JP4449519B2 - 細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は細胞外電位測定あるいは細胞活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられている細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法であり、たとえば化学物質によって細胞が発する反応を検出して細胞への薬理効果を判定する薬品スクリーニングに用いられる。

従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品候補物質をスクリーニングすることはパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法により行われている。

このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（例えば、非特許文献１参照）。

また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する方法もある。しかしながら、パッチクランプ法はマイクロピペットの作成および操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。

また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングすることができる。しかしながら細胞を染色する工程が必要になるとともに、用いる色素の影響により測定時に検出されるバックグラウンド・レベルが高くなることから、時間とともにこの色素が脱色するためにＳ／Ｎ比が悪くなるという欠点がある。

これに代わる方法として、細胞の保持手段を有した基板およびこれに設けられた電極によって細胞外電位を測定するデバイスも発明者等のグループにより提案されている（例えば、特許文献１参照）。この方法はパッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、しかも蛍光色素を用いる方法のように簡易に高速で大量の試料を測定できることも可能であり、その構成は基板上に設けられた細胞の保持手段を有する少なくとも一つのウエルと、このウエルに電気信号を検出するセンサー手段とを有する細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定するものである。この細胞外電位測定デバイスの動作について図面を用いて詳細に説明する。

図１７は前記特許文献１で開示されている細胞外電位測定デバイスのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル１４内に培養液２０が入れられ、被験体細胞１９は基板１６に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板１６に形成された窪み１５および開口部を介してこの窪み１５に連絡する貫通孔１７を備えた構成となっている。

さらに、貫通孔１７の中にはセンサー手段である測定電極１８が配置されており、この測定電極１８は配線を経て信号検出部に連結されている。

そして、測定の際には被験体細胞１９を貫通孔１７側から吸引ポンプなどの手段により、この被験体細胞１９が窪み１５に密着保持される。

このようにして被験体細胞１９の活動により発生する電気信号はウエル１４中の培養液２０側に漏れることなく、貫通孔１７側に設けた測定電極１８によって検出される。
「細胞の分子生物学、第三版」、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２項、１９９５年、教育者 国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット

しかしながら、前記従来の構成では、信号を検出する際の測定電極１８が貫通孔１７の壁面にまで形成されていないことから、測定が不安定になったり、ウエル１４のサイズを小型化していくと、被験体細胞１９と測定電極１８間に介在する培養液２０の充填が不十分となるなどの問題があり、高精度な測定を行うことが困難であるという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、ウエルサイズの小型化に対応できるとともに高精度に測定できるウエル構造を実現した細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。

前記従来の課題を解決するために、本発明は基板の一側面にダイアフラムを有し、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを有し、この窪みの曲面上の開口部を他方側の開口部よりも小さくした貫通孔を有し、この貫通孔の壁面に検出電極を有した構造とするものである。

以上のように、本発明の細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法は、小型で高精度な測定を可能とするウエル構造を有するデバイスとすることができ、これによって、細胞が活動する際に発する物理化学的変化を、効率よく高精度に安定して検出することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスを示す斜視図であり、図２は図１のＡ−Ａ部における断面図であり、図３は図２の貫通孔の周辺部を基板の下面側から見た拡大平面図であり、図４は本発明の細胞外電位測定デバイスの動作を説明するための要部拡大断面図である。

また、図５〜図１１は本発明の細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図であり、図１２は本発明の別の例の細胞外電位測定デバイスの構成を示す断面図であり、図１３は同貫通孔の周辺部の拡大平面図である。

次に、本発明の細胞外電位測定デバイスの構成について説明する。

図１〜図３において、基板１はシリコンで形成されており、基板１の一面側にダイアフラム２が形成されている。このダイアフラム２の材質は基板１と同じシリコンである。３はダイアフラム２の一面側に形成された窪みであり、半球形の曲面で構成されている。この窪み３の曲面上の所定の位置からダイアフラム２の一面側とは反対の他方側へつながる貫通孔４を有し、この貫通孔４の窪み３の所定の位置の曲面上に設けた開口部は他方側に設けた開口部より小さくなっていて、さらにこの貫通孔４の壁面は直線的な形状を有している。つまり、窪み３の所定の位置の曲面上に設けた開口部と他方側に設けた開口部を結ぶ壁面の稜線は直線となっている。このように基板１にシリコンを用いることにより、ダイヤフラム２、窪み３、貫通孔４をドライエッチングにより高精度に形成した細胞外電位測定デバイスを実現することができる。

さらに、この貫通孔４の壁面全体およびダイアフラム２の他方側の面には測定の安定性から貴金属を主体とする検出電極５を設けている。この検出電極５を貫通孔４の壁面全体にも設けることにより細胞外電位の測定精度を高めることができる。さらにこの検出電極５に貴金属を用いることにより酸化膜などの形成が少なく安定した電極特性を示すことができ、これに用いる貴金属としては金あるいは白金などを用いると良い。

次に、図４を用いて本発明の細胞外電位測定デバイスの動作について説明する。

図４はダイアフラム２に窪み３、貫通孔４、検出電極５が形成された箇所の拡大断面図である。

まず、培養液の物理化学的変化を検出する手順について説明する。

図４に示すように、ダイヤフラム２の上部を培養液６で満たすと窪み３、貫通孔４は表面張力により培養液６によって順に満たされる。

そして、ダイヤフラム２の上部空間を加圧もしくはダイアフラム２の下部空間を減圧すると培養液６は貫通孔４から窪み３の他方側の開口部へ吐出してくるが、加圧あるいは減圧の条件を適度な値にすると、貫通孔４の窪み３の他方側の開口部の先端に培養液６はメニスカス形状を形成して定常状態となる。

次に、被験体細胞７の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する手順について説明する。

図４に示すように、被験体細胞７を培養液６と共に投入し、ダイヤフラム２の上部空間を加圧もしくはダイアフラム２の下部空間を減圧すると、被験体細胞７および培養液６は共に窪み３内へ引き込まれる。

ここで窪み３は所定の曲面で構成されているので、被験体細胞７を保持するためにより効率的な形状となっている。

さらに、被験体細胞７が窪み３の内に保持された後に培養液６が貫通孔４の出口側で適当なメニスカスを形成するように上下の圧力を調整する。

また、被験体細胞７を窪み３の内で貫通孔４の窪み側の開口部を塞ぐように保持した後は被験体細胞７への刺激となりうる行為を施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激などがある。

そして、前記被験体細胞７がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、例えば被験体細胞７は細胞膜が保有するイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この反応は直接的には被験体細胞７が培養液６と接している箇所において起こるが、間接的に貫通孔４の内の培養液６と被験体細胞７の間でもイオン交換が行われる。

この結果として、貫通孔４の内の培養液６、被験体細胞７の細胞内液のイオン濃度は変化するので、培養液６を介して検出電極５によってその変化を検出することができるようになる。ここで、検出電極５は貫通孔４の壁面全体にも形成することにより被験体細胞７が保持されている近辺にまで形成していることから、培養液６を介した細胞外電位の測定を行っても、ノイズを拾うことなく被験体細胞７の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を高精度に測定を行うことができる。

次に、図２に示す構成を有する細胞外電位測定デバイスの製造方法について図５〜図１１を用いて説明する。

図５〜図１１は図２に示すところの細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための工程断面図である。

図５に示すように、この細胞外電位測定デバイスの製造方法はシリコンからなる基板１を用意し、基板１の他面にレジストマスク８を形成した後、図６に示すように基板１の下面側からエッチングすることによって、基板１の上部にダイアフラム２を形成する。ここで、ダイヤフラム２を所定の厚みに形成するためには、エッチングを行う量を高精度に管理すべきである。特に本発明のように基板１がシリコンの場合には不用意にエッチングを過剰に行うと、ダイヤフラム２を貫通してしまう恐れがある。このような問題を解決するため、基板１の材料としては図１１に示すようなシリコン１３と二酸化シリコン１２とシリコン１３の積層構造を有した基板１を用いることもできる。このような基板１はＳＯＩ基板と呼ばれ、上部のダイヤフラム２の厚みを高精度に形成することができるとともに、貫通孔４をエッチングによって形成する際にも二酸化シリコン１２の層がエッチングストップ層となるので、さらに高精度で生産性に優れた細胞外電位測定デバイスとその製造方法を実現することができる。

次に、ダイヤフラム２を形成した後レジストマスク８は除去する。

その後、図７に示すようにダイアフラム２の一面側にレジストマスク９を形成する。このときのレジストマスク９のエッチングホール９ａの形状は必要とする貫通孔４ａの形状とほぼ同じになるよう設計しておく。

次に、図８に示すようにドライエッチングによってダイアフラム２側からエッチングを行う。このとき、エッチングガスとしてはエッチングを促進するガスのみを用いる。基板１がシリコンの場合、エッチングを促進するガスとして、ＳＦ₆、ＣＦ₄、ＸｅＦ₂などを用いることができる。これらは基板１であるシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用があるからである。実験ではＸｅＦ₂を用いて効果を確認している。

これによって、エッチングの形状は図８に示すようにエッチングホール９ａの開口部を中心とする半球形となり、窪み３が形成される。またレジストマスク９はほとんどエッチングされないので最初の形状をそのまま保つことができる。

次に、図９に示すように基板１を基板１の厚さ方向に対して０度より大きい角度θになるように傾けて設置し、貫通孔４ａを形成する。この貫通孔４ａを形成する際にはエッチングを促進するガスによるエッチング工程と、エッチングされた内壁に保護膜を形成する工程とを交互に繰り返すことでドライエッチングを行う。このときのエッチングガスとしては、それぞれの工程でエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを交互に用いる。エッチングを促進するガスとしてはＸｅＦ₂、ＣＦ₄、ＳＦ₆などがある。またエッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈などがある。これらのガスを用いてエッチングを促進するガスによるエッチング工程で少しのエッチングを行った後、エッチングを抑制するガスによる保護膜の形成工程で、エッチングされた壁面にＣＦ₂のポリマーである保護膜を形成するという工程を交互に繰り返すことによるドライエッチング法により、貫通孔４ａの形成をレジストマスク９に設けたエッチングホール９ａの下方方向のみに直線的に進行させることができる。

ここで、ドライエッチングがエッチングホール９ａの下方方向のみに進行する仕組みをさらに詳しく説明する。

エッチングを促進するガスによるエッチング工程では、外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ発生領域の中で、別の高周波電源を容量結合された基板１に高周波を加えることにより基板１にマイナスのバイアス電圧が発生することになり、プラズマ中のプラスイオンであるＳＦ⁵⁺やＣＦ³⁺が基板１に向かって衝突するのでエッチングは垂直に下方方向に進むことになる。さらにエッチングを抑制するガスによる保護膜の形成工程では、同様に誘導結合法によって生成されたプラズマ発生領域の中で、基板１に高周波を加えなければ基板１にはバイアス電圧が全く発生しないことからプラズマ中に存在する保護膜の材料となるＣＦ⁺が偏向を受けなくなり、基板１のエッチングされた壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。実験ではエッチングを促進するガスとしてＳＦ₆、抑制するガスとしてＣ₄Ｆ₈を用いて確認している。

これらの工程を交互に繰り返すことによって、エッチングは垂直に下方方向のみに進行するので、結果として図９のように貫通孔４ａを形成することができる。

ここで、例えば窪み３の深さが１０μｍ、貫通孔４ａの深さが１０μｍ、レジストマスク９のエッチングホール９ａが直径５μｍのとき、基板１を基板１の厚さ方向に対して０度より大きく７度以下の範囲で傾けて設置を行う条件が、最も本発明の製造方法を実施する上で効率がよい。

その後、図１０に示すように基板１を基板１の平面内で１８０度回転移動させてエッチングを行い、貫通孔４ｂを形成する。ここで基板１の厚さ方向に対して傾ける角度θを所定の角度に設定することにより貫通孔４ａ，４ｂは図１０に示すようにつながった状態となる。その結果、貫通孔４ａ，４ｂは図２に示すような貫通孔４の構造となり、窪み３の曲面上の所定の位置に設けた開口部は窪み３の他方側に設けた開口部より小さい形状とすることができる。また貫通孔４の壁面は直線的な構造となる。

その後、貫通孔４の壁面全体およびダイアフラム２の他方側の面に金／チタンの２層からなる検出電極５を通常の薄膜形成手段によって形成し、図２のような構造を形成する。このとき、貫通孔４は窪み３の曲面上の所定の位置に設けた開口部よりも窪み３の他方側に設けた開口部の方が大きくなっていることと、貫通孔４の壁面は直線的であることから基板１の下面側より薄膜形成手段を用いて検出電極５を形成することにより、検出電極５は切断されることなく容易に窪み３の曲面上の所定の位置に設けた開口部まで連続して形成できる構造とすることができる。

また、貫通孔４を形成する工程において、図９に示すようにエッチングを行った後基板１をダイアフラム２の平面内で基板１を中心に回転させる角度は１８０度にする他、図１２、図１３に示すように９０度に設定し、その後エッチングを行うことによっても貫通孔１０を形成することができる。このような方法により貫通孔１０の窪み３の他方側に設けた開口部の形状を自由に設計することができるとともに開口部の面積を大きくすることができる。

以上のように、回転移動させる角度を等間隔とすることにより貫通孔４の断面形状の対称性を高めることにより生産性の効率を高めることができる。

（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２における細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。

図１４は本実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの断面図であり、図１５は貫通孔１１の周辺部の拡大図であり、図１６は製造工程を説明するための断面図である。

本発明の実施の形態２が実施の形態１と異なる点は、図１４および図１５に示すように貫通孔１１の形状が円錐台形状となっていることと、この円錐台形状の貫通孔１１を形成する方法のみであり、実施の形態１と異なっている点についてのみ詳細に説明する。

まず、窪み３を形成するまでの工程は実施の形態１の図５〜図８に示した製造工程と同じ方法で形成することができるので詳細は省略する。

その後、図１６に示すように円錐台形状をしている貫通孔１１を形成するために、基板１を基板１の厚さ方向に対して０度より大きくθ度傾け、ダイヤフラム２の平面内で連続的に回転させながらドライエッチングを行う。このようなドライエッチングによって窪み３の曲面上および他方側に設けた貫通孔１１の開口部は円形状となり、窪み３の曲面上の所定の位置に設けた開口部の開口径が窪み３の他方側に設けた開口部の開口径よりも小さな円形形状を有する貫通孔１１を形成することができる。また、この貫通孔１１の壁面は直線的となる。

その後、図１４、図１５に示すように貫通孔１１の壁面全体およびダイアフラム２の他方側の面に検出電極５を実施の形態１と同じ方法によって形成することができる。これによって、基板１をダイアフラム２の厚み方向に対して角度をつけて傾けた後、連続的に回転させながらドライエッチングを行うことによって、貫通孔１１の両開口部の形状は円形状となり、また貫通孔１１の壁面は直線的な逆テーパ−状となっているため、後の工程で検出電極５を形成する際には断線することなく容易に形成することができる。

また、回転の速度を等速とすることで貫通孔１１の断面形状の対称性を高めることができることから生産性を高めることができる。

また、回転を間欠運動させることによって貫通孔１１の断面形状に特殊な形状を持たせて、様々な種類の培養液６に対応できるデバイスを実現することができる。

以上のような方法により貫通孔１１を形成することによって、検出電極５は切断されることなく、さらに容易に形成できる構造となり、実施の形態１に比べて、検出電極５が途中で切断される恐れがより少ない細胞外電位測定デバイスを提供することができるのである。

なお、基板１の材料としては実施の形態１と同様に、図１１に示すシリコンと二酸化シリコンとシリコンの積層基板を用いることができる。これによる効果は実施の形態１と同様である。

本発明の細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法は、細胞が活動する際に発する物理化学的変化を検出電極によって効率よく安定に測定できる装置に有用である。

本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの斜視図 同図１におけるＡ−Ａ部の断面図 同貫通孔の周辺部の拡大平面図 同動作を説明するための要部拡大断面図 同製造方法を説明するための断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同別の基板の断面図 同別の例の細胞外電位測定デバイスの断面図 同貫通孔の周辺部の拡大平面図 本発明の実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの断面図 同貫通孔の周辺部の拡大平面図 同製造方法を説明するための断面図 従来の細胞外電位測定デバイスの断面図

符号の説明

１ 基板
２ ダイアフラム
３ 窪み
４，４ａ，４ｂ 貫通孔
５ 検出電極
６ 培養液
７ 被験体細胞
８ レジストマスク
９ レジストマスク
９ａ エッチングホール
１０，１１ 貫通孔
１２ 二酸化シリコン
１３ シリコン

Claims (15)

1. 基板の一面側にダイアフラムを有し、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを有し、この窪みの曲面上の開口部を他方側の開口部よりも小さくした貫通孔を有し、少なくともこの貫通孔の壁面に検出電極を有した細胞外電位測定デバイス。
2. 前記検出電極が前記他方側の開口部を有する前記ダイアフラム上に延長されている請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
3. 貫通孔の壁面を直線状とした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
4. 基板をシリコンとした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
5. 基板をシリコンと二酸化シリコンとシリコンの積層基板とした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
6. 検出電極の電極をＡｕ，Ｐｔとした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
7. 基板の一面側にダイアフラムを有し、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを有し、この窪みの曲面上の開口部を他方側の開口部よりも小さくした貫通孔を有し、この貫通孔の壁面に検出電極を有した細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、前記基板のダイアフラムを構成するいずれかの面の上にレジストマスクを形成する工程と、このレジストマスクを用いてエッチングによって窪みを形成する工程と、前記基板をダイアフラムの厚み方向に対して０度より大きな角度に傾けて設置して窪みの曲面側よりドライエッチングにて貫通孔の一部を形成した後このダイアフラムの平面内で基板中心に所定の角度で回転移動させた後ドライエッチングを行うことにより貫通孔を形成する工程と、この貫通孔の内部に検出電極を形成する工程からなる細胞外電位測定デバイスの製造方法。
8. 回転移動させる角度を等間隔とする請求項７に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
9. 基板をダイアフラムの厚み方向に対して０度より大きく７度より小さな角度に傾けて設置する請求項７に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
10. 基板の一面側にダイアフラムを有し、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを有し、この窪みの曲面上から他方側へつながる貫通孔を有し、この貫通孔の窪み側の開口部を他方側に向かって大きくするとともに貫通孔の壁面は直線的であり、且つこの貫通孔の壁面に検出電極を有した細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、前記基板のダイアフラムを構成するいずれかの面の上にレジストマスクを形成する工程と、このレジストマスクを用いてエッチングによって窪みを形成する工程と、前記基板をダイアフラムの厚み方向に対して０度より大きく傾けて設置してこのダイアフラムの平面内で基板中心に回転させながら窪みの曲面側よりドライエッチングを行うことによって貫通孔を形成する工程と、この貫通孔の内部に検出電極を形成する工程からなる細胞外電位測定デバイスの製造方法。
11. ドライエッチングはエッチングを促進する工程とエッチングされた内壁に保護膜を形成する工程とを交互に繰り返す請求項７または１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
12. ドライエッチングは、エッチングを促進する工程とエッチングされた内壁に保護膜を形成する工程からなり、エッチングを促進するガスにＸｅＦ₂、ＣＦ₄、ＳＦ₆のうちのいずれか一つを含むガスを用い、保護膜を形成するガスにＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈のいずれかまたはこれらを含むガスを用いる請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
13. エッチングを促進する工程とエッチングされた内壁に保護膜を形成する工程とを交互に繰り返すとともに前記エッチングを促進する工程を１回行う間に基板を少なくとも１回転させる請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
14. 回転の速度を等速とする請求項１３に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
15. 回転を間欠運動とする請求項１３に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。

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