JP4426700B2

JP4426700B2 - Ｄｎａ分析素子あるいはｐｎａ分析素子を用いる相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法

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Publication number: JP4426700B2
Application number: JP2000166383A
Authority: JP
Inventors: 快彦牧野; 義彦阿部; 雅司小川; 誠高木; 繁織竹中; 健一山下
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1999-06-07
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: JP2001056311A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ分析素子、ＰＮＡ分析素子、および試料中に非常に僅かな量で含まれる、相補性を有する試料核酸断片の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
試料中の検出対象とするＤＮＡ断片の検出は、そのＤＮＡ断片の塩基配列と相補性を有する既知のＤＮＡ断片を用いて、試料中のＤＮＡ断片と既知のＤＮＡ断片とで形成されるハイブリッドを、電気化学的な方法、蛍光法、ラジオアイソトープ法などによって検出することにより行うのが一般的である。電気化学的方法は、蛍光法等に比較して、簡便な測定装置で充分に測定が可能である点や励起光による褪色が起こらない点で優れている。相補的な既知のＤＮＡ断片は、通常、固相担体に固定させて使用することから、「プローブ」あるいは「プローブＤＮＡ」と呼ばれる。プローブＤＮＡを用いた試料ＤＮＡ断片の検出方法は、病原菌の検出や遺伝子のスクリーニングに広く利用されている。
【０００３】
電気化学的方法としては、フェロセン修飾ＤＮＡ断片（フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで修飾したＤＮＡ断片）を電極型センサに適用する方法が知られている（特開平９−２８８０８０号公報および第５７回分析化学討論会予稿集、ｐ１３７−１３８（１９９６年））。即ち、出力端子を備えた電極表面に固定されたフェロセン修飾ＤＮＡ断片に、一本鎖の試料ＤＮＡ断片を電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下に反応させ、フェロセン修飾ＤＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片とで形成される二本鎖ＤＮＡ断片に結合した該インターカレータと電極との間を流れる電流量を測定することによって、相補性を有する試料ＤＮＡ断片を定量する方法である。
【０００４】
上記の方法では、面積が約１ｍｍ²の電極表面に約１０^-11モルの量のフェロセン修飾ＤＮＡ断片が固定されており、ここに試料ＤＮＡ断片を接触させると、フェロセン修飾ＤＮＡ断片に相補性を有する１０^-15乃至１０^-11モル／ｍｍ²の範囲の量の試料ＤＮＡ断片を定量することができるとされている。しかし、この方法では、１０^-16モル／ｍｍ²以下の量の試料ＤＮＡ断片が定量可能か否かについては明らかにされていない。
【０００５】
一方、ＤＮＡ断片が電極に固定されてなるＤＮＡ修飾電極に、前記の電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下、試料ＤＮＡ断片を接触させ、ＤＮＡ断片に相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出する方法が知られている（第４７回高分子学会予稿集、ｐ３１５５−３１５６（１９９８年））。この方法は、電極表面に固定されたＤＮＡ断片に予めフェロセン化合物が修飾されていない点で上記の方法と異なる。この方法では、面積が２ｍｍ²の電極表面に約１０^-11モルの量のＤＮＡ断片が固定されており、ここに約１０倍以上の量の試料ＤＮＡ断片を接触させることにより、約１０^-11モルの量の試料ＤＮＡ断片を検出することができる。しかし、１０^-12モル以下の量の試料ＤＮＡ断片の検出については明らかにされておらず、また試料ＤＮＡ断片の定量性についても示されていない。
【０００６】
遺伝子機能を効率的に解析する方法の一つとして、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を整列させたＤＮＡチップを用いる方法（Fodor S.P.A., Science, 251, 767(1991)およびSchena M., Science, 270, 467(1995)）が利用されているが、この方法にあっても、現在のところ定量できる試料ＤＮＡ断片の量は、１０^-19モル／ドットが限界である。また、ＤＮＡチップを用いる場合には、蛍光によって検出を行うのが最も一般的であり、この方法による検出の問題点は前記記載の通りである。
【０００７】
しかし、遺伝子発現のモニタリング（特に低発現の遺伝子のモニタリング）、遺伝子の変異解析、遺伝子の多型解析等においては、現実的には１０^-19モルのレベルよりも高い感度が要求される。従って、蛍光法以外の方法あって、該レベル以上の高い感度を満たし、かつ簡便な遺伝子の検出・定量の方法が必要とされている。
【０００８】
特開平１１−２３６３９６号公報には、ＤＮＡは負電荷を持つ分子であるが、そのＤＮＡの代わりに、負電荷を持たず、かつＤＮＡもしくはＲＮＡを模倣した分子であるＰＮＡ（peptide nucleic acid）が開示されている。
【０００９】
ＰＮＡは、いわゆるアンチセンス分子の一つとして知られているものである。アンチセンス分子は、遺伝子が発現する際に、一本鎖になるＤＮＡの塩基配列の転写領域もしくはＲＮＡの塩基配列の翻訳領域に高選択的に結合して、その領域の機能を制限するように働く分子であり、遺伝子治療の分野ではアンチセンス医薬品として知られている。ＰＮＡは、核酸と同様にその分子中に核酸塩基を有し、相補的な塩基配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズして二本鎖を形成する（P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。ＰＮＡは、機能的には核酸とほとんど変わりないが、その構造は全く異なり、Ｎ−(２−アミノエチル）グリシンを単位とするポリアミドを基本骨格としており、その分子中に糖およびリン酸を含まない。核酸塩基は、ポリアミド骨格に、通常、メチレンカルボニル基を介して結合している。下記に、ＰＮＡの代表的な構造をＤＮＡの構造と共に示す。
【００１０】
【化１】

【００１１】
ＰＮＡは、電気的には中性であり、塩の存在しない条件下でも荷電することがない。ＰＮＡの有する機能は核酸のそれとほとんど同じと言っても、ＰＮＡと核酸とで形成される二本鎖は、ＤＮＡと核酸とで形成される二本鎖よりも安定であり、核酸の塩基配列をより厳密に認識できるという特徴を持つ（杉本直巳、日本化学会第７４回春季大会要旨集、１２８７頁）。そのため、ＰＮＡは、アンチセンス医薬以外にも各種診断薬への応用が期待されている分子である（特表平６−５０９０６３号の明細書）。
【００１２】
特開平１１−３３２５９５号公報には、固相担体表面にＰＮＡ断片をその一端で固定してなるＰＮＡプローブ、およびＰＮＡプローブを用いるＤＮＡ断片の検出方法が開示されている。このＰＮＡプローブは、アビジン−ビオチン法によって、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップにＰＮＡ断片を固定させたものである。ＰＮＡプローブを用いたＤＮＡ断片の検出は、表面プラズモン共鳴シグナルを測定することによって行なわれている。また、ＰＮＡプローブ、およびラジオアイソトープで標識した試料ＤＮＡ断片を用いて、相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出する方法も知られている（P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。上記のアビジン−ビオチン法および上記のラジオアイソトープ法では、何れも、ＰＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片との間に生じる電気的反発が少なくなるため、検出感度を向上させることができる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中に非常に僅かな量で含まれる、ＤＮＡ分析素子に固定されたＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を再現性良く定量することができる電気化学的な高感度定量法を提供することにある。また、本発明は、ＤＮＡのように負電荷を有しないというＰＮＡの性質を利用して、ＰＮＡ分析素子に固定されたＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を再現性良く定量することができる電気化学的な高感度定量法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、導電性基板の表面に導電性基板表面１ｍｍ^２当たり１０^−２０乃至１０^−１２モルの範囲の量のＤＮＡ断片がその一端で固定され、かつ該ＤＮＡ断片の固定領域以外の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍で固定されているＤＮＡ分析素子に、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、電位を印加しながら、導電性基板の表面に固定させたＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を接触させることにより、該試料核酸断片を結合させると共に、該電気化学活性分子をも結合させ、該電気化学活性分子と導電性基板との間を流れる電流量を測定することを特徴とする、ＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法にある。
上記ＤＮＡ分析素子は、導電性基板の表面に、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着し、そしてＤＮＡ断片をその一端で固定させ、次いでＤＮＡ断片が固定された導電性基板の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍に導電性基板の表面に結合可能な反応性基を有する化合物を含む溶液を滴下し、そして該鎖状分子を該反応性基を介して固定させることによって製造されたものである。
【００１５】
本発明で用いるＤＮＡ分析素子の好ましい態様は以下の通りである。
（イ）鎖状分子の親水性基が水酸基である。
（ロ）鎖状分子の導電性基板の表面への固定が、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に備えられたメルカプト基を介して行われている。
（ハ）鎖状分子が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、６−メルカプトヘキサノールおよびＮ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンからなる群より選ばれる化合物から誘導された分子である。
【００１８】
本発明は、また、導電性基板の表面に導電性基板表面１ｍｍ^２当たり１０^−２０乃至１０^−１２モルの範囲の量のＰＮＡ断片がその一端で固定され、かつ該ＰＮＡ断片の固定領域以外の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍で固定されているＰＮＡ分析素子に、ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、電位を印加しながら、導電性基板の表面に固定させたＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を接触させることにより、該試料核酸断片を結合させると共に、該電気化学活性分子をも結合させ、該電気化学活性分子と導電性基板との間を流れる電流量を測定することを特徴とする、ＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法にもある。
上記ＰＮＡ分析素子は、導電性基板の表面に、ＰＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着し、そしてＰＮＡ断片をその一端で固定させ、次いでＰＮＡ断片が固定された導電性基板の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍に導電性基板の表面に結合可能な反応性基を有する化合物を含む溶液を滴下し、そして該鎖状分子を該反応性基を介して固定させることによって製造されたものである。
【００１９】
本発明で用いるＰＮＡ分析素子の好ましい態様は以下の通りである。
（イ）鎖状分子の親水性基が水酸基である。
（ロ）鎖状分子の導電性基板の表面への固定が、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に備えられたメルカプト基を介して行われている。
（ハ）鎖状分子が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、６−メルカプトヘキサノールおよびＮ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンからなる群より選ばれる化合物から誘導された分子である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
図１の（２）に、本発明で用いる代表的なマスクしたＤＮＡ分析素子５１の模式図を示す。マスクしたＤＮＡ分析素子５１は、導電性基板１１の表面に、多数のＤＮＡ断片がその一端部（端部の近傍を含む）で固定され、かつ固定されたＤＮＡ断片２１の固定領域以外の導電性基板の表面に、多数の鎖状分子４１ｂがその一端部もしくはその近傍で固定されてなる新規な分析素子である。
【００２２】
本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子５１は、図１の導電性基板１１の表面にＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着し、必要であれば乾燥を行い、そしてＤＮＡ断片をその一端部（端部の近傍を含む）で固定させることによって得られる未処理のＤＮＡ分析素子３１の表面に、後述するマスク処理用化合物４１ａを含む溶液を滴下し、必要であれば乾燥させ、そして多数の鎖状分子４１ｂをその一端もしくはその近傍で固定させることによって製造される。
【００２３】
以下、本明細書で用いる用語を次のように定義する。
「本発明で用いるＤＮＡ分析素子」、「本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子」および「マスクしたＤＮＡ分析素子」とは、何れも、未処理のＤＮＡ分析素子（図１では、３１）にマスク処理が施されたＤＮＡ分析素子をいう。マスクしたＰＮＡ分析素子についても同様とする。
「ＰＮＡ断片」とは、合成によって得られたＰＮＡを切断等の操作により断片化したものを含まない。
「マスク処理」とは、マスク処理用化合物を含む溶液を、未処理のＤＮＡ分析素子表面の全体に滴下し、必要であれば乾燥させ、そして固定することをいう。
「マスク処理用化合物」とは、後に鎖状分子に誘導される原化合物をいう。
「ハイブリッドＤＮＡ」とは、マスクしたＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成される二本鎖断片を、「ハイブリッドＰＮＡ」とは、マスクしたＰＮＡ分析素子上に固定されたＰＮＡ断片と試料核酸断片とで形成される二本鎖断片をいう。
「ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子」とは、ハイブリッドＤＮＡに結合し、かつ電気化学活性を有するものをいう。但し、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子は、形成されたハイブリッドＤＮＡ以外に、マスクしたＤＮＡ分析素子上の一本鎖のＤＮＡ断片、あるいは一本鎖の試料核酸断片にも一時的に結合することがある。「ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子」についても同様である。
「結合」とは、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子がハイブリッドＤＮＡ構造内に挿入された状態、あるいはハイブリッドＤＮＡ構造外でハイブリッドＤＮＡに静電的に相互作用している状態をいう。
【００２４】
［導電性基板］
導電性基板としては、疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板、または疎水性（あるいは低親水性）の電気絶縁性の担体上に複数の疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板が設けられてなる基板であることが好ましい。導電性の疎水性基板および電気絶縁性の疎水性担体は、何れも、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。
電気絶縁性の担体の材質としては、何れも、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体の厚さは、特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。
疎水性の導電性基板としては、電極、光ファイバ、フォトダイオード、サーミスタ、ピエゾ素子、表面弾性波素子なども好ましく用いることができるが、電極を用いることが特に好ましい。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることがが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。
【００２５】
導電性基板としては、疎水性の電気絶縁性の担体上に、複数の疎水性の導電性基板が設けられてなる基板を用いることが特に好ましい。このとき、導電性基板は、互いに接しないように、かつ規則的に電気絶縁性の担体上に配置されていることが好ましい。電気絶縁性の担体上に導電性基板を設ける前に、電気絶縁性の担体上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体の凹凸を軽減することができる。また、担体の種類によっては、その担体中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体も好ましく用いることができる。
【００２６】
電気絶縁性の担体上に複数の電極が配置されたものとしては、文献（Sosnowski,R.G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記載の、核酸が未固定のシリコンチップも好ましく用いることができる。また、プリント配線導電性基板のように、電極が導電性基板上に印刷されてなるものであってもよい。
【００２７】
［ＤＮＡ断片］
ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリ、ゲノムのライブラリあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましく、その塩基種も既知であることが好ましい。ＤＮＡ断片は、３乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。ＤＮＡ断片として、電気絶縁性の担体上に一定の間隔で配置された複数の導電性基板のそれぞれに、互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を固定させるため、そのような複数の種類のＤＮＡ断片を用いることも好ましい。
【００２８】
ＤＮＡ断片の導電性基板への固定方法としては、公知の方法を用いることができ、、ＤＮＡ断片の種類および導電性基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素, Vol. 43, No.13, 2004-2011(1998)）。合成ヌクレオチドを固定する場合には、導電性基板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合のための反応性基を導入したオリゴマーを合成し、表面処理した導電性基板に共有結合させる方法を用いることができる。例えば、導電性基板の表面が金で蒸着処理されている場合には、ＤＮＡ断片の５’もしくは３’末端にメルカプト基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、ＤＮＡ断片を導電性基板に固定する。該ＤＮＡ断片にメルカプト基を導入する方法は、文献（M.Maeda et al., Chem.Lett., 1805-1808(1994)およびB.A.Connolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484(1985)）に記載されている。導電性基板の表面がグラシーカーボンで塗布処理されている場合には、そのグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、導電性基板の表面にカルボン酸基を導入し、ＤＮＡ断片をアミド結合により導電性基板表面に固定することができる。実際の固定化方法については、文献（K.M.Millan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317-2323(1993)）に詳細が記載されている。ＤＮＡ断片は、予め調製されたハイブリッドＤＮＡであってもよい。ハイブリッドＤＮＡを金で蒸着処理された導電性基板に固定する場合には、ハイブリッドＤＮＡの片方の鎖の５’もしくは３’末端（好ましくは、５’末端）にメルカプト基を導入しておく。そして、固定後にハイブリッドＤＮＡを解離させて、一本鎖を固定させることもできる。
共有結合のための反応性基としては、アミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。導電性基板としてガラスやシリコンを用いる場合には、その表面処理には、公知のシランカップリング剤を用いることが好ましい。
【００２９】
ＤＮＡ断片の固定は、電気絶縁性の担体上に一定の間隔で配置された複数の導電性基板のそれぞれの上に、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散されてなる水性液を点着することによって実施することが好ましい。点着するＤＮＡ断片の濃度は、数ｐＭ乃至数ｍＭの範囲にあることが好ましく、数ｐＭ乃至数ｎＭの範囲にあることが特に好ましい。点着量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１０ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。ＤＮＡ断片を含む水性液中には、その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリコール、グリセロール等を挙げることができる。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うことも好ましい。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＤＮＡ断片が複数の導電性基板上に固定される。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
点着によって固定されたＤＮＡ断片の量は、導電性基板表面１ｍｍ²当たり１０^-20乃至１０^-12モルの量の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の固定量は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）等の機器分析の手段により決定することができる。
【００３０】
［ＰＮＡ断片］
本発明で好ましく用いられるＰＮＡ断片は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００３１】
【化２】

【００３２】
上記式中、Ｂ¹¹は、リガンドであって、天然の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＩもしくはＵ）あるいは塩基類似体を表す。Ｂ¹¹は、天然に見出される位置、即ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリンについては、９位において、チミン、ウラシルもしくはシトシンを含むピリミジンについては、１位において結合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の一部がＣからＮへ、もしくはＮからＣへ置換された化合物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾を施された化合物（スルフヒドリル基やハロゲン原子が導入された化合物）をいう。また、Ｂ¹¹は、核酸塩基を含まない芳香族部分、炭素原子数が１乃至４のアルカノイル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基類似体としては、７−デアザアデニン、６−アザウラシルおよび５−アザシトシンを挙げることができる。
典型的な核酸塩基リガンドおよび例示的合成リガンドについては、ＷＯ９２／２０７０２に図示されており、５−プロピルチミンおよび３−デアザウラシルは、ＤＮＡ断片への結合親和性を増加させることが知られている（特開平１１−２３６３９６号公報）。他の有用な天然にない核酸塩基としては、６−チオグアニンやピラゾロ［４，３ｄ］−ピリミジンが有用である（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４７９５）。
さらに、Ｂ¹¹は、ＤＮＡインターカレータ、レポーターリガンド（例えば、フルオロフォア）、ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン標識、あるいは放射性標識であってもよい。
Ｂ¹¹は、核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧもしくはＵ）であることが特に好ましい。
【００３３】
Ｒ¹¹は、水素原子、もしくは天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を含む炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のヘテロアリール基、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基、−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴基、メルカプト基、および炭素原子数が１乃至６のアルキル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。炭素原子数が１乃至６のアルキル基は、さらに、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基もしくは炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基で置換されていてもよい。Ｒ¹³およびＲ¹⁴は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が１乃至３のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至３のアルキルチオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしくは水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基は、Ｒ¹¹が結合している炭素原子の水素原子と一緒になって脂環あるいは複素環を形成していてもよい。
【００３４】
Ｌ¹¹は、連結基を表し、−ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＲ¹²−基であることが好ましく、−ＣＯ−基であることが特に好ましい。Ｒ¹²は、水素原子、炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、水酸基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が１乃至４のアルキル基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい。
【００３５】
ｄは、１乃至６０の整数を表す。ｄは、１乃至４０の整数であることが好ましい。ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立に０乃至５の整数を表す。ａ、ｂおよびｃは、何れも１であることが好ましい。
【００３６】
本発明で用いるＰＮＡ断片は、下記一般式(ＩＩ)で表される化合物であることが特に好ましい。式中、Ｂ¹¹およびｄは、それぞれ、上記一般式（Ｉ）のＢ¹¹、ｄを表す。
【００３７】
【化３】

【００３８】
ＰＮＡ断片の導電性基板への固定方法としては、公知の方法を用いることができる（蛋白質・核酸・酵素, Vol.43, No.13, 2004-2011(1998)、および特開平９−２８８０８０号公報）。固定方法は、ＰＮＡ断片の種類および導電性基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる。例えば、導電性基板上で直接、ＰＮＡ断片を合成する方法、あるいは予め合成したＰＮＡ断片を導電性基板表面に点着して、Ｎ末端もしくはＣ末端にて固定させる方法を用いることができる。導電性基板の表面は、ＰＮＡ断片を固定させるために予め処理をしておくことが好ましい。別途合成したＰＮＡ断片を用いる場合には、合成したＰＮＡ断片の一方の末端に、導電性基板との結合のための反応性基を導入しておくことが好ましい。反応性基としては、アミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。導電性基板の表面処理としては、例えば、導電性基板がグラシーカーボンである場合には、導電性基板を過マンガン酸カリウムで処理することが好ましい。
【００３９】
ＰＮＡ断片の固定は、ＰＮＡ断片を含む水性液を導電性基板上に点着して行うことが好ましい。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＰＮＡ断片のが導電性基板表面に固定される。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うことも好ましい。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、固定されていないＰＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００４０】
［マスク処理］
本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子は、マスク処理用化合物を含む溶液をＤＮＡ分析素子の表面に点着することによって作製することが好ましい。マスク処理用化合物は、０．５乃至２ｍＭの範囲で用いることが好ましく、０．８乃至１．５ｍＭの範囲で用いることが特に好ましい。マスク処理用化合物を点着後、所定の温度（好ましくは、室温）で数時間放置することが好ましい。点着後、必要であればインキュベーションを行ってもよい。マスクしたＤＮＡ分析素子は、数日間保存することが可能で、また数回であれば繰り返し使用することもできる。
【００４１】
マスク処理用化合物は、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有していてもよい鎖状分子に、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部もしくはその近傍に、導電性基板の表面に結合可能な反応性基が結合している化合物である。該鎖状分子は、導電性基板の表面に結合可能な反応性基を介して、導電性基板の表面に固定される。
一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有するとは、親水性基が必ずしも鎖状分子の末端に位置していなくてもよいことを示すが、端部に親水性基を有することが好ましい。親水性基は、一個であっても、複数個であってもよい。導電性基板の表面に結合可能な反応性基は、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に結合していることが好ましい。途中に環状基を有していてもよい鎖状分子は、マスク処理用化合物から誘導された分子である。
マスク処理用化合物としては、導電性基板に固定されているＤＮＡ断片よりも直鎖の長さが短い化合物であって、直鎖の炭素原子数が１乃至６のアルキレン基の一方の末端に親水性基を有しかつ他方の末端に導電性基板と結合する反応性基を有する化合物であることが好ましい。
【００４２】
導電性基板の表面に結合可能な反応性基としては、メルカプト基、スルフィド基、ジスルフィド基、チオカルボニル基およびチオカルボン酸基からなる群より選ばれる基を挙げることができる。導電性基板の表面にアミノ基、アルデヒド基、カルボン酸基等の反応性基を導入する処理を予め施している場合には、該反応性基としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、アミド基、カルボン酸基、アルデヒド基、エポキシ基および過オキシ酸基からなる群より選ばれる基を挙げることもできる。上記の該反応性基としては、メルカプト基、チオカルボニル基もしくはスルフィド基であることがさらに好ましく、メルカプト基であることが特に好ましい。
【００４３】
親水性基は、水酸基、カルボン酸基、アミド基、リン酸基もしくはスルホン酸基であることが好ましく、水酸基であることが特に好ましい。但し、導電性基板の表面に結合可能な反応性基とは、互いに異なるものであることが好ましい。
環状基は、環構成炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数が３乃至６のシクロアルキル基、あるいはＮ、Ｓ、ＯおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数が２乃至１０の複素環基であることが好ましい。環状基は、導電性基板の表面に結合可能な反応性基が共同して環状基を形成している基であってもよい。後者の好ましい例として、イミダゾール−２−チオン基を挙げることができる。
【００４４】
よって、マスク処理用化合物としては、メルカプトメタノール、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、５−メルカプトペンタノール、６−メルカプトヘキサノール、Ｎ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンもしくは文献に記載のイミダゾール−２−チオン誘導体（A.J.Arduengo et al., J.Am.Chem.Soc., 1990, 112, 6153-6154）であることが好ましく、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、５−メルカプトペンタノール、６−メルカプトヘキサノールであることがさらに好ましく、２−メルカプトエタノールであることが特に好ましい。上記のマスク処理用化合物は、そのナトリウム、カリウム等の塩であってもよく、また、そのアルキレン鎖が特定の置換基によって置換されていてもよい。その特定の置換基としては、炭素原子数が１乃至６の炭化水素基（好ましくは、メチル基、エチル基、フェニル基等）であることが好ましい。
ＤＮＡ断片の固定方法に応じて、マスク処理用化合物を選択することが望ましい。二種類以上のマスク処理用化合物を組み合わせて使用してもよい。
【００４５】
ＤＮＡ分析素子にマスク処理を施すと、図１に示すように、多数のマスク処理用化合物は、その親水性基を導電性基板の表面から外側方向に向けて整列した親水性の表面を形成する。図１の（２）の４２は、親水性基を表す。
【００４６】
［ハイブリダイゼーション］
ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ分析素子を用いる場合には、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、ＰＮＡ分析素子を用いる場合には、ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、マスクしたＤＮＡ分析素子あるいはマスクしたＰＮＡ分析素子に試料核酸断片を接触させることによって実施する。
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子は、ハイブリダイゼーションの終了後に、形成されたハイブリッドＤＮＡに接触させてもよい。この場合には、ハイブリダイゼーションの終了後、界面活性剤（好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム）と緩衝液（好ましくは、クエン酸緩衝液）との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去しておくことが好ましい。または、ハイブリダイゼーションの際に試料核酸断片を含む水性液中に該電気化学活性分子を含めることによって、形成されたハイブリッドＤＮＡに接触させてもよい。該電気化学活性分子は、（一本鎖の）試料核酸断片あるいは試料中に含まれる二本鎖の試料核酸断片に、該電気化学活性分子が非特異的に結合するのを避けるため、ハイブリダイゼーション終了後に未反応の試料核酸断片を除去してから、接触させることが望ましい。ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子についても同様である。ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子あるいはハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子は、１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範囲にて用いることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましいが、導電性基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長、試料核酸断片の種類などに応じて、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定することが望ましい。例えば、遺伝子発現の解析を目的とする場合には、低発現の遺伝子も充分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましく、一塩基変異の検出を目的とする場合には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤（好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム）と緩衝液（好ましくは、クエン酸緩衝液）との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。
【００４７】
［試料核酸断片］
試料核酸断片としては、生物試料から抽出したＤＮＡ断片、遺伝子操作によって作製したＤＮＡ断片等を制限酵素等で切断し、次いで電気泳動による分離等で精製したＤＮＡ断片、または化学合成で得られた一本鎖のＤＮＡ断片を用いることが好ましい。生物試料等から得られたＤＮＡ断片の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖のＤＮＡ断片に解離させておくことが好ましい。
制限酵素で切断を受けたＤＮＡ断片は、一般的に複数個の種類のＤＮＡ断片となるが、これを試料ＤＮＡ断片として用いる場合のＤＮＡ断片は、一種類であっても複数個の種類であってもよい。試料ＤＮＡ断片は、数ｐＭ乃至数ｍＭの範囲にあることが好ましく、数ｐＭ乃至数ｎＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００４８】
［ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子およびハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子］
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子は、ハイブリッドＤＮＡに結合し、かつ電気活性活性を有する分子であれば何れのものも用いることができる。ハイブリッドＤＮＡは、図１の（３）に示すように、マスクしたＤＮＡ分析素子に試料核酸断片を接触させて得られるものであることが好ましいが、このような方法によらなくても、マスクしたＤＮＡ分析素子に関与しない方法で別途調製されたものであってもよい。マスクしたＤＮＡ分析素子をマスクしたＰＮＡ分析素子に置き換えた場合にも、上記と同様である。
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子（あるいはハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子）は、マスクしたＤＮＡ分析素子（マスクしたＰＮＡ分析素子）を対応する電気化学活性分子を含む溶液に浸漬する方法、あるいはマスクしたＤＮＡ分析素子（マスクしたＰＮＡ分析素子）上に対応する電気化学活性分子を含む溶液を滴下する方法によって、ハイブリッドＤＮＡ（あるいはハイブリッドＰＮＡ）に接触させることができる。ハイブリッドＤＮＡへの結合の様式は、インターカレート型、ハイブリッドへの溝（主溝もしくは副溝）結合型等の何れであってもよい。
ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子は、ハイブリッドＰＮＡに結合し、かつ電気活性活性を有する分子であれば何れのものも用いることができる。ハイブリッドＰＮＡへの結合様式は、ハイブリッドＤＮＡの場合と同様である。
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子およびハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子は、何れも１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範囲で用いることが好ましい。
【００４９】
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子およびハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子としては、同一の分子を使用することができ、このような分子の具体例としては、導電性基で標識された縫い込み型インターカレータを挙げることができる。
導電性基で標識された縫い込み型インターカレータは、酸化還元活性を有する物質であることが好ましい。酸化還元活性部分としては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体、ビオローゲン化合物等であることが好ましく、フェロセン化合物であることが特に好ましい。インターカレータ部分としては、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノン等であることが好ましく、ナフタレンジイミドであることが特に好ましい。よって、該インターカレータとしては、フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと対応するアミン体との反応により合成される下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（S.Takenaka et al., J.Chem.Soc.,Commun., 1111(1998)）であることが特に好ましい。
【００５０】
【化４】

【００５１】
また、下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
【００５２】
【化５】

【００５３】
但し、Ｘは下記式で表される一つの結合手を有するフェロセン誘導体である。
【００５４】
【化６】

【００５５】
【化７】

【００５６】
【化８】

【００５７】
【化９】

【００５８】
導電性基で標識された縫い込み型インターカレータには、酸化還元活性部分とインターカレータ部分とを繋ぐリンカー部分がある。前記式で表される１，４−ジプロピルピペラジニル基がこのリンカー部分に相当する。このピペラジニル基の代わりに、四級化されたイミノ基を導入することもできる。四級化されたイミノ基を導入した下記式で表されるインターカレータは、反応系のｐＨに関わらすカチオン性となるために、ハイブリッドＤＮＡあるいはハイブリッドＰＮＡの結合がより強くなる。四級化されたイミノ基を導入したインターカレータは、ＰＮＡ分析素子を用いる場合に特に有効である。リンカー部分に相当する基としては上記記載のものに限定されない。例えば、ピペラジニル基の代わりに、Ｎ−アルキル基（アルキル基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基であることが好ましく、メチル基、エチル基もしくはｎ−プロピル基であることが特に好ましい）を導入することも好ましい。リンカー部分に相当する基の構造の違いより、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。
【００５９】
【化１０】

【００６０】
縫い込み型インターカレータとして上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合し、二塩基おきに配列してハイブリッドＤＮＡに飽和している。このことは、ナフタレンジイミド誘導体の二つのフェロセン分子が、それぞれハイブリッドＤＮＡの主溝と副溝とに密に並んだ状態を意味している。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡからの解離速度が極めて遅くなり、ハイブリッドＤＮＡとナフタレンジイミド誘導体との安定な複合体を形成することができる。また、ナフタレンジイミド誘導体のハイブリッドＤＮＡへの結合がインターカレーションモードであることは、一般的にハイブリッドＤＮＡに該インターカレータを接触させたときに、粘度の変化が認められることにより確認される。例えば、ウイルスＳＶ４０に代表される閉環状プラスミドは、インターカレーションが起こると、超らせんの変化に伴って粘度も変化することが知られている。一方、該インターカレータは、一本鎖ＤＮＡ断片に対しては結合しないか、あるいは一旦結合してもすぐに解離して遊離のインターカレータとなる。
【００６１】
［試料核酸断片の高感度定量法］
図１は、本発明の高感度定量法の代表的な方法を模式的に示すものでもある。マスクしたＤＮＡ分析素子５１に、ＤＮＡ断片２１と相補性を有する試料核酸断片６１が溶解あるいは分散されてなる試料水性液を接触させると、該試料核酸断片６１がＤＮＡ断片２１とハイブリッドＤＮＡ７１を形成する。ここに、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子８１を接触させると、該電気化学活性分子８１ａが７１に結合する。次いで、導電性基板１１に電位を印加し、８１ｂと導電性基板１１との間を流れる電流量を測定するとによって、ハイブリッドＤＮＡ７１、即ち試料核酸断片６１を検出・定量することができる。以下、ＤＮＡ分析素子を用いる場合を中心に説明するがＰＮＡ分析素子についても同様である。
【００６２】
本発明の高感度定量法では、マスクしたＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片の量に対して一定の関係を満たすように調整した、相補性を有する試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料水性液を接触させる。ハイブリダイゼーションは、接触によって開始する。接触方法は、該水性液を分析素子表面に点着する方法であっても、該水性液中に分析素子を浸漬する方法の何れであってもよいが、前者であることが好ましい。一定の関係とは、ＤＮＡ断片の固定量に対する、ＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片のＤＮＡ断片に接触する量の比が、約１乃至１０⁴の範囲にあることを示す。しかし、該比が１０⁴より大きいと、導電性基板上にハイブリダイゼーションに関与しないＤＮＡ断片が非常に多く存在することになり、ここにハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子を接触させると、その非関与ＤＮＡ断片に静電的に結合した該電気化学活性分子の存在が原因となって、ハイブリッドＤＮＡと該電気化学活性分子とで形成される複合体の存在の識別が困難となる。このことは検出感度の低下を招く原因となる。該電気化学活性分子は、ハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合する性質を有することから、上記の比が１に近いければ近いほど、非関与ＤＮＡ断片への該電気化学活性分子の結合は抑えられる。
【００６３】
ＤＮＡ断片の固定量が１０^-10モル／ｍｍ²以上の量である場合には、ＤＮＡ断片は、導電性基板上で密集状態にあると推定される。このとき、ＤＮＡ断片は、それらのすべてが導電性基板の表面に対して垂直方向に伸張した状態で固定されているわけではなく、実際にはＤＮＡ断片が絡まった状態、複数のＤＮＡ断片同士が互いに絡まり合った凝集状態等をとっているものと考えられる。一方、ＤＮＡ断片の固定量が１０^-12モル／ｍｍ²以下の場合には、ＤＮＡ断片は互いに少しの間隔をおいて固定されるが、導電性基板の表面にＤＮＡ断片が固定されていない領域（以下、「すき間」という）が生じる。そのため、ＤＮＡ断片は、導電性基板表面に沿って倒れ、垂直方向に伸張し難くなると考えられる。導電性基板の表面に沿って倒れたＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片が有する極性基と導電性基板の表面との弱い相互作用を生じさせ、二本鎖形成反応の効率を低下させると考えられる。
【００６４】
マスクしたＤＮＡ分析素子に、導電性基板１ｍｍ²当たり１０^-16モル以下の量の試料核酸断片を接触させ、このレベルの量が定量できるためには、導電性基板上のＤＮＡ断片の固定量は、前記記載の関係より１０^-20乃至１０^-12モル／ｍｍ²の範囲にあることが好ましい。このとき、導電性基板の表面には、さらに多くのすき間が生じていることになる。このことは、ＤＮＡ断片に好ましくない固定状態をさらにとらせることになる。従って、マスク処理の効果の一つは、導電性基板表面上のＤＮＡ断片の垂直方向への整列化にあると考えられる。
マスク処理を施すことによって、導電性基板表面１ｍｍ²当たり１０^-20乃至１０^-16モルの範囲の量の相補性を有する試料核酸断片を定量することができる。さらに、面積の小さい導電性基板を使用することによって、１０^-21モル／ｍｍ²まで定量限界を向上させることができる。特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法では、１０^-15モル／ｍｍ²の量が定量限界であることから、本発明の定量法は、１０^-16モル以下の量の該試料核酸断片を検出し、かつ定量できる初めての電気化学的方法である。
【００６５】
他の効果としては、試料核酸断片およびハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の導電性基板の表面への非特異的吸着を防止する効果を挙げることができる。ＤＮＡ分析素子にマスク処理を行うことによって、すき間にマスク処理用化合物がその一端もしくはその近傍で固定されるため、すき間が埋められる結果、試料核酸断片および該電気化学活性分子の非特的吸着を防止することができる。ＤＮＡ分析素子に対してマスク処理を施すとバックグラウド電流が大きく軽減されることが確認されている。マスク処理用化合物の親水性基は、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の疎水的吸着の防止に寄与する。さらにマスク処理の他の効果としては、ＤＮＡ分析素子におけるＤＮＡ断片の修飾量の減少を抑えることが挙げられる。
【００６６】
前述したように、導電性基板に固定させたＤＮＡ断片の中に二本鎖の形成に関与しないＤＮＡ断片が多く存在する場合に、ここにＤＮＡ結合性電気化学活性分子を接触させると、該電気化学活性分子のＤＮＡ断片への非特的吸着が起こる。このような吸着を回避するため、該電気化学活性分子を含む水溶液の塩濃度は、０．１Ｍ以上であることが好ましく、０．１乃至１．０Ｍの範囲にあることが特に好ましい。
【００６７】
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の接触後は、導電性基板を洗浄しないことが好ましい。洗浄によって、遊離の該電気化学活性分子を除去することはできるが、一旦ハイブリッドＤＮＡに結合した該電気化学活性分子も外れるおそれがあるためである。
【００６８】
ハイブリッドＤＮＡへのハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の結合は、電流を測定することにより検出する。電流の測定には、電位を印加して流れる電流を測定できる方法であれば何れの方法も用いることができ、サイクリックボルタモグラフィ（ＣＶ）、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ（ＤＰＶ）、ポテンショスタット等を用いることが好ましく、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを用いることが特に好ましい。
【００６９】
本発明の高感度定量法では、試料核酸断片の量が、マスクしたＤＮＡ分析素子に対して導電性基板１ｍｍ²当たり１０^-21乃至１０^-16モルの範囲にあるように調製された試料水性液を用いることが好ましく、１０^-20乃至１０^-18モルの範囲にあるように調製された試料水性液を用いることが特に好ましい。
【００７１】
【実施例】
［実施例１］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
面積が１ｍｍ²の金電極を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１時間浸積し、水で洗浄後、濃硝酸に浸し、１５分間攪拌した。この金電極を超純水で洗浄後、金電極表面に、５’末端にメルカプトヘキシル基を有するアデニンの２０量体（ＨＳ−ｄＡ₂₀）（１０^-14モル／μＬ）の水溶液１μＬを点着し、２時間放置した後、超純水で洗浄し、ＤＮＡ分析素子を作製した。また、ＨＳ−ｄＡ₂₀の合成には、特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法に従って行った。
（２）ＤＮＡ分析素子のマスク処理
上記（１）で得られたＤＮＡ分析素子の上に、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）の水溶液１μＬを滴下し、該分析素子にキャップをして２時間放置した。次いで、キャップを外して超純水で洗浄し、マスクしたＤＮＡ分析素子とした。
（３）フェロセン縫い込み型インターカレータの合成
下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミドは、特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法に従って合成した。
【００７２】
【化１１】

【００７３】
（４）試料ＤＮＡ断片の検出
試料ＤＮＡ断片として、チミンの２０量体（ｄＴ₂₀）を上記公報に記載の方法に従って合成し、ｄＴ₂₀（１０^-20モル／μＬ）の水溶液１μＬを、上記（２）で得たマスクしたＤＮＡ分析素子の表面に点着し、２５℃で３０分間放置した。次いで、２０℃に保った恒温セル中の電解質溶液（上記（３）で得たフェロセン化ナフタレンジイミド（５０μＭ）を含む０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液の混合液）に、上記の放置後の分析素子（作用極）、白金（対極）および銀／塩化銀参照電極を浸漬して三電極を形成させ、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ（ＤＰＶ）を測定した。そして、そのＤＰＶより、４６０ｍＶにおけるピーク電流値を求めた。
試料ＤＮＡ断片（ｄＴ₂₀）の濃度を、１０^-19、１０^-18モル／μＬにそれぞれ変える以外は上記と同様にして、それぞれのＤＰＶを測定し、各ピーク電流値を求めた。試料ＤＮＡ断片の点着量に対するピーク電流値を図２の−○−に示す。
【００７４】
次に、試料ＤＮＡ断片をｄＡ₂₀（アデニンの２０量体、前記公報に記載の方法に従って合成）に変える以外は上記と同様の操作を行って、試料ＤＮＡ断片の点着量に対するピーク電流値を求めた（図２の−□−）。
【００７５】
図２より、試料ＤＮＡ断片の点着量とピーク電流値との関係は、試料ＤＮＡ断片の点着量が電極表面１ｍｍ²当たり１０^-20〜１０^-18モルの範囲において、ほぼ良好な直線関係を示すことが分かる。従って、点着量が１０^-20〜１０^-18モル／ｍｍ²の範囲となるように濃度が調製された試料ＤＮＡ断片について、充分に定量を行うことができる。
【００７６】
［実施例２］
（１）ＰＮＡ分析素子の作製
表面にメルカプト基を有する面積が２．２５ｍｍ²の金電極に、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液を滴下して得られる、一方の端部のビニルスルホニル基が遊離な金電極に、５０ｎＭの下記式で表されるＰＮＡ断片：ＰＮＡ−Ｔ₁₀の水溶液（１ｎＬ）を滴下し、室温で１時間放置し、電極に固定されなかったＰＮＡ−Ｔ₁₀を蒸留水で洗浄してＰＮＡ分析素子を作製した。尚、ＰＮＡ−Ｔ₁₀については、文献（P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1897(1992)および114, 9677-9678(1992)）に記載の方法に従って合成した。Ｔは、チミンを表す。
【００７７】
【化１２】

【００７８】
（２）ＰＮＡ分析素子のマスク処理
上記（１）で得られたＰＮＡ分析素子の上に、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）の水溶液１μＬを滴下し、該分析素子にキャップをして２時間放置した。次いで、キャップを外して超純水で洗浄し、マスクしたＰＮＡ分析素子とした。
（３）試料ＤＮＡ断片の検出
マスクしたＤＮＡ分析素子の代わりに、上記（２）で得たマスクしたＰＮＡ分析素子を用いる以外は実施例１の（４）と同様の操作を行ったところ、図２の−○−とほぼ同様な結果が得られた。
【００７９】
【発明の効果】
本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子は、極微量のＤＮＡ断片が固定されてなるＤＮＡ分析素子に生じるすき間をマスク処理して得られたものであり、このマスク処理は、効率のよいハイブリダイゼーションが行えるようにＤＮＡ断片を整列させると共に、試料核酸断片およびハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の導電性基板の表面への非特異的吸着を防止する効果を有する。マスクしたＤＮＡ分析素子を使用することによって、ハイブリダイゼーションの効率を向上させ、検出の感度を向上させることができる。従って、本発明者は、現在のＤＮＡチップ技術の定量限界と並ぶ、電気化学的手法による初めての、ゼプトモルのレベルの試料核酸断片を再現性良く定量できる超高感度な定量法を確立することに成功した。本発明の定量法を用いることによって、遺伝子発現のモニタリング、遺伝子解析等を高感度、迅速、かつ簡便に行うことができる。
【００８０】
また、本発明者は、本発明で用いるマスクしたＰＮＡ分析素子を用いる場合にも、本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子の場合と同様に、試料核酸断片の超高感度な定量に成功した。特に、マスクしたＰＮＡ分析素子を用いる方法では、ＰＮＡ断片と試料核酸断片との電気的な反発が抑えられるために、より効率のよいハイブリダイゼーションが可能となる。これは、ハイブリッドＰＮＡを形成していないＰＮＡ断片とハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子との結合を回避できるために、検出感度が上昇したものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いる代表的なマスクしたＤＮＡ分析素子、および本発明の代表的な相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法を模式的に表した図である。
【図２】実施例１の、ハイブリッドＤＮＡが形成された場合および形成されなかった場合の試料核酸断片の点着量とピーク電流値との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１１導電性基板
２１固定されたＤＮＡ断片
３１ＤＮＡ分析素子
４１ａマスク処理用化合物
４１ｂＤＮＡ分析素子に固定された鎖状分子
４２親水性基
５１マスクしたＤＮＡ分析素子
６１ＤＮＡ断片と相補性を有する試料核酸断片
７１ハイブリッドＤＮＡ
８１ａハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子
８１ｂハイブリッドＤＮＡに結合したハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子

Claims

導電性基板の表面に、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着し、そしてＤＮＡ断片をその一端で固定させ、次いでＤＮＡ断片が固定された導電性基板の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍に導電性基板の表面に結合可能な反応性基を有する化合物を含む溶液を滴下し、そして該鎖状分子を該反応性基を介して固定させることによって製造された、導電性基板の表面に導電性基板表面１ｍｍ^２当たり１０^−２０乃至１０^−１２モルの範囲の量のＤＮＡ断片がその一端で固定され、かつ該ＤＮＡ断片の固定領域以外の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍で固定されているＤＮＡ分析素子に、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、電位を印加しながら、導電性基板の表面に固定させたＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を接触させることにより、該試料核酸断片を結合させると共に、該電気化学活性分子をも結合させ、該電気化学活性分子と導電性基板との間を流れる電流量を測定することを特徴とする、ＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法。
ＤＮＡ分析素子の鎖状分子の親水性基が、水酸基であることを特徴とする請求項１に記載の試料核酸断片の高感度定量法。
ＤＮＡ分析素子の鎖状分子の導電性基板の表面への固定が、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に備えられたメルカプト基を介して行われていることを特徴とする請求項１もしくは２に記載の試料核酸断片の高感度定量法。
ＤＮＡ分析素子の鎖状分子が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、６−メルカプトヘキサノールおよびＮ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンからなる群より選ばれる化合物から誘導された分子であることを特徴とする請求項１乃至３の内の何れかの項に記載の試料核酸断片の高感度定量法。
ＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を導電性基板表面１ｍｍ ^２当たり１０ ^−２０乃至１０ ^−１６モルの範囲で高感度に定量することを特徴とする請求項１に記載の試料核酸断片の高感度定量法。
導電性基板の表面に、ＰＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着し、そしてＰＮＡ断片をその一端で固定させ、次いでＰＮＡ断片が固定された導電性基板の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍に導電性基板の表面に結合可能な反応性基を有する化合物を含む溶液を滴下し、そして該鎖状分子を該反応性基を介して固定させることによって製造された、導電性基板の表面に導電性基板表面１ｍｍ ^２当たり１０ ^−２０乃至１０ ^−１２モルの範囲の量のＰＮＡ断片がその一端で固定され、かつ該ＰＮＡ断片の固定領域以外の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍で固定されているＰＮＡ分析素子に、ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、電位を印加しながら、導電性基板の表面に固定させたＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を接触させることにより、該試料核酸断片を結合させると共に、該電気化学活性分子をも結合させ、該電気化学活性分子と導電性基板との間を流れる電流量を測定することを特徴とする、ＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法。
ＰＮＡ分析素子の鎖状分子の親水性基が、水酸基であることを特徴とする請求項６に記載の試料核酸断片の高感度定量法。
ＰＮＡ分析素子の鎖状分子の導電性基板の表面への固定が、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に備えられたメルカプト基を介して行われていることを特徴とする請求項６もしくは７に記載の試料核酸断片の高感度定量法。
ＰＮＡ分析素子の鎖状分子が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、６−メルカプトヘキサノールおよびＮ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンからなる群より選ばれる化合物から誘導された分子であることを特徴とする請求項６乃至８の内の何れかの項に記載の試料核酸断片の高感度定量法。
ＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を導電性基板表面１ｍｍ ^２当たり１０ ^−２０乃至１０ ^−１６モルの範囲で高感度に定量することを特徴とする請求項６に記載の試料核酸断片の高感度定量法。