JP2006058255A - 小型で高速な試料スクリーニング装置 - Google Patents

Abstract

【課題】動物細胞等の数十マイクロメータサイズの微細細胞を対象とした、信頼性が高く、高効率にスクリーニングが行える薬効スクリーニング装置と方法の提供。
【解決手段】原子間力顕微鏡に用いられるカンチレバー式の針を薬効スクリーニング装置の電極針として用い、かつ、電極針に配線を形成して絶縁膜で覆い、電極針の先端から１０マイクロメートル程度はなれた位置に開口を設けて、配線の一部を露出させること、さらに、複数の細胞を保持するマイクロチャンバを形成し、複数の電極針を備えて、前記細胞に対応する位置に電極針を配した構造とすることによって解決できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞を用いて薬効をスクリーニングする薬効スクリーンニング装置に係る技術に関する。

いわゆる高齢化社会、高度医療化社会の到来、あるいはヒト遺伝子の解析完了に伴って、新薬の開発が活発化している。新薬は、薬物候補物質を探索する創薬、さらに量産用のプロセス開発、スケールアップといった過程を経て製品化される。このうち、創薬において重要なのが、薬物候補物質の細胞レベルでの薬効スクリーニングである。

新薬の細胞レベルでの薬効スクリーニングでは、先端にマイクロメータ程度の開口を有するガラス電極に塩化カリウム（ＫＣｌ）を満たした針を動物の培養細胞や卵母細胞等、各種の細胞に挿入して、薬物候補物質を注入する手法が用いられている（例えば、特開２００１−１８３３２９号公報参照）。

その結果、もし、薬物候補物質に対し細胞が感受性を有すれば、細胞膜電位変化、細胞分裂等の形態変化、あるいは、蛍光色素による発色が生じるため、これらを検出することによって、薬物候補物質に対する感受性、すなわち薬効を判定することが可能となる。

特開２００１-１８３３２９号公報

上記従来法のシステムによれば、卵母細胞レベルでの薬効スクリーニングを実現することができる。
しかしながら、上述のスクリーニング装置では、用いられる細胞が球状で大きさもミリメートル・レベルの卵母細胞ではなく、不定形でかつ大きさも１０ミクロン・レベルの動物培養細胞の場合では、微小セル内に細胞を導入し、さらに、安定的に電極を挿入するのが困難であった。このため、上述従来法のシステムでは、動物培養細胞を利用した、より信頼性の高い薬効スクリーニング実験への対応に課題を有していた。

本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであり、微小セル内への動物培養細胞等への電極挿入が容易で、微小セルのさらなる微細化・高集積化、ひいては薬効スクリーニング実験等の高効率化が図れるスクリーニング装置に係る技術を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明のスクリーニング装置では、１０ミクロンオーダの動物細胞への電極挿入を可能とするため、金属表面を絶縁膜で覆ったカンチレバー式の針を有しており、所定の位置に絶縁膜の開口を設けた構成を取ることを特徴とする。

さらに、上記カンチレバー式の針状の電極は、複数個設けられており、上記動物細胞を捕捉する複数のマイクロチャンバの位置に合わせて設けることにより、同時に多数の細胞をスクリーニングできるので、高効率に信頼性の高い薬効スクリーニング実験を可能とすることを特徴とする。

この結果、動物細胞等が捕捉されたチャンバに位置合わせしてカンチレバー式の電極を押し込むことにより、いずれの細胞に対しても一定の押し付け力で電極の挿入が確実にでき、かつ、細胞内の一定の距離に電極の金属面を位置決めすることができる。これにより、サイズが１０ミクロン程度と極微小かつ不定形の動物細胞を試料に用いても、細胞内に電極を挿入することが可能となり、スクリーニング装置の小型化・高集積化、ひいては薬効スクリーニング実験等の試料スクリーニングの高効率化を図ることが可能となる。

以上述べたように、本発明によれば、大きさが数十マイクロメータの微細な動物細胞に対して確実に電極針を挿入できるため、セルの微細化・高集積化、ひいては、高スループットな薬効スクリーニングが可能なスクリーニング装置とスクリーニング方法を提供できる。

以下、本発明の実施例について、図を参照して説明する。

図１は、本発明によるスクリーニング装置の概念（基本的構成）を説明する図であり、図１の装置は、創薬を目的としたスクリーニング装置を意図している。

図１において、２は細胞を捕捉するマイクロチャンバであり、試料が導入・保持される孔部ないし凹面が、表面に複数個形成された基板により構成される。基板材料としては、例えば、表面に撥水処理を行なったＳｉウェハなどを用いることができる。基板表面の孔部には培養液が満たされており、そこに細胞５をロードする。このマイクロチャンバの上方には、片持ち支持構造の電極針１が設置されており、電極針１を支持する支持手段と、当該支持手段を上下に移動するための移動機構を備えている。また、マイクロチャンバ１の上方には薬液供給ノズル３があり、スクリーニングする薬液４の供給を行う。

電極針１の構造は、原子間力顕微鏡に用いられている、いわゆるカンチレバー構造をとることを特徴としている。ここで、カンチレバーとは、一点だけで支持された構造物を意味し、図１を例にすると、複数の尖部１２が梁で支えられている構造がカンチレバーに相当する。本明細書では、カンチレバーを「片持ち支持の梁構造」と表記する場合もある。電極針１の表面には、配線６が埋設されており、針の先端まで導かれている。他端は、電流源７と電圧計８に接続するための端子になっており、マイクロチャンバ２との間の電圧測定と電流印加を行うことができる。

電極針１上の配線６の針先端と反対側の端子は、図１に示すように外部に設けられた電圧計８と電流源７に接続される。マイクロチャンバ２の細胞を挿入する凹部と電圧計８、電流源７のもう一方の端子は、接地されている。電極針１は、同一基板上に複数の針が設けられ、各針の各電極は、同様の配線が組まれている。電極針毎に電圧計８と電流源７を備えてもよいが、切換えによって電極針ごとのデータを取得する方式としてもよい。

また、マイクロチャンバ２の細胞を保持する凹部と電極針１は複数の尖部１２のペアが設けられており、お互いの相対位置を合わせて正確に位置決め可能で、かつ、図１に矢印で示した方向に、電極針１を細胞５に正確に差し込むために上下運動が可能な構成となっている。

電極針１の詳細構成を図２と図３を用いて説明する。図２は、電極針１の先端の拡大図である。針表面には２本の配線６が溝内に埋設されており、電極針１の表面と配線上部は絶縁膜１０により被膜されている。ただし、電極針１の先端には、開口９が設けられており、この開口部分のみ配線が表面と導通する。この開口９の位置は、電極針１の最先端から１０マイクロメートルほど離れた位置に設けることが特徴である。図３には、マイクロチャンバ２内の細胞５に電極針１を差し入れた状態を断面図にて示している。細胞の大きさは、２０〜５０ミクロメートルのものを用いているので、細胞の中央近辺に電極針１を位置決めした後に細胞に押し付ければ、電極針１に形成した開口９は、細胞５の内部に完全に侵入し、かつ、マイクロチャンバ２と接触することはない。

つまり、確実な電極挿入が電極針１を単に押し付けるのみで達成できる特徴があるといえる。また、開口を先端に設ける他の効果として、電極針を挿入した試料の内部のみに電流・電位を印加できるという効果もある。言うまでもなく明白なことであるが，上述の細胞よりも小さい細胞を扱う場合には、それに合わせて、十分に細胞内部に侵入する位置に開口９を設ければよい。
図３は、電極針１を細胞５内に挿入した様子を示す。開口９は、自動的に、細胞５の内部に挿入され、かつ、マイクロチャンバ２の壁面には接触しない位置に位置決めが確実に行える。

次に、電極針１の作製方法について説明する。電極針１は、原子間力顕微鏡に用いるカンチレバーと同様な形状をなしており、製作方法もそれに準じた方法を用いることができる。例えば、半導体プロセスを利用すると微小な形状を加工しやすく望ましい。電極針１のベース板材料としては、剛性が高く比重に小さいものがよい。例えば、ＳｉＯ_２やＳｉが適当な材料の一例としてあげられる。電極針１の特徴的な構造は、表面に２本の配線６が形成されている点にある。図２に示すように、針の表面には溝が形成されており、導電性の配線材料が埋め込まれている。

材料としては細胞内や培養液中で必要以上にイオン化して荷電粒子化せず，電気的に安定な、銀（Ａｇ）や塩化銀（ＡｇＣｌ）が望ましいが、半導体プロセスで扱う材料ではないので、パターン形成に手間がかかるという問題がある。そこで，多少の金属イオンの存在を問題としない細胞を扱う場合には、半導体プロセスにおいて一般的な配線材料であるタングステン（Ｗ）、アルミニウム（Ａｌ）等を用いてもよい。また、溝を形成せずに針表面に配線をリソグラフィとエッチングを用いてパターンニングしてもよい。

配線６が形成されたら、表面全体を絶縁膜１０で多い配線６を絶縁する。絶縁材料としては、ＳｉＯ_２が望ましい。その後、尖部１２の先端から１０マイクロメートル程度離れた位置の配線６上の絶縁膜１０に開口９を設けて、配線６の一部を露出させる。

次に、スクリーニング方法の概略を説明する。
図１において、マイクロチャンバ２に細胞５をロードし、ＫＯＨ溶液で満たして置く。その後、尖部１２を細胞５に挿入し、電圧計８を用いて電圧測定を行う。この時の電圧値を所定の一定値になるように電流源７を調整する。この条件は、各測定間で細胞の状態を電気的に一定に保つために行うもので、データのばらつきを抑え、信頼性を向上させる効果がある。この状態でマイクロチャンバ２に薬液供給ノズル３よりスクリーンニングに用いる薬液４を供給し、電圧あるいは、電流値を測定して細胞への活性度を測定することにより、スクリーニングを行うものである。判定基準は、薬液投入前後の電圧あるいは、電流値の増減である。

測定を終了した細胞と薬液は廃棄され、次の細胞をロードして、前記手法を繰り返す。マイクロチャンバ２に細胞５を挿入する凹みを複数設けて、尖部１２をそれらに対応させて備えれば、一度の動作により、複数のデータが取得できて望ましい。

次に薬液のスクリーニング方法について説明する。例えば癌細胞のサンプルとしてＨｅｌａ細胞を用いて、この細胞に対する薬効のある薬剤を分別することを目的とする。
Ｈｅｌａ細胞の大きさは３０〜５０マイクロメータ程度であり、この細胞をマイクロチャンバ２にロードする。このとき、Ｈｅｌａ細胞の培養に用いた液から、ＫＯＨに置換する。

次に尖部１２を細胞に挿入し、電圧を測定する。この電圧値をゼロとするように電流源７を駆動して調整する。
次に、ＫＯＨを排出し、スクリーニングする薬液を各細胞毎に供給し、上記の電流条件で電圧値を測定する。滴下した薬液に細胞が反応すれば、電圧値が増減するので、この結果をもとに薬液のスクリーニングができる。

測定が終了したら、マイクロチャンバ２内のＨｅｌａ細胞を排出して、次の細胞をロードし、スクリーニングを終了するまで継続する。
このような構成と方法を用いることにより、特定の細胞に対する薬液のスクリーニングが高効率に行えた。

図４は、本発明の第２の実施例になるスクリーニング装置の構成であり、図５は、電極針１１先端の詳細形状を示す。電極針１１の構成は、実施例１で示した電極針１と比較すると、配線６が１本である点のみが異なるものである。その他の構成や、製作方法は実施例１と同様でよい。

電極針１１上の配線６の針先端と反対側の端子は、図４に示すように外部に設けられた電圧計８に接続される。マイクロチャンバ２の細胞を挿入する凹部と電圧計８のもう一方の端子は、接地されている。電極針１１は、同一基板上に複数の尖部１３が設けられ、各針の各電極は、同様の配線が組まれている。電極針毎に電圧計８を備えてもよいが、切換えによって電極針ごとのデータを取得する方式としてもよい。

本実施例における薬液のスクリーニング方法について説明する。まず、マイクロチャンバ２に細胞５をロードする。この時、細胞は、ＫＯＨ溶液中に浸されている。次に尖部１３を細胞５に挿入するように下方へ移動させ、図６に示すように開口９を細胞５の内部に確実に挿入する。この状態で、電圧を電圧計８により測定し、図示しない記憶手段に記録する。その後、ＫＯＨにスクリーニングする薬液を加えるか、置換する。そして、前記と同様に電圧を電圧計８により測定する。この電圧値と先ほど測定したＫＯＨ溶液中の電圧値と比較することによって、細胞の該当薬液に対する反応性が判明する。

本発明のスクリーニング装置の概略構成を説明する断面図。 本発明の第１の実施例になるスクリーニング装置の電極針構造を説明する図。 本発明の第１の実施例になるスクリーニング装置における電極針と細胞の位置関係を説明する図。 本発明の第２の実施例になるスクリーニング装置の概略構成を説明する図。 本発明の第２の実施例になるスクリーニング装置の電極針構成を説明する図。 本発明の第２の実施例になるスクリーニング装置における電極針と細胞の位置関係を説明する図。

符号の説明

１…電極針、２…マイクロチャンバ、３…薬液供給ノズル、４…薬液、５…細胞、６…配線、７…電流源、８…電圧計、９…開口、１０…絶縁膜、１１…実施例２の電極針、１２…尖部、１３…実施例２の尖部。

Claims (6)

1. 試料が保持される凹面を複数有する基板と、
   該基板に保持された試料に刺しいれるための複数の電極と、
   該電極により検出される電気信号を計測する手段とを有し、
   前記複数の電極が片持ち支持の梁構造を有することを特徴とするスクリーニング装置。
2. 請求項１に記載のスクリーニング装置において、
   前記電極は、電気が導電する部分を備えた針と、
   該針を被覆する絶縁膜と、該絶縁膜に設けられ、
   前記導電部が露出した開口とを備えることを特徴とするスクリーニング装置。
3. 請求項３に記載のスクリーニング装置において、
   前記開口は、前記針の先端から一定の距離を隔てた位置に形成されることを特徴とするスクリーニング装置。
4. 請求項３に記載のスクリーニング装置において、
   前記針は、前記電気が導電する部分として、針表面に形成された導電性配線を備え、
   該導電性配線の配線材料は銀であることを特徴とするスクリーニング装置。
5. 請求項３に記載のスクリーニング装置において、
   前記開口が、前記電極の先端から１０マイクロメータ以上離れた位置に設けられたことを特徴とするスクリーニング装置。
6. 試料が保持される孔を複数有する基板と、
   電極針と、
   前記孔部に対して試料を供給する手段と、
   前記電極針により検出される電気信号を計測する手段と、
   前記電極針と支持板とを移動する手段とを備え、
   前記電極針は、前記試料に挿入するための複数の尖部を有し、
   該複数の尖部の間隔は、前記複数の孔の位置に合わせて一定に保持されており、
   前記電極針と尖部とが、片持ち支持の梁構造をなすことを特徴とするスクリーニング装置。

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