JP4744910B2 - バイオセンサ、マルチバイオセンサ及びこれを用いた多成分測定システム - Google Patents

Description

本発明は、バイオセンサ及びこれを用いた多成分測定システムに関するもので、例えば抗原抗体反応を用いて野菜や果物などに残留する各種農薬を検出する場合、環境水や土壌中の微量な外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）を検出する場合、あるいは生体反応からの病症検知や診断をする場合などにおいて、高感度で、かつ簡便な測定方法として有用である。

近年、食品に対する安全意識の高まりから、農作物の残留農薬の有無あるいは残留量を検出する要求が高まっている。また、環境水や土壌など環境汚染に対する認識の高揚から、ダイオキシンやビスフェノールＡといった、いわゆる環境ホルモンによる汚染状況を正確に把握する必要が強まっている。

こうした測定には、従来より各種の測定方法が実施されているが、例えば残留農薬の検出に際しては、通常収穫した農産物の細砕等所定の前処理をしてその農作物の成分分析を行うことにより、農薬が含有されているか否かを検査する方法が多用されている。また、農産物を破壊することなく、その農産物に残留した農薬を検出することができる残留農薬検出方法が提案されている。具体的には、図１７に示すような検出方法の一形態が提示されている（例えば特許文献１参照）。

さらに、環境ホルモンの検出については、例えば、固定化女性ホルモン受容体を用いた検出方法として、図１８に示すように、固定化女性ホルモン受容体（固定化エストロゲン受容体等）１０２を充填した検出容器（微小セル等）１０１、該容器内を励起する光源１０３、励起後の検出容器内の蛍光強度を検出する検出器１０４からなり、ある濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記検出容器に導入した場合の蛍光強度Ｆ_０ と、試験すべき試料を混合した上記と同濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記検出容器に導入した場合の蛍光強度Ｆ_１ とを比較し、Ｆ_１ ＜Ｆ_０ であれば、上記試験すべき試料中に環境ホルモンが存在すると判断する分析方法が提案されている（例えば特許文献２参照）。
特開２００２−１３９４３７号公報 特開２００１−１１６７５３号公報

しかしながら、従来技術で述べた検出方法や検査システムでは、以下のような課題が生じることがある。

農産物を破壊することなく残留農薬を検出する方法による場合にあっては、測定手段が限定されることから、検出する農薬や試薬が制限されるという点や、特に低濃度の残留農薬は検出できないという点において問題がある。

吸光光度法を用いて検出する場合には、一般に発色剤等を添加する必要から試薬などの調整管理が煩雑となり、別途流路を有する分光光学系を必要とすることから装置の複雑化を招くという課題があった。さらに、発光量あるいは吸光量の検知に基く測定については、発光量や吸光量と濃度との関係を予め検証しておき、測定時に校正する必要があり、絶対的な濃度測定は難しいという課題があった。

また、農薬や環境ホルモンの存在量は、非常に低濃度レベルであり、高い精度の分析値を得ることができる検出感度の確保は非常に困難であり、また精度を上げるためには分析時間を大幅に増加させる必要がある。また、高い選択性を得ることが困難であることから、試料から測定成分を抽出し濃縮してから分析するという非常に煩雑な作業を必要とする。従って、各所の試料を分析する必要性が増えるにつれ、迅速かつ簡易で精度の高い分析装置の要請が非常に高まっている。

さらに、上述のような分析方法では、バッチ的に所定量の試料中の測定成分の濃度を分析することはできても、複数の物質を同時に分析することはできず、分析成分ごとに試料を準備する必要があり、時間的に作業も煩雑化するという課題があった。

そこで、本発明の目的は、上記のような問題点を解決し、測定対象の変更が容易で、汎用性が高く、高い測定精度を有するコンパクトかつ簡便なバイオセンサおよびこれを用いた多成分測定システムを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、以下に示すバイオセンサにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。

本発明は、バイオセンサであって、デバイスと、該デバイス表面に施した導電性薄膜と、該薄膜上に配され、被検体または被検体との結合体に対して選択的に結合を形成する生体分子と、を構成要素とし、前記生体分子の電位の変化を検出することを特徴とする。

従来、生体分子が化学的あるいは物理的現象に関与して生じる電位の変化は、非常に微小であり基準電位が不安定であることから、生体分子自体をあるいは生体分子を介して被検体を検出することは困難であるとされてきた。しかしながら、本発明者は、例えば金膜のような導電性薄膜の表面に、例えば蛋白質のような生体分子を物理吸着あるいは化学的に修飾した場合には、農薬などの特定の物質との接触あるいは結合によって検出可能な電位の変化が生じることを見出した。

研究の結果得られた知見に基づけば、導電性薄膜表面に生体分子を介在させることによって、生体分子が表面をカバーし外部からの影響を受けにくい状態を形成し安定化を図ることができるとともに、被検体の結合自体による電位の変化は僅かだが、被検体の結合による生体分子自体の変化に伴う電位の変化が大きくなる、つまり増幅作用を生じる、ためであると推考している。これによって、高い測定精度を有するコンパクトかつ簡便なバイオセンサを提供することが可能となった。また、導電性薄膜表面全体に多数の生体分子を配設することによって、二次元的な測定が可能となる。なお、ここでいう「生体分子」とは、抗原、抗体、蛋白質、レセプタ、ＤＮＡやＲＮＡ、ペプチド核酸、酵素、細胞などを広く一般に生体に関わるものいう。

本発明は、上記バイオセンサであって、前記生体分子が、蛋白質を主体とする生体分子によって形成されていることを特徴とする。

蛋白質は、アミノ酸がペプチド結合により多数繋がった生体高分子であり、化学的にはアミノ基およびカルボキシル基を有し、酸あるいは塩基との結合や共有結合を形成することが可能である。また、構造的には三次元の立体構造を有し、多数の分枝において種々の機能を付加することも可能である。さらに、複数で１つの機能を有する場合もあるとともに、１つのたんぱく質において複合した機能を有することも可能である。本発明は、このような生体分子の中でも、機能面で非常に柔軟性が高いたんぱく質の特性を利用したもので、導電性薄膜表面に生体分子を介在させることによって、測定対象の変更が容易で、汎用性が高く、高い測定精度を有するコンパクトかつ簡便なバイオセンサを提供することが可能となった。

本発明は、上記バイオセンサであって、前記生体分子が、複数の生体分子の結合体を主体とする生体分子によって形成されていることを特徴とする。特に、前記生体分子が、蛋白質とＤＮＡの結合体を主体とする生体分子によって形成されていることが好ましい。また、前記生体分子が、蛋白質とペプチド核酸（以下「ＰＮＡ」という。）の結合体を主体とする生体分子によって形成されていることが好ましい。

従来、ＤＮＡ単体は、先端部を特定分子あるいは特定の基に置き換える（修飾）ことによって特定の物質との特異的な結合を生じることが知られおり、修飾物を取り替えることによって、計測にも利用可能であり汎用的に使用することできる。しかし、例えばＤＮＡのように、構造的には二次元構造に近く、本発明において直接導電性薄膜表面に配設しても電位の変化が少なく、単独での利用は難しい生体分子もある。本発明者は、本発明に適用する生体分子について、このＤＮＡをたんぱく質と組み合わせることによって、ＤＮＡにおける電位の変化が蛋白質全体の変化を誘導し、非常に大きな電位の変化を生じることを見出した。さらに、たんぱく質の表面に多数のＤＮＡを配設することによって一層大きな信号量を得ることができるとともに、面全体として検出することによって、二次元的な測定が可能となる。

また、ＤＮＡと相補性を有するＰＮＡについても、たんぱく質と組み合わせることによって、ＰＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションによる電位の変化が蛋白質全体の変化を誘導し、非常に大きな電位の変化を生じることを見出し、ＤＮＡ同様、計測にも利用することが可能であり汎用的に使用することできることが分かった。

本発明は、上記バイオセンサであって、前記生体分子が、前記導電性薄膜と結合する、導電体からなる担体あるいは導電体を有する担体によって、担持されることを特徴とする。

上記の発明では、導電性薄膜上に直接生体分子を配設することを特徴の１つにしているが、本発明は、間接的に同様の条件を形成した場合についても同様の技術効果を得ることができることを見出した。つまり、導電性薄膜と結合する、導電体からなる担体あるいは導電体を有する担体を介して導電性薄膜上に配設することによって、バイオセンサの表面は、上記発明と同様の状態を保持することができるとともに、担体を交換可能な構造とすることで、測定対象の変更が容易で繰り返し測定可能なバイオセンサとすることができるという新たな技術的効果を創出することが可能となる。また、担体としてコロイド状の金などを用いた場合には点あるいは狭い領域での配設が可能となり、多様な用途に対応することができる。これによって、高い測定精度を有するコンパクトかつ簡便なバイオセンサの提供を可能とした。

本発明は、上記バイオセンサであって、前記デバイスが、ＭＯＳ形の電界効果型トランジスタ、イオン感応性電界効果型トランジスタまたはいわゆるケミカルＣＣＤを形成することを特徴とする。

本発明者は、上記のようなセンサ構造の形成が容易なデバイスとして、ＭＯＳ形の電界効果型トランジスタ（ＭＯＳ形ＦＥＴ）、イオン感応性電界効果型トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）、あるいはケミカルＣＣＤのいずれかを形成することが好適であることを案出したものである。つまり、ＭＯＳ形ＦＥＴでは、高い感応性を活かしながら、溶液中の生体分子自身の電位の変化あるいは生体分子と被検体との反応などによって生じる電位の変化情報を得ることができることから、高い検出感度を有するコンパクトなバイオセンサが可能となる。

また、ＩＳＦＥＴは、各種イオン濃度に対する高い感応性および特定イオンに対する高い選択性を有するという優れた特性を有する検出器であると同時に、電荷信号を精度よく取り出すデバイスとして非常に汎用性が高い。本発明はこうした特性を活かしながら、上記溶液中のイオン濃度の変化あるいは生体分子との反応などによって生じるイオン濃度の変化を、該生体分子を介して検出することで、微小濃度の被検体を簡易かつ高感度に分析することができる。

さらに、いわゆるケミカルＣＣＤはｐＨに対する高い感応性を有する検出器であると同時に、二次元的に電荷信号を取り出すデバイスとして非常に汎用性が高い。本発明はこうした特性を活かしながら、上記溶液中のイオン濃度の変化あるいは生体分子との反応などによって生じる溶液中のｐＨ変化を、該生体分子を介して検出することで、ｐＨ変化の二次元情報を得ることができることから、複数の成分分析など本発明の広い展開が可能となる。

本発明は、上記バイオセンサであって、特異性を有する生体分子と特異性の異なる生体分子の組合せ、特異性を有する生体分子と特異性を有しない生体分子の組合せ、特異性を有する生体分子と処理をしない生体分子の組合せ、異なる生体分子を担持した担体の組合せ、あるいは生体分子を担持した担体と担持していない担体との組合せ、のいずれかの組合せからなるデュアル構造を形成することを特徴とする。

こうしたデュアル構造を形成することによって、各生体分子あるいは担体の基準点の僅かな変化を相互に補完し合い、差量センサ出力を得ることができる。特に同じ構成からなる生体分子あるいは担体の組合せにおいては、同一試料を測定し、より一層補正精度の向上を図るとともに、センサ出力を絶対信号として取り扱うことが可能となる。

本発明は、マルチバイオセンサであって、上記いずれかに記載のバイオセンサを複数のセルに配することを特徴とする。

本発明に係るバイオセンサは、その汎用性の高さから複数の測定対象に対応することができるとともに、生体分子あるいは担体の交換が可能な構造を有するバイオセンサをマルチセル化することで、測定対象の追加・変更および測定項目の追加・変更が容易となり、従来困難であった多成分測定を可能とし、非常に汎用性の高いセンサを形成することが可能となる。

本発明は、多成分測定システムであって、上記いずれかに記載のバイオセンサを用い、複数のサンプルウェルを有するマイクロプレートを形成することを特徴とする。

上記のようなマルチ化されたバイオセンサの１つの実施の形態として、複数のサンプルウェルを有するマイクロプレートを形成することによって、迅速かつ簡易的な多成分の測定システムを可能したものである。これによって、従来のような使い捨てのウェルではなく、担体交換による非常に幅広い測定対象の追加・変更および測定項目の追加・変更が可能な測定システムを供給することができる。

以上のように、本発明におけるバイオセンサであっては、測定対象の変更が容易で、汎用性が高く、高い測定精度を有するコンパクトかつ簡便なバイオセンサおよびこれを用いた多成分測定システムを提供することができる。

特に、生体分子による平面的な検出端を形成することで、微小電位の増幅を図り、電位の安定性を確保することができるとともに、ＩＳＦＥＴあるいはケミカルＣＣＤを形成することによって複数の成分分析や２次元情報などが可能となり、非常に応用範囲の広いセンサを得ることができる。また、複数のサンプルウェルを有するマイクロプレートを形成することによって、迅速かつ簡易的な多成分の測定システムを可能したものである。

以下、本発明の実施の形態について説明する。

図１に、本発明にかかるバイオセンサの基本的な構成（第１構成例）を例示する。導電性薄膜２が施されたデバイス１の表面に、生体分子３として蛋白質が該導電性薄膜２と結合するように配置されている。デバイス１の他面には電極４が設けられ、導電性薄膜２と電極４間の電位差をポテンショメータ５で測定する構成が採られている。

このとき、導電性薄膜２と生体分子３とは同電位を保持しており、被検体中の測定対象物６と生体分子３との相互作用によって生じる電位の変化は、デバイス１における導電性薄膜２と電極４間の電位差の変化として捉えることができる。従って、ポテンショメータ５でその電位差の変化を測定することによって、測定対象物６の定量を行うことができる。また、生体分子３と測定対象物６との相互作用によって生じる電位差の変化量は、測定前に校正によってより精度を高くすることができる。また、両者を特定することによって理論的に求めることができる場合もあり、絶対的な濃度測定が可能となる。

つまり、本発明は、生体分子３と測定対象物６との相互作用によって生じる変化を、電荷を標識とするセンサによって測定することで、絶対的な濃度測定を可能とし、検出感度の向上および汎用性を確保するとともに、高い測定精度を有するコンパクトかつ簡便なバイオセンサの提供を可能とする。

また、生体分子３を導電性被膜２から遊離可能な構造とした場合には、生体分子３ごと交換が可能であり、繰り返し同一試料を測定する場合や、試料の変更あるいは測定対象物６を変更する場合には、バイオセンサの基本構成はそのままに、最小単位のみの交換で対応することが可能となる。

ここで、デバイス１としては、上記のポテンショメータに代え、ＭＯＳ形ＦＥＴ、ＩＳＦＥＴ、あるいはケミカルＣＣＤなどが挙げられる。各デバイスの詳細は、後述するが、基本的に電位の変化として検出でき、生体分子の配設ができれば、本発明のセンサデバイスとして使用することが可能である。

また、導電性薄膜２は、薄膜形成が容易で導電性を有し耐蝕性を有するものであれば、特に限定するものではないが、金属類、特に、金あるいは白金などの貴金属類あるいはチタンなどが有用である。膜厚は、特に制限はないが、加工面あるいは強度的な面を考慮すると、通常数μｍ程度を有することが好適である。

生体分子３は、上述の通り種々の生体に関わるものが利用可能であるが、導電性薄膜２をカバーし検出感度を確保する点においては、蛋白質を主体とする生体分子あるいは蛋白質とＤＮＡの結合体を主体とする生体分子や蛋白質とＰＮＡの結合体を主体とする生体分子などが好ましい。蛋白質としては、測定対象物６との結合性・特異性などの関係で選択され、例えば、農薬を対象とする場合にはアルブミンやカゼインなどが該当する。また、導電性被膜２への配設においては、物理吸着や化学的処理などによる結合が好ましい。

図２に、基本構成を用い、上記と異なる形態で測定対象物（農薬）６を測定する場合を例示する。測定対象物６と生体分子３が直接結合しないことから、生体分子３と結合可能な中間体（例えば抗体）７と測定対象物６との結合体の、生体分子３との結合を介して生体分子３の電位の変化を取出す方法である。生体分子３として蛋白質、抗体７として異なる蛋白質や蛋白質複合体（具体的には、酵素やレセプタなど）を用い、測定対象物６として農薬を示す。このとき、生体分子３は農薬６とは直接結合することはなく、抗体７とは特異的に結合する場合には、農薬６と抗体７との結合体が生体分子３に結合することによって、単に抗体７のみが結合した場合とは生体分子３の電位の変化量が異なる。従って、変化した電荷量を検出することによって農薬６の濃度を測定することができる
上記の基本的な構成における生体分子単体に代えて、複数種の生体分子の組み合わせをバイオセンサの生体分子として用いることも可能である。具体的には、蛋白質−蛋白質、蛋白質−レセプタ、蛋白質−抗原、蛋白質−抗体、蛋白質−ＤＮＡ／ＲＮＡ、蛋白質−ＰＮＡ、蛋白質−酵素、蛋白質−細胞、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡなどが挙げられる。

第２構成例として、蛋白質−ＤＮＡをバイセンサの生体分子とした場合を図３に示す。第１生体分子（蛋白質）３と第２生体分子（ＤＮＡ）８との結合体が、デバイス１の表面に導電性薄膜２と結合するように配置されている。被検体中の測定対象物（農薬）６がＤＮＡ８の先端部あるいは本体に修飾された部位と結合すると、ＤＮＡ８の電位の変化が生じると同時に、これに繋がる生体分子３において電位の変化が生じる。これをデバイス１における導電性薄膜２と電極４間の電位差の変化として捉えることができる。従って、ポテンショメータ５でその電位差の変化を測定することによって、測定対象物６の定量を行うことができる。

ここで、ＤＮＡに代えてＰＮＡを第２生体分子８とした場合についても、同様に、被検体中の測定対象物６の定量を行うことができる。後述する実施例２において、デバイス１の表面にプローブＰＮＡ分子を固定化した場合の詳細を示す。

図４に、本発明にかかるバイオセンサの他の構成例（第３構成例）を例示する。導電性薄膜２が施されたデバイス１の表面に、導電体からなる担体９が該導電性薄膜２と結合するように配置され、担体９の表面には生体分子３が担持されている。デバイス１の他面には電極４が設けられ、導電性薄膜２と電極４間の電位差をポテンショメータ５で測定する構成が採られている。

このとき、導電性薄膜２と担体９とは同電位を保持しており、測定対象物が生体分子３との相互作用によって生じる電位の変化は、デバイス１における導電性薄膜２と電極４間の電位差の変化として捉えることができる。従って、ポテンショメータ５でその電位差の変化を測定することによって、測定対象物６の定量を行うことができる。また、生体分子３と測定対象物６との相互作用によって生じる電位差の変化量は、両者を特定することによって理論的に求めることができ、絶対的な濃度測定が可能となる。むろん、測定前に校正によってより精度を高くすることができることはいうまでもない。

つまり、本発明は、生体分子３と測定対象物６との相互作用によって生じる変化を、電位の変化として検出するセンサによって測定することで、絶対的な濃度測定を可能とし、検出感度の向上および汎用性を確保するとともに、高い測定精度を有するコンパクトかつ簡便なバイオセンサの提供を可能とする。

また、担体９を導電性薄膜２から遊離可能な構造とした場合には、担体９に担持された生体分子３ごと交換が可能であり、繰り返し同一試料を測定する場合や、試料の変更あるいは測定対象物６を変更する場合には、バイオセンサの基本構成はそのままに、最小単位のみの交換で対応することが可能となる。

つまり、本発明は、センサデバイスの基準（導電体）と常に同電位を維持することができる構造を有し、かつ交換可能な構造を有する担体９を構成することで、測定対象の変更が容易で繰り返し測定可能なバイオセンサとすることができる。

例えば、抗原抗体反応を利用して外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）を測定対象物６とする場合には、生体分子３として環境ホルモン用抗体が用いられる。特定の環境ホルモン（抗原）６と反応する生体分子（抗体）３を担体９に担持した状態で、該抗原６の導入によって、抗原６と抗体４との反応により結合体が形成されると同時に、担体９の表面電位が変化し、導電性薄膜２と電極４間の電位差が変化することとなる。このとき、その電位差の変化量は抗原６の量すなわち被検体中の環境ホルモン６の濃度と一定の相関を有することから、ポテンショメータ５でその電位差の変化量を測定することによって、試料中の特定の環境ホルモンの濃度を検出することができる。

次に、同じ試料を繰り返し測定する場合、あるいは同じ環境ホルモン６を含む別の試料を測定する場合には、測定済の担体９を導電性薄膜２から取外し、前回と同じ構成を有する新たな担体９を導電性薄膜２に取り付けて、測定を行うことができる。また、上記と異なる環境ホルモンを６測定する場合には、それと反応する抗体を担持した担体９を導電性薄膜２に取り付けて、測定を行うことができる。

また、上記のような結合体の形成による電位差の変化が微小な場合にあっては、別途、抗原６と反応する標識物を加え、抗原６と標識物との結合体による生体分子３の電位の変化、あるいは抗原６と標識物との反応や結合によって発生する物質（イオンやアニオンを含む）による生体分子３の電位の変化として取り出す方法がある。

担体９は、生体分子３を担持しつつ導電性薄膜２と同電位を維持できるものであって、導電性薄膜２に嵌合あるいは結合しかつ取外し可能な構造を有するもので、例えば、金製の微小ディスク、あるいは金粒子の集合体や多孔質体などを挙げることができる。また、金の微粒子、金属のナノ粒子、カーボンナノチューブ、導電性微粒子、マルチビーズなどを用いることも可能である。さらには、担体自体が金属である必要はなく、樹脂の表面に金属をコーティングした担体などを使用することが可能である。

生体分子３としては、測定対象物７との相互作用によって、保持されている担体９に対し直接的あるいは間接的にその表面電位を変化させるものであれば、特に限定されるものではないが、測定対象物との関係において選択性および検出感度を考慮して設定される。具体的には、上記同様、たんぱく質や抗原、抗体、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＰＮＡ、酵素、細胞などを測定に利用することが可能である。

本発明において、センサデバイスとしていわゆるＭＯＳ形ＦＥＴを用いることが好適である（第４構成例）。ＭＯＳ形ＦＥＴは、図５に示したセンシング部１０に測定対象の化学物質が存在する場合、その物質濃度に応じた電気的なエネルギーレベルを表す電位が発生する。そこで、この電荷量を測定することにより化学物質の濃度を求めることができる。本発明に用いた場合には、センシング部１０に生体分子を配設することによって発生する電位の変化を検出することができる。この測定法による大きな特長としては、センシング部１０における電荷量の変化をソース拡散層Ｓとドレイン拡散層Ｄの間の電気伝導度の変化として捉えることから、両者の間の抵抗値が非常に小さく（数ｍ〜数Ω）、損失が小さくなるため、微小変化でも精度よく検知できることが挙げられる。また、ＭＯＳＦＥＴを駆動する回路の構成が簡単であり、マルチセンサの形成などにおける回路構成を、非常にコンパクトなものとすることが可能である。さらに、ＭＯＳＦＥＴを、ＩＣやＬＳＩと一体化処理して製造することができる点においても優れている。

また、センサデバイスとしてＩＳＦＥＴを用いることが好適である（第５構成例）。ＩＳＦＥＴは、図６に示すように、特殊な薄膜１１が、インピーダンス変換機能を果たす電界効果トランジスタに一体化された構造の半導体センサであり、化学修飾により様々なイオン検出が可能であるという優れた特性を有している。また、保守性に優れ、かつ小型化が可能であることから、本発明のセンサデバイスに非常に適している。従って、ＩＳＦＥＴの各種イオン濃度に対する高い感応性および特定イオンに対する高い選択性を活かしながら、測定対象物と生体分子の相互作用によって生じる生体分子の電位の変化としてＩＳＦＥＴによって検出することができる。また、導電体からなる担体あるいは導電体を有する担体を用いた場合には、担体表面の電位の変化を、担体表面と結合する同電位の導電体を介してＩＳＦＥＴによって検出することができる。さらに、上記測定対象物と生体分子の相互作用によって生じる溶液中のイオン濃度の変化を検出することで、測定対象物の濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。

さらに、センサデバイスとしていわゆるケミカルＣＣＤを用いることが好適である（第６構成例）。ケミカルＣＣＤは、図７に示したセンシング部１２に測定対象の化学物質が存在する場合、その物質濃度に応じ、電気的なエネルギーレベルを表す電位が発生する。そこで、この電荷量を測定することにより化学物質の濃度を求めることができる。この測定法による大きな特長としては、電荷注入〜電荷転送を繰り返すことにより、電荷を累積し、信号を任意の大きさ（Ｎ倍）に増幅することが可能で、非常に高感度化を目指すことができる。また、この測定法によるとランダムに生じるノイズ成分はお互いにキャンセルされるため、ノイズが増幅されることがなく、信号成分だけを増幅することができる。例えば、１回の測定時の信号出力がＳとすると、５回蓄積測定を行なった場合の信号出力は５倍の５Ｓとなるが、ノイズ成分はランダムな信号なので増幅されない。このような原理で、ケミカルＣＣＤデバイスでは高精度測定が可能となる。と同時にセンシング部１２を複数の部位に分割し、各部位の電荷量を測定することで、２次元情報を得ることができるという優れた特性がある。

本発明においては、こうした高い感応性を活かしながら、測定対象物と生体分子の相互作用によって生じる生体分子の電位の変化としてケミカルＣＣＤによって検出することができる。また、導電体からなる担体あるいは導電体を有する担体を用いた場合には、担体表面と結合する同電位の導電体を介してケミカルＣＣＤによって検出することができる。また、測定対象物と生体分子の相互作用によって生じる溶液内部でのイオンの変化に伴う、ｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化を２次元情報として得ることができる。

さらに、本発明は、上記のバイオセンサであって、特異性を有する生体分子と特異性の異なる生体分子の組合せ、特異性を有する生体分子と特異性を有しない生体分子の組合せ、特異性を有する生体分子と処理をしない生体分子の組合せ、異なる生体分子を担持した担体の組合せ、あるいは生体分子を担持した担体と担持していない担体との組合せ、のいずれかの組合せからなるデュアル構造体を形成することが好ましい。図８に、本発明に係る構成を例示する（第７構成例）。

図８（Ａ）は特異性を有する生体分子と特異性を有しない生体分子の組合せであって、電極４を共通とし、一方には測定対象物に対し特異性を有する生体分子３（３ａ）を設け、他方には測定対象物に対し特異性を有しない生体分子３（３ｂ）を設け、処理部１３によって両者の電位の差あるいは比を検出するまたは演算することによって、デュアル構造を形成する。

また、特異性を有する生体分子と特異性の異なる生体分子の組合せは、図示しないが、一方に測定対象物に対して特異性を有する生体分子を設け、対照となるチャンネルに測定対象物に対して特異性の異なる生体分子を設けている。具体的には、後述する〔実施例６〕のように、認識特異性の異なる２種の抗体を固定化したバイオセンサが挙げられる。

図８（Ｂ）は導電体からなる担体あるいは導電体を有する担体を用いた場合であって、複数の担体の一方（９ａ）に生体分子３ａを担持し、他方の担体９ｂには生体分子を担持しない構造体を用いたデュアル構造を形成する。

同一試料を測定した場合には、各担体の基準点の僅かな変化を相互に補完し合い、センサ出力を絶対信号として取り扱うことが可能となる。このとき、両担体９ａと９ｂは必ずしも同じ構成であることは必要としないが、特に同じ構成からなる担体の組合せにおいては、より一層補正精度の向上を図ることができる。

さらに、異なる生体分子を担持した担体を組合せた場合には、各担体の基準点の僅かな変化を相互に補完し合いつつ、同一試料中に対する異なる感応基による差量センサ出力を得ることができる。つまり、測定対象物との結合時に生じる電位の変化が異なる２つの抗体を各々担持し、各変化量を演算（具体的には、両者の差を比で除算する）することで、測定精度を上げることができる。

本発明においては、上記の生体分子３あるいは担体９を交換することが可能であり、繰り返し同一試料を測定する場合や試料の変更あるいは測定対象物を変更する場合には、基本構成はそのままに、最小単位のみの交換で多種多様な対応を行うことが可能となる。

また、本発明は、上記のいずれかのバイオセンサを複数のセルに配し、マルチバイオセンサとすることが好適である（第８構成例）。具体的には、図９のような、複数のサンプルウェル１８の各々に上記のようなバイオセンサ１９を配置してマルチセル２０（例えば、後述するマイクロプレートなど）を形成することで、従来困難であった多成分測定を可能とし、非常に汎用性の高いセンサを形成することが可能となる。ここで、（１）隣接するセルとのデュアル構造を複数列形成すること、（２）１つのセルを基準とし、複数の異なる担体を配置すること、など多種多様な対応を行うことが可能となる。

さらに、本発明においては、繰り返し同一試料を測定する場合や、試料の変更あるいは測定対象物を変更する場合には、上記のように生体分子あるいは担体の交換が可能な構造を有するバイオセンサをマルチセル化することで、各セルに結合する担体を交換し、測定対象の追加・変更および測定項目の追加・変更を容易に行うことができる。

また、本発明の応用として、上記のいずれかのバイオセンサを用い、複数のサンプルウェルを有するマイクロプレートを形成し、多成分測定システムとして用いることが可能である（第９構成例）。具体的には、図１０に例示するように、上記のようなマルチ化されたバイオセンサによって複数のサンプルウェル１８を有するマイクロプレート２０を形成し、これをリーダ２１によって、各センサの出力を取出すことができる。以下、本装置の操作方法を例示する。
（１）各サンプルウェル１８にサンプルを挿入する。
（２）マイクロプレート２０を装置前面Ａの位置にあるトレイ２２にセットする。
（３）測定をスタートすると、マイクロプレート２０はトレイ２２とともに、ガイド２３に沿って、装置内部に移動する。
（４）マイクロプレート２０が、Ｂの位置に移行したときトレイ２２は停止する。Ｂの位置の検出は、トレイ２２に設けられた孔２４を位置センサ２５によって検知する方法などが採られる。
（５）このとき、リーダ２１内の下部に設けられた各サンプルウェル１８の位置に対応する接点（図示せず）とセンサ出力端子とが接続する。
（６）各センサ出力を読み取り、測定値を演算する。
本発明は、このような装置によって、迅速かつ簡易的な多成分の測定システムを可能したものである。これによって、従来のような使い捨てのウェルではなく、担体交換による非常に幅広い測定対象の追加・変更および測定項目の追加・変更が可能な測定システムを供給することができる。

以上のような、本発明の各構成例は、例えば、河川や土壌などの環境サンプル中の残留農薬あるいは環境ホルモンの測定などにおいて適用することが可能である。具体的には、デバイスとしてケミカルＣＣＤ、生体分子として蛋白質を用い、抗原抗体反応を利用することで、非常に微量な在留農薬（例えば、アセタプリミドなど）を精度よく測定することができる。また、デバイスとしてＩＳＦＥＴ、導電体として金、担体として金のディスクを用い、抗原抗体反応を利用することで、非常に微量なビスフェノールＡ成分を精度よく測定することができる。環境サンプル中の環境ホルモンの測定に利用することが可能となる。さらに、デバイスとしてケミカルＣＣＤ、導電性薄膜として金、担体として金粒子の集合体を用い、ＤＮＡ−ＤＮＡ間の相互作用を利用して、環境サンプル中の残留農薬の測定が可能となる。
なお、本発明がかかる構成例あるいは実施例等に限定されるものでないことはいうまでもない。

以下、本発明の構成を具体的に示す実施例等について説明する。なお、本発明がかかる実施例等に限定されるものでないことはいうまでもない。
＜実施例１＞
（１）方法
２つのチャンネルを持つケミカルＣＣＤセンサチップの両方のＡｕゲート表面をピラニア溶液で洗浄し、緩衝溶液で濯いだ後、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ＮＡｖ）を吸着させ、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）によってブロッキングを行った。次いでチャンネル１にＢｉｏｔｉｎ修飾プローブＤＮＡを添加し、ゲート表面にＡｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ結合により固定化した。一方、チャンネル２にはＢｉｏｔｉｎを添加し、ＮＡｖに結合させた。そしてプローブＤＮＡに相補的なターゲットＤＮＡを２つのチャンネルに同時にインジェクトし、ハイブリダイゼーション反応を行わせた際のゲート出力を測定した。標的モデルＤＮＡとしては、癌抑制遺伝子Ｐ５３のコドン２４５−２５１に相当するオリゴヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を用いた。

（２）結果及び考察
センサチップに、チャンネル１と相補的なターゲットＤＮＡをインジェクションしたところ、時間と共に図１１のような出力変化を示した。ターゲットＤＮＡに対して相補的なプローブＤＮＡの固定化されたチャンネル１の出力変化の方が、コントロールであるチャンネル２の出力変化に比べて大きく負に変化することが示された。この結果は、本ケミカルＣＣＤの動作原理（ゲート表面における負電荷の増加に伴い、出力はマイナスシフトする）からの予測と一致するものであり、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を検出できることが示された。

＜実施例２＞
デバイスとしてケミカルＣＣＤを用い、プローブＰＮＡ分子のゲート表面への固定化反応やターゲットＤＮＡ分子のプローブＰＮＡに対するハイブリダイゼーション反応の過程をケミカルＣＣＤの出力変化として測定した。

（１）方法
２つのチャンネルを持つケミカルＣＣＤセンサチップの両方のＡｕゲート表面をエタノールで洗浄し、バッファーで濯いだ後、ニュートラアビジンを吸着させ、カゼインブロッキングを行った。次いで２つのゲート表面にビオチン修飾した２種類のプローブＰＮＡをそれぞれアビジン−ビオチン結合により固定化した。そして、０．３２４ｆＭ〜３２４ｆＭの濃度範囲でチャンネル１のプローブに相補的なターゲットＤＮＡを２つのチャンネルに同時にインジェクトし、ハイブリダイゼーション反応を行わせ、その後ゲート出力を測定した。ターゲットＤＮＡとしては、癌抑制遺伝子ｐ５３のコドン２４５−２５１（２１ｍｅｒ）に相当するオリゴヌクレオチドを用い、プローブＰＮＡは、ターゲットＤＮＡの中央部分に相補的な１３ｍｅｒ（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＡＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＣＡの配列に相当するＰＮＡ）のものを用いた。

（２）結果及び考察
センサチップに、ターゲットＤＮＡをインジェクションしたところ、ターゲットＤＮＡに対して相補的なプローブＰＮＡの固定化されたチャンネル１では、コントロールであるチャンネル２に比べて大きな負の出力変化が示された。この結果は、本ケミカルＣＣＤの動作原理からの予測と一致するものであり、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を検出できることが示された。また、濃度を変えたＤＮＡ溶液を添加した際の出力を測定したところ、図１２のように、飽和曲線を描き、濃度依存性が示された。

＜実施例３＞
デバイスとしてケミカルＣＣＤ、導電性薄膜として金、生体分子（抗原）として癌マーカー蛋白質（ＡＦＰ）を用い、抗原抗体反応を利用して、特異抗体結合量の測定を行なった。

（１）方法
ケミカルＣＣＤセンサチップのＡｕゲート表面に、ＡＦＰ５０μＬ（１２μｇ／ｍＬ）を添加し固定させた。次に、次に、ＢＳＡによってブロッキングを行った。抗体として抗ＡＦＰ抗体を５０μＬ（６．７μｇ／ｍＬ）添加した。次いで、電位の変化を測定した。

（２）結果及び考察
図１３に示すように、ケミカルＣＣＤにおける抗原抗体反応による出力について、Ａｕゲートへの抗原ＡＦＰの吸着、その後の抗体の特異結合による電位の減少が観察された。つまり、抗原ＡＦＰに特異性を有する抗体が吸着することによって所定の電位の変化が認められた。また、生体分子の分子量が大きな場合における電位の変化量および安定性を確認することができた。

＜実施例４＞
デバイスとして２つのチャンネルを持つケミカルＣＣＤ、導電性薄膜として金、生体分子（抗原）として一方のチャンネルにＡＦＰ、他方のチャンネル（対照）にＢＳＡを用い、抗原抗体反応を利用して、特異抗体結合量の測定を行なった。

（１）方法
ケミカルＣＣＤセンサチップのＡｕゲート表面に何も付加固定しない状態での電位を測定した後、チャンネル１にＡＦＰ３０μＬ（１２μｇ／ｍＬ）を、チャンネル２にＢＳＡ３０μＬ（１０μｇ／ｍＬ）を吸着固定させ、この状態での電位を測定した。次に、抗体として抗ＡＦＰ抗体を５０μＬ（６．７μｇ／ｍＬ）添加した。次いで、電位の変化を測定した。

（２）結果及び考察
ケミカルＣＣＤのチャンネル１およびチャンネンル２における抗原抗体反応による主力変化を、抗原固定化及び抗原抗体反応の各段階ごとに図１４に示した。抗体の添加に対して抗原を吸着させたチャンネル（チャンネル１）の方がＢＳＡを吸着させたチャンネル（チャンネル２）よりも大きな主力減少が見られた。つまり、チャンネル１とチャンネル２の差異として、特異抗体の添加量と所定の相関関係を出力変化として取り出せることが示され、癌マーカー検出に利用できることが示された。

＜実施例５＞
デバイスとして２つのチャンネルを持つケミカルＣＣＤ、導電性薄膜として金、生体分子として蛋白質とＤＮＡの組み合わせを用い、ターゲットとしてＤＮＡを添加し観察を行なった。

（１）方法
ケミカルＣＣＤセンサチップのＡｕゲート表面を、１５秒間ピランハ洗浄し、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、チャンネル１および２に室温条件下で、卵白由来のアビジン０．２ｍｇ／ｍＬを２時間で固定させた。次に、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、室温条件下で、プローブとしてチャンネル１にＢＳＡ０．２ｍｇ／ｍＬを、チャンネル２にＤＮＡ５’−ビオチン−２７３Ｐを室温にて２時間で固定させた。再度ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、ターゲットとしてＤＮＡ５’−ビオチン−２７３Ｔを添加した。次いで、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、電位の変化を測定した。

プローブＤＮＡ：２７３Ｐの配列
５’−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＴＴ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＧＴＴ ＴＧＴ ＧＣＣ−３’ターゲットＤＮＡ：２７３Ｔの配列
５’−ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＡＣ ＡＣＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＡＡＡ−３’

（２）結果及び考察
チャンネル１およびチャンネンル２の相補的な処理がされた結果、図１５に示すようにターゲットＤＮＡの濃度に依存する電位の変化つまり電荷量が観察された。つまり、チャンネル１とチャンネル２の差異として、ターゲットＤＮＡの濃度によって所定の電位の変化が認められた。従って、ターゲットＤＮＡの検出に利用できることが示された。

＜実施例６＞
デバイスとして２つのチャンネルを持つケミカルＣＣＤ、導電性薄膜として金、生体分子（抗原）として一方のチャンネルにアセタミプリド（ＡＡＰ）とＢＳＡの結合体（ＡＡＰ−ＢＳＡ）、対照チャンネルにＢＳＡを用い、抗原抗体反応を利用して、抗アセタミプリド抗体の結合量の測定を行なった。

（１）方法
ケミカルＣＣＤセンサチップのＡｕゲート表面を、１５秒間ピランハ洗浄し、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、室温条件下で、チャンネル１にＡＡＰ−ＢＳＡ０．２ｍｇ／ｍＬを、チャンネル２にＢＳＡ０．２ｍｇ／ｍＬを２時間で固定させた。次に、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、抗体として抗アセタミプリド抗体を添加した。次いで、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、電位の変化を測定した。

（２）結果及び考察
チャンネル１およびチャンネンル２の相補的な処理がされた結果、アセタミプリド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬに対し電位の変化つまり電荷量が５３ｍＶ発生した。つまり、チャンネル１とチャンネル２の差異として、アセタミプリドハプテンに特異性を有する抗体が吸着することによって所定の電位の変化が認められた。従って、競合反応系を用いたＥＬＩＳＡ法によりアセタミプリドの検出に利用できることが示された。

＜実施例７＞
デバイスとして２つのチャンネルを持つケミカルＣＣＤ、導電性薄膜として金、生体分子（抗体）として一方のチャンネルに抗ＡＡＰ、他方のチャンネル（対照）に抗クロロタロニル（ＣＬＴ）を用い、抗原抗体反応を利用して、農薬であるアセタミプリド（抗原）の測定を行なった。

（１）方法
ケミカルＣＣＤセンサチップのＡｕゲート表面を、１５秒間ピランハ洗浄し、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、室温条件下で、チャンネル１にＡＡＰ０．５ｍｇ／ｍＬを、チャンネル２にＣＬＴ０．５ｍｇ／ｍＬを２時間で固定させた。次に、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、ＢＳＡ０．５ｍｇ／ｍＬによって室温２時間でブロッキングを行った。再度ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、抗原としてアセタミプリドを添加した。次いで、ＰＢＳＥ洗浄を４回繰り返した後、電位の変化を測定した。

（２）結果及び考察
チャンネル１およびチャンネンル２の相補的な処理がされた結果、アセタミプリド濃度が０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲で観察すると、アセタミプリドの添加量と電位の変化つまり発生する電荷量の関係は、図１６のような出力変化を示した。つまりチャンネル１とチャンネル２の差異として、アセタミプリドの添加量と所定の相関関係を出力変化として取り出せることが示され、アセタミプリドの検出に利用できることが示された。

以上、この発明は、環境サンプルを始め、広く溶液などサンプルの測定に好適に用いることができるほか、以下のような分野にも適用することができる。
（１）環境計測・環境；バイオリメディエーションへの適用
（２）食品検査・食品、微生物
（３）ＭＥ分野・医学・生態組織；組織細胞の表面計測、ＤＮＡ計測
（４）バイオ分野
（５）動植物分野；カルスの表面計測・生物・動物
また、サンプルの二次元分布を測定し、現象のリアルタイム画像化から画像ソフトによる他の種類の解析、表示にも有用である。

本発明に係るバイオセンサの構成例（第１構成例）を示す説明図。 本発明に係る１の実施の態様を例示する説明図。 本発明に係るバイオセンサの第２構成例を示す説明図。 本発明に係るバイオセンサの第３構成例を示す説明図。 本発明の関する測定手段であるＭＯＳＦＥＴの一例（第４構成例）を示す説明図。 本発明の関する測定手段であるＩＳＦＥＴの一例（第５構成例）を示す説明図。 本発明の関する測定手段であるケミカルＣＣＤの一例（第６構成例）を示す説明図。 本発明のデュアル構造体を形成したバイオセンサを例示する説明図。 本発明のマルチバイオセンサを例示する説明図。 本発明の多成分測定システムを例示する説明図。 本発明の実施例１に係るバイオセンサの出力変化を示す説明図。 本発明の実施例２に係るバイオセンサの出力変化を示す説明図。 本発明の実施例３に係るバイオセンサの出力変化を示す説明図。 本発明の実施例４に係るバイオセンサの出力変化を示す説明図。 本発明の実施例５に係るバイオセンサの出力変化を示す説明図。 本発明の実施例７に係るバイオセンサの出力変化を示す説明図。 従来技術に係る残留農薬検出方法を例示する説明図。 従来技術に係る環境ホルモンの検出方法を例示する説明図。

符号の説明

１ デバイス
２ 導電性薄膜
３ （第１）生体分子
４ 電極
５ ポテンショメータ
６ 測定対象物
７ 中間体
８ 第２生体分子
９、９ａ、９ｂ 担体
１０ ＭＯＳＦＥＴのセンシング部
１１ ＩＳＦＥＴの薄膜
１２ ケミカルＣＣＤのセンシング部
１３ 処理部
１８ サンプルウェル
１９ バイオセンサ
２０ マルチセル（マイクロプレート）
２１ リーダ

Claims (9)

1. ケミカルＣＣＤと、該ケミカルＣＣＤ表面に施した導電性薄膜と、該薄膜上に配され、被検体または被検体との結合体に対して選択的に結合を形成する生体分子と、を構成要素とし、前記生体分子の電位の変化を検出するバイオセンサであり、
   前記ケミカルＣＣＤは、センシング部を有し、前記センシング部に測定対象の化学物質が存在する場合、その物質濃度に応じ、電気的なエネルギーレベルを表す電位が発生するものであり、電荷注入と電荷転送とを繰り返すことにより、電荷を累積し、信号を増幅するものであり、
   前記導電性薄膜は、前記ケミカルＣＣＤを構成する前記センシング部の表面に施されていることを特徴とするバイオセンサ。
2. 前記生体分子が、蛋白質を主体とする生体分子によって形成されていることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
3. 前記生体分子が、複数の生体分子の結合体を主体とする生体分子によって形成されていることを特徴とする請求項１または２記載のバイオセンサ。
4. 前記生体分子が、蛋白質とＤＮＡの結合体を主体とする生体分子によって形成されていることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ。
5. 前記生体分子が、蛋白質とペプチド核酸の結合体を主体とする生体分子によって形成されていることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ。
6. 前記生体分子が、前記導電性薄膜と結合する、導電体からなる担体あるいは導電体を有する担体によって、担持されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のバイオセンサ。
7. 特異性を有する生体分子と特異性の異なる生体分子の組合せ、特異性を有する生体分子と特異性を有しない生体分子の組合せ、特異性を有する生体分子と処理をしない生体分子の組合せ、異なる生体分子を担持した担体の組合せ、あるいは生体分子を担持した担体と担持していない担体との組合せ、のいずれかの組合せからなるデュアル構造を形成することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のバイオセンサ。
8. 請求項１〜７いずれかに記載のバイオセンサを複数のセルに配することを特徴とするマルチバイオセンサ。
9. 請求項１〜８いずれかに記載のバイオセンサを用い、複数のサンプルウェルを有するマイクロプレートを形成することを特徴とする多成分測定システム。

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