JP4731350B2 - 抗老化剤、皮膚化粧料及び美容用飲食品 - Google Patents

Description

本発明は、植物抽出物を含有するＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、抗老化剤、皮膚化粧料及び美容用飲食品に関する。

皮膚は角層、表皮、基底膜及び真皮から構成されている。基底膜は表皮真皮境界部に存在し、表皮と真皮を繋ぎ止めるだけでなく、皮膚機能の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献１参照）。基底膜の主要骨格はＩＶ型コラーゲンからなる網目構造をしている。基底膜と表皮の境界に存在し、基底膜と表皮を繋ぎとめているのがラミニン５を主成分とする各種糖蛋白質である。若い皮膚においては、基底膜の働きにより表皮、真皮の相互作用が恒常性を保つことで水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。

ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンや、ラミニン５は分解・変質を起こし、基底膜構造が破壊される（非特許文献２参照）。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるから、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、基底膜成分の減少、基底膜の構造変化が関与している。

近年の研究により、この変化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ；Matrix metalloproteinases）の関与が指摘されている。このＭＭＰｓの中でも、ゼラチナーゼ群に属する酵素であるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９は、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンやラミニン５を分解する酵素として知られているが、その発現及び活性は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線による基底膜成分の減少、基底膜の構造変化の原因となり、皮膚におけるシワやたるみの形成等の大きな要因となることが明らかとなっている（非特許文献３参照）。

したがって、ＩＶ型コラーゲン及びラミニン５の産生を促進することによって基底膜構造の再構築を誘導し、またＭＭＰｓの活性を阻害することにより基底膜成分の減少、基底膜の構造変化を抑制し、皮膚機能を改善する物質の開発が望まれている。

ＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有するものとしては、例えば、加水分解カゼイン、プレエキス、ブナの芽エキス、エリスリナエキス、可溶性卵殻膜、カッコンエキス及び西洋キズタエキス（特許文献１参照）、サポニン又はサポゲノール（特許文献２参照）等が知られている。

また、ラミニン５産生促進作用を有するものとしては、例えば、カッコン抽出物、カンゾウ抽出物またはそのフラボノイド画分、ヒオウギ抽出物、ジタノキ抽出物、イボツヅラフジ抽出物、コロハ抽出物および乳清抽出物（特許文献３参照）オノニス抽出物、メリロート抽出物、モヤシ抽出物、アズキ抽出物（特許文献４参照）、大豆抽出物（特許文献５参照）等が知られている。

さらに、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有するものとしては、例えば、黒霊芝抽出物（特許文献６参照）、クリ渋皮発酵物からの抽出物（特許文献７参照）等が知られている。
特開２００４−１８４７１号公報 特表２００２−５１６８３７号公報 特開２００３−１３７７６７号公報 特開２００３−１３７７６８号公報 特開２００４−２１７６１８号公報 特開２００５−２９８３９１号公報 特開２００４−３５２６３４号公報 Marinkovich MP et al.，「J. Cell. Biol.」，1992年，第199巻，p.695-703 Lavker et al.，「J. Invest. Dermatol.」，1979年，第73巻，p.59-66 Gary J. Fisher et al.，「Nature」，1996年，第379巻，第25号，p.335

本発明は、天然物の中からＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有する物質を見出し、それを有効成分として含有するＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、抗老化剤、皮膚化粧料及び美容用飲食品を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、第１に、本発明は、クロバナツルアズキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤又は抗老化剤を提供する。

第２に、本発明は、クロバナツルアズキからの抽出物を配合したことを特徴とする皮膚化粧料及び美容用飲食品を提供する。

本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤においては、前記抽出物が、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害作用及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）阻害作用を有することが好ましい。

本発明によれば、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有するクロバナツルアズキ抽出物を有効成分として含有するＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及び抗老化剤、並びに当該抽出物を配合した皮膚化粧料及び美容用飲食品を提供することができる。

以下、本発明について詳細に説明する。
〔抗老化剤，ＩＶ型コラーゲン産生促進剤，ラミニン５産生促進剤，マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤〕
本発明の抗老化剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、クロバナツルアズキからの抽出物を有効成分として含有する。

ここで、本発明において「抽出物」には、クロバナツルアズキを抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。

本発明において使用する抽出原料は、クロバナツルアズキ（学名：Phaseolus atropurpureus）である。クロバナツルアズキ（Phaseolus atropurpureus）は、本州、九州、沖縄等に分布しているマメ科インゲンマメ属に属するつる性の多年草であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る部位としては、例えば、幹部、地上部、根部、全草等が挙げられるが、好ましくは幹部である。

クロバナツルアズキ抽出物に含まれるＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有する物質の詳細は不明であるが、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、クロバナツルアズキからＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有する抽出物を得ることができる。

例えば、クロバナツルアズキを乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有する抽出物を得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。

抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。

抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。

２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１０〜９０質量部を混合することが好ましい。

抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を溶出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。

精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでもＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。

クロバナツルアズキ抽出物は、特有の匂いと味とを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。

以上のようにして得られるクロバナツルアズキ抽出物は、抗老化作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有しているため、それらの作用を利用して抗老化剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の有効成分として用いることができる。

本発明の抗老化剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、クロバナツルアズキからの抽出物のみからなるものでもよいし、クロバナツルアズキからの抽出物を製剤化したものでもよい。

クロバナツルアズキからの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化して提供することができ、他の組成物（例えば、後述する皮膚化粧料、美容用飲食品等）に配合して使用できるほか軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。

なお、本発明の抗老化剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、必要に応じてＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有する他の天然抽出物等を、クロバナツルアズキからの抽出物とともに配合して有効成分として用いることができる。

本発明の抗老化剤は、クロバナツルアズキからの抽出物が有するＩＶ型コラーゲン産生促進作用を通じて、ＩＶ型コラーゲンの産生を促進することができるとともに、クロバナツルアズキからの抽出物が有するラミニン５産生促進作用を通じて、ラミニン５の産生を促進することができる。また、本発明の抗老化剤は、クロバナツルアズキからの抽出物が有するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を通じて、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することができ、特にマトリックスメタロプロテアーゼ−２及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９の活性を阻害することができる。これにより、基底膜構造の再構築を誘導し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明の抗老化剤は、これらの用途以外にもＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤は、クロバナツルアズキからの抽出物が有するＩＶ型コラーゲン産生促進作用を通じて、ＩＶ型コラーゲンの産生を促進することができ、これにより、基底膜構造の再構築を誘導し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤は、これらの用途以外にもＩＶ型コラーゲン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

本発明のラミニン５産生促進剤は、クロバナツルアズキからの抽出物が有するラミニン５産生促進作用を通じて、ラミニン５の産生を促進することができる。これにより、基底膜構造の再構築を誘導し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のラミニン５産生促進剤は、これらの用途以外にもラミニン５産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、クロバナツルアズキからの抽出物が有するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を通じて、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することができ、特に、マトリックスメタロプロテアーゼ−２及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９の活性を阻害することができる。これにより、基底膜構造の再構築を誘導し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、これらの用途以外にもマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

なお、クロバナツルアズキからの抽出物は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）のうちのマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）の活性を阻害する作用を有するため、それらの作用を利用してマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）阻害剤の有効成分として用いることができる。

〔皮膚化粧料〕
本発明の皮膚化粧料は、クロバナツルアズキからの抽出物を配合したものである。クロバナツルアズキからの抽出物は、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用及びマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有しており、皮膚に適用した場合の使用感と安全性とに優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。この場合、クロバナツルアズキからの抽出物をそのまま配合してもよいし、クロバナツルアズキからの抽出物より製剤化した抗老化剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を配合してもよい。クロバナツルアズキからの抽出物、又は上記抗老化剤、上記ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、上記ラミニン５産生促進剤若しくは上記マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を皮膚化粧料に配合することによって、皮膚化粧料にＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を付与することができる。

クロバナツルアズキからの抽出物を配合し得る皮膚化粧料としては、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。

クロバナツルアズキからの抽出物を皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は標準的な抽出物に換算して約０．０００１〜１０質量％であり、特に好適な配合率は標準的な抽出物に換算して約０．００５〜５質量％である。

本発明の皮膚化粧料は、クロバナツルアズキからの抽出物が有するＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用及びマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌、抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、抗老化剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。

〔美容用飲食品〕
クロバナツルアズキからの抽出物は、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用及びマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有しており、消化管で消化されるようなものではないことが確認されており、安全性にも優れているため、美容用飲食品に配合するのに好適である。この場合に、クロバナツルアズキからの抽出物をそのまま配合してもよいし、クロバナツルアズキからの抽出物より製剤化した抗老化剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を配合してもよい。

ここで、「美容用飲食品」とは、美肌を図ることを目的とした飲食物、又は肌荒れ、皮膚の老化及びこれらに伴って生じる各種皮膚疾患を予防・改善することを目的とした飲食物を意味する。

クロバナツルアズキからの抽出物、又は上記抗老化剤、上記ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、上記ラミニン５産生促進剤若しくは上記マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を美容用飲食品に配合する場合、それらにおける有効成分の配合量は、使用目的、症状、性別等を考慮して適宜変更することができるが、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して、成人１日あたりのクロバナツルアズキからの抽出物の摂取量が約１〜１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。

本発明の美容用飲食品は、クロバナツルアズキからの抽出物をその活性を妨げないような任意の飲食品に配合したものであってもよいし、クロバナツルアズキからの抽出物を主成分とする栄養補助食品であってもよい。

本発明の美容用飲食品を製造する際には、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類などの任意の助剤を添加して任意の形状の飲食品にすることができる。

クロバナツルアズキからの抽出物を配合し得る美容用飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などが挙げられ、これらの飲食品にクロバナツルアズキからの抽出物を配合するときに、通常用いられる補助的な原料や添加物を併用することができる。

なお、本発明の抗老化剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、皮膚化粧料又は美容用飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。

〔製造例１〕クロバナツルアズキ抽出物の製造
細切りにしたクロバナツルアズキの幹部の乾燥物２００ｇに抽出溶媒２０００ｍＬを加え、還流抽出器で８０℃にて３時間加熱抽出し、熱時濾過した。得られた抽出液を減圧下に濃縮し、乾燥してクロバナツルアズキ抽出物を得た。抽出溶媒として、水、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比＝１：１）、エタノールを用いたときの各抽出物の収率を表１に示す。

［表１］
試 料 抽出溶媒 抽出物収率（％）
１ 水 ２０．５
２ ５０％エタノール １４．３
３ エタノール ８．４

〔試験例１〕ＩＶ型コラーゲン産生促進作用試験
製造例１で得られたクロバナツルアズキ抽出物（試料１〜３）について、以下のようにしてＩＶ型コラーゲン産生促進作用を試験した。

ヒト線維芽細胞を９６穴プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの条件下にて、試料（試料１〜３）添加培地（試料濃度：４００μｇ／ｍＬ）で７２時間培養した後、上清１００μＬをエライザプレートに移し換え４℃、一晩でプレートに吸着させたのち、溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行った。その後、１％のウシ血清アルブミンを含むリン酸生理緩衝液で、ブロッキング操作を行った。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、抗ヒトコラーゲンタイプＩＶ抗体（ウサギＩｇＧ，ノボテック社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させたのち、同様の洗浄操作を行い、発色反応を行った。

ＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）は、標準品を用いて上記ＥＬＩＳＡを行い、検量線を作成し、試料無添加時のＩＶ型コラーゲン産生量を１００％として算出した。各試料のＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）を表２に示す。

[表２]
試 料 ＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）
１ １４８
２ １６３
３ １５５

表２に示されるように、クロバナツルアズキ抽出物（試料１〜３）は、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有することが確認された。

〔試験例２〕ラミニン５産生促進作用試験
製造例１で得られたクロバナツルアズキ抽出物（試料１〜３）について、以下のようにしてラミニン５産生促進作用を試験した。

正常ヒト表皮角化細胞を２４穴プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２-９５％ａｉｒの条件下にて、試料添加培地（試料濃度：５０μｇ／ｍＬ）で２４時間培養した後、上清１００μＬをエライザプレートに移し換え、４℃、一晩でプレートに吸着させた。その後、溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行った。その後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸生理緩衝液で、ブロッキング操作を行った。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行い、抗ヒトラミニン５抗体（マウスＩｇＧ，ケミコン社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行い、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（アマシャムバイオサイエンス社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行い、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（カルビオケム社製）と反応させた後、同様の洗浄操作を行い、発色反応を行った。

ラミニン５産生促進率は（％）、試料無添加時における吸光度を１００％として算出した。各試料のラミニン５産生促進率（％）を表３に示す。

[表３]
試 料 ラミニン５産生促進率（％）
１ １３８
２ １４５
３ １４０

表３に示される結果より、クロバナツルアズキ抽出物（試料１〜３）は、優れたラミニン５産生促進作用を有することが確認された。

〔試験例３〕ＭＭＰ−２活性阻害作用試験
（１）ＭＭＰ−２の調製
ヒトＭＭＰ−２のｃＤＮＡ（Collier. I.E. et al.，「J. Biol. Chem.」，1998年，第263巻第14号，p.6579-6587）について、５’ＰＣＲプライマー（配列番号１）及び３’ＰＣＲプライマー（配列番号２）を用いて、ＭＭＰ−２の３．３ｋｂ ｃＤＮＡ断片を含むｐＳＧ−ＧｅｌＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られた^３０Ａｌａから^４７４Ｖａｌまでをコードする１．３ｋｂＰＣＲ断片をＢａｍ ＨＩ／Ｓａｌ Ｉ部位にクローン化した。なお、ｐＴＨ−７２発現ベクターは、タンデムリピートのＴ７プロモーターの下流に、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン、マルチクローニング部位、ヘキサヒスチジンタグをコードする配列、および翻訳終止コドンを含んでいる。

ヒトＭＭＰ−２は、Ｉｔｏｈらの方法（Itoh，M. et al.，「J. Biol. Chem.」，1996年，第119巻，p.667-673）により発現した。また、精製及び巻き戻し（以下「リフォールディング」という。）は、公知の方法（西村義文 大野茂雄 監修，「タンパク実験プロトコール 細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ２ 構造解析編」，1997年）に準じて行った。

すなわち、ＭＭＰ−２のｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｐＴＨ−ＭＭＰ−２）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフェクトし、ＩＰＴＧで発現誘導した。発現タンパクは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Quiagen INC.社製）を用いてアフィニティー精製後、リフォールディングを行い、酢酸４−アミノフェニル水銀と３７℃、６０分間反応を行うことで、活性型へ移行させた後、ＥＤＴＡを加えた。これを酵素標本とし、蛍光性ペプチド基質（ＭＯＣＡｃ／ＤＮＰペプチド）切断活性反応を行い、下記の条件にて高速液体クロマトグラフィーによる生成物のピーク面積を測定し、これを酵素活性の指標とした。

＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：ＬＣ−８０２０（東ソー社製）
固定相：Wakosil 5C₁₈（和光純薬工業社製）
溶離液：３０％アセトニトリル＋０．１％ＴＨＦ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：励起波長３２５ｎｍ，蛍光波長４１０ｎｍ
検出器：８２０−ＦＰ（日本分光社製）

（２）ＭＭＰ−２阻害活性の測定
試料（試料１〜３）を蒸留水に溶解させて（試料濃度：４．０ｍｇ／ｍＬ）、懸濁物を除くため、当該試料溶液をろ過した。ＭＭＰ−２阻害活性の測定は、４０μＬの活性型ＭＭＰ−２、２０μＬの試料溶液、２０μＬのアッセイバッファー（５００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)，１．５Ｍの塩化ナトリウム，１００ｍＭの塩化カルシウム，５００μＭの硫酸亜鉛，３０ｍＭのアジ化ナトリウム，０．０５％のＢｒｉｊ３５）を３７℃で１５分間プレインキュベーションした後、４．１６μＭのＭＯＣＡｃ／ＤＮＰペプチド１２０μＬを添加し、３７℃で２時間反応させた後、ＥＤＴＡ１０μＬ（２００ｍＭ）を添加した。反応液中の生成物について高速液体クロマトグラフィー分析によるピーク面積を測定した。試料溶液の代わりに蒸留水を加えた反応液の生成物についても同様に高速液体クロマトグラフィー分析によるピーク面積を測定し、下記の式に基づいて、ＭＭＰ−２阻害率（％）を求めた。

ＭＭＰ−２阻害率(％)＝(Ａ−Ｂ)／Ｃ×１００
式中、Ａは「試料溶液添加時のピーク面積」を表し、Ｂは「ブランクのピーク面積」を表し、Ｃは「コントロールのピーク面積」を表す。
結果を表４に示す。

［表４］
試 料 ＭＭＰ−２阻害率（％）
１ １１
２ １５
３ １３

表４に示すように、クロバナツルアズキからの抽出物は、優れたＭＭＰ−２活性阻害作用を有することが確認された。

〔試験例４〕ＭＭＰ−９阻害作用試験
製造例１にて得られたクロバナツルアズキ抽出物（試料１〜３）について、以下のようにしてＭＭＰ−９阻害作用を試験した。

（１）一本鎖ＤＮＡの調製
正常ヒト表皮角化細胞を３５ｍｍシャーレに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの条件下にて、２４時間培養した。培養終了後、リン酸生理緩衝液１ｍＬで洗浄し、ハンクス液１ｍＬに交換した。これにＴＯＲＥＸ ＦＬ２０ＳＥ−３０／ＤＭＲを４灯装着した紫外線照射装置を光源として紫外線ＵＶ−Ｂを５０ｍＪ／ｃｍ^２照射した。照射後直ちに試料添加培地（試料濃度：１０μｇ／ｍＬ）に交換し、２４時間培養した。培養終了後、細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（トリゾール，インビトロジェン社製）で溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加した後、遠心（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮した。濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（１０ｍＭのトリス−塩酸／１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Themal Cycler MP，タカラバイオ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（TaKaRa ExScript RT reagent Kit，RR035A，タカラバイオ社製）を用いて、ＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現量を測定するために鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。また、試料を添加せず紫外線を照射せずに培養した細胞、及び試料を添加せず紫外線を照射して培養した細胞についても、同様に総ＲＮＡを調製し、一本鎖ＤＮＡを合成した。

（２）サイバーグリーン法を用いたリアルタイム−ＰＣＲ反応
ＭＭＰ−９遺伝子増幅用プライマーとして、センスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を作製した。また、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、センスプライマー（配列番号５）及びアンチセンスプライマー（配列番号６）を作製した。

上述したようにしてそれぞれ培養した細胞から調製した一本鎖ＤＮＡ及び検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液を用いて、リアルタイムＰＣＲ装置（Real Time PCR System Smart Cycler II，Cepheid社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（SYBR Premix Ex Taq，RR041A，タカラバイオ社製）にてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「１０００００」とし、以降１０倍希釈を繰り返して、濃度値「１０００００」、「１００００」、「１００」及び「１０」の５段階の希釈系列とした。反応は、９５℃で１０秒間保温した後、９５℃で５秒間、５７℃で２０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクルごとにサイバーグリーン色素の発光量を測定した。

（３）解析
サイクルごとのサイバーグリーン色素の発光量から、ＭＭＰ−９及びＧ３ＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸に増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数をとった検量線を作成した。各発現定量用サンプルについては、増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。ＭＭＰ−９の発現量は、同一サンプルにおけるＧ３ＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、さらに試料を添加せず紫外線を照射せずに培養した細胞から調製した一本鎖ＤＮＡを用いて算出したＭＭＰ−９の発現量の補正値を１００としたときの、試料を添加せずに紫外線を照射して培養した細胞から調製した一本鎖ＤＮＡを用いて算出したＭＭＰ−９の発現量の補正値、及び試料を添加し紫外線を照射して培養した細胞から調整した一本鎖ＤＮＡを用いて算出したＭＭＰ−９の発現量の補正値を算出した。得られた補正値から下記の式に基づいてＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現抑制率（％）を算出した。

ｍＲＮＡ発現抑制率(%)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中、Ａは「試料無添加・紫外線非照射の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加・紫外線照射の補正値」を表し、Ｃは「試料添加・紫外線照射の補正値」を表す。
結果を表５に示す。

［表５］
試 料 ｍＲＮＡ発現抑制率（％）
１ ７８
２ ８７
３ ８３

表５に示すように、クロバナツルアズキ抽出物は、ＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現を抑制可能であることが確認された。このことから、クロバナツルアズキ抽出物は、優れたＭＭＰ−９阻害作用を有することが推認される。

〔配合例１〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
クロバナツルアズキ幹部５０質量％エタノール抽出物（製造例１）
０．０１ｇ
ホホバオイル ４．０ｇ
モモ葉エキス ０．１ｇ
オリーブオイル ２．０ｇ
スクワラン ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．０ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.O.） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.） ２．０ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１ｇ
サルビアエキス ０．１ｇ
加水分解コンコンキオリン ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．０ｇ
ヒノキチオール ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例２〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
クロバナツルアズキ幹部５０質量％エタノール抽出物（製造例１）
０．０５ｇ
アロエエキス ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
センブリエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例３〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
クロバナツルアズキ幹部５０質量％エタノール抽出物（製造例１）
０．０５ｇ
エイジツエキス ０．１ｇ
シャクヤクエキス ０．１ｇ
ワレモコウエキス ０．１ｇ
モノステアリン酸ポリエチレングリコール ２．０ｇ
自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５．０ｇ
ステアリン酸 ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
スクワラン １２．０ｇ
マカダミアナッツ油 ３．０ｇ
メチルポリシロキサン ０．２ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ７．０ｇ
キサンタンガム ０．２ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例４〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
クロバナツルアズキ幹部５０質量％エタノール抽出物（製造例１）
０．０１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
シソエキス ０．１ｇ
シラカバエキス ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例５〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
クロバナツルアズキ幹部５０質量％エタノール抽出物（製造例１）
０．０５ｇ
クワエキス ０．１ｇ
リョクチャエキス ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．２ｇ
キサンタンガム ０．２ｇ
ヒアルロン酸ナトリウム ０．１ｇ
ポリエチレングリコール ３．０ｇ
グリセリン ６．０ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
Ｌ−アルギニン ０．１５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例６〕
下記組成のパックを常法により製造した。
クロバナツルアズキ幹部５０質量％エタノール抽出物（製造例１）
０．０５ｇ
ヨクイニンエキス ０．１ｇ
ホップエキス ０．１ｇ
ポリビニルアルコール １５．０ｇ
ポリエチレングリコール ３．０ｇ
プロピレングリコール ７．０ｇ
エタノール １０．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．０５ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例７〕
下記組成の洗浄用化粧水を常法により製造した。
クロバナツルアズキ幹部５０質量％エタノール抽出物（製造例１）
０．０５ｇ
ラベンダーエキス ０．１ｇ
ハマメリスエキス ０．１ｇ
メリッサエキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリセリン ４．０ｇ
ジプロピレングリコール ２．０ｇ
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン
デシルテトラデシルエーテル ０．７ｇ
エタノール ３．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
香料 ０．００１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例８〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
クロバナツルアズキ幹部５０質量％エタノール抽出物（製造例１）
０．０５ｇ
ローズマリーエキス ０．１ｇ
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン １．０ｇ
テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット １．５ｇ
親油型モノステアリン酸グリセリン １．０ｇ
ステアリン酸 ０．５ｇ
ベヘニルアルコール １．５ｇ
パルミチン酸セチル ０．５ｇ
スクワラン １０．０ｇ
メチルポリシロキサン ０．５ｇ
香料 適量
１，３−ブチレングリコール ７．０ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１ｇ
キサンタンガム ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、抗老化剤、皮膚化粧料又は美容用飲食品は、皮膚の老化症状の予防・改善に有用である。

Claims (5)

1. クロバナツルアズキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＩＶ型コラーゲン産生促進剤。
2. クロバナツルアズキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするラミニン５産生促進剤。
3. クロバナツルアズキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）阻害剤。
4. 前記抽出物が、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害作用及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）阻害作用を有することを特徴とする請求項３に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）阻害剤。
5. クロバナツルアズキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。