JP2008000079A - 細胞電気生理センサ - Google Patents

Abstract

【課題】貫通孔に細胞を保持密着させるため、貫通孔の下方側より吸引する手段が用いられるが、貫通孔の内部に気泡が存在していると細胞の安定した保持と高精度な測定に支障をきたすという課題を有していた。
【解決手段】第一の貫通孔５を有するウエル１と、このウエル１の下方に当接した第二の貫通孔６を有した保持プレート２と、この保持プレート２の下方に液体の流入口と流出口を両端に備えた空洞８を有した流路プレート３を当接し、第二の貫通孔６の内部に第三の貫通孔７を備えたダイアフラム９を有したセンサチップ４を当接した細胞電気生理センサであって、第三の貫通孔７に対向するように少なくとも一つの振動子１３を設けた構成とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサに関するものである。

従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネル機能を測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかしながら、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い技能を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。

例えば、２つの領域を分離するキャリアに穴を設け、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞を穴に効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞の電気生理的測定を行う方法について開示している（例えば、特許文献１参照）。

また、一つのチャネルが貫通している表面に、細胞の下面から吸引して位置決めした後、圧力差を増大させて細胞の下面の一部を破裂させることにより、液体中に含まれる細胞の測定を行う方法について開示している（例えば、特許文献２参照）。

これらに開示しているように、平板に作成された穴（貫通孔）はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、平板の裏面側からの吸引などの方法により、細胞が自動的に引きつけられて、細胞を容易に保持できるという利点を有している。
特表２００２−５０８５１６号公報 特表２００３−５１１６９９号公報

前記従来の構成における細胞電気生理センサの主な目的は細胞の電気生理現象を従来のパッチクランプ法で使われる微細プローブを用いることなく簡便に計測することであり、そのためには確実に平板の一部に形成した貫通孔（穴）に細胞を密着保持させて測定することが必要である。

しかしながら、特に気泡が貫通孔（穴）の中に残存した場合、高精度な細胞の電気生理現象の測定ができなくなるという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、貫通孔の内部に気泡の残留を少なくし、高精度に電気生理現象を測定することが可能な細胞電気生理センサを提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、第三の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えた空洞を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたダイアフラムを有したセンサチップを当接した細胞電気生理センサであって、前記第三の貫通孔に対向するように振動子を少なくとも一つ以上設けた構成とするものである。

本発明の細胞電気生理センサは、細胞を保持するための貫通孔の内部の閉空間における気泡の残留を少なくすることによって、安定した細胞の保持を実現した細胞電気生理センサを実現し、電気生理現象を高精度に測定することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサについて図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、図２はその要部拡大断面図である。

図１および図２において、１は樹脂よりなるウエルであり、このウエル１に細胞外液１８を貯留しておくための第一の貫通孔５を形成している。この第一の貫通孔５は断面形状をテーパー状に形成しておくことによって、電解液などの液体または細胞などを投入するときに効率が良い。

また、前記ウエル１の下方には第二の貫通孔６を有した樹脂よりなる保持プレート２を当接しており、この保持プレート２の第二の貫通孔６の内部には、少なくとも一つの第三の貫通孔７を備えたダイアフラム９を有したセンサチップ４がセットされている。このセンサチップ４はシリコン基板またはシリコン酸化物をフォトリソグラフィー、ドライエッチングなどの半導体加工技術によって形成することによって効率良く作製することが可能であり、そのときの寸法形状としては、ダイアフラム９の厚み；２０μｍ、第三の貫通孔７の開口径：５μｍφ以下の形状で一体的に形成している。この第三の貫通孔７の開口径は細胞を保持するために最適な大きさの寸法形状とすることができ、この第三の貫通孔７の開口径は細胞２０の大きさによって適宜選択することができる。

さらに、前記保持プレート２の下方には、その両端に液体を流出入させるための空洞８を有した流路プレート３を当接して細胞電気生理センサを構成しており、前記第三の貫通孔７の上面に細胞２０を密着保持し、この細胞の電気生理現象を測定することができるようになっている。そして、前記空洞８には入口１６から細胞内液１９を充填し、出口１７から吸引ポンプなどを用いて吸引することによって細胞内液１９を充填することができる。

また、前記ウエル１、保持プレート２、および流路プレート３はすべて樹脂で構成しておくと都合がよい、特に好ましくは熱可塑性樹脂を用いることがより好ましい。これにより、これらの材料は熱溶着などの手段を用いることによって接着剤を使用することなく互いに強固に接合することができる。さらに好ましくは、これらの熱可塑性樹脂はポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、オレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルアセテート（ＰＭＭＡ）のいずれか、またはこれらの組み合わせを用いることである。これらの材料は熱溶着によって接合を効率良く行いやすい。さらに好ましくは、これら熱可塑性樹脂が環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、またはこれらが重合した環状オレフィンコポリマー、またはポリエチレン（ＰＥ）からなる熱可塑性樹脂が作業性、製造コスト、材料の入手性の観点から好ましい。特に、環状オレフィンコポリマーは透明性、アルカリ・酸などの無機系薬剤に対する耐性が強く、本発明の製造工程もしくは使用環境に適している。

そして、前記第三の貫通孔７とダイアフラム９に対向する位置に振動エネルギを発生させるための振動子１３を配置し、この振動子１３を保持しておくための振動プレート１２を設けた構成としている。この振動子１３としては、例えば圧電材料を上下の電極で挟んだ構造からなる圧電素子、あるいは電磁コイルからなる電磁素子などを所定の寸法に加工して作製したものを用いることができる。

特に、薄膜プロセスによって圧電薄膜を形成することがこの細胞電気生理センサの大きさを考慮すると適している。この圧電薄膜を用いた振動子１３は白金などの貴金属電極からなる下部電極の上にＰＺＴ薄膜を成膜形成し、このＰＺＴ薄膜の上に金電極などの上部電極を形成することによって積層構造を有した圧電薄膜振動子からなる振動子１３を形成することができる。このとき、振動プレート１２はガラス基板あるいはシリコン基板などの耐熱性を有する材料を用いることが好ましい。

また、圧電素子、電磁素子などの振動子１３を貼り付ける場合には樹脂材料などを用いることができる。

さらに、前記振動子１３は細胞外液１８の中で用いることを前提としており、前記細胞外液１８の中で振動子１３に電位あるいは電流を印加することから、絶縁性を確保しておく必要があり、絶縁材にて被覆しておくことが不可欠である。これらの材料としては、二酸化ケイ素、酸化アルミニウムなどの無機酸化物によるパッシベーション膜、あるいはシリコン樹脂、エポキシ樹脂などの防水性に優れた有機絶縁性樹脂が好ましい。

そして、細胞２０を保持した第三の貫通孔７を介して第一の電極１４と第二の電極１５との間において、細胞２０を保持したセンサチップ４で発生する電気的指標、たとえば電位、電流などを測定することができる。ここで、第一の電極１４は薄膜プロセスを用いて金属薄膜を形成し、第二の電極１５は第二の貫通孔６を塞ぐように導電性樹脂ペーストなどを用いて充填して形成することができる。

そして、これらの第一の電極１４および第二の電極１５は配線パターン電極へと接続している。

次に、本発明の細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理活動を測定する方法について簡単に述べる。

まず、図２に示すようにウエル１に細胞外液１８を充填し、空洞８に細胞内液１９をウエル１の入口１６から出口１７にかけて吸引することで充填する。ここで、細胞外液１８とは、Ｋ⁺イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞内液１９とは、例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ⁺イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。

この状態で、ウエル１の内部に設置された第一の電極１４と空洞８の内部に設置された第二の電極１５との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の抵抗値を観測することができる。これは細胞外液１８あるいは細胞内液１９が浸透し、第一の電極１４と第二の電極１５との間で電気回路が形成されるからである。

ここで、ウエル１と空洞８とセンサチップ４に細胞外液１８を充填する時、第三の貫通孔７が細胞２０を保持できる程度の微小な形状となっているため、第三の貫通孔７の中に細胞外液１８あるいは細胞内液１９が浸透せず気泡が残る場合がある。この気泡が残留した場合、ウエル１の内部に設置した第一の電極１４と空洞８に連通するように設置した第二の電極１５との間で抵抗値が不安定となったり、細胞２０の微小な電気的変化を検出することが困難となる。

そのため、この気泡を除去しない限り、次のステップである細胞２０の投入と細胞２０の保持、そして最終目的である細胞の電気生理現象の測定を行うことができない。そこで、この残留した気泡を除去するため、第三の貫通孔７およびダイアフラム９に対向するように設けた振動子１３によって振動を与えることで、液体である細胞外液１８を介して第三の貫通孔７とダイアフラム９に振動エネルギを伝えることができる。そして、このダイアフラム９が振動することによって第三の貫通孔７の内壁が振動・変形し、第三の貫通孔７の内部に留まっていた気泡も振動することになり、第三の貫通孔７の内壁から気泡が離れる機会ができることになる。この振動を連続して、あるいは間欠的に繰り返し与えるなかで、確実に効率良く第三の貫通孔７の内部から気泡を除去することができる。

これによって、細胞電気生理現象の測定の第一段階であるウエル１の内部に設置した第一の電極１４と空洞８の内部に設置した第二の電極１５との間の導通抵抗値を安定して維持することができ、その後の細胞電気生理現象の測定を効率良く、確実に行うことができることになる。

なお、ダイアフラム９を振動させることから、ダイアフラム９の表面あるいは近傍に付着した気泡も除去できるという効果も有していることはいうまでもない。

また、第三の貫通孔７の内部に残留した気泡を完全に除去するために最適な位置に振動子１３を配置することが重要であり、振動子１３と、第三の貫通孔７およびダイアフラム９とが液体１８を介して対向する位置に平行で配置することが、最も効率良く振動子１３の振動エネルギを第三の貫通孔７およびダイアフラム９に伝達し、気泡の除去に最も効果的な振動を与えることができる。

また、振動子１３は振動プレート１２の一部に固着している。この振動プレート１２は振動子１３を固着保持しておくためのものであり、この振動プレート１２の形状を最適な形状とし、可動可能とすることによって気泡の除去に最適な位置に振動子１３を配置することができる。例えば、ダイアフラム９との距離を変化させたり、角度を傾斜させたりすることも可能である。

そして、振動子１３に電気接続を前記振動プレート１２の配線パターンを介して接続することができる。

なお、振動子１３の振動効率を高めるために振動プレート１２と振動子１３の間に振動を制御するゴムなどの弾性体を介して固定することが効果的である。

また、本実施の形態１における細胞電気生理センサにおいては、振動子１３とダイアフラム９との距離を０．５〜３．０ｍｍを移動させた場合において、その効果を確認している。さらに、ダイアフラム９に対して振動子１３の振動面の傾き角が±１０度の範囲においても同じ効果を発揮することを確認している。

次に、気泡を除去した細胞電気生理センサにウエル１から細胞２０を投入する。そして、ウエル１の入口１６または出口１７の一方を減圧すると、細胞２０は第三の貫通孔７に引き付けられた後、この第三の貫通孔７を塞いで密着保持され、ウエル１側と空洞８側の電気抵抗が十分に高いＧΩ以上の絶縁状態となる（ギガシールと呼ぶ）。

この状態において、細胞２０の電気生理活動によって細胞内外の電位が変化した場合に、わずかな電位差あるいは電流変化であっても高精度な測定が可能となる。

さらに好ましくは、気泡を除去するステップにおいて、振動子１３の振動周波数をダイアフラム９が共振する周波数とすることによって、ダイアフラム９、つまり第三の貫通孔７の壁面を大きく共振振動させ、さらに効率良く気泡を除去することができる。ダイアフラム９の外径；５００μｍφ、厚み；２０μｍとしたとき、そのときの共振周波数は１．２ＭＨｚであり、そのときの振動子１３の形状としては、外径；７００μｍ、厚み；５０μｍの圧電薄膜を形成することによって振動周波数１．０〜１．４ＭＨｚのものを発振させることができた。

また、ダイアフラム９の振動モードを、ダイアフラム９の全面が厚み方向に振動する振動モードとすることによって、第三の貫通孔７の内壁がハの字型に開閉振動することになり、気泡も大きく伸縮振動・変形することになる。

その結果、効率良く第三の貫通孔７の内部から気泡を除去することができるようになり、これによって微小な気泡であっても確実に効率良く気泡を除去することが可能である。

また、前記振動子１３の振動周波数を変化させながら振動を与えることによって、ダイアフラム９を様々なモードで振動・変形させることによって、前記と同様に第三の貫通孔７の内部の気泡の除去を確実に行うことができる。例えば、前記形状の振動子１３を用いて１〜１．４ＭＨｚの範囲で周波数を可変させることによってサイズの異なる気泡に対して有効である。これは、振動子１３の振動周波数を変化させながら振動を与えることによって、第三の貫通孔７の中の様々な大きさの気泡を直接、共振振動させ変形させるとともに、気泡を破壊することができ、第三の貫通孔７より様々な大きさの気泡を除去することができるからであると考えられる。

また、振動周波数を変化させながら行うことによって、気泡に対して直接振動を与えるだけでなく、先に説明したダイアフラム９の共振振動による気泡の除去も行え、さらに効率良い気泡の除去を行うことができる。

さらに、振動子１３をダイアフラム９に対してほぼ平行に対向配置することによって、振動子１３の振動が細胞外液１８あるいは細胞内液１９を介して効率良くダイアフラム９に伝達し、第三の貫通孔７の中の気泡が抜けやすい方向へダイアフラム９が振動することになり、第三の貫通孔７の内部に残留した気泡の除去を速やかに行うことができる。

なお、振動子１３による振動を与えながら流路プレート３の空洞８側を減圧することで、振動子１３の振動によって気泡が振動・変形するとともに、気泡が変形したところにさらに圧力が加わることで、第三の貫通孔７の側壁から気泡を除去できやすくなる。

さらに、振動子１３の振動周波数を第三の貫通孔７の中に入る大きさの体積の気泡を共振させる周波数とし、気泡自身を直接振動・変形させることによって、第三の貫通孔７の内壁から気泡を移動させる、あるいは気泡を破壊することもできる。これによって、気泡の除去を効率的に行うことができることから、細胞の電気生理現象の測定を効率良く確実に行うことができる。

次に、振動子１３の振動によって振動子１３と流路プレート３の壁面との間で振動子１３の面と流路プレート３の壁面と平行な方向に節あるいは山ができるように定在波を発生させることによって、定在波の節に気泡を留ませることができる。これは振動子１３の振動による音波の放射圧によって気泡が力を受けるためであり、定在波の山の部分では気泡に与える力が大きく、節の部分では力が０となるため、定在波の節に気泡が集まるような力を受けるからである。例えば、ダイアフラム９と振動子１３との距離を３．０ｍｍとしたとき、定在波の節を３個発生させるためには１．０ＭＨｚ以上の周波数で振動させることによってその効果を発揮することができる。

そして、その後振動子１３の位相を変化させることで定在波を移動させ、定在波の節に留まった気泡も運ぶことができる。その結果、第三の貫通孔７の中の気泡を除去することができ、これによっても細胞２０の測定を効率良く、確実に行うことができる。また、ダイアフラム９と振動子１３との距離を短くするためには振動周波数を高く設定する必要がある。

このとき、振動子１３をダイアフラム９に対して対向して設置し、かつ振動子１３の面とダイアフラム９の面を平行に設置することによって、振動子１３と流路プレート３と壁面との間に定在波を確実に発生させることができ、より効率良く気泡除去を行うことができる。

なお、この細胞電気生理センサは第三の貫通孔７において設置する方向として、ダイアフラム９が第一の貫通孔５側へ近くなるようにセットしても良い。この選択は測定する細胞２０の性質によって最適に決定されるべきである。

（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサについて図面を参照しながら説明する。

図３は本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図であり、図４は別の例の細胞電気生理センサの構成を説明するための断面図である。なお、本実施の形態２における細胞電気生理センサの基本的な構成は実施の形態１で説明した細胞電気生理センサの構成とほぼ同様であり、図面において実施の形態１と同じ機能を持つ構成部材については同番号を付与し、その説明は省略する。

ここでは、本実施の形態２における細胞電気生理センサが実施の形態１における細胞電気生理センサの構成と大きく異なっているところについて詳細に説明する。

図３において、本実施の形態２における細胞電気生理センサが実施の形態１の構成と大きく異なっている点は、流路プレート３に設けた空洞８の一部に第三の貫通孔７に対向して配置するように振動子１３を配置していることである。

このような構成の振動子１３に、電流あるいは電圧を印加することによって振動を与え、液体１８を媒体としてダイアフラム９または第三の貫通孔７の中の気泡に振動エネルギを伝達し、この振動エネルギによって気泡を除去することができる。これによって、実施の形態１と同様の構成と効果を実現することができる。

また、このような構成とすることによって、第一の貫通孔５および第二の貫通孔６の寸法形状が小さい場合、最適な位置に振動子１３を配置することができない構造であったとしても、所望の位置に振動子１３を配置することができる。そして、振動プレート１２が不必要となり、製造プロセスを簡略化することができる。

また、ダイアフラム９と振動子１３の配置関係が少しずれたとしても、外形の大きな振動子１３を配置することによって、その振動面積が大きいことから、確実に、より大きな振動エネルギをダイアフラム９へ伝達することができる。

さらに、より広い面積に振動エネルギを伝達することができることから、センサチップ４近傍の保持プレート２の下面などに残存している気泡を除去することも可能である。このように、周辺部分に残留した気泡なども含んで、より効率良く気泡を除去することができる細胞電気生理センサを実現することができる。

また、ダイアフラム９の直下に振動子１３を配置できることから、ダイアフラム９と振動子１３との距離を近距離に配置することが可能であり、０．２〜１．０ｍｍまでの距離に振動子１３を配置することが可能である。

なお、空洞８の中に振動子１３を形成するためには、圧電素子からなる振動子１３を接着剤などを用いて空洞８の所定の部所に接合することによって安価に作製することができる。また、実施の形態１と同様にして薄膜プロセスを用いて圧電薄膜からなる積層圧電素子を直接空洞８の所望の位置へ形成しても良い。

そして、前記振動子１３は細胞内液１９の中で、電圧あるいは電流を印加することから、絶縁性を確保しておくことが必要である。そのため、振動子１３の表面を絶縁材にて被覆しておくことが重要である。これらの材料としては、絶縁性無機材料、シリコン樹脂、エポキシ樹脂などの防水性に優れた絶縁性樹脂が好ましい。

また、空洞８の内部で細胞内液１９を介して定在波を発生させ、この定在波によって第三の貫通孔７の中の気泡を補足し、移動・除去することができる。例えば、ダイアフラム９と振動子１３との距離を０．５ｍｍとしたとき、振動子１３の振動周波数を６．０ＭＨｚとすることによって、ダイアフラム９と振動子１３との間に３個の定在波の節を形成することができる。このように、定在波の節を３個以上形成し、その定在波の節を移動させることによって気泡を移動除去させることができる。これによっても、実施の形態１で説明した定在波の効果と同様の効果を得ることができる。

次に、本実施の形態２における別の例の細胞電気生理センサの構成について図４を用いて説明する。図４において、特に異なっている点は、振動子１３をセンサチップ４のダイアフラム９の一面に形成していることである。

このような構成とすることによって、第三の貫通孔７の中の気泡を効率よく移動・除去することができる。

なお、図４では、振動子１３をダイアフラム９の下面に形成しているが、ダイアフラム９の上面に形成しても同様の効果を発揮することができる。

そして、この振動子１３はダイアフラム９の表層に薄膜プロセスを用いて圧電薄膜を形成することによって、例えば外径；５００μｍφ、厚み；２０μｍの積層の薄膜圧電素子からなる振動子１３を直接ダイアフラム９の表層に形成することができる。

この振動子１３は振動周波数；１．５ＭＨｚで振動させることができ、第三の貫通孔７の内部に残留した気泡を効率よく除去することができた。

本発明の細胞電気生理センサは、細胞電気生理活動の測定を効率良く、確実に行うことにおいて有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図 同要部拡大断面図 本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図 同別の例の細胞電気生理センサの要部拡大断面図

符号の説明

１ ウエル
２ 保持プレート
３ 流路プレート
４ センサチップ
５ 第一の貫通孔
６ 第二の貫通孔
７ 第三の貫通孔
８ 空洞
９ ダイアフラム
１２ 振動プレート
１３ 振動子
１４ 第一の電極
１５ 第二の電極
１６ 入口
１７ 出口
１８ 細胞外液
１９ 細胞内液
２０ 細胞

Claims (7)

1. 第一の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えた空洞を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたダイアフラムを有したセンサチップを当接した細胞電気生理センサであって、前記第三の貫通孔に対向するように少なくとも一つの振動子を設けた細胞電気生理センサ。
2. 第二の貫通孔と振動子の間に液体を充填した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. 振動子の振動周波数をダイアフラムが共振する周波数とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. 振動子の振動によってダイアフラムを厚さ方向に振動させる請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
5. 振動子の振動周波数を変化させる請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
6. 振動子と第三の貫通孔との間に定在波を発生させる請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
7. 振動子とダイアフラムの面を平行に配置した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。

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