ末端から４番目のアミノ酸はＰｒｏまたはＡｒｇと推定され、ＮＡＳのＣ末端配列はＣ末端側からＮＬＳＰ／Ｒであることが確認された。

（４）一次構造の決定
以上の方法により決定されたアミノ酸配列は、配列表の配列番号２及び図７に示す通りである。尚、図７において、４行目のＮはＮ末端から決定したアミノ酸配列部分を示し、Ｃ１〜１４はｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ消化から得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示し、Ｄ１〜４は、ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ消化から得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示し、Ｔ１〜４はｔｒｙｐｓｉｎ消化から得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示す。また、←はＣ末端から得られた配列を示す。

実施例２において得られたネオクリンを構成するＮＢＳ画分のアミノ酸配列を、実施例３と同様の手順に従い解析した。
その結果、ＮＢＳのアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列からなり、特開平６−１８９７７１公報において既に開示されているポリペプチドであるクルクリンＢのアミノ酸配列とほぼ完全に一致したが、Ｃ末端にＧｌｙが付加されており、クルクリンＢのアミノ酸残基数１１４よりも１残基長かった。

実施例２において得られたネオクリンを構成するＮＡＳ画分の糖鎖修飾について、以下の手順に従い解析した。
すなわち、糖鎖付加コンセンサス配列を有するペプチド、すなわち、実施例３（２）（ｉｉ）で得た精製ＮＡＳのｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ消化ペプチドＣ１を回収し、ＡＢＥＥ糖組成分析キットプラスＳ（ホーネンコーポレーション社製）を用いて、糖鎖の糖組成を分析した。
具体的には、シアル酸の遊離処理をしてから、還元糖に変換し、引き続き、酸加水分解により、糖タンパク質糖鎖中に含まれるグリコシド結合を全て切断し、単糖に遊離した。生じた単糖は標識化をした後、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡカラム（東ソー社製、直径４．６ｍｍ×７．５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣで分離し、３０５ｎｍの吸収で検出し、分析した。
分析の結果、ＮＡＳに付加された糖鎖の糖組成は、マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン／フコース／キシロースがほぼ３／２／１／１の比であった。この結果、及び植物に一般的に見られる糖鎖構造を参考に推定されたＮＡＳに付加された糖鎖構造を図８に示す。

ネオクリンを構成するＮＡＳをコードする遺伝子を、以下の手順に従いクローニングした。

（１）ｃＤＮＡライブラリーの作成
材料には、クルクリゴ・ラチフォリアの果実（日本新薬（株） 山科植物資料館から提供された）を用いた。受粉４〜８週後の果実約２０．６ｇを液体窒素によって凍結し、解凍しないように粉砕した。このようにして得た粉末２０．６ｇを試料として、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Amersham Bioscience社製）を用いてＰｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを抽出した。
抽出したｍＲＮＡ約４．５μｇからｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Amersham Bioscience社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。ｃＤＮＡはＥｃｏＲＩアダプター連結でλＺＡＰＩＩベクター（Stratagene社製）に挿入した。これをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（Stratagene社製）を用いてファージにパッケージングし、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ´に感染させたところ、約１．２×１０^５個のプラークから成るライブラリーを得た。

（２）プローブの作成
凍結乾燥処理したクルクリゴ・ラチフォリアの果実２０ｍｇを材料とし、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。特開平６−１８９７７１号公報で開示されているＮＢＳのアミノ酸配列を元に配列表の配列番号４に記載のＮＣ１Ｓプライマー、及び配列表の配列番号５に記載のＮＣ１Ａプライマーを合成し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応（９４℃，３分，４２℃，３分、７２℃，３分を１サイクル、９４℃，３０秒、４２℃，３０秒、７２℃，１分を５０サイクル）を行ったところ、ＮＡＳの一部をコードする４６９ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片をプローブとして使用した。

（３）プラークハイブリダイゼーション
（１）で得たライブラリーのうち、２ｘ１０^４個のプラークをナイロンメンブレンに移してＤＮＡを固定した後、（２）で作成したプローブを用い、６５℃でハイブリダイゼーションを行った。洗浄は０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用い６５℃で行った。その結果、約１００個のプラークがプローブとハイブリダイズした。強いシグナルを示す２５個のプラークについて、２次スクリーニングを行い、シングルプラークに分離した。

（４）塩基配列の決定
（３）で得たシングルプラークファージをヘルパーファージとＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ´に共感染させｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎすることでλＺＡＰＩＩベクターからインサートｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を切り出した。ｃＤＮＡの塩基配列をジデオキシ法により決定した。
その結果、決定された塩基配列は配列表の配列番号１に示すとおりであった。配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は、実施例４で得られたＮＡＳのアミノ酸配列（配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列）と一致していた。
また、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７からなる部分には、ＮＡＳのアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見出された。このことから、ＮＡＳはシグナルペプチド及び延長ペプチドを含む前駆体ペプチド（ＰＮＡＳ）の形で産生されることが確認された。塩基番号４〜４７７からなる塩基配列がコードするＰＮＡＳのアミノ酸配列は、配列表の配列番号３に記載するとおりである。

ネオクリンを添加した野菜ジュースを、以下の手順に従い調製し、その味覚改変活性を評価した。
細かく切った新鮮なほうれん草１３５ｇ、ピーマン６５ｇ、セロリ６５ｇ、及びレモン汁２５ｇに水３００ｍｌを加えてミキサーで５分間懸濁し、これを孔計０．１ｍｍのナイロンメッシュでろ過して、約４００ｍｌの野菜ジュースを得た。この野菜ジュース１００ｍｌに実施例１の精製ネオクリン粉末を５０ｍｇ添加したものを高濃度添加野菜ジュース、１０ｍｇ添加したものを低濃度添加野菜ジュースとし、無添加野菜ジュースを対照サンプルとして、パネラー４名により官能評価を行った。評価点は無添加野菜ジュースの苦味、えぐ味、及び甘味をそれぞれ０点とし、それぞれの味において、顕著に増強された時を２点、増強された時を１点、顕著に低減された時を−２点、低減された時を−１点とした。評価結果の平均値を表２に示す。

表２の結果から、本発明のネオクリンは、苦味及びえぐ味を顕著に低減すると共に、甘味を付与することにより食品の嗜好を高める効果があることが確認された。

ネオクリンを添加したグレープフルーツ果汁を、以下の手順に従い調製し、その味覚改変活性を評価した。
グレープフルーツ果汁１００ｍｌに実施例１の精製ネオクリン粉末を１０ｍｇ添加したものを高濃度添加サンプル、５ｍｇ添加したものを低濃度添加サンプルとし、無添加グレープフルーツ果汁を対照サンプルとして、パネラー４名により官能評価を行った。評価点は対象サンプルの苦味、酸味、及び甘味をそれぞれ０点とし、それぞれの味において、顕著に増強された時を２点、増強された時を１点、顕著に低減された時を−２点、低減された時を−１点とした。評価結果の平均値を表３に示す。

表３の結果から、本発明品のネオクリンは、苦味を顕著に低減すると共に、酸味を抑制し、甘味を付与することにより食品の嗜好を高める効果があることが確認された。

ネオクリンを添加した寿司ネタ用調味液を、以下の手順に従い調製し、その味覚改変活性を評価した。尚、ここでいう寿司ネタ用調味料とは、生のまま、又は一旦加熱処理した寿司用の寿司ネタに予め塗布したり、浸漬したりして寿司ネタを調味するための調味料である。
寿司ネタ用調味料の組成は、表４に示す通りとした。尚、寿司ネタ用調味料は、使用時は寿司ネタの種類、量に応じて適宜、水で希釈して用いるため、本実施例においては２倍希釈して用いた。

希釈済寿司ネタ用調味液１００ｍｌに、実施例１の精製ネオクリン粉末１１．３ｍｇを添加してネオクリン添加調味液を得た。このネオクリン添加調味液に海老を２０分間浸漬して海老の寿司ネタ（ネオクリン添加サンプル）を得た。一方、ネオクリン粉末を添加しないままの希釈済寿司ネタ用調味液にも同様に海老を浸漬して海老の寿司ネタ（対照サンプル）を得た。パネラー４名が、ネオクリン添加サンプル及び対照サンプルを各一尾ずつ食することにより、各サンプルのえぐ味の強さを評価した。その結果、ネオクリン添加サンプルは、対照サンプルに比べて、えぐ味が顕著に抑制されることが確認された。

ネオクリンの味覚改変活性とクルクリンの味覚修飾活性とを、以下の手順で比較した。

（１）クルクリンの調製
まず、特開平６−１８９７７１号公報の実施例１〜１２において開示されている方法により、クルクリンＢを発現させた。
その後、クルクリンＢを発現している形質転換大腸菌を超音波発生装置により破壊した懸濁液を、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて遠心分離により４回洗浄した。これを８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴを含む５００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、３７℃で２．５時間還元した。この溶液に、１０倍量の８Ｍ尿素、０．１１Ｍ酸化型グルタチオンを含む５００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、室温で３時間静置し、タンパク質をグルタチオン化した。このグルタチオン化タンパク質に、１０倍量の４ｍＭシステインを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、４℃で２日間反応させた後、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に透析することでホモダイマーを形成させた。その後、凍結乾燥することで、クルクリンＢのホモダイマーであるクルクリン粉末を得た。

クルクリンＢがホモダイマーを形成していることは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。すなわち、クルクリン粉末１０μｇを、ゲル濃度１５％でＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色を行ったところ、図９に示す通り、非還元下で約２０ｋＤａの位置に単一バンドが見られ、還元下では約１１ｋＤａの位置に１本のバンドが見られることを確認した。該ホモダイマー、クルクリンを用いて以下の官能検査を行った。

（２）味覚改変活性及び味覚修飾活性の比較
実施例１で得た精製ネオクリンを、３０、５０、７５、１００μｇ／ｍｌの各濃度となるように、また、（１）で得たクルクリンを、１００μｇ／ｍｌとなるように、水に溶解した。１００μｇ／ｍｌクルクリン溶液５００μｌを口に含み、溶液を吐き出した後、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸を口に含んだ時の甘さを基準として、各濃度のネオクリン溶液５００μｌを口に含み、溶液を吐き出した後、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸を口に含んだ時の甘さをパネラー３名で評価した。その際、クルクリン溶液時の甘さに比べて、同等の甘味の時は０点、やや甘味が強い時は１点、甘味が強い時は２点、著しく甘味が強い時は３点、やや甘味が弱い時は−１点、甘味が弱い時は−２点、著しく甘味が弱い時は−３点とした。評価結果の平均値を表５に示す。

表５の結果から、ネオクリンの有する味覚改変活性は、クルクリンの味覚修飾活性よりも著しく強いことが確認された。

ＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡを含むベクターとＮＢＳをコードする遺伝子のＤＮＡを含むベクターを用いて麹菌でのネオクリンの発現を確認した。
麹菌の一種であるアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）などの糸状菌を用いた異種タンパク質生産では、宿主分泌タンパク質との融合タンパク質として発現することにより、大量に生産することが可能である。また、ゴルジ体に局在するプロテアーゼであるＫＥＸ２の切断配列を融合部位に挿入することで、目的のタンパク質のみを分泌させることができる（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Appl．Environ．Microbiol．）」、６３巻、ｐ４８８−４９７、１９９７年参照）。
本実施例ではアスペルギルス・オリゼで最も大量に分泌されるタンパク質であるα−アミラーゼをキャリアーにして、ＮＡＳをコードする遺伝子とＮＢＳをコードする遺伝子を発現させて、ネオクリンの生産をおこなった。
発現の手順は、以下に示す通りとした。

（１）組換えベクターの作製
ベクター構築キット（Multisite Gateway Three-Fragment Vector Construction Kit；Invitrogen社製）を使用して組換えベクター（ｐｇＦａ３ＧＮａＳＪ及びｐｇＦａ３ＧＮｂＴａ）を作製した。
このキットを用いた方法は、（ａ）５’エントリークローンの作製、（ｂ）目的遺伝子エントリークローンの作製、（ｃ）３’エントリークローンの作製、（ｄ）３種類のエントリークローンとデスティネーション・ベクターとの組換え反応による発現ベクターの作製、の順でコンストラクションを行うものである。
具体的には、以下に示すような手順及び条件にて実施した。

（ａ）５’エントリークローンの作製
馬橋らの方法（例えば、２００４年日本農芸化学会要旨集、ｐ．２４、２００４年参照）に従って、５‘エントリークローン（ｐｇ５’ＰＦａ）を作製した。
すなわち、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＲＩＢ４０株（独立行政法人酒類総合研究所にＲＩＢ Ｎｏ．４０として保存され、入手可能）のゲノムを鋳型とし、配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー１（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＧＡＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＴＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴ−３’、但し下線はａｔｔＢサイト配列を示す）と、配列表の配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー２（５’−ＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡ−３’、但し下線はａｔｔＢサイト配列を示す）とを使用したＰＣＲを行って、ａｍｙＢプロモーター及びそのＯＲＦの配列を増幅した。

ＰＣＲによって得られた増幅断片を、ドナーベクターｐＤＯＮＲ Ｐ４−Ｐ１Ｒ（Invitrogen社製）にａｔｔＢサイトとａｔｔＰサイトの組換え反応（ＢＰ組換え反応）を利用して導入し、５’エントリークローン（以下、ｐｇ５’ＰＦａと称する）を得た。その後、ｐｇ５’ＰＦａを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。

（ｂ）目的遺伝子エントリークローンの作製
目的遺伝子のうち、ＮＡＳをコードする遺伝子のエントリークローン（ｐｇＥ３ＧＮａ）は、以下のようにして作製した。すなわち、ＮＡＳをコードする遺伝子のｃＤＮＡクローンのうち、ＮＡＳの成熟領域（^２３Ａｓｐ〜^１３５Ａｓｎをコードする部分、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる部分）を鋳型とし、Ｎ末端の前にＫＥＸ２切断配列（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）及び３残基のＧｌｙを付加して設計された配列表の配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー３（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣ−３’、但し下線はａｔｔＢサイト配列を示す）と、Ｃ末端の後に終止コドンを含む塩基配列を付加して設計された配列表の配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー４（５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣ−３’、但し、下線はａｔｔＢサイト配列を示す）とを使用したＰＣＲを行った。
ＰＣＲによって得られた増幅断片を、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（Invitrogen社製）にＢＰ組換え反応を利用して導入し、ＮＡＳをコードする遺伝子のエントリークローン（以下、ｐｇＥ３ＧＮａと称する）を得た。その後、ｐｇＥ３ＧＮａを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。

ＮＡＳをコードする遺伝子のエントリークローン（ｐｇＥ３ＧＮｂ）についても、基本的には上記ＮＡＳをコードする遺伝子の場合と同様に行った。すなわち、ＮＢＳをコードする遺伝子のｃＤＮＡクローンのうち、ＮＢＳの成熟領域（^２３Ａｓｐ〜^１３７Ｇｌｙをコードする部分、配列表の配列番号１７記載の塩基配列のうち塩基番号６７〜４１１からなる部分）を鋳型とし、Ｎ末端の前にＫＥＸ２切断配列及び３残基のＧｌｙを付加して設計された配列表の配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマー５（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＧ−３’、但し下線はａｔｔＢプライマー配列）と、Ｃ末端の後に終止コドンが入る配列を付加して設計された配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマー６（５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＡＣＧＧＣＧ−３’、但し下線はａｔｔＢプライマー配列）とを使用したＰＣＲを行った。
ＰＣＲによって得られた増幅断片を、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（Invitrogen社製）にＢＰ組換え反応を利用して導入し、ＮＢＳをコードする遺伝子のエントリークローン（以下、ｐｇＥ３ＧＮｂと称する）を得た。その後、ｐｇＥ３ＧＮｂを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。

（ｃ）３’エントリークローンの作製
馬橋らの方法（例えば、２００４年日本農芸化学会要旨集、ｐ．２４、２００４年参照）に従って、３’エントリークローン（ｐｇ３’ｓＣＪ及びｐｇ３’Ｔａ）を作製した。
まず、ａｍｙＢターミネーター及びAsperugillus nidulansのｓＣ遺伝子を組み込んだ３’エントリークローンは、以下のようにして得た。すなわち、ｐｇＤＳＮ（ａｍｙＢターミネーター及びAsperugillus nidulansのＡＴＰスルフリラーゼ（ｓＣ）遺伝子の配列（配列表の配列番号１８に記載の塩基配列）を組み込んであるプラスミド）を鋳型とし、配列表の配列番号１３に示したプライマー７（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡ−３’、但し下線はａｔｔＢプライマー配列を示す）と、配列表の配列番号１４に示したプライマー８（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧ−３’、但し、下線はａｔｔＢプライマー配列を示す）を使用しＰＣＲを行って、ａｍｙＢターミネーター及びAsperugillus nidulansのｓＣ遺伝子の配列を増幅した。
ＰＣＲによって得られた増幅断片を、ドナーベクターｐＤＯＮＲＰ２Ｒ−Ｐ３（Invitrogen社製）にＢＰ組換え反応を利用して導入し、３’エントリークローン（以下、ｐｇ３’ｓＣＪと称する）を得た。その後、ｐｇ３’ｓＣＪを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。

また、ａｍｙＢターミネーターのみを持つ３’エントリークローン（ｐｇ３’Ｔａ）は、上記ｐｇ３’ｓＣＪと同様の手順で得た。
すなわち、配列表の配列番号１８に記載の塩基配列を鋳型として、配列表の配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマー９（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧ−３’、但し下線はａｔｔＢプライマー配列を示す）と、配列表の配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー１０（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＡＡＴＡＧＡＣＴＡＧＣＧＴＧＣ−３’、但し下線はａｔｔＢプライマー配列を示す）を使用し、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲによって得られた増幅断片を、ドナーベクターｐＤＯＮＲＰ２Ｒ−Ｐ３（Invitorogen社製）にＢＰ組換え反応によって導入し、３’エントリークローン（以下、ｐｇ３’Ｔａと称する）を得た。その後、大腸菌ＤＨ５α株に導入して得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。

（ｄ）３種類のエントリークローンとデスティネーション・ベクターとの組換え反応による発現ベクターの作製
ＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡを導入した組換えベクター、すなわちＮＡＳ発現ベクター（以下、ｐｇＦａ３ＧＮａＳＪと称する）は、以下のようにして作製した。
すなわち、上述の（ａ）で得られたｐｇ５’ＰＦａと、（ｂ）で得られたｐｇＥ３ＧＮａと、（ｃ）で得られたｐｇ３’ｓＣＪの３種類のエントリークローンを、デスティネーション・ベクターｐＤＥＳＴＲ４−Ｒ３（Invitrogen社製）と混合し、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｐｌｕｓ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを加え、ａｔｔＬサイトとａｔｔＲサイトの組換え反応（ＬＲ組換え反応）を行った。その結果得られる組換えベクターを大腸菌ＤＨ５α株に導入して形質転換し、得られたコロニーを増殖させた後、目的の組換えベクターとして、ｐｇＦａ３ＧＮａＳＪを抽出した。
このようなｐｇＦａ３ＧＮａＳＪの作製過程及び構造の概略を、図１０に示した。

ＮＢＳをコードする遺伝子のＤＮＡを導入した組換えベクター、すなわちＮＢＳ発現ベクター（以下、ｐｇＦａ３ＧＮｂＴａと称する）は、以下のようにして作製した。
すなわち、上述の（ａ）で得られたｐｇ５’ＰＦａと、（ｂ）で得られたｐｇＥ３ＧＮｂと、（ｃ）で得られたｐｇ３’Ｔａの３種類のエントリークローンを、デスティネーション・ベクターｐＤＥＳＴＲ４−Ｒ３（Invitrogen社製）と混合し、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｐｌｕｓ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを加え、ＬＲ組換え反応を行った。その結果得られる組換えベクターを大腸菌ＤＨ５α株に導入して形質転換し、得られたコロニーを増殖させた後、目的の組換えベクターとしてｐｇＦａ３ＧＮｂＴａを抽出した。
このようなｐｇＦａ３ＧＮｂＴａの作製過程及び構造の概略を、図１１に示した。

このようにして得られた組換えベクター（ｐｇＦａ３ＧＮａＳＪ及びｐｇＦａ３ＧＮｂＴａ）は、以下に示す３つの特徴をもつ。
まず、第一の特徴は、キャリアータンパク質としてα−アミラーゼを用い、ＮＡＳ及びＮＢＳとα−アミラーゼとの融合タンパク質を発現させるべく、α−アミラーゼをコードする遺伝子を、ＮＡＳ及びＮＢＳをコードする遺伝子と共に導入したことである。
タンパク質を、本来の由来生物以外の異種を宿主として生産する場合、特に宿主としてアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）を用いた報告としては、宿主の分泌タンパク質であるグルコアミラーゼ（ＧｌａＡ）をキャリアーとして用い、その結果、生産量が増加したという報告がある（「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotechnol．Biochem．）」、５８巻、５号、ｐ．８９５−８９９、１９９４年）。しかし、他の分泌タンパク質をキャリアーとして用いることは検討されていない。今回、本発明者らは、アスペルギルス・オリゼが最も大量に分泌する酵素であるα−アミラーゼを用い、分泌経路での異種タンパク質の安定化及び生産量の増加を試みた。

第二の特徴は、α−アミラーゼとＮＡＳ又はＮＢＳとの連結部分に、ＫＥＸ２の認識配列（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）を導入したことである。
麹菌のゴルジ体中には、ＫＥＸ２様のプロテアーゼが存在する。ＫＥＸ２プロテアーゼとは、塩基性アミノ酸対（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、及びＡｒｇ−Ａｒｇ：ＫＥＸ２の認識配列）を認識し、そのＣ末端を切断するセリンプロテアーゼである。つまり、これらのＫＥＸ２の認識配列を持つタンパク質が小胞体（ＥＲ）からゴルジ体へと移行すると、ゴルジ体内でＫＥＸ２様プロテアーゼにより切断される。従って、ＫＥＸ２の認識配列を導入することにより、融合タンパク質であるα−アミラーゼとＮＡＳ又はＮＢＳとの間が切断され（プロセシング）、ＮＡＳ又はＮＢＳを単独で得ることができる。

第三の特徴は、切断効率が改良された点である。
上記したＫＥＸ２による切断は、ＫＥＸ２の認識配列付近の立体構造によって不正確になされることがある。ネオクリンはヘテロ２量体を形成し、切断部位付近の立体構造が複雑であることが予想されたため、ＮＡＳ及びＮＢＳのＮ末端のＡｓｐの直前に３残基のＧｌｙを挿入して、切断効率と切断の正確性の改良を行った。

（２）形質転換体の作製
形質転換はプントらの方法（「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol．）」、２１６巻、ｐ．４４７−４５７、１９９２年）の方法を改変して、以下のようにして行った。

（ａ）プロトプラストの調製
ＰＤプレート（１リッターの水に対して３９ｇのポテトデキストロース（ニッスイ社製）を溶解しオートクレーブした後、滅菌済みプレートに分注）に、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＮＳ４株（ｓＣ，ｎｉａＤ）を滅菌した竹串に塗布し、７日間３０℃でインキュベーションして分生子を生育させた。
これを１００ｍｌのＤＰＹ液体培地（２％Ｄｅｘｔｒｉｎ、１％Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．５％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．５）に、竹串で掻き入れ３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養した後、滅菌したミラクロス（Calbiochem社製）で菌体を回収し、滅菌水で洗浄した。
１０ｍｌのＳｏｌ−１（１％Ｙａｔａｌａｓｅ（宝酒造社製）、０．６Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５０ｍＭ Ｍａｌｅａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を入れたＬ字管に菌体を移し、３０℃で３時間やさしく振とうしプロトプラスト化した。

（ｂ）発現ベクターの導入−適当量の発現ベクターを共形質転換と栄養要求培地による選択と形質の安定化
得られたプロトプラストをミラクロスに通し菌体残渣を除去し、等量のＳｏｌ−２（１．２Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、２０００ｒｐｍ、４℃、ｂｒｅａｋ ｏｆｆで遠心した。
沈殿をＳｏｌ−２で２回洗浄後、２００μｌのＳｏｌ−２に１×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌになるようにＳｏｌ−２に懸濁した。

ＮＡＳ導入プラスミドを２μｇ、ＮＢＳ導入プラスミドを１０μｇずつ加え、３０分氷上でインキュベートした。２５０μｌ、２５０μｌ、８５０μｌと段階的にＳｏｌ−３（６０％ＰＥＧ４０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、やさしく混合し２０分室温放置した。５〜１０ｍｌのＳｏｌ−２を加えて遠心後、５００μｌのＳｏｌ−２に懸濁した。

懸濁液を予め分注し保温しておいた５ｍｌのＴｏｐ Ａｇａｒ（１．２Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ入り）に加え、下層培地（ＭＳプレート；１．２ Ｍ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、０．２％ ＮＨ_４Ｃｌ、０．１％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．０５％ＫＣｌ、０．０５％ ＮａＣｌ、０．１％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００２％ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２％ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％Ａｇａｒ、ｐＨ５．５）に流し込んだ。
その後、パラフィルムをまき空気穴を開け３０℃で３〜５日インキュベートした。得られたコロニーをＭプレート（０．２％ ＮＨ_４Ｃｌ、０．１％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．０５％ ＫＣｌ、０．０５％ ＮａＣｌ、０．１％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００２％ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２％ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％Ａｇａｒ、ｐＨ５．５）に３回植えついで形質を安定させた。１プレートにつき３０株の形質転換体が得られた。

（３）ネオクリン生産株の選抜
（ａ）ＤＰＹ液体培地（ｐＨ８．０）による小スケールでの生産と培養液の回収
上記（２）形質転換体の作製で得られた形質転換体１２株をＭプレートに塗布し、３０℃で２〜４日インキュベートした。オートクレーブした竹串で分生子を掻き取り２０ｍｌのＤＰＹ液体培地（ｐＨ８．０）（ＤＰＹ液体培地（ｐＨ５．５）の試薬の組成のうち、０．５％ＫＨ_２ＰＯ_４を０．５％Ｋ_２ＨＰＯ_４に替え、１Ｍ ＮａＯＨ溶液でｐＨを８．０に調整）を入れた１００ｍｌフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで３日間振とう培養した。培養液から菌体をミラクロスで分離し回収した。

（ｂ）生産株の選抜とウェスタンブロッティング解析
回収した培養液を還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）に供した後、ＰＶＤＦ膜（Millipore社製）に転写しウェスタンブロッティング解析を行った。
転写終了後の膜を５％スキムミルクを含むＴＢＳＴに浸し、６０分室温でゆるやかに振とうさせた。２．５ｍｌの５％スキムミルクを含むＴＢＳＴに０．５μｌの抗ネオクリン抗体を１次抗体として加えプラスチックバッグに入れ室温で６０分放置した。ＴＢＳＴで膜を１０分ずつ３回洗浄したのち、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴに２．５μｌのアルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を２次抗体として加えプラスチックバッグに入れ室温で６０分放置した。ＴＢＳＴで膜を１０分ずつ３回洗浄したのち、１０ｍｌの反応液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）に、基質として６６μｌのＮＢＴと３３μｌのＢＣＩＰを加え、これを遮光条件で数分間反応させ発色させた。その結果を図１２に示した。

その結果、クルクリゴ果実から精製したネオクリン標品の分子量と、形質転換体により産生された２つのサブユニットのバンドの割合（図１２の矢印）を考慮して１２株の形質転換体の中から＃２株を選抜した。ここに選択された＃２株は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＮＳ−ＮＡＢ２株と命名され、日本国茨城県つくば市中央第６の独立行政法人特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２０９として寄託されている。

（４）大量培養
（ａ）分生子の回収
上記（３）ネオクリン生産株の選抜で得られた形質転換体（＃２株）の分生子を、ＰＤプレートに竹串で塗りつけ３０℃で３〜７日間インキュベートした。分生子が成長したプレートに１０ｍｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を注ぎ滅菌スポイト（Sarstedt社製）で分生子を掻き取った。
これを１５ｍｌファルコンに回収し、１分間激しく攪拌したのち、滅菌したミラクロスで菌体残渣を取り除いた。４℃で４０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を捨て１０ｍｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え攪拌した。同じ操作をもう１度繰り返した後、４℃で４０００ｒｐｍ、５分遠心し、上清を捨て沈殿を１ｍｌの滅菌水に溶解した。回収液のうち数μｌを水で１０倍程度に希釈しトーマ血球計算版を用いて分生子の数を計測した。

（ｂ）ＤＰＹ液体培地（ｐＨ８．０）での大量振とう培養
ＤＰＹ液体培地（ｐＨ８．０）を１２０ｍｌずつ、５００ｍｌフラスコに加えたものを５つ用意した。それぞれに分生子を１×１０^７ｃｅｌｌ／ｌとなるように加え、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。培養液から菌体をミラクロスで分離し約４００ｍｌを回収した。

（５）組換えネオクリンの精製
（ａ）硫安分画
上記（４）の大量培養で回収した培地に、飽和硫安濃度が６０％になるように硫安を加えたのち３０分インキュベートした。１００００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心し沈殿を回収した。

（ｂ）フェニル疎水カラムクロマトグラフィーによる精製
硫安分画して得られた沈殿をＢｕｆｆｅｒＡ（３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ、ｐＨ５．０）に溶解したのち、ＢｕｆｆｅｒＡに対して１晩透析した。回収後、溶液を０．４５μｍフィルターでろ過したものをサンプルとした。
カラムはＨＩＣ ＰＨ−８１４（２０×１５０ｍｍ）（Ｓｈｏｄｅｘ社製）を用い、０〜２０分まではＢｕｆｆｅｒＡ、２０〜９０分の間はＢｕｆｆｅｒＡに対してＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ、ｐＨ５．０）を、０から１００％のグラジェント、さらに、９０〜１１０分まではＢｕｆｆｅｒＢを移動相として、流速３．０ｍｌ／ｍｉｎの条件で、フェニル疎水カラムクロマトグラフィーによる分画（検出；２８０ｎｍ）を行った（図１３（ａ））。得られた画分（Ｆｒ．１〜５）を電気泳動した後、ウェスタンブロッティング解析したところ（図１３（ｂ））、組換えネオクリン（ＮＡＳとＮＢＳのヘテロダイマー）は、Ｆｒ．１に溶出し、Ｆｒ．２〜５では主にＮＡＳのホモダイマーと見られるバンドが検出された。Ｆｒ．１を回収し、さらに精製を進めた。（図１３）。

（ｃ）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製
フェニル疎水カラムクロマトグラフィーによる精製で得られたＦｒ．１画分を水に対して透析後、凍結乾燥したのち少量の水に溶解したものをサンプルとした。
カラムはＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷ（７．５×３００ｍｍ）（ＴＯＳＯＨ社製）を用い、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ、ｐＨ５．０を移動相として、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎの条件で、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる分画（検出；２８０ｎｍ）を行った（図１４（ａ））。
Ｆｒ．１〜４を個々に回収し、それぞれを水に対して透析後、凍結乾燥したのち少量の水に溶解した。これを還元条件又は非還元条件の下で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、ＣＢＢ染色（図１４（ｂ））及びウェスタンブロッティング解析（図１４（ｃ））を行った結果、組換えネオクリンはＦｒ．３及びＦｒ．４に溶出し低ることが明らかとなった。

Ｆｒ．１〜４のうち、Ｆｒ．３（レーン３）とＦｒ．４（レーン４）には還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約１３ｋＤａの位置にＮＡＳとみられるスメアなバンド（図１４（ｂ）の黒矢印）が見られ、また、約１１ｋＤａの位置にＮＢＳとみられるバンド（図１４（ｂ）の白矢印）が検出された。
また、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、約２０ｋＤａの位置にヘテロダイマーとみられるバンドが検出された（図１４（ｂ）中の黒矢尻）。
尚、Ｆｒ．３には目的タンパク質であるネオクリン以外の不純タンパク質（ウェスタンブロッティング解析では検出されない）が多量に含まれていた。一方、Ｆｒ．４はネオクリンタンパク質の含量が高いことが明らかになった。

更に、Ｆｒ．４の還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１３ｋＤａ及び１１ｋＤａの位置のバンド（図１４中、左下図のレーン４の矢印）についてＰＶＤＦ膜に転写したのちアミノ末端配列を解析したところ、１３ｋＤａの位置のバンドのタンパク質はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒであり、また、１１ｋＤａの位置のバンドのタンパク質はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒであって、これらはそれぞれ、ＫＥＸ２による切断効率を高めるためにＮ末端に付加した３つのＧｌｙに続く、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜６部分、配列表の配列番号６記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜６部分に該当していたことから、ＮＡＳ及びＮＢＳを意味していることが分かった。このことから、いずれも正確な位置でプロセシングされた組換えネオクリンが得られたことが明らかとなった。

（６）組換えネオクリンの味覚改変活性確認
精製した組換えネオクリンを０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解し、味覚改変活性評価をおこなった。
０．０２Ｎのクエン酸を２００μｌ味わって酸味を感じたのち、２０μｌの組換えネオクリン溶液を味わい舌になじませた。その後、再度クエン酸を２００μｌを味わったところ、酸味の抑制と甘味が感じられ味覚修飾活性が確認された。
これは同濃度の標品（０．３ｍｇ／ｍｌ）と同程度の比活性であり、組換えネオクリンを味わった後１０分後にクエン酸を味わってもその活性は維持されていた。また水を摂取しても甘味は感じられおよそ６０分程度にわたってその活性は確認できた。
以上の結果から、ＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡを含むベクターとＮＢＳをコードする遺伝子のＤＮＡを含むベクターを用いることにより、麹菌による味覚修飾活性を持ったネオクリンの発現が可能であることが確認された。

本発明により、優れた味覚改変活性を有し、クルクリンとは異なりヘテロダイマー構造を取る新規な二量体タンパク質ネオクリンが提供され、当該タンパク質を用いて、食品等に実用可能な新規な味覚改変組成物を提供することが可能となった。
また、本発明により、当該タンパク質を構成するサブユニットのアミノ酸配列が提供され、このアミノ酸配列通りに、適当な合成方法によって当該タンパク質を提供することが可能となった。
さらには、本発明により、当該タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡが提供されたことで、適当な宿主を選び、特に麹菌を宿主として、遺伝子工学技術を用いて効率的に当該タンパク質を提供することが可能となった。

Claims (16)

1. 下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すポリペプチドＮＡＳ。
   （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
   （ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
2. マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン／フコース／キシロースの比が３／２／１／１で構成されるＮ結合型糖鎖が付加された請求項１に記載のポリペプチドＮＡＳ。
3. 下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡ。
   （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
   （ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
4. 下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すＤＮＡである請求項３に記載の遺伝子のＤＮＡ。
   （Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
   （Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
   （ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
5. 下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドＰＮＡＳ。
   （Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
   （ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
6. マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン／フコース／キシロースの比が３／２／１／１で構成されるＮ結合型糖鎖が付加された請求項５に記載のポリペプチドＰＮＡＳ。
7. 下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドＰＮＡＳをコードする遺伝子のＤＮＡ。
   （Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
   （ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
8. 下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すＤＮＡである請求項７に記載の遺伝子のＤＮＡ。
   （Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
   （Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４〜４７７からなる塩基配列から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチドＮＡＳとなった後に、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
   （ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
9. 請求項１又は２に記載のポリペプチドＮＡＳと下記の（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチドＮＢＳとからなり、味覚改変活性を有することを特徴とする二量体タンパク質ネオクリン。
   （ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
10. 請求項９に記載の二量体タンパク質ネオクリンを有効成分として含有することを特徴とする味覚改変組成物。
11. 請求項３又は４記載のＤＮＡ、若しくは請求項７又は８に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
12. ベクターが、真核生物で機能するベクターである請求項１１記載の組換えベクター。
13. ベクターが、糸状菌で機能するベクターである請求項１１記載の組換えベクター。
14. ベクターが、麹菌で機能するベクターである請求項１１記載の組換えベクター。
15. 請求項１１記載の組換えベクター、請求項１２記載の組換えベクター、請求項１３記載の組換えベクター、又は、請求項１４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
16. 請求項１５に記載の形質転換体を培養することを特徴とする請求項９に記載のネオクリンの製造方法。

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