ES2310476B1 - Electrodos selectivos de iones de contacto solido basados en nanotubos de carbono. - Google Patents
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Abstract
Electrodos selectivos de iones de contacto
sólido basados en nanotubos de carbono.
La invención define un electrodo selectivo de
iones de contacto sólido que comprende una capa transductora de
nanotubos de carbono que pone en contacto la capa sensora y el
elemento conductor. Asimismo, la invención define un método para la
preparación de dicho electrodo selectivo de iones de contacto sólido
y el uso del mismo para la determinación cualitativa, cuantitativa
o semicuantitativa de analitos. Dicho electrodo selectivo de iones
de contacto sólido permite detectar o cuantificar muy diversas
especies químicas de modo fiable y reproducible con las ventajas
adicionales derivadas de su sencillez y bajo coste de
construcción.
Description
Electrodos selectivos de iones de contacto
sólido basados en nanotubos de carbono.
La invención se refiere al campo de la
electroquímica y, en particular, a sensores electroquímicos basados
en electrodos selectivos de iones de contacto sólido. Más
específicamente, la invención se refiere a un electrodo selectivo
de iones de contacto sólido basado en nanotubos de carbono. Dicho
electrodo permite determinaciones cualitativas, cuantitativas o
semicuantitativas de muy diversos analitos, con buena
reproducibilidad y fiabilidad.
Como es bien conocido en el estado de la
técnica, los electrodos selectivos de iones o ISEs ("Ion
Selective Electrodes") se han venido empleando para
determinaciones cualitativas o cuantitativas de diversos analitos,
si bien inicialmente se emplearon para determinar la concentración
de iones en solución. La configuración tradicional incluye una
solución interna transductora entre la membrana selectiva a iones y
el elemento conductor de la señal eléctrica generada, que es capaz
de transformar el flujo iónico en flujo electrónico (Eric Bakker,
Ernö Pretsch, Trends in Analytical Chemistry, 24 (2005)
199-207 "Potentiometric sensors for
trace-level analysis"). Dicha configuración, sin
embargo, no es apropiada para determinadas aplicaciones,
particularmente para electrodos miniaturizados, por lo que la
solución interna se ha sustituido por un contacto sólido,
desarrollando así los electrodos selectivos de iones de contacto
sólido o de estado sólido
("all-solid-contact ISEs" o
"all-solid-state ISEs").
Así, la nueva generación de electrodos
selectivos de iones se construirá probablemente en base a un
contacto interno sólido. Ello es así debido a las ventajas claras
en cuanto a las posibilidades de miniaturización y construcción
mucho más simple que ofrecen estos
"all-solid-state" electrodos
potenciométricos respecto a aquellos que contienen una solución
interna (Pretsch E., TrAC 26 (2007) 46-51,
"The new wave of ion-selective
electrodes").
En algunos casos, la membrana selectiva a iones
se ha depositado directamente sobre el elemento conductor, como es
el caso del electrodo de hilo metálico recubierto o CWE
("Coated-Wire Electrode"), si bien la respuesta
es poco estable y la adherencia de la membrana al metal es
reducida. En otros casos, la membrana selectiva a iones se ha
puesto en contacto con el elemento conductor a través de una capa
de un polímero conductor o CP ("Conducting Polymer"). Dicha
capa polimérica actúa como transductor interno convirtiendo el
flujo iónico en flujo electrónico. Como polímeros conductores se
emplean polipirroles, politiofenos o polianilinas, entre otros, que
pueden estar convenientemente dopados tal como polipirrol dopado
con aniones cloruro o polipirrol dopado con aniones ferrocianuro,
por ejemplo (Agata J. Michalska, Charles
Appaih-Kusi, Lee Yook Heng, Sebastian Walkiewicz and
Elizabeth A. H. Hall, Anal. Chem. 76 (2004)
2031-2039, "An Experimental Study of Membrane
Materials and Inner Contacting Layers for
Ion-Selective K^{+} Electrodes with a Stable
Response and Good Dynamic Range").
A pesar de que los polímeros conductores
utilizados como transductores entre la membrana exterior selectiva
a iones y el elemento conductor de la señal eléctrica generada,
mejoran la estabilidad de los electrodos de contacto sólido,
todavía es necesario un proceso de optimización del dopado del
polímero conductor para cada aplicación individual con el fin de
maximizar el proceso de transducción de la corriente de iones a
corriente electrónica (Bobacka, J. Electroanalysis 18(2006)
7-18, "Conducting polymer-based
solid-state ion selective electrodes";
Michalska, A., Anal. Bioanal. Chem. 384 (2006)
391-406, "Optimizing the analytical performance
and construction ISEs with conducting polymer-based
ion-to-electron
transducers").
Continúa existiendo en el estado de la técnica,
por tanto, la necesidad de nuevos ISEs de contacto sólido que
superen los inconvenientes del estado de la técnica.
Los presentes inventores han descubierto que el
empleo de una capa a base de nanotubos de carbono (CNTs) como capa
interna transductora que pone en contacto la capa sensora (membrana
selectiva a iones u otra), y el elemento conductor permite obtener
un ISE de contacto sólido muy ventajoso en cuanto a la
determinación cualitativa o cuantitativa de muy diversas especies
químicas con bajos límites de detección, bajos tiempos de respuesta
y con una gran selectividad, es decir, con buena fiabilidad y
reproducibilidad. Estos nuevos ISEs de contacto sólido, además, son
muy sencillos de construir y su coste es, por tanto, muy
razonable.
Los nanotubos de carbono son conocidos en el
estado de la técnica por sus extraordinarias propiedades derivadas
de su estructura química. Por lo que respecta al campo de los
sensores electroquímicos, algunas de sus características más
interesantes son la relación tan alta entre superficie y volumen y
su gran capacidad de promover la transferencia de cargas entre
fases heterogéneas (Davis et al., J. Electroanal. Chem. 1997,
440, 279-282; Luo et al., Anal. Chem. 2001, 73,
915-920; Britto et al., AdV. Mater. 1999,
11(2), 154-157). Aprovechando estas
propiedades, los CNTs se han utilizado como componentes de
transistores de efecto campo (Field Effect Transistors, FETs)
(Postma HWCh, Science 293 (2001) 76-79, "CNT
single-electron transistors at room
temperature"), condensadores (Snow ES, Science,
307(2005) 1942-5, "Chemical detection with
a single-walled carbon nanotube capacitor") y
nanoelectrodos en serie que se han aplicado al análisis
voltamperométrico (Tu Y, Electroanalysis, 17 (2005)
79-84, "Carbon Nanotubes Based Nanoelectrode.
Arrays Fabrication"). Igualmente, en la solicitud de patente US
2006/0200044 se describe un microelectrodo de nanotubos de carbono
en técnicas no potenciométricas para medir niveles de glucosa, y en
la solicitud de patente US 2004/0146863 se emplean los nanotubos
de carbono como material conductor para electrodos convencionales
de biosensores usados en la detección y cuantificación de analitos
mediante técnicas potenciométricas.
Sin embargo, hasta la fecha nadie ha utilizado
los CNTs como transductores en análisis potenciométrico.
Kaempgen et al. (Kaempgen M., Roth S.,
J Electroanal. Chem 586 (2006) 72-76,
"Transparent and flexible carbon nanotube/polyaniline pH
sensors") incluyeron los CNTs como componentes de electrodos de
pH pero, como claramente indican los propios autores, los nanotubos
de carbono se utilizan como estructura de soporte de la capa del
polímero conductor (polianilina) que actúa simultáneamente como
capa sensora, dado que los iones oxonio interactúan con los grupos
amino de la polianilina, y como capa transductora, gracias a sus
propiedades de polímero conductor. No cabría esperar, por tanto, el
uso de los CNTs como capa interna transductora de muy diversos ISEs
de contacto sólido que sea capaz de convertir eficazmente la señal
química procedente de la capa sensora (de diversa naturaleza en
función del analito que se desee detectar o cuantificar) en una
señal eléctrica medible.
Los presentes inventores, sin embargo, han
demostrado por primera vez que los CNTs pueden actuar como
transductores muy activos en diversos electrodos selectivos de
iones de contacto sólido en los que la transducción de la señal
química desde la capa sensora correspondiente hacia el elemento
conductor se ha solucionado incluyendo una capa intermedia a base
de nanotubos de carbono.
Así pues, la invención proporciona un electrodo
selectivo de iones de contacto sólido alternativo que permite
detectar o cuantificar muy diversas especies químicas de modo
fiable y reproducible con las ventajas adicionales derivadas de su
sencillez y bajo coste de construcción.
La presente invención, por tanto, tiene por
objeto proporcionar un electrodo selectivo de iones de contacto
sólido que comprende una capa transductora de nanotubos de carbono
que pone en contacto la capa sensora y el elemento conductor.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
método para la preparación de dicho electrodo selectivo de iones de
contacto sólido.
Por último, otro objeto de la invención es
proporcionar el uso de dicho electrodo selectivo de iones de
contacto sólido para la determinación cualitativa, cuantitativa o
semicuantitativa de analitos.
La figura 1a muestra la capa transductora del
ISE de contacto sólido de la invención formada por varios nanotubos
de carbono en forma de red entrecruzada tipo "césped" o
"spaguetti". La figura 1b muestra la capa transductora del ISE
de contacto sólido de la invención formada por varios nanotubos de
carbono en forma de red perpendicular tipo "cepillo".
La figura 2 muestra un nanotubo de carbono de
capa única (SWNT o "Single-walled carbon
nanotube") y un nanotubo de carbono de capa múltiple (MWNT o
"Multi-walled carbon nanotube") que pueden
formar la capa transductora del ISE de contacto sólido de la
invención.
La figura 3 muestra una imagen AFM (microscopía
de fuerza atómica) de la red de nanotubos empleada como capa
transductora en un ISE de contacto sólido de la invención.
La figura 4 muestra tres posibles
configuraciones del ISE de contacto sólido de la invención que
incluyen soportes diversos.
La figura 5 muestra la respuesta potenciométrica
(fuerza electromotriz, EMF = voltaje a corriente nula) de un ISE de
contacto sólido de la invención frente al logaritmo de la
actividad de iones potasio.
La figura 5bis nuestra la respuesta
potenciométrica (fuerza electromotriz, EMF = voltaje a corriente
nula) de un ISE de contacto sólido de la invención frente al
logaritmo de la actividad de iones potasio en un intervalo de
logaritmos de actividad de iones potasio (entre -4,5 y -1,5).
La figura 6 muestra la respuesta potenciométrica
(fuerza electromotriz, EMF = voltaje a corriente nula) de un ISE de
contacto sólido de la invención frente al tiempo.
La figura 7 muestra la respuesta potenciométrica
(fuerza electromotriz, EMF = voltaje a corriente nula) de un ISE de
contacto sólido de la invención para diferentes actividades de
K^{+} tomadas a lo largo del tiempo.
La figura 8 muestra el aptámero de 15 bases
selectivo para la \alpha-trombina empleado en la
capa sensora de un ISE de contacto sólido de la invención.
La figura 9 muestra un nanotubo de carbono de
capa única (SWNT) funcionalizado con un grupo carboxilo y activado
con EDC (clorhidrato de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida)
de un ISE de contacto sólido de la invención.
La figura 10 muestra un nanotubo de carbono de
capa única (SWNT) unido covalentemente al aptámero selectivo para
la \alpha-trombina de un ISE de contacto sólido de
la invención.
La figura 11 muestra la respuesta
potenciométrica (fuerza electromotriz, EMF = voltaje a corriente
nula) de un ISE de contacto sólido de la invención para diferentes
concentraciones de trombina a lo largo del tiempo.
La presente invención proporciona un electrodo
selectivo de iones de contacto sólido que comprende una capa
transductora de nanotubos de carbono que pone en contacto la capa
sensora y el elemento conductor, en adelante "electrodo de la
invención".
Tal y como se ha indicado, el nombre de
electrodo selectivo de iones o ISE, se ha consolidado por razones
históricas dado que los electrodos iniciales sólo tenían capacidad
de reconocer iones mediante la intervención de fuerzas donde
intervenían cargas eléctricas. Hoy en día, sin embargo, estos
dispositivos reconocen muchos más tipos de iones o moléculas
(véase, por ejemplo, Bakker E. et al., Chem Rev. 97 (1997)
3083).
Así, en el contexto de la invención el término
"electrodo selectivo de iones de contacto sólido" se refiere a
electrodos de contacto sólido que son selectivos a diversos
analitos tales como cationes inorgánicos (de metales alcalinos,
alcalino-térreos, de metales de transición, etc.),
aniones inorgánicos (carbonatos, tiocianatos, nitritos, hidroxilos,
fosfatos, sulfatos, sulfitos, cloruros, etc.), cationes orgánicos
(feniletilamina, naftiletilamina, efedrina, anfetamina, propanolol,
etc.), aniones orgánicos (salicilato, ftalato, maleato, etc.),
analitos neutros (dióxido de carbono, amoniaco, etc.), moléculas
orgánicas de bajo peso molecular (pesticidas, fungicidas, azúcares,
vitaminas, segmentos de ácidos nucleicos, etc.), moléculas
orgánicas de alto peso molecular (proteínas, polisacáridos,
enzimas, anticuerpos, etc.) o células (virus, bacterias, hongos,
etc.).
Tal y como se ha señalado, los nanotubos de
carbono son los responsables de la transducción de la señal. Así,
convierten el evento de reconocimiento químico que tiene lugar en
la capa sensora en una señal eléctrica que se transmite a través
del elemento conductor hacia el dispositivo externo. El elemento
conductor está formado por un material sólido caracterizado por una
conductividad eléctrica muy elevada. Los ejemplos más típicos son
los conductores metálicos (hilos o cables de cobre, platino u otros
metales) pero también pueden ser conductores orgánicos como grafito
o polímeros conductores, por ejemplo. Este elemento conductor se
une a la capa transductora de nanotubos a través de contacto
directo o mediante un elemento adhesivo (también conductor) como
composites conductores (de Ag/AgCl u otros). La señal eléctrica así
generada es una fuerza electromotriz, es decir, una diferencia de
potencial que se mide en un electrómetro de alta impedancia interna
(respecto a otro electrodo de referencia) en ausencia de corriente
eléctrica apreciable.
En una realización particular del electrodo de
la invención, la capa transductora de nanotubos de carbono está
formada por uno o más nanotubos de carbono. Cuando está formada por
varios nanotubos de carbono, estos pueden encontrarse en forma de
red entrecruzada tipo "césped" o "spaguetti" (Figura 1a),
en forma de red perpendicular tipo "cepillo" (Figura 1b) o en
otras disposiciones.
Asimismo, los nanotubos de carbono pueden tener
diversas longitudes y diversos diámetros. También su quiralidad
puede ser muy variada, traduciéndose en nanotubos no conductores,
semiconductores o metálicos. Por otra parte, los nanotubos de
carbono pueden estar o no funcionalizados con otros átomos,
moléculas, nanopartículas u otros componentes.
En otra realización particular del electrodo de
la invención, los nanotubos de carbono de la capa transductora se
seleccionan entre nanotubos de carbono de capa única y nanotubos de
carbono de capa múltiple.
Los nanotubos de carbono de capa única o SWNT
("Single-walled carbon nanotubes") son
cilindros que consisten en una lámina simple de grafito enrollada y
que pueden tener un diámetro de entre menos de 1 nm y 3 nm y una
longitud del orden de micrómetros. Los nanotubos de carbono de capa
múltiple MWNT ("Multi-walled carbon
nanotubes") están formados por varios nanotubos de carbono de
capa única concéntricos, siendo su diámetro muy diverso. La Figura
2 muestra una representación de dichos nanotubos de capa única y de
capa múltiple.
Asimismo, en el electrodo de la invención se
pueden usar también nanotubos de carbono con otras características
estructurales tales como los nanotubos de carbono de tipo caña de
bambú.
En una realización particular del electrodo de
la invención, la capa transductora de nanotubos de carbono tiene
un espesor de entre 1,5 nm y 50 \mum. En una realización
preferida, la capa transductora de nanotubos de carbono tiene un
espesor de entre 1 \mum y 30 \mum. En una realización aún más
preferida, la capa transductora de nanotubos de carbono tiene un
espesor de 15 \mum.
Por otra parte, la capa sensora del electrodo de
la invención puede estar formada por distintos constituyentes y
será seleccionada por el experto en la materia en función de la
aplicación deseada. Así, se puede emplear como capa sensora una
membrana, de cristal sólido o polimérica, selectiva a iones u otros
analitos, que recubre la capa transductora y que contiene en su
seno las especies químicas capaces de reconocer a los analitos (en
ocasiones también denominados ionóforos o portadores de iones). En
la bibliografía están descritos multitud de ejemplos formados por
pares de especies: molécula reconocedora-molécula o
ión a determinar, por lo que el experto en la materia podrá
seleccionar el ionóforo adecuado para cada aplicación. El tipo más
común es el que contiene un ionóforo, tal como la valinomicina, por
ejemplo, que se emplea para la determinación de potasio ya que esta
molécula es capaz de formar un complejo de forma selectiva con el
ion potasio. En cuanto a la matriz de la membrana selectiva a
iones, esta puede ser de poli(cloruro de vinilo) (PVC), o de
un derivado del ácido acrílico, tal como n-butil
acrilato (n-BA) o metil
metacrilato-dimetil metacrilato
(MMA-DMA), por ejemplo.
Igualmente, la capa sensora puede estar formada
por geles que incluyen en su estructura a las especies químicas que
tienen la capacidad de reconocer a los analitos de interés,
atrapadas en su matriz mediante el método conocido como
"entrapment". Hay muchos tipos de geles que se emplean pero el
más común se forma por hidrólisis del alcóxido metálico
(Si-OR) al mezclarlo con agua. El proceso se
describe con las siguientes reacciones:
En la etapa 1 el alcóxido reacciona con el agua
(hidrólisis) para dar lugar al grupo alcohol ligado al átomo de Si
(silanol) y a la base (ROH). En la etapa 2a los grupos silanol
adyacentes condensan entre sí para formar el polímero (gel) con
unidad estructural -Si-O-Si-. En la
etapa 2b el grupo silanol también puede interaccionar con un
alcóxido inicial para formar el gel de la etapa 2.
Dada la naturaleza porosa de la matriz, que
tiene el aspecto de la gelatina, las especies sensoras
"atrapadas" permaneces accesibles y pueden interactuar con las
especies químicas a determinar en la muestra analizada. Así, por
ejemplo, se puede determinar carbamatos empleando como reconocedor
de los mismos la enzima acetil colinesterasa (Bucur B. et al.,
Anal. Chico. Acta 562 (2006) 115-121
"Biosensors based on highly sensitive acetylcholinesterases for
enhanced carbamate insecticides detection").
Del mismo modo, la capa sensora puede estar
formada por membranas semipermeables que encierran o encapsulan a
las especies reconocedoras de analitos, es decir, no contienen en
su seno a las especies reconocedoras sino que sólo actúan
envolviéndolas. Estas membranas semipermeables son del tipo de
membranas empleadas en diálisis (acetato de celulosa) o formadas
por Teflon (selectiva a algunos gases), Nafion, poliuretanos o
policarbonatos, por ejemplo. Esta fue la técnica original utilizada
para desarrollar el primer biosensor de glucosa con membrana
encapsuladora depositada sobre el electrodo de oxígeno.
Asimismo, la capa sensora puede estar
constituida por las especies químicas reconocedoras de analitos
adsorbidas sobre los nanotubos de carbono mediante enlaces químicos
débiles tipo van deer Waals u otros (fuerzas hidrófobas, enlaces de
hidrógeno, etc.), de forma directa o indirecta (ligadas a otros
compuestos que son los que se adsorben sobre los nanotubos de
carbono). Un ejemplo muy típico son las inmunoglobulinas, proteínas
que actúan como anticuerpos y que se adsorben fuertemente sobre las
superficies de los nanotubos de carbono. Una vez adsorbidas son
capaces de reconocer el analito de interés correspondiente (en
términos bioquímicos denominado antígeno) que puede ser otra
proteína, una bacteria, un virus, etc., mediante la reacción de
reconocimiento antígeno-anticuerpo
correspondiente.
Por otro lado, la capa sensora puede estar
constituida también por las especies químicas reconocedoras de
analitos unidas mediante enlaces covalentes a los propios nanotubos
de carbono, bien sea mediante enlaces covalentes directos o bien
mediante los llamados entrecruzadores
("cross-linkers"). Un ejemplo de ello es la
funcionalización de los nanotubos con grupos carboxilo mediante
oxidación, grupos que pueden reaccionar químicamente con otras
moléculas hasta enlazar covalentemente con la molécula sensora tal
como, por ejemplo, un aptámero selectivo a un analito. Los
aptámeros son oligonucleótidos de RNA o DNA pequeños que usualmente
contienen menos de 100 bases. La gran variedad de disposiciones
posibles de las unidades básicas
(fosfato-azúcar-base púrica o
pirimídica) en la cadena de oligonucleótidos, junto con el número
tan elevado de formas tridimensionales que pueden adoptar, son
características que permiten a los aptámeros unirse de forma muy
selectiva a los diferentes analitos que se quieren determinar y que
pueden ser desde iones y moléculas pequeñas hasta proteínas o
células completas.
Asimismo, los nanotubos funcionalizados con
carboxilo pueden reaccionar químicamente con otras moléculas hasta
enlazar covalentemente con una molécula sensora tal como, por
ejemplo, una nanopartícula que es capaz de reconocer analitos que
tengan grupos tiol (-SH) u otro tipos de analitos de interés (Katz,
ChemPhysChem, 2004, 5, 1084-1104,
"Biomolecule-functionalized CNTs"):
Finalmente, pueden emplearse capas sensoras
formadas por entidades químicas que tienen capacidad de reconocer
analitos de interés y que, a su vez, están en contacto directo o
indirecto (a través de membranas interpuestas, por ejemplo) con los
nanotubos de carbono, tales como los polímeros impresos
molecularmente (Molecular imprinted polymers o MIPs), aptámeros,
segmentos de DNA o RNA u otros. En el caso de que estos
reconocedores estén situados muy cerca de los nanotubos de carbono
a través de membranas interpuestas, los CNTs están recubiertos de
una membrana muy delgada de polímero (tal como el Parylene, por
ejemplo) que posee unos grupos funcionales a través de los cuales
se ligan a los MIPs o los segmentos de DNA, por ejemplo.
Así, en una realización particular del electrodo
de la invención, la capa sensora se selecciona entre una membrana
selectiva a iones, un gel con un reconocedor de analitos atrapado
en su matriz, una membrana semipermeable con un reconocedor de
analitos encapsulado, una capa de reconocedores de analitos
adsorbidos sobre los nanotubos de carbono, una capa de
reconocedores de analitos unidos covalentemente a los nanotubos de
carbono y una capa de reconocedores de analitos en contacto con los
nanotubos de carbono a través de una membrana interpuesta. En una
realización preferida, la capa sensora es una membrana selectiva a
iones que contiene un ionóforo. En una realización aún más
preferida, la capa sensora es una membrana selectiva a iones
potasio que contiene como ionóforo la valinomicina.
La capa sensora del electrodo de la invención,
en cualquier caso, no será nunca una capa sensora y transductora a
la vez, tal como la capa de polianilina de Kaempgen (Kaempgen 2006,
supra).
En una realización particular del electrodo de
la invención, la capa sensora tiene un espesor de entre 0,1 y 1000
\mum. En una realización preferida, la capa sensora tiene un
espesor de entre 1 y 100 \mum. En una realización aún más
preferida, la capa sensora tiene un espesor de 50 \mum.
En una realización particular, el electrodo de
la invención comprende también un soporte sobre el que se deposita
la capa de nanotubos de carbono o que, a modo de tubo aislante, por
ejemplo, contiene en su extremo la capa sensora depositada sobre
la capa transductora de nanotubos de carbono. Este soporte puede
ser no conductor, tal como un soporte de PVC o SiO_{2}, por
ejemplo, o bien puede tener características conductoras, tal como
un soporte de metal (Pt, Ag, Cu, etc.), de carbono vitrificado o de
otro material conductor. Estos soportes pueden tener diversas
formas geométricas. Así, pueden estar configurados como hilos o
cables, como tubos, como capas finas o más gruesas, o siguiendo
otros diseños. Dicho soporte es opcional ya que, en algunos casos,
los propios nanotubos de carbono pueden actuar como soporte, bien
solos o bien formando parte de un material compuesto
(composites).
El tamaño total del electrodo selectivo de
estado sólido de la invención varía desde un tamaño macroscópico
(del orden de cm o mm) hasta un tamaño nanoscópico (del orden de nm)
formado por un solo nanotubo de carbono o por varios nanotubos,
pasando por un tamaño microscópico (del orden de \mum). En cada
caso se adaptan las medidas de la capa transductora de nanotubos de
carbono, de la capa sensora y, dado el caso, del soporte.
En la Figura 4 se representan tres posibles
configuraciones de un electrodo de la invención con soporte. En la
Figura 4a) se representa un soporte no conductor de tipo cilíndrico
sobre el que se deposita la capa transductora de nanotubos de
carbono sobre la cual, a su vez, se deposita la capa sensora. En la
Figura 4b) se representa un soporte no conductor a modo de tubo
aislante que contiene en su extremo la capa sensora depositada
sobre la capa transductora de nanotubos de carbono. En la Figura
4c) se representa un soporte no conductor de tipo laminar sobre el
que se deposita la capa transductora de nanotubos de carbono sobre
la cual, a su vez, se deposita la capa sensora.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un método para la preparación del electrodo selectivo de iones de
contacto sólido descrito previamente, que comprende las etapas
de:
- (a)
- preparar una capa transductora de nanotubos de carbono, y
- (b)
- poner en contacto la capa transductora preparada en la etapa (a) con la capa sensora.
En una realización particular, en la etapa (a)
del procedimiento, la capa transductora se prepara por compactación
de polvo de nanotubos de carbono.
En caso de que el electrodo de la invención
comprenda un soporte de tipo tubo que contiene en su extremo la
capa sensora depositada sobre la capa transductora de nanotubos de
carbono, éste se prepara colocando en primer lugar un disco sólido,
que constituye el elemento conductor, en el extremo del tubo. Con
el electrodo dispuesto "cabeza abajo" se deposita sobre este
disco los nanotubos de carbono que se encuentran dispersados en el
solvente adecuado (por ejemplo, los nanotubos de capa única se
pueden dispersar en dimetilformamida). Una vez evaporado el
solvente, queda una capa de nanotubos entrecruzados que constituye
la capa transductora. Finalmente, esta capa transductora se pone en
contacto con la capa sensora depositando ésta última sobre aquella
mediante deposición de gotas de la solución en la que está
dispuesta. Una vez evaporado el solvente de la capa sensora, ésta
recubre totalmente la capa transductora, de forma semejante a cómo
quedan recubiertos los nanotubos en los otros diseños de
electrodos.
En caso de que el electrodo de la invención
comprenda un soporte sobre el que se deposita la capa transductora
de nanotubos de carbono, esta capa puede depositarse sobre el
soporte mediante cualquier método de deposición adecuado.
Así, en otra realización particular, en la etapa
(a) del procedimiento la capa transductora se prepara por
recubrimiento de un soporte con una suspensión de nanotubos de
carbono mediante rociado en forma de aerosol, deposición de gotas,
inmersión o impregnación.
Dicha suspensión se prepara, por ejemplo,
mediante dispersión de polvo de nanotubos de carbono en un solvente
polar (como agua o etanol) que incluye un surfactante (como
dodecilsulfato sódico, SDS). De esta forma, el surfactante rodea a
los nanotubos individuales y permite que estos estén bien dispersos
en el medio polar del solvente. Otros métodos de dispersión
utilizan solventes menos polares como xilenos o clorobencenos. Para
que se logre una buena dispersión en estos últimos solventes es
necesario un proceso de sonicación (vibración de alta frecuencia)
para que los nanotubos, que de forma natural tienden a agruparse
unos con otros, se dispersen bien.
El polvo de nanotubos de carbono puede obtenerse
en el mercado, tal como el comercializado por las compañías Carbon
Solutions, Inc., HELIX Material Solutions o NTP, por ejemplo; o
bien puede prepararse mediante deposición química en fase de vapor
o CVD (Chemical Vapor Deposition) a partir de metano a una
temperatura de 900ºC y en presencia de un chip de dióxido de
silicio como catalizador, por ejemplo.
En la etapa (b) del procedimiento, la capa
transductora preparada se pone en contacto con la capa sensora.
Así, las membranas selectivas a iones normalmente se ponen en
contacto con la capa de nanotubos mediante impregnación, método en
el que la estructura de nanotubos de carbono, o el soporte
recubierto con una capa de nanotubos, se sumerge en la solución
densa que contiene la membrana disuelta en el disolvente adecuado.
Después se retira y se deja secar la membrana que ha quedado
adherida. También se usa la técnica de la deposición en la que unas
gotas de esta disolución densa que contiene la membrana se
depositan sobre la capa de nanotubos.
En el caso de los geles que contienen un
reconocedor de analitos atrapado en su matriz, estos se sintetizan
"in situ". Así, el gel se forma una vez depositados por
impregnación sus componentes monómeros sobre la capa transductora,
tal y como se ha indicado previamente.
Las membranas semipermeables con los
reconocedores de analitos encapsulados se ponen en contacto con la
capa transductora de nanotubos de carbono mediante deposición sobre
la misma de unas gotas de solución que contiene el reconocedor de
analitos, el cual se adsorberá sobre los nanotubos, y posterior
sellado del conjunto recubriéndolo totalmente, a modo de
envoltorio, con la membrana semipermeable previamente
preparada.
Los reconocedores que se adsorben sobre los
nanotubos de carbono simplemente se ponen en contacto con ellos
sumergiendo la estructura de nanotubos de carbono, o el soporte
recubierto con una capa de nanotubos, en una disolución conteniendo
proteínas como elemento reconocedor, por ejemplo. Las fuerzas de
interacción débiles como las de van der Waals u otras hacen que las
proteínas queden adsorbidas sobre la superficie de los nanotubos de
carbono.
Los reconocedores de analitos se unen a los
nanotubos de carbono de forma covalente cuando se hacen reaccionar
químicamente con grupos funcionales contenidos en los nanotubos.
Así, por ejemplo, se sumerge la estructura de nanotubos de carbono
funcionalizados con grupos -COOH, o el soporte recubierto con una
capa de nanotubos funcionalizados con grupos -COOH, en una
disolución que contiene moléculas reconocedoras que poseen el grupo
amino. Se produce entonces la formación química de las amidas con
lo que las moléculas reconocedoras quedan unidas en forma estable a
los nanotubos de carbono.
En el caso de la capa de reconocedores de
analitos en contacto con los nanotubos de carbono a través de una
membrana interpuesta, esta membrana se deposita sobre los nanotubos
de carbono por polimerización "in situ" de los
monómeros y después se hace reaccionar covalentemente el grupo
funcional de la membrana con la molécula reconocedora de forma
parecida al apartado anterior.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
el uso del electrodo selectivo de iones de contacto sólido descrito
previamente para la determinación cualitativa, cuantitativa o
semicuantitativa de analitos. Tal y como se ha indicado
previamente, dichos analitos pueden ser cationes o aniones
inorgánicos, cationes o aniones orgánicos, analitos neutros,
moléculas orgánicas de bajo peso molecular, moléculas orgánicas de
alto peso molecular o células.
En una realización particular, los analitos son
iones. Así, dicha determinación se efectuará sobre especies iónicas
en las condiciones en las que se determinan (la anfetamina es
solamente un ion a partir de un pH determinado de aproximadamente
9,9, por ejemplo). En una realización preferida, los analitos son
iones potasio.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados como limitativos del alcance de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Como capa sensora se utilizó una membrana
selectiva a iones potasio que contenía valinomicina como ionóforo.
La membrana selectiva a potasio utilizada se construyó según un
procedimiento descrito en la literatura científica (L Y Heng and E
A.H. Hall, ACA 403 (2000) 77-89,
"Methacrylic-acrylic polymers in
ion-selective membranes: achieving the right
polymer recipe") y contenía un 1,6% (p/p) (20,1 mmol kg^{-1})
de valinomicina, 0,5% (p/p) (5,1 mmol kg^{-1}) de un anión
lipofílico
(tetraquis(4-clorofenil)borato de
potasio) (KTCIPB) y 97,9% (p/p) de monómero de
metil-metacrilato y
dimetil-metacrilato, MMA-DMA. Se
disolvieron 200 mg de esta mezcla en 2 ml de diclorometano. Para
preparar los electrodos se roció en forma de aerosol una suspensión
del 1% (p/p) de nanotubos de carbono de capa única (SWCNT) en
dodecil sulfato (Furtado et al., J. Am. Chem. Soc. 2004,
126, 6095-6105. "Debundling and Dissolution of
Single-Walled Carbon Nanotubes in Amide
Solvents") sobre un cable de PVC aislante como soporte mecánico
secar, se apreció una capa transductora formada por una red de
(Kaempgen 2006, supra). Tras lavar abundantemente con agua y
nanotubos de aproximadamente 15 \mum de grosor. En la Figura 3 se
muestra una imagen obtenida por AFM o microscopía de fuerza atómica
de la red de nanotubos preparada. La membrana selectiva (de unos 50
\mum de grosor) se depositó sobre la red de nanotubos por
inmersión del cable de PVC recubierto con la capa de nanotubos en
la solución de diclorometano descrita anteriormente. En la Figura
4a) se muestra la configuración del electrodo de la invención
preparado. También se preparó, siguiendo la misma metodologia, un
electrodo sin la capa transductora de nanotubos de carbono de capa
única como electrodo control.
\vskip1.000000\baselineskip
Los potenciales eléctricos se midieron a
temperatura ambiente (22ºC) con agitación continua. Se utilizó como
electrodo de referencia un electrodo de Ag/AgCl/3M KCl con doble
juntura (modelo 6.0729.100 Methrom AG) conteniendo como puente
salino una solución de LiAcO 1M. Los experimentos se realizaron en
vasos de precipitados de vidrio de 100 ml previamente tratados
durante una noche con solución de HNO_{3} 10^{-4}M. Todos los
valores de fuerza electromotriz (EMF) medidos se corrigieron por
los valores de los potenciales de unión líquida calculados mediante
la ecuación de Henderson. Los coeficientes de actividad se
calcularon mediante la aproximación de Debye-Huckel.
Se utilizó un electrómetro (Keithley 6514) con entrada de alta
impedancia para realizar las mediciones de fuerza
electromotriz.
Se midió la fuerza electromotriz o EMF (voltaje
a corriente nula) del ISE de contacto sólido preparado en el
ejemplo 1 a distintas concentraciones de iones potasio. Las curvas
de calibrado (EMF vs lg actividad) obtenidas por incrementos
sucesivos de la actividad de ión K^{+} se muestran en las Figuras
5 y 5bis.
La Figura 5 muestra la respuesta potenciométrica
del electrodo del ejemplo 1 frente al log de la actividad de iones
K^{+}. El electrodo se acondicionó durante 1 h en 0,01 M KCl y se
guardó en la misma solución entre cada uso. El límite de detección
o LOD obtenido es de 10^{-5,5} M. No se obtuvo señal cuando se
utilizó el electrodo control (ISE de contacto sólido sin capa
transductora de nanotubos de carbono SWCNT).
\vskip1.000000\baselineskip
El límite de detección (LOD) expresa la cantidad
o concentración mínima de analito de interés que puede detectarse
con fiabilidad mediante el electrodo. Cuanto más bajo es el LOD,
mayor es su fiabilidad. Se calcula mediante la intersección de los
segmentos rectos de las rectas dibujadas. El electrodo preparado en
el ejemplo 1 puede detectar una concentración mínima de ión K^{+}
de 10^{-5,5} M, es decir, es capaz de detectar una concentración
de iones K^{+} del orden de décimas de micromoles por litro,
comparable al detectado por un ISE de contacto sólido con capa
transductora interna a base de un polímero conductor.
La Figura 5bis muestra la respuesta
potenciométrica del electrodo del ejemplo 1 frente al log de la
actividad de iones K^{+} en un intervalo de logaritmos de
actividad de potasio (de -4,5 a -1,5). La pendiente obtenida es de
(58,1 \pm 0,4) mV/década de actividad, lo que muestra una
respuesta Nernstiana. Se muestra así que el electrodo proporciona
una respuesta muy similar a la teórica (59,16 mV/década de
actividad) que debería obtenerse en la detección de un ión con
valencia 1 positivo como el K^{+}, es decir, el electrodo
presenta una buena fiabilidad.
Se midieron los coeficientes de selectividad
potenciométricos K_{JK}^{pot}, donde K es el ión de interés
(potasio) y J es el ión que también pude detectarse constituyendo
una interferencia en la medida registrada. Dichos coeficientes
reflejan cuantitativamente la selectividad o capacidad que tiene el
electrodo a interactuar con otras especies químicas diferentes al
analito de interés.
En la Tabla 1 se muestran los coeficientes de
selectividad obtenidos con el ISE de contacto sólido preparado en
el ejemplo 1 y con un electrodo similar pero con capa transductora
de un polímero conductor o CP (Michalska, A., Anal Bioanal
Chem 384 (2006) 391-406, "Optimizing the
analytical performance and construction ISEs with conducting
polymer-based
ion-to-electron
transducers").
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Coeficientes de selectividad aproximadamente
inferiores a 10^{-2,5} (log K_{KJ}^{pot} < 2,5) significan
que la respuesta del electrodo no se ve modificada por
concentraciones apreciables de otros iones. El ISE de contacto
sólido del ejemplo 1, por tanto, presenta una buena selectividad
para los iones potasio, similar a la de un electrodo del estado de
la técnica con capa transductora de polímero conductor.
Se midió el tiempo de respuesta, entendido como
el tiempo desde que se introduce el analito hasta que se obtiene
una respuesta estable del electrodo, del ISE de contacto sólido
preparado en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura
6 en donde se representa la respuesta potenciométrica (fuerza
electromotriz, EMF = voltaje a corriente nula) obtenida con el ISE
de contacto sólido del ejemplo 1 en función del tiempo. En el
recuadro interior se muestra ampliado el intervalo de medida
seleccionado.
Como puede verse en dicha Figura 6, a
concentraciones bajas de analito
(10^{-9}-10^{-8}) el tiempo de respuesta llega a
ser de 1 minuto. Sin embargo, a partir de concentraciones más
elevadas (10^{-6}-10^{-5}) el tiempo de
respuesta es casi inmediato, de menos de 5 segundos. La respuesta
del electrodo preparado en el ejemplo 1 es, por tanto, muy rápida,
similar a la de un electrodo del estado de la técnica con solución
interna.
Se midió la fuerza electromotriz o EMF (voltaje
a corriente nula) del ISE de contacto sólido preparado en el
ejemplo 1 a distintas concentraciones de iones potasio a lo largo
del tiempo. Los resultados se muestran en la Figura 7. El electrodo
se acondicionó durante 1 h en 0,01 M KCl y se guardó en la misma
solución entre cada uso.
La Figura 7 refleja la estabilidad de la
respuesta del electrodo de la invención con el tiempo: conforme se
mide la misma solución a lo largo de los días, la respuesta del
electrodo se modifica ligeramente cuando se miden concentraciones
muy bajas. Sin embargo, para concentraciones de potasio igual o
superiores a 10^{-5} M la respuesta obtenida es la misma al cabo
de 22 días. Así pues, el electrodo del ejemplo 1 presenta una gran
estabilidad de la respuesta con el tiempo.
Puede concluirse, por tanto, que el ISE de
contacto sólido preparado en el ejemplo 1 es fiable y reproducible
para concentraciones superiores a 10^{-5,5} M KCl.
\vskip1.000000\baselineskip
Como capa sensora se utilizaron aptámeros unidos
de forma covalente a los nanotubos de carbono de la capa
transductora. En particular, se utilizó el aptámero de 15 bases
(GGTTGGTGTGGTTGG) selectivo para la
\alpha-trombina representado en la Figura 8. En
dicha Figura 8 se observa tanto la secuencia de las unidades
básicas como la disposición espacial y el punto a través del cual
el aptámero se une mediante un enlace covalente al nanotubo de
carbono de capa única.
Para la fabricación de este electrodo se
siguieron los siguientes pasos:
1. Se purificaron los CNTs siguiendo el
procedimiento de Furtado et al. (Furtado et al.,
2004, supra) mediante tratamiento con HNO_{3} 2,6M durante
4 h a reflujo.
2. Se depositó una capa de nanotubos
carboxilados (los grupos -COOH se introdujeron en la etapa 1
mediante el tratamiento ácido) sobre un soporte no conductor de PVC
de tipo cilíndrico (configuración de la Figura 4a). La deposición
se realizó mediante pulverizado de los nanotubos dispersados en
solución acuosa conteniendo dodecil sulfato sódico siguiendo el
procedimiento descrito en la literatura científica (K. Maehashi, T.
Katsura, K. Kerman, Y. Takamura, K. Matsumoto and E. Tamiya,
Anal. Chem. 79 (2007) 782-787
"Label-Free Protein Biosensor Based on
Aptamer-Modified Carbon Nanotube
Field-Effect Transistors"). Los nanotubos se
lavaron y se secaron, quedando adheridos al soporte de PVC.
3. Se activaron los grupos carboxilo con el fin
de que se unieran de forma covalente con el aptámero de 15 bases
para la \alpha-trombina (molécula reconocedora).
Se usó para esta activación un compuesto de tipo carbodiimida como
es el EDC (clorhidrato de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida).
Para ello, se colocó el soporte de PVC conteniendo los nanotubos
carboxilados en una disolución acuosa de EDC y se obtuvieron los
nanotubos funcionalizados y activados que se muestran en la Figura
9.
4. Los nanotubos activados con EDC se hicieron
reaccionar en solución acuosa (introduciendo en ella el soporte de
PVC con la capa de nanotubos activados sobre él) con los grupos
amino del aptámero selectivo a la trombina a temperatura ambiente
siguiendo el esquema descrito en la bibliografía
(Hye-Mi So, Jeong-O Lee et. al.,
J. Am. Checo. Soc. 127 (2005) 11906-11907
"Single-Walled Carbon Nanotube Biosensors Using
Aptamers as Molecular Recognition Elements"), obteniéndose los
nanotubos unidos de forma covalente con el aptámero de la trombina
(molécula reconocedora), tal como se muestra en la Figura 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Los potenciales eléctricos se midieron a
temperatura ambiente (22ºC) con agitación continua. Se utilizó como
electrodo de referencia un electrodo de Ag/AgCl/3M KCl con doble
juntura (modelo 6.0729.100 Methrom AG) conteniendo como puente
salino una solución de LiAcO 1M. Los experimentos se realizaron en
vasos de precipitados de vidrio de 100 ml previamente tratados
durante una noche con solución de HNO_{3} 10^{-4}M. Todos los
valores de fuerza electromotriz (EMF) medidos se corrigieron por
los valores de los potenciales de unión líquida calculados mediante
la ecuación de Henderson. Los coeficientes de actividad se
calcularon mediante la aproximación de Debye-Huckel.
Se utilizó un electrómetro (Keithley 6514) con entrada de alta
impedancia para realizar las mediciones de fuerza
electromotriz.
Se midió la fuerza electromotriz o EMF (voltaje
a corriente nula) del ISE de contacto sólido preparado en el
ejemplo 3 a lo largo del tiempo a distintas concentraciones de
\alpha-trombina. Los resultados se muestran en la
Figura 11. Para ello, el electrodo se sumergió inicialmente en una
solución conteniendo solamente disolución amortiguadora de fosfato
correspondiente al pH fisiológico (pH = 7,4) y se observó que la
fuerza electromotriz proporcionada por el electrodo construido se
mantenía constante. A esta disolución se le añadió, al cabo de 9
minutos, una solución de \alpha-trombina disuelta
en tampón fosfato de tal modo que la concentración total en la
disolución fue de 8 nM. Se observó un cambio de respuesta
apreciable que se estabilizó en menos de 1 minuto. Esta operación
se repitió con concentraciones de \alpha-trombina
16, 24 y 32 nM. En la Figura 11 se observa que el electrodo
respondió correctamente a las distintas concentraciones del analito
seleccionado hasta que todos los aptámeros reaccionaron con la
trombina, alcanzándose la saturación del electrodo. Por
consiguiente, el electrodo del ejemplo 3 es útil para determinar
concentraciones de trombina del mismo orden de magnitud con que se
encuentra en la sangre.
Claims (21)
1. Un electrodo selectivo de iones de contacto
sólido caracterizado porque comprende una capa transductora
de nanotubos de carbono que pone en contacto la capa sensora y el
elemento conductor.
2. Electrodo según la reivindicación 1,
caracterizado porque la capa transductora de nanotubos de
carbono está formada por uno o más nanotubos de carbono.
3. Electrodo según la reivindicación 2,
caracterizado porque los nanotubos de carbono se seleccionan
entre nanotubos de carbono de capa única y nanotubos de carbono de
capa múltiple.
4. Electrodo según la reivindicación 1,
caracterizado porque la capa transductora de nanotubos de
carbono tiene un espesor de entre 1,5 nm y 50 \mum.
5. Electrodo según la reivindicación 4,
caracterizado porque la capa transductora de nanotubos de
carbono tiene un espesor de entre 1 \mum y 30 \mum.
6. Electrodo según la reivindicación 5,
caracterizado porque la capa transductora de nanotubos de
carbono tiene un espesor de 15 \mum.
7. Electrodo según la reivindicación 1,
caracterizado porque la capa sensora se selecciona entre una
membrana selectiva a iones, un gel con un reconocedor de analitos
atrapado en su matriz, una membrana semipermeable con un
reconocedor de analitos encapsulado, una capa de reconocedores de
analitos adsorbidos sobre los nanotubos de carbono, una capa de
reconocedores de analitos unidos covalentemente a los nanotubos de
carbono, una capa de reconocedores de analitos en contacto con los
nanotubos de carbono a través de una membrana interpuesta.
8. Electrodo según la reivindicación 7,
caracterizado porque la capa sensora es una membrana
selectiva a iones.
9. Electrodo según la reivindicación 8,
caracterizado porque la capa sensora es una membrana
selectiva a iones potasio.
10. Electrodo según la reivindicación 1,
caracterizado porque la capa sensora tiene un espesor de
entre 0,1 y
1000 \mum.
1000 \mum.
11. Electrodo según la reivindicación 10,
caracterizado porque la capa sensora tiene un espesor de
entre 1 y
100 \mum.
100 \mum.
12. Electrodo según la reivindicación 11,
caracterizado porque la capa sensora tiene un espesor de 50
\mum.
13. Electrodo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un soporte.
14. Electrodo según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicho soporte es un soporte
conductor.
15. Electrodo según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicho soporte es un soporte no
conductor.
16. Método para la preparación del electrodo
selectivo de iones de contacto sólido según las reivindicaciones
1-15, caracterizado porque comprende:
- (a)
- preparar una capa transductora de nanotubos de carbono, y
- (b)
- poner en contacto la capa transductora preparada en la etapa (a) con la capa sensora.
17. Método según la reivindicación 16,
caracterizado porque en la etapa (a) la capa transductora se
prepara por recubrimiento de un soporte con una suspensión de
nanotubos de carbono mediante rociado en forma de aerosol,
deposición de gotas, inmersión o impregnación.
18. Método según la reivindicación 16,
caracterizado porque en la etapa (a) la capa transductora se
prepara por compactación de polvo de nanotubos de carbono.
19. Uso del electrodo selectivo de iones de
contacto sólido según las reivindicaciones 1-15
para la determinación cualitativa, cuantitativa o semicuantitativa
de analitos.
20. Uso según la reivindicación 19,
caracterizado porque los analitos son iones.
21. Uso según la reivindicación 20,
caracterizado porque los analitos son iones potasio.
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