JP4549625B2

JP4549625B2 - 人参サポニン代謝産物を有効成分とする微細乳化粒子及びその製造方法、並びにこれを含有する皮膚老化防止用の化粧料組成物

Info

Publication number: JP4549625B2
Application number: JP2002374691A
Authority: JP
Inventors: 炳煕兪; 炳永姜; 明勳廉; 大石成; 喜鏡朱; 相勳韓; 漢坤金
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2002-01-05
Filing date: 2002-12-25
Publication date: 2010-09-22
Anticipated expiration: 2022-12-25
Also published as: JP2003212776A; US20030175315A1; EP1327434B1; US20060216261A1; EP1327434A1; US8263565B2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、人参サポニンの代謝産物を有効成分とする微細乳化粒子(nanoeulsion)及びその製造方法、並びにこれを含有する皮膚老化防止用の化粧料組成物に関するものである。より詳しくは、本発明は、糖転換反応によって製造された人参サポニンの主要代謝産物、例えば、２０-O-β-Ｄ-グルコピラノシル-２０(Ｓ)-プロトパナクサジオール（以下、化合物Ｋと記す）、２０-O-β-Ｄ-グルコピラノシル-２０(Ｓ)-プロトパナクサトリオール（以下、ジンセノサイド(ginsenoside)Ｆ１と記す）、及び２０-O-[α-Ｌ-アラビノピラノシル(１→６)-β-Ｄ-グルコピラノシル]-２０(Ｓ)-プロトパナクサジオール（以下、化合物Ｙと記す）、並びにこれらの混合物を含む微細乳化粒子に関するものである。本発明の微細乳化粒子は、人参サポニンの代謝産物を高圧乳化法及び溶媒抽出法などのナノ乳化技術を用い、レシチン等の皮膚親和性乳化剤により微細な乳化粒子またはリポソーム内に乳化させることにより得られる。本発明の微細乳化粒子は、強化した皮膚透過性を有し、これにより、これを含有する化粧料組成物は、皮膚細胞増殖及びコラーゲン生合成を促進することができ、皮膚老化を効果的に防止することができる。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚は、人体の一次防御膜として体内の諸器官を温度、湿度変化、紫外線、公害物質など、外部環境の刺激から保護し、体温調節などの生体恒常性維持に重要な役割を果たしている。しかし、外部からの過度な物理的・化学的刺激、ストレス及び栄養欠乏などは、皮膚の正常機能を低下させ、弾力損失、角質化、シワ生成などの皮膚老化現象を促進するようになる。皮膚老化を防止し、健康で且つ弾力のある皮膚を維持するために、従来の各種動物、植物、または微生物から、皮膚の固有機能を維持、皮膚細胞を活性化させることができる生理活性物質を分離して含有することにより、皮膚老化を效果的に抑制できる化粧料の開発に努力して来た。
【０００３】
しかし、これらの活性物質は、効能が不十分であるか、または皮膚副作用を誘発する等、様々な問題点を持っていた。
従って、皮膚副作用を誘発せず、皮膚老化防止に効果的な化粧料を提供するために、活発な研究が進んで来た。特に、人参抽出物に対する関心が非常に高くて一貫した研究が進んでいる。これらの研究は、人参抽出物、つまり人参サポニン(ginseng saponin)と、人参サポニンを精製及び糖転換反応(酸、アルカリ加水分解反応あるいは酵素反応)して得られる人参サポニンの腸内細菌代謝産物、例えば化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙに集中している。
【０００４】
人参サポニンは、ダンマラン(dammarane)系のトリテルペン(triterpene)の非糖部のＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃位置のアルコール性ＯＨ基に、グルコース(glucose)、ラムノース(rhamnose)、キシロース(xylose)及びアラビノース(arabinose)のような糖類がエーテル結合された構造を有している。現在まで総２９種のサポニンが発見された。前記人参サポニンの各成分は、１９６４年、柴田が人参に含有された配糖体という意味で、ジンセノサイド(ginsenoside)と命名した。ジンセノサイドは、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)から分離した移動距離の順に、オレアナン(oleanane)系サポニンであるジンセノサイド-Ｒｏ、ジンセノサイド-Ｒａ、-Ｒｂ１、-Ｒｂ２、-Ｒｃ、-Ｒｄ、-Ｒｅ、-Ｒｆ、-Ｒｇ１、-Ｒｇ２、-Ｒｇ３、及び-Ｒｈ等と命名した。
【０００５】
このような人参サポニンは、７５０余種の植物に含有された他の植物のサポニンとは、化学構造が相違するだけでなく、薬理効能も異なるものと発表された。特に、人参サポニンは、薬性が非常に温和で、過量投与による毒性がないだけでなく、溶血作用も殆どないということが明らかになった。
【０００６】
また、人参サポニンを、リン脂質との複合体であるリポソーム(liposome)形態に人体皮膚に塗布した結果、老化した皮膚に活力を与え、弾力性増加、水和性増加及び皮膚の血液循環促進などの効果があると報告された（非特許文献１〜３参照）。
その後、人参サポニンを老化抑制製品の原料に応用するために、皮膚透過性を増加させるために人参アグリコン(aglycon)を生転換させ、皮膚における効能を試験した結果、人参サポニンの効能を維持していることが確認された。
【０００７】
上記の人参抽出物または人参サポニンを利用した例として、化粧料組成物が開示されており（特許文献１〜１２参照）、また、医薬組成物が開示されており（特許文献１３〜２４参照）、更に、人参サポニンの分離、精製法も開示されている（特許文献２５〜３４参照）。
【０００８】
しかし、人参サポニンは、ダンマラン非糖部のＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃位置のアルコール性ＯＨ基に、糖類がエーテル結合で連結された構造を有しているので親水性が大きく、分子量が大きいので皮膚の角質層を通過できず、皮膚内部への流入に難しさがあった。
【０００９】
一方、最近、サポニンの代謝産物に関する研究が進行されながら、人参サポニンの効能は、サポニン自体によるものだというよりは、サポニンが腸内細菌により分解されたサポニンの腸内細菌代謝産物によるものであると明らかになった。これにより、人参のサポニン成分のうち、アグリコンに糖(グルコース)が一つ付いた構造からなるジンセノサイドＲｈ１、Ｒｈ２及びＦ１と、化合物Ｋ等とが、ガン細胞及び腫瘍の増殖抑制作用、抗ガン剤の活性増大作用などの薬理作用を有していると報告されている。
【００１０】
このような研究にもかかわらず、人参サポニンから糖の一部を除去することによって得られた化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙに対して、未だに皮膚に導入させる技術や剤型化技術に関しては研究されたことがなかった。
【００１１】
【非特許文献１】
Curri. SB, Gezz, Z, Longhi, MG, Castelpietra, R：Fitoterapia, 57, 217(1986)
【非特許文献２】
Gezzi, A, Longhi, MG, Mazzoleni, R, Curri, SB：Fitoterapia, 57, 15(1986)
【非特許文献３】 Bombardelli, E. Curri, SB, Gariboldi, PL： Proc. 5^th Intl. Ginseng Sym. Seoul Korea, 11(1988)
【００１２】
【特許文献１】
米国特許第５,５６５,２０７号明細書
【特許文献２】
米国特許第５,５６７,４１９号明細書
【特許文献３】
米国特許第５,５７８,３１２号明細書
【特許文献４】
米国特許第５,６６３,１６０号明細書
【特許文献５】
米国特許第５,６２６,８６８号明細書
【特許文献６】
米国特許第５,７５３,２４２号明細書
【特許文献７】
米国特許第５,７４７,３００号明細書
【特許文献８】
米国特許第５,８５３,７０５号明細書
【特許文献９】
米国特許第６,０２７,７２８号明細書
【特許文献１０】
米国特許第６,０６３,３６６号明細書
【特許文献１１】
米国特許第６,２２１,３７２号明細書
【特許文献１２】
米国特許第６,２２８,３７８号明細書
【００１３】
【特許文献１３】
米国特許第５,５６９,４５９号明細書
【特許文献１４】
米国特許第５,５７１,５１６号明細書
【特許文献１５】
米国特許第５,５８７,１６７号明細書
【特許文献１６】
米国特許第５,６７４,４８８号明細書
【特許文献１７】
米国特許第５,６６５,３９３号明細書
【特許文献１８】
米国特許第５,６２９,３１６号明細書
【特許文献１９】
米国特許第５,７７６,４６０号明細書
【特許文献２０】
米国特許第５,７３９,１６５号明細書
【特許文献２１】
米国特許第５,９１６,５５５号明細書
【特許文献２２】
米国特許第６,０７１,５２１号明細書
【特許文献２３】
米国特許第６,０８３,５１２号明細書
【特許文献２４】
米国特許第６,２５５,３１３号明細書
【００１４】
【特許文献２５】
米国特許第５,５９１,６１１号明細書
【特許文献２６】
米国特許第５,５９１,６１２号明細書
【特許文献２７】
米国特許第５,７３６,３８０号明細書
【特許文献２８】
米国特許第５,７８９,３９２号明細書
【特許文献２９】
米国特許第５,７８０,６２０号明細書
【特許文献３０】
米国特許第５,９２２,５８０号明細書
【特許文献３１】
米国特許第５,９３５,６３６号明細書
【特許文献３２】
米国特許第６,１３２,７２６号明細書
【特許文献３３】
米国特許第６,１５６,８１７号明細書
【特許文献３４】
米国特許第６,２０７,１６４号明細書
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙを皮膚に適用できる方法を見いだすために、微細乳化法（microemulsification）に対して研究して来た。その結果、皮膚親和性乳化剤及びナノ乳化技術（nano-emulsification）を用いて、人参サポニンの代謝産物を乳化粒子またはリポソーム内に乳化させることにより得られた微細乳化粒子(nanoemulsion)が強化された皮膚透過性を有し、これにより、皮膚老化防止用の組成物に適用できることを確認した。本発明の微細乳化粒子を含有する化粧料組成物は、繊維芽細胞の増殖及びコラーゲンの生合成を促進することができ、従って、皮膚老化を効果的に防止することができる。
【００１６】
従って、本発明の目的は、人参サポニンの代謝産物を含み、強化された皮膚透過性を有する微細乳化粒子（nanoemulsion）を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、微細乳化粒子の製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、微細乳化粒子を含有することにより繊維芽細胞増殖及びコラーゲン生合成を促進することができる皮膚老化防止用の組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の微細乳化粒子は、糖転換反応により生成される人参サポニンの主要代謝産物、つまり化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙ、並びにこれらの混合物を含む。本発明の微細乳化粒子は、皮膚親和性乳化剤及びナノ乳化技術を用いて、人参サポニンの代謝産物を微細な乳化粒子またはリポソームに乳化させることにより製造できる。本発明の微細乳化粒子は、強化された皮膚透過性を有し、これにより、これを含有する化粧料組成物は、繊維芽細胞増殖及びコラーゲン生合成を促進することができ、従って、皮膚老化を効果的に防止することができる。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
以下、本発明をより詳しく説明する。
本発明は、糖転換反応によって製造された人参サポニンの主要代謝産物である化合物Ｋ(２０-O-β-Ｄ-グルコピラノシル２０(Ｓ)-プロトパナクサジオール)、ジンセノサイドＦ１(２０-O-β-Ｄ-グルコピラノシル-２０(Ｓ)-プロトパナクサトリオール)、及び化合物Ｙ（２０-O-[α-Ｌ-アラビノピラノシル(１→６)-β-Ｄ-グルコピラノシル]-２０(Ｓ)-プロトパナクサジオール）、並びにこれらの混合物を含有する微細乳化粒子に関するものである。上記代謝産物の混合物を以下では、「バイオＧＦ１Ｋ」という。本発明では、好ましくは、バイオＧＦ１Ｋが使用されるが、これは、それぞれの代謝産物への精製過程が要らないためである。より好ましくは、バイオＧＦ１Ｋは、人参精製サポニンから糖転換反応(酸、アルカリ加水分解反応あるいは酵素反応)により得られる代謝産物の混合物として、化合物Ｋを３０〜５０重量%、ジンセノサイドＦ１を５〜２５重量%、及び化合物Ｙを５〜２５重量%含む。
【００１９】
本発明の微細乳化粒子は、ナノ乳化技術を用いて、人参サポニンの代謝産物を微細な乳化粒子またはリポソーム内に乳化させることにより製造することができる。好ましくは、本発明の微細乳化粒子は、ナノメートル単位の粒子サイズを有するナノ乳化粒子である。特に、本発明の微細乳化粒子は、人参サポニンの代謝産物を高圧乳化法及び溶媒抽出法などのナノ乳化技術を用いて、レシチンまたはその誘導体のような皮膚親和性乳化剤により微細な乳化粒子またはリポソーム内に乳化させることにより製造することができる。得られる微細乳化粒子は、強化された皮膚透過性を有し、これにより、これを含有する化粧料組成物は、繊維芽細胞増殖及びコラーゲン生合成を促進することができ、皮膚老化を効果的に防止することができる。
【００２０】
上記化合物Ｋは下記化学式１で、ジンセノサイドＦ１は下記化学式２で、化合物Ｙは化学式３で表される。
【００２１】
【化４】

（式中、Ｒ₁はＯ-Ｇlcであり、Ｒ₂はＯＨであり、Ｒ₃はＨである。）
【００２２】
【化５】

（式中、Ｒ₁はＯ-Ｇlcであり、Ｒ₂はＯＨであり、Ｒ₃はＯＨである。）
【００２３】
【化６】

（式中、Ｒ₁はＯ-Ｇlc⁶-¹Ａrapであり、Ｒ₂はＯＨであり、Ｒ₃はＨである。）
【００２４】
また、上記バイオＧＦ１Ｋは、化学式１で表される化合物Ｋを３０〜５０重量%、化学式２で表されるジンセノサイドＦ１を５〜２５重量%、化学式３で表される化合物Ｙを５〜２５重量%含む。
【００２５】
一般に、疎水性物質が親水性物質より皮膚透過に効果的である。これは、皮膚の角質層中に分布されているセラミドのような細胞間地質のためである。疎水性物質は、細胞間地質との相互作用を有し、これにより皮膚の最外層をより容易に通過できる。上記化学式１〜３に示されているように、化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１、及び化合物Ｙは、人参サポニンから糖の一部を除去することにより分子量を減らし、疎水性であり、このため、皮膚透過性が増加される。
【００２６】
本発明において、バイオＧＦ１Ｋは、酸またはアルカリ加水分解、または酵素反応により人参サポニンから糖を除去した後、シリカゲルコラムを通過させて製造することができる。また、バイオＧＦ１Ｋは、シリカゲルコラム上で溶離液の極性を変化させて分画した後、ＴＬＣ上でそれぞれの人参サポニン代謝産物に分離することができる。
【００２７】
本発明で使用される酵素は、サポニン糖結合を分解するβ-グルコース分解酵素(β-glucosidase)；エキソ糖結合を分解するα,β-アラビノース分解酵素(α,β-arabinosidase)及びα,β-ラムノース分解酵素(α,β-rhamnosidase)；これらの酵素複合体などである。
【００２８】
本発明の微細乳化粒子は、人参サポニン代謝産物を微細乳化粒子の総重量に対して、１０^-10〜５０重量%の量で含有することができる。より好ましくは、代謝産物を０．００１〜３０重量%の量で含有することができる。
【００２９】
本発明の微細乳化粒子は、製法によって差異があるが、組成物の総重量に対して１０^-10〜５０重量%の量で配合される。１０^-10重量%の未満では、効能を期待できず、５０重量%を超える場合は、剤型安定度が劣るおそれがある。
【００３０】
本発明の微細乳化粒子は、その粒径が３０〜５００nm程度で、好ましくは５０〜３００nm程度が適当である。これにより、本発明の微細乳化粒子は、５００nm以上の粒径を有する通常の乳化粒子に比べて、皮膚との接触面を相対的に増加させることができ、経皮吸収面積も増加させることができる。また、皮膚角質層の細胞間地質間の隙間が約５０nm内外という点と、乳化粒子の乳化膜が柔軟性を有するという点とを勘案すると、本発明の微細乳化粒子は、細胞間地質内に容易に吸収されて拡散される。すなわち、ナノ乳化技術によって粒径が３０〜５００nmの本発明の微細乳化粒子は、皮膚との接触面の増加と、細胞間地質への浸透及び拡散という２つの経路を通じて、微細乳化粒子自体及び有効成分としてその内部に含有されている化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙの皮膚透過性を増加させることができる。
【００３１】
また、本発明において、乳化剤として使用されるレシチンは、ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、リゾホスファチジルコリン(lysophosphatidylcholine)のような不飽和コリン系化合物と；セリン系化合物と；ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine)のようなセファリン系化合物と；これらの水素添加物と；からなる群のうち選択された１種以上を含有するリポソームとして、微細乳化粒子の総重量に対して０．５〜１０重量%、好ましくは２〜５重量%の量で使用する。
【００３２】
また、陰イオン系、陽イオン系、非イオン系または両性イオン系乳化剤などの補助乳化剤をレシチンと一緒に使用することができ、レシチンの重量対比０．５〜５倍、好ましくは１〜３倍の割合で使用することができる。
また、ナノ乳化技術としては、５００〜２，５００bar圧力下での高圧乳化法または溶媒抽出法を利用することができる。
【００３３】
得られた微細乳化粒子は、皮膚老化防止用の組成物に配合される。本発明の組成物は、その剤型において、特に限定されるものではないが、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メーキャップベース、ファンデーション、染毛剤、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤、歯磨き粉または口腔清浄液などの化粧料、及びローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチまたは噴霧剤等の医薬料に剤型化される。
【００３４】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。
【００３５】
〔参考例１〕人参精製サポニンの製造
紅参２kgに水と、エタノール４リットルとを入れ、３回還流してそれぞれ抽出した後、１５℃で６日間沈積させた。その後、濾過及び遠心分離により残渣と濾液を分離し、分離された濾液を減圧濃縮した。濃縮液を水に懸濁した後、エーテル１リットルで５回抽出して色素を除去した。水層を１-ブタノール５００mlで３回抽出して得られた１-ブタノール層全体を５%ＫＯＨで処理した後、蒸溜水で洗浄した。次いで、減圧濃縮して１-ブタノール抽出液を得、これを少量のメタノールに溶かした後、大量のエチルアセテートに追加した。得られた沈殿物を乾燥して、人参精製サポニン１００g(収率：５%)を得た。
【００３６】
〔参考例２〕酸加水分解方法によるバイオＧＦ１Ｋの製造
参考例１で得られた人参精製サポニン１０gに２０倍(ｖ/ｗ)の７%硫酸/５０%エタノール溶液(ｖ/ｗ)を加え、１００℃の水槽で６時間加熱還流させて、人参サポニンに結合された糖結合を加水分解させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣に蒸溜水１，０００mlを加えて懸濁させた後、同量のエーテルで３回抽出した。エーテル層全体を蒸溜水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウム(ＭｇＳＯ₄)で脱水、濾過、濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー(溶離液で、クロロホルム：メタノール＝９：１→４：１)で分離し、バイオＧＦ１Ｋ２１０mg(収率２%)を得た。各分画に対して、薄膜クロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/水＝６５/３５/１０)し、化合物Ｋ(Ｒｆ＝０．７３)７０mg、ジンセノサイドＦ１(Ｒｆ＝０．６５)３０mg、及び化合物Ｙ(Ｒｆ＝０．４９)３５mgを得た。
【００３７】
〔参考例３〕塩基加水分解方法によるバイオＧＦ１Ｋの製造
参考例１で得られた人参精製サポニン１０gを乾燥ピリジン(５００ml)に溶かした後、ここに、ナトリウム・メトキシド(粉末、１０g)を加え、油浴で８時間還流反応させて、人参サポニンに結合された糖結合を加水分解させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣に蒸溜水１，０００mlを加えて懸濁させた後、同量のエーテルで３回抽出した。エーテル層全体を蒸溜水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウム(ＭｇＳＯ₄)で脱水、濾過、濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー(溶離液として、クロロホルム：メタノール＝９：１→４：１)で分離し、バイオＧＦ１Ｋ２０５mg(収率２%)を得た。各分画に対して、薄膜クロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/水＝６５/３５/１０)し、化合物Ｋ(Ｒｆ＝０．７３)７５mg、ジンセノサイドＦ１(Ｒｆ＝０．６５)３５mg、及び化合物Ｙ(Ｒｆ＝０．４９)３０mgを得た。
【００３８】
〔参考例４-１〕酵素分解方法によるバイオＧＦ１Ｋの製造
参考例１で得られた人参精製サポニン１０gをシートレート緩衝溶液(ｐＨ５．５)１００mlに溶解させた。ここに、ペニシリウムの中で分離したナリンギナーゼ(naringinase)酵素１gを添加し、４０℃の水浴で４８時間攪拌させながら反応させた。反応は、薄層クロマトグラフィーにより周期的にチェックした。基質が完全に消失されると熱水で１０分間加熱して反応を終了させた。反応液は、同量のエーテルで３回抽出、濃縮した。得られた生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー(溶離液として、クロロホルム-メタノール＝９：１→４：１)で分離し、バイオＧＦ１Ｋ１，０５０mg(収率１０．５%)を得た。各分画に対して、薄膜クロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/水＝６５/３５/１０)し、化合物Ｋ(Ｒｆ＝０．７３)４４０mg、ジンセノサイドＦ１(Ｒｆ＝０．６５)１５０mg、及び化合物Ｙ(Ｒｆ＝０．４９)１４０mgを得た。
【００３９】
本発明のバイオＧＦ１Ｋの製造に、次のような酵素反応を利用することができる。
〔参考例４-２〕
人参精製サポニン１０gを、１５%エタノールを含有したシートレート緩衝溶液(ｐＨ４．０)１００mlに溶解させた。ここに、ペニシリウムの中から分離したナリンギナーゼ酵素０．５gを添加し、４０℃の水浴で４８時間攪拌させながら反応させた。反応は、薄層クロマトグラフィーにより周期的にチェックした。基質が完全に消失されると熱水で１０分間加熱して反応を終了させた。反応液は、同量のエチルアセテートで３回抽出、濃縮した。得られた生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー(溶離液として、クロロホルム-メタノール＝９：１→４：１)で分離し、バイオＧＦ１Ｋ３７３mg(収率３．７３%)を得た。各分画に対して、薄膜クロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/水＝６５/３５/１０)し、化合物Ｋ(Ｒｆ＝０．７３)１５０mg、ジンセノサイドＦ１(Ｒｆ＝０．６５)１００mg、及び化合物Ｙ(Ｒｆ＝０．４９)１０２mgを得た。
【００４０】
〔参考例４-３〕
人参精製サポニン１０gを、１５%エタノールを含有したシートレート緩衝溶液(ｐＨ４．０)１００mlに溶解させた。ここに、アスペルギルスの中から分離したペクチナーゼ(pectinase)酵素２gを添加し、３０℃の水浴で４８時間攪拌させながら反応させた。反応は、薄層クロマトグラフィーにより周期的にチェックした。基質が完全に消失されると熱水で１０分間加熱して反応を終了させた。反応液は、同量のエチルアセテートで３回抽出、濃縮した。得られた生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー(溶離液として、クロロホルム-メタノール＝９：１→４：１)で分離し、バイオＧＦ１Ｋ１９０mg(収率１．９%)を得た。各分画に対して、薄膜クロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/水＝６５/３５/１０)し、化合物Ｋ(Ｒｆ＝０．７３)８０mg、ジンセノサイドＦ１(Ｒｆ＝０．６５)３０mg、及び化合物Ｙ(Ｒｆ＝０．４９)３５mgを得た。
【００４１】
〔参考例４-４〕
人参精製サポニン１０gをシートレート緩衝溶液(ｐＨ５．５)１００mlに溶解させた。ここに、アスペルギルスの中から分離したペクチナーゼ酵素２gを添加し、３０℃の水浴で４８時間攪拌させながら反応させた。反応は、薄層クロマトグラフィーにより周期的にチェックした。基質が完全に消失されると熱水で１０分間加熱して反応を終了させた。反応液は、同量のエーテルで３回抽出、濃縮した。得られた生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー(クロロホルム-メタノール＝９：１→４：１)で分離し、バイオＧＦ１Ｋ４９３mg(収率４．９３%)を得た。各分画に対して、薄膜クロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/水＝６５/３５/１０)し、化合物Ｋ(Ｒｆ＝０．７３)１８０mg、ジンセノサイドＦ１(Ｒｆ＝０．６５)８２mg、及び化合物Ｙ(Ｒｆ＝０．４９)８５mgを得た。
下記の実施例１〜６では、参考例から得られた化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙを含有することにより、本発明の微細乳化粒子を製造した。各成分及び含量は、表１に示した。
【００４２】
〔実施例１〕
レシチン、水添レシチン、コレステロール、豆油及びプロピレングリコールが溶解された溶液に化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙを含むバイオＧＦ１Ｋを入れ、７０〜７５℃まで加熱して完全に溶解させた。その後、あらかじめ加熱した水相パート(蒸溜水、ＥＤＴＡ)と混合し、一般のホモミキサにより３，０００〜６，０００rpmで３分間前乳化(pre-emulsion)させた。次いで、高圧乳化器(Microfluidizer)を使用して１，０００bar/３cyclesで乳化させた。
上記成分のうち、水添レシチンの場合、乳化安定度は優秀であるが、不飽和レシチンに比べて皮膚親和度が劣るので、皮膚透過性がよくない。従って、本実施例では、２種類のレシチンを混合して使用した。
【００４３】
〔実施例２〕
実施例１で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに化合物Ｋを乳化させた。
【００４４】
〔実施例３〕
実施例１で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりにジンセノサイドＦ１を乳化させた。
【００４５】
〔実施例４〕
実施例１で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに化合物Ｙを乳化させた。
【００４６】
〔実施例５〕
レシチン、ＰＥＧ-５ブドウの種ステロール、トリカプリン酸グリセリル/トリカプリルグリセリル、ＢＨＴ、α-トコフェロール、及びペンチレングリコールをエタノールに溶解させた溶液に、バイオＧＦ１Ｋを入れ、７０〜７５℃まで加熱して完全に溶解させた。その後、あらかじめ加熱した水相パート(蒸溜水、ＥＤＴＡ)と混合し、一般のホモミキサにより３，０００〜６，０００rpmで３分間前乳化させた。次いで、高圧乳化器を使用して１，０００bar/３cyclesで乳化させた。
上記成分のうち、不飽和レシチンの化学的不安定性を補完するために、抗酸化剤としてＢＨＴを添加し、乳化安定度を増加するために、補助乳化剤としてＰＥＧ-５ブドウの種ステロールを添加した。
【００４７】
〔実施例６〕
水添レシチン、水添リゾホスファチジルコリン(ＨＬＰＣ)及びプロピレングリコールをエタノールに溶解させた溶液に、バイオＧＦ１Ｋを入れ、７０〜７５℃まで加熱して完全に溶解させた。その後、あらかじめ加熱した水相パート(蒸溜水、ＥＤＴＡ、グリセリン、ベタイン)と混合し、一般のホモミキサにより３，０００〜６，０００rpmで３分間前乳化させた。次いで、高圧乳化器を使用して１，０００bar/３cyclesで乳化させた。
上記成分のうち、水添リゾホスファチジルコリン(ＨＬＰＣ)は、水添レシチンを構成している水添ホスファチジルコリン(ＨＰＣ)を加水分解させて得られたもので、ＨＰＣより乳化力が優れている。
【００４８】
皮膚透過性において、実施例１〜６で得られた微細乳化粒子と人参精製サポニンとを比較するために、実施例で説明した方法により、人参サポニン代謝産物の変わりに人参精製サポニンを乳化させ、比較例１〜３を製造した。各成分及び含量は、表１に示した。
【００４９】
〔比較例１〕
実施例１で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに参考例１で製造した人参精製サポニンを乳化させた。
【００５０】
〔比較例２〕
実施例５で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに参考例１で製造した人参精製サポニンを乳化させた。
【００５１】
〔比較例３〕
実施例６で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに参考例１で製造した人参精製サポニンを乳化させた。
【００５２】
〔実施例７〕
実施例５で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに化合物Ｋを乳化させた。
【００５３】
〔実施例８〕
実施例５で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりにジンセノサイドＦ１を乳化させた。
【００５４】
〔実施例９〕
実施例５で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに化合物Ｙを乳化させた。
【００５５】
〔実施例１０〕
実施例６で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに化合物Ｋを乳化させた。
【００５６】
〔実施例１１〕
実施例６で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりにジンセノサイドＦ１を乳化させた。
【００５７】
〔実施例１２〕
実施例６で説明した方法により、バイオＧＦ１Ｋの代わりに化合物Ｙを乳化させた。
【００５８】
【表１】

【００５９】
一方、皮膚親和性乳化剤の使用及びナノ乳化技術による微細乳化粒子の皮膚透過性増進効果を確認するために、比較例４として、参考例４-１で製造したバイオＧＦ１Ｋ１．５重量%を溶解させたエタノール溶液を；比較例５として、バイオＧＦ１Ｋ１．５重量%を溶解させたプロピレングリコール/エタノール溶液を；比較例６として、バイオＧＦ１Ｋ１．５重量%を溶解させたペンチレングリコール/エタノール溶液を製造した。そして、比較例２として、人参精製サポニン１．５重量%を溶解させたエタノール溶液を；比較例８として、人参精製サポニン１．５重量%を溶解させたプロピレングリコール/エタノール溶液を；比較例９として、人参精製サポニン１．５重量%を溶解させたペンチレングリコール/エタノール溶液を製造した。比較例４〜９は、表２に示した。
【００６０】
【表２】

【００６１】
そして、本発明の微細乳化粒子は、次の組成物により処方した。表３〜表７の単位は重量%である。
【００６２】
【表３】

【００６３】
【表４】

【００６４】
【表５】

【００６５】
【表６】

【００６６】
【表７】

【００６７】
〔試験例１〕皮膚透過性の効果
皮膚透過性は、ギニーピッグ皮膚を対象とし、フランツ透過セルを用いて測定した。試験直前、ギニーピッグの腹部の皮膚を採取し、平方１cm²の面積に切断した後、これを透過鏡の直径が０．９cmである透過セルに実装し、クランプで固定した。皮膚の一方の面(donor容器)は、実施例１〜９及び比較例１〜６を０．０５ml取って０．５mlになるように蒸溜水で希釈し、剤型例１〜３０及び比較剤型例１〜１５の場合には、０．５mlを入れた。他方の面(receptor容器)には、蒸留水とエタノールが４：１の重量比で混合された溶媒とを満たし、試験時の温度は実際皮膚温度の３２℃を維持させた。試験開始後、一定時間の間隔で溶媒の一部を採取した後、ＨＰＬＣを用いて皮膚に吸収された化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙの量を測定し、塗布濃度当たり皮膚吸収量(μg/cm²/重量%)で表わし、その結果を下記表９及び表１０に示した。
【００６８】
人参精製サポニンに対しては、経皮吸収されたサポニンの含量を定量した。そして、バイオＧＦ１Ｋに対しては、経皮吸収された化合物Ｋ、ジンセノサイド化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙの含量を定量し、それぞれのピークの合計を求めて総経皮吸収量を計算した。
【００６９】
<ＨＰＬＣ分析条件>
-Column：Ｃ１８(ＯＤＳ)
-Solvent Flow：１ml/min
-Detection UV：２０３nm
-Sample test concentration：５mg/ml
-Sample injection amount：１０μg
-Eluent： Gradient condition
-A： Acetonitrile/D．I．water＝１５/８５
-B： Acetonitrile/D．I．water＝８０/２０
【００７０】
【表８】

【００７１】
【表９】

【００７２】
【表１０】

【００７３】
上記の試験結果から、実施例１〜１２、すなわちナノ乳化技術を適用して製造した微細乳化粒子が、それぞれを単純に溶媒に溶解させた比較例１〜９に比べて、優れた皮膚透過性を有していることが確認できた。参考として、比較例においても、ナノ乳化技術が適用された比較例１〜３が、単純溶液から製造された比較例４〜９に比べて、優れた透過効果を有している。
【００７４】
それぞれの対応する実施例及び比較例を比較してみる時、人参サポニン代謝産物、すなわち化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙが、人参精製サポニンより優れた皮膚透過性を有することが分かる。これは、化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙの特徴的な化学的構造から由来したものと考えられる。
【００７５】
要するに、人参サポニン代謝産物、すなわち化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙが、人参精製サポニンに比べて、より高い皮膚透過性を有し、特に、皮膚親和性が優れたレシチンとナノ乳化技術を適用して乳化させることにより、皮膚透過性を増大することができる。
【００７６】
また、このような結果は、実施例及び比較例を剤型化した剤型例１〜３０及び比較剤型例１〜１５によっても確認することができた。つまり、皮膚親和性が優れたレシチンとナノ乳化技術により強化された代謝産物の皮膚透過性を剤型内でも確認することができた。
【００７７】
表１０に示したように、一般に、化粧の持続時間が４〜８時間であることを勘案すれば、化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙを含有した実施例及び剤型例が、人参精製サポニンを含有した比較例及び比較剤型例に比べて、約９〜１０倍強化された皮膚透過性を示す。
【００７８】
〔試験例２〕繊維芽細胞(fibroblast)の増殖効能測定
３.５%のウシ胎児血清が含有されたＤＭＥＭ(Doubecco's Modified Eagle's Media；以下「ＤＭＥＭ」と記す)培地で培養したヒト繊維芽細胞を、９６-ウエル平板培養器(96-well microtiter plate)に５，０００細胞/wellになるように分注した。実施例１〜４及び比較例１の微細乳化粒子の場合には、各代謝産物、バイオＧＦ１Ｋ及び人参精製サポニンの濃度が、それぞれ１%になるように試料を用意した。そして、剤型例１〜４及び比較剤型例１のクリームは、それぞれ１０%の溶液に試料を用意した。試料を培養培地により１/１０ずつ順次的に希釈して添加した後、３７℃で４日間培養した。培養後、０．２%ＭＴＴ(３-[４，５-dimethylthiazol-２-yl]-２，５-diphenyltetrazolium bromide)溶液を各ウェル当たり５０μlずつ添加し、さらに３７℃で４時間培養した。生成されたホルマザン(formazane)をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。溶解されたホルマザンの吸光度を平板培養測定機(microplate reader)を用いて５７０nmで測定した。繊維芽細胞増殖能は、試料を処理しない対照群の吸光度と比較して評価した。その結果を表１１に示した。
【００７９】
【表１１】

【００８０】
表１１に示したように、人参サポニン代謝産物を含有する実施例１〜４の微細乳化粒子が、人参精製サポニンを含有する比較例１の微細乳化粒子に比べて、繊維芽細胞を増殖するのに効果的であった。
また、このような結果は、実施例１〜４及び比較例１を剤型化した剤型例１〜４及び比較剤型例１でも確認することができた。つまり、剤型例１〜４が比較剤型例１より繊維芽細胞を増殖するのに効果的であった。
【００８１】
〔試験例３〕角質形成細胞(keratinocyte)の増殖効能測定
角質形成細胞の増殖効能も試験例２と同様の方法で測定した。試料としては、実施例５、比較例２、剤型例５及び比較剤型例２を試験例２で説明したように用意した。その結果を表１２に示した。
【００８２】
【表１２】

【００８３】
表１２に示したように、バイオＧＦ１Ｋを含有する実施例５の微細乳化粒子を処理したのが、人参精製サポニンを含有する比較例２の微細乳化粒子に比べて、角質形成細胞を増殖するのに約２倍程度効果的であった。
また、このような結果は、実施例５及び比較例２を剤型化した剤型例５及び比較剤型例２でも確認することができた。
【００８４】
〔試験例４〕試験管内(in vitro)コラーゲン生合成効能測定
ヒト繊維芽細胞を２４-ウエル平板培養器に培養した後、試験例２と同様の方法により、実施例６及び比較例３の微細乳化粒子の場合には、試料を培養培地で１/１００ずつ順次的に希釈して添加し、剤型例６及び比較剤型例３のクリームは、培養培地で１/１０ずつ順次的に希釈して添加した。培養３日目、１０%のウシ胎児血清が含有されたＤＭＥＭ培地を各ウェル当たり０．５mlずつ添加した後、Ｌ[２,３,４,５-３Ｈ]-プロリン１０μＣｉを添加した。２４時間経過後、各ウェルに入っている培地と細胞をかき集め、５%のトリクロロ酢酸(ＴＣＡ)溶液に入れて水洗いした後、２つの試験管に分注した。１つの試験管には、タイプIコラゲナーゼ(type I collagenase)１unit/μｌを入れ、３７℃で９０分間培養し、他の試験管は４℃で保管した。その後、全ての試験管に５０%ＴＣＡを０．０５mlずつ添加して４℃で２０分間放置した。得られた溶液をそれぞれ１２，０００rpmで１０分間遠心分離した。それぞれの上澄みと沈殿物を液体シンチレーション計数器(LSC;Liquid Scintillation Counter)によりdpm(decay per minute)値を得た。下記数式１により、対照群と試験群に対して、コラーゲン生合成値(RCB;Relative Collagen Biosynthesis)を求め、その結果を下記表１３に示した。
【００８５】
[数式１]
ＲＣＢ＝[コラーゲンdpm/[(全体コラーゲン−コラーゲンdpm)×５．４＋コラーゲンdpm]]×１００
【００８６】
【表１３】

【００８７】
表１３に示したように、バイオＧＦ１Ｋを含有する実施例６の微細乳化粒子を処理したのが、人参精製サポニンを含有する比較例３の微細乳化粒子に比べて、コラーゲン生合成を促進するのに約３倍程度効果的であった。
また、このような結果は、実施例６及び比較例３を剤型化した剤型例６及び比較剤型例３でも確認することができた。
【００８８】
〔試験例５〕生体内(in vivo)でのコラーゲン生合成効能測定
各々の脱毛マウス(４２週、female)の背中に、剤型例７及び比較剤型例４をエタノール：プロピレングリコール＝７：３の溶液を賦形剤として塗布し、３日間貼布した。２４時間の休止期をおいて３日間貼布を繰り返した。その後、脱毛マウスの皮膚を生体検査(biopsy)し、タイプI ｐＮプロコラーゲン(type I pN procollagen)及びＭＭＰ-１(Matrix Metalloproteinase-１)に対する免疫染色と、ヘマトキシリンエオシン染色(haematoxylin-eosin staining)とにより組織染色を行った。組織染色によりプロコラーゲン、ＭＭＰ-１の発現量及び表皮厚さの変化を観察し、その結果を図１及び図２に示した。
【００８９】
図１及び図２に示したように、剤型例７と比較剤型例４を比較してみれば、本発明の微細乳化粒子の剤型が化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙの皮膚透過においてより効果的で、従って、コラーゲン生合成を促進できるということが分かる。比較剤型例４の場合は、人参精製サポニンが皮膚に効果的に吸収されず、コラーゲン生合成効果が微小なことを確認することができた。これは、人参精製サポニンが構造的に皮膚に吸収され難いためであり、これは皮膚親和性レシチンやナノ乳化技術によっても容易に克服されないことが分かる。
【００９０】
要するに、上記の結果から、人参サポニン代謝産物、すなわち化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙが構造的に皮膚に吸収され易く、皮膚親和性レシチン及びナノ乳化技術によって皮膚透過性が極大化されることが確認できる。つまり、本発明の微細乳化粒子は、コラーゲン生合成を促進することができる。
【００９１】
〔試験例６〕生体内(in vivo)でのコラーゲン生合成効能測定
試験例５と同様の方法により、試料として剤型例の変わりに、実施例２〜４及び比較例１の微細乳化粒子を用いて、これらのコラーゲン生合成効能を測定した。その結果を図３(化合物Ｋを含有する実施例２)、図４(ジンセノサイドＦ１を含有する実施例３)、図５(化合物Ｙを含有する実施例４)、及び図６(人参精製サポニンを含有する比較例１)に示した。
【００９２】
試験例５で説明したように、試験例１及び６の結果から、人参サポニン代謝産物、すなわち化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙを含有する本発明の微細乳化粒子が、より効果的に皮膚を透過することができ、従って、コラーゲン生合成を促進できることを確認した。これに対して、人参精製サポニンを含有する微細乳化粒子は、皮膚に効果的に吸収されず、コラーゲン生合成の効果が微小であることが確認できた。これは、人参精製サポニンが構造的に皮膚に吸収され難いためであり、これは、皮膚親和性レシチンやナノ乳化技術によっても容易に克服されないことが分かる。
【００９３】
〔試験例７〕人体皮膚を対象にした皮膚シワ改善効果
本発明の微細乳化粒子を含有する組成物に対して皮膚シワ改善効果を評価するために、３５〜４５才の顔面シワのある試験対象者を試験群当たり３０人ずつ４つの試験群に分けて、剤型例１及び比較剤型例１のクリーム剤型(１群)と；剤型例２及び比較剤型例１のクリーム剤型(２群)と；剤型例３及び比較剤型例１のクリーム剤型(３群)と；剤型例４及び比較剤型例１のクリーム剤型(４群)と；を３ヶ月使用させた。被検者の顔面左部には剤型例のクリームを、右部には比較剤型例１のクリームを使用した。クリーム使用の前に顔面両側の皮膚状態を測定しておき、３ケ月後同一部位を再測定する方法において、皮膚シワの変化を測定した。皮膚測定は、温度２４℃、相対湿度４０%の恒温実習室で行い、目尻部位のシワをレプリカ(replica)で複製して、ビシオメータシステム(Visiometer system；Ｃ＋Ｋ社)で皮膚シワを測定した。皮膚シワの変化量は、下記数式２によって計算した。その結果を表１４に示した。
【００９４】
[数式２]
皮膚シワの変化量(△%)＝[(Ｔｄ_i-Ｔｄ_o)/Ｔｄ_o]×１００
(式中、Ｔｄ_iは３ヶ月クリームを使用した後、測定した皮膚シワ値であり、Ｔｄ_oはクリームを使用した前、測定した皮膚シワ値である。)
【００９５】
【表１４】

【発明の効果】
上記したように、本発明の微細乳化粒子は、人参サポニンから糖の一部を除去することにより、皮膚透過性において構造的長所を有する化合物Ｋ、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｙを含有している。また、本発明の微細乳化粒子は、皮膚親和性乳化剤及びナノ乳化技術を適用することにより、皮膚透過性を極大化し、これにより、繊維芽細胞増殖及びコラーゲン生合成を促進することができ、皮膚シワの改善及び皮膚老化を防止するのに有利に使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】剤型例７のコラーゲン生合成効能を示す皮膚細胞組織図である。
【図２】比較剤型例４のコラーゲン生合成効能を示す皮膚細胞組織図である。
【図３】実施例２のコラーゲン生合成効能を示す皮膚細胞組織図である。
【図４】実施例３のコラーゲン生合成効能を示す皮膚細胞組織図である。
【図５】実施例４のコラーゲン生合成効能を示す皮膚細胞組織図である。
【図６】比較例１のコラーゲン生合成効能を示す皮膚細胞組織図である。

Claims

人参サポニンから糖転換反応により得られた人参サポニン代謝産物を含有する微細乳化粒子であって、前記人参サポニン代謝産物が、下記化学式１で表される20-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナクサジオール(protopanaxadiol)３０〜５０重量%、化学式２で表される20-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナクサトリオール(protopanaxatriol)５〜２５重量%、及び化学式３で表される20-O-[α-L-アラビノピラノシル(1→6)-β-D-グルコピラノシル]-20(S)-プロトパナクサジオール５〜２５重量%を含むことを特徴とする微細乳化粒子。

（式中、Ｒ₁はＯ-Ｇlcであり、Ｒ₂はＯＨであり、Ｒ₃はＨである。）

（式中、Ｒ₁はＯ-Ｇlcであり、Ｒ₂はＯＨであり、Ｒ₃はＯＨである。）

（式中、Ｒ₁はＯ-Ｇlc⁶-¹Ａrapであり、Ｒ₂はＯＨであり、Ｒ₃はＨである。）
人参サポニン代謝産物を微細乳化粒子の総重量に対して、１０^-8〜５０重量%の量で含有することを特徴とする請求項１に記載の微細乳化粒子。
人参サポニン代謝産物を微細乳化粒子の総重量に対して、０．００１〜３０重量%の量で含有することを特徴とする請求項２に記載の微細乳化粒子。
平均粒径が３０〜５００nmであることを特徴とする請求項１に記載の微細乳化粒子。
レシチンまたはその誘導体で乳化させたことを特徴とする請求項１に記載の微細乳化粒子。
前記レシチンは、不飽和コリン系化合物、セリン系化合物、セファリン系化合物、及びこれらの水素添加物からなる群のうち選択された１種以上を含有するリポソームであり、微細乳化粒子の総重量に対して０．５〜１０重量%の量で使用されることを特徴とする請求項５に記載の微細乳化粒子。
前記不飽和コリン系化合物は、ホスファチジルコリンまたはリゾホスファチジルコリンであり、前記セファリン系化合物は、ホスファチジルエタノールアミンであることを特徴とする請求項６に記載の微細乳化粒子。
陰イオン系、陽イオン系、非イオン系または両性イオン系乳化剤からなる群のうち選択された補助乳化剤が、レシチンと一緒に使用され、レシチンの重量に対して０．１〜５倍の比率に使用されることを特徴とする請求項５ないし７のいずれかに記載の微細乳化粒子。
５００〜２，５００barでの高圧乳化のナノ乳化技術で乳化させたことを特徴とする請求項１または５に記載の微細乳化粒子。
請求項１に記載の微細乳化粒子の製造方法であって、レシチンまたはその誘導体により人参サポニンの代謝産物を乳化させる段階を含むことを特徴とする微細乳化粒子の製造方法。
ナノ乳化技術により人参サポニンの代謝産物を乳化させる段階を含むことを特徴とする請求項１０に記載の微細乳化粒子の製造方法。
前記ナノ乳化技術は、５００〜２，５００barでの高圧乳化法であることを特徴とする請求項１１に記載の微細乳化粒子の製造方法。
請求項１ないし９のいずれかに記載の微細乳化粒子を含む外用組成物。
請求項１ないし９のいずれかに記載の微細乳化粒子を組成物の総重量に対して、１０^-8〜５０重量%含有することを特徴とする外用組成物。
柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メーキャップベース、ファンデーション、染毛剤、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤、歯磨き粉、口腔清浄液、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、及び噴霧剤からなる群のうち選択された剤型であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の外用組成物。
皮膚老化防止用であることを特徴とする請求項１３ないし１５のいずれかに記載の外用組成物。
請求項１ないし９のいずれかに記載の微細乳化粒子を有効成分とする繊維芽細胞および／または角質形成細胞増殖促進剤。
請求項１ないし９のいずれかに記載の微細乳化粒子を有効成分とするコラーゲン生合成促進剤。
請求項１ないし９のいずれかに記載の微細乳化粒子を有効成分とするシワ改善剤。
請求項１ないし９のいずれかに記載の微細乳化粒子を有効成分とする皮膚老化防止剤。