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JP4532784B2 - 静電荷像現像トナー、該トナーの製造方法及び該トナーを用いた画像形成方法および画像形成装置 - Google Patents

静電荷像現像トナー、該トナーの製造方法及び該トナーを用いた画像形成方法および画像形成装置 Download PDF

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JP4532784B2
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電子写真、静電記録等に用いられる静電荷像現像トナー及び該トナーの製造方法、該トナーを用いた画像形成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、電子写真法としては多数の方法が知られているが、一般的には、光導電性物質を利用し、種々の手段によって像担持体(感光体)上に電気的潜像を形成し、次いで該潜像をトナーで現像して可視像とし、必要に応じて紙等の被転写材にトナー像を転写した後、熱及び/または圧力等により被転写材上にトナー画像を定着して複写物を得るものである。電気的潜像を可視化する方法としては、カスケード現像法、磁気ブラシ現像法、加圧現像方法等が知られている。さらには、磁性トナーと中心に磁極を配した回転現像スリーブを用いて、現像スリーブ上から感光体上へと磁性トナーを磁界にて飛翔させる方法も用いられている。静電潜像を現像する際に用いられる現像方式には、トナーとキャリアとからなる二成分系現像剤を使用する二成分現像方式と、キャリアを使用しないトナーのみからなる一成分系現像剤を用いる一成分現像方式とがある。
【０００３】
ここで、一般にトナーと称される着色剤(これ以降、着色剤は着色材を必須成分とし、他の機能を付与するために、その他の成分が含まれていることもある着色物のことを言う)は、バインダー樹脂と着色材(これ以降、着色材はカーボンブラック、顔料、染料、その他の着色物そのものを言う)とを必須成分とし、その他必要に応じ磁性粉等から構成されている。ここで、単色カラー複写機用トナーとしては、黒色の他に、赤色、青色、緑色、茶色等の単色カラートナーが用いられるが、これらのカラートナーは、黒色トナーの黒色着色材(主に、カーボンブラック)に代わって、各々の色調を発現させるための顔料や染料が用いられている。
【０００４】
これらの顔料や染料を用いてカラートナーを作製する場合、これらの顔料や染料をバインダー樹脂と混練して、機械式あるいは空気衝突式の粉砕機にて粉砕の後、所望の平均粒径、粒度分布になるよう分級を行う方法が広く用いられている。ここで上記従来からの方法は、その組成によってはトナー中に添加される着色材等の分散が均一になりにくい場合があり、かつ小粒径のトナーを狭い粒度分布で製造する事が困難な場合があり、そのため従来の製造法によるトナーは、場合によっては帯電劣化が著しいためカブリが発生するおそれがあり、また粒度分布が広くなる場合があり、その場合は選択現像が生じ画像が劣化するおそれがあった。
【０００５】
また、各着色材によって帯電性や粉体流動性等が異なるため、各カラートナーの特性を均一にするためには、内添する電荷制御剤や外添剤の種類、量等を調整することが行われている。また、フルカラー複写機用のトナーについても、黒色の他に、マゼンタ色、イエロー色及びシアン色のカラートナーが使用されるが、この場合にも、上記と同様に内添する電荷制御剤や外添剤の種類や量を調整して、各カラートナーの特性を均一にすることが行われている。ここで、上記のように内添剤あるいは外添剤の種類及び量を調整して、各カラートナーの特性が同一になるようにすることは、実際上きわめて繁雑かつ困難である場合が多く、そのため、単色カラー用トナーの場合もフルカラー用トナーの場合も、各色カラートナー間で、コピー画像の画質にばらつきや、劣化挙動の異なりが発生する場合があるという問題があった。
【０００６】
また近年、フルカラー電子写真法による画像形成において、顔料の分散技術の向上による発色域の拡大、平均粒子径７〜８μｍの小径トナー採用による画像の高解像度化等によりフルカラー複写機の画質は向上したものの、オフセット印刷画像と比較した場合、電子写真方式による画像は画像光沢の均一性、画像高さの均一性、中間調領域の再現性などに課題を有している場合もある。
【０００７】
上記の画像不均一性を改善するために、さらなるトナーの小径化による、転写媒体上に載るトナー量の低減が検討されてきている。しかしながら、小径トナーにおいて印刷画像と同等の濃度を再現しようとした場合、トナー中へ添加する着色材の濃度を高くする必要があるが、トナー中の着色材濃度を高くするとトナーの帯電量の制御に課題を生じ、特に高温高湿/低温低湿下や、着色材の種類によっては帯電量差が拡大し、画質が悪化するおそれが生じる。また、着色材はバインダー樹脂の溶融特性への影響を拡大するため、ホットオフセットの発生や画像強度の低下など、定着性に課題を生じる場合がある。
【０００８】
上記、着色材のトナー諸特性への影響を改善するために特開昭 62-17753 号公報、特開平５-88406 号公報、特開平５-289396 号公報、特開平５-341574 号公報では分散助剤として界面活性効果を有する樹脂を使用し、異なる組成の樹脂を溶融相分離させることによりマトリックス-ドメイン構造を形成したトナーにおいて、ドメイン中のみに着色材を分散する提案、特開昭 63-305367 号公報では懸濁重合法により作製した着色材を多量に含む核体粒子を２段重合法により着色材を含まない電気抵抗の高い樹脂で被覆してトナー表面電気抵抗を制御して発色性と電気特性のバランスをとる提案がある。
【０００９】
これらの提案は、確かにトナー中の着色材の分散している領域をある程度制御できるため着色材のトナー諸特性への影響を緩和することができるが、前者の方法で樹脂を相分離させるためにはマトリックスに使用する樹脂とドメインに使用する樹脂が非混和性のものに限られるため使用できる樹脂の選択幅が狭くなり、ドメインの粒子サイズや分布の制御が困難、着色材が高濃度になった時や着色材の種類によってはドメイン中にのみ着色材を含有させることは困難である等の問題点を有している。
【００１０】
後者の方法では、懸濁重合法により着色材を多く含む核体粒子を作製後さらにモノマーを添加することによりトナーを作製しているが、核体粒子と被覆する樹脂を構成するモノマーの種類が同種であり樹脂がきわめて良好に相溶するため、着色材のトナー表面への移行は避けられず、トナー帯電性の悪化や定着特性への影響が無視できなくなる。また、懸濁重合法では核体粒子中に導入できる着色材の濃度に制限があるため、トナー中の着色材を高濃度にすることは困難であり、加えて核体粒子を小さくすることはできない点が課題であった。さらには、懸濁重合法により製造された核体粒子では、大量に使用する懸濁安定剤などの界面活性剤や重合反応剤などがカプセルに残留するため、用途によっては界面活性剤や重合反応剤の種類や量に制限があり所期の目的を達するのが困難な場合もある。
【００１１】
さらに上記製造方法では、モノマーの重合やポリマーの溶解等のために有機溶媒を用いる場合が多く、有機溶媒に可溶な着色材を使用することが困難であり、また大量生産のために大量に有機溶媒を使用する場合、設備や人体・環境への負荷が大きくなり、この点において好ましい方法とは言えなかった。また、反応条件の制御が容易でなく、その工程も煩雑である点が課題であった。
【００１２】
ところで、近年、生物工学的手法によって高分子化合物を製造する研究が活発に行われてきており、また、一部で実用化されている。例えば、微生物由来の高分子化合物として、ポリ-３-ヒドロキシ-n-酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合もある)や３-ヒドロキシ-n-酪酸と３-ヒドロキシ-n-吉草酸との共重合体(以下、ＰＨＢ/Ｖと略す場合もある)等のポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す場合がある)、バクテリアセルロースやプルラン等の多糖類、ポリ-γ-グルタミン酸やポリリジン等のポリアミノ酸などが知られている。特にＰＨＡは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品に利用することができるうえ、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【００１３】
これまで、多くの微生物がＰＨＡを生産し菌体内に蓄積することが報告されてきた。例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス・Ｈ 16 株(Ａlcaligenes eutropus Ｈ 16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Ｐaracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Ｐseudoｍonas sp.)の微生物によるＰＨＢ/Ｖの生産が報告されている(特開平５-74492 号公報、特公平６-15604 号公報、特公平７-14352 号公報、特公平８-19227 号公報など)。
【００１４】
また、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852 株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、３-ヒドロキシ-n-酪酸と４-ヒドロキシ-n-酪酸とをモノマーユニットに持つＰＨＡを生産することが開示されている(特開平９-191893 号公報)。さらに、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)により、３-ヒドロキシ-n-酪酸と３-ヒドロキシヘキサン酸との共重合体を生産することが開示されている(特開平５-93049 号公報、特開平７-265065 号公報)。
【００１５】
これらＰＨＢやＰＨＢ/Ｖの生合成は、種々の炭素源から、生体内の様々な代謝経路を経て生成された(Ｒ)-３-ヒドロキシブチリルＣoＡまたは(Ｒ)-３-ヒドロキシバレリルＣoＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＢ合成酵素(ＰＨＢポリメラーゼ、ＰＨＢシンターゼともいう)である。なお、ＣoＡとは補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)の略称であり、その化学構造は下記化学式の通りである。
【００１６】
【化３４】
Figure 0004532784
【００１７】
また、近年、炭素数が３から 12 程度までの中鎖長(ｍediuｍ-chain-length)の３-ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート(以下、ｍcl-ＰＨＡと略す場合がある)についての研究が精力的に行われている。
【００１８】
例えば、特許公報第 2642937 号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347 株(Ｐseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から 12 までの３-ヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。また、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.、58、746(1992)には、シュードモナス・レジノボランス(Ｐseudoｍonas resinovorans)が、オクタン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ-n-酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸をモノマーユニットとするＰＨＡを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ-n-酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸をユニットとするＰＨＡを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３-ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットの導入は、後述の脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
【００１９】
Int.J.Ｂiol.Ｍacroｍol.、16(３)、119(1994)には、シュードモナスsp.61-３株(Ｐseudoｍonas sp.strain 61-３)が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３-ヒドロキシ-n-酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸、３-ヒドロキシドデカン酸といった３-ヒドロキシアルカン酸、および、３-ヒドロキシ-５-cis-デセン酸、３-ヒドロキシ-５-cis-ドデセン酸といった３-ヒドロキシアルケン酸をユニットとするＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２０】
上記のＰＨＡは側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ(以下、usual-ＰＨＡと略す場合がある)である。しかし、より広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基(例えば、フェニル基、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどなど)を側鎖に導入したＰＨＡ(以下、unusual-ＰＨＡと略す場合がある)が極めて有用である。
【００２１】
フェニル基を有するunusual-ＰＨＡの生合成の例としては、例えば、Ｍacroｍolecules、24、5256-5260(1991)、Ｍacroｍol.Ｃheｍ.、191、1957-1965(1990)、Ｃhirality、３、492-494(1991)などで、シュードモナス・オレオボランスが、５-フェニル吉草酸から、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。また、Ｍacroｍolecules、29、1762-1766(1996)で、シュードモナス・オレオボランスが、５-(４-トリル)吉草酸(５-(４-メチルフェニル)吉草酸)から、３-ヒドロキシ-５-(４-トリル)吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。さらに、Ｍacroｍolecules、32、2889-2895(1999)には、シュードモナス・オレオボランスが、５-(２、４-ジニトロフェニル)吉草酸から、３-ヒドロキシ-５-(２、４-ジニトロフェニル)吉草酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-５-(４-ニトロフェニル)吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。
【００２２】
また、フェノキシ基を有するunusual-ＰＨＡの例としては、Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.、195、1665-1672(1994)で、シュードモナス・オレオボランスが、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。また、Ｍacroｍolecules、29、3432-3435(1996)には、シュードモナス・オレオボランスが、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸ユニット、３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸ユニットを含むＰＨＡを、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２３】
さらに、Ｃan.J.Ｍicrobiol.、41、32-43(1995)では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347 株及びシュードモナス・プチダ・ＫＴ 2442 株(Ｐseudoｍonas putida ＫＴ 2442)が、p-シアノフェノキシヘキサン酸または p-ニトロフェノキシヘキサン酸から、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸ユニットまたは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告している。特許第 2989175 号公報には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)吉草酸ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)吉草酸ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエートユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエートユニットを含有するコポリマーとその製造方法が記載されており、その効果として、融点が高く良好な加工性を保ちつつ、立体規則性、撥水性を付与することができるとしている。
【００２４】
また、シクロヘキシル基を有するunusual-ＰＨＡの例としては、Ｍacroｍolecules、30、1611-1615(1997)に、シュードモナス・オレオボランスが、シクロヘキシル酪酸またはシクロヘキシル吉草酸から該ＰＨＡを生産するとの報告がある。
【００２５】
これらｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路(例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路)を経て生成された(Ｒ)-３-ヒドロキシアシルＣoＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＡ合成酵素(ＰＨＡポリメラーゼ、ＰＨＡシンターゼともいう)である。以下に、β酸化系およびＰＨＡ合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がＰＨＡとなるまでの反応を示す。
【００２６】
【化３５】
Figure 0004532784
【００２７】
一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた(Ｒ)-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ(ＡＣＰとはアシルキャリアプロテインのことである)から変換された(Ｒ)-３-ヒドロキシアシルＣoＡを基質として、同様にＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されると考えられる。
【００２８】
近年、上記のＰＨＢ合成酵素やＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系(in vitro)でＰＨＡを合成しようとする試みが始まっている。
【００２９】
例えば、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、92、6279-6283(1995)では、アルカリゲネス・ユウトロファス(Ａlcaligenes eutrophus)由来のＰＨＢ合成酵素に３-ヒドロキシブチリルＣoＡを作用させることにより、３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。また、Int.J.Ｂiol.Ｍacroｍol.、25、55-60(1999)では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素に、３-ヒドロキシブチリルＣoＡや３-ヒドロキシバレリルＣoＡを作用させることにより、３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニットや３-ヒドロキシ-n-吉草酸ユニットからなるＰＨＡの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の３-ヒドロキシブチリルＣoＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍacroｍol.Ｒapid Ｃoｍｍun.、21、77-84(2000)においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢ合成が報告されている。
【００３０】
また、ＦＥＭＳ Ｍicrobiol.Ｌett.、168、319-324(1998)では、クロマチウム・ビノサム(Ｃhroｍatiuｍ vinosuｍ)由来のＰＨＢ合成酵素に３-ヒドロキシブチリルＣoＡを作用させることにより、３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。
【００３１】
Ａppl.Ｍicrobiol.Ｂiotechnol.、54、37-43(2000)では、シュードモナス・アエルギノーサ(Ｐseudoｍonas aeruginosa)のＰＨＡ合成酵素に３-ヒドロキシデカノイルＣoＡを作用させることにより、３-ヒドロキシデカン酸ユニットからなるＰＨＡを合成している。
【００３２】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、従来の静電荷像現像トナーにおいては、数色のトナーを必要とする静電荷像現像剤において、黒色をも含めた各色のトナー間で、帯電性、流動性、経時安定性、環境安定性等のトナー特性を均一に設計することができる静電荷像現像トナーを提供することが多くの場合において困難であった。また、フルカラー静電荷像現像小径トナーでは、着色材の高濃度化に伴なって帯電特性、粉体特性、帯電量維持性、定着特性の悪化が問題となる場合があった。
【００３３】
さらには、小粒径でかつ着色剤が均一に微分散され彩度、透明性に優れ帯電の均一性の高く耐久性にすぐれた小粒径の静電荷像現像トナーが望まれていた。また、環境や生物に対する負荷が低く、着色材の材質の制約が少なく、着色材が高密度に内包された、また、従来カプセル構造体(着色剤)の汚染源となっていた界面活性剤、重合反応剤等の混入のないカプセル構造体(着色剤)を含んでなる上記静電荷像現像トナーが望まれていた。
【００３４】
本発明の目的は、上記課題を解決する静電荷像現像トナー、該静電荷像現像トナーの製造方法、該静電荷像現像トナーを用いた画像形成方法ならびに画像形成装置を提供することにある。
【００３５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、ポリヒドロキシアルカノエート(以下ＰＨＡと略す)合成酵素を着色材に固定化し、ここに３-ヒドロキシアシル補酵素Ａを加えて反応させることにより、着色材を界面活性剤なしに容易に微細なマイクロカプセルに内包できること、その際、ＰＨＡが着色材表面を直接被覆するため、着色材が高密度に内包されていること、さらに適当な種類の３-ヒドロキシアシル補酵素Ａを選択することで、着色剤の外被であるＰＨＡについてバインダー樹脂との相溶性を任意に設定できることを見出した。
【００３６】
また、該ＰＨＡに化学修飾を施すことにより、各種の特性（特には、上記の相溶性の制御）等を改良した構造体を得ることができることを見出した。さらに詳しくは、例えば、該ＰＨＡにグラフト鎖を導入することで、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたＰＨＡにより、着色材の少なくとも一部を被覆した着色剤を得ることができることを見出した。また、該ＰＨＡを架橋化せしめることで、所望の物理化学的性質（例えば、機械的強度、耐薬品性、耐熱性など）を備えたＰＨＡにより、着色材の少なくとも一部を被覆した着色剤を得ることができることを見出した。なお、本発明における化学修飾（Chemical modification）とは、高分子材料の分子内または分子間、あるいは高分子材料と他の化学物質との間で化学反応を行わせることにより、該高分子材料の分子構造を改変することを言う。また、架橋（crosslinking）とは、高分子材料の分子内または分子間を化学的あるいは物理化学的にに結合せしめて網状構造をつくることを言い、架橋剤（crosslinking agent）とは、前記架橋反応を行うために添加する、前記高分子材料と一定の反応性を有する物質を言う。
【００３７】
そして上記特性によって、各色のトナー間でトナー特性を均一に設計することができること、着色材の高濃度化をトナーの他の諸機能を損なうことなく容易に達成できること、着色剤がトナー粒子内において均一に微分散されうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３８】
本発明の静電荷像現像トナーは、静電荷像現像トナーにおいて、第１の樹脂成分であるポリヒドロキシアルカノエートで少なくともその一部が被覆された着色剤と、第２の樹脂成分からなるバインダー樹脂とから少なくとも構成されてなることを特徴とする静電荷像現像トナーである。
【００３９】
すなわち本発明は、数色のトナーを必要とする静電荷像現像剤において、黒色をも含めた各色のトナー間で、帯電性、流動性、経時安定性、環境安定性等のトナー特性を均一に設計することができる静電荷像現像トナーを提供するものである。また、フルカラー静電荷像現像小径トナーの着色材の高濃度化に伴う、帯電特性、粉体特性、帯電量維持性、定着特性の悪化を解決する静電荷像現像トナーを提供するものである。さらには、小粒径でかつ着色剤が均一に微分散され彩度、透明性に優れ帯電の均一性の高く耐久性にすぐれた小粒径の静電荷像現像トナーを提供するものである。また、本発明に拠れば、環境や生物に対する負荷が低く、種々の機能性を有するＰＨＡを利用して、着色材の材質の制約が少なく、着色材が高密度に内包された、また、従来カプセル構造体(着色剤)の汚染源となっていた界面活性剤、重合反応剤等の混入のないカプセル構造体(着色剤)を含んでなる上記静電荷像現像トナーを提供することが可能となる。
【００４０】
本発明にかかる静電荷像現像トナーは、外部より帯電部材に電圧を印加して静電潜像担持体に帯電を行う工程と、帯電された静電潜像担持体に静電荷像を形成する工程と、該静電荷像を静電荷像現像トナーにより現像してトナー像を静電潜像担持体上に形成する現像工程と、静電潜像担持体上のトナー像を被記録材へ転写する転写工程と、被記録材上のトナー像を加熱定着する定着工程とを少なくとも有する画像形成方法に用いることができる。
【００４１】
画像形成方法の他の態様としては、外部より帯電部材に電圧を印加して静電潜像担持体に帯電を行う工程と、帯電された静電潜像担持体に静電荷像を形成する工程と、該静電荷像を静電荷像現像トナーにより現像してトナー像を静電潜像担持体上に形成する現像工程と、静電潜像担持体上のトナー像を中間の転写体に転写する第１の転写工程と、該中間の転写体上のトナー像を被記録材に転写する第２の転写工程と、被記録材上のトナー像を加熱定着する定着工程とを少なくとも有する画像形成方法がある。
【００４２】
本発明にかかる静電荷像現像トナーは、外部より帯電部材に電圧を印加して静電潜像担持体に帯電を行う手段と、帯電された静電潜像担持体に静電荷像を形成する手段と、該静電荷像を静電荷像現像トナーにより現像してトナー像を静電潜像担持体上に形成する現像手段と、静電潜像担持体上のトナー像を被記録材へ転写する転写手段と、被記録材上のトナー像を加熱定着する定着手段とを少なくとも有する画像形成装置に用いることができる。
【００４３】
画像形成装置の他の態様としては、外部より帯電部材に電圧を印加して静電潜像担持体に帯電を行う手段と、帯電された静電潜像担持体に静電荷像を形成する手段と、該静電荷像を静電荷像現像トナーにより現像してトナー像を静電潜像担持体上に形成する現像手段と、静電潜像担持体上のトナー像を中間の転写体に転写する第１の転写手段と、該中間の転写体上のトナー像を被記録材に転写する第２の転写手段と、被記録材上のトナー像を加熱定着する定着手段とを少なくとも有する画像形成装置において、上記の静電荷像現像トナーを使用することを特徴とする画像形成装置がある。
【００４４】
また、本発明にかかる静電荷像現像トナーの製造方法は、着色材を第１の樹脂成分であるポリヒドロキシアルカノエートで少なくともその表面の一部を被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーの製造方法において、前記着色剤が、水性媒体に分散された着色材の表面に固定されたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の存在下に３-ヒドロキシアシルＣoＡを基質として、ポリヒドロキシアルカノエート合成反応を行うことで該着色材表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆することにより製造されることを特徴とする静電荷像現像トナーの製造方法である。
【００４５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明をより具体的に説明する。本発明の静電荷像現像トナーは、第１の樹脂成分であるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）で少なくともその一部が被覆された着色剤と、第２の樹脂成分からなるバインダー樹脂とから構成される。この第１の樹脂成分としてのＰＨＡとしては、式[１]から式[10]に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも１つを有するポリヒドロキシアルカノエートを好適に用いることができる。
【００４６】
【化３６】
Figure 0004532784
【００４７】
(ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびaの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
【００４８】
Ｒ１が 水素原子(Ｈ)でありaが０から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がハロゲン原子でありaが１から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が 発色団でありaが１から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
R１がカルボキシル基あるいはその塩であり、aが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【００４９】
【化３７】
Figure 0004532784
【００５０】
でありaが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。)
【００５１】
【化３８】
Figure 0004532784
【００５２】
(ただし、式中bは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5及び-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【００５３】
【化３９】
Figure 0004532784
【００５４】
(ただし、式中cは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5及び-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【００５５】
【化４０】
Figure 0004532784
【００５６】
(ただし、式中dは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5及び-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【００５７】
【化４１】
Figure 0004532784
【００５８】
(ただし、式中eは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7、-ＣＨ3、-Ｃ2Ｈ5及び-Ｃ3Ｈ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【００５９】
【化４２】
Figure 0004532784
【００６０】
(ただし、式中fは０から７の整数のいずれかを表す。)
【００６１】
【化４３】
Figure 0004532784
【００６２】
(ただし、式中gは１から８の整数のいずれかを表す。)
【００６３】
【化４４】
Figure 0004532784
【００６４】
(ただし、式中hは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＯＯＲ'、-ＳＯ2Ｒ''、-ＣＨ3、-Ｃ2Ｈ5、-Ｃ3Ｈ7、-ＣＨ(ＣＨ3)2及び-Ｃ(ＣＨ3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ'は水素原子(Ｈ)、Ｎａ、Ｋ、-ＣＨ3及び-Ｃ2Ｈ5のいずれかであり、Ｒ''は-ＯＨ、-ＯＮａ、-ＯＫ、ハロゲン原子、-ＯＣＨ3及び-ＯＣ2Ｈ5のいずれかである。)
【００６５】
【化４５】
Figure 0004532784
【００６６】
(ただし、式中iは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＯＯＲ'及び-ＳＯ2Ｒ''からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ'は水素原子(Ｈ)、Ｎａ、Ｋ、-ＣＨ3及び-Ｃ2Ｈ5のいずれかであり、Ｒ''は-ＯＨ、-ＯＮａ、-ＯＫ、ハロゲン原子、-ＯＣＨ3及び-ＯＣ2Ｈ5のいずれかである。)
【００６７】
【化４６】
Figure 0004532784
【００６８】
(ただし、式中jは１から９の整数のいずれかを表す。)
かかるＰＨＡは、それぞれ対応する３-ヒドロキシアシル補酵素Ａ、すなわち化学式[11]から化学式[20]に示す３-ヒドロキシアシル補酵素Ａから選択された必要数の３-ヒドロキシアシル補酵素Ａを用いて合成することができる。
【００６９】
【化４７】
Figure 0004532784
【００７０】
(ただし、前記化学式中-ＳＣoＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中Ｒ１およびaの組合せが下記のいずれかである群より選択される少なくとも一つであり、かつ、前記化学式[１]で表されるモノマーユニットにおけるＲ１およびaと対応する。
【００７１】
Ｒ１が水素原子(Ｈ)であり、aが０から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が ハロゲン原子であり、aが１から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が発色団であり、aが１から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
R１がカルボキシル基あるいはその塩であり、aが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【００７２】
【化４８】
Figure 0004532784
【００７３】
であり、aが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。)
【００７４】
【化４９】
Figure 0004532784
【００７５】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、bは前記化学式[２]で表されるモノマーユニットにおけるbと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は前記化学式[２]で表されるモノマーユニットにおけるＲ２と対応する、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5及び-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【００７６】
【化５０】
Figure 0004532784
【００７７】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、cは前記化学式[３]で表されるモノマーユニットにおけるcと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は前記化学式[３]で表されるモノマーユニットにおけるＲ３と対応する、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5及び-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【００７８】
【化５１】
Figure 0004532784
【００７９】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、dは前記化学式[４]で表されるモノマーユニットにおけるdと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は前記化学式[４]で表されるモノマーユニットにおけるＲ４と対応する、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5及び-Ｃ3Ｆ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【００８０】
【化５２】
Figure 0004532784
【００８１】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、eは前記化学式[５]で表されるモノマーユニットにおけるeと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は前記化学式[５]で表されるモノマーユニットにおけるＲ５と対応する、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＦ3、-Ｃ2Ｆ5、-Ｃ3Ｆ7、-ＣＨ3、-Ｃ2Ｈ5及び-Ｃ3Ｈ7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【００８２】
【化５３】
Figure 0004532784
【００８３】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、fは前記化学式[６]で表されるモノマーユニットにおけるfと対応する０から７の整数のいずれかを表す。)
【００８４】
【化５４】
Figure 0004532784
【００８５】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、gは前記化学式[７]で表されるモノマーユニットにおけるgと対応する１から８の整数のいずれかを表す。)
【００８６】
【化５５】
Figure 0004532784
【００８７】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、hは前記化学式[８]で表されるモノマーユニットにおけるhと対応する１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は前記化学式[８]で表されるモノマーユニットにおけるＲ６と対応する、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＯＯＲ'、-ＳＯ2Ｒ''、-ＣＨ3、-Ｃ2Ｈ5、-Ｃ3Ｈ7、-ＣＨ(ＣＨ3)2及び-Ｃ(ＣＨ3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ'は水素原子(Ｈ)、Ｎａ、Ｋ、-ＣＨ3、-Ｃ2Ｈ5のいずれかであり、Ｒ''は-ＯＨ、-ＯＮａ、-ＯＫ、ハロゲン原子、-ＯＣＨ3及び-ＯＣ2Ｈ5のいずれかである。)
【００８８】
【化５６】
Figure 0004532784
【００８９】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、iは前記化学式[９]で表されるモノマーユニットにおけるiと対応する１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は前記化学式[９]で表されるモノマーユニットにおけるＲ７と対応する、水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ2、-ＣＯＯＲ'及び-ＳＯ2Ｒ''からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ'は水素原子(Ｈ)、Ｎａ、Ｋ、-ＣＨ3及び-Ｃ2Ｈ5のいずれかであり、Ｒ''は-ＯＨ、-ＯＮａ、-ＯＫ、ハロゲン原子、-ＯＣＨ3及び-ＯＣ2Ｈ5のいずれかである。)
【００９０】
【化５７】
Figure 0004532784
【００９１】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、jは前記化学式[10]で表されるモノマーユニットにおけるjと対応する１から９の整数のいずれかを表す。)
本発明の静電荷像現像トナーは、上記のように、トナー中に直接顔料等の着色材を分散させるかわりに、第１の樹脂としてのＰＨＡからなる外殻樹脂で被覆されている着色剤を、熱可塑性樹脂を含むバインダー樹脂中に分散させることを特徴とするものである。図８は、トナーバインダー樹脂中に着色剤を分散させた本発明のトナー粒子の断面図を模式的に示しており、図９は従来のトナーの断面図であって、従来のトナーの場合には、例えば、顔料９１がバインダー樹脂９４中に分散された状態になっているが、本発明の場合には、例えば、顔料８１が第１の樹脂成分８２で被覆され、それが第２の樹脂成分８３の中に分散した状態で存在している。
【００９２】
本発明のトナーは、上記のように、外殻樹脂で被覆された着色剤を熱可塑性樹脂で結着しているため、着色剤に含まれる着色材と着色剤を結着する樹脂の組合せに制限がなく材料の選択の自由度が大きい。また、着色材である、例えば顔料粒子の着色剤外への移行(着色剤表面への露出)が起こり難い。さらに、外殻で覆われることによりなる着色剤は、着色材を高濃度に含有させても粒度分布がシャープなものが製造できる。ここで、ポリヒドロキシアルカノエートにより被覆された着色剤の内部は、一般的には着色材そのものであり、着色材としては、着色材の耐光性、耐ブリード性を考慮すると顔料が好ましい。
【００９３】
上記の着色剤について、以下詳述する。
【００９４】
＜ＰＨＡ＞
本発明に利用可能なＰＨＡとしては、ＰＨＡの生合成反応に関わるＰＨＡ合成酵素によって合成され得るＰＨＡであれば、特に限定はされない。
【００９５】
ここで、ＰＨＡの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路(例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路)を経て生成された(Ｒ)-３-ヒドロキシアシルＣoＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＡ合成酵素(ＰＨＡポリメラーゼ、ＰＨＡシンターゼともいう)である。
【００９６】
なお、ＣoＡとは補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)の略称であり、その化学構造は先に示した通りである。また、β酸化系およびＰＨＡ合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がＰＨＡとなるまでの反応経路についても先に示したとおりである。一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた(Ｒ)-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ(ＡＣＰとはアシルキャリアプロテインのことである)から変換された(Ｒ)-３-ヒドロキシアシルＣoＡを基質として、同様にＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されると考えられる。さらに、上記のＰＨＢ合成酵素やＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系(in vitro)でＰＨＡを合成できることもわかっており、種々の報告がなされていることも先に記載したとおりである。このように、ＰＨＡ合成酵素は、生物体内でのＰＨＡ合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成され得ることが知られているＰＨＡであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のＰＨＡに対応する３-ヒドロキシアシルＣoＡを、本発明における着色材に固定化された該酵素に作用させることによって、生物体内において合成され得ることが知られているあらゆる種類のＰＨＡで着色材を被覆したマイクロカプセル(着色剤)を作成することが可能である。
【００９７】
本発明において用いうるＰＨＡの具体例としては前述のＰＨＡが挙げられる。なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素、塩素、臭素などを挙げることができる。また、前記の発色団としては、その３-ヒドロキシアシルＣoＡ 体がＰＨＡ合成酵素の触媒作用を受け得るものである限り特に限定はされないが、高分子合成時の立体障害などを考慮すると、３-ヒドロキシアシルＣoＡ 分子内において、ＣoＡの結合したカルボキシル基と発色団との間に炭素数１から５のメチレン鎖があるほうが望ましい。また、該発色団を有するＰＨＡによるマイクロカプセル化顔料の着色組成物としての用途としては、例えば、顔料の発色成分との複合作用による、より効果的な発色性などが期待できる。
【００９８】
さらに本発明において用いられるＰＨＡとしては、上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したＰＨＡの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。さらに、基質である３-ヒドロキシアシルＣoＡの添加量や添加順序を適宜制御することによって、任意の順序および組成比のブロック共重合体を着色材表面に合成することも可能である。また必要に応じて、ＰＨＡを合成したのち、あるいは、合成中に、さらに化学修飾等を施しても良い。
【００９９】
例えば、基質である３−ヒドロキシアシルＣoＡの種類や濃度などの組成を経時的に変化させることによって、着色剤の内側から外側へ向かう方向においてＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることも可能である。これによって、バインダー樹脂との相溶性の高いＰＨＡを着色剤表層に、着色材との親和性の高いＰＨＡを着色材表層に形成させることで、本発明の効果をさらに高めることができる。より具体的には、バインダー樹脂に相溶性のあるＰＨＡが着色材に対しては親和性が低い場合、まず着色材を着色材と親和性の高いＰＨＡで被覆し、バインダー樹脂に相溶性のあるＰＨＡのモノマーユニットを、着色剤の内側から外側へ向かう方向に変化、例えば多層構造あるいはグラディエント構造とすることで、着色材との結合を強固にし、かつバインダー樹脂に相溶性のあるPHA被膜を有する着色剤を製造することが可能となる。
【０１００】
また、着色剤表層のＰＨＡにグラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因するバインダー樹脂への相溶性を備えた着色剤を得ることができる。また、着色剤表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、機械的強度に優れた着色剤を得ることができる。
【０１０１】
なお、本発明の構造体に用いる、ＰＨＡ合成酵素により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【０１０２】
ＰＨＡの合成基質である３-ヒドロキシアシルＣoＡは、例えば、酵素を用いたin vitro合成法、微生物や植物などの生物体を用いたin vivo合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣoＡシンセターゼ(アシルＣoＡリガーゼ、Ｅ.Ｃ.6.2.1.3)を用いた下記反応：
「3-ヒドロキシアルカン酸＋CoA→（アシルCoAシンセターゼ）→3-ヒドロキシアシルCoA」
を用いた方法などが知られている(Ｅur.J.Ｂiocheｍ.、250、432-439(1997)、Ａppl.Ｍicrobiol.Ｂiotechnol.、54、37-43(2000)など)。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産してもよい。
【０１０３】
＜ＰＨＡ合成酵素およびその生産菌＞
本発明に用いるＰＨＡ合成酵素は、該酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を宿主微生物に導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【０１０４】
ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、ＰＨＢやＰＨＢ/Ｖ生産菌を用いることができ、このような微生物として、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、クロマチウム属(Ｃhroｍatiuｍ sp.)、コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍsp.)、パラコッカス属(Ｐaracoccus sp.)、シュードモナス属(Ｐseudoｍonas sp.)のなどの他に、本発明者らにより分離された、バルクホルデリア・セパシア・ＫＫ 01 株(Ｂurkholderia cepacia ＫＫ 01)、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ 64 株(Ｒalstonia eutropha ＴＢ 64)、アルカリゲネス属・ＴＬ２株(Ａlcaligenes sp.ＴＬ２)などを用いることができる。なお、ＫＫ 01 株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-4235 として、ＴＢ 64 株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-6933 として、ＴＬ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-6913 として、経済産業省生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにそれぞれ寄託されている。
【０１０５】
また、ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物として、ｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡの生産菌を用いることができ、このような微生物として、シュードモナス・オレオボランス、シュードモナス・レジノボランス、シュードモナス属 61-３株、シュードモナス・プチダ・ＫＴ 2442 株、シュードモナス・アエルギノーサなどのほかに、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・Ｐ 91 株(Ｐseudoｍonas putida Ｐ 91)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ 45 株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ 45)、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ 161 株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ 161)等のシュードモナス属微生物や、特開 2001-78753 号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ３株(Ｂurkholderia sp.ＯＫ３、ＦＥＲＭ Ｐ-17370)、特開 2001-69968 号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ４株(Ｂurkholderia sp.ＯＫ４、ＦＥＲＭ Ｐ-17371)などのバークホルデリア属微生物を用いることができる。また、これら微生物に加えて、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.)、コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)などに属し、ｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【０１０６】
なお、Ｐ 91 株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7373 として、Ｈ 45 株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7374 として、ＹＮ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7375 として、Ｐ 161 株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7376 として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、経済産業省産業技術総合研究所(旧通商産業省工業技術院)生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに国際寄託されている。
【０１０７】
本発明にかかるＰＨＡ合成酵素の生産に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡ合成酵素の生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【０１０８】
培養は液体培養や固体培養等、該微生物が増殖する方法であればいかなる方法をも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０１０９】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、ＰＨＡ合成酵素を生産する場合は、例えば、オクタン酸やノナン酸等のアルカン酸を含む無機培地で該微生物を増殖させ、対数増殖期から定常期初期にかけての微生物を遠心分離等で回収して所望の酵素を抽出する方法などを用いることができる。なお、上記のような条件で培養を行うと、添加したアルカン酸に由来するｍcl-ＰＨＡが菌体内に合成されることになるが、この場合、一般に、ＰＨＡ合成酵素は菌体内に形成されるＰＨＡの微粒子に結合して存在するとされている。しかし、本発明者らの検討によると、上記の方法で培養した菌体の破砕液を遠心分離した上清液にも、相当程度の酵素活性が存在していることがわかっている。これは、前記の如き対数増殖期から定常期初期にかけての比較的培養初期には、菌体内で該酵素が活発に生産され続けているため、遊離状態のＰＨＡ合成酵素も相当程度存在するためと推定される。
【０１１０】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等)など、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(J.Ｂiol.Ｃheｍ.、218、97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【０１１１】
Ｎa2ＨＰＯ4 : 6.2 g
ＫＨ2ＰＯ4 : 3.0 g
ＮaＣl : 0.5 g
ＮＨ4Ｃl : 1.0 g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
さらに、良好な増殖及びＰＨＡ合成酵素の生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3 ％(v/v)程度添加するのが好ましい。
【０１１２】
(微量成分溶液)
ニトリロ三酢酸: 1.5 g
ＭgＳＯ4 : 3.0 g
ＭnＳＯ4 : 0.5 g
ＮaＣl : 1.0 g
ＦeＳＯ4 : 0.1 g
ＣaＣl2 : 0.1 g
ＣoＣl2 : 0.1 g
ＺnＳＯ4 : 0.1 g
ＣuＳＯ4 : 0.1 g
ＡlＫ(ＳＯ4)2 : 0.1 g
Ｈ3ＢＯ3 : 0.1 g
Ｎa2ＭoＯ4 : 0.1 g
ＮiＣl2 : 0.1 g
(１リットル中)
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 14 〜 40 ℃、好ましくは 20 〜 35 ℃程度が適当である。
【０１１３】
また、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、所望のＰＨＡ合成酵素を生産することも可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は 25 から 37 ℃の範囲で、好気的に８〜 27 時間培養することにより、微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積されたＰＨＡ合成酵素の回収を行うことができる。培地には、必要に応じて、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド(IＰＴＧ)、テトラサイクリン、インドールアクリル酸(IＡＡ)等が誘導物質として挙げられる。
【０１１４】
ＰＨＡ合成酵素としては、微生物の菌体破砕液や、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物などの粗酵素を用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素を用いても良い。該酵素には必要に応じて、金属塩、グリセリン、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)などの安定化剤、付活剤を適宜添加して用いることができる。
【０１１５】
ＰＨＡ合成酵素の分離・精製方法は、ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、得られた微生物菌体を、フレンチプレス、超音波破砕機、リゾチームや各種界面活性剤等を用いて破砕したのち、遠心分離して得られた粗酵素液、またはここから調製した硫安塩析物について、アフィニティクロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。特に、遺伝子組換えタンパク質は、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン、血液凝固因子Ｘa等のプロテアーゼで切断する、pＨを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。あるいは、発現ベクターとしてpＴＹＢ１(Ｎeｗ Ｅnglan Ｂiolab社製)を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はdithiothreitolなどで還元条件として切断する。アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、キチン結合ドメイン(ＣＢＤ)、マルトース結合タンパク(ＭＢＰ)、あるいはチオレドキシン(ＴＲＸ)等も公知である。ＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ親和性レジンによって精製することができる。
【０１１６】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、３-ヒドロキシアシルＣoＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣoＡを、５、５'-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。試薬１:ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)を 0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に 3.0 ｍg/ｍL溶解、試薬２:３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡを 0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に 3.0 ｍＭ溶解、試薬３:トリクロロ酢酸を 0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に 10 ｍg/ｍL溶解、試薬４:５、５'-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)を 0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に 2.0 ｍＭ溶解。第１反応(ＰＨＡ合成反応):試料(酵素)溶液 100 μLに試薬１を 100 μL添加して混合し、30 ℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を 100 μL添加して混合し、30 ℃で１〜 30 分間インキュベートしたのち、試薬３を添加して反応を停止させる。第２反応(遊離ＣoＡの発色反応):反応停止した第１反応液を遠心分離(147、000ｍ/s2(=15、000Ｇ)、10 分間)し、この上清 500 μLに試薬４を 500 μL添加し、30 ℃で 10 分間インキュベートしたのち、412 nｍの吸光度を測定する。酵素活性の算出:１分間に１μｍolのＣoＡを放出させる酵素量を１単位(Ｕ)とする。
【０１１７】
＜着色剤製造方法＞
本発明にかかる着色剤を用いた静電荷像現像トナーの製造方法の一例としては、少なくとも以下の着色剤の製造工程を含む方法を挙げることができる。
-着色剤の製造工程-
着色材を水性媒体に分散する工程
水性媒体に分散された着色材にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を固定化する工程
基質である３-ヒドロキシアシルＣoＡを添加する工程
ポリヒドロキシアルカノエート合成反応を行うことで該着色材表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆する工程
着色材を水性媒体に分散する工程は、選択した１つまたは複数の着色材、例えば顔料を水性媒体に添加し、分散処理を行った後、必要であれば所望の粒径範囲に分級することによって行う。
【０１１８】
以下、着色材を顔料とした場合について詳述する。
【０１１９】
本発明で用いられる顔料は、有機および無機のいずれであってもよいが、耐熱性、耐光性に優れているものが望ましい。有機顔料の例としては、アゾ系、フタロシアニン系、ベンゾイミダゾロン系、キナクリドン系、イソインドリノン系、ピラスロン系、ジブロムアンザンスロン系、インダスロン系、アンスラピリミジン系、フラバスロン系、ペリレン系、ペリノン系、キノフタロン系、フタロン系、チオインジゴ系、インジゴ系、ジオキサジン系、アントラキノン系、キサンテン系、メチン系、アゾメチン系の顔料およびその他の金属錯体系を含む縮合多環系顔料等を挙げることができる。無機顔料の例としては、ミロリブルー、酸化鉄、コバルト紫、マンガン紫、群青、紺青、コバルトブルー、セルリアンブルー、ビリジアン、エメラルドグリーン、コバルトグリーン等を挙げることができ、これらから１種または２種以上を適宜選択して用いられる。上記顔料は、公知の各種の表面処理などを施した後、用いても良い。表面処理の例としては、界面活性剤処理や、カップリング処理や、顔料誘導体処理などが挙げられる。
【０１２０】
分散処理は、ホモミキサー、水平ミニミル、ボールミル、ロールミル、サンドグラインダー、摩砕機、超音波処理等によって行うことができる。また、液体ジェット相互作用室内で少なくとも 1000 psi(約 70.3 kg/cｍ２)の液圧で多数のノズルに混合物を通す方法によって行うこともできる。
【０１２１】
分散された顔料の粒径は、光透過性、印字表面の均一性等の観点から、少なくとも 0.7 μｍ以下、より好ましくは、0.01 〜 0.4 μｍとするのが好ましく、単分散させることが望ましい。分散された顔料の粒径が所望の範囲に無い場合は、ろ過や沈降法などによる分級を行うことによって調整することができる。
【０１２２】
分散された顔料の粒径は、吸光度法、静的光散乱法、動的光散乱法、遠心沈降法などの既知の方法により測定でき、例えば、コールターカウンターマルチサイザー等の粒径測定装置を用いることができる。
【０１２３】
本工程の合成反応の水性媒体の組成は、顔料を所望の状態に分散させうるもので、さらに後の工程の、酵素を顔料に固定化する工程やＰＨＡ合成反応を行う工程を妨げないものであればよいが、後の工程の省略化を図るために、本工程の水性媒体の組成をＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成としておくこともできる。ここで、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成として、例えば緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、生化学的反応に用いられる一般的な緩衝液、例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、３-(Ｎ-モルフォリノ)プロパンスルフォン酸(ＭＯＰＳ)バッファー、Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-３-アミノプロパンスルフォン酸(ＴＡＰＳ)バッファー、トリス塩酸バッファー、グリシンバッファー、２-(シクロヘキシルアミノ)エタンスルフォン酸(ＣＨＥＳ)バッファーなどが好適に用いられる。ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る水性媒体の濃度は、一般的な濃度、即ち５ｍＭから 1.0 Ｍの範囲で使用することができるが、望ましくは 10 〜 200 ｍＭで行うことが好ましい。また、pＨは 5.5 から 9.0、好ましくは 7.0 から 8.5 となるように調製するが、使用するＰＨＡ合成酵素の至適pＨやpＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１２４】
また、水性媒体中での顔料の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度、さらには本発明の着色組成物の目的を妨げない種類及び濃度であれば、適当な界面活性剤を添加してもよい。このような界面活性剤の例として、例えばオレイン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル-Ｎ-サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルピリジニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤、３-〔(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ〕-１-プロパンスルホン酸(ＣＨＡＰＳ)、３-〔(３-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ〕-２-ヒドロキシ-１-プロパンスルホン酸(ＣＨＡＰＳＯ)、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル-β-アラニン等の両性イオン界面活性剤、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、デカノイル-Ｎ-メチルグルカミド(ＭＥＧＡ-10)、ポリオキシエチレンドデシルエーテル(Ｂrij、Ｌubrol)、ポリオキシエチレン-i-オクチルフェニルエーテル(Ｔriton Ｘ)ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(Ｎonidet Ｐ-40、Ｔriton Ｎ)、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル(Ｓpan)、ポリオキシエチレンソリビトールエステル(Ｔｗeen)等の非イオン界面活性剤などを挙げることが出来る。
【０１２５】
また、水性媒体中での顔料の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度、さらには本発明の着色組成物の目的を妨げない種類及び濃度であれば、適当な補助溶媒を添加してもよい。補助溶媒としては、例えばヘキサン等、直鎖脂肪族炭化水素、またメタノール、エタノール等の１価アルコール類やグリセロール等の多価アルコール類及び脂肪酸エーテル類、カルボン酸エステル類等の誘導体から選ばれる一種又は二種以上のものを選択し使用することができる。
【０１２６】
ＰＨＡ合成酵素を顔料に固定化する工程は、先の顔料分散液にＰＨＡ合成酵素を添加し、固定化処理を施すことによって行うことができる。固定化処理は、該酵素の活性が保持され得るものであり、かつ、所望の顔料において適用可能なものであれば、通常行われている酵素固定化方法の中から任意に選択して行うことができる。例えば、共有結合法、イオン吸着法、疎水吸着法、物理的吸着法、アフィニティ吸着法、架橋法、格子型包括法などを例示することができるが、特にイオン吸着や疎水吸着を利用した固定化方法が簡便である。
【０１２７】
ＰＨＡ合成酵素などの酵素タンパク質は、アミノ酸が多数結合したポリペプチドであり、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの遊離のイオン性基を有するアミノ酸によってイオン吸着体としての性質を示し、またアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンなどの遊離の疎水性基を有するアミノ酸によって、また有機高分子であるという点で疎水吸着体としての性質を有している。従って、程度の差はあるが、イオン性や疎水性、もしくはイオン性と疎水性の両方の性質を有する顔料に吸着させることが可能である。
【０１２８】
主にイオン吸着法によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法では、イオン性官能基を表面に発現している顔料を用いれば良く、例えば、粘土鉱物や金属酸化物等を主要な成分とする無機顔料を用いることができる。
【０１２９】
また、主に疎水吸着によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法では、表面が非極性である顔料を用いればよく、例えば、芳香環を複数有するアゾ顔料や縮合多環のフタロシアニン系顔料、アントラキノン系顔料等の有機顔料、カーボンブラックなどの炭素結晶からなる無機顔料を用いることができる。
【０１３０】
イオン吸着法または疎水吸着法によるＰＨＡ合成酵素の顔料への固定化は、顔料とＰＨＡ合成酵素を所定の水性媒体中で所定の濃度となるように混合することによって達成される。このとき、酵素が顔料の表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【０１３１】
上記固定化処理において、顔料と酵素の混合された水性媒体の組成としては、水性媒体のpＨや塩濃度によって顔料およびＰＨＡ合成酵素の表面電荷の正負や電荷量、疎水性が変化することから、それを考慮した組成とするのが望ましい。例えば、顔料が主にイオン吸着性である場合には、塩濃度を下げることにより、顔料とＰＨＡ合成酵素との吸着に寄与する電荷量を増やすことができる。また、pＨを変える事により、両者の反対電荷を増やすことができる。顔料が主に疎水吸着性である場合には、塩濃度を上げることによって両者の疎水性を増やすことができる。また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、顔料やＰＨＡ合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、吸着に適した組成を設定をすることもできる。さらに、顔料とＰＨＡ合成酵素との吸着量を直接測定して組成を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、顔料が分散された溶液に濃度既知のＰＨＡ合成酵素溶液を添加し、吸着処理を行った後、溶液中のＰＨＡ合成酵素濃度を測定し、差し引き法により吸着酵素量を求める等の方法を用いればよい。
【０１３２】
イオン吸着法や疎水吸着法によって酵素を固定化し難い顔料の場合は、操作の煩雑さや酵素の失活の可能性を考慮すれば共有結合法によってもかまわない。例えば、芳香族アミノ基を有する顔料をジアゾ化し、これに酵素をジアゾカップリングする方法や、カルボキシル基、アミノ基を有する顔料と酵素の間にペプチド結合を形成させる方法、ハロゲン基を有する顔料と酵素のアミノ基等との間でアルキル化する方法、固体粒子のアミノ基と酵素のアミノ基との間を架橋する方法、アルデヒド基またはケトン基を有する化合物とイソシアニド化合物の存在下、カルボキシル基、アミノ基を有する顔料と酵素を反応させる方法、ジスルフィド基を有する顔料と酵素のチオール基との間で交換反応させる方法などがある。
【０１３３】
また、アフィニティ吸着によって酵素をリガンドが導入された顔料に固定化してもよい。
【０１３４】
この場合、リガンドとしてＰＨＡ合成酵素の酵素活性を維持しながらアフィニティ吸着を行えるものであれば、いかなるものも選択できる。また、ＰＨＡ合成酵素にタンパク質等の他の生体高分子を結合させ、結合した生体高分子をアフィニティ吸着することで酵素を固定化してもよい。ＰＨＡ合成酵素と生体高分子との結合は遺伝子組換え等によって行ってもよいし、化学的に行ってもよい。例えば、実施例に後述するように、形質転換によってグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(Ｇlutathione Ｓ-transferase)をＰＨＡ合成酵素に融合し、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼのリガンドであるグルタチオンを導入したセファロース(Ｓepharose)に融合タンパク質をアフィニティ吸着し、固定化することができる。
【０１３５】
また、顔料に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むペプチドをポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に融合して提示させ、該顔料に対して結合能を有するアミノ酸配列のペプチド部分と、顔料との結合性に基づいて、該顔料表面にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を固定化することもできる。
【０１３６】
顔料に対する結合能を有するアミノ酸配列は、例えばランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定することができる。特に例えばM13 系ファージの表面蛋白質（例えばgeneIII 蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージディスプレイペプチドライブラリーを好適に用いることが出来るが、この場合顔料に対する結合能を有するアミノ酸配列の決定するには、次のような手順をとる。すなわち、顔料に対してファージディスプレイペプチドライブラリーを添加することによって接触させ、その後洗浄により結合ファージと非結合ファージを分離する。顔料結合ファージを酸などにより溶出し緩衝液で中和した後大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと目的の顔料に結合能のある複数のクローンが濃縮される。ここで単一なクローンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。
【０１３７】
上記方法により得られた顔料に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に融合して利用される。顔料に対する結合能を有するペプチドはポリヒドロキシアルカノエート合成酵素のN末端あるいはC末端に連結して発現することができる。また適当なスペーサー配列を挿入して発現することもできる。スペーサー配列としては、約３〜約４００アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、PHA合成酵素が機能するのを妨害せず、また、PHA合成酵素が顔料に結合するのを妨害しないものである。
【０１３８】
上記方法により作製された、酵素を固定化した顔料は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。
【０１３９】
ここで、３-ヒドロキシアシルＣoＡの重合によりＰＨＡが合成される反応において放出されるＣoＡ量が１分間に１μｍolとなるＰＨＡ合成酵素量を１単位(Ｕ)としたとき、顔料に固定する酵素の量は、顔料１ gあたり 10 単位(Ｕ)から１、000 単位(Ｕ)、望ましくは 50 単位(Ｕ)から 500 単位(Ｕ)の範囲内に設定すると良い。
【０１４０】
酵素の固定化処理を行う時間は１分から 24 時間が望ましく、より望ましくは 10 分から１時間である。過剰な静置あるいは放置は顔料の凝集及び酵素活性の低下を招くので好ましくない。
【０１４１】
また、前工程の顔料を分散する工程を省略して、水性媒体に分散する前の顔料を、直接酵素溶液に添加し、酵素溶液中で分散を行いながら、酵素を顔料に固定化してもよい。この場合、顔料に固定化された酵素が保有するイオン性官能基による電気的反発や立体障害によって、顔料が水性媒体中で分散することを容易にし、水性媒体への界面活性剤の添加を不要にする、もしくは少量化することが可能となる。
【０１４２】
基質である３-ヒドロキシアシルＣoＡを添加する工程は、前工程の酵素が固定化された顔料の水性分散液に対し、別途用意した３-ヒドロキシアシルＣoＡの保存液を目的濃度に達するように添加することによって達成される。基質である３-ヒドロキシアシルＣoＡは、一般に 0.1 ｍＭから 1.0 Ｍ、望ましくは 0.2 ｍＭから 0.2 Ｍ、さらに望ましくは 0.2 ｍＭから 1.0 ｍＭの終濃度で添加される。
【０１４３】
また、上記工程において、水系反応液中の３−ヒドロキシアシルＣoＡの種類や濃度などの組成を経時的に変化させることによって、着色材の形状が球形であれば内側から外側へ向かう方向に着色材を被覆するＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることができる。
【０１４４】
このモノマーユニット組成の変化した着色剤の形態として、例えば、ＰＨＡ被膜の組成変化が連続的で、半径方向に組成の勾配を形成した１層のＰＨＡが着色材を被覆した形態を挙げることができる。製造方法としては、例えば、ＰＨＡを合成しながら反応液中に別組成の３−ヒドロキシアシルＣoＡを添加するなどの方法によればよい。
【０１４５】
また別の形態として、ＰＨＡ被膜の組成変化が段階的で、組成の異なるＰＨＡが着色材を多層に被覆した形態を挙げることができる。この製造方法としては、ある３−ヒドロキシアシルＣoＡの組成でＰＨＡを合成した後、遠心分離などによって調製中の着色剤を反応液からいったん回収し、これに異なる３−ヒドロキシアシルＣoＡの組成からなる反応液を再度添加するなどの方法によればよい。
【０１４６】
ＰＨＡ合成反応を行う工程は、合成するＰＨＡによって所望の形状のマイクロカプセル(着色剤)が得られるように、反応溶液の組成を前工程までに調製していない場合にはＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成となるように調製を行い、反応温度及び反応時間を調整することによって行う。
【０１４７】
ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る反応溶液の濃度は、一般的な濃度、即ち５ｍＭから 1.0 Ｍの範囲で使用することができるが、望ましくは 10 〜 200 ｍＭで行うことが好ましい。また、pＨは 5.5 から 9.0、好ましくは 7.0から 8.5となるように調製するが、使用するＰＨＡ合成酵素の至適pＨやpＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１４８】
反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の特性に応じて適宜設定するものであるが、通常、４℃から 50 ℃、好ましくは 20 ℃から 40 ℃に設定すると良い。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１４９】
反応時間は、使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間から 24 時間、好ましくは 30 分間から３時間の範囲内で適宜選択して設定する。
【０１５０】
本工程によってマイクロカプセル(着色剤)が得られるが、そのマイクロカプセル(着色剤)を構成するＰＨＡのモノマーユニット構造は、マイクロカプセル(着色剤)からクロロホルムによってＰＨＡを抽出した後、ガスクロマトグラフィー等による組成分析や、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳIＭＳ)とイオンスパッタリング技術を用いて判定することができる。
【０１５１】
ＰＨＡの分子量は特に制限はないが、マイクロカプセル(着色剤)の強度を維持するため、また後述するガラス転移温度を発揮するため、数平均分子量が１、000 〜 10、000、000、より好ましくは、10、000 〜 10、000、00 の範囲とするのが望ましい。ＰＨＡの分子量は、マイクロカプセル(着色剤)からクロロホルムによってＰＨＡを抽出した後、ＧＰＣ(ゲルパーミエーションクロマトグラフィー)によって測定すればよい。
【０１５２】
また、本発明の目的を充分に達成するためには、それらの数平均分子量が、次の関係式を満たすことが望ましい。
(第１の樹脂成分の数平均分子量)＞(第２の樹脂成分の数平均分子量)
第１及び第２の樹脂成分が上記のような関係を有していると、混練物を粉砕してトナーを得る場合、第２の樹脂成分中で割れるか、あるいは第１の樹脂成分と第２の樹脂成分の界面で割れる確率が高くなり、トナー表面は殆どが第１の樹脂成分及び第２の樹脂成分で覆われる。つまり、着色材、例えば顔料が直接トナー粒子の表面に露出する確率が低くなる。そのため、帯電量が低い、高温高湿下及び低温低湿下での帯電量の差が大きい(環境依存性)、顔料の種類、例えばフルカラー画像記録のようにシアン、マゼンタ、イエロー、ブラックの各顔料を用いる場合の各色トナーについて帯電量がばらつく、などの課題を解決することが可能となる。また、種々のカラートナーについて、同様な種類または量の外添剤を使用することが可能となる。
【０１５３】
さらに、本発明にかかる着色剤を用いることにより、着色材、例えば顔料を多量に使用してもトナーの組成分布が生じにくく、粉体の流動性も良好になる。特には、５μｍ以下の小径トナーについてトナー中に多量の着色材、例えば顔料を添加しても、従来の方法では達成し得なかった、上記のような帯電特性、定着特性、粉体特性を維持することが可能となる。ここで、本発明のマイクロカプセル(着色剤)の製造方法では、着色材、例えば顔料に直接ＰＨＡを被覆できるため、マイクロカプセル中の着色材の密度を高めることができる。しかし一方で、マイクロカプセル(着色剤)の分散性、機械的強度を上げるためにＰＨＡの被覆量を増やすことが求められる結果、ＰＨＡの被覆量としては、着色材に対して１〜 30 質量％の範囲の質量組成比であり、好ましくは１〜 20 質量％の範囲、より好ましくは１〜 15 質量％の範囲とする。
【０１５４】
従来、異なる樹脂を溶融相分離させてマトリックス-ドメイン構造を作っていたものは、使用可能な樹脂の選択幅が小さい、ドメインの粒子サイズや分布の制御が困難であったが、本発明のトナーは外殻樹脂で被覆された着色材を熱可塑性樹脂で結着しているため、着色材とバインダー樹脂の組合せに制限はなく、また着色剤中の着色材濃度や着色剤の粒子サイズ等は容易に制御することができる。
【０１５５】
上記工程によって得られるマイクロカプセル(着色剤)の粒径は、通常１μｍ以下、好ましくは 0.7 μｍ以下、より好ましくは、0.01 〜 0.4 μｍとする。マイクロカプセル化顔料の粒径は、吸光度法、静的光散乱法、動的光散乱法、遠心沈降法などの既知の方法により測定でき、例えば、コールターカウンターマルチサイザー等の粒径測定装置を用いることができる。
【０１５６】
また、本工程で得られたマイクロカプセル(着色剤)に各種二次加工や化学修飾等の処理を施して使用することもできる。
【０１５７】
例えば、着色剤表層のＰＨＡに化学修飾を施すことにより、さらに有用な機能・特性を備えた着色剤を得ることができる。例えば、グラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性、例えばバインダー樹脂との相溶性が向上した着色剤を得ることができる。また、着色剤表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、着色剤の機械的強度、耐薬品性、耐熱性などを向上させることが可能である。
【０１５８】
化学修飾の方法は、所望の機能・構造を得る目的を満たす方法であれば特に限定はされないが、例えば、反応性官能基を側鎖に有するＰＨＡを合成し、該官能基の化学反応を利用して化学修飾する方法を、好適な方法として用いることができる。
【０１５９】
前記の反応性官能基の種類は、所望の機能・構造を得る目的を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、前記したエポキシ基を例示することができる。エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができる。具体的には、例えば水酸基に変換したり、スルホン基を導入することが可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもでき、例えば、末端に反応性官能基を有する化合物、具体的には、エポキシ基との反応性が高いアミノ基を末端に有する化合物などを添加して反応させることにより、ポリマーのグラフト鎖が形成される。
【０１６０】
アミノ基を末端に有する化合物としては、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、アミノ変性ポリシロキサン（アミノ変性シリコーンオイル）などのアミノ変性ポリマーを例示することができる。このうち、アミノ変性ポリシロキサンとしては、市販の変性シリコーンオイルを使用しても良く、また、J.Amer.Chem.Soc.、78、2278（1956）などに記載の方法で合成して使用することもでき、該ポリマーのグラフト鎖の付加によるバインダー樹脂との相溶性の改善等の効果が期待できる。
【０１６１】
また、エポキシ基を有するポリマーの化学的変換の他の例として、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン化合物、無水コハク酸、2−エチル−4−メチルイミダゾールなどによる架橋反応が、物理化学的変換の例として電子線照射などによる架橋反応が挙げられる。このうち、エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡとヘキサメチレンジアミンとの反応は、下記のスキームに示すような形で進行し、架橋ポリマーが生成する。
【０１６２】
【化５８】
Figure 0004532784
【０１６３】
本発明のマイクロカプセル(着色剤)は、上記のように着色材密度が高く、かつ微小であるという特長を有しているため、本マイクロカプセル(着色剤)を含有する静電荷像現像トナーを用いることで、透明性や発色性の良好な、コントラストに優れた画像が形成することができる。
【０１６４】
＜着色材具体例＞
本発明の静電荷像現像トナーを構成する着色材としては、通常、トナーを製造する際に用いられているものであればいずれも使用でき、特に限定されるものではない。例えば、本発明に効果的に適用される着色材として顔料が挙げられる。
【０１６５】
顔料としては、公知の有機若しくは無機の顔料を使用することができる。ブラック系の顔料としては無機系のカ-ボンブラック、四三酸化鉄、有機系のシアニンブラック等が挙げられる。ホワイト系の顔料としては亜鉛華、酸化チタン、アンチモン白、硫化亜鉛などが挙げられる。イエロー系顔料としては、無機系の黄鉛、カドミウムイエロー、黄色酸化鉄、チタン黄、オーカー等が挙げられる。
【０１６６】
また、難溶性金属塩(アゾレーキ)のアセト酢酸アニリド系モノアゾ顔料としては、ハンザイエローＧ(Ｃ.I.Ｎo.pigｍent Ｙelloｗ １、以下、同様)、ハンザイエロー 10 Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ ３)、ハンザイエローＲＮ(pigｍent Ｙelloｗ 65)、ハンザブリリアントイエロー５ＧＸ(pigｍent Ｙelloｗ 74)、ハンザブリリアントイエロー 10 ＧＸ(pigｍent Ｙelloｗ 98)、パーマネントイエローＦＧＬ(pigｍent Ｙelloｗ 97)、シムラレーキファストイエロー６Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 133)、リオノールイエローＫ-２Ｒ(pigｍent Ｙelloｗ 169)、またアセト酢酸アニリドジスアゾ顔料としては、ジスアゾイエローＧ(pigｍent Ｙelloｗ 12)、ジスアゾイエローＧＲ(pigｍent Ｙelloｗ 13)、ジスアゾイエロー５Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 14)、ジスアゾイエロー８Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 17)、ジスアゾイエローＲ(pigｍent Ｙelloｗ 55)、パーマネントイエローＨＲ(pigｍent Ｙelloｗ 83)が挙げられる。
【０１６７】
縮合アゾ顔料としては、クロモフタルイエロー３Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 93)、クロモフタルイエロー６Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 94)、クロモフタルイエローＧＲ(pigｍent Ｙelloｗ 95)が挙げられる。更に、ベンズイミダゾロン系モノアゾ顔料としては、ホスタパームイエローＨ３Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 154)、ホスタパームイエローＨ４Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 151)、ホスタパームイエローＨ２Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 120)、ホスタパームイエローＨ６Ｇ(pigｍent Ｙelloｗ 175)、ホスタパームイエローＨＬＲ(pigｍent Ｙelloｗ 156)が挙げられる。また、イソインドリノン系顔料としては、イルガジンイエロー３ＲＬＴＮ(pigｍent Ｙelloｗ 110)、イルガジンイエロー２ＲＬＴ、イルガジンイエロー２ＧＬＴ(pigｍent Ｙelloｗ 109)、ファストゲンスーパーイエローＧＲＯＨ(pigｍent Ｙelloｗ 137)、ファストゲンスーパーイエローＧＲＯ(pigｍent Ｙelloｗ 110)、サンドリンイエロー６ＧＬ(pigｍent Ｙelloｗ 173)が挙げられ、その他、スレン系顔料であるフラバントロン(pigｍent Ｙelloｗ 24)、アントラミリミジン(pigｍent Ｙelloｗ 108)、フタロイルアミド型アントラキノン(pigｍent Ｙelloｗ123)、ヘリオファストイエローＥ３Ｒ(pigｍent Ｙelloｗ 99)、金属錯体顔料であるアゾ系ニッケル錯体顔料(pigｍent Ｇreen 10)、ニトロソ系ニッケル錯体顔料(pigｍent Ｙelloｗ 153)、アゾメチン系銅錯体顔料(pigｍent Ｙelloｗ 117)、更にキノフタロン顔料であるフタルイミドキノフタロン顔料(pigｍent Ｙelloｗ 138)等が挙げられる。
【０１６８】
また、マゼンタ系顔料としては無機系のカドミウムレッド、ベンガラ、銀朱、鉛丹、アンチモン朱が挙げられる。また、アゾ系顔料のアゾレーキ系としては、ブリリアントカーミン６Ｂ(pigｍent Ｒed 57 :１)、レーキレッド(pigｍent Ｒed 53 :１)、パーマネントレッドＦ５Ｒ(pigｍent Ｒed 48)、リソールレッド(pigｍent Ｒed 49)、ペルシアオレンジ(pigｍent Ｏrange 17)、クロセイオレンジ(pigｍent Ｏrange 18)、ヘリオオレンジＴＤ(pigｍent Ｏrange 19)、ピグメントスカーレット(pigｍent Ｒed 60 :１)、ブリリアントスカーレットＧ(pigｍent 64 :１)、ヘリオレッドＲＭＴ(pigｍent Ｒed 51)、ボルドー 10 Ｂ(pigｍent Ｒed 63)、ヘリオボルドーＢＬ(pigｍent Ｒed 54)が挙げられ、また、不溶性アゾ系(モノアゾ、ジスアゾ系、縮合アゾ系)としては、パラレッド(pigｍent Ｒed１)、レーキレッド４Ｒ(pigｍent Ｒed３)、パーマネントオレンジ(pigｍent Ｏrange５)、パーマネントレッドＦＲ２(pigｍent Ｒed２)、パーマネントレッドＦＲＬＬ(pigｍent Ｒed９)、パーマネントレッドＦＧＲ(pigｍent Ｒed112)、ブリリアントカーミンＢＳ(pigｍent Ｒed 114)、パーマネントカーミンＦＢ(pigｍent Ｒed５)、Ｐ.Ｖ.カーミンＨＲ(pigｍent Ｒed 150)、パーマネントカーミンＦＢＢ(pigｍent Ｒed 146)、ノバパームレッドＦ３ＲＫ-Ｆ５ＲＫ(pigｍent Ｒed 170)、ノバパームレッドＨＦＧ(pigｍent Ｏrange 38)、ノバパームレッドＨＦ４Ｂ(pigｍent Ｒed 187)、ノバパームオレンジＨＬ.ＨＬ-70(pigｍent Ｏrange 36)、Ｐ.Ｖ.カーミンＨＦ４Ｃ(pigｍent Ｒed 185)、ホスタバームブラウンＨＦＲ(pigｍent Ｂroｗn 25)、バルカンオレンジ(pigｍent Ｏrange 16)、ピラゾロンオレンジ(pigｍent Ｏrange 13)、ピラゾロンレッド(pigｍent Ｒed 38)が挙げられ、更に、縮合アゾ顔料としてクロモフタールオレンジ４Ｒ(pigｍent Ｏrange 31)、クロモフタールスカーレットＲ(pigｍent Ｒed 166)、クロモフタールレッドＢＲ(pigｍent Ｒed 144)が挙げられる。
【０１６９】
また、縮合多環系顔料であるアントラキノン顔料としてピランスロンオレンジ(pigｍent Ｏrange 40)、アントアントロンオレンジ(pigｍent Ｏrange 168)、ジアントラキノニルレッド(pigｍent Ｒed 177)が挙げられ、チオインジゴ系顔料としてチオインジゴマゼンタ(pigｍent Ｖiolet 38)、チオインジゴバイオレット(pigｍent Ｖiolet 36)、チオインジゴレッド(pigｍent Ｒed 88)が挙げられ、ペリノン系顔料としてペリノンオレンジ(pigｍent Ｏrange 43)が挙げられ、更にペリレン系顔料として、ペリレンレッド(pigｍent Ｒed 190)、ペリレンバーミリオン(pigｍent Ｒed 123)、ペリレンマルーン(pigｍent Ｒed 179)、ペリレンスカーレット(pigｍent Ｒed 149)、ペリレンレッド(pigｍent Ｒed 178)が挙げられ、キナクリドン系顔料としてキナクリドンレッド(pigｍent Ｖiolet 19)、キナクリドンマゼンタ(pigｍent Ｒed 122)、キナクリドンマルーン(pigｍent Ｒed 206)、キナクリドンスカーレット(pigｍent Ｒed 207)が挙げられ、その他、縮合多環顔料としてピロコリン系顔料、赤色系フルオルビン系顔料、染付けレーキ系顔料(水溶性染料＋沈殿剤→レーキ化固着)が挙げられる。
【０１７０】
シアン系顔料としては、無機系の群青、紺青、コバルトブルー、セルリアンブルー等が挙げられ、またフタロシアニン系として、ファーストゲンブル-ＢＢ(pigｍent Ｂlue 15)、スミトン・シアニン・ブルーＨＢ(pigｍent Ｂlue 15)、シアニンブルー 5020(pigｍent Ｂlue 15 :１)、スミカプリント・シアニン・ブルーＧＮ-Ｏ(pigｍent Ｂlue 15)、ファスト・スカイブルーＡ-612(pigｍent Ｂlue 17)、シアニン・グリーンＧＢ(pigｍent Ｇreen７)、シアニングリーンＳ 537-２Ｙ(pigｍent Ｇreen 36)、スミトン・ファストバイオレットＲＬ(pigｍentＶiolet 23)が挙げられ、また、スレン系顔料であるインダントロンブルー(ＰＢ-60 Ｐ、ＰＢ-22、ＰＢ-21、ＰＢ-64)、塩基性染料レーキ顔料であるメチルバイオレット・リン・モリブデン酸レーキ(ＰＶ-３)等が挙げられる。また体質顔料としてバライト粉、炭酸バリウム、クレー、シリカ、ホワイトカーボン、タルク、アルミナホワイトなどが挙げられる。その他、上記顔料の表面に樹脂をコーティングした加工顔料も同様に使用することができる。
【０１７１】
上記したような顔料は、単独で使用してもよく、さもなければ、所望とするトナーの色調を得るために任意に混合して使用してもよい。なお、環境保全や人体に対する安全性などを考慮した場合には、各種の食用レーキ等の食用色素を好適に使用可能であり、例えば、食用赤色 40 号アルミニウムレーキ、食用赤色２号アルミニウムレーキ、食用赤色３号アルミニウムレーキ、食用赤色 106 号アルミニウムレーキ、食用黄色５号アルミニウムレーキ、食用黄色４号アルミニウムレーキ、食用青色１号アルミニウムレーキ、食用青色２号アルミニウムレーキなどが挙げられる。
【０１７２】
上記したような着色材のトナー中の含有量は、所望とする着色効果などに応じて広く変更することが可能である。通常、最も良好なトナー特性を得るため、すなわち、印字の着色力、トナーの形状安定性、トナーの飛散などを考慮した場合、これらの着色材が、バインダー樹脂 100 質量部に対して、0.1 〜 60 質量部好ましくは 0.5 〜 20 質量部程度の割合となるようにすれば良い。
【０１７３】
＜着色剤後処理＞
本発明の製造方法によって得られたカプセル構造体(着色剤)は反応液のまま水分散体として用いることができるし、緩やかな遠心分離や吸引ろ過等によりカプセル構造体(着色剤)を回収した後、別の水溶液に分散させて使用することもできる。また、回収したカプセル構造体(着色剤)をＰＨＡ不溶性の有機溶媒に分散させたり、溶媒置換を行ってＰＨＡ不溶性の有機溶媒に分散して溶剤分散体として用いることもできる。また、上記の方法を用いて、カプセル構造体(着色剤)を洗浄することもできる。
【０１７４】
粉末状のカプセル構造体(着色剤)を取得するためには、粒径の大きい場合には緩やかな遠心分離や吸引ろ過等によりウェットケーキを得たのち、減圧乾燥やジェットミルなどで乾燥を行えばよい。また、粒径の小さな場合にはスプレードライ法などにより乾燥を行えばよい。
【０１７５】
粒径の揃った着色材を用いることで、製造されるカプセル構造体(着色剤)の粒径をある程度揃えることが可能であるが、より粒径を揃えるため、カプセル構造体(着色剤)製造後にさらに分級を行ってもよい。
【０１７６】
＜トナー構成材料＞
以下、本発明の静電荷像現像トナーを構成するその他の構成材料について説明する。本発明の静電荷像現像トナーは、上記構成の着色剤とバインダー樹脂を少なくとも含有し、必要に応じて荷電制御剤やその他の添加物が添加されて構成されている。
【０１７７】
(バインダー樹脂)
バインダー樹脂としては、先に記したように、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル、スチレン-アクリル酸エステル共重合体などのスチレン系ポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニリデン、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂等が挙げられ、通常、トナーを製造する際に用いられているものであればいずれも使用することができ、特に限定されない。
【０１７８】
(生分解性プラスチック)
また、本発明においては、上市されている各種生分解性プラスチックについても好ましく使用することができる。例えば、「エコスター」「エコスタープラス」(萩原工業)「バイオポール」(アイ・シー・アイ・ジャパン)「アジコート」(味の素)「プラクセル」「ポリカプロラクトン」(ダイセル化学)「ショーレックス」「ビオノーレ」(昭和電工)「ラクティ」(島津製作所)「レイシア」(三井化学)等が挙げられる。
【０１７９】
(その他の樹脂)
スチレン系ポリマーとしては、スチレンと(メタ)アクリル酸エステルとの共重合体およびこれらと共重合可能な他の単量体の共重合体、スチレンとジエン系単量体(ブタジエン、イソプレンなど)との共重合体およびこれらと共重合可能な他の単量体の共重合体などが挙げられる。ポリエステル系ポリマーとしては芳香族ジカルボン酸と芳香族ジオールのアルキレンオキサイド付加物との重縮合物などが挙げられる。エポキシ系ポリマーとしては芳香族ジオールとエピクロルヒドリンとの反応物およびこれの変性物などが挙げられる。ポリオレフィン系ポリマーとしてはポリエチレン、ポリプロピレンおよびこれらと他の共重合可能な単量体との共重合体鎖などが挙げられる。ポリウレタン系ポリマーとしては芳香族ジイソシアネートと芳香族ジオールのアルキレンオキサイド付加物との重付加物などが挙げられる。
【０１８０】
バインダー樹脂の具体例としては、以下に挙げる重合性単量体の重合体、または、これらの混合物、或いは、以下に挙げる重合性単量体を２種類以上使用して得られる共重合生成物が挙げられる。このようなものとしては、具体的には、例えば、スチレン-アクリル酸共重合体、或いはスチレン-メタクリル酸系共重合体などのスチレン系ポリマー、さらにはポリエステル系ポリマー、エポキシ系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマーおよびポリウレタン系ポリマー等が挙げられ、好ましく使用できる。
【０１８１】
(重合性単量体)
重合性単量体の具体例としては、例えば、スチレン、o-メチルスチレン、ｍ-メチルスチレン、p-メチルスチレン、p-メトキシスチレン、p-フェニルスチレン、p-クロルスチレン、３、４-ジクロルスチレン、p-エチルスチレン、２、４-ジメチルスチレン、p-n-ブチルスチレン、p-tert-ブチルスチレン、p-n-ヘキシルスチレン、p-n-オクチルスチレン、p-n-ノニルスチレン、p-n-デシルスチレン、p-n-ドデシルスチレンの如きスチレン及びその誘導体；エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレンの如きエチレン不飽和モノオレフィン類；ブタジエンの如き不飽和ポリエン類；塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル、弗化ビニルの如きハロゲン化ビニル類；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ベンゾエ酸ビニルの如きビニルエステル酸；メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸n-ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸n-オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸２-エチルヘキシル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸ジエチルアミノエチルの如きα-メチレン脂肪族モノカルボン酸エステル類；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸n-ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸n-オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸２-エチルヘキシル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２-クロルエチル、アクリル酸フェニルの如きアクリル酸エステル類；ビニルメチルエーテル、ビニルエチルエーテル、ビニルイソブチルエーテルの如きビニルエーテル類；ビニルメチルケトン、ビニルヘキシルケトン、メチルイソプロペニルケトンの如きビニルケトン類；Ｎ-ビニルピロール、Ｎ-ビニルカルバゾール、Ｎ-ビニルインドール、Ｎ-ビニルピロリドンの如きＮ-ビニル化合物；ビニルナフタリン類；アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミドの如きアクリル酸若しくはメタクリル酸誘導体；前述のα、β-不飽和酸のエステル、二塩基酸のジエステル類；マレイン酸、マレイン酸メチル、マレイン酸ブチル、マレイン酸ジメチル、フタル酸、コハク酸、テレフタル酸などのジカルボン酸類；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１、２-プロピレングリコール、１、３-プロピレングリコール、１、４-ブタンジオール、１、６-ヘキサンジオール、ビスフェノールＡ、水素添加ビスフェノールＡ、ポリオキシエチレン化ビスフェノールＡ等のポリオール化合物；p-フェニレンジイソシアネート、p-キシリレンジイソシアネート、１、４-テトラメチレンジイソシアネート等のイソシアネート類；エチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、１、４-ジアミノベンゼン、１、４-ジアミノブタン、モノエタノールアミン等のアミン類；ジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ビスフェノールＡグリシジルエーテル、ハイドロキノンジグリシジルエーテル等のエポキシ化合物等が挙げられる。
【０１８２】
(架橋剤)
また、バインダー樹脂を形成する場合、必要に応じて下記に挙げるような架橋剤を用いることもできる。例えば、２官能の架橋剤として、ジビニルベンゼン、ビス(４-アクリロキシポリエトキシフェニル)プロパン、エチレングリコールジアクリレート、１、３-ブチレングリコールジアクリレート、１、４-ブタンジオールジアクリレート、１、５-ペンタンジオールジアクリレート、１、６-ヘキサンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコール＃200、＃400、＃600の各ジアクリレート、ジプロピレングリコールジアクリレート、ポリプロピレングリコールジアクリレート、ポリエステル型ジアクリレート(ＭＡＮＤＡ日本化薬)、及び以上のアクリレートをメタクリレートに変えたもの等が挙げられる。
【０１８３】
２官能以上の多官能の架橋剤としては、例えば、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリメチロールエタントリアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート、オリゴエステルアクリレート及びそのメタクリレート、２、２-ビス(４-メタクリロキシ、ポリエトキシフェニル)プロパン、ジアリルフタレート、トリアリルシアヌレート、トリアリルアソシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルトリメリテート、ジアリールクロレンデート等が挙げられる。
【０１８４】
(重合開始剤)
また、バインダー樹脂を形成する場合には、下記に挙げるような重合開始剤を必要に応じて用いることができる。例えば、t-ブチルパーオキシ-２-エチルヘキサノエート、クミンパーピバレート、t-ブチルパーオキシラウレート、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ジ-t-ブチルパーオキサイド、t-ブチルクミルパーオキサイド、ジクミルパーオキサイド、２、２′-アゾビスイソブチロニトリル、２、２′-アゾビス(２-メチルブチロニトリル)、２、２′-アゾビス(２、４-ジメチルバレロニトリル)、２、２′-アゾビス(４-メトキシ-２、４-ジメチルバレロニトリル)、１、１-ビス(t-ブチルパーオキシ)３、３、５-トリメチルシクロヘキサン、１、１-ビス(t-ブチルパーオキシ)シクロヘキサン、１、４-ビス(t-ブチルパーオキシカルボニル)シクロヘキサン、２、２-ビス(t-ブチルパーオキシ)オクタン、n-ブチル４、４-ビス(t-ブチルパーオキシ)バリレート、２、２-ビス(t-ブチルパーオキシ)ブタン、１、３-ビス(t-ブチルパーオキシ-イソプロピル)ベンゼン、２、５-ジメチル-２、５-ジ(t-ブチルパーオキシ)ヘキサン、２、５-ジメチル-２、５-ジ(t-ブチルパーオキシ)ヘキサン、２、５-ジメチル-２、５-ジ(ベンゾイルパーオキシ)ヘキサン、ジ-t-ブチルジパーオキシイソフタレート、２、２-ビス(４、４-ジ-t-ブチルパーオキシシクロヘキシル)プロパン、ジ-t-ブチルパーオキシα-メチルサクシネート、ジ-t-ブチルパーオキシジメチルグルタレート、ジ-t-ブチルパーオキシヘキサヒドロテレフタレート、ジ-t-ブチルパーオキシアゼラート、２、５-ジメチル-２、５-ジ(t-ブチルパーオキシ)ヘキサン、ジエチレングリコール-ビス(t-ブチルパーオキシカーボネート)、ジ-t-ブチルパーオキシトリメチルアジペート、トリス(t-ブチルパーオキシ)トリアジン、ビニルトリス(t-ブチルパーオキシ)シラン等が挙げられる。
【０１８５】
これらが単独或いは併用して使用できる。その使用量はモノマー 100 質量部に対し、0.05 質量部以上(好ましくは 0.1 〜 15 質量部)の濃度で用いられる。
【０１８６】
(荷電制御剤)
荷電制御剤としては、従来使用されている荷電制御剤を使用できる。具体例としては、ニグロシン系染料、四級アンモニウム塩、モノアゾ系の金属錯体塩染料等を挙げることができる。荷電制御剤の添加量はバインダー樹脂の帯電性、着色剤の添加量・分散方法を含めた製造方法、その他の添加剤の帯電性等の条件を考慮した上で決めることができるが、バインダー樹脂 100 質量部に対して 0.1 〜 20 質量部、好ましくは 0.5 〜 10 質量部の割合で用いることができる。この他、金属酸化物等の無機粒子や前記有機物質で表面処理した無機物質を用いても良い。これら荷電制御剤は、バインダー樹脂中に混合添加して用いても、トナー粒子表面に付着させた形で用いても良い。
【０１８７】
＜トナーの他の成分＞
本発明の静電荷像現像トナー中には、上記した着色剤、バインダー樹脂、荷電制御剤の他に、以下の化合物を含有させてもよい。例えば、シリコーン樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、エポキシ樹脂、ポリビニルブチラール、ロジン、変性ロジン、テルペン樹脂、フェノール樹脂、低分子量ポリエチレンまたは低分子量ポリプロピレンの如き脂肪族または脂環族炭化水素樹脂、芳香族系石油樹脂、及び、塩素化パラフィン、パラフィンワックス等である。これらの中でも好ましく用いられるワックス類としては、具体的には、低分子量ポリプロピレン及びこの副生成物、低分子量ポリエステル及びエステル系ワックス、脂肪族の誘導体が挙げられる。これらのワックスから、種々の方法によりワックスを分子量により分別したワックスも本発明に好ましく用いられる。また、分別後に酸価やブロック共重合、グラフト変性を行ってもよい。
【０１８８】
特に、本発明の静電荷像現像トナーにおいては、上記したようなワックス成分を含み、しかも透過型電子顕微鏡(ＴＥＭ)を用いてトナーの断層観察を行なった場合に、これらのワックス成分が、バインダー樹脂中に実質的に球状及び/または紡錘形の島状に分散されている場合に優れた特性のトナーとなる。
【０１８９】
＜静電荷像現像トナー製造方法＞
上記のような構成を有する本発明の静電荷像現像トナーを作製する具体的な方法としては、従来公知の方法をいずれも用いることができる。ここで、本発明にかかる着色剤をバインダー樹脂中へ分散する手法としては、着色剤を乾燥させたものをバインダー樹脂中へ着色剤が破壊されない程度の剪断力を加えて溶融混練して分散してもよいし、着色剤が比較的容易に一次粒子に均一に分散できる着色剤製造工程の含水ケーキを溶融したバインダー樹脂で置換するメルトフラッシング法等により分散してもよい。
【０１９０】
(粉砕法)
本発明の静電荷像現像トナーは、例えば、下記の工程によってトナーを得る、所謂粉砕法によって作製できる。即ち、具体的には、本発明にかかる着色剤、バインダー樹脂等の樹脂類、その他、必要に応じて添加される荷電制御剤、ワックスを、ヘンシェルミキサー、ボールミル等の混合器により充分混合してから、加熱ロール、ニーダー、エクストルーダーの如き熱混練機を用いて溶融混練して樹脂類をお互いに相溶せしめた中に必要に応じて添加される磁性体、金属化合物等の添加剤を分散または溶解せしめ、冷却固化後、ジェットミル、ボールミル等の粉砕機により固化物を粉砕した後、分級を行って所望の粒径を有する本発明の静電荷像現像トナーを得ることができる。
【０１９１】
なお、上記分級工程においては、生産効率上、多分割分級機を用いることが好ましい。本発明の場合、溶融混練の際に、第１の樹脂成分に被覆されている着色材、例えば顔料が、第２の樹脂成分中に溶出したり、あるいは再凝集することがなく、着色材、例えば顔料が第１の樹脂成分中に被覆されたままの状態で、第２の樹脂成分の中に分散された静電荷像現像トナーが得られる。
【０１９２】
また、バインダー樹脂と荷電制御剤等を溶剤(トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素、クロロホルム、エチレンジクロライドなどのハロゲン化物、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトンおよびジメチルホルムアミドなどのアミドなど)を用い、溶液混合し、攪拌処理後、水中に投じて再沈澱せしめ、濾過、乾燥後、ジェットミル、ボールミル等の粉砕機により固化物を粉砕した後、分級を行って所望の粒径を有する本発明の静電荷像現像トナーを得ることもできる。尚、上記分級工程においては、生産効率上、多分割分級機を用いることが好ましい。
【０１９３】
(重合法)
また、本発明の静電荷像現像トナーは、下記のような所謂重合法によって作製することもできる。即ち、この場合には、バインダー樹脂の重合性単量体、本発明にかかる着色剤、または磁性体、必要に応じて、架橋剤、重合開始剤、ワックス、その他の添加剤等の材料を混合分散し、界面活性剤等の存在下、水系分散媒体中で懸濁重合することにより重合性着色樹脂粒子を合成し、得られた粒子を固液分離した後、乾燥し、必要に応じて分級を行って本発明の静電荷像現像トナーを得ることができる。
【０１９４】
(シリカ外添剤)
本発明においては、上記のような方法によって作製されたトナーに、帯電安定性、現像性、流動性、耐久性向上のため、シリカ微粉末を外添することが好ましい。この際に用いられるシリカ微粉末としては、ＢＥＴ法で測定した窒素吸着による比表面積が 20 ｍ2/g以上(特に 30 〜 400 ｍ2/g)の範囲内のものが良好な結果を与える。この場合のシリカ微粉末の量としては、トナー粒子 100 質量部に対して、シリカ微粉体を 0.01 〜８質量部、好ましくは 0.1 〜５質量部程度使用することが好ましい。この際に使用するシリカ微粉末としては、必要に応じて、疎水化及び帯電性コントロールの目的で、シリコーンワニス、各種変性シリコーンワニス、シリコーンオイル、各種変性シリコーンオイル、シランカップリング剤、官能基を有するシランカップリング剤、その他の有機ケイ素化合物の如き処理剤で処理されたものを使用することが好ましい。これらの処理剤は混合して使用してもよい。
【０１９５】
(無機粉体)
また、トナーの現像性及び耐久性を向上させるために、次に挙げるような無機粉体を添加することも好ましい。例えば、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム、セリウム、コバルト、鉄、ジルコニウム、クロム、マンガン、ストロンチウム、錫、アンチモンの如き金属の酸化物；チタン酸カルシウム、チタン酸マグネシウム、チタン酸ストロンチウムの如き複合金属酸化物；炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸アルミニウムの如き金属塩；カオリンの如き粘土鉱物；アパタイトの如きリン酸化合物；炭化ケイ素、窒化ケイ素の如きケイ素化合物；カーボンブラックやグラファイトの如き炭素粉末が挙げられる。これらの中でも、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化コバルト、二酸化マンガン、チタン酸ストロンチウム、チタン酸マグルシウムの微粉体を使用することが好ましい。
【０１９６】
(滑剤)
さらに、下記に挙げるような滑剤粉末をトナーに添加してもよい。例えば、テフロン、ポリフッ化ビニリデンの如きフッ素樹脂；フッ化カーボンの如きフッ素化合物；ステアリン酸亜鉛の如き脂肪酸金属塩；脂肪酸、脂肪酸エステルの如き脂肪酸誘導体；硫化モリブデン等が挙げられる。
【０１９７】
本発明のトナーは、その表面が殆ど第１の樹脂成分及び第２の樹脂成分で覆われているため、顔料の種類によってトナーの帯電性が左右されることがなくなる。従って、種々のトナーについて、同様な種類または量の上記外添剤を使用することが可能である。
【０１９８】
これらの、バインダー樹脂、電荷制御剤、および、その他必要に応じて添加される添加物については、廃棄後のことを考慮して、可能であれば、生分解性を有するものを使用することがより好ましい。
【０１９９】
＜キャリアについて＞
上記のような構成を有する本発明の静電荷像現像トナーは、単独で非磁性一成分現像剤として使用されたり、磁性キャリアとともに磁性二成分現像剤を構成したりする非磁性トナーや、単独で磁性一成分トナーとして使用される磁性トナー等の、従来公知の種々のトナーに適用することができる。ここで二成分現像方法に用いる場合のキャリアとしては、従来知られているものをいずれも使用することができる。具体的には、表面酸化または未酸化の鉄、ニッケル、コバルト、マンガン、クロム、希土類の如き金属及びそれらの合金または酸化物で形成される平均粒径 20 〜 300 μｍの粒子を、キヤリア粒子として使用できる。また、本発明において用いるキャリアは、上記したキャリア粒子の表面が、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂、シリコーン系樹脂、フッ素系樹脂、ポリエステル樹脂の如き物質によって付着または被覆されているものであることが好ましい。
【０２００】
＜磁性トナー＞
本発明の静電荷像現像トナーは、磁性材料をトナー粒子中ら含有させ磁性トナーとしてもよい。この場合には、磁性材料に、着色剤の役割を兼ねさせることもできる。この際に使用される磁性材料としては、マグネタイト、ヘマタイト、フェライトの如き酸化鉄；鉄、コバルト、ニッケルのような金属或いはこれらの金属とアルミニウム、コバルト、銅、鉛、マグネシウム、スズ、亜鉛、アンチモン、ベリリウム、ビスマス、カドミウム、カルシウム、マンガン、セレン、チタン、タングステン、バナジウムのような金属との合金及びその混合物が挙げられる。本発明において用いることのできるこれらの磁性材料としては、平均粒子径が２μｍ以下、好ましくは 0.1 〜 0.5 μｍ程度のものが好ましい。トナー中に含有させる量としては、バインダー樹脂 100 質量部に対し 20 〜 200 質量部、特に好ましくは、バインダー樹脂 100 質量部に対して 40 〜 150 質量部とすることが好ましい。
【０２０１】
更に、高画質化を達成するためには、より微小な潜像ドットを忠実に現像することを可能にする必要があり、そのためには、例えば、本発明の静電荷像現像トナー粒子の重量平均径が４μｍ〜９μｍの範囲内となるように調整することが好ましい。即ち、重量平均径が４μｍ未満のトナー粒子では、転写効率の低下が生じ、感光体上に転写残トナーが多く残り易く、カブリ・転写不良に基づく画像の不均一ムラの原因となり易く、好ましくない。また、トナー粒子の重量平均径が９μｍを超える場合には、文字やライン画像の飛び散りが生じ易い。
【０２０２】
本発明において、トナーの平均粒径及び粒度分布は、コールターカウンターＴＡ-II型或いはコールターマルチサイザー(コールター社製)等を用い、個数分布、体積分布を出力するインターフェイス(日科機製)及びＰＣ-9801 パーソナルコンピューター(ＮＥＣ製)を接続して測定した。その際に使用する電解液として、１級塩化ナトリウムを用いて１％ＮaＣl水溶液を調製する。電解液としては、例えば、市販のＩＳＯＴＯＮ Ｒ-II(コールターサイエンティフィックジャパン社製)を使用することもできる。具体的な測定法としては、上記電解水溶液 100 〜 150 ｍL中に、分散剤として界面活性剤(好ましくは、アルキルベンゼンスルフォン酸塩を使用する)を 0.1 〜５ｍL加え、更に、測定試料を２〜 20 ｍg加えて測定用試料とする。測定の際には、この測定試料が懸濁された電解液を超音波分散器で約１〜３分間分散処理を行った後、前記コールターカウンターＴＡ-II型によりアパーチャーとして 100 μｍアパーチャーを用いて、２μｍ以上のトナーの体積、個数を測定し、体積分布と個数分布とを算出した。それから、本発明に係わる体積分布から求めた体積基準の重量平均粒径(Ｄ４)、個数分布から求めた個数基準の長さ平均粒径(Ｄ１)を求めた。
【０２０３】
＜帯電量＞
また、本発明の静電荷像現像トナーは、単位質量あたりの帯電量(二成分法)が-10 〜-80 μＣ/g、より好ましくは -15 〜 -70 μＣ/gであることが、電圧を印加した転写部材を用いる転写方法において転写効率を向上させる上で好ましい。
【０２０４】
本発明において使用した二成分法による帯電量(二成分トリボ)の測定法を以下に示す。測定には、図７に示した帯電量測定装置を使用した。先ず、一定環境下、キャリアとしてＥＦＶ 200 / 300(パウダーテック社製)を用い、該キャリア 9.5 gに対して、測定対象のトナー 0.5 gを加えた混合物を、50 〜 100 ｍL容量のポリエチレン製の瓶に入れ、振幅を一定にした振とう機に設置して、振とう条件を、振幅 100 ｍｍ、振とう速度１分間 100 回往復に設定し、一定時間振とうする。次いで、図７に示した帯電量測定装置の、底に 500 メッシュのスクリーン 43 のある金属製の測定容器 42 に、前記混合物 1.0 〜 1.2 gを入れて、金属製のフタ 44 をする。この時の測定容器 42 全体の質量を秤かりＷ１(g)とする。次に、不図示の吸引機(測定容器 22 と接する部分は少なくとも絶縁体)で吸引口 47 から吸引し、風量調節弁 46 を調節して真空計 45 の圧力が 2450 Ｐa(250 ｍｍＡq)になるようにする。この状態で一分間吸引を行って、トナーを吸引除去する。この時の電位計 49 の電位をＶ(ボルト)とする。ここで 48 はコンデンサーであり容量をＣ(μＦ)とする。また、吸引後の測定機全体の質量をはかりＷ２(g)とする。トナーの摩擦帯電量(μＣ/g)は、これらの測定値から、下式によって計算される。
計算式：摩擦帯電量（μＣ／ｇ）＝Ｃ×Ｖ／(Ｗ１−Ｗ２)
＜バインダー樹脂の分子量＞
本発明において、バインダー樹脂の分子量は、ＧＰＣ(ゲルパーミエーションクロマトグラフィー)により測定した。具体的なＧＰＣの測定方法としては、予めトナーをＴＨＦ(テトラヒドロフラン)溶剤でソックスレー抽出器を用いて 20時間抽出を行ったサンプルを測定用に用い、カラム構成は、昭和電工製Ａ-801、802、803、804、805、806、807 を連結し標準ポリスチレン樹脂の検量線を用い分子量分布を測定した。また、本発明においては、上記のようにして測定した重量平均分子量(Ｍｗ)と数平均分子量(Ｍn)との比率(Ｍｗ/Ｍn)が、２〜 100 の範囲内にあるバインダー樹脂を使用することが好ましい。
【０２０５】
＜トナーのガラス転移点＞
さらに、本発明のトナーは、適宜な材料を用いることによって、定着性、保存性の観点から、そのガラス転移点Ｔgが、30℃〜 80℃、更に好ましくは、50℃〜 70 ℃となるように調製されることが好ましい。この場合におけるガラス転移点Ｔgの測定には、例えば、パーキンエルマー社製のＤＳＣ-７のような高精度の内熱式入力補償型の示差走査熱量計を用いて測定を行えばよい。測定方法としては、ＡＳＴＭ Ｄ 3418-82 に準じて行う。本発明においては、ガラス転移点Ｔgを測定する場合に、測定試料を１回昇温して全履歴をとった後、急冷し、再度、温度速度 10 ℃/ｍin、温度０〜 200 ℃の範囲で昇温させたときに測定されるＤＳＣ曲線を用いるとよい。
【０２０６】
＜画像形成方法ならびに装置＞
上記で説明した構成を有する本発明の静電荷像現像トナーは、少なくとも、外部より帯電部材に電圧を印加して、静電潜像担持体に帯電を行う帯電工程と、帯電された静電潜像担持体に静電荷像を形成する工程と、該静電荷像をトナーにより現像してトナー像を静電潜像担持体上に形成する現像工程と、静電潜像担持体上のトナー像を被記録材へ転写する転写工程と、被記録材上のトナー像を加熱定着する加熱定着工程とを有する画像形成方法、あるいは、転写工程が、静電潜像担持体上のトナー像を中間の転写体に転写する第１の転写工程と、該中間の転写体上のトナー像を被記録材に転写する第２の転写工程とからなる画像形成方法に適用することが特に好ましい。
【０２０７】
また、この方法で用いられる装置は、それぞれの工程に対応した手段、すなわち帯電手段、静電荷像形成手段、現像手段、転写手段、加熱定着手段をそなえていることが好ましい。
【０２０８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下における「％」は特に標記した以外は質量基準である。
【０２０９】
(参考例１) ＰＨＢ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ＴＢ 64 株由来のＰＨＢ合成酵素の生産能を有する形質転換体の作製方法に関しては、発明者らが別途既に出願しているが、ここではその具体例を挙げる。ＴＢ 64 株を 100 ｍLのＬＢ培地(１％ポリペプトン、0.5 ％酵母エキス、0.5 ％塩化ナトリウム、pＨ 7.4)で、30 ℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓau３ＡIで部分分解した。ベクターはpＵＣ 18 を使用し、制限酵素ＢaｍＨIで切断し、脱リン酸化処理(Ｍolecular Ｃloning、１巻、572 頁、1989 年；Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory出版)の後、ＤＮＡライゲーションキットＶer.II(宝酒造)を用いて染色体ＤＮＡのＳau３ＡI部分分解断片と連結した。次に、この連結ＤＮＡ断片を用いて大腸菌(Ｅscheichia coli)ＨＢ 101 株を形質転換し、ＴＢ 64 株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０２１０】
次に、ＴＢ 64 株のＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るための表現型スクリーニングを行った。選択培地には２％グルコースを含有するＬＢ培地を用い、寒天平板培地上のコロニーが適当な大きさに生育してきた時点でスダンブラックＢ溶液を噴霧し、ＵＶ光照射により蛍光を発するコロニーを取得した。取得したコロニーからアルカリ法によりプラスミドを回収することでＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０２１１】
ここで取得した遺伝子断片を不和合性グループであるIncＰ、IncＱ、あるいはIncＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターpＢＢＲ 122(Ｍo ＢiＴec)に組み換え、この組み換えプラスミドをラルストーニャ・ユートロファＴＢ 64 ｍ１株(ＰＨＢ合成能欠損株)にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＴＢ 64 ｍ１株のＰＨＢ合成能が復帰し、相補性を示した。
【０２１２】
次に、ＰＨＢ合成酵素遺伝子の開始コドン近傍の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計・合成し(アマシャムファルマシア・バイオテク)、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ＰＨＢ合成酵素遺伝子を含む断片を増幅した(ＬＡ-ＰＣＲキット；宝酒造)。
【０２１３】
次に、上のようにして得られたＰＣＲ増幅断片について制限酵素ＢaｍＨIを用いて完全分解し、発現ベクターpＴrc 99 Ａの制限酵素ＢaｍＨIで切断、脱リン酸化処理(Ｍolecular Ｃloning、１巻、5.7.2 頁、1989 年；Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory出版)したものに、ＤＮＡライゲーションキットＶer.II(宝酒造)を用いて連結した。得られた組換えプラスミドで大腸菌(Ｅscherichia coli ＨＢ 101)を塩化カルシウム法により形質転換し(宝酒造)、得られた組換え体より回収した組換えプラスミドをpＴＢ 64-ＰＨＢとした。
【０２１４】
pＴＢ 64-ＰＨＢで大腸菌(Ｅscherichia coli ＨＢ 101)を塩化カルシウム法により形質転換し、pＴＢ 64-ＰＨＢ組換え株を得た。
【０２１５】
(参考例２) ＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
pＴＢ 64-ＰＨＢ組換え株をＬＢ培地 200 ｍLに植菌して、37 ℃、125 ストローク/分で 12 時間振盪培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離によって回収し、定法によりプラスミドＤＮＡを回収した。
【０２１６】
pＴＢ 64-ＰＨＢに対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号:１)および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号:２)をそれぞれ設計・合成した(アマシャムファルマシア・バイオテク)。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pＴＢ 64-ＰＨＢをテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢaｍＨI制限部位、下流にＸhoI制限部位を有するＰＨＢ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した(ＬＡ-ＰＣＲキット；宝酒造)。
【０２１７】
精製したＰＣＲ増幅産物をＢaｍＨIおよびＸhoIにより消化し、プラスミドpＧＥＸ‐６Ｐ‐１(アマシャムファルマシア・バイオテク社製)の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌(JＭ 109)を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍiniprep(Ｗizard Ｍinipreps ＤＮＡ Ｐurification Ｓysteｍs、ＰＲＯＭＥＧＡ社製)を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢaｍＨI、ＸhoIで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。
【０２１８】
(参考例３) ＰＨＢ合成酵素の調製
得られた発現用菌株をアンピシリン(100 μg/Ｌ)を添加した２×ＹＴ培地(ポリペプトン 16 g/Ｌ、酵母エキス 10 g/Ｌ、ＮaＣl ５g/Ｌ、ＰＨ 7.0)100 ｍLで 30 ℃にて一晩前培養した。
【０２１９】
これをアンピシリン(100 μg/Ｌ)を添加した２×ＹＴ培地(ポリペプトン 16 g/Ｌ、酵母エキス 10 g/Ｌ、ＮaＣl ５g/Ｌ、ＰＨ 7.0)10 リットルに添加し、30℃にて３時間培養後、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド(IＰＴＧ)を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、30 ℃にて３時間培養した。
【０２２０】
回収した培養液を４℃、78000ｍ/s2(=8000Ｇ)で 10 分間遠心処理し、上清を取り除いた後、菌体ペレットを４℃のＰＢＳ溶液 500 ｍLに再懸濁した。この菌液をあらかじめ４℃に冷却しておいたベッセルに各回 40 ｍLずつ注入し、フレンチプレスによって 216ＭPa(=2200 kg/cｍ2)に加圧しながら少しずつノズルから菌液を解放することで菌体破砕処理を行った。菌体破砕液を４℃、78000ｍ/s2(=8000Ｇ)で 10 分間遠心処理した後、上清を回収した。この上清を 0.45 μｍのフィルターで濾過し、固形夾雑物を取り除き、上清中に目的のグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)の融合したＰＨＢ合成酵素が存在することをＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した。
【０２２１】
次に、このＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素をグルタチオン・セファロース４Ｂ(Ｇlutathion Ｓepharose ４Ｂ：アマシャムファルマシア・バイオテク社製)で精製した。グルタチオン・セファロース４Ｂの 75 ％スラリー 6.65 ｍLを４℃、4900ｍ/s2(=500Ｇ)で５分間遠心処理し、上清を取り除いた後、４℃のＰＢＳ溶液 200 ｍLに再懸濁し、さらに４℃、4900ｍ/s2(=500Ｇ)で５分間遠心処理し、上清を取り除いた。さらに４℃のＰＢＳ溶液５ｍLに再懸濁し、グルタチオン・セファロース４Ｂ の 50 %スラリーとした。
【０２２２】
このグルタチオン・セファロース４Ｂの 50 %スラリー 10 ｍLに先ほど調整した上清全量を添加し、室温で 30 分間緩やかに振とうしてグルタチオン・セファロース４Ｂに上清中の目的とする融合たんぱく質をアフィニティ吸着させた。その後、４℃、4900ｍ/s2(=500Ｇ)で５分間遠心処理し、上清を取り除いた後、４℃のＰＢＳ溶液５ｍLに再懸濁し、再び同様の遠心処理を行い、上清を除いた。このＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素を固定化したグルタチオン・セファロース４Ｂについて、ＰＢＳ溶液への再懸濁と遠心処理を２回繰り返して洗浄した後、最後に５℃のクリベージ緩衝液(Ｃleavage Ｂuffer；Ｔris-ＨＣl 50 ｍＭ、ＮaＣl150ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、Ｄithiothreitol１ｍＭ、ＰＨ７)５ｍLに懸濁した。これに４% のプレシション・プロテアーゼ(ＰreＳcission Ｐrotease；アマシャムファルマシア バイオテク社製)のクリベージ緩衝液溶液 0.5 ｍLを添加し、５℃で４時間緩やかに振とうした。これを４℃、4900ｍ/s2(=500Ｇ)で５分間遠心処理し、上清を回収した。次に上記と同様に調整したグルタチオン・セファロース４Ｂの 50 ％スラリー１ｍLを、４℃、4900ｍ/s2(=500Ｇ)で５分間遠心処理し、上清を除いた後のグルタチオン・セファロース４Ｂに先ほど回収した上清を添加し、緩やかに攪拌して上清中に残留したプレシション・プロテアーゼをグルタチオン・セファロース４Ｂに吸着させた。次いで４℃、4900ｍ/s2(=500Ｇ)で５分間遠心処理して上清を回収した。この上清はＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示し、精製されていることを確認した。
【０２２３】
また、含有するＰＨＢ合成酵素活性を以下の方法で測定した。まず、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)を 0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に 3.0ｍg/ｍL溶解した溶液 100 μLを酵素溶液 100 μLに添加して混合し、30 ℃で１分間プレインキュベートした。これに、３-ヒドロキシブチリルＣoＡを 0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に 3.0 ｍＭ溶解した溶液 100 μLを添加して混合し、30 ℃で１〜 30 分間インキュベートしたのち、トリクロロ酢酸を 0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に 10 ｍg/ｍL溶解した溶液 300 μLを添加して反応を停止させた。反応停止したこの溶液を遠心分離(147、000ｍ/s2(=15、000Ｇ)、10 分間)し、５、５'-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)を 0.1 Ｍトリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に 2.0 ｍＭ溶解した溶液 500 μLを上清 500 μLに添加し、30 ℃で 10 分間インキュベートしたのち、412 nｍの吸光度を測定した。そして１分間に１μｍolのＣoＡを放出させる酵素量を１単位(Ｕ)として、酵素活性を計算した。その結果、比活性として 7.5 Ｕ/ｍLが得られた。この液を、ライホゲルを添加して限外濾過濃縮し、10 Ｕ/ｍLとしたものを精製酵素液(１)とした。
【０２２４】
(参考例４) ＰＨＢ合成酵素含有粗酵素液の調製方法
ＫＫ 01 及びＴＬ２株を、酵母エキス 0.5 ％、ミネラル溶液(下記参照)0.3％を含有したＭ９培地(下記組成)10 リットルで 30 ℃、24 時間培養し、回収した培養液を４℃、78000ｍ/s2(=8000Ｇ)で 10 分間遠心処理し、上清を取り除いた後、菌体ペレットを４℃のＰＢＳ溶液 500 ｍLに再懸濁した。この菌液をあらかじめ４℃に冷却しておいたベッセルに各回 40 ｍLずつ注入し、フレンチプレスによって 2200 kg/cｍ2に加圧しながら少しずつノズルから菌液を解放することで菌体破砕処理を行った。得られた菌体破砕液を４℃、78000ｍ/s2(=8000Ｇ)で 10 分間遠心処理した後、上清を回収した。この上清を 0.45 μｍのフィルターで濾過し、固形夾雑物を取り除き、含有するＰＨＢ合成酵素活性を前述の方法で測定した。その結果、比活性としてＫＫ 01 株については 1.6 Ｕ/ｍL、ＴＬ２株については 1.2 Ｕ/ｍLが得られた。この液を、生体溶液試料濃縮剤(商品名:みずぶとりくん、アトー社製)を添加して限外濾過濃縮し、10 Ｕ/ｍLとした粗酵素液を、ＫＫ 01 株由来のものを粗酵素液(１)、ＴＬ２株由来のものを粗酵素液(２)とした。
(Ｍ９培地)
Ｎa2ＨＰＯ4 : 6.2 g
ＫＨ2ＰＯ4 : 3.0 g
ＮaＣl : 0.5 g
ＮＨ4Ｃl : 1.0 g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
(ミネラル溶液)
ニトリロ三酢酸 : 1.5 g
ＭgＳＯ4 : 3.0 g
ＭnＳＯ4 : 0.5 g
ＮaＣl : 1.0 g
ＦeＳＯ4 : 0.1 g
ＣaＣl2 : 0.1 g
ＣoＣl2 : 0.1 g
ＺnＳＯ4 : 0.1 g
ＣuＳＯ4 : 0.1 g
ＡlＫ(ＳＯ4)2 : 0.1 g
Ｈ3ＢＯ3 : 0.1 g
Ｎa2ＭoＯ4 : 0.1 g
ＮiＣl2 : 0.1 g
(１リットル中、pＨ 7.0)
(参考例５) ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体を作製した。
【０２２５】
ＹＮ２株を 100 ｍLのＬＢ培地(１％ポリペプトン(日本製薬(株)製)、0.5 ％酵母エキス(Ｄifco社製)、0.5 ％塩化ナトリウム、pＨ 7.4)で 30 ℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈind IIIで完全分解した。ベクターにはpＵＣ 18 を使用し、制限酵素Ｈind IIIで切断した。末端の脱リン酸処理(Ｍolecular Ｃloning、１、572、(1989); Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory出版)ののち、ＤＮＡライゲーションキットＶer.II(宝酒造(株)製)を用いて、ベクターの切断部位(クローニングサイト)と染色体ＤＮＡのＨind III完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌(Ｅscherichia coli)ＨＢ 101 株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０２２６】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号:３および配列番号:４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し(アマシャムファルマシア・バイオテク(株))、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡlkＰhosＤirect(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製)を利用して行った。
【０２２７】
得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０２２８】
ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるIncＰ、IncＱ、あるいはIncＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターpＢＢＲ 122(Ｍo Ｂi Ｔec)に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍL株(ＰＨＡ合成能欠損株)にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍL株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍL株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０２２９】
このＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号:５および配列番号:６で示される塩基配列が存在することが確認された。これらのＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
【０２３０】
即ち、配列番号:５で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー(配列番号:７)および下流側プライマー(配列番号:８)、配列番号:６で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー(配列番号:９)および下流側プライマー(配列番号: 10)をそれぞれ合成した(アマシャムファルマシア・バイオテク(株))。これらのプライマーを用いて、配列番号:５および配列番号:６で示される塩基配列それぞれについてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した(ＬＡ-ＰＣＲキット；宝酒造(株)製)。
【０２３１】
次に、得られたＰＣＲ増幅断片および発現ベクターpＴrc 99 Ａを制限酵素Ｈind IIIで切断し、脱リン酸化処理(Ｍolecular Ｃloning、１巻、572 頁、1989 年；Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory出版)したのち、この発現ベクターpＴrc 99 Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットＶer.II(宝酒造(株)製)を用いて連結した。
【０２３２】
得られた組換えプラスミドで大腸菌(Ｅscherichia coli ＨＢ 101 :宝酒造)を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号:５の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをpＹＮ２-Ｃ１、配列番号:６の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをpＹＮ２-Ｃ２とした。pＹＮ２-Ｃ１、pＹＮ２-Ｃ２で大腸菌(Ｅscherichia coli ＨＢ 101 fＢ fadＢ欠損株)を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、pＹＮ２-Ｃ１組換え株、pＹＮ２-Ｃ２組換え株を得た。
【０２３３】
(参考例６) ＰＨＡ合成酵素の生産１
pＹＮ２-Ｃ１に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号: 11)および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号: 12)をそれぞれ設計・合成した(アマシャムファルマシア・バイオテク(株))。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pＹＮ２-Ｃ１をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢaｍＨI制限部位、下流にＸhoI制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した(ＬＡ-ＰＣＲキット；宝酒造(株)製)。
【０２３４】
同様にpＹＮ２-Ｃ２に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号: 13)および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号: 14)をそれぞれ設計・合成した(アマシャムファルマシア・バイオテク(株))。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pＹＮ２-Ｃ２をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢaｍＨI制限部位、下流にＸhoI制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した(ＬＡ-ＰＣＲキット；宝酒造(株)製)。
【０２３５】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢaｍＨIおよびＸhoIにより消化し、プラスミドpＧＥＸ-６Ｐ-１(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製)の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌(JＭ 109)を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍiniprep(Ｗizard Ｍinipreps ＤＮＡ Ｐurification Ｓysteｍs、ＰＲＯＭＥＧＡ社製)を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢaｍＨI、ＸhoIで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。得られた菌株をＬＢ-Ａｍp培地 10 ｍLで一晩プレ・カルチャーした後、その 0.1 ｍLを、10 ｍLのＬＢ-Ａｍp培地に添加し、37 ℃、170 rpｍで３時間振とう培養した。その後IＰＴＧを添加(終濃度 １ ｍＭ)し、37 ℃で４から 12 時間培養を続けた。
【０２３６】
IＰＴＧ 誘導した大腸菌を集菌(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、２分、４℃)し、１/ 10 量の ４℃ リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ；８ g ＮaＣl、1.44 g Ｎa2ＨＰＯ4、0.24 g ＫＨ2ＰＯ4、0.2 g ＫＣl、１、000 ｍL精製水)に再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、10 分、４℃)して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製)で精製した。
【０２３７】
使用するグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、１分、４℃)した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１/２量のＰＢＳに再懸濁した。
【０２３８】
前処理したグルタチオンセファロース 40 μLを、無細胞抽出液１ ｍL に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ-ＹＮ２-Ｃ１およびＧＳＴ-ＹＮ２-Ｃ２をグルタチオンセファロースに吸着させた。吸着後、遠心(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、１分、４℃)してグルタチオンセファロースを回収し、400 μLのＰＢＳで３回洗浄した。その後、10 ｍＭグルタチオン 40 μLを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、２分、４℃)して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、シングルバンドを確認した。
【０２３９】
各ＧＳＴ融合タンパク質 500 μgをＰreＳcissionプロテアーゼ(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製、５Ｕ)で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴとを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ 200 カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２-Ｃ１およびＹＮ２-Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりそれぞれ 60.8 kＤa、および 61.5 kＤaのシングルバンドを確認した。
【０２４０】
該酵素を生体溶液試料濃縮剤(みずぶとりくんＡＢ-1100、アトー(株)製)を用いて濃縮し、10 Ｕ/ｍLの精製酵素溶液を得た。
【０２４１】
各精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット(ピアスケミカル社製)によって測定した。各精製酵素の活性測定の結果を表１に示した。
【０２４２】
【表１】
Figure 0004532784
【０２４３】
(参考例７) ＰＨＡ合成酵素の生産２
Ｐ 91 株、Ｈ 45 株、ＹＮ２株およびＰ 161 株を、酵母エキス(Ｄifco社製)0.5 ％、オクタン酸 0.1 ％とを含むＭ９培地 200 ｍLに植菌して、30 ℃、125ストローク/分で振盪培養した。24 時間後、菌体を遠心分離(98、000ｍ/s2(10、000Ｇ)、４℃、10 分間)によって回収し、0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)200 ｍLに再懸濁して再度遠心分離することによって洗浄した。菌体を 0.1 Ｍ トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)2.0 ｍLに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕したのち、遠心分離(118、000ｍ/s2(=12、000Ｇ)、４℃、10 分間)して上清を回収して粗酵素溶液を得た。各粗酵素活性は前述の方法で測定し、その結果を表２に示した。
【０２４４】
【表２】
Figure 0004532784
【０２４５】
該粗酵素溶液を生体溶液試料濃縮剤(みずぶとりくんＡＢ-1100、アトー(株)製)を用いて濃縮し、10 Ｕ/ｍLの粗酵素溶液を得た。
【０２４６】
＜実施例１＞
精製されたＰＨＢ合成酵素液を用いて、フタロシアニンブルー(Ｃ.I.ピグメントブルー 15 :３)を着色材とした本発明にかかる着色剤を下記の方法で調製した。
【０２４７】
フタロシアニンブルーを 0.1 μｍ以下となるようにサンドミルで分散し、この１質量部に精製酵素液(１)10 質量部、ＰＢＳ 39 質量部を添加し、30 ℃にて 30 分間緩やかに振盪してＰＨＢ合成酵素を顔料表面に吸着させた。これを遠心分離(98、000ｍ/s2(10、000Ｇ)、４℃、10 分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98、000ｍ/s2(10、000Ｇ)、４℃、10 分間)してフタロシアニンブルーにＰＨＢ合成酵素を固定化した。
【０２４８】
上記固定化酵素を 0.1 Ｍリン酸バッファー(pＨ 7.0)48 質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシブチリルＣoＡ(シグマ・アルドリッチ・ジャパン(株)社製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1 質量部を添加し、30 ℃で２時間緩やかに振盪した。生成した青色のマイクロカプセル化顔料(以下着色剤と記す)を濾過洗浄乾燥し着色剤１とした。
【０２４９】
ここで、上記反応液 0.01 部をスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液 0.01 部を添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330 〜 380 nｍ励起フィルタ、420 nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、着色剤１表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤１はＰＨＢにより表面を被覆されていることがわかった。対照として、フタロシアニンブルー 10 質量部を 0.1 Ｍリン酸ナトリウムバッファー(pＨ 7.0)100 質量部に添加し、30 ℃で 2.5 時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、対照のフタロシアニンブルー表面は全く蛍光を発しなかった。
【０２５０】
また、着色剤１を真空乾燥したのち、20 ｍLのクロロホルムに懸濁し、60 ℃で 20 時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径 0.45 μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品であるヒドロキシ酪酸のメチル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた着色剤１の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０２５１】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、カラム温度； 40 ℃、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝ 75、000 であった。
【０２５２】
また、被覆前後の顔料の体積平均粒子径をレーザードップラー方式粒度分布測定機(ＵＰＡ-150 ；日機装社製)を用いて測定したところ、被覆前の粒子径 0.064 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.082 μｍであり、顔料をＰＨＢが被覆しているものと推測された。
【０２５３】
＜実施例２＞
実施例１におけるフタロシアニン顔料の代わりに、カーミン６Ｂ(Ｃ.I.ピグメントレッド 57 :１)を用いた点と精製酵素液(１)の替わりに粗酵素液(１)を用いた点以外は、実施例１と全く同様にして着色剤２を得た。
【０２５４】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤２表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤２はＰＨＢにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤２の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤２の数平均分子量は 73、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.071 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.086 μｍであった。
【０２５５】
＜実施例３＞
実施例１におけるフタロシアニン顔料の代わりに、ジスアゾイエロー(Ｃ.I.ピグメントイエロー 12)を用いた点と精製酵素液(１)の替わりに粗酵素液(２)を用いた点以外は、実施例１と全く同様にして着色剤３を得た。
【０２５６】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤３表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤３はＰＨＢにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤３の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤３の数平均分子量は 69、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.073 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.085 μｍであった。
【０２５７】
＜実施例４＞
実施例１における精製酵素液(１)の替わりに精製酵素液(２)を用いた点と(Ｒ)-３-ヒドロキシブチリルＣoＡの替わりに(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡ(Ｅur.J.Ｂiocheｍ.、250、432-439(1997)に記載の方法で調製)を用いた点以外は、実施例１と全く同様にして着色剤４を得た。
【０２５８】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤４表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤４はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤４の外被の主成分が３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤４の数平均分子量は 27、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.064 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.080 μｍであった。
【０２５９】
＜実施例５＞
実施例４におけるフタロシアニン顔料の代わりに、カーミン６Ｂ(Ｃ.I.ピグメントレッド 57 :１)を用いた点と精製酵素液(２)の替わりに精製酵素液(３)を用いた点以外は、実施例４と全く同様にして着色剤５を得た。
【０２６０】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤５表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤５はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤５の外被の主成分が３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤５の数平均分子量は 24、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.071 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.085 μｍであった。
【０２６１】
＜実施例６＞
実施例４におけるフタロシアニン顔料の代わりに、ジスアゾイエロー(Ｃ.I.ピグメントイエロー 12)を用いた点と精製酵素液(２)の替わりに粗酵素液(３)を用いた点以外は、実施例４と全く同様にして着色剤６を得た。
【０２６２】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤６表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤６はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤６の外被の主成分が３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤６の数平均分子量は 25、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.073 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.088 μｍであった。
【０２６３】
＜実施例７＞
実施例４における精製酵素液(２)の替わりに粗酵素液(４)を用いた点以外は、実施例４と全く同様にして着色剤７を得た。
【０２６４】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤７表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤７はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤７の外被の主成分が３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤７の数平均分子量は 24、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.064 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.079 μｍであった。
【０２６５】
＜実施例８＞
実施例４におけるフタロシアニン顔料の代わりに、カーミン６Ｂ(Ｃ.I.ピグメントレッド 57 :１)を用いた点と精製酵素液(２)の替わりに粗酵素液(５)を用いた点以外は、実施例４と全く同様にして着色剤８を得た。
【０２６６】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤８表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤８はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤８の外被の主成分が３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤８の数平均分子量は 27、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.071 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.088 μｍであった。
【０２６７】
＜実施例９＞
実施例４におけるフタロシアニン顔料の代わりに、ジスアゾイエロー(Ｃ.I.ピグメントイエロー 12)を用いた点と精製酵素液(２)の替わりに粗酵素液(６)を用いた点以外は、実施例４と全く同様にして着色剤９を得た。
【０２６８】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤９表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤９はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤９の外被の主成分が３-ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤９の数平均分子量は 25、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.073 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.086 μｍであった。
【０２６９】
＜実施例１０＞
実施例４における(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡの替わりに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣoＡ（Reformatsky反応により得られた３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．、250、432−439（1997） に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例４と全く同様にして着色剤１０を得た。
【０２７０】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤１０表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤１０はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤１０の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤１０の数平均分子量は 27、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.064 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.081 μｍであった。
【０２７１】
＜実施例１１＞
実施例４における(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡの替わりに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣoＡ（J.Org.Chem.、55、1490−1492（1990）に記載の方法で合成した３-フェノキシプロパナール及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるReformatsky反応で得られた３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．、250、432−439（1997） に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例４と全く同様にして着色剤１１を得た。
【０２７２】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤１１表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤１１はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置による解析の結果より、得られた着色剤１１の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤１１の数平均分子量は 29、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.064 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.080 μｍであった。
【０２７３】
＜実施例１２＞
実施例１０と全く同様にして３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡで被覆された着色剤１０を得た。
【０２７４】
次いで、この着色剤１０をコアとして用いた点以外は、実施例１１と全く同様にして着色剤１２を得た。
【０２７５】
このカプセル構造体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（TOF-SIMS ＩＶ、CAMECA製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面のＰＨＡは３−ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ユニットで構成されていることが確認された。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体の表面を少しずつ削りながら同様にTOF-SIMSによりマススペクトルを測定していったところ、ある時点でカプセル構造体を構成するＰＨＡのモノマーユニットが３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットに置き換わることが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、フタロシアニンブルー(Ｃ.I.ピグメントブルー 15 :３)を被覆した、ポリ（３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸）の上を、ポリ（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸）が被覆した、所望のカプセル構造体であることがわかった。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤１２の数平均分子量は 23、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.064 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.096 μｍであった。
【０２７６】
＜実施例１３＞
実施例４における１質量部の(Ｒ)-３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡの替わりに 0.8質量部の(Ｒ、Ｓ)−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣoＡ、0.2質量部の(Ｒ、Ｓ)−３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタノイルＣoＡ（Int.J.Biol.Macromol.、12、85−91（1990）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Eur.J.Biochem.、250、432-439（1997）に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例４と全く同様にして着色剤１３を得た。
【０２７７】
実施例１と同様にして評価した結果、着色剤１３表面が蛍光を発していることが確認された。従って、着色剤１３はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。また、1H-NMR（使用機器：FT-NMR：Bruker DPX400、測定核種：1H、使用溶媒：重クロロホルム（TMS入り））解析の結果より、得られた着色剤１３の外被は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットが７５％、３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタン酸ユニットが２５％からなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた着色剤１３の数平均分子量は 22、000 であった。また、被覆前の粒子径 0.064 μｍに対し、被覆後の粒子径は 0.079 μｍであった。
【０２７８】
＜実施例１４＞
上記の着色剤１３について50質量部を遠心分離（10、000×g、4℃、10分間）により回収し、精製水50質量部に懸濁する操作を3回繰返したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン0.5質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、70℃で12時間反応させることで着色剤１４を得た。
【０２７９】
着色剤１４について赤外吸収を測定した（FT-IR；パーキンエルマー社製、1720X）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（3340 cm-1付近）及びエポキシ（822 cm-1付近）のピークが着色剤１４では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、架橋ポリマーにより被覆された着色剤１４が得られたことがわかる。
【０２８０】
＜実施例１５＞
上記の着色剤１３について50質量部を遠心分離（10、000×g、4℃、10分間）により回収し、精製水50質量部に懸濁する操作を3回繰返したのち、凍結乾燥により水を除去した。ここに、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルTSF4700、GE東芝シリコーン(株)製）を10質量部添加し、70℃で2時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（10、000×g、4℃、20分間）する操作を繰返すことで洗浄、乾燥し、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する着色剤１５を得た。
【０２８１】
着色剤１５について赤外吸収を測定した（FT-IR；パーキンエルマー社製、1720X）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（3340 cm-1付近）及びエポキシ（822 cm-1付近）のピークが着色剤１５では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する着色剤１５が得られたことがわかる。
【０２８２】
＜実施例 16 ＞
・スチレン-ブチルアクリレート共重合樹脂(ガラス転移温度70℃)：100質量部
・着色剤１(実施例１)：５質量部
・荷電制御剤(ヘキスト社製:ＮＸＶＰ 434)：２質量部
上記組成を混合し、二軸エクストルーダー(Ｌ/Ｄ＝ 30)で溶融混練した。この混練物を冷却後、ハンマーミルで粗粉砕し、ジェットミルで微粉砕した後に分級して、粉砕法によってシアン着色粒子(１)を得た。このシアン着色粒子(１)の粒度は、重量平均粒径 7.1 μｍ、微粉量は 6.0 個数％であった。
【０２８３】
このシアン着色粒子(１)100 質量部に対して、流動向上剤として、ヘキサメチルジシラザンで処理した疎水性シリカ微粉体(ＢＥＴ: 250 ｍ2/g)1.5 質量部をヘンシェルミキサーで乾式混合して、本実施例のシアントナー(１)を得た。更に、得られたシアントナー(１)７質量部と樹脂コート磁性フェライトキャリア(平均粒子径: 45 μｍ)93 質量部とを混合して、磁気ブラシ現像用の２成分系シアン現像剤(１)を調製した。
【０２８４】
＜実施例 17 〜 24＞
着色剤１の代わりに、着色剤４、着色剤７、着色剤１０〜１５をそれぞれ５質量部使用する以外は実施例 16 と同様の方法で、実施例 17 〜 24 のシアントナー(２)〜(９)を得た。これらのトナーの特性を実施例 16 と同様に測定し、その結果を表３に示した。また、これを用いて実施例 16 と同様にして、２成分系シアン現像剤(２)〜(９)をそれぞれ得た。
【０２８５】
＜比較例１＞
着色剤１の替わりにフタロシアニンブルー(Ｃ.I.ピグメントブルー 15 :３)を５質量部使用する以外は実施例 16 と同様の方法により、比較例１のシアントナー(１０)を得た。このトナーの特性を実施例 16 と同様に測定し、その結果を表３に示した。また、これを用いて実施例 16 と同様にして、比較例１の２成分系シアン現像剤(１０)を得た。
【０２８６】
＜実施例 25 〜 27 ＞
着色剤１の代わりに、着色剤２、着色剤５および着色剤８をそれぞれ５質量部使用する以外は実施例 16 と同様の方法で、実施例 25 〜 27 のマゼンタトナー(１)〜(３)を得た。これらのトナーの特性を実施例 16 と同様に測定し、その結果を表３に示した。また、これを用いて実施例 16 と同様にして、２成分系マゼンタ現像剤(１)〜(３)をそれぞれ得た。
【０２８７】
＜比較例２＞
着色剤１の替わりにカーミン６Ｂ(Ｃ.I.ピグメントレッド 57 :１)を５質量部使用する以外は実施例 16 と同様の方法により、比較例２のマゼンタトナー(４)を得た。このトナーの特性を実施例 16 と同様に測定し、その結果を表３に示した。また、これを用いて実施例 16 と同様にして、比較例２の２成分系マゼンタ現像剤(４)を得た。
【０２８８】
＜実施例 28 〜 30 ＞
着色剤１の代わりに、着色剤３、着色剤６および着色剤９をそれぞれ５質量部使用する以外は実施例 16 と同様の方法で、実施例 28 〜 30 のイエロートナー(１)〜(３)を得た。これらのトナーの特性を実施例 16 と同様に測定し、その結果を表３に示した。また、これを用いて実施例 16 と同様にして、２成分系イエロー現像剤(１)〜(３)をそれぞれ得た。
【０２８９】
＜比較例３＞
着色剤１の替わりにジスアゾイエロー(Ｃ.I.ピグメントイエロー 12)を５質量部使用する以外は実施例 16 と同様の方法により、比較例３のイエロートナー(４)を得た。このトナーの特性を実施例 16 と同様に測定し、その結果を表３に示した。また、これを用いて実施例 16 と同様にして、比較例３の２成分系イエロー現像剤(４)を得た。
【０２９０】
＜評価＞
上記実施例 16 〜 30 で得られた２成分系シアン現像剤(１)〜(９)、マゼンタおよびイエロー現像剤(１)〜(３)、および比較例１〜３で得られた２成分系シアン現像剤(１０)、マゼンタおよびイエロー像剤(４)について、常温常湿(25 ℃、60 ％ＲＨ)、及び高温高湿(30℃、80 ％ＲＨ)のそれぞれの環境下で、先に述べた帯電量の測定方法を用いて、10 秒、及び 300 秒攪拌後のトナーの帯電量を測定した。その結果を表３にまとめて示した。
【０２９１】
【表３】
Figure 0004532784
【０２９２】
＜実施例 31 〜実施例 45 および比較例４〜比較例６＞
先ず、実施例 31 〜実施例 45 および比較例４〜比較例６の画像形成方法に用いた画像形成装置について説明する。図１は、本発明の実施例及び比較例の画像形成方法を実行するための画像形成装置の断面の概略的説明図である。図１に示した感光体ドラム１は、基材１b上に有機光半導体を有する感光層１aを有し、矢印方向に回転するように構成されているが、感光体ドラム１に対向し、且つ該ドラムと接触回転している帯電部材である帯電ローラー２によって、その表面が約-600 Ｖの表面電位に帯電されている。図１に示したように、帯電ローラー２は、芯金２bの上に導電性弾性層２aが被覆されて構成されている。
【０２９３】
次に、表面が帯電された感光体ドラム１に向けて露光３されるが、その際、ポリゴンミラーにより感光体上にデジタル画像情報に応じてオン-オフさせることで、露光部電位が-100 Ｖ、暗部電位が-600 Ｖの静電荷像が形成される。続いて、この感光体ドラム１上の静電荷像は、複数の現像装置４-１、４-２、４-３、４-４を用いて反転現像されてに顕在化され、感光体ドラム１上トナー像が形成される。その際、現像剤として、実施例 16 〜 30 および比較例１〜３で得た２成分系現像剤をそれぞれ用い、イエロートナー、マゼンタトナー、シアントナーでトナー画像を形成した。図２は、その際に用いた二成分現像剤用の各現像装置４の要部の拡大断面図である。次に、感光体ドラム１上のトナー像は、感光体ドラム１と接触回転している中間の転写体５上に転写される。この結果、中間の転写体５上には、四色の色重ね顕色像が形成される。感光体ドラム１上に転写されずに残った転写残トナーは、クリーナー部材８によって、残トナー容器９内に回収される。
【０２９４】
中間の転写体５は、図１に示したように、支持体としての芯金５bと、その上に積層された弾性層５aとで構成されている。本実施例においては、パイプ状の芯金５b上に、カーボンブラックを導電付与材料とし、ニトリル-ブタジエンラバー(ＮＢＲ)中にこれを充分に分散させた弾性層５bがコーティングされた中間の転写体５を使用した。「JIＳ Ｋ-6301 」に準拠して測定した弾性層５bの硬度は 30 度であり、体積抵抗値は、109 Ω・cｍであった。感光体ドラム１から中間の転写体５への転写に必要な転写電流は約５μＡであるが、これは、電源より＋ 500 Ｖを芯金５bに付与することで得られた。
【０２９５】
中間の転写体５上に形成された四色のトナーの色重ね顕色像は、転写ローラー７によって、紙等の被転写材に転写され、その後、加熱定着装置Ｈによって定着されて固定される。転写ローラー７は、その外径の直径が 10 ｍｍの芯金７b上に、カーボンを導電性付与材料として、エチレン-プロピレン-ジエン系三次元共重合体(ＥＰＤＭ)の発砲体中に該カーボンが充分な状態で分散したものがコーティングされた弾性層７aが形成されている。その体積固有抵抗値は、106 Ω・cｍであり、「JIＳ Ｋ-6301 」に準拠して測定した硬度が 35 度の値を示すのもを用いた。又、この転写ローラー７には電圧を印加して、15 μＡの転写電流を流した。
【０２９６】
図１に示した装置では、加熱定着装置Ｈに、図５及び図６に示したようなオイル塗布機構のない熱ロール方式の定着装置を用いた。このとき、上部ローラー、下部ローラー共にフッ素系樹脂の表面層を有するものを使用した。又、ローラーの直径は 60 nｍであった。定着の際の定着温度を 160 ℃とし、ニップ幅を７ｍｍに設定した。尚、クリーニングによって回収された感光体ドラム１上の転写残トナーは、リユース機構により現像器に搬送し再使用した。
【０２９７】
＜評価＞以上の条件で、常温常湿(25 ℃、60 ％ＲＨ)及び、高温高湿(30 ℃、80 ％ＲＨ)環境下、８枚(Ａ４サイズ)/分のプリントアウト速度で、実施例 16〜 30 のトナーを使用して作製した２成分系現像剤と、比較例１〜３のトナーを使用して作製した２成分系現像剤をそれぞれ使用し、逐次補給しながら、単色での間歇モード(即ち、一枚プリントアウトする毎に 10 秒間現像器を休止させ、再起動時の予備動作でトナーの劣化を促進させるモード)でプリントアウト試験を行い、得られたプリントアウト画像を下記の項目について評価した。評価結果を表４にまとめて示した。
【０２９８】
[プリントアウト画像評価]
1.画像濃度
通常の複写機用普通紙(75 g/ｍ2)に、所定枚数のプリントアウトをして、初期の画像に対するプリント終了時における画像の画像濃度維持の程度により評価した。尚、画像濃度はマクベス反射濃度計(マクベス社製)を用い、原稿濃度が 0.00 の白地部分のプリントアウト画像に対する相対濃度を測定し、評価に用いた。
◎:優(終了時の画像濃度が 1.40 以上)
○:良(終了時の画像濃度が 1.35 以上 1.40 未満)
△:可(終了時の画像濃度が 1.00 以上 1.35 未満)
×:不可(終了時の画像濃度が 1.00 未満)
2.画像カブリ
通常の複写機用普通紙(75 g/ｍ2)に所定枚数のプリントアウトをし、プリント終了時のベタ白画像により評価した。具体的には、下記のような方法で評価した。反射式濃度計(ＴＯＫＹＯ ＤＥＮＳＨＯＫＵ ＣＯ.、ＬＴＤ社製ＲＥＦＬＥＣＴＯＭＥＴＥＲ ＯＤＥＬ ＴＣ-６ＤＳ)を用いて測定したプリント後の白地部反射濃度の最悪値をＤs、プリント前の用紙の反射濃度平均値をＤrとし、これらの値から(Ｄs-Ｄr)を求め、これをカブリ量とし、下記の基準で評価した。
◎:非常に良好(カブリ量が０％以上 1.5 ％未満)
○:良好(カブリ量が 1.5 ％以上 3.0 ％未満)
△:実用可(カブリ量が 3.0 ％以上 5.0 ％未満)
×:実用不可(カブリ量が 5.0 ％以上)
3.転写性
通常の複写機用普通紙(75 g/ｍ2)に、黒ベタ画像を所定枚数プリントアウトをし、プリント終了時の画像の画像抜け量を目視により観察し、下記の基準で評価した。
◎ : 非常に良好(殆ど発生せず)
○ : 良好(軽微)
△ : 実用可
× : 実用不可
また、実施例 31 〜実施例 45 および比較例４〜比較例６で、5000 枚画像出力を行ったときの感光ドラム及び中間転写体表面の傷や残留トナーの固着の発生状況とプリントアウト画像への影響(画像形成装置とのマッチング)を目視で評価したところ、実施例 31 〜実施例 45および比較例４〜比較例６の２成分系現像剤を使用した系ともに、感光ドラム及び中間転写体表面の傷や、残留トナーの固着が全く確認できず、画像形成装置とのマッチングは非常に良好であった。
【０２９９】
【表４】
Figure 0004532784
【０３００】
(実施例 46 〜実施例 48、比較例７〜比較例９)
実施例 46 〜実施例 48、比較例７〜比較例９の画像形成方法の実施にあたっては、現像剤として、実施例 16、25、28 および比較例１〜３で得たトナーをそれぞれ用いた。また、画像を形成する手段としては、図３に示したように、市販のレーザービームプリンターＬＢＰ-ＥＸ(キヤノン社製)にリユース機構を取り付けて改造し、再設定した画像形成装置を用いた。即ち、図３に示した画像形成装置では、転写後に感光体ドラム 20 上に残った未転写トナーを、該感光体ドラム 20 に当接しているクリーナー 21 の弾性ブレード 22 により掻き落とした後、クリーナーローラーによってクリーナー 21 内部へと送り、更にクリーナーリユース 23 を経て、搬送スクリューを設けた供給用パイプ 24 によってホッパー 25 を介して現像器 26 に戻し、再度、回収トナーを利用するシステムを取り付けられている。
【０３０１】
図３に示した画像形成装置では、一次帯電ローラー 27 により、感光体ドラム 20 の表面の帯電がなされる。一次帯電ローラー 27 には、ナイロン樹脂で被覆された、導電性カーボンが分散されたゴムローラー(直径 12 ｍｍ、当接圧 50 g/cｍ)を使用し、静電潜像担持体(感光体ドラム 20)上に、レーザー露光(600 dpi、不図示)により、暗部電位ＶＤ＝-700 Ｖ、明部電位ＶＬ＝-200 Ｖの静電潜像を形成した。トナー担持体として、その表面に、カーボンブラックが分散された樹脂がコートされている表面粗度Ｒaが 1.1 を呈する現像スリーブ 28 を用いた。
【０３０２】
図４に、実施例 46 〜実施例 48、比較例７〜比較例９で用いた一成分現像剤用の現像装置の要部の拡大断面図を示した。静電潜像を現像する条件としては、該現像スリーブ 28 の速度を、対向する感光ドラム 20 面の移動速度に対して 1.1 倍の速さになるように設定し、更に、感光ドラム 20 と現像スリーブ 28 との間隔α(Ｓ-Ｄ間)を 270 μｍとした。トナーの層厚規制部材としては、ウレタンゴム製ブレード 29 を当接させて用いた。又、トナー画像を定着させる加熱定着装置の設定温度は 160 ℃とした。なお、定着装置は、図５及び図６に示した定着装置を用いた。
【０３０３】
以上のようにして、常温常湿(25 ℃、60 ％ＲＨ)環境下、８枚(Ａ４サイズ)/分のプリントアウト速度で、トナーを逐次補給しながら連続モード(即ち、現像器を休止させることなくトナーの消費を促進させるモード)で、３万枚までプリントアウトを行い、得られたプリントアウト画像について画像濃度を測定し、その耐久について下記に示した基準で評価した。又、10、000 枚目の画像を観察し、画像カブリについて下記の基準で評価した。又、同時に、耐久試験後における画像形成装置を構成している各装置の様子を観察し、各装置と上記の各トナーとのマッチングについても評価した。以上の結果を表５にまとめて示した。
【０３０４】
[耐久時の画像濃度推移]通常の複写機用普通紙(75 g/ｍ2)に、所定枚数のプリントアウトをして、初期の画像に対するプリント終了時における画像の画像濃度維持の程度により評価した。尚、画像濃度はマクベス反射濃度計(マクベス社製)を用い、原稿濃度が 0.00 の白地部分のプリントアウト画像に対する相対濃度を測定し、評価に用いた。
◎:優(終了時の画像濃度が 1.40 以上)
○:良(終了時の画像濃度が 1.35 以上 1.40 未満)
△:可(終了時の画像濃度が 1.00 以上 1.35 未満)
×:不可(終了時の画像濃度が 1.00 未満)
[画像カブリ] 通常の複写機用普通紙(75 g/ｍ2)に所定枚数のプリントアウトをし、プリント終了時のベタ白画像により評価した。具体的には、下記のような方法で評価した。反射式濃度計(ＴＯＫＹＯ ＤＥＮＳＨＯＫＵ ＣＯ.、ＬＴＤ社製ＲＥＦＬＥＣＴＯＭＥＴＥＲ ＯＤＥＬ ＴＣ-６ＤＳ)を用いて測定したプリント後の白地部反射濃度の最悪値をＤs、プリント前の用紙の反射濃度平均値をＤrとし、これらの値から(Ｄs-Ｄr)を求め、これをカブリ量とし、下記の基準で評価した。
◎:非常に良好(カブリ量が０％以上 1.5 ％未満)
○:良好(カブリ量が 1.5 ％以上 3.0 ％未満)
△:実用可(カブリ量が 3.0 ％以上 5.0 ％未満)
×:実用不可(カブリ量が 5.0 ％以上)
[画像形成装置マッチング評価]
1.現像スリーブとのマッチング
プリントアウト試験終了後、現像スリーブ表面への残留トナーの固着の様子とプリントアウト画像への影響を目視で評価した。
◎ : 非常に良好(未発生)
○ : 良好(殆ど発生せず)
△ : 実用可(固着があるが、画像への影響が少ない)
× : 実用不可(固着が多く、画像ムラを生じる)
2.感光ドラムとのマッチング
感光体ドラム表面の傷や残留トナーの固着の発生状況とプリントアウト画像への影響を目視で評価した。
◎ : 非常に良好(未発生)
○ : 良好(僅かに傷の発生が見られるが、画像への影響はない)
△ : 実用可(固着や傷があるが、画像への影響が少ない)
× : 実用不可(固着が多く、縦スジ状の画像欠陥を生じる)
3.定着装置とのマッチング
定着フィルム表面の様子を観察し、表面性及び残留トナーの固着状況の結果を総合平均化して、その耐久性を評価した。
【０３０５】
(１)表面性
プリントアウト試験終了後の定着フィルム表面の傷や削れの発生の様子を目視で観察し、評価した。
◎ : 非常に良好(未発生)
○ : 良好(殆ど発生せず)
△ : 実用可
× : 実用不可
(２)残留トナーの固着状況
プリントアウト試験終了後の定着フィルム表面の残留トナーの固着状況を目視で観察し、評価した。
◎ : 非常に良好(未発生)
○ : 良好(殆ど発生せず)
△ : 実用可
× : 実用不可
【０３０６】
【表５】
Figure 0004532784
【０３０７】
(実施例49)
図３の画像形成装置のトナーリユース機構を取り外し、プリントアウト速度を 16 枚(Ａ４サイズ)/分とした以外は実施例 46 と同様にし、実施例 16 の青色トナー(１)を逐次補給しながら連続モード(即ち、現像器を休止させることなく、トナーの消費を促進させるモード)でプリントアウト試験を行った。得られたプリントアウト画像評価ならびに用いた画像評価装置とのマッチングを実施例 46 〜実施例 48、比較例７〜比較例９と同様の項目について評価した。その結果、いずれの項目についても良好な結果が得られた。
【０３０８】
【発明の効果】
本発明により提供される、第１の樹脂成分であるポリヒドロキシアルカノエートで少なくともその一部が被覆された着色剤と、第２の樹脂成分からなるバインダー樹脂とから構成されてなる静電荷像現像トナーにより、数色のトナーを必要とする静電荷像現像剤において、黒色をも含めた各色のトナー間で、帯電性、流動性、経時安定性、環境安定性等のトナー特性を均一に設計することができる静電荷像現像トナーを提供することが可能となった。また、フルカラー静電荷像現像小径トナーの着色材の高濃度化に伴う、帯電特性、粉体特性、帯電量維持性、定着特性の悪化のない静電荷像現像トナーを提供することが可能となった。
【０３０９】
さらには、小粒径でかつ着色剤が均一に微分散され彩度、透明性に優れ帯電の均一性の高く耐久性にすぐれた小粒径の静電荷像現像トナーを提供することが可能となった。また、環境や生物に対する負荷が低く、着色材の材質の制約が少なく、着色材が高密度に内包された、また、従来カプセル構造体(着色剤)の汚染源となっていた界面活性剤、重合反応剤等の混入のないカプセル構造体(着色剤)を含んでなる上記静電荷像現像トナーを提供することが可能となった。
【０３１０】
併せて、上記静電荷像現像トナーの製造方法、上記静電荷像現像トナーを用いた画像形成方法ならびに画像形成装置を提供することが可能となった。
【０３１１】
【配列表】
Figure 0004532784
Figure 0004532784
Figure 0004532784
Figure 0004532784
Figure 0004532784
Figure 0004532784
Figure 0004532784

【図面の簡単な説明】
【図１】画像形成装置の概略的説明図である。
【図２】二成分現像剤用の現像装置の要部の断面図である。
【図３】トナーのリユース機構を有する画像形成装置の概略的説明図である。
【図４】一成分現像剤用の現像装置の要部の断面図である。
【図５】定着装置の要部の分解斜視図である。
【図６】定着装置の非駆動時のフィルム状態を示した要部の拡大断面図である。
【図７】トナーの帯電量を測定するブローオフ帯電量測定装置を示す模式図である。
【図８】本発明のトナー粒子の断面図(模式図)
【図９】従来のトナー粒子の断面図(模式図)
【符号の説明】
１、20 :感光体(静電潜像担持体)
２、27 :帯電ローラー
３:露光
４、26 :現像装置(４-１、４-２、４-３、４-４)
５:中間の転写体
６:被転写材
７:転写ローラー
13 :感光体ドラム
11、28 :現像剤担持体
30 :ステー
31 :加熱体
31 a:ヒーター基板
31 b:発熱体
31 c:表面保護層
31 d:検温素子
32 :定着フィルム
33 :加熱ローラー
34 :コイルばね
35 :フィルム端部規制フランジ
36 :給電コネクター
37 :絶縁部材
38 :入口ガイド
39 :出口ガイド(分離ガイド)
43 :スクリーン
45 :真空計
47 :吸引口
49 :電位計

Claims (2)

  1. 静電荷像現像トナーにおいて、第１の樹脂成分である下記の式[１]から式[10]に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも１つを有するポリヒドロキシアルカノエートで少なくともその一部が被覆された着色剤を、第２の樹脂成分からなるバインダー樹脂中に分散させて構成されたことを特徴とする静電荷像現像トナー。
    Figure 0004532784
     (ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびaの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
    Ｒ１が水素原子(Ｈ)であり、aが０から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
    Ｒ１がハロゲン原子であり、aが１から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
    Ｒ１が発色団であり、aが１から 10 の整数のいずれかであるモノマーユニット、
    R１がカルボキシル基あるいはその塩であり、aが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、
    Ｒ１が、
    Figure 0004532784
     であり、aが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中bは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ 2 、-ＣＦ 3 、-Ｃ 2 Ｆ5及び-Ｃ 3 Ｆ 7 からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中cは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ 2 、-ＣＦ 3 、-Ｃ 2 Ｆ 5 及び-Ｃ 3 Ｆ 7 からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中dは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ 2 、-ＣＦ 3 、-Ｃ 2 Ｆ 5 及び-Ｃ 3 Ｆ 7 からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中eは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ 2 、-ＣＦ 3 、-Ｃ 2 Ｆ 5 、-Ｃ 3 Ｆ 7 、-ＣＨ 3 、-Ｃ 2 Ｈ 5 及び-Ｃ 3 Ｈ 7 からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中fは０から７の整数のいずれかを表す。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中gは１から８の整数のいずれかを表す。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中hは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ 2 、-ＣＯＯＲ'、-ＳＯ 2 Ｒ''、-ＣＨ 3 、-Ｃ 2 Ｈ 5 、-Ｃ 3 Ｈ 7 、-ＣＨ(ＣＨ 3 ) 2 及び-Ｃ(ＣＨ 3 ) 3 からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ'は水素原子(Ｈ)、Ｎａ、Ｋ、-ＣＨ 3 及び-Ｃ 2 Ｈ 5 のいずれかであり、Ｒ''は-ＯＨ、-ＯＮａ、-ＯＫ、ハロゲン原子、-ＯＣＨ 3 及び-ＯＣ 2 Ｈ 5 のいずれかである。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中iは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、-ＣＮ、-ＮＯ 2 、-ＣＯＯＲ'及び-ＳＯ 2 Ｒ''からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ'は水素原子(Ｈ)、Ｎａ、Ｋ、-ＣＨ 3 及び-Ｃ 2 Ｈ 5 のいずれかであり、Ｒ''は-ＯＨ、-ＯＮａ、-ＯＫ、ハロゲン原子、-ＯＣＨ 3 及び-ＯＣ 2 Ｈ 5 のいずれかである。)
    Figure 0004532784
     (ただし、式中jは１から９の整数のいずれかを表す。)
  2. 前記着色剤が顔料を含むことを特徴とする請求項１に記載の静電荷像現像トナー。
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