FR3011248A1 - Procede d'obtention d'oligosaccharides bioactifs clives, micro-organisme pour sa mise en œuvre, oligosaccharides obtenus et leur utilisation cosmetique - Google Patents

Abstract

Le procédé consiste à fournir un micro-organisme apte à produire au moins une enzyme lyase de clivage osidique, à mettre en contact des polysaccharides d'algue verte, de préférence du genre Ulva, avec ladite enzyme de manière à provoquer ledit clivage, et à récupérer lesdits oligosaccharides bioactifs clivés. Selon l'invention, le micro-organisme est choisi parmi le groupe de bactéries de la famille des Flavobacteriaceae comprenant la souche Jejuia pallidilutea, la souche Flavobacteriaceae bacterium, la souche Gaetbulibacter marinus et la souche référencée CNCM I-4797. Le mélange d'oligosaccharides clivés obtenus présente une activité cosmétique sur les cellules de la peau, notamment des effets anti-inflammatoires, anti-radicalaires, dé-pigmentant, sur des molécules de la matrice extracellulaire dermique (comme le collagène 1, collagène 4 et la fibronectine), sur des molécules de la matrice extracellulaire épidermique (l'acide hyaluronique).

Description

DESCRIPTION L'invention se rapporte à un procédé d'obtention d'oligosaccharides bioactifs clivés obtenus par clivage enzymatique de polysaccharides issus d'algues vertes, à un nouveau micro-organisme pour la mise en oeuvre de ce procédé, aux oligosaccharides clivés obtenus selon ce procédé et à leur utilisation cosmétique. La présente invention concerne ainsi notamment l'industrie des cosmétiques qui fabrique et/ou utilise des produits destinés au traitement de la peau, du cuir chevelu, des muqueuses et des phanères (tels que poils, cils, sourcils, ongles, cheveux) de mammifères, animaux ou humains, pour en améliorer l'apparence et/ou l'état général.

L'industrie des cosmétiques est en demande croissante de nouveaux produits, en particulier en demande de nouveaux ingrédients actifs qui sont issus de matériel végétal afin de s'inscrire dans une démarche de développement durable par comparaison à une voie d'obtention synthétique ou chimique. Les algues constituent ainsi une source abondante de matière première valorisée dans de nombreux domaines comme l'alimentaire, la pharmacie et la cosmétique.

En cosmétique, les algues sont déjà largement utilisées mais principalement pour les propriétés gélifiantes ou épaississantes de leurs extraits qui contiennent essentiellement des polysaccharides. Les polysaccharides constituent en outre une classe de molécules particulièrement intéressante notamment parce qu'ils contiennent des séquences comparables à certains oligomères bioactifs. La Demanderesse s'est plus particulièrement intéressée aux algues vertes et plus particulièrement encore au genre ulva, et à l'espèce ulva lactuca. Il est connu que les polysaccharides issus d'algues du genre ulva contiennent notamment des unités osidiques d'acide iduronique (IdopA) et de rhamnose 3 sulfate (Rhap3 sulfate) ayant un potentiel intéressant pour des applications thérapeutiques ou cosmétiques (W02009/016275). La Demanderesse s'est plus particulièrement intéressée aux deux types de polysaccharides d'ulva pouvant être extraits des parois des algues vertes du genre ulva et contenant de telles unités osidiques : 1) le polysaccharide d'ulvane comprenant deux séquences osidiques majoritaires, dénommées «séquences d'acides aldobiuroniques» : - une première séquence [4)-13-D-GlcpA-(14)-a-L-Rhap3 sulfate-(11.; et - une seconde séquence [4)-a-L-IdopA-(14)- a-L-Rhap3 sulfate-(11..

Dans ces séquences, les unités « GlcpA » correspondent à des unités d'acide glucuronique. A l'intérieur de ce polysaccharide, on peut trouver également des séquences de type «glucuronanes», mais minoritairement. Ces séquences contiennent des enchaînements d'unités d'acide glucuronique : [4)-13-D-GlcpA-(14)-(3-D-GlcpA-(11'. 2) le polysaccharide de glucuronane qui comprend majoritairement des séquences osidiques glucuronanes contenant des enchaînements d'unités d'acide glucuronique [4)-(3-D-GlcpA- (14)-(3-D-GlcpA-(11', comme décrites ci-dessus.

Une enzyme de la classe des lyases est capable de provoquer le clivage de la liaison osidique reliant les unités oses selon une réaction de (3 élimination (ou transélimination). Une enzyme ulvane-lyase sera adaptée à cliver plus particulièrement la liaison osidique entre GlcpA et Rhap3 sulfate et entre IdopA et Rhap3, tandis qu'une enzyme glucuronane lyase sera adaptée à cliver plus particulièrement la liaison osidique reliant deux GlcpA. Le mécanisme schématique de clivage est le suivant : Ce processus de clivage fait apparaître des fragments de molécules saccharidique les oligosaccharides, ayant au niveau de l'extrémité terminale non réductrice créée, un hétérocycle présentant une liaison éthylénique entre le carbone 4 et le carbone 5, ce résidu correspondant à un acide 4-déoxy-(hex-4-ène) pyranosyluronique. L'analyse par spectroscopie UV à 235nm permet de suivre l'apparition de cette liaison éthylène et le dosage des produits formés. Les oligosaccharides clivés sont constitués d'oligo-ulvanes et d'oligo-glucuronanes La proportion de chacun dépend de la proportion de chacun des polysaccharides de glucuronane et d'ulvane de départ mis en contact avec le mélange enzymatique.

Des procédés de clivage de polysaccharides d'ulva ont été décrits consistant à : - fournir un micro-organisme apte à produire un mélange enzymatique de lyases - mettre en contact les polysaccharides extraits d'algue du genre ulva avec ledit mélange enzymatique de lyases de manière à provoquer le clivage des liaisons osidiques; et - à récupérer les oligosaccharides clivés.

Dans le document W02009/016275 mentionné ci-dessus, un micro-organisme de type Ochrobactrum trille' et déposé sous le numéro I-3776 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris) est utilisé permettant de produire un mélange enzymatique ayant une double activité enzymatique, ulvane lyase et glucuronane lyase, et d'obtenir ainsi un mélange d'oligo-glucuronanes et d'oligo-ulvanes ayant un degré de polymérisation (DP) inférieur à 25 et avec de bons rendements pour une production industrielle. Selon la présente demande, un DP correspond à une unité diholoside (contenant deux oses). Par exemple, une séquence de type (4)-(3- D-GlcpA-(14)-a-L-Rhap3 sulfate-(11n correspond ainsi à un DP de 1, comprenant une unité diholoside glucose/rhamnose. La bactérie marine Nonlabens ulvanivorans de la famille des flavobacteriacées déposée sous le numéro I-4324 auprès de la CNCM a également été proposée pour obtenir un tel clivage osidique. La présente invention a pour but de proposer un procédé alternatif pour obtenir des mélanges d'oligosaccharides bioactifs clivés obtenus par clivage enzymatique de polysaccharides issus d'algues vertes. H3C SO3Na O o H3C SO3Na O Elle propose ainsi un procédé consistant à : - fournir un micro-organisme apte à produire au moins une enzyme lyase de clivage osidique ; - mettre en contact lesdits polysaccharides avec ladite enzyme de manière à provoquer ledit clivage ; et - à récupérer lesdits oligosaccharides clivés, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est choisi parmi le groupe de bactéries de la famille des Flavobacteriaceae comprenant la souche Jejuia pallidilutea, la souche Flavobacteriaceae bacterium, la souche Gaetbulibacter marinus et la souche référencée CNCM I-4797. Ces différentes souches sont apparentées en termes de taxonomie. Elles permettent d'obtenir des oligosaccharides clivés présentant avantageusement des activités cosmétiques particulièrement intéressantes comme le montrent notamment les résultats de tests in vitro donnés plus loin en exemple. La présente invention couvre plus particulièrement la souche CNCM I-4797. Elle a été déposée au nom de la Demanderesse auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) au siège de l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15.

De préférence, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre avec cette nouvelle souche CNCM I- 4797. La souche Jejuia pallidilutea est notamment disponible auprès de la collection DSMZ (« Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH », Inhoffen str 7B 38124 Braunschweig, Allemagne) sous la référence DSMZ21165.

La souche Gaetbulibacter marinus est notamment disponible auprès de la collection «National Institute of Technology and Evaluation (NITE) », # 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japon), sous la référence NBRC 102040. Le micro-organisme selon l'invention est apte à produire une enzyme de clivage ulvane lyase et/ou une enzyme glucuronane lyase, de préférence les deux enzymes. Ainsi, le procédé selon l'invention est de préférence mis en oeuvre pour réaliser le clivage de polysaccharides sulfatés issus d'une algue verte du genre Ulva, notamment ulva lactuca, comprenant des polysaccharides sulfatés d'ulvanes et/ou de glucuronanes Comme expliqué plus haut, de tels polysaccharides issus d'algue verte du genre Ulva comprennent : - des séquences aldobiuroniques [4)-(3-D-G1cpA-(14)-a-L-Rhap3 sulfate-(11. et [4)-a-L-IdopA-(14)- a-L-Rhap3 sulfate-(11. ; et - des séquences glucuronanes [4)-13-D-G1cpA-(14)-(3-D-G1cpA-(11', avec dans ces séquences, les unités GlcpA correspondant à des unités d'acide glucuronique, Rhap3 sulfate des unités de rhamnose 3 sulfate et IdopA des unités d'acide iduronique. L'enzyme ulvane-lyase selon l'invention est adaptée à cliver la liaison osidique entre les unités GlcpA et Rhap3 sulfate et entre IdopA et Rhap3 sulfate, tandis que l'enzyme glucuronane lyase selon l'invention est adaptée à cliver la liaison osidique reliant deux unites GlcpA.

De préférence, selon l'invention, on limite le procédé au clivage des polysaccharides d'ulvanes débarrassés préalablement des polysaccharides de type glucuronanes et comprenant ainsi majoritairement des séquences aldobiuroniques, le mélange d'oligosaccharides obtenu étant ainsi enrichi en oligo-ulvanes.

La présente invention couvre également les oligosaccharides bioactifs clivés obtenus selon le procédé de l'invention, la présente invention couvrant également l'utilisation cosmétique non thérapeutique pour la peau et ses phanères desdits oligosaccharides clivés. Le traitement cosmétique peut être notamment un traitement choisi parmi un traitement dépigmentant, anti-radicalaire, hydratant (notamment via la synthèse de l'acide hyaluronique de la matrice épidermique) ou anti-âge via une stimulation des molécules de la matrice extracellulaire dermique (collagène 1, collagène 4 et la fibronectine). Selon l'invention en outre, il a été montré notamment qu'un mélange d'oligosaccharides clivés présentant un DP compris entre 2 et 10 permettait d'obtenir des activités cosmétiques particulièrement intéressantes par comparaison à d'autres DP. Il va de soi que d'autres fractions de mélange d'oligosaccharides peuvent être obtenues appartenant à un intervalle de DP différents selon les conditions opératoires mises en oeuvre pour le procédé. D'une manière générale, on cherchera à obtenir des oligosaccharides ayant un DP inférieur à 50, de préférence encore inférieur à 20. Selon l'invention il est également proposé une composition cosmétique topique comprenant des oligosaccharides sulfatés bioactifs selon l'invention et un milieu physiologiquement acceptable.

Le degré de polymérisation (DP) est mesuré par une méthode de chromatographie ionique. Le poids moyen de la fraction est de 6 kD mesuré par CPC/DEDL (chromatographie de partage centrifuge) avec un taux de sulfatation de 13 à 20%. Selon d'autres caractéristiques avantageuses, les oligosaccharides peuvent être utilisés en combinaison avec un ou plusieurs ingrédients actifs additionnels, permettant avantageusement d'offrir une palette de propriétés cosmétiques plus large. Les ingrédients actifs additionnels sont utilisés soit en renfort d'activité soit en complément d'activité. Les ingrédients actifs additionnels peuvent être par exemple choisis parmi les actifs éclaircissants, anti-rougeurs, anti-tâches, calmants, pour le traitement des peaux sensibles, réactives, les filtres solaires UV, les actifs hydratants, humectants, exfoliants, lissants, tonifiants, raffermissants, anti-âges, anti-rides et ridules, améliorant les propriétés mécaniques et élastiques, l'éclat du teint, les actifs détoxyfiants, anti-repousse poil, agissant sur la barrière cutanée, anti-acné, agissant sur la sécrétion de sébum, matifiants, unifiants, anti-inflammatoires, anti-oxydants, anti-radicalaires, anti-glycants, contours des yeux (anti-cernes et anti-poches), favorisant la circulation sanguine, peptides, vitamines, etc. Ces ingrédients actifs peuvent être obtenus à partir de matériaux végétaux, comme des extraits végétaux ou des produits de culture végétale ou de fermentation. Plus spécifiquement, les oligosaccharides de la présente invention peuvent être combinés avantageusement avec des oligo-glucuronanes, notamment les oligo-glucuronanes acétylés décrits dans la demande de brevet W02010067327 et vendus notamment sous le nom commercial SubliskinTM par Sederma. Il s'agit de composés oligomères de l'acide D-glucuronique ou D-glucuronate à enchainement 13 (1-4) selon la formule (I) suivante : 0 ) O -0 0 OH

RO RO RO RO RO RO RO RO H R=H, COCH3 De manière préférée, chaque cycle d'acide glucuronique de formule (I) comprend un degré d'acétylation compris entre 8,7±0,5 et 9,2±0,5% en poids de groupes O-CO-CH3 par rapport au poids du cycle acide glucuronique et un degré de polymérisation compris entre 18 et 19 ±2. Ces composés oligomères agissent au niveau de l'élasticité du derme et de l'épiderme et augmentent la cohésion dermoépidermique afin de lutter contre le vieillissement de la peau, les rides, les ridules, les discontinuités de la peau visibles et/ou tactiles, la perte de fermeté, d'élasticité et de tonus, et pour lutter contre la déformabilité des tissus cutanés. Ils permettent également d'hydrater la peau. Des actifs classiques comme les composés de la vitamine B3, la niacinamide ou le tocophérol, les composés rétinoïdes comme le rétinol, l'hexamidine, l'acide a-lipoïque, le resvératrol ou la DHEA, les peptides, notamment le N-acétyl-Tyr-Arg-O-hexadécyl, le Pal-VGVAPG, le Pal-KTTKS, le Pal-GHK, le Pal-KMO2K et le Pal-GQPR peuvent être combinés aux oligosaccharides de la présente invention. D'autres exemples d'ingrédients additionnels sont donnés plus loin dans la description détaillée. La présente invention propose également une méthode de traitement topique de la peau et de ses phanères, comprenant l'application topique d'une quantité efficace d'une composition selon l'invention comprenant des oligosaccharides tels que définis ci-dessus.

Par « traitement topique », on entend une application qui est destinée à agir à l'endroit où elle est appliquée : peau, muqueuse, phanères. Des améliorations de l'apparence et de l'état général de la peau des muqueuses et des phanères peuvent être obtenues par application topique de manière régulière comme par exemple de façon quotidienne.

La composition topique est préférentiellement appliquée une fois chaque jour pour une période d'au moins une semaine, mais elle peut être appliquée pendant des périodes durant 2, 4, 8 ou 12 semaines. La composition topique est préférentiellement appliquée sur le visage et le cou, mais peut être appliquée sur toute partie de peau nécessitant une amélioration esthétique, où la composition reste sur la zone de peau à traiter, et préférentiellement n'est pas retirée ou rincée de la peau.

Il faut comprendre également que, tels qu'utilisés ici, les termes traiter et traitement incluent et englobent la réduction, l'amélioration, la progression, l'allègement, et/ou l'élimination des effets dermatologiques, notamment du vieillissement. Les compositions de la présente invention ainsi que les méthodes conviennent à une utilisation pour traiter les conditions dermatologiques de la peau dans de nombreuses zones de la peau, incluant sans s'y limiter, le visage, le front, les lèvres, le cou, le décolleté, les bras, les mains, le corps, les jambes, les genoux, les pieds, la poitrine, le dos, les fesses, et autres. L'un des grands avantages de la présente invention réside dans la possibilité de pouvoir procéder, chaque fois que nécessaire ou souhaitable, à des traitements "doux" localisés et sélectifs grâce au mode d'application par voie topique, non invasifs. Une application peut être réalisée de manière très localisée à l'aide d'une seringue ou d'une micro-canule. La composition topique selon l'invention est appliquée en général deux fois par jour, matin et soir, mais peut ne l'être également qu'une fois par jour, pendant une période d'au moins une semaine, et pouvant aller jusqu'à 12 semaines. À titre d'indication, pour un traitement cosmétique de la figure, le dosage standard européen en crème est de 2,72 mg/cm2/jour/personne et pour un traitement cosmétique du corps de 0,5 mg/cm2/jour/personne (selon les données publiées par le Comité Scientifique Européen pour la Sécurité des Consommateurs (SCCS) « SCCS'S NOTES OF GUIDANCE FOR THE TESTING OF COSMETIC SUBSTANCES AND THEIR SAFETY EVALUATION 8TH REVISION », 11 décembre 2012)). Selon d'autres particularités, le procédé de traitement cosmétique selon l'invention peut être associé avec un ou plusieurs autres procédés de traitement visant la peau, comme par exemple les traitements par luminothérapie, par la chaleur ou par aromathérapie. Selon l'invention, il est possible de proposer des dispositifs à plusieurs compartiments ou kits destinés à la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, et qui pourrait comprendre, à titre d'exemple, et sans que ce soit limitatif, dans un premier compartiment une composition contenant les oligosaccharides et dans un second compartiment une composition contenant un autre actif et/ou excipient, les compositions contenues dans lesdits premier et second compartiments étant ici considérées comme composition de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps notamment dans l'un des traitements définis ci-dessus. La présente invention sera mieux comprise à la lumière de la description détaillée qui va suivre. A. Préparation des oligosaccharides selon l'invention Polysaccharide formant le substrat de départ Un mélange de polysaccharides contenus dans les parois d'algue du genre ulva lactuca est extrait à chaud. Après élimination des insolubles, le pH de l'extrait est abaissé à 2 avec de l'acide dilué de sorte qu'un précipité incluant des résidus d'acide glucuronique est formé. On récupère alors la solution que l'on ramène à un pH neutre voisin de 7, puis que l'on purifie par exemple par ultrafiltration, et que l'on précipite à l'alcool. On élimine ainsi la fraction de polysaccharide de glucuronane et on obtient un polysaccharide d'ulvane incluant essentiellement des séquences aldobiruoniques, les séquences glucuronanes restantes étant minoritaires et celles intégrées au sein du polysaccharide d'ulvane. L'objectif est ici de soumettre uniquement le polysaccharide d'ulvane au clivage enzymatique afin de récupérer essentiellement des oligo-ulvanes (un mélange enrichi en oligo-ulvanes) mais il va de soi que le procédé peut aussi en variante être mis en oeuvre sur un mélange de polysaccharides d'ulvane et de glucuronane La masse moléculaire moyenne du polysaccharide d'ulvane est déterminée par chromatographie d'exclusion stérique couplée à un détecteur à diffusion de lumière en ligne avec un réfractomètre (Technologie SEC-MALLS, pour « Size Exclusion Chromatography Coupled to Multi-angle Laser- Light-Scattering », en langue anglaise) ; cette masse moyenne est de 6.105. Préparation de la souche bactérienne A partir d'une des souches bactériennes selon l'invention, ici la souche référencée CNCM I-4797, on prépare une substance enzymatique ayant potentiellement une double activité enzymatique, ulvane- lyase et glucuronane-lyase. La souche CNCM I-4797 selon l'invention présente les caractéristiques suivantes : elle est pigmentée (couleur orange/jaune), gram négatif et aérobie. Les colonies sur milieu de culture gélosé sont crémeuses et opaques. En microscopie, on observe des bacilles de taille moyenne, non mobiles. La souche est cultivée sur un milieu nutritif minimal minéral contenant - NaC1 : 22g ; Na2SO4. 3,7g KC1 : 0,6g ; KBr : 0,1g ; MgC12,6H20 : lOg ; CaC12,2H20 : 2,94g ; NaHCO3 : 0,16g ; NaNO3 : 25mg NaH3PO4,12H20 : 5mg et H20 QSP 1 litre ; à un pH de 7,2. A ce milieu nutritif on ajoute comme substrat et source de carbone le polysaccharide d'ulvane préparé ci-dessus (2g/L). La souche apte à dégrader ce polysaccharide d'ulvane est isolée sur boite de pétri contenant le même milieu nutritif additionné de gélose. Après incubation, on recueille des colonies de souche qui métabolisent le substrat en le dégradant selon un mode de (3-élimination et qui se sont le plus développées. Préparation de l'activité enzymatique La souche CNCM I-4797 est inoculée dans un bioréacteur d'une capacité de 2 litres, rempli par 1,5 litres de milieu minéral : NaC1 : 22g ; Na2SO4. 3,7g ; KC1 : 0,6g KBr : 0,1g ; MgC12,7H20 : 5mg NaNO3 : 25mg ; NaH3PO4,12H20, H2O QSP 1 litre ; à un pH de 7,2 et additionné d'extrait de levure : lg/L, de peptone : 5g/L et de polysaccharide d'ulvane (2g/L). L'incubation est préférentiellement réalisée entre 25 et 35°C sous agitation pendant une durée moyenne de 48 heures. Pendant l'incubation, la concentration en mélange enzymatique (ulvane-lyase et glucuronane-lyase) dans le milieu de culture de la souche s'accroit et par conséquent l'activité enzymatique du milieu de culture également. Le milieu de culture est alors débarrassé des bactéries après incubation puis on ajoute du sulfate d'ammonium (60% p/v) pour précipiter les protéines qu'il contient. On procède ensuite à une centrifugation du milieu de culture précipité et on récupère le culot de protéines qui est ensuite réintroduit dans environ 10 ml d'une solution tampon Tris/HC120mM à pH 7,5. Une chromatographie sur résine échangeuse d'anions permet ensuite de récupérer exclusivement la fraction correspondant à une substance enzymatique présentant majoritairement une activité ulvane lyase et minoritairement glucuronane lyase. Une activité enzymatique de 30.10-3 umol/ml/min est quantifiée par mesure de l'absorbance à 235 nm. Clivage enzymatique La substance enzymatique obtenue ci-dessus est appliquée sur une solution de substrat à 50g de polysaccharide d'ulvane pour 1 litre de solution enzymatique. L'expérience de dégradation est réalisée à 20-30°C pendant une durée d'incubation de 3 heures (en théorie pouvant varier de 1 à 72h). Le profil chromatographique selon la technologie SEC-MALLS décrite plus haut permet de suivre la fraction d'oligo-ulvanes attendue selon l'invention (sa masse moyenne).

L'analyse du produit résultant de la dégradation par chromatographie d'exclusion stérique sur Biogel P2 (détection par réfractométrie) met en évidence une fraction majoritaire analysée par spectrométrie de masse de type ESI-Q/TF (pour électrospray-quadrupôle-temps de vol). Les oligosaccharides présentent un degré de polymérisation DP compris entre 2 et 10, un poids moyen de 6kD et un taux de sulfatation de 16,6%.

Ce procédé peut être mis en oeuvre sur les trois autres souches bactériennes selon l'invention, à savoir Jejuia pallidilutea référencée DSMZ21165, la souche bactérienne Flavobacteriaceae bacterium ou la souche bactérienne Gaetbulibacter marinus. B. Tests in vitro Les différents tests suivants ont été menés sur le mélange d'oligosaccharides obtenus au point A ci- dessus avec la souche CNCM I-4797, pour mettre en évidence l'activité cosmétique. 1) Mesure de l'effet anti-inflammatoire sur fibroblastes humains normaux (FHN) : Des FHN sont cultivés jusqu'à obtention d'un tapis confluent. A ce stade, ils sont mis au contact des produits à tester pendant 24h puis les tapis sont irradiés (UVB 70mJ/cm2) et remis à nouveau en contact des produits pendant 24h. Les quantités de PGE2, d'IL-6 et d'IL-8 synthétisés sont mesurées dans les surnageants de culture par dosage ELISA. 2) Mesure de l'effet sur la matrice extracellulaire (MEC) épidermique : Des kératinocytes humains (HaCat) sont cultivés en plaque pendant 24h. Les cellules sont mises en contact ou non des produits à tester pendant 3 jours. Les surnageants de culture sont prélevés et un dosage de la quantité d'acide hyaluronique est réalisé. L'acide rétinoïque est utilisé comme témoin 30 positif 3) Mesure de l'effet anti-radicalaire (ROS intracellulaires DCFH) : Des FHN sont ensemencés dans des plaques de puits. Après 24h d'attachement, les cellules sont mises en contact des produits pendant 24h. Les produits sont éliminés et les tapis rincés. Les cellules sont chargées durant 30 min avec une sonde « DCFH-DA » qui devient fluorescente en présence de ROS 35 (espèces radicalaires oxygénées). Après rinçage, les cellules sont de nouveau mises au contact des produits et de l'agent stressant (H202 800um) durant 2h. Une lecture de fluorescence permet d'estimer la quantité de ROS présente dans les cellules. 4) Mesure de l'effet sur la MEC dermique (FHN) : Des FHN sont cultivés en plaque pendant 24h. Les cellules sont mises en contact ou non des produits à tester pendant 3 jours. La synthèse du collagène 1, collagène 4 et de la fibronectine est évaluée par la méthode ELISA. 5) Mesure de l'effet dépigmentant : Des mélanomes de souris (cellules B16) sont ensemencées en plaque dans du milieu DMEMc (« DULBECCO'S Modified Eagle Medium ») + 10°/0SVF (Sérum de veau foetal). Après 24h d'attachement, les cellules sont mises en contact des produits à évaluer dans le même milieu durant 48h. A l'issu du contact, les milieux de culture sont éliminés et les mélanines totales est dosée par spectrophotométrie. Les tableaux 1 et 2 suivants présentent les résultats des différents tests sur les oligosaccharides selon l'invention : Tableau 1 : 1) Anti-inflammation 2) MEC 3) Anti- épidermique radicalaire PGE2 IL-6 IL-8 Oligosaccharides clivés selon l'invention »0 >0 >0 >0 (acide hyaluronique) >0 Tableau 2 : 4) MEC dermique 5) Dépigmentation Col 1 Fibronectine Col 4 Oligosaccharides clivés selon l'invention >0 »0 >0 »0 Ces résultats montrent que le mélange d'oligosaccharides selon l'invention présente une activité cosmétique. C. Préparation d'une composition selon l'invention Par « milieu physiologiquement acceptable » on entend selon la présente invention, sans être limitatif, une solution aqueuse ou hydro-alcoolique, une émulsion eau-dans-huile, une émulsion huile-dans-eau, une microémulsion, un gel aqueux, un gel anhydre, un sérum, une dispersion de vésicules, une poudre. « Physiologiquement acceptable » signifie pour la présente invention que les compositions conviennent à leur utilisation topique , en contact avec les muqueuses, les phanères (ongles, cheveux, poils), le cuir chevelu et la peau de mammifère et plus particulièrement humaine, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, de réponse allergique, et autres. Ce « milieu physiologiquement acceptable » forme ce que l'on appelle classiquement l'excipient de la composition. Le choix de l'excipient de la composition est effectué en fonction des contraintes liées aux oligosaccharides (stabilité, solubilisation, etc.) et le cas échéant de la forme galénique envisagée ensuite pour la composition topique. Les oligosaccharides peuvent être incorporés dans la composition au moyen d'une solution aqueuse, ou être solubilisés grâce à des solubilisants usuels physiologiquement acceptables, comme par exemple et sans limiter à cette liste : l'éthanol, le propanol, l'isopropanol, le propylène glycol, la glycérine, le butylène glycol, ou le polyéthylène glycol ou toute combinaison. Il peut être également intéressant de solubiliser les oligosaccharides à l'aide d'émulsifiants. De préférence selon l'invention, on utilise comme milieu physiologiquement acceptable une solution aqueuse ou hydro-alcoolique. Selon l'invention, la quantité efficace d'oligosaccharides, c'est-à-dire leur dosage, dépend de divers facteurs, comme l'âge, l'état de la peau du patient, etc. Une quantité efficace signifie une quantité non toxique suffisante pour obtenir l'effet désiré que l'homme du métier est capable d'ajuster. Les compositions topiques adaptées à la présente invention sont généralement préparées par des méthodes usuelles bien connues par l'homme du métier. De telles méthodes peuvent impliquer un mélange d'ingrédients dans une ou plusieurs étapes pour obtenir un état uniforme, avec ou sans chauffage, refroidissement, etc. Les différentes formes galéniques pouvant contenir les oligosaccharides selon l'invention se présentent sous toute forme à savoir crèmes, lotions, onguents laits ou crèmes, gels, émulsions, dispersions, solutions, suspensions, nettoyants, fonds de teint, préparations anhydres (sticks en particulier baume à lèvres, huiles pour le corps et le bain), gels pour la douche et le bain, shampooings et lotions de soin du cheveu, laits ou crèmes pour les soins de la peau ou des cheveux, lotions ou laits démaquillants, lotions, laits ou crèmes anti-solaires, lotions, laits ou crèmes de bronzage artificiel, crèmes, mousses, gels ou lotions de pré rasage, de rasage, ou après-rasage, maquillage, rouges à lèvres, mascaras ou vernis à ongles, "essences" de peau, sérums, matériels adhésifs ou absorbants, patchs, ou poudres, lotions, laits ou crèmes émollientes, sprays, huiles pour le corps et le bain, bases de fond de teint, pommades, émulsions, colloïdes, suspensions compactes ou solides, crayons, formulations pulvérisables, fards à joues, rouges, eyeliners, lipliners, brillants à lèvres, poudres pour le visage ou le corps, mousses ou gels coiffants, conditionnants pour ongles, baumes à lèvres, conditionnants pour la peau, hydratants, laques, savons, exfoliants, astringents, produits dépilatoires solutions ondulantes permanentes, formulations anti-pelliculaires, compositions anti-transpirantes ou antiperspirantes, notamment sticks, « roll-on » déodorants, désodorisants, pulvérisations pour nez et ainsi de suite. Ces compositions peuvent également se présenter sous la forme de bâtons pour les lèvres destinés soit à les colorer, soit à éviter les gerçures, ou de produits de maquillage pour les yeux ou des fards et fonds de teint pour le visage. Les compositions selon l'invention incluent des produits de beauté, des produits personnels de soin et des préparations pharmaceutiques. On peut également envisager une composition sous la forme d'une mousse ou encore sous forme de composition pour aérosol comprenant également un agent propulseur sous pression. Les oligosaccharides dans le cadre de la présente invention peuvent être utilisés sous forme solution, de dispersion, d'émulsion, de pâte ou de poudre, individuellement ou en pré-mélange ou être véhiculée individuellement ou en pré-mélange par des vecteurs comme les macrocapsules, les microcapsules ou les nanocapsules, les macrosphères, les microsphères, ou les nanosphères, les liposomes, les oléosomes ou les chylomicrons, les macroparticules, les microparticules ou les nanoparticules, macroéponges, les microéponges ou les nanoéponges, les microémulsions ou les nanoémulsions, ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites, spores ou exines et autres supports minéraux ou organiques. Les oligosaccharides dans le cadre de présente invention peuvent être utilisés sous n'importe quelle forme, dans une forme liée, incorporée ou adsorbée sur des macro -, micro -, et nanoparticules, ou sur macro-, micro- et nanocapsules, pour le traitement des textiles, des fibres naturelles ou synthétiques, des laines, et tous matériaux destinés à entrer en contact avec la peau et qui peuvent être employés dans l'habillement, les sous-vêtements de jour ou de nuit, les mouchoirs, ou les tissus, afin d'exercer son effet cosmétique par l'intermédiaire de ce contact peau/textile et permettre une délivrance topique continue. Ingrédients additionnels Le CTFA ("International cosmetic ingredient dictionary & handbook (13ème Ed. 2010) publié par "the Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc.", Washington, D.C.) décrit une grande variété, sans limitation, d'ingrédients cosmétiques et pharmaceutiques habituellement utilisés dans l'industrie du soin de la peau, qui conviennent pour être utilisés comme ingrédients additionnels dans les compositions selon la présente invention tant qu'ils sont physiquement et chimiquement compatibles avec les autres ingrédients de la composition et spécialement avec les oligosaccharides de la présente invention. Par ailleurs la nature de ces ingrédients additionnels ne doit pas altérer de manière inacceptable les bénéfices des oligosaccharides de l'invention. Ces ingrédients additionnels peuvent être synthétiques ou naturels comme par exemple les extaits de plantes ou venir d'un procédé de biofermentation. D'autres actifs de soin de la peau et capillaire qui sont particulièrement utiles en combinaison avec la composition peuvent être trouvés dans la documentation commerciale de Sederma et sur le site www.sederma.fr. On peut aussi citer à titre d'exemples les actifs commerciaux suivants : la bétaïne, le glycérol, l'Actimoist Bio 2TM (Active organics), AquaCacteenTM (Mibelle AG Cosmetics), AquaphylineTM (Silab), AquaregulKTM (Solabia), CarcilineTM (Greentech), CodiavelaneTM (Biotech Marine), DermafluxTM (Arch Chemicals, Inc), Hydra'FlowTM (Sochibo), Hydromoist LTM (Symrise), RenovHyalTM (Soliance), SeamossTM (Biotech Marine), ArgirelineTM (nom commercial de l'acétyl hexapeptide-3 de Lipotec), le spilanthol ou un extrait d'Acmella oleracea connu sous le nom Gatuline ExpressionTM, un extrait de Boswellia serrata connu sous le nom BoswellinTM, Deepaline PVBTM (Seppic), Syn-AKETM (Pentapharm), AmelioxTM, BioxiliftTM (Silab), SubliskinTM (Sederma), VenuceaneTM (Sederma), Moist 24TM (Sederma), EssenskinTM (Sederma), JuvinityTM (Sederma), RevidratTM (Sederma), ResistemTM (Sederma), ChronodynTM (Sederma), KombuchkaTM (Sederma), ChromocareTM (Sederma), CalmosensineTM (Sederma), Glycokin factor STM (Sederma), OdawhiteTM (Sederma), LumisphereTM (Sederma) ou des mélanges de ceux-ci. Parmi les extraits de plante pouvant être combinés avec l'extrait selon l'invention, on peut mentionner en outre en particulier les extraits de lierre, par exemple de lierre grimpant (Hedera Helix), de Bupleurum chinensis, de Bupleurum Falcatum, d'arnica (Arnica Montana L), de romarin (Rosmarinus officinalis /V), de souci (Calendula officinalis), de sauge (Salvia officinalis L), de ginseng (Panax ginseng), de Zingiber zerumbet sm., de ginko biloba, de millepertuis (Hyperycum Perforatum), de fragon (Ruscus aculeatus L), d'ulmaire (Filipendula ulmaria L), d'orthosiphon (Orthosiphon Stamincus Benth), d'algues (Fucus Vesiculosus), de bouleau (Betula alba), de thé vert, de noix de cola (Cola Nipida), de marronniers d'Inde, de bambou, Centella asiatica, de bruyère, fucus, saule, piloselle, les extraits d'escine, les extraits de cangzhu, les extraits de chrysanthellum indicumde chrysanthellum indicum, de plantes du genre Armeniacea, Atractylodis Platicodon, Sinnomenum, Pharbitidis, Flemingia, de Coleus comme C. Forskohlii, C. blumei, C. esquirolii, C. scutellaroides, C. xanthantus et C. Barbatus, comme un extrait de raciness de Coleus barbatus, des extraits de Ballote, Guioa, Davallia, Terminalia, Barringtonia, Trema, antirobia, cecropia, argania, dioscoreae comme Dioscorea opposita ou mexicain, des extraits de Ammi visnaga, de Siegesbeckia, en particulier Siegesbeckia orientalis, des extraits végétaux de la familles des Ericaceae, en particulier des extraits de myrtilles (Vaccinium angustifollium) de Arctostaphylos uva ursi, alpe vexa, de plantes contenant des stérols (notamment des phytostérols), de Manjistha (extrait de plantes du genre Rubia, en particulier Rubia Cordifolia), de Guggal (extrait de plantes du genre Commiphora, en particulier Commiphora Mukul), un extrait de kola, camomille, trefle violet, de Piper methysticum (Kava Kava de Sederma), de Bacopa monieri (BacocalmineTM, Sederma) et de fouet de mer, de Glycyrrhiza glatira, de mûrier, de melaleuca (arbre à thé), de Larrea divaricata, de Rabdosia rubescens, de Euglena gracilis, de Fibraurea recisa Hirudinea, de Chaparral Sorghum, de fleur de tournesol, d'Enantia chlorantha, de Mitracarpe du genre Spermacocea, de Buchu barosma, de Lawsonia inermis L., d' Adiantium Capillus-Veneris L., de Chelidonium malus, de Luffa cylindrica, de « Japanese Mandarin » (Citrus reticulata Blanco var. unshiu), de Camelia sinensis, de Imperata cylindrica, de Glaucium Flavum, de Cupressus Sempervirens, de Polygonatum multiflorum, de loveyly hemsleya, de Sambucus Nigra, de Phaseolus lunatus, de Centaurium, de Macrocystis Pyrifera, de Turnera Diffusa, de Anemarrhena asphodeloides, de Portulaca pilosa, d'Humulus lupulus, de café Arabica ou d'Ilex Paraguariensis.

Les compositions selon la présente invention peuvent comprendre des peptides, incluant, sans se limiter, les, di-, tri-, tetra-, penta- et hexapeptides et leurs dérivés. Selon un mode de réalisation particulier, la concentration du peptide additionnel, dans la composition, varie entre lx10-7% et 20%, de préférence entre 1x10-6% et 10%, préférentiellement entre 1x10-5% et 5%, en poids. Dans le cadre de la présente invention, le terme «peptide » désigne les peptides contenant 10 acides aminés ou moins, leurs dérivés, isomères et complexes avec d'autres espèces telles qu'un ion métal (e.g. cuivre, zinc, manganèse, magnésium, et autres). Le terme "peptides" se réfère à la fois à des peptides naturels et à des peptides de synthèse. Il se réfère également à des compositions qui contiennent des peptides et qui se rencontrent dans la nature, et/ou qui sont commercialement disponibles. Des exemples non limitatifs de dipeptides utilisables dans le cadre de la présente invention, comprennent la Carnosine (beta-AH), YR, VW, NF, DF, KT, KC, CK, KP, KK ou TT. Des exemples non limitatifs de tripeptides comprennent RKR, HGG, GHK, GKH, GGH, GHG, KFK, GKH, KPK, KMOK, KMO2K ou KAvaK. Des exemples non limitatifs de tetrapeptides sont RSRK, GQPR ou KTFK. Un exemple non limitatif de pentapeptide est le KTTKS et d'hexapeptides les GKTTKS et VGVAPG.

D'autres peptides utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être choisis parmi, sans que cette liste soit limitative : les dérivés lipophiles de peptides, de préférence les dérivés palmitoyl, et les complexes avec les ions métal mentionnés plus haut (e.g. complexe cuivre du tripeptide HGG). Les dipeptides préférés comprennent par exemple le N-Palmitoyl-béta-Ala-His, N-Acetyl-Tyr-Arghexadecylester (CalmosensineTM, IdealiftTM, Sederma). Les tripeptides préférés comprennent notamment le Pal-GKH, le Pal-GHK, le dérivé cuivre de HGG (LaminTM, Sigma), la lipospondin (N- Elaidoyl-KFK) et ses analogues de substitution conservative, N-Acetyl-RKR-NH2 (Peptide CK+), NBiot-GHK (Sederma), le Pal-KMO2K (Matrixyl Synthe6TM de Sederma) et leurs dérivés. Des dérivés tetrapeptides utilisables dans le cadre de la présente invention comprennent, sans y être limités, le NPal-GQPR (Sederma), des dérivés pentapeptides utilisables sont, sans y être limités, le N-Pal-KTTKS (MATRIXYLTm, Sederma), le N-Pal-Tyr-Gly-Gly-Phe-X avec X étant Met ou Leu ou leur mélange. Des dérivés hexapeptides utilisables, comprennent sans y être limités : N-Pal-VGVAPG et dérivés. On peut citer aussi le mélange Pal-GHK et Pal-GQPR (MatrixylTm 3000, Sederma). Les compositions préférées disponibles dans le commerce contenant un tripeptide ou dérivé comprennent le Biopeptide-CLTM, MaxilipTM ou BiobustylTM de Sederma. Les compositions préférées, disponibles dans le commerce, sources de tétrapeptides comprennent : RIGINTM, EyelissTM MatrixylTM Reloaded et Matrixyl 3000Tm, qui contiennent entre 50 et 500 ppm de palmitoyl-GQPR et un excipient, proposé par Sederma. Les peptides commerciaux suivants peuvent également être mentionnés comme ingrédients actifs additionnels : VialoxTM, Syn-akeTM or Syn-CollTM (Pentapharm), Hydroxyprolisilane CNTM (Exsymol), Argireline TM, Leuphasyl TM, AldenineTM, TrylgenTM, EyeserylTM, SerilesineTM or DecorinylTM (Lipotec), CollaxylTM or QuintescineTM (Vincience), BONT-L-PeptideTM (lnfinitec Activos), CytokinolTMLS (Laboratoires Serobiologiques/Cognis), KollarenTM, IP2000TM or MelipreneTM (Institut Européen de Biologie Cellulaire), NeutrazenTM (Innovations), ECM-ProtectTm (Atrium Innovations), Timp-Peptide TM or ECM Moduline TM (lnfinitec Activos).

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Procédé d'obtention d'oligosaccharides bioactifs clivés obtenus par clivage enzymatique de polysaccharides issus d'algues vertes, ledit procédé consistant à : - fournir un micro-organisme apte à produire au moins une enzyme lyase de clivage osidique; - mettre en contact lesdits polysaccharides avec ladite enzyme de manière à provoquer ledit clivage ; et - à récupérer lesdits oligosaccharides clivés, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est choisi parmi le groupe de bactéries de la famille des Flavobacteriaceae comprenant la souche Jejuia pallidilutea, la souche Flavobacteriaceae bacterium, la souche Gaetbulibacter marinus et la souche référencée CNCM I-4797.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit micro-organisme correspond à la souche bactérienne référencée CNCM I-4797.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est apte à produire une enzyme de clivage ulvane lyase et/ou une enzyme glucuronane lyase.
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les polysaccharides sont des polysaccharides sulfatés.
5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les polysaccharides sulfatés sont des polysaccharides d'ulvanes et/ou de glucuronanes
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'algue verte est du genre Ulva.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'algue verte est du genre Ulva lactuca.
8. 8. Micro-organisme référencé CNCM I-4797 notamment pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 7.
9. 9. Oligosaccharides bioactifs clivés obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7.
10. 10. Composition cosmétique topique comprenant des oligosaccharides selon la revendication 9 et un milieu physiologiquement acceptable.
11. 11. Utilisation cosmétique non thérapeutique pour la peau et ses phanères d'oligosaccharides selon la revendication 9 ou d'une composition selon la revendication 10.
12. 12. Utilisation cosmétique non thérapeutique pour la peau et ses phanères d'oligosaccharides sulfatés bioactifs obtenus selon le procédé de la revendication 2 et 7, caractérisée en ce que les oligosaccharides clivés présentent un degré de polymérisation (DP) compris entre 2 et 10.
13. 13. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que le traitement cosmétique est un traitement choisi parmi un traitement dépigmentant, anti-radicalaire, hydratant ou anti-âge via une stimulation des molécules de la matrice extracellulaire dermique.
14. 14. Utilisation selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que les oligosaccharides sont combinés à un mélange d'oligo-glucuronanes acétylés, oligomères de l'acide Dglucuronique ou D-glucuronate à enchainement 13 (1-4).