[go: up one dir, main page]

KR100482718B1 - 핵산 프로브 고정화 기체 및 그것을 이용한 표적 핵산의존재를 검출하는 방법 - Google Patents

핵산 프로브 고정화 기체 및 그것을 이용한 표적 핵산의존재를 검출하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100482718B1
KR100482718B1 KR10-2002-7012456A KR20027012456A KR100482718B1 KR 100482718 B1 KR100482718 B1 KR 100482718B1 KR 20027012456 A KR20027012456 A KR 20027012456A KR 100482718 B1 KR100482718 B1 KR 100482718B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
acid probe
target
gas
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
KR10-2002-7012456A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20040037015A (ko
Inventor
마사요시 다까하시
준 오까다
고지 하시모또
Original Assignee
가부시끼가이샤 도시바
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시끼가이샤 도시바 filed Critical 가부시끼가이샤 도시바
Publication of KR20040037015A publication Critical patent/KR20040037015A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100482718B1 publication Critical patent/KR100482718B1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 기체, 및기 기체에 스페이서를 통해 고정화되고표적 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산 프로브를 구비하는 핵산 프로브 고정화 기체로서, 상기 스페이서가, 그 길이를 X로 하고, 상기 핵산 프로브에 대하여 상기 표적 서열을 그 일부에 포함하는 표적 핵산을 혼성화시켰을 때, 해당 혼성화 부위의 기체측 말단으로부터 상기 표적 핵산의 기체측 말단까지의 길이를 Y로 한 경우에, X≥Y의 관계가 성립되는 스페이서인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체에 관한 것이다.

Description

핵산 프로브 고정화 기체 및 그것을 이용한 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법 {Nucleic Acid Probe-Immobilized Substrate and Method of Detecting the Presence of Target Nucleic Acid by Using the Same}
본 발명은 표적 핵산의 존재를 검출하기 위한 핵산 프로브 고정화 기체 (基體) 및 그것을 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
최근, 유전공학의 발전에 의해, 의료 분야에서는 유전자에 의한 병의 진단이나 예방이 가능해졌다. 이를 유전자 진단이라고 부른다. 예를 들면, 병의 원인이 되는 인간 유전자의 결함이나 변화를 검출함으로써, 병의 발증 전이나 그 초기 단계에서 병의 진단이나 예측을 행할 수 있다. 또한, 인간 게놈의 해독과 동시에 유전자형과 질병과의 관련성에 관한 연구가 진행되어, 각 개인의 유전자형에 적합한 치료 (테일러 메이드 의료)도 현실화되고 있다. 따라서, 유전자의 검출 및 유전자형의 결정을 간편하게 행하는 것은 매우 중요하다.
이러한 유전자 해석에 있어서, 일반적으로 주목받는 것이 DNA 칩 또는 DNA 마이크로어레이 (microarray)라는 장치이다 (여기에서는, 양쪽 모두를 총칭하여 DNA 칩이라고 함). DNA 칩은 기판상에 많은 종류의 염기 서열로 이루어지는 다수의 핵산 프로브를 고정시켜 구비하는 장치이다. 이러한 DNA 칩을 사용함으로써, 1회 시험으로 많은 종류의 표적 핵산을 검출하는 것이 가능하다. 그러나, 이와 같은 장점을 갖는 한편, 시료 중에 존재하는 다른 표적 핵산의 혼성화 효율이 상이하고, 경우에 따라서 매우 낮은 혼성화 효율밖에 얻을 수 없는 경우가 있다.
<발명의 개시>
상기의 상황에 감안하여, 본 발명의 목적은 고효율로 혼성화를 행할 수 있는 프로브 고정화 기체를 제공하는 것이다.
상기의 목적은 이하와 같은 본 발명의 실시양태에 의해 달성할 수 있다. 즉,
(1) 기체, 및 상기 기체에 스페이서를 통해 고정화되고 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산 프로브를 구비하는 핵산 프로브 고정화 기체로서, 상기 스페이서가, 그 길이를 X로 하고, 상기 핵산 프로브에 대하여 상기 표적 서열을 그 일부에 포함하는 표적 핵산이 혼성화시에 해당 혼성화 부위의 기체측 말단으로부터 상기 표적 핵산의 기체측 말단까지의 길이를 Y로 한 경우에, X≥Y의 관계가 성립되는 스페이서인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체;
(2) 시료 핵산을, 상기 X와 Y와의 관계가 X≥Y가 성립되도록 선택된 프라이머를 사용하여 증폭하는 공정,
적절한 혼성화가 얻어질 수 있는 조건하에서 상기 증폭으로 얻어진 증폭 산물을 상기 (1)에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체에 고정화된 핵산 프로브와 반응시키는 공정, 및
상기 반응시킨 공정에 의해 발생된 혼성화를 검출함으로써, 시료 핵산 중에 표적 핵산이 존재하는 것을 판정하는 공정
을 구비하는, 상기 (1)에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법; 및
(3) 기체, 및 상기 기체에 고정화되고 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 프로브를 구비하는 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 해당 표적 서열을 포함하는 표적 핵산을 검출하는 방법으로서,
(a) 해당 표적 핵산이 표적 서열을 통해 상기 핵산 프로브와 혼성화시에, 해당 표적 서열 부위의 기체측 말단부로부터 40 염기 이내에 상기 표적 핵산의 말단이 위치하도록 해당 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 준비하는 것과,
(b) 상기 (a)에서 준비된 프라이머를 사용하여 시료 핵산을 증폭하는 것과,
(c) 상기 (b)에서 얻어진 증폭 산물을 단일쇄로 만드는 것과,
(d) 상기 (c)에서 얻어진 단일쇄를 상기 핵산 프로브와 반응시키는 것과,
(e) 상기 (d)에서 발생된 혼성화를 검출함으로써, 해당 시료 핵산 중 표적 핵산의 존재를 검출하는 것
을 구비한 핵산 검출 방법에 의해 달성할 수 있다.
도 1A는 본 발명의 핵산 프로브 고정화 기체의 일례를 나타내는 평면도이고, 도 1B는 도 1A의 선 B-B에 따른 단면도이다.
도 2는 본 발명의 핵산 프로브 고정화 기체의 일례를 나타내는 도면이다.
도 3은 핵산 프로브와 표적 핵산의 결합 상태를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예에서 사용된 핵산 프로브와 표적 핵산을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 X와 Y의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 6A는 실시예에서 사용된 여러 가지 스페이서를 포함하는 핵산 프로브와 표적 핵산과의 결합 상태를 나타내는 도면이고, 도 6B는 실시예에서 행한 시험에 의해 얻어진 결과를 나타내는 도면이다.
도 7A는 실시예에서 사용된 여러 가지 스페이서를 포함하는 핵산 프로브와 표적 핵산과의 결합 상태를 나타내는 도면이고, 도 7B는 실시예에서 행한 시험에 의해 얻어진 결과를 나타내는 도면이다.
도 8A는 실시예에서 사용된 여러 가지 스페이서를 포함하는 핵산 프로브와 표적 핵산과의 결합 상태를 나타내는 도면이고, 도 8B는 실시예에서 행한 시험에 의해 얻어진 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예에서 사용한 증폭 단편과 핵산 프로브와의 관계를 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예에서 행한 시험에 의해 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 실시예에서 사용한 증폭 단편과 핵산 프로브와의 관계를 나타낸 도면이다.
도 12는 실시예에서 행한 시험에 의해 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 실시예에서 행한 시험에 의해 얻어진 결과를 나타내는 그래프이다.
1. 발명의 개요
본 발명은 기본적으로 기체와, 상기 기체에 스페이서를 통해 고정된 핵산 프로브를 구비하는 핵산 프로브 고정화 기체이다. 본 발명은 본 발명자들이 스페이서의 길이를 특정함으로써 더욱 효율이 좋은 혼성화를 얻을 수 있음을 발견한 것에 기초한다.
즉, 본 발명의 실시양태에 의한 핵산 프로브 고정화 기체에서는, 스페이서의 길이를 X로 하고, 상기 핵산 프로브에 대하여 상기 표적 서열을 그 일부에 포함하는 표적 핵산을 혼성화시에, 해당 혼성화 부위의 기체측 말단으로부터 상기 표적 핵산의 기체측 말단까지의 길이를 Y로 한 경우에, X≥Y의 관계가 성립되는 스페이서를 통해 핵산 프로브가 기체에 고정되어 있다.
또한, 본원 발명의 실시양태에 따른 핵산 프로브 고정화 기체의 측정 원리는 이하와 같다. 해당 핵산 프로브는 표적 서열에 상보적인 서열을 갖도록 설계되어 있다. 시료 핵산에 표적 서열이 존재하는 경우에는, 해당 핵산 프로브 고정화 기체상에서 혼성화가 발생된다. 따라서, 본 발명의 장치는 기본적으로 이 혼성화 결과로부터 발생된 이중쇄 핵산의 존재를 검출함으로써, 또는 해당 핵산 프로브에 혼성화시에 핵산의 존재를 검출함으로써, 시료 핵산 중에 표적 서열이 존재하는 것을 검출할 수 있다. 여기에서 사용되는 "혼성화를 검출함"이라는 용어는 발생된 해당 이중쇄 핵산을 검출하는 것, 또는 시료 핵산을 미리 어느 표지 물질에 의해 표지해 두고, 혼성화 후에 그 표지 물질에서 유래하는 신호를 검출하는 것, 또는 그 자체로 공지된 다른 수단으로, 반응에 의해 이중쇄 핵산이 존재하는 것이나 혼성화가 발생한 것을 검출하는 것을 총괄적으로 나타내는 용어이다.
이와 같은 혼성화의 검출은, 예를 들면 후술하는 전기 화학적 검출 또는 형광 검출에 의해 행할 수 있다.
이러한 전기 화학적 검출의 경우, 핵산 프로브 고정화 기체는, 기본적으로 기체에 전기 화학적 신호를 검출 가능하게 배치된 전극에 대하여 원하는 핵산 프로브를 스페이서를 통해 고정화시키면 얻어진다.
또한, 형광 물질 등의 표지 물질을 사용하여 검출하는 수단을 행하는 경우, 핵산 프로브 고정화 기체는, 기본적으로 기체에 대하여 원하는 핵산 프로브를 스페이서를 통해 고정화시키면 얻을 수 있다.
2. 용어의 설명
여기에서 사용되는 "핵산"이라는 용어는 리보핵산 (즉, RNA), 데옥시리보핵산 (즉, DNA), 펩티드 핵산 (즉, PNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, cDNA 및 cRNA 등, 및 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 등, 핵산 및 핵산 유사체를 총괄적으로 나타내는 용어이다. 또한, 그와 같은 핵산은 천연에 존재하는 것일 수도 있고, 인공적으로 합성된 것일 수도 있다.
여기에서 "핵산 프로브"라 함은, 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산으로, 기체에 고정화시키기 위한 핵산 단편을 의미한다. 핵산 프로브는 목적으로 하는 표적 서열에 상보적인 서열을 갖고, 그것에 의해 적절한 조건하에서 표적 서열과 혼성화시킬 수 있다.
여기에서 "표적 서열"이라 함은, 그 존재를 검출하고 싶은 염기 서열, 또는 핵산 프로브의 염기 서열에 의해서 포착하려고 하는 서열을 가리킨다. 또한, 그와 같은 표적 서열을 포함하는 핵산을 표적 핵산이라고 한다.
여기에서 사용되는 "상보", "상보적" 및 "상보성"이라는 용어는 50 ％ 내지 100 ％의 범위에서 상보적일 수 있으며, 바람직하게는 100 ％ 상보적인 것을 의미한다.
여기에서 사용되는 "스페이서"라는 용어는 핵산 프로브와 기판 사이에 배치되는 어느 정도의 길이를 갖는 쇄형 물질을 의미한다. 스페이서를 구성하는 물질이 핵산인 경우, 표적 서열에 상보적이거나 혼성화되는 부분을 프로브로, 그 이외의 부분을 스페이서로 분류한다.
여기에서 사용되는 "스페이서의 길이"라는 용어는 핵산 프로브와 기체 사이에 배치되는 쇄형 분자의 길이를 의미한다. 또한, 기체에 도 3에 나타낸 것과 같은 블로킹제를 사용하는 경우는, 상기 스페이서의 길이로부터 블로킹제의 길이를 뺀 것을 "스페이서의 길이"로 한다.
3. 발명의 실시양태
우선, 본 발명의 기본적인 구성예를 이하에 설명한다.
(1) 제1 실시양태
도 1을 이용하여 본 발명의 제1 실시양태를 설명한다. 본 발명의 제1 실시양태인 핵산 프로브 고정화 기체 (1)은, 기체 (2)에 구비된 전극 (3)에 스페이서 (4)를 통해 고정화된 핵산 프로브 (5)를 구비한다 (도 1A 및 도 1B). 전극 (3)은 전기적 정보를 송출하기 위한 파트 (6)에 접속되어 있다. 도 1B에서는 편의상, 스페이서 (4)를 굵은 선으로 표시하고, 핵산 프로브 (5)를 쇄선으로 표시하였다.
이러한 핵산 프로브 고정화 기체 (1)은 예를 들면, 그 자체로 공지된 수단에 의해 실리콘 기판에 전극을 배치하고, 그 전극 표면에 대하여 스페이서를 통해 핵산 프로브를 고상화 (固相化)함으로써 제조할 수 있다.
본 실시양태에서는 전극수를 6으로 하였지만, 1개의 기체에 배치하는 전극의 수는 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 전극의 배치 패턴도 도 1A에 나타낸 것으로 한정되지 않고, 당업자가 필요에 따라서 적절하게 설계 변경할 수 있다. 필요에 따라서, 참조 전극 및 대극 (對極)을 설치할 수도 있다. 이와 같은 핵산 프로브 고정화 기체도 본 발명의 범위내에 있다.
(2) 제2 실시양태
도 2에 본 발명의 제2 실시양태를 모식적으로 나타내었다. 본 발명의 제2 실시양태인 핵산 프로브 고정화 기체 (11)은 기체 (12)에 스페이서 (13)을 통해 고정화된 핵산 프로브 (14)를 구비한다 (도 2). 도 2에서도 편의상, 스페이서 (13)을 굵은 선으로 표시하고, 핵산 프로브 (14)를 쇄선으로 표시하였다.
이러한 핵산 프로브 고정화 기체 (11)은, 예를 들면 그 자체로 공지된 수단에 의해 실리콘 기판에 대하여 스페이서를 통해 핵산 프로브를 고상화함으로써 제조할 수 있다.
본 실시양태에서는 1개의 기체에 배치하는 핵산 프로브의 수가 이것으로 한정되지 않고, 원하는 대로 변경할 수도 있으며, 또한, 복수 종류의 염기 서열을 갖는 핵산 프로브를 1개의 기체에 배치할 수도 있다. 복수 및(또는) 복수 종류의 핵산 프로브의 기체에의 고상 패턴은 당업자가 필요에 따라서 적절하게 설계 변경할 수 있다. 이와 같은 핵산 프로브 고정화 기체도 본 발명의 범위내에 있다.
4. 구성
본 발명에 따른 실시양태는 상술한 바와 같은 기본적인 구성을 갖고 있지만, 핵산 프로브가 스페이서를 통해 고정되어 있는 것이 특징이다. 상세하게는, 본 발명에서 사용되는 스페이서는, 스페이서의 길이를 X로 하고, 상기 핵산 프로브에 대하여 상기 표적 서열을 그 일부에 포함하는 표적 핵산을 혼성화시에 해당 혼성화 부위의 기체측 말단으로부터 상기 표적 핵산의 기체측 말단까지의 길이를 Y로 한 경우에, X≥Y의 관계가 성립되는 스페이서이다.
도 3에 핵산 프로브와 표적 핵산의 결합 상태에 대한 일례를 나타낸다. 도 3의 좌측에는 핵산 프로브 고정화 기체 (30)과 일반적인 표적 핵산의 예를 모식적으로 나타낸다. 기체 (31)에 배치된 전극 (32)의 표면에 링커제 (33a) 및 블로킹제 (33b)가 처리되어 있다. 해당 링커제 (33a)에 의해, 핵산 프로브 (35)는 스페이서 (34)를 통해 전극 (32)에 고정되어 있다. 이러한 핵산 프로브 (35)의 서열에 대하여 상보적인 표적 서열을 그 일부분에 갖는 표적 핵산 (36)을 그 옆에 나란히 표시하였다.
개체나 조직 및 세포 등의 대상으로부터 얻어진 시료나, 그것을 원하는 대로 처리하여 얻어진 시료로부터 얻은 시료 핵산에서 검출하고자 하는 표적 서열을 포함하는 표적 핵산에서도, 표적 핵산의 존재 위치는 여러 가지로 생각할 수 있다. 도 3의 좌측의 시료 핵산 (36)은 그와 같은 다양한 표적 핵산내의 평균적인 일례로 여기에 표시하였다.
이와 같이 고정화된 핵산 프로브 (35)와 표적 핵산 (36)이 혼성화된 경우의 상태를, 기본선 (37)로부터 상부를 비교할 수 있도록 도 3의 우측에 표시한다. 도면에서 분명히 알 수 있는 바와 같이, 스페이서 (34)의 길이가 "X"이고, 핵산 프로브 (35)에 대하여 표적 서열을 통해 표적 핵산 (36)이 혼성화되었을 때에, 표적 서열 부분의 기체측 말단으로부터 이 표적 핵산의 기체측 말단까지의 길이가 "Y"이다.
X<Y의 경우에는, 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산 프로브 (35)와 표적 핵산 (36)과의 혼성화 효율이 낮다. 즉, 이러한 경우에는, 표적 핵산의 길이나 그 표적 핵산에서 표적 서열의 위치를 고려하면, 고정화되는 핵산 프로브는 기체 표면 근처에 과도하게 존재한다. 그 때문에 핵산 프로브끼리 상호 입체 장해의 원인이 되거나, 고상인 기체가 입체 장해의 원인이 될 수 있다. 그 결과, 핵산 프로브와 표적 핵산과의 혼성화 효율을 충분하게는 얻을 수 없다고 생각된다.
이에 대하여, X≥Y의 경우에는 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산 프로브 (35)와 표적 핵산 (36)과의 혼성화 효율이 높다. X≥Y의 경우에는, 도 3의 우측 에서 알 수 있는 바와 같이, 핵산 프로브와 표적 서열이 혼성화된 경우에 표적 서열보다도 기체 (31)측에 존재하는 표적 핵산 (36) 부분의 잉여 서열은, 가령 있었다고 해도 짧고, 또는 그와 같은 잉여 서열은 존재하지 않는다. 또한, 표적 핵산의 길이 및 표적 서열의 위치에서 보더라도, 스페이서 (34)가 충분한 길이이므로 핵산 프로브는 반응 용매 중에서 자유롭게 움직이는 범위가 확대되고 (즉, 자유도가 충분하게 크고), 혼성화 반응 중에 표적 서열과 조우할 확률이 향상된다고 생각된다.
X와 Y와의 관계를 도 5에 나타낸다. 도 5의 그래프는 횡축이 X의 길이이고, 종축이 Y의 길이이다. 중앙의 직선은 Y=X인 그래프이다. 본 발명의 실시양태에 따라, 바람직한 Y와 X의 관계는 X≥Y이다. 도면에서, 영역 A는 표적 핵산과 고상과의 입체 장해를 작게 하기 위해 X≥Y를 만족시키는 영역이다. 영역 B는 영역 A에 포함되고, 핵산 프로브의 자유도를 더욱 향상시키기 위해서 X-50Å≥Y를 만족하는 영역이다. 영역 C는 B 영역에 포함되고, 또한 핵산 프로브 합성시의 비용이나 수량을 고려한 경우에 더욱 바람직한 영역이다. 영역 D는, Y가 수 10 Å보다 더 짧은 경우에도, X는 자유도를 확보하기 위해 일정한 길이 이상 필요한 것을 고려한 경우에 회피하는 것이 바람직한 영역이다. 또한 영역 E는, Y가 0이거나 또는 매우 짧기 때문에 스페이서의 유무나 길이에 의해서도 혼성화 효율에 영향이 발생되지 않는 영역이다.
실제로 검출을 행한 경우에 대부분은 영역 A, B, C 및 D이지만, 본 발명의 실시양태에서 더욱 바람직한 영역은 영역 C 및 영역 D이다.
본 발명의 취지에 따르면, X 길이의 한계는 20000 Å 이하이거나 10000 Å 이하일 수도 있다. 핵산 프로브를 합성하는 측면에서 고려한 경우, X 길이의 상한은 2000 Å (이것은 핵산으로 약 400 염기에 상당함)일 수 있고, 1000 Å이 바람직하며, 500 Å이 더욱 바람직하다. 이는, X의 길이를 길게 설정하면 핵산 프로브를 합성하는 경우의 수량 및 순도가 저하될 가능성이 있기 때문이다.
또한, 상술한 바와 같은 본 발명의 실시양태에 따른 조건을 만족시키기 위해서는, 표적 서열 선택시에 연구하거나, 시료로부터 표적 서열을 포함하는 표적 핵산을 증폭하는 경우에 사용하는 프라이머의 서열 선택시에 연구하는 것도 가능하다. 스페이서의 길이가 조절될 뿐 아니라, 이와 같은 조정을 행함으로써 더욱 바람직한 혼성화 효율을 달성할 수 있다.
해당 스페이서로 사용되는 물질의 예로는 유기쇄형 분자가 있으며, 예를 들면, 핵산, 알칸 및 폴리에틸렌글리콜, 폴리펩티드 등이 바람직하다.
예를 들면, 스페이서가 핵산으로 이루어진 핵산 스페이서인 경우, 그의 염기 서열은 표적 핵산이나 시료 중에 포함될 수 있는 핵산과 결합하지 않는 서열로 된 것이 바람직하다. 또한, 후술하는 전기 화학적 검출에 의해 발생된 혼성화를 검출할 경우, 거기에서 사용하는 이중쇄 인식체의 핵산 염기와 결합하는 경향을 고려한 서열로 된 것이 바람직하다. 예를 들면, 획스트 (Hoechst) 33258은 시토신 및 구아닌과 결합하기는 어렵고, 티민 및 아데닌과 결합하기는 쉽다. 한편, 구아닌의 연속된 서열은 합성이 어렵다. 따라서, 시토신으로 이루어진거나 또는 시토신을 많이 함유하는 염기 서열이 더욱 바람직하고, 티민으로 이루어지거나 또는 이들을 많이 함유하는 염기 서열이 바람직하며, 구아닌 또는 아데닌으로 이루어지거나 또는 이들을 많이 함유하는 염기 서열은 그다지 바람직하지 않다.
이러한 스페이서를 배치함으로써, 핵산 프로브와 표적 핵산과의 효율이 양호한 혼성화가 달성된다.
본 발명에서 사용되는 핵산 프로브는, 일반적으로 프로브로서 사용되는 길이인 것이 바람직하다. 예를 들면, 핵산 프로브의 길이는 약 3 염기 길이로부터 약 1000 염기 길이가 좋고, 약 10 염기 길이로부터 약 200 염기 길이가 바람직하다.
본 발명에서 사용될 수 있는 기체는 표적 서열과의 혼성화를 행하기 위한 핵산 프로브가 고정화되는 기체이면 좋다. 이와 같은 기체의 예로는, 비다공성, 경질 및 반경질인 재질일 수 있고, 웰, 홈 또는 평평한 표면을 갖는 판형이거나, 또는 구체 및 입방체 등의 입체 형상으로 이루어진 형태일 수 있다. 기체는 실리콘, 유리 등의 실리카 함유 기재, 및 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌 및 폴리카보네이트 등의 플라스틱 및 중합체 등으로 제조될 수도 있으나, 이것으로 한정되지는 않는다. 그러나, 기체를 사용하지 않고 후술하는 전극 자체를 기체로 사용하는 것도 가능하다.
형광 검출을 행하기 위한 핵산 프로브 고정화 기체의 경우에는, 상기 중 어느 하나의 기체에 대하여 핵산 프로브를 스페이서를 통해 고정화시킬 수 있다. 또한, 전기 화학적 검출을 행하기 위한 핵산 프로브 고정화 기체의 경우에는, 상기 중 어느 하나의 기체에 전기 화학적인 검출이 가능하도록 전극을 배치하여, 그 전극상에 핵산 프로브를 고정화시키면 좋다.
본 발명에서 사용될 수 있는 전극은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 그라파이트, 글래시 (glassy) 카본, 열분해 (pyrolytic) 그라파이트, 카본 페이스트, 탄소 섬유와 같은 탄소 전극, 백금, 백금흑, 금, 팔라듐, 로듐과 같은 귀금속 전극, 산화티탄, 산화주석, 산화망간, 산화납과 같은 산화물 전극, Si, Ge, ZnO, CdS, TiO2, GaAs와 같은 반도체 전극, 티탄 등을 들 수 있다. 이러한 전극은 도전성 고분자에 의해 피복될 수도 있고, 단분자막에 의해 피복될 수도 있으며, 필요에 따라서 그 밖의 표면 처리제를 처리할 수 있다.
스페이서를 통한 핵산 프로브의 고정은, 그 자체로 공지된 임의의 수단에 의해서 행할 수 있다. 예를 들면, 스페이서를 전극에 대하여 고정시키고, 그 후에 스페이서에 대하여 핵산 프로브를 추가로 고정시킬 수도 있다. 또는, 미리 핵산 프로브에 스페이서를 결합시켜, 그 스페이서를 통해 전극에 고정시킬 수도 있다. 또는, 전극상에서 스페이서와 핵산 프로브를, 그 자체로 공지된 수단에 의해서 합성할 수도 있다. 또한, 스페이서를 통한 핵산 프로브의 고정은, 처리 또는 무처리 기체 또는 전극 표면에 대하여 해당 스페이서를 공유 결합, 이온 결합 또는 물리적 흡착 등에 의해서 직접 고정화시킬 수도 있다. 또는, 스페이서를 통해 핵산 프로브의 고정을 돕는 링커제를 사용할 수도 있고, 이와 같은 링커제를 사용하여 기판 또는 전극에 대하여 스페이서를 통해 핵산 프로브를 고정화시킬 수도 있다. 또한, 전극에 대한 시료 핵산의 비특이적인 결합을 방지하기 위한 블로킹제를 링커제와 함께 전극에 처리할 수도 있다. 또한, 여기에서 사용되는 링커제 및 블로킹제는, 예를 들면 전기 화학적 검출을 유리하게 행하기 위한 물질일 수도 있다.
또한, 상이한 염기 서열을 갖는 핵산 프로브는 각각 상이한 전극에 대하여 스페이서를 통해 고정화될 수도 있고, 다른 염기 서열을 갖는 복수 종류의 핵산 프로브가 혼합된 상태에서 1개의 전극에 대하여 스페이서를 통해 고정화될 수도 있다.
5. 검출
본 발명에 따른 핵산 프로브 고정화 기체는, 상기 기체에 고정화된 핵산 프로브와 표적 핵산 사이의 혼성화 반응 결과 생성된 이중쇄의 존재를 검지하기 위한 수단으로 전기 화학적 방법 및 형광 검출법을 사용하는 것이 가능하다.
(1) 전기 화학적 검출
전기 화학적 방법에 의한 이중쇄 핵산의 검출은, 예를 들면 그 자체로 공지된 이중쇄 인식 물질을 사용하여 행할 수 있다.
여기에서 사용되는 이중쇄 인식체는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 획스트 33258, 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 다우노마이신 (downomycin), 메탈로인터칼레이터 (metallointercalator), 비스아크리딘 등의 비스인터칼레이터, 트리스인터칼레이터 및 폴리인터칼레이터 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 이러한 인터칼레이터를 전기 화학적으로 활성인 금속 착체, 예를 들면 페로센, 비올로겐 (viologen) 등으로 수식해 두는 것도 가능하다. 또한, 그 밖의 공지된 임의의 이중쇄 인식 물질도 본 발명에 있어서 바람직하게 사용된다.
본 발명에 따른 핵산 프로브 고정화 기체에는 스페이서를 통해 핵산 프로브가 전극에 고정화되어 있다. 이러한 전극을 사용하는 이중쇄 핵산의 검출은 다른 일반적인 전기 화학적 검출법과 동일하고, 대극이나 참조극을 더 사용할 수도 있다. 참조극을 배치할 경우, 예를 들면, 은/염화은 전극이나 수은/염화수은 전극 등의 일반적인 참조극을 사용할 수 있다.
예를 들면, 시료 핵산 중에 표적 핵산의 포함 여부를 검출하는 경우에는, 이하와 같이 시험을 행할 수 있다. 예를 들면, 인간을 포함한 동물 등의 개체, 조직 또는 세포 등의 대상으로부터 채취된 시료에서 핵산 성분을 시료 핵산으로 추출한다. 얻어진 시료 핵산은, 필요에 따라서 역전사, 신장, 증폭 및(또는) 효소 처리 등의 처리를 행한다. 전처리된 시료 핵산을 핵산 프로브 고정화 기체에 고정화된 핵산 프로브와 접촉시켜, 적절한 혼성화가 가능한 조건하에서 반응을 행한다. 이와 같은 적절한 조건은, 표적 서열에 포함되는 염기의 종류, 핵산 프로브 고정화 기체에 구비되는 스페이서 및 핵산 프로브의 종류, 시료 핵산의 종류 및 이들 상태 등의 여러 가지 조건에 따라서 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 이하와 같은 조건하에서 반응을 행할 수 있다.
즉, 혼성화 반응은 이온 강도가 0.01 내지 5의 범위이고, pH가 5 내지 10의 범위인 완충액 중에서 행한다. 이 용액 중에는 혼성화 촉진제인 황산 덱스트란, 및 연어의 정자 DNA, 소의 흉선 DNA, EDTA 및 계면활성제 등을 첨가할 수도 있다. 여기에 얻어진 시료 핵산을 첨가하여, 90 ℃ 이상에서 열변성시킨다. 열변성된 시료 핵산에의 핵산 프로브 고정화 기체의 삽입은, 변성 직후, 또는 0 ℃로 급냉시킨 후에 행할 수도 있다. 또한, 기체상에 액체를 적가함으로써 혼성화 반응을 행하는 것도 가능하다.
반응 중에, 교반 또는 진동 등의 조작으로 반응 속도를 높일 수도 있다. 반응 온도는, 예를 들면 10 ℃ 내지 90 ℃의 범위에서, 반응 시간은 1 분 이상 내지 하루 정도 행할 수 있다. 혼성화 반응 후, 전극을 세정한다. 세정은, 예를 들면 이온 강도가 0.01 내지 5의 범위이고, pH가 5 내지 10의 범위인 완충액을 사용할 수 있다. 시료 핵산 중에 표적 서열을 포함하는 표적 핵산이 존재하는 경우, 핵산 프로브와 혼성화시키면, 그것에 따라 이중쇄 핵산이 생성된다.
이어서, 전기 화학적 수단에 의해 이하와 같은 순서로 생긴 이중쇄 핵산의 검출을 행한다. 일반적으로는, 혼성화 반응 후에 기체를 세정하고, 전극 표면에 형성된 이중쇄 부분에 이중쇄 인식체를 작용시켜, 그것에 따라 발생되는 신호를 전기 화학적으로 측정한다.
이중쇄 인식체의 농도는 그 종류에 따라서 다르지만, 일반적으로는 1 ng/mL 내지 1 mg/mL의 범위로 사용한다. 이 때, 이온 강도가 0.001 내지 5의 범위이고, pH가 5 내지 10의 범위인 완충액을 사용할 수 있다.
예를 들면, 전기 화학적인 측정은, 이중쇄 인식체가 전기 화학적으로 반응하는 전위 이상으로 전위를 인가하여, 이중쇄 인식체에서 유래하는 반응 전류치를 측정할 수 있다. 이 때, 전위는 정속으로 소인 (掃引)하거나, 또는 펄스로 인가하거나, 또는 정전위를 인가할 수도 있다. 측정시에 예를 들면, 포텐시오 스타트, 디지털 멀티미터 및 함수 발생기 (function generator) 등의 장치를 이용하여 전류, 전압을 제어할 수도 있다. 예를 들면, 얻어진 전류치를 기초로 검량선에서 표적 핵산의 농도를 산출할 수도 있다.
또한, 그 자체로 공지된 전기 화학적 검출 수단, 예를 들면 문헌 [Hashimoto et al. 1994] 및 문헌 [Wang et al. 1998]에 개시되어 있는 수단 등도 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용할 수 있다. 해당 문헌에서, 하시모또 등은 DNA 프로브로 수식된 금 전극과 전기 화학적으로 활성인 색소를 사용하는 서열 특이적 유전자 검출을 보고하였다. 색소에서 유래하는 (+)극의 전류는 표적 DNA의 농도와 상관성이 있다. 또한, 왕 등은 인디케이터가 없는 (indicator-free) 전기 화학적 DNA 혼성화에 대해 보고하였다. 이 바이오 센서의 구성은 카본 페이스트 전극에의 이노신 치환 프로브 (구아닌을 포함하지 않음)의 고정화와, 해당 표지의 구아닌 산화 피크의 존재에 의한 이중쇄 형성의 대시간전위차법 (chronopotentiometry) 검출을 포함한다. 이들 문헌에 기재된 검출 수단은 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다.
(2) 형광 검출법
형광 표지 물질을 사용하는 방법의 경우에는, 시료 핵산이 FITC, Cy3, Cy5 또는 로다민 등의 형광 색소, 또는 바이오틴, 합텐 (hapten), 옥시다아제 또는 포스파타아제 등의 효소, 또는 페로센 또는 퀴논류 등의 전기 화학적으로 활성인 물질로 표지된다. 또는, 상술한 물질로 표지한 제2 프로브를 사용함으로써 검출을 행한다. 복수의 표지 물질을 동시에 사용할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 시료 물질로부터 추출된 핵산 성분과 프로브 고정화 칩에 고정화된 프로브와의 혼성화 반응은, 예를 들면 이하와 같이 행한다. 즉, 혼성화 반응은 이온 강도가 O.01 내지 5의 범위이고, pH가 5 내지 10의 범위인 완충액 중에서 행한다. 이 용액 중에는 혼성화 촉진제인 황산 덱스트란, 및 연어의 정자 DNA, 소의 흉선 DNA, EDTA 및 계면활성제 등을 첨가할 수도 있다. 여기에 추출된 핵산 성분을 첨가하여, 90 ℃ 이상에서 열변성시킨다. 프로브 고정화칩의 삽입은, 변성 직후, 또는 O ℃로 급냉시킨 후에 행할 수 있다. 또한, 기체상에 액체를 적가함으로써 혼성화 반응을 행하는 것도 가능하다. 반응 중에, 교반 또는 진동 등의 조작으로 반응 속도를 높일 수 있다. 반응 온도는, 예를 들면 10 ℃ 내지 90 ℃의 범위에서, 반응 시간은 1분 내지 하루 정도 행하면 좋다. 혼성화 반응 후, 세정을 행한다. 세정에는, 예를 들면 이온 강도가 0.01 내지 5의 범위이고, pH가 5 내지 10의 범위인 완충액을 사용한다.
형광 검출의 경우, 혼성화 반응의 검출은 표지의 종류에 따라 적절한 검출 장치를 사용하여 시료 중의 표지된 염기 서열 또는 2차 프로브 중의 표지를 검출함으로써 행한다. 표지가 형광 물질인 경우에는, 예를 들면 형광 검출기를 사용하여 표지를 검출할 수 있다.
또한, 상술한 바와 같은 본 발명의 핵산 프로브를 사용하는 임의의 표적 핵산 또는 표적 서열의 존재를 검출하는 방법도 본 발명의 범위내에 있다.
특히, 상술한 바와 같은 X와 Y의 관계를 얻기 위한 프라이머를 사용하여 시료 핵산을 증폭하고, 얻어진 증폭 산물을 본 발명의 실시양태에 따라 핵산 프로브 고정화 기체에 고정화된 핵산 프로브와 반응시켜 발생된 혼성화를 검출하고 표적 핵산의 존재를 검출함으로써, 더욱 바람직한 혼성화 효율을 얻을 수 있다. 이와 같은 방법도 본 발명에 포함된다. 또한, 이와 같은 방법에서 이용할 수 있는 증폭법에는, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응 (일반적으로 PCR이라고 하며, 이하 PCR이라고 약칭함) 등의 증폭이나, 역전사 효소를 사용하는 역전사 증폭 등의 역전사 PCR이나, 이 이외에 자체로 공지된 증폭이면 어느 것도 포함된다.
본 발명의 실시양태에 따라서 사용할 수 있는 증폭에는, 예를 들면 핵산 가닥-기재 증폭 (Nucleic acid strand-based amplification; NASBA), 전사 매개 증폭 (Transcription mediated amplification; TMA), 리가아제 연쇄 반응 (Ligase chain reaction; LCR), 가닥 치환 증폭 (Strand displacement amplification; SDA), 등온 및 키메라 프라이머-개시 핵산 증폭 (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids; ICAN), 롤링 써클 증폭 (Rolling circle amplification; RCA) 등의 증폭법이 있다.
본 발명의 실시양태에 따른 핵산 해석 방법은, 샘플 중에 포함되는 검체 핵산의 해석, 예를 들면 표적 서열의 존재 검출 및 정량, 유전자 발현의 출현 소실 등의 발현 해석, 게놈에 있어서의 단염기다형 (Single Nucleotide Polymorphism, 즉, SNP)이나 마이크로세텔라이트 (microsatellite) 서열 등의 다형 해석, 질환 관련 유전자 해석에 의한 질환의 진단이나 발증의 위험율 예측, 감염의 존재 검출, 바이러스형의 해석, 및 독성 시험 등을 실시하는 경우 등에 이용할 수 있다. 따라서, 임상적인 진단이나 발증 예측 등의 여러 가지 임상적 목적을 위해 이용할 수 있다. 또한, 예를 들면 식품 검사, 검역, 의약품 검사, 법의학, 농업, 축산, 어업 및 임업 등, 여러 가지 기초적 연구 및 응용 연구 등에 광범위하게 이용할 수 있다.
이하에, 본 발명에 의한 핵산 검출 방법의 실시예를 설명한다.
본 실시예는 핵산 프로브의 스페이서 길이 (X)와 표적 핵산에 있어서 핵산 프로브 결합 부위로부터 그 기체측의 말단까지의 길이 (Y)와의 관계와, 혼성화 효율 정도의 관계를 조사한 것이다.
(1) 핵산 프로브와 표적 핵산의 관계
본 실시예에서 사용한 핵산 프로브와 표적 핵산과의 관계를 도 4에 나타내었다. 핵산 프로브와 표적 핵산의 상세한 서열은 후술하지만, 우선 이들의 대략적인 구성과 상관성에 대해서 설명한다.
도 4는 핵산 프로브 C-0, 핵산 프로브 C-10, 핵산 프로브 C-20 및 핵산 프로브 C-30과, 표적 핵산 70-0, 표적 핵산 70-20 및 표적 핵산 70-40을 함께, 20 염기인 표적 서열 및 표적 서열에 상보적인 서열을 기준으로 병기한 도면이다.
여기에서 사용한 핵산 프로브는 4종류이다. 핵산 프로브의 표적 서열에 상보적인 서열은 20 염기이고, 도 4에서는 사선으로 표시된 부분에 상당한다.
핵산 프로브 C-0은 그 5' 말단에 스페이서를 붙이지 않는다.
핵산 프로브 C-10은 그 5' 말단에 시토신 10 염기로 이루어딘 스페이서 X1이 붙어 있다.
핵산 프로브 C-20은 그 5' 말단에 시토신 20 염기로 이루어진 스페이서 X2가 붙어 있다.
핵산 프로브 C-30은 그 5' 말단에 시토신 30 염기로 이루어진 스페이서 X3이 붙어 있다. 이러한 4종류의 핵산 프로브는 스페이서 이외에 관해서는 동일하다. 또한, 이러한 핵산 프로브는 어느 것이든 5' 말단을 기체에 고정화시킨다.
여기에서 사용된 표적 핵산은 3종류이다. 이들 3종류의 표적 핵산이 구비하는 표적 서열은 길이가 동일하게 20 염기이다. 도 4에서, 표적 서열은 ×표 부분에 상당한다. 3종류의 표적 핵산에 포함되는 표적 서열의 염기 서열은 동일하다.
표적 핵산 70-0은 전체 길이가 70 염기인 핵산이고, 그 3' 말단에 20 염기의 표적 서열이 존재한다.
표적 핵산 70-20은 전체 길이가 70 염기인 핵산이다. 표적 서열의 5'측에는 30 염기가 존재하며, 표적 서열의 3'측에는 20 염기의 서열 Y1이 존재한다.
표적 핵산 70-40은 전체 길이가 70 염기인 핵산이다. 표적 서열의 5'측에는 10 염기가 존재하며, 표적 서열의 3'측에는 40 염기의 서열 Y2가 존재한다.
(2) 핵산 프로브
핵산 프로브에 포함되는 표적 서열에 상보적인 서열은 20 염기이다. 핵산 프로브 C-0, C-10, C-20, C-30은 상기 20 염기의 핵산 프로브 서열의 5' 말단에 각각 C (즉, 시토신) 0 염기, 10 염기, 20 염기 및 30 염기를 스페이서로서 부가한 프로브이다. 서열은 이하와 같다.
C-O : 5'-SH-TGGACGAAGACTGACGCTC-3'(서열 1)
C-1O : 5'-SH-(C10)TGGACGAAGACTGACGCTC-3'(서열 2)
C-2O : 5'-SH-(C20)TGGACGAAGACTGACGCTC-3'(서열 3)
C-3O : 5'-SH-(C30)TGGACGAAGACTGACGCTC-3'(서열 4)
상기 4종류의 프로브, 즉, C-0, C-10, C-20 및 C-30의 5'말단에는 티올기가 수식되어 있다. 또한, 핵산 프로브 C-0, C-10, C-20, C-30의 X는, 각각 0 염기, 10 염기, 20 염기 및 30 염기이다.
(3) 표적 핵산
한편, 표적 핵산의 모델로서 상기 20 염기의 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 70 염기의 올리고뉴클레오티드를 준비하였다. 이 올리고뉴클레오티드는, 프로브 결합 부위의 말단에서 3' 말단까지의 길이가 0 염기, 20 염기, 40 염기인 3종류이다. 각각의 서열은 이하에 나타낸 바와 같다.
표적 핵산 70-0 (서열 5):
5'CTATAAACATGCTTTCCGTGGCAGTGAGAACAAATGGGACCGTGCATTGC(GAGCGTCAGTCTTCGTCC AG)
표적 핵산 70-20 (서열 6):
5'CTATAAACATGCTTTCCGTGGCAGTGAGAA(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)CAAATGGGACCGTGCATTGC
표적 핵산 70-40 (서열 7):
5'CTATAAACAT(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)GCTTTCCGTGGCAGTGAGAACAAATGGGACCGTGCATTGC
인데, 괄호 "()" 사이에 있는 서열이 프로브 결합 부위이고, 5' 말단에는 형광 색소가 표지되어 있다. 이러한 표적 핵산인 서열 5, 서열 6 및 서열 7의 Y는 각각 0 염기, 20 염기 및 40 염기이다.
(4) 핵산 프로브의 고정화
본 실시예에서는 기체로서 금 기판을 사용하였다. 금 기판을, 핵산 프로브 C-0, C-10, C-20 및 C-30을 각각 포함하는 완충액에 침지하여, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후, 증류수로 세정하여 건조시킴으로써 핵산 프로브 고정화 금 기판을 제조하였다.
(5) 표적 핵산의 혼성화
3종류의 표적 핵산을 각각 포함하는 완충액을 95 ℃에서 5 분에 걸쳐 열변성시켰다. 그 후, 얼음속에서 급냉시켜 표적 핵산 용액으로 하였다. 이 표적 핵산 용액에 각 핵산 프로브를 고정화시킨 핵산 프로브 고정화 금 기판을 침지하였다. 이것을 35 ℃에서 1 시간 정치하였다. 그 후, 상기 한 핵산 프로브 고정화 금 기판을 어떤 핵산도 포함하지 않은 완충액에 침지하고, 35 ℃에서 1 시간 정치한 후, 세정하였다.
(6) 혼성화된 표적 핵산의 검출
표적 핵산의 5' 말단에 수식한 형광 색소에서 유래하는 형광 강도를 검출함으로써, 해당 고정화된 핵산 프로브에 대하여 혼성화된 표적 핵산의 존재를 검출하였다.
(7) 결과
(i) 표적 핵산 70-0을 사용한 경우
표적 핵산 70-0을 사용한 경우의 결과를 도 6에 나타낸다. 표적 핵산 70-0과 핵산 프로브 C-0, C-10, C-20 및 C-30의 결합 상태를 도 6A에 모식적으로 나타낸다. 모든 핵산 프로브의 경우에 X≥Y이다. 또한, 이 때, 도 6B에 나타낸 바와 같이 각각의 핵산 프로브 C-0, 핵산 프로브 C-10, 핵산 프로브 C-20, 핵산 프로브 C-30과 혼성화된 표적 핵산 70-0의 양이 거의 동일한 정도임을 검출된 형광 강도로부터 알 수 있었다.
(ii) 표적 핵산 70-20을 사용한 경우
표적 핵산 70-20을 사용한 경우의 결과를 도 7에 나타낸다. 표적 핵산 70-20과 핵산 프로브 C-0, C-10, C-20 및 C-30의 결합 상태를 도 7A에 모식적으로 나타낸다. 핵산 프로브 C-0 및 C-10에서는 X<Y이고, 핵산 프로브 C-20에서는 X=Y이며, 핵산 프로브 C-30에서는 X>Y이다.
또한, 이 때 검출된 형광 강도는 도 7B에 나타낸 바와 같이, 핵산 프로브의 스페이서의 길이에 의존적으로 강해졌다. 마찬가지로, 해당 스페이서의 길이에 의존적으로 표적 핵산 70-20의 혼성화 양이 증가하고, 핵산 프로브 결합 부위로부터 표적 핵산의 3' 말단까지의 염기수와 동일한 시토신 20 염기 (즉, C20)의 스페이서를 포함하는 핵산 프로브를 사용하였을 때에 형광 강도가 최대가 되어, 그 이상의 염기를 포함하는 스페이서를 사용한 경우와 비교하여 거의 동일한 정도였다 (도 7B).
iii) 표적 핵산 70-40을 사용한 경우
표적 핵산으로서 표적 핵산 70-40을 사용한 경우, 표적 핵산 70-20과 핵산 프로브 C-0, C-10, C-20 및 C-30의 결합 상태를 도 8A에 모식적으로 나타낸다. 모든 핵산 프로브의 경우에 X<Y이다. 이 때, 각 핵산 프로브와 혼성화된 표적 핵산은, 어느 경우에서도 거의 동일한 정도였으며, 혼성화 효율은 낮았다 (도 8B).
(iv) 결과의 종합
이상의 결과로부터, 핵산 프로브를 고상 담체에 결합시킬 때 사용하는 스페이서의 길이 (X)와, 상기 핵산 프로브에 대하여 표적 서열을 그 일부에 포함하는 표적 핵산이 혼성화되었을 때 해당 혼성화 부위의 기체측 말단으로부터 상기 표적 핵산의 기체측 말단까지의 길이 (Y)와의 사이에 X≥Y의 관계가 성립되는 경우에 혼성화 효율이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 혼성화 효율의 향상에 의해, 더욱 높은 정밀도로 표적 핵산의 존재를 검출하는 것이 가능해진다.
(8) 프라이머를 사용한 시료 핵산의 증폭에 의한 조절 1
본 발명의 한층 더 발전된 실시양태에 따르면, 상술한 바와 같은 본 발명의 실시양태에 따른 핵산 프로브 고정화 기체와 시료 핵산을 반응시키기 전에, 바람직한 표적 핵산을 얻을 수 있는 핵산 프로브를 사용하여 시료 핵산을 증폭하는 공정을 구비한 방법이 제공된다. 이와 같은 핵산 프로브는, 표적 핵산이 표적 서열을 통해 핵산 프로브와 혼성화시에, 해당 표적 서열 부위의 기체측 말단부로부터 약 40 염기 이내, 바람직하게는 약 26 염기 내지 약 12 염기에 상기 표적 핵산의 말단이 위치하도록 시료 핵산을 증폭하기 위한 프라이머이면 바람직하다.
도 9는 본 발명의 한층 더 발전된 실시양태에 관한 증폭 단편과 핵산 프로브와의 관계를 나타낸 도면이다. 여기에서는, 인간 게놈 중의 MxA 유전자를 검출하기 위한 시스템을 나타낸다. 도 9에는 서열 8의 핵산 프로브와 2종의 PCR 산물을 나타내었다. 서열 8의 핵산 프로브는 20 염기의 스페이서 부분 (도면 중, "스페이서-20"이라고 함)을 갖고 있다. PCR 산물 A (이하 "A"라고 함)는 5' 말단을 바이오틴화시킨 서열 9의 염기 서열에 나타낸 프라이머와, cy5 표지된 서열 10의 염기 서열에 나타낸 프라이머를 사용하여 제조하였다. PCR산물 B (이하 "B"라고 함)는 5' 말단을 바이오틴화시킨 서열 11의 염기 서열에 나타낸 프라이머와, cy5 표지된 서열 12의 염기 서열에 나타낸 프라이머를 사용하여 제조하였다.
단일쇄의 제조는 아비딘 표지 자기 미립자를 사용하여 행하였다. 도 9에서 A는 핵산 프로브 결합 부위의 말단에서의 거리가 12 염기 (도면에서 "12 mer"라고 함)이고, B는 26 염기 (도면에서 "26 mer"라고 함)이다. 이 표적을 사용하여 혼성화 반응을 행한 후, 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, A는 B의 약 10배에 해당하는 형광 강도를 나타내었다 (도 10).
또한, B는 약 1 시간 후에 반응이 거의 포화에 도달한 데 비하여, A는 약 10분 후에 반응이 포화에 도달하였다. 또한, SNP 검출의 특이성을 조사한 결과, A와 B 사이에서 S/N이 약 2배 달라져 있었다.
(9) 프라이머를 사용한 시료 핵산의 증폭에 의한 조절 2
도 11은 본 발명의 한층 더 발전된 실시양태에 따른 증폭 단편과 프로브와의 관계를 나타낸 도면이다. 도 11에서는 인간 게놈 중 MBL 유전자의 다형을 결정하기 위해서 증폭하여 얻은 증폭 산물과 핵산 프로브의 예에 대한 결과를 나타낸다. 도 11에서 서열 13의 염기 서열로 표시되는 핵산 프로브와, 3종의 PCR 산물을 나타내었다. PCR 산물 C (이하 "C"라고 함)는 5' 말단을 인산화시킨 서열 14의 염기 서열로 표시되는 프라이머와, cy5 표지된 서열 15의 염기 서열로 표시되는 프라이머를 사용하여 제조하였다. PCR산물 D (이하 "D"라고 함)는 5' 말단을 인산화시킨 서열 16의 염기 서열로 표시되는 프라이머와, cy5 표지된 서열 15의 염기 서열로 표시되는 프라이머를 사용하여 제조하였다. PCR 산물 E (이하 "E"라고 함)는 5' 말단을 인산화시킨 서열 18의 염기 서열로 표시되는 프라이머와, cy5 표지된 서열 17의 염기 서열로 표시되는 프라이머를 사용하여 제조하였다. 또한, PCR 산물의 핵산 프로브 결합 부위의 말단에서의 거리가 40 염기인 프라이머도 사용하였다. 단일쇄의 제조는 λ뉴클레아제를 사용하여 행하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이 PCR 산물은 각각, C는 프로브 결합 부위의 말단에서의 거리가 13 염기(도면에서 "13 mer"라고 함)이고, D는 33 염기 (도면에서 "33 mer"라고 함)이며, E는 48 염기(도면에서 "48 mer"라고 함)이다. 또한 도시하지는 않았지만, 프로브 결합 부위의 말단에서의 거리가 40 염기인 PCR 산물도 얻었다. 이러한 표적을 사용하여 혼성화 반응을 행한 후, 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, C는 D의 약 6배, E의 약 40배에 해당하는 형광 강도를 나타내었다 (도 12).
또한, 도 13에는 전기 화학적인 수법에 의한 MBL 검출 시스템의 검출 결과를 나타내었다. 각각의 표적과 혼성화 반응 후, 획스트 33258의 전류를 측정하였다. 그 결과, 표적 C는 D의 약 3배, E의 10 배 이상에 해당하는 전류치를 나타내었다.
이상의 결과로부터, 프라이머의 3' 말단이 핵산 프로브의 결합 부위 중심에서 40 염기 이상만큼 떨어진 부위에 위치하면 혼성화 효율이 대폭 저하되는 것을 알 수 있었다. 또한, 특이성도 저하되는 현상이 나타났기 때문에, 고속, 고선택성, 고감도로 핵산 검출을 행하기 위해서는 핵산 프로브의 결합 부위 중심에서 40 염기 이내에 위치하는 프라이머를 사용하여 증폭하는 것이 중요하다.
상술한 바와 같은 본 발명에 의해, 검출 감도 및 특이성이 높은 핵산 서열 검출 방법, 및 그 방법에 사용하는 프라이머가 제공되었다.
또한, 장점 및 변경은 당업자에 의해서 쉽게 발견될 것이다. 따라서, 그 광범위한 측면에 있어서, 본 발명은 여기에 나타낸 상세한 설명 및 전형적인 실시양태로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 첨부된 청구의 범위 및 그 균등물에 의해 명시되는 전반적인 발명 사상의 정신 또는 범위에서 일탈되지 않고, 여러 가지 변경이 가능하다.
<110> KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA TAKAHASHI, Masayoshi OKADA, Jun HASHIMOTO, Koji <120> The nucleic acids probe immobilized substrate and Method for detecting of nucleic acid with it <130> 02S1022P <150> JP 2002-218644 <151> 2002-7-26 <160> 18 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> E. Coli <400> 1 TGGACGAAGA CTGACGCTC 19 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <400> 2 CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 29 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <400> 3 CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 39 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> artificial <400> 4 CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 45 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> artificial <400> 5 CTATAAACAT GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA CAAATGGGAC CGTGCATTGC GAGCGTCAGT 60 CTTCGTCCAG 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> artificial <400> 6 CTATAAACAT GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA GAGCGTCAGT CTTCGTCCAG CAAATGGGAC 60 CGTGCATTGC 70 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> artificial <400> 7 CTATAAACAT GAGCGTCAGT CTTCGTCCAG GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA CAAATGGGAC 60 CGTGCATTGC 70 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 8 CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GTTTCTGCTC CCGGA 35 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapience <400> 9 GAGCTAGGTT TCGTTTCTGC 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> homo sapience <400> 10 GGCCTCCGCT CTCGCTTCGC CT 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> homo sapience <400> 11 AGGTGCGGGG CCAGGAGCTA GG 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapience <400> 12 TCCGCTCTCG CTTCGCCTCT 20 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 13 CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CTTGGTGTCA TCACG 35 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapience <400> 14 CCCCCTTTTC TCCCTTGGTG 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapience <400> 15 TGTGAGGATG CCCAAAAGAC 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapience <400> 16 AGCCCAACAC GTACCTGGTT 9 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapience <400> 17 TTGCCTGTAG CTCTCCAGGC 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapience <400> 18 TTGCAGAGAC AGAACAGCCC 20

Claims (20)

  1. 기체 (基體), 및 상기 기체에 스페이서를 통해 고정화되고 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산 프로브를 구비하며,
    상기 스페이서의 길이를 X로 하고, 상기 핵산 프로브에 대하여 상기 표적 서열을 그 일부에 포함하는 표적 핵산이 혼성화할 때에 해당 혼성화 부위의 기체측 말단으로부터 상기 표적 핵산의 기체측 말단까지의 길이를 Y로 한 경우에, 상기 스페이서가 X≥Y의 관계가 성립하는 스페이서인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y이며, Y≥10 Å인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y이고, Y≥10 Å이며, X-10 Å≥Y인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y이고, Y≥10 Å이고, X-10 Å≥Y이며, 200 Å≥X인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y이고, Y≥10 Å이고, X-10 Å≥Y이고, 200 Å≥X이며, X≥100 Å인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y이고, Y≥10 Å이고, X-10 Å≥Y이며, 100 Å≥X인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y이며, 10 Å≥Y인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 스페이서가 유기쇄형 분자인 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 스페이서가 핵산, 에틸렌 글리콜 및 알칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 기체가 전기 화학적 검출을 행할 수 있는 전극을 구비하며, 상기 전극에 해당 핵산 프로브가 스페이서를 통해 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  11. 제8항에 있어서, 상기 기체가 전기 화학적 검출을 행할 수 있는 전극을 구비하며, 상기 전극에 해당 핵산 프로브가 스페이서를 통해 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  12. 제9항에 있어서, 상기 기체가 전기 화학적 검출을 행할 수 있는 전극을 구비하며, 상기 전극에 해당 핵산 프로브가 스페이서를 통해 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 프로브 고정화 기체.
  13. 시료 핵산을, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y가 성립하도록 선택된 프라이머를 사용하여 증폭하는 공정,
    적절한 혼성화가 얻어지는 조건하에서, 상기 증폭에 의해 얻어진 증폭 산물을 제1항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체에 고정화된 핵산 프로브와 반응시키는 공정, 및
    상기 반응시킨 공정에 의해 발생한 혼성화를 검출함으로써, 시료 핵산 중에 표적 핵산이 존재하는 것을 판정하는 공정
    을 구비하는, 제1항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  14. 시료 핵산을, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y가 성립하도록 선택된 프라이머를 사용하여 증폭하는 공정,
    적절한 혼성화가 얻어지는 조건하에서, 상기 증폭에 의해 얻어진 증폭 산물을 제8항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체에 고정화된 핵산 프로브와 반응시키는 공정, 및
    상기 반응시킨 공정에 의해 발생한 혼성화를 검출함으로써, 시료 핵산 중에 표적 핵산이 존재하는 것을 판정하는 공정
    을 구비하는, 제8항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  15. 시료 핵산을, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y가 성립하도록 선택된 프라이머를 사용하여 증폭하는 공정,
    적절한 혼성화가 얻어지는 조건하에서, 상기 증폭에 의해 얻어진 증폭 산물을 제9항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체에 고정화된 핵산 프로브와 반응시키는 공정, 및
    상기 반응시킨 공정에 의해 발생한 혼성화를 검출함으로써, 시료 핵산 중에 표적 핵산이 존재하는 것을 판정하는 공정
    을 구비하는, 제9항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  16. 시료 핵산을, 상기 X와 Y의 관계가 X≥Y가 성립하도록 선택된 프라이머를 사용하여 증폭하는 공정,
    적절한 혼성화가 얻어지는 조건하에서, 상기 증폭에 의해 얻어진 증폭 산물을 제10항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체에 고정화된 핵산 프로브와 반응시키는 공정, 및
    상기 반응시킨 공정에 의해 발생한 혼성화를 검출함으로써, 시료 핵산 중에 표적 핵산이 존재하는 것을 판정하는 공정
    을 구비하는, 제10항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  17. (a) 해당 표적 핵산이 표적 서열을 통해 핵산 프로브와 혼성화시에, 해당 표적 서열 부위의 기체측 말단부로부터 40 염기 이내에 상기 표적 핵산의 말단이 위치하도록 해당 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 준비하는 단계,
    (b) 상기 (a)에서 준비된 프라이머를 사용하여 시료 핵산을 증폭하는 단계,
    (c) 상기 (b)에서 얻어진 증폭 산물을 단일쇄로 만드는 단계,
    (d) 상기 (c)에서 얻어진 단일쇄를 상기 핵산 프로브와 반응시키는 단계, 및
    (e) 상기 (d)에서 발생된 혼성화를 검출함으로써, 해당 시료 핵산 중 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계
    를 구비하는, 기체, 및 상기 기체에 고정화되고 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 프로브를 구비하는 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 해당 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  18. (a) 해당 표적 핵산이 표적 서열을 통해 핵산 프로브와 혼성화시에, 해당 표적 서열 부위의 기체측 말단부로부터 40 염기 이내에 상기 표적 핵산의 말단이 위치하도록 해당 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 준비하는 단계,
    (b) 상기 (a)에서 준비된 프라이머를 사용하여 시료 핵산을 증폭하는 단계,
    (c) 상기 (b)에서 얻어진 증폭 산물을 단일쇄로 만드는 단계,
    (d) 상기 (c)에서 얻어진 단일쇄를 상기 핵산 프로브와 반응시키는 단계, 및
    (e) 상기 (d)에서 발생된 혼성화를 검출함으로써, 해당 시료 핵산 중 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계
    를 구비하는, 제1항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 해당 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  19. (a) 해당 표적 핵산이 표적 서열을 통해 핵산 프로브와 혼성화시에, 해당 표적 서열 부위의 기체측 말단부로부터 40 염기 이내에 상기 표적 핵산의 말단이 위치하도록 해당 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 준비하는 단계,
    (b) 상기 (a)에서 준비된 프라이머를 사용하여 시료 핵산을 증폭하는 단계,
    (c) 상기 (b)에서 얻어진 증폭 산물을 단일쇄로 만드는 단계,
    (d) 상기 (c)에서 얻어진 단일쇄를 상기 핵산 프로브와 반응시키는 단계, 및
    (e) 상기 (d)에서 발생된 혼성화를 검출함으로써, 해당 시료 핵산 중 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계
    를 구비하는, 제8항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 해당 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  20. (a) 해당 표적 핵산이 표적 서열을 통해 핵산 프로브와 혼성화시에, 해당 표적 서열 부위의 기체측 말단부로부터 40 염기 이내에 상기 표적 핵산의 말단이 위치하도록 해당 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 준비하는 단계,
    (b) 상기 (a)에서 준비된 프라이머를 사용하여 시료 핵산을 증폭하는 단계,
    (c) 상기 (b)에서 얻어진 증폭 산물을 단일쇄로 만드는 단계,
    (d) 상기 (c)에서 얻어진 단일쇄를 상기 핵산 프로브와 반응시키는 단계, 및
    (e) 상기 (d)에서 발생된 혼성화를 검출함으로써, 해당 시료 핵산 중 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계
    를 구비하는, 제10항에 기재된 핵산 프로브 고정화 기체를 사용하여 해당 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
KR10-2002-7012456A 2002-07-26 2002-08-28 핵산 프로브 고정화 기체 및 그것을 이용한 표적 핵산의존재를 검출하는 방법 Expired - Fee Related KR100482718B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002218644 2002-07-26
JPJP-P-2002-00218644 2002-07-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20040037015A KR20040037015A (ko) 2004-05-04
KR100482718B1 true KR100482718B1 (ko) 2005-04-13

Family

ID=31184686

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-7012456A Expired - Fee Related KR100482718B1 (ko) 2002-07-26 2002-08-28 핵산 프로브 고정화 기체 및 그것을 이용한 표적 핵산의존재를 검출하는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20040086856A1 (ko)
EP (1) EP1586639A4 (ko)
JP (1) JP4301941B2 (ko)
KR (1) KR100482718B1 (ko)
CN (2) CN100480384C (ko)
WO (1) WO2004011643A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005011350A1 (de) * 2005-03-11 2006-09-14 Eppendorf Ag CDNA Microarrays mit Zufallsspacern
JP5092405B2 (ja) * 2006-01-12 2012-12-05 東レ株式会社 選択結合性物質固定化担体
AR059361A1 (es) * 2006-02-07 2008-03-26 Antara Biosciences Inc Dispositivo y metodos para detectar y cuantificar uno o mas agentes objetivos
JP4957063B2 (ja) * 2006-04-24 2012-06-20 ソニー株式会社 検出表面へのプローブ核酸の固定方法
GB0701444D0 (en) * 2007-01-25 2007-03-07 Iti Scotland Ltd Detecting analytes
JP4580996B2 (ja) * 2008-02-27 2010-11-17 株式会社東芝 標的核酸の検出方法および標的核酸検出用基体
JP6862502B2 (ja) * 2019-07-16 2021-04-21 株式会社東芝 核酸検出方法及びアッセイキット
KR102365010B1 (ko) * 2020-07-30 2022-02-21 주식회사 진시스템 멀티플렉스 pcr 칩 및 이를 이용한 멀티플렉스 pcr 방법
WO2023023737A1 (en) * 2021-08-23 2023-03-02 Universal Biosensors Pty Ltd Electrochemical sensors

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4775619A (en) * 1984-10-16 1988-10-04 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US4824776A (en) * 1985-07-25 1989-04-25 Molecular Biosystems, Inc. Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays
US5541308A (en) * 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
JP2897959B2 (ja) * 1988-05-20 1999-05-31 エフ．ホフマン―ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト 固定化された配列特異的プローブ
US5776672A (en) * 1990-09-28 1998-07-07 Kabushiki Kaisha Toshiba Gene detection method
EP0511559A1 (en) * 1991-04-30 1992-11-04 F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Oligonucleotide probe reagent
JPH0698797A (ja) * 1992-09-22 1994-04-12 Toyobo Co Ltd 核酸検出法
US6048698A (en) * 1994-09-20 2000-04-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel SELEX™
US5747248A (en) * 1994-12-05 1998-05-05 Chiron Corporation Discontinuous probe design using hybritope mapping
US5612473A (en) * 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US6090549A (en) * 1996-01-16 2000-07-18 University Of Chicago Use of continuous/contiguous stacking hybridization as a diagnostic tool
US5824478A (en) * 1996-04-30 1998-10-20 Vysis, Inc. Diagnostic methods and probes
US6221586B1 (en) * 1997-04-09 2001-04-24 California Institute Of Technology Electrochemical sensor using intercalative, redox-active moieties
US6238869B1 (en) * 1997-12-19 2001-05-29 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system
US6063573A (en) * 1998-01-27 2000-05-16 Clinical Micro Sensors, Inc. Cycling probe technology using electron transfer detection
US6290839B1 (en) * 1998-06-23 2001-09-18 Clinical Micro Sensors, Inc. Systems for electrophoretic transport and detection of analytes
DE19964220C2 (de) * 1998-11-23 2003-07-03 Friz Biochem Gmbh Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche
DE19921940C2 (de) * 1998-11-23 2003-02-06 Friz Biochem Gmbh Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomerhybriden
AU2965500A (en) * 1999-01-15 2000-08-01 Gene Logic, Inc. Immobilized nucleic acid hybridization reagent and method
US7205104B2 (en) * 2000-03-24 2007-04-17 Eppendorf Array Technologies Sa (Eat) Identification of biological (micro) organisms by detection of their homologous nucleotide sequences on arrays
JP2001269197A (ja) * 2000-03-27 2001-10-02 Toyobo Co Ltd 固定化オリゴヌクレオチドプローブ

Also Published As

Publication number Publication date
JP4301941B2 (ja) 2009-07-22
CN100480384C (zh) 2009-04-22
US20090075275A1 (en) 2009-03-19
CN101307363A (zh) 2008-11-19
EP1586639A4 (en) 2007-09-19
KR20040037015A (ko) 2004-05-04
JPWO2004011643A1 (ja) 2005-11-24
CN1531593A (zh) 2004-09-22
WO2004011643A1 (ja) 2004-02-05
EP1586639A1 (en) 2005-10-19
US20040086856A1 (en) 2004-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6461820B1 (en) Electrochemical sensor using intercalative, redox-active moieties
CA2616259C (en) Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection
US20030077609A1 (en) Modified oligonucleotides and uses thereof
US7202037B2 (en) Electrochemical sensor using intercalative, redox-active moieties
US20090075275A1 (en) Nucleic acid probe-immobilized substrate and method of detecting the presence of target nucleic acid by using the same
EP1975249A2 (en) Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of N-acetyltransferase 2 (NAT2)
US7361470B2 (en) Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection
US20020182606A1 (en) Detection of single nucleotide polymorphisms
WO2004099755A2 (en) Method of electrochemical detection of somatic cell mutations
JP3917640B2 (ja) 核酸プローブ固定化基体を用いた標的核酸の存在を検出する方法
JP3790194B2 (ja) 核酸プローブ固定化基体
JP4012008B2 (ja) 複数のターゲット配列を含むターゲット核酸を検出する方法
JP2007325600A (ja) ターゲット核酸の反復数を決定するための方法
JP2004041109A (ja) 核酸検出方法およびそれに使用されるプライマー
JP2004073065A (ja) 核酸断片、核酸プローブ固定化基体およびアッセイキット
JP2004065125A (ja) ターゲット核酸の反復数を決定するための方法
AU2002312155A1 (en) Detection of single nucleotide polymorphisms
EP1620575A2 (en) Method of electrochemical detection of somatic cell mutations

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0105 International application

Patent event date: 20020919

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PA0201 Request for examination
PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20040831

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20050223

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20050401

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20050404

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20080327

Start annual number: 4

End annual number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20090330

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20090330

Start annual number: 5

End annual number: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee
PC1903 Unpaid annual fee