JP4426700B2 - Highly sensitive quantification method of complementary nucleic acid fragments using DNA analysis element or PNA analysis element - Google Patents

Description

【００１１】
ＰＮＡは、電気的には中性であり、塩の存在しない条件下でも荷電することがない。ＰＮＡの有する機能は核酸のそれとほとんど同じと言っても、ＰＮＡと核酸とで形成される二本鎖は、ＤＮＡと核酸とで形成される二本鎖よりも安定であり、核酸の塩基配列をより厳密に認識できるという特徴を持つ（杉本直巳、日本化学会第７４回春季大会要旨集、１２８７頁）。そのため、ＰＮＡは、アンチセンス医薬以外にも各種診断薬への応用が期待されている分子である（特表平６−５０９０６３号の明細書）。
【００１２】
特開平１１−３３２５９５号公報には、固相担体表面にＰＮＡ断片をその一端で固定してなるＰＮＡプローブ、およびＰＮＡプローブを用いるＤＮＡ断片の検出方法が開示されている。このＰＮＡプローブは、アビジン−ビオチン法によって、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップにＰＮＡ断片を固定させたものである。ＰＮＡプローブを用いたＤＮＡ断片の検出は、表面プラズモン共鳴シグナルを測定することによって行なわれている。また、ＰＮＡプローブ、およびラジオアイソトープで標識した試料ＤＮＡ断片を用いて、相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出する方法も知られている（P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。上記のアビジン−ビオチン法および上記のラジオアイソトープ法では、何れも、ＰＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片との間に生じる電気的反発が少なくなるため、検出感度を向上させることができる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中に非常に僅かな量で含まれる、ＤＮＡ分析素子に固定されたＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を再現性良く定量することができる電気化学的な高感度定量法を提供することにある。また、本発明は、ＤＮＡのように負電荷を有しないというＰＮＡの性質を利用して、ＰＮＡ分析素子に固定されたＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を再現性良く定量することができる電気化学的な高感度定量法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、導電性基板の表面に導電性基板表面１ｍｍ^２当たり１０^−２０乃至１０^−１２モルの範囲の量のＤＮＡ断片がその一端で固定され、かつ該ＤＮＡ断片の固定領域以外の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍で固定されているＤＮＡ分析素子に、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、電位を印加しながら、導電性基板の表面に固定させたＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を接触させることにより、該試料核酸断片を結合させると共に、該電気化学活性分子をも結合させ、該電気化学活性分子と導電性基板との間を流れる電流量を測定することを特徴とする、ＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法にある。
上記ＤＮＡ分析素子は、導電性基板の表面に、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着し、そしてＤＮＡ断片をその一端で固定させ、次いでＤＮＡ断片が固定された導電性基板の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍に導電性基板の表面に結合可能な反応性基を有する化合物を含む溶液を滴下し、そして該鎖状分子を該反応性基を介して固定させることによって製造されたものである。
【００１５】
本発明で用いるＤＮＡ分析素子の好ましい態様は以下の通りである。
（イ）鎖状分子の親水性基が水酸基である。
（ロ）鎖状分子の導電性基板の表面への固定が、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に備えられたメルカプト基を介して行われている。
（ハ）鎖状分子が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、６−メルカプトヘキサノールおよびＮ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンからなる群より選ばれる化合物から誘導された分子である。
【００１８】
本発明は、また、導電性基板の表面に導電性基板表面１ｍｍ^２当たり１０^−２０乃至１０^−１２モルの範囲の量のＰＮＡ断片がその一端で固定され、かつ該ＰＮＡ断片の固定領域以外の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍で固定されているＰＮＡ分析素子に、ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、電位を印加しながら、導電性基板の表面に固定させたＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を接触させることにより、該試料核酸断片を結合させると共に、該電気化学活性分子をも結合させ、該電気化学活性分子と導電性基板との間を流れる電流量を測定することを特徴とする、ＰＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法にもある。
上記ＰＮＡ分析素子は、導電性基板の表面に、ＰＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着し、そしてＰＮＡ断片をその一端で固定させ、次いでＰＮＡ断片が固定された導電性基板の表面に、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有するか、或いは有していない鎖状分子が他方の端部もしくはその近傍に導電性基板の表面に結合可能な反応性基を有する化合物を含む溶液を滴下し、そして該鎖状分子を該反応性基を介して固定させることによって製造されたものである。
【００１９】
本発明で用いるＰＮＡ分析素子の好ましい態様は以下の通りである。
（イ）鎖状分子の親水性基が水酸基である。
（ロ）鎖状分子の導電性基板の表面への固定が、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に備えられたメルカプト基を介して行われている。
（ハ）鎖状分子が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、６−メルカプトヘキサノールおよびＮ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンからなる群より選ばれる化合物から誘導された分子である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
図１の（２）に、本発明で用いる代表的なマスクしたＤＮＡ分析素子５１の模式図を示す。マスクしたＤＮＡ分析素子５１は、導電性基板１１の表面に、多数のＤＮＡ断片がその一端部（端部の近傍を含む）で固定され、かつ固定されたＤＮＡ断片２１の固定領域以外の導電性基板の表面に、多数の鎖状分子４１ｂがその一端部もしくはその近傍で固定されてなる新規な分析素子である。
【００２２】
本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子５１は、図１の導電性基板１１の表面にＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液を点着し、必要であれば乾燥を行い、そしてＤＮＡ断片をその一端部（端部の近傍を含む）で固定させることによって得られる未処理のＤＮＡ分析素子３１の表面に、後述するマスク処理用化合物４１ａを含む溶液を滴下し、必要であれば乾燥させ、そして多数の鎖状分子４１ｂをその一端もしくはその近傍で固定させることによって製造される。
【００２３】
以下、本明細書で用いる用語を次のように定義する。
「本発明で用いるＤＮＡ分析素子」、「本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子」および「マスクしたＤＮＡ分析素子」とは、何れも、未処理のＤＮＡ分析素子（図１では、３１）にマスク処理が施されたＤＮＡ分析素子をいう。マスクしたＰＮＡ分析素子についても同様とする。
「ＰＮＡ断片」とは、合成によって得られたＰＮＡを切断等の操作により断片化したものを含まない。
「マスク処理」とは、マスク処理用化合物を含む溶液を、未処理のＤＮＡ分析素子表面の全体に滴下し、必要であれば乾燥させ、そして固定することをいう。
「マスク処理用化合物」とは、後に鎖状分子に誘導される原化合物をいう。
「ハイブリッドＤＮＡ」とは、マスクしたＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成される二本鎖断片を、「ハイブリッドＰＮＡ」とは、マスクしたＰＮＡ分析素子上に固定されたＰＮＡ断片と試料核酸断片とで形成される二本鎖断片をいう。
「ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子」とは、ハイブリッドＤＮＡに結合し、かつ電気化学活性を有するものをいう。但し、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子は、形成されたハイブリッドＤＮＡ以外に、マスクしたＤＮＡ分析素子上の一本鎖のＤＮＡ断片、あるいは一本鎖の試料核酸断片にも一時的に結合することがある。「ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子」についても同様である。
「結合」とは、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子がハイブリッドＤＮＡ構造内に挿入された状態、あるいはハイブリッドＤＮＡ構造外でハイブリッドＤＮＡに静電的に相互作用している状態をいう。
【００２４】
［導電性基板］
導電性基板としては、疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板、または疎水性（あるいは低親水性）の電気絶縁性の担体上に複数の疎水性（あるいは低親水性）の導電性基板が設けられてなる基板であることが好ましい。導電性の疎水性基板および電気絶縁性の疎水性担体は、何れも、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。
電気絶縁性の担体の材質としては、何れも、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体の厚さは、特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。
疎水性の導電性基板としては、電極、光ファイバ、フォトダイオード、サーミスタ、ピエゾ素子、表面弾性波素子なども好ましく用いることができるが、電極を用いることが特に好ましい。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることがが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。
【００２５】
導電性基板としては、疎水性の電気絶縁性の担体上に、複数の疎水性の導電性基板が設けられてなる基板を用いることが特に好ましい。このとき、導電性基板は、互いに接しないように、かつ規則的に電気絶縁性の担体上に配置されていることが好ましい。電気絶縁性の担体上に導電性基板を設ける前に、電気絶縁性の担体上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体の凹凸を軽減することができる。また、担体の種類によっては、その担体中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体も好ましく用いることができる。
【００２６】
電気絶縁性の担体上に複数の電極が配置されたものとしては、文献（Sosnowski,R.G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記載の、核酸が未固定のシリコンチップも好ましく用いることができる。また、プリント配線導電性基板のように、電極が導電性基板上に印刷されてなるものであってもよい。
【００２７】
［ＤＮＡ断片］
ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリ、ゲノムのライブラリあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましく、その塩基種も既知であることが好ましい。ＤＮＡ断片は、３乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。ＤＮＡ断片として、電気絶縁性の担体上に一定の間隔で配置された複数の導電性基板のそれぞれに、互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を固定させるため、そのような複数の種類のＤＮＡ断片を用いることも好ましい。
【００２８】
ＤＮＡ断片の導電性基板への固定方法としては、公知の方法を用いることができ、、ＤＮＡ断片の種類および導電性基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素, Vol. 43, No.13, 2004-2011(1998)）。合成ヌクレオチドを固定する場合には、導電性基板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合のための反応性基を導入したオリゴマーを合成し、表面処理した導電性基板に共有結合させる方法を用いることができる。例えば、導電性基板の表面が金で蒸着処理されている場合には、ＤＮＡ断片の５’もしくは３’末端にメルカプト基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、ＤＮＡ断片を導電性基板に固定する。該ＤＮＡ断片にメルカプト基を導入する方法は、文献（M.Maeda et al., Chem.Lett., 1805-1808(1994)およびB.A.Connolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484(1985)）に記載されている。導電性基板の表面がグラシーカーボンで塗布処理されている場合には、そのグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、導電性基板の表面にカルボン酸基を導入し、ＤＮＡ断片をアミド結合により導電性基板表面に固定することができる。実際の固定化方法については、文献（K.M.Millan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317-2323(1993)）に詳細が記載されている。ＤＮＡ断片は、予め調製されたハイブリッドＤＮＡであってもよい。ハイブリッドＤＮＡを金で蒸着処理された導電性基板に固定する場合には、ハイブリッドＤＮＡの片方の鎖の５’もしくは３’末端（好ましくは、５’末端）にメルカプト基を導入しておく。そして、固定後にハイブリッドＤＮＡを解離させて、一本鎖を固定させることもできる。
共有結合のための反応性基としては、アミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。導電性基板としてガラスやシリコンを用いる場合には、その表面処理には、公知のシランカップリング剤を用いることが好ましい。
【００２９】
ＤＮＡ断片の固定は、電気絶縁性の担体上に一定の間隔で配置された複数の導電性基板のそれぞれの上に、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散されてなる水性液を点着することによって実施することが好ましい。点着するＤＮＡ断片の濃度は、数ｐＭ乃至数ｍＭの範囲にあることが好ましく、数ｐＭ乃至数ｎＭの範囲にあることが特に好ましい。点着量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１０ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。ＤＮＡ断片を含む水性液中には、その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリコール、グリセロール等を挙げることができる。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うことも好ましい。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＤＮＡ断片が複数の導電性基板上に固定される。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
点着によって固定されたＤＮＡ断片の量は、導電性基板表面１ｍｍ²当たり１０^-20乃至１０^-12モルの量の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の固定量は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）等の機器分析の手段により決定することができる。
【００３０】
［ＰＮＡ断片］
本発明で好ましく用いられるＰＮＡ断片は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００３１】
【化２】

【００３２】
上記式中、Ｂ¹¹は、リガンドであって、天然の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＩもしくはＵ）あるいは塩基類似体を表す。Ｂ¹¹は、天然に見出される位置、即ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリンについては、９位において、チミン、ウラシルもしくはシトシンを含むピリミジンについては、１位において結合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の一部がＣからＮへ、もしくはＮからＣへ置換された化合物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾を施された化合物（スルフヒドリル基やハロゲン原子が導入された化合物）をいう。また、Ｂ¹¹は、核酸塩基を含まない芳香族部分、炭素原子数が１乃至４のアルカノイル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基類似体としては、７−デアザアデニン、６−アザウラシルおよび５−アザシトシンを挙げることができる。
典型的な核酸塩基リガンドおよび例示的合成リガンドについては、ＷＯ９２／２０７０２に図示されており、５−プロピルチミンおよび３−デアザウラシルは、ＤＮＡ断片への結合親和性を増加させることが知られている（特開平１１−２３６３９６号公報）。他の有用な天然にない核酸塩基としては、６−チオグアニンやピラゾロ［４，３ｄ］−ピリミジンが有用である（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４７９５）。
さらに、Ｂ¹¹は、ＤＮＡインターカレータ、レポーターリガンド（例えば、フルオロフォア）、ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン標識、あるいは放射性標識であってもよい。
Ｂ¹¹は、核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧもしくはＵ）であることが特に好ましい。
【００３３】
Ｒ¹¹は、水素原子、もしくは天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を含む炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のヘテロアリール基、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基、−ＮＲ¹³Ｒ¹⁴基、メルカプト基、および炭素原子数が１乃至６のアルキル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。炭素原子数が１乃至６のアルキル基は、さらに、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基もしくは炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基で置換されていてもよい。Ｒ¹³およびＲ¹⁴は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が１乃至３のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至３のアルキルチオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしくは水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基は、Ｒ¹¹が結合している炭素原子の水素原子と一緒になって脂環あるいは複素環を形成していてもよい。
【００３４】
Ｌ¹¹は、連結基を表し、−ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＲ¹²−基であることが好ましく、−ＣＯ−基であることが特に好ましい。Ｒ¹²は、水素原子、炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、水酸基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至４のアルキレン基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が１乃至４のアルキル基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい。
【００３５】
ｄは、１乃至６０の整数を表す。ｄは、１乃至４０の整数であることが好ましい。ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立に０乃至５の整数を表す。ａ、ｂおよびｃは、何れも１であることが好ましい。
【００３６】
本発明で用いるＰＮＡ断片は、下記一般式(ＩＩ)で表される化合物であることが特に好ましい。式中、Ｂ¹¹およびｄは、それぞれ、上記一般式（Ｉ）のＢ¹¹、ｄを表す。
【００３７】
【化３】

【００３８】
ＰＮＡ断片の導電性基板への固定方法としては、公知の方法を用いることができる（蛋白質・核酸・酵素, Vol.43, No.13, 2004-2011(1998)、および特開平９−２８８０８０号公報）。固定方法は、ＰＮＡ断片の種類および導電性基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる。例えば、導電性基板上で直接、ＰＮＡ断片を合成する方法、あるいは予め合成したＰＮＡ断片を導電性基板表面に点着して、Ｎ末端もしくはＣ末端にて固定させる方法を用いることができる。導電性基板の表面は、ＰＮＡ断片を固定させるために予め処理をしておくことが好ましい。別途合成したＰＮＡ断片を用いる場合には、合成したＰＮＡ断片の一方の末端に、導電性基板との結合のための反応性基を導入しておくことが好ましい。反応性基としては、アミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。導電性基板の表面処理としては、例えば、導電性基板がグラシーカーボンである場合には、導電性基板を過マンガン酸カリウムで処理することが好ましい。
【００３９】
ＰＮＡ断片の固定は、ＰＮＡ断片を含む水性液を導電性基板上に点着して行うことが好ましい。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＰＮＡ断片のが導電性基板表面に固定される。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うことも好ましい。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、固定されていないＰＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００４０】
［マスク処理］
本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子は、マスク処理用化合物を含む溶液をＤＮＡ分析素子の表面に点着することによって作製することが好ましい。マスク処理用化合物は、０．５乃至２ｍＭの範囲で用いることが好ましく、０．８乃至１．５ｍＭの範囲で用いることが特に好ましい。マスク処理用化合物を点着後、所定の温度（好ましくは、室温）で数時間放置することが好ましい。点着後、必要であればインキュベーションを行ってもよい。マスクしたＤＮＡ分析素子は、数日間保存することが可能で、また数回であれば繰り返し使用することもできる。
【００４１】
マスク処理用化合物は、一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有する、途中に環状基を有していてもよい鎖状分子に、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部もしくはその近傍に、導電性基板の表面に結合可能な反応性基が結合している化合物である。該鎖状分子は、導電性基板の表面に結合可能な反応性基を介して、導電性基板の表面に固定される。
一方の端部もしくはその近傍に親水性基を有するとは、親水性基が必ずしも鎖状分子の末端に位置していなくてもよいことを示すが、端部に親水性基を有することが好ましい。親水性基は、一個であっても、複数個であってもよい。導電性基板の表面に結合可能な反応性基は、該鎖状分子の親水性基側端部とは逆側の端部に結合していることが好ましい。途中に環状基を有していてもよい鎖状分子は、マスク処理用化合物から誘導された分子である。
マスク処理用化合物としては、導電性基板に固定されているＤＮＡ断片よりも直鎖の長さが短い化合物であって、直鎖の炭素原子数が１乃至６のアルキレン基の一方の末端に親水性基を有しかつ他方の末端に導電性基板と結合する反応性基を有する化合物であることが好ましい。
【００４２】
導電性基板の表面に結合可能な反応性基としては、メルカプト基、スルフィド基、ジスルフィド基、チオカルボニル基およびチオカルボン酸基からなる群より選ばれる基を挙げることができる。導電性基板の表面にアミノ基、アルデヒド基、カルボン酸基等の反応性基を導入する処理を予め施している場合には、該反応性基としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、アミド基、カルボン酸基、アルデヒド基、エポキシ基および過オキシ酸基からなる群より選ばれる基を挙げることもできる。上記の該反応性基としては、メルカプト基、チオカルボニル基もしくはスルフィド基であることがさらに好ましく、メルカプト基であることが特に好ましい。
【００４３】
親水性基は、水酸基、カルボン酸基、アミド基、リン酸基もしくはスルホン酸基であることが好ましく、水酸基であることが特に好ましい。但し、導電性基板の表面に結合可能な反応性基とは、互いに異なるものであることが好ましい。
環状基は、環構成炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数が３乃至６のシクロアルキル基、あるいはＮ、Ｓ、ＯおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数が２乃至１０の複素環基であることが好ましい。環状基は、導電性基板の表面に結合可能な反応性基が共同して環状基を形成している基であってもよい。後者の好ましい例として、イミダゾール−２−チオン基を挙げることができる。
【００４４】
よって、マスク処理用化合物としては、メルカプトメタノール、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、５−メルカプトペンタノール、６−メルカプトヘキサノール、Ｎ，Ｎ’−ジ（３−ヒドロキシ−ｎ−プロピル）−イミダゾール−２−チオンもしくは文献に記載のイミダゾール−２−チオン誘導体（A.J.Arduengo et al., J.Am.Chem.Soc., 1990, 112, 6153-6154）であることが好ましく、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、４−メルカプトブタノール、５−メルカプトペンタノール、６−メルカプトヘキサノールであることがさらに好ましく、２−メルカプトエタノールであることが特に好ましい。上記のマスク処理用化合物は、そのナトリウム、カリウム等の塩であってもよく、また、そのアルキレン鎖が特定の置換基によって置換されていてもよい。その特定の置換基としては、炭素原子数が１乃至６の炭化水素基（好ましくは、メチル基、エチル基、フェニル基等）であることが好ましい。
ＤＮＡ断片の固定方法に応じて、マスク処理用化合物を選択することが望ましい。二種類以上のマスク処理用化合物を組み合わせて使用してもよい。
【００４５】
ＤＮＡ分析素子にマスク処理を施すと、図１に示すように、多数のマスク処理用化合物は、その親水性基を導電性基板の表面から外側方向に向けて整列した親水性の表面を形成する。図１の（２）の４２は、親水性基を表す。
【００４６】
［ハイブリダイゼーション］
ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ分析素子を用いる場合には、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、ＰＮＡ分析素子を用いる場合には、ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子の存在下にて、マスクしたＤＮＡ分析素子あるいはマスクしたＰＮＡ分析素子に試料核酸断片を接触させることによって実施する。
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子は、ハイブリダイゼーションの終了後に、形成されたハイブリッドＤＮＡに接触させてもよい。この場合には、ハイブリダイゼーションの終了後、界面活性剤（好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム）と緩衝液（好ましくは、クエン酸緩衝液）との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去しておくことが好ましい。または、ハイブリダイゼーションの際に試料核酸断片を含む水性液中に該電気化学活性分子を含めることによって、形成されたハイブリッドＤＮＡに接触させてもよい。該電気化学活性分子は、（一本鎖の）試料核酸断片あるいは試料中に含まれる二本鎖の試料核酸断片に、該電気化学活性分子が非特異的に結合するのを避けるため、ハイブリダイゼーション終了後に未反応の試料核酸断片を除去してから、接触させることが望ましい。ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子についても同様である。ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子あるいはハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子は、１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範囲にて用いることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましいが、導電性基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長、試料核酸断片の種類などに応じて、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定することが望ましい。例えば、遺伝子発現の解析を目的とする場合には、低発現の遺伝子も充分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましく、一塩基変異の検出を目的とする場合には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤（好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム）と緩衝液（好ましくは、クエン酸緩衝液）との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。
【００４７】
［試料核酸断片］
試料核酸断片としては、生物試料から抽出したＤＮＡ断片、遺伝子操作によって作製したＤＮＡ断片等を制限酵素等で切断し、次いで電気泳動による分離等で精製したＤＮＡ断片、または化学合成で得られた一本鎖のＤＮＡ断片を用いることが好ましい。生物試料等から得られたＤＮＡ断片の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖のＤＮＡ断片に解離させておくことが好ましい。
制限酵素で切断を受けたＤＮＡ断片は、一般的に複数個の種類のＤＮＡ断片となるが、これを試料ＤＮＡ断片として用いる場合のＤＮＡ断片は、一種類であっても複数個の種類であってもよい。試料ＤＮＡ断片は、数ｐＭ乃至数ｍＭの範囲にあることが好ましく、数ｐＭ乃至数ｎＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００４８】
［ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子およびハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子］
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子は、ハイブリッドＤＮＡに結合し、かつ電気活性活性を有する分子であれば何れのものも用いることができる。ハイブリッドＤＮＡは、図１の（３）に示すように、マスクしたＤＮＡ分析素子に試料核酸断片を接触させて得られるものであることが好ましいが、このような方法によらなくても、マスクしたＤＮＡ分析素子に関与しない方法で別途調製されたものであってもよい。マスクしたＤＮＡ分析素子をマスクしたＰＮＡ分析素子に置き換えた場合にも、上記と同様である。
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子（あるいはハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子）は、マスクしたＤＮＡ分析素子（マスクしたＰＮＡ分析素子）を対応する電気化学活性分子を含む溶液に浸漬する方法、あるいはマスクしたＤＮＡ分析素子（マスクしたＰＮＡ分析素子）上に対応する電気化学活性分子を含む溶液を滴下する方法によって、ハイブリッドＤＮＡ（あるいはハイブリッドＰＮＡ）に接触させることができる。ハイブリッドＤＮＡへの結合の様式は、インターカレート型、ハイブリッドへの溝（主溝もしくは副溝）結合型等の何れであってもよい。
ハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子は、ハイブリッドＰＮＡに結合し、かつ電気活性活性を有する分子であれば何れのものも用いることができる。ハイブリッドＰＮＡへの結合様式は、ハイブリッドＤＮＡの場合と同様である。
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子およびハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子は、何れも１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範囲で用いることが好ましい。
【００４９】
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子およびハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子としては、同一の分子を使用することができ、このような分子の具体例としては、導電性基で標識された縫い込み型インターカレータを挙げることができる。
導電性基で標識された縫い込み型インターカレータは、酸化還元活性を有する物質であることが好ましい。酸化還元活性部分としては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体、ビオローゲン化合物等であることが好ましく、フェロセン化合物であることが特に好ましい。インターカレータ部分としては、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノン等であることが好ましく、ナフタレンジイミドであることが特に好ましい。よって、該インターカレータとしては、フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと対応するアミン体との反応により合成される下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（S.Takenaka et al., J.Chem.Soc.,Commun., 1111(1998)）であることが特に好ましい。
【００５０】
【化４】

【００５１】
また、下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
【００５２】
【化５】

【００５３】
但し、Ｘは下記式で表される一つの結合手を有するフェロセン誘導体である。
【００５４】
【化６】

【００５５】
【化７】

【００５６】
【化８】

【００５７】
【化９】

【００５８】
導電性基で標識された縫い込み型インターカレータには、酸化還元活性部分とインターカレータ部分とを繋ぐリンカー部分がある。前記式で表される１，４−ジプロピルピペラジニル基がこのリンカー部分に相当する。このピペラジニル基の代わりに、四級化されたイミノ基を導入することもできる。四級化されたイミノ基を導入した下記式で表されるインターカレータは、反応系のｐＨに関わらすカチオン性となるために、ハイブリッドＤＮＡあるいはハイブリッドＰＮＡの結合がより強くなる。四級化されたイミノ基を導入したインターカレータは、ＰＮＡ分析素子を用いる場合に特に有効である。リンカー部分に相当する基としては上記記載のものに限定されない。例えば、ピペラジニル基の代わりに、Ｎ−アルキル基（アルキル基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基であることが好ましく、メチル基、エチル基もしくはｎ−プロピル基であることが特に好ましい）を導入することも好ましい。リンカー部分に相当する基の構造の違いより、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。
【００５９】
【化１０】

【００６０】
縫い込み型インターカレータとして上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合し、二塩基おきに配列してハイブリッドＤＮＡに飽和している。このことは、ナフタレンジイミド誘導体の二つのフェロセン分子が、それぞれハイブリッドＤＮＡの主溝と副溝とに密に並んだ状態を意味している。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡからの解離速度が極めて遅くなり、ハイブリッドＤＮＡとナフタレンジイミド誘導体との安定な複合体を形成することができる。また、ナフタレンジイミド誘導体のハイブリッドＤＮＡへの結合がインターカレーションモードであることは、一般的にハイブリッドＤＮＡに該インターカレータを接触させたときに、粘度の変化が認められることにより確認される。例えば、ウイルスＳＶ４０に代表される閉環状プラスミドは、インターカレーションが起こると、超らせんの変化に伴って粘度も変化することが知られている。一方、該インターカレータは、一本鎖ＤＮＡ断片に対しては結合しないか、あるいは一旦結合してもすぐに解離して遊離のインターカレータとなる。
【００６１】
［試料核酸断片の高感度定量法］
図１は、本発明の高感度定量法の代表的な方法を模式的に示すものでもある。マスクしたＤＮＡ分析素子５１に、ＤＮＡ断片２１と相補性を有する試料核酸断片６１が溶解あるいは分散されてなる試料水性液を接触させると、該試料核酸断片６１がＤＮＡ断片２１とハイブリッドＤＮＡ７１を形成する。ここに、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子８１を接触させると、該電気化学活性分子８１ａが７１に結合する。次いで、導電性基板１１に電位を印加し、８１ｂと導電性基板１１との間を流れる電流量を測定するとによって、ハイブリッドＤＮＡ７１、即ち試料核酸断片６１を検出・定量することができる。以下、ＤＮＡ分析素子を用いる場合を中心に説明するがＰＮＡ分析素子についても同様である。
【００６２】
本発明の高感度定量法では、マスクしたＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片の量に対して一定の関係を満たすように調整した、相補性を有する試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる試料水性液を接触させる。ハイブリダイゼーションは、接触によって開始する。接触方法は、該水性液を分析素子表面に点着する方法であっても、該水性液中に分析素子を浸漬する方法の何れであってもよいが、前者であることが好ましい。一定の関係とは、ＤＮＡ断片の固定量に対する、ＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片のＤＮＡ断片に接触する量の比が、約１乃至１０⁴の範囲にあることを示す。しかし、該比が１０⁴より大きいと、導電性基板上にハイブリダイゼーションに関与しないＤＮＡ断片が非常に多く存在することになり、ここにハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子を接触させると、その非関与ＤＮＡ断片に静電的に結合した該電気化学活性分子の存在が原因となって、ハイブリッドＤＮＡと該電気化学活性分子とで形成される複合体の存在の識別が困難となる。このことは検出感度の低下を招く原因となる。該電気化学活性分子は、ハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合する性質を有することから、上記の比が１に近いければ近いほど、非関与ＤＮＡ断片への該電気化学活性分子の結合は抑えられる。
【００６３】
ＤＮＡ断片の固定量が１０^-10モル／ｍｍ²以上の量である場合には、ＤＮＡ断片は、導電性基板上で密集状態にあると推定される。このとき、ＤＮＡ断片は、それらのすべてが導電性基板の表面に対して垂直方向に伸張した状態で固定されているわけではなく、実際にはＤＮＡ断片が絡まった状態、複数のＤＮＡ断片同士が互いに絡まり合った凝集状態等をとっているものと考えられる。一方、ＤＮＡ断片の固定量が１０^-12モル／ｍｍ²以下の場合には、ＤＮＡ断片は互いに少しの間隔をおいて固定されるが、導電性基板の表面にＤＮＡ断片が固定されていない領域（以下、「すき間」という）が生じる。そのため、ＤＮＡ断片は、導電性基板表面に沿って倒れ、垂直方向に伸張し難くなると考えられる。導電性基板の表面に沿って倒れたＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片が有する極性基と導電性基板の表面との弱い相互作用を生じさせ、二本鎖形成反応の効率を低下させると考えられる。
【００６４】
マスクしたＤＮＡ分析素子に、導電性基板１ｍｍ²当たり１０^-16モル以下の量の試料核酸断片を接触させ、このレベルの量が定量できるためには、導電性基板上のＤＮＡ断片の固定量は、前記記載の関係より１０^-20乃至１０^-12モル／ｍｍ²の範囲にあることが好ましい。このとき、導電性基板の表面には、さらに多くのすき間が生じていることになる。このことは、ＤＮＡ断片に好ましくない固定状態をさらにとらせることになる。従って、マスク処理の効果の一つは、導電性基板表面上のＤＮＡ断片の垂直方向への整列化にあると考えられる。
マスク処理を施すことによって、導電性基板表面１ｍｍ²当たり１０^-20乃至１０^-16モルの範囲の量の相補性を有する試料核酸断片を定量することができる。さらに、面積の小さい導電性基板を使用することによって、１０^-21モル／ｍｍ²まで定量限界を向上させることができる。特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法では、１０^-15モル／ｍｍ²の量が定量限界であることから、本発明の定量法は、１０^-16モル以下の量の該試料核酸断片を検出し、かつ定量できる初めての電気化学的方法である。
【００６５】
他の効果としては、試料核酸断片およびハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の導電性基板の表面への非特異的吸着を防止する効果を挙げることができる。ＤＮＡ分析素子にマスク処理を行うことによって、すき間にマスク処理用化合物がその一端もしくはその近傍で固定されるため、すき間が埋められる結果、試料核酸断片および該電気化学活性分子の非特的吸着を防止することができる。ＤＮＡ分析素子に対してマスク処理を施すとバックグラウド電流が大きく軽減されることが確認されている。マスク処理用化合物の親水性基は、ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の疎水的吸着の防止に寄与する。さらにマスク処理の他の効果としては、ＤＮＡ分析素子におけるＤＮＡ断片の修飾量の減少を抑えることが挙げられる。
【００６６】
前述したように、導電性基板に固定させたＤＮＡ断片の中に二本鎖の形成に関与しないＤＮＡ断片が多く存在する場合に、ここにＤＮＡ結合性電気化学活性分子を接触させると、該電気化学活性分子のＤＮＡ断片への非特的吸着が起こる。このような吸着を回避するため、該電気化学活性分子を含む水溶液の塩濃度は、０．１Ｍ以上であることが好ましく、０．１乃至１．０Ｍの範囲にあることが特に好ましい。
【００６７】
ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の接触後は、導電性基板を洗浄しないことが好ましい。洗浄によって、遊離の該電気化学活性分子を除去することはできるが、一旦ハイブリッドＤＮＡに結合した該電気化学活性分子も外れるおそれがあるためである。
【００６８】
ハイブリッドＤＮＡへのハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の結合は、電流を測定することにより検出する。電流の測定には、電位を印加して流れる電流を測定できる方法であれば何れの方法も用いることができ、サイクリックボルタモグラフィ（ＣＶ）、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ（ＤＰＶ）、ポテンショスタット等を用いることが好ましく、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを用いることが特に好ましい。
【００６９】
本発明の高感度定量法では、試料核酸断片の量が、マスクしたＤＮＡ分析素子に対して導電性基板１ｍｍ²当たり１０^-21乃至１０^-16モルの範囲にあるように調製された試料水性液を用いることが好ましく、１０^-20乃至１０^-18モルの範囲にあるように調製された試料水性液を用いることが特に好ましい。
【００７１】
【実施例】
［実施例１］
（１）ＤＮＡ分析素子の作製
面積が１ｍｍ²の金電極を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１時間浸積し、水で洗浄後、濃硝酸に浸し、１５分間攪拌した。この金電極を超純水で洗浄後、金電極表面に、５’末端にメルカプトヘキシル基を有するアデニンの２０量体（ＨＳ−ｄＡ₂₀）（１０^-14モル／μＬ）の水溶液１μＬを点着し、２時間放置した後、超純水で洗浄し、ＤＮＡ分析素子を作製した。また、ＨＳ−ｄＡ₂₀の合成には、特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法に従って行った。
（２）ＤＮＡ分析素子のマスク処理
上記（１）で得られたＤＮＡ分析素子の上に、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）の水溶液１μＬを滴下し、該分析素子にキャップをして２時間放置した。次いで、キャップを外して超純水で洗浄し、マスクしたＤＮＡ分析素子とした。
（３）フェロセン縫い込み型インターカレータの合成
下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミドは、特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法に従って合成した。
【００７２】
【化１１】

【００７３】
（４）試料ＤＮＡ断片の検出
試料ＤＮＡ断片として、チミンの２０量体（ｄＴ₂₀）を上記公報に記載の方法に従って合成し、ｄＴ₂₀（１０^-20モル／μＬ）の水溶液１μＬを、上記（２）で得たマスクしたＤＮＡ分析素子の表面に点着し、２５℃で３０分間放置した。次いで、２０℃に保った恒温セル中の電解質溶液（上記（３）で得たフェロセン化ナフタレンジイミド（５０μＭ）を含む０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液の混合液）に、上記の放置後の分析素子（作用極）、白金（対極）および銀／塩化銀参照電極を浸漬して三電極を形成させ、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ（ＤＰＶ）を測定した。そして、そのＤＰＶより、４６０ｍＶにおけるピーク電流値を求めた。
試料ＤＮＡ断片（ｄＴ₂₀）の濃度を、１０^-19、１０^-18モル／μＬにそれぞれ変える以外は上記と同様にして、それぞれのＤＰＶを測定し、各ピーク電流値を求めた。試料ＤＮＡ断片の点着量に対するピーク電流値を図２の−○−に示す。
【００７４】
次に、試料ＤＮＡ断片をｄＡ₂₀（アデニンの２０量体、前記公報に記載の方法に従って合成）に変える以外は上記と同様の操作を行って、試料ＤＮＡ断片の点着量に対するピーク電流値を求めた（図２の−□−）。
【００７５】
図２より、試料ＤＮＡ断片の点着量とピーク電流値との関係は、試料ＤＮＡ断片の点着量が電極表面１ｍｍ²当たり１０^-20〜１０^-18モルの範囲において、ほぼ良好な直線関係を示すことが分かる。従って、点着量が１０^-20〜１０^-18モル／ｍｍ²の範囲となるように濃度が調製された試料ＤＮＡ断片について、充分に定量を行うことができる。
【００７６】
［実施例２］
（１）ＰＮＡ分析素子の作製
表面にメルカプト基を有する面積が２．２５ｍｍ²の金電極に、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液を滴下して得られる、一方の端部のビニルスルホニル基が遊離な金電極に、５０ｎＭの下記式で表されるＰＮＡ断片：ＰＮＡ−Ｔ₁₀の水溶液（１ｎＬ）を滴下し、室温で１時間放置し、電極に固定されなかったＰＮＡ−Ｔ₁₀を蒸留水で洗浄してＰＮＡ分析素子を作製した。尚、ＰＮＡ−Ｔ₁₀については、文献（P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1897(1992)および114, 9677-9678(1992)）に記載の方法に従って合成した。Ｔは、チミンを表す。
【００７７】
【化１２】

【００７８】
（２）ＰＮＡ分析素子のマスク処理
上記（１）で得られたＰＮＡ分析素子の上に、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）の水溶液１μＬを滴下し、該分析素子にキャップをして２時間放置した。次いで、キャップを外して超純水で洗浄し、マスクしたＰＮＡ分析素子とした。
（３）試料ＤＮＡ断片の検出
マスクしたＤＮＡ分析素子の代わりに、上記（２）で得たマスクしたＰＮＡ分析素子を用いる以外は実施例１の（４）と同様の操作を行ったところ、図２の−○−とほぼ同様な結果が得られた。
【００７９】
【発明の効果】
本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子は、極微量のＤＮＡ断片が固定されてなるＤＮＡ分析素子に生じるすき間をマスク処理して得られたものであり、このマスク処理は、効率のよいハイブリダイゼーションが行えるようにＤＮＡ断片を整列させると共に、試料核酸断片およびハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子の導電性基板の表面への非特異的吸着を防止する効果を有する。マスクしたＤＮＡ分析素子を使用することによって、ハイブリダイゼーションの効率を向上させ、検出の感度を向上させることができる。従って、本発明者は、現在のＤＮＡチップ技術の定量限界と並ぶ、電気化学的手法による初めての、ゼプトモルのレベルの試料核酸断片を再現性良く定量できる超高感度な定量法を確立することに成功した。本発明の定量法を用いることによって、遺伝子発現のモニタリング、遺伝子解析等を高感度、迅速、かつ簡便に行うことができる。
【００８０】
また、本発明者は、本発明で用いるマスクしたＰＮＡ分析素子を用いる場合にも、本発明で用いるマスクしたＤＮＡ分析素子の場合と同様に、試料核酸断片の超高感度な定量に成功した。特に、マスクしたＰＮＡ分析素子を用いる方法では、ＰＮＡ断片と試料核酸断片との電気的な反発が抑えられるために、より効率のよいハイブリダイゼーションが可能となる。これは、ハイブリッドＰＮＡを形成していないＰＮＡ断片とハイブリッドＰＮＡ結合性電気化学活性分子との結合を回避できるために、検出感度が上昇したものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明で用いる代表的なマスクしたＤＮＡ分析素子、および本発明の代表的な相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法を模式的に表した図である。
【図２】 実施例１の、ハイブリッドＤＮＡが形成された場合および形成されなかった場合の試料核酸断片の点着量とピーク電流値との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１１ 導電性基板
２１ 固定されたＤＮＡ断片
３１ ＤＮＡ分析素子
４１ａ マスク処理用化合物
４１ｂ ＤＮＡ分析素子に固定された鎖状分子
４２ 親水性基
５１ マスクしたＤＮＡ分析素子
６１ ＤＮＡ断片と相補性を有する試料核酸断片
７１ ハイブリッドＤＮＡ
８１ａ ハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子
８１ｂ ハイブリッドＤＮＡに結合したハイブリッドＤＮＡ結合性電気化学活性分子[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA analysis element, a PNA analysis element, and a method for quantifying complementary sample nucleic acid fragments contained in a very small amount in a sample.
[0002]
[Prior art]
Detection of a DNA fragment to be detected in a sample is performed by using a known DNA fragment having complementarity to the base sequence of the DNA fragment, to form a hybrid formed by the DNA fragment in the sample and the known DNA fragment, In general, the detection is performed by an electrochemical method, a fluorescence method, a radioisotope method, or the like. The electrochemical method is superior to the fluorescence method and the like in that it can be sufficiently measured with a simple measuring device and that no fading occurs due to excitation light. Complementary known DNA fragments are usually referred to as “probes” or “probe DNAs” because they are used by being immobilized on a solid support. A sample DNA fragment detection method using a probe DNA is widely used for detection of pathogenic bacteria and screening of genes.
[0003]
As an electrochemical method, there is known a method in which a ferrocene-modified DNA fragment (a DNA fragment modified with ferrocenecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester) is applied to an electrode-type sensor (Japanese Patent Laid-Open Nos. 9-288080 and 57). Proceedings of the Annual Meeting of Analytical Chemistry, p137-138 (1996)). That is, a ferrocene-modified DNA fragment immobilized on the surface of an electrode having an output terminal is reacted with a single-stranded sample DNA fragment in the presence of an electrochemically active threaded intercalator, and the ferrocene-modified DNA fragment and the sample DNA fragment are reacted. The sample DNA fragment having complementarity is quantified by measuring the amount of current flowing between the intercalator bound to the double-stranded DNA fragment formed by the electrode and the electrode.
[0004]
In the above method, the area is about 1 mm.²About 10 on the electrode surface^-11A molar amount of the ferrocene-modified DNA fragment is immobilized, and when the sample DNA fragment is brought into contact therewith, the ferrocene-modified DNA fragment is complementary to 10^-15Thru 10^-11Mol / mm²It is said that a sample DNA fragment in an amount in the range can be quantified. However, with this method, 10^-16Mol / mm²It is not clear whether the following amounts of sample DNA fragments can be quantified.
[0005]
On the other hand, a sample DNA fragment that is complementary to the DNA fragment is detected by bringing the sample DNA fragment into contact with a DNA modified electrode in which the DNA fragment is fixed to the electrode in the presence of the electrochemically active threaded intercalator. A method is known (The 47th Polymer Society Proceedings, p3155-3156 (1998)). This method differs from the above method in that the ferrocene compound is not previously modified on the DNA fragment immobilized on the electrode surface. In this method, the area is 2 mm²About 10 on the electrode surface^-11A molar amount of the DNA fragment is immobilized, and about 10 times or more of the sample DNA fragment is brought into contact therewith to give about 10^-11Molar amounts of sample DNA fragments can be detected. But 10^-12The detection of sub-molar amounts of sample DNA fragments has not been clarified, nor is the quantitative nature of the sample DNA fragments shown.
[0006]
One method for efficiently analyzing gene function is to use a DNA chip in which a large number of DNA fragments are aligned on a solid support such as a glass slide (Fodor SPA, Science, 251, 767 (1991) and Schena M , Science, 270, 467 (1995)), the amount of sample DNA fragments that can be quantified at present is 10^-19Mole / dot is the limit. In the case of using a DNA chip, the detection is most commonly performed by fluorescence, and the problems of detection by this method are as described above.
[0007]
However, in the case of gene expression monitoring (especially low-expression gene monitoring), gene mutation analysis, gene polymorphism analysis, etc., 10^-19Sensitivity higher than the molar level is required. Therefore, there is a need for a method for detecting and quantifying genes that is simple and satisfies high sensitivity above the level, except for the fluorescence method.
[0008]
In Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-236396, DNA is a molecule having a negative charge, but PNA (peptide nucleic acid) which does not have a negative charge and mimics DNA or RNA is used instead of the DNA. It is disclosed.
[0009]
PNA is known as one of so-called antisense molecules. When a gene is expressed, an antisense molecule binds with high selectivity to a transcription region of a DNA base sequence that becomes a single strand or a translation region of an RNA base sequence, and restricts the function of that region. It is a working molecule and is known as an antisense drug in the field of gene therapy. PNA has a nucleobase in its molecule like a nucleic acid, and specifically hybridizes to a nucleic acid having a complementary base sequence to form a double strand (PENielsen et al., Science, 254, 1497-1500 (1991)). PNA is functionally almost the same as a nucleic acid, but its structure is completely different, and it is based on a polyamide based on N- (2-aminoethyl) glycine, and contains sugar and phosphate in the molecule. Absent. The nucleobase is usually bonded to the polyamide skeleton via a methylenecarbonyl group. Below, the typical structure of PNA is shown with the structure of DNA.
[0010]
[Chemical 1]

[0011]
PNA is electrically neutral and does not charge even in the absence of salt. Although the function of PNA is almost the same as that of nucleic acid, the double strand formed by PNA and nucleic acid is more stable than the double strand formed by DNA and nucleic acid. It has a feature that it can be recognized more precisely (Naoto Sugimoto, Abstracts of the 74th Spring Meeting of the Chemical Society of Japan, page 1287). Therefore, PNA is a molecule that is expected to be applied to various diagnostic agents in addition to antisense drugs (specification of JP-T-6-509063).
[0012]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-332595 discloses a PNA probe in which a PNA fragment is fixed at one end to the surface of a solid support, and a DNA fragment detection method using the PNA probe. This PNA probe is obtained by immobilizing a PNA fragment on a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor by an avidin-biotin method. Detection of a DNA fragment using a PNA probe is performed by measuring a surface plasmon resonance signal. In addition, a method for detecting a sample DNA fragment having complementarity using a PNA probe and a sample DNA fragment labeled with a radioisotope is known (PENielsen et al., Science, 254, 1497-1500 (1991). )). In both the avidin-biotin method and the radioisotope method described above, the electric repulsion generated between the PNA fragment and the sample DNA fragment is reduced, so that the detection sensitivity can be improved.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
  The present invention contains a very small amount in the sample.DElectrochemical high-sensitivity quantification capable of reproducibly quantifying sample nucleic acid fragments that are complementary to DNA fragments immobilized on an NA analysis elementThe lawIt is to provide. In addition, the present invention utilizes the property of PNA that does not have a negative charge like DNA,PNElectrochemical high-sensitivity quantification method capable of quantitatively quantifying a sample nucleic acid fragment having complementarity to a PNA fragment immobilized on an A-analyzerOfferThere is to serve.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
  In the present invention, the conductive substrate surface is 1 mm on the surface of the conductive substrate.²10 per hit^-20Thru 10^-12A DNA fragment having a molar amount is fixed at one end thereof, and has a hydrophilic group at one end or in the vicinity thereof on the surface other than the fixing region of the DNA fragment, or has a cyclic group in the middle thereof, or The surface of the conductive substrate is applied with a potential applied to a DNA analysis element in which a chain molecule not possessed is fixed at or near the other end in the presence of a hybrid DNA-binding electrochemically active molecule. By contacting an aqueous solution in which a sample nucleic acid fragment having a complementarity to a DNA fragment immobilized on the DNA is dissolved or dispersed, the sample nucleic acid fragment is bound, and the electrochemically active molecule is also bound. It is a highly sensitive quantification method for a sample nucleic acid fragment having complementarity to a DNA fragment, characterized by measuring an amount of current flowing between a chemically active molecule and a conductive substrate.
The above-described DNA analysis element is prepared by spotting an aqueous solution in which DNA fragments are dissolved or dispersed on the surface of a conductive substrate, fixing the DNA fragment at one end thereof, and then fixing the DNA fragment on the conductive substrate. A chain molecule that has a hydrophilic group at one end or in the vicinity of it, has a cyclic group in the middle, or does not have it can bind to the surface of the conductive substrate at or near the other end. A solution containing a compound having a reactive group is dropped, and the chain molecule is immobilized through the reactive group.
[0015]
  Preferred embodiments of the DNA analysis element used in the present invention are as follows.
  (A) The hydrophilic group of the chain molecule is a hydroxyl group.
  (B) The chain molecule is fixed to the surface of the conductive substrate through a mercapto group provided at the end opposite to the hydrophilic base side end of the chain molecule.
  (C) The chain molecule is selected from the group consisting of 2-mercaptoethanol, 3-mercaptopropanol, 6-mercaptohexanol and N, N′-di (3-hydroxy-n-propyl) -imidazole-2-thione. A molecule derived from a compound.
[0018]
  The present invention also provides a conductive substrate surface 1 mm on the surface of the conductive substrate.²10 per hit^-20Thru 10^-12A molar amount of PNA fragment is fixed at one end thereof, and has a hydrophilic group at one end or in the vicinity thereof on the surface other than the fixing region of the PNA fragment, or has a cyclic group in the middle, or While applying potential in the presence of hybrid PNA-binding electrochemically active molecules to the PNA analytical element in which the chain molecules not possessed are fixed at or near the other end, the surface of the conductive substrate By contacting an aqueous solution in which a sample nucleic acid fragment having a complementarity to the PNA fragment immobilized on the gel is dissolved or dispersed, the sample nucleic acid fragment is bound and the electrochemically active molecule is also bound. There is also a high-sensitivity quantification method for a sample nucleic acid fragment having complementarity to a PNA fragment, characterized in that the amount of current flowing between the chemically active molecule and the conductive substrate is measured.
In the PNA analysis element, an aqueous liquid in which a PNA fragment is dissolved or dispersed is spotted on the surface of the conductive substrate, and the PNA fragment is fixed at one end thereof, and then the conductive substrate on which the PNA fragment is fixed. A chain molecule that has a hydrophilic group at one end or in the vicinity of it, has a cyclic group in the middle, or does not have it can bind to the surface of the conductive substrate at or near the other end. A solution containing a compound having a reactive group is dropped, and the chain molecule is immobilized through the reactive group.
[0019]
  Preferred embodiments of the PNA analytical element used in the present invention are as follows.
  (A) The hydrophilic group of the chain molecule is a hydroxyl group.
  (B) The chain molecule is fixed to the surface of the conductive substrate through a mercapto group provided at the end opposite to the hydrophilic base side end of the chain molecule.
  (C) The chain molecule is selected from the group consisting of 2-mercaptoethanol, 3-mercaptopropanol, 6-mercaptohexanol and N, N′-di (3-hydroxy-n-propyl) -imidazole-2-thione. A molecule derived from a compound.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  FIG. 1 (2) shows the present invention.Used inA schematic diagram of a representative masked DNA analysis element 51 is shown. The masked DNA analysis element 51 has a large number of DNA fragments fixed to the surface of the conductive substrate 11 at one end (including the vicinity of the end) and conductivity other than the fixed region of the fixed DNA fragment 21. This is a novel analytical element in which a large number of chain molecules 41b are fixed on the surface of a substrate at one end or in the vicinity thereof.
[0022]
  The present inventionUsed inThe masked DNA analysis element 51 is spotted with an aqueous solution in which DNA fragments are dissolved or dispersed on the surface of the conductive substrate 11 of FIG. 1, dried if necessary, and the DNA fragments are attached to one end ( A solution containing a mask treatment compound 41a described later is dropped onto the surface of an untreated DNA analysis element 31 obtained by fixing at a position including the vicinity of the end), dried if necessary, and a number of chains It is produced by fixing the molecule 41b at one end thereof or in the vicinity thereof.
[0023]
  Hereinafter, terms used in the present specification are defined as follows.
  "InventionUsed inDNA analysis element "," the present inventionUsed inBoth the “masked DNA analysis element” and the “masked DNA analysis element” refer to a DNA analysis element in which an unprocessed DNA analysis element (31 in FIG. 1) is subjected to mask processing. The same applies to the masked PNA analysis element.
  The “PNA fragment” does not include a PNA obtained by synthesis that has been fragmented by an operation such as cutting.
  “Mask treatment” means that a solution containing a compound for mask treatment is dropped on the whole surface of an untreated DNA analysis element, dried if necessary, and fixed.
  The “masking compound” refers to a raw compound that is later derived into a chain molecule.
  “Hybrid DNA” refers to a double-stranded fragment formed by a DNA fragment immobilized on a masked DNA analysis element and a sample nucleic acid fragment. “Hybrid PNA” refers to a fragment immobilized on a masked PNA analysis element. A double-stranded fragment formed by a PNA fragment and a sample nucleic acid fragment.
  “Hybrid DNA-binding electrochemically active molecule” refers to a molecule that binds to hybrid DNA and has electrochemical activity. However, the hybrid DNA-binding electrochemically active molecule temporarily binds to a single-stranded DNA fragment or a single-stranded sample nucleic acid fragment on the masked DNA analysis element in addition to the formed hybrid DNA. There is. The same applies to “hybrid PNA-binding electrochemically active molecule”.
  “Binding” refers to a state in which a hybrid DNA-binding electrochemically active molecule is inserted into the hybrid DNA structure, or a state in which the hybrid DNA is electrostatically interacted with the hybrid DNA outside the hybrid DNA structure.
[0024]
[Conductive substrate]
As the conductive substrate, a hydrophobic (or low hydrophilic) conductive substrate or a plurality of hydrophobic (or low hydrophilic) conductive substrates on a hydrophobic (or low hydrophilic) electrically insulating carrier It is preferable that the substrate is provided with. Both the conductive hydrophobic substrate and the electrically insulating hydrophobic carrier can be preferably used even if the surfaces thereof have irregularities and low planarity.
As materials for the electrically insulating carrier, any of ceramics such as glass, cement, ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, polymethyl methacrylate, polymers, silicon, activated carbon, porous Porous materials such as porous glass, porous ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven or knitted fabric, nonwoven fabric, filter paper, short fiber, membrane filter, etc., but may be various polymers, glass or silicon Particularly preferred. This is due to the ease of surface treatment and the ease of analysis by electrochemical methods. The thickness of the electrically insulating carrier is not particularly limited, but when it is plate-like, it is preferably in the range of 100 to 10,000 μm.
As the hydrophobic conductive substrate, an electrode, an optical fiber, a photodiode, a thermistor, a piezo element, a surface acoustic wave element, or the like can be preferably used, but an electrode is particularly preferable. The electrode materials include carbon electrodes such as graphite and glassy carbon, noble metal electrodes such as platinum, gold, palladium and rhodium, oxide electrodes such as titanium oxide, tin oxide, manganese oxide and lead oxide, Si, Ge, ZnO Examples thereof include semiconductor electrodes such as CdS and electron conductors such as titanium, but it is particularly preferable to use gold or glassy carbon. These electronic conductors may be coated with a conductive polymer or a monomolecular film.
[0025]
As the conductive substrate, it is particularly preferable to use a substrate in which a plurality of hydrophobic conductive substrates are provided on a hydrophobic electrically insulating carrier. At this time, it is preferable that the conductive substrates are regularly arranged on an electrically insulating carrier so as not to contact each other. Before the conductive substrate is provided on the electrically insulating carrier, a layer made of a hydrophilic polymer substance having a charge or a layer made of a crosslinking agent may be provided on the electrically insulating carrier. By providing such a layer, the unevenness of the carrier can be reduced. Further, depending on the type of carrier, it is possible to include a hydrophilic polymer substance having a charge in the carrier, and a carrier that has been subjected to such treatment can also be preferably used.
[0026]
Examples of a plurality of electrodes arranged on an electrically insulating carrier are described in the literature (Sosnowski, RG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1119-1123 (1997)) A silicon chip to which nucleic acids are not immobilized can also be preferably used. Moreover, the electrode may be printed on a conductive substrate like a printed wiring conductive substrate.
[0027]
[DNA fragment]
DNA fragments can be divided into two types according to the purpose. In order to examine gene expression, it is preferable to use cDNA, a part of cDNA, or a polynucleotide such as EST. The functions of these polynucleotides may be unknown, but generally they are amplified by the PCR method using cDNA libraries, genomic libraries, or whole genomes as templates based on sequences registered in a database. Prepare. Those not amplified by the PCR method can also be preferably used. In order to examine gene mutations and polymorphisms, it is preferable to synthesize various oligonucleotides corresponding to mutations and polymorphisms based on known standard sequences and use them. Furthermore, in the case of base sequence analysis, 4ⁿIt is preferable to use a synthesized oligonucleotide (n is the length of the base). The base sequence of the DNA fragment is preferably determined in advance by a general base sequence determination method, and the base type is preferably known. The DNA fragment is preferably a 3 to 50 mer, particularly preferably a 10 to 25 mer. In order to immobilize DNA fragments having different base sequences on each of a plurality of conductive substrates arranged at regular intervals on an electrically insulating carrier as a DNA fragment, It is also preferable to use it.
[0028]
As a method for fixing the DNA fragment to the conductive substrate, a known method can be used, and an appropriate method can be selected according to the type of the DNA fragment and the type of the conductive substrate (protein, nucleic acid, Enzyme, Vol. 43, No. 13, 2004-2011 (1998)). When immobilizing synthetic nucleotides, a method of directly synthesizing on a conductive substrate, or a method of synthesizing an oligomer in which a reactive group for covalent bonding has been introduced at the terminal in advance and covalently bonding it to a surface-treated conductive substrate Can be used. For example, when the surface of the conductive substrate is vapor-deposited with gold, a mercapto group is introduced at the 5 ′ or 3 ′ end of the DNA fragment, and the DNA fragment is removed via coordinate bond between gold and sulfur. Secure to conductive substrate. Methods for introducing mercapto groups into the DNA fragments are described in the literature (M. Maeda et al., Chem. Lett., 1805-1808 (1994) and BAConnolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484 (1985)). Has been. When the surface of the conductive substrate is coated with glassy carbon, the glassy carbon is oxidized with potassium permanganate to introduce carboxylic acid groups on the surface of the conductive substrate, thereby It can be fixed to the surface of the conductive substrate by an amide bond. The actual immobilization method is described in detail in the literature (K. M. Millan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317-2323 (1993)). The DNA fragment may be a hybrid DNA prepared in advance. When the hybrid DNA is immobilized on a conductive substrate that has been vapor-deposited with gold, a mercapto group is introduced into the 5 'or 3' end (preferably the 5 'end) of one strand of the hybrid DNA. Then, after fixing, the hybrid DNA can be dissociated to fix the single strand.
Examples of reactive groups for covalent bonding include amino groups, aldehyde groups, mercapto groups, and biotin. When glass or silicon is used as the conductive substrate, a known silane coupling agent is preferably used for the surface treatment.
[0029]
The DNA fragments are fixed by spotting an aqueous solution in which the DNA fragments are dissolved or dispersed on each of a plurality of conductive substrates arranged at regular intervals on an electrically insulating carrier. It is preferable. The concentration of the DNA fragment to be spotted is preferably in the range of several pM to several mM, and particularly preferably in the range of several pM to several nM. The amount of spotting is preferably in the range of 1 to 100 nL, and particularly preferably in the range of 1 to 10 nL. The aqueous liquid containing the DNA fragment may contain an additive that increases the viscosity of the aqueous liquid. Examples of such additives include sucrose, polyethylene glycol, glycerol and the like. Although spotting can be performed by manual operation, it is also preferable to perform spotting using a spotter equipped in a widely used DNA chip manufacturing apparatus. After spotting, the DNA fragments are fixed on a plurality of conductive substrates when left for several hours at a predetermined temperature. It is also preferable to perform incubation after spotting. After incubation, it is preferable to remove unattached DNA fragments by washing.
The amount of DNA fragments fixed by spotting is 1 mm on the surface of the conductive substrate.²10 per hit^-20Thru 10^-12It is preferably in the range of molar amounts. The amount of DNA fragment immobilized can be determined by means of instrumental analysis such as HPLC (high performance liquid chromatography).
[0030]
[PNA fragment]
The PNA fragment preferably used in the present invention is a compound represented by the following general formula (I).
[0031]
[Chemical 2]

[0032]
In the above formula, B¹¹Is a ligand and represents a natural nucleobase (A, T, C, G, I or U) or a base analog. B¹¹Are attached at the position found in nature, ie at position 9 for purines containing adenine, guanine or inosine and at position 1 for pyrimidines containing thymine, uracil or cytosine. A base analog is an organic base similar to a non-naturally occurring nucleobase, a compound in which a part of the purine ring or pyrimidine ring is substituted from C to N, or N to C, or a purine ring or pyrimidine ring. A compound (a compound into which a sulfhydryl group or a halogen atom has been introduced) is newly modified in part. B¹¹May be an aromatic part not containing a nucleobase, an alkanoyl group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxyl group or a hydrogen atom. Base analogs can include 7-deazaadenine, 6-azauracil and 5-azacytosine.
Exemplary nucleobase ligands and exemplary synthetic ligands are illustrated in WO 92/20702, and 5-propylthymine and 3-deazauracil are known to increase binding affinity to DNA fragments ( JP-A-11-236396). Other useful non-natural nucleobases are 6-thioguanine and pyrazolo [4,3d] -pyrimidine (international application PCT / US92 / 04795).
In addition, B¹¹May be a DNA intercalator, a reporter ligand (eg, fluorophore), a protein label of hapten or biotin, a spin label, or a radioactive label.
B¹¹Is particularly preferably a nucleobase (A, T, C, G or U).
[0033]
R¹¹Represents a hydrogen atom or a group representing a side chain of a natural α-amino acid. The group representing the side chain of a natural α-amino acid includes a carbon atom containing an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. An aralkyl group having 7 to 26 carbon atoms, a heteroaryl group having 6 to 20 carbon atoms, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, -NR¹³R¹⁴A group selected from the group consisting of a group, a mercapto group, and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be further substituted with a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms. R¹³And R¹⁴Are independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, an alkylthio group having 1 to 3 carbon atoms, and a hydroxyl group. Or represents a hydroxyl group. The group representing the side chain of a natural α-amino acid is R¹¹An alicyclic or heterocyclic ring may be formed together with a hydrogen atom of a carbon atom to which is bonded.
[0034]
L¹¹Represents a linking group, -CO- group or -CO-NR¹²-Group is preferable, and -CO- group is particularly preferable. R¹²Represents an atom or group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, and an amino group. The alkylene group having 1 to 4 carbon atoms, the alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms and the amino group are all alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 4 carbon atoms, or It may be substituted with a hydroxyl group.
[0035]
d represents an integer of 1 to 60. d is preferably an integer of 1 to 40. a, b and c each independently represents an integer of 0 to 5; It is preferable that all of a, b and c are 1.
[0036]
The PNA fragment used in the present invention is particularly preferably a compound represented by the following general formula (II). Where B¹¹And d are each B in the general formula (I).¹¹, D.
[0037]
[Chemical Formula 3]

[0038]
As a method for fixing the PNA fragment to the conductive substrate, a known method can be used (Protein / Nucleic Acid / Enzyme, Vol.43, No.13, 2004-2011 (1998), and JP-A-9-288080). Publication). As the fixing method, an appropriate method can be selected according to the type of the PNA fragment and the type of the conductive substrate. For example, a method of synthesizing a PNA fragment directly on a conductive substrate, or a method of spotting a previously synthesized PNA fragment on the surface of the conductive substrate and fixing it at the N-terminal or C-terminal can be used. The surface of the conductive substrate is preferably pretreated in order to fix the PNA fragment. When a separately synthesized PNA fragment is used, it is preferable to introduce a reactive group for bonding to the conductive substrate at one end of the synthesized PNA fragment. Examples of reactive groups include amino groups, aldehyde groups, mercapto groups, and biotin. As the surface treatment of the conductive substrate, for example, when the conductive substrate is glassy carbon, it is preferable to treat the conductive substrate with potassium permanganate.
[0039]
The PNA fragment is preferably fixed by spotting an aqueous liquid containing the PNA fragment on the conductive substrate. After being spotted, the PNA fragments are fixed on the surface of the conductive substrate when left for several hours at a predetermined temperature. Although spotting can be performed by manual operation, it is also preferable to perform spotting using a spotter equipped in a widely used DNA chip manufacturing apparatus. It is also preferable to perform incubation after spotting. After incubation, it is preferable to wash away PNA fragments that are not immobilized.
[0040]
[Mask processing]
  The present inventionUsed inThe masked DNA analysis element is preferably prepared by spotting a solution containing a mask processing compound on the surface of the DNA analysis element. The compound for mask treatment is preferably used in the range of 0.5 to 2 mM, particularly preferably in the range of 0.8 to 1.5 mM. After spotting the mask processing compound, it is preferably left at a predetermined temperature (preferably room temperature) for several hours. After the spotting, if necessary, incubation may be performed. The masked DNA analysis element can be stored for several days, and can be used repeatedly as long as it is several times.
[0041]
The compound for mask treatment has a hydrophilic group at one end or in the vicinity thereof, and a chain molecule which may have a cyclic group in the middle is opposite to the hydrophilic group side end of the chain molecule. It is a compound in which a reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate is bonded to the side edge or the vicinity thereof. The chain molecule is fixed to the surface of the conductive substrate through a reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate.
Having a hydrophilic group at one end or in the vicinity thereof indicates that the hydrophilic group does not necessarily have to be located at the end of the chain molecule, but preferably has a hydrophilic group at the end. . One or more hydrophilic groups may be used. The reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate is preferably bonded to the end of the chain molecule opposite to the end of the hydrophilic group. The chain molecule which may have a cyclic group in the middle is a molecule derived from a mask processing compound.
The compound for mask treatment is a compound having a shorter straight chain length than the DNA fragment fixed to the conductive substrate, and is hydrophilic at one end of the straight chain alkylene group having 1 to 6 carbon atoms. It is preferable that it is a compound which has a reactive group which has a reactive group and couple | bonds with a conductive substrate in the other terminal.
[0042]
Examples of the reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate include a group selected from the group consisting of a mercapto group, a sulfide group, a disulfide group, a thiocarbonyl group, and a thiocarboxylic acid group. In the case where a treatment for introducing a reactive group such as an amino group, an aldehyde group, or a carboxylic acid group has been performed on the surface of the conductive substrate in advance, the reactive group includes an amino group, an imino group, a hydrazine group, and a hydrazide. Mention may also be made of groups selected from the group consisting of groups, amide groups, carboxylic acid groups, aldehyde groups, epoxy groups and peroxy acid groups. The reactive group is more preferably a mercapto group, a thiocarbonyl group, or a sulfide group, and particularly preferably a mercapto group.
[0043]
The hydrophilic group is preferably a hydroxyl group, a carboxylic acid group, an amide group, a phosphoric acid group or a sulfonic acid group, and particularly preferably a hydroxyl group. However, the reactive groups that can be bonded to the surface of the conductive substrate are preferably different from each other.
The cyclic group is an aryl group having 6 to 12 ring carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, or 1 to 4 heteroatoms selected from the group consisting of N, S, O, and P. It is preferably a heterocyclic group having 2 to 10 carbon atoms. The cyclic group may be a group in which reactive groups capable of binding to the surface of the conductive substrate jointly form a cyclic group. A preferred example of the latter is imidazol-2-thione group.
[0044]
Therefore, as the compound for mask treatment, mercaptomethanol, 2-mercaptoethanol, 3-mercaptopropanol, 4-mercaptobutanol, 5-mercaptopentanol, 6-mercaptohexanol, N, N′-di (3-hydroxy-n -Propyl) -imidazole-2-thione or an imidazole-2-thione derivative described in the literature (AJArduengo et al., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 6153-6154), 2-mercaptoethanol, 3-mercaptopropanol, 4-mercaptobutanol, 5-mercaptopentanol, and 6-mercaptohexanol are more preferable, and 2-mercaptoethanol is particularly preferable. The mask treatment compound may be a salt such as sodium or potassium, and the alkylene chain may be substituted with a specific substituent. The specific substituent is preferably a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms (preferably a methyl group, an ethyl group, a phenyl group, or the like).
It is desirable to select a compound for mask treatment depending on the DNA fragment immobilization method. Two or more kinds of mask processing compounds may be used in combination.
[0045]
When the DNA analysis element is masked, as shown in FIG. 1, many mask processing compounds form a hydrophilic surface in which the hydrophilic groups are aligned outward from the surface of the conductive substrate. . 42 in FIG. 1 (2) represents a hydrophilic group.
[0046]
[Hybridization]
Hybridization is performed in the presence of a hybrid DNA-binding electrochemically active molecule when a DNA analysis element is used, and in the presence of a hybrid PNA-binding electrochemically active molecule when a PNA analysis element is used. This is carried out by bringing a sample nucleic acid fragment into contact with a masked DNA analysis element or a masked PNA analysis element.
The hybrid DNA-binding electrochemically active molecule may be contacted with the formed hybrid DNA after completion of hybridization. In this case, after completion of hybridization, washing is performed using a mixed solution of a surfactant (preferably sodium dodecyl sulfate) and a buffer solution (preferably citrate buffer solution), and unreacted sample nucleic acid is obtained. It is preferable to remove fragments. Alternatively, the hybrid DNA thus formed may be contacted by including the electrochemically active molecule in an aqueous solution containing a sample nucleic acid fragment during hybridization. The electrochemically active molecule is hybridized to avoid non-specific binding of the electrochemically active molecule to a (single stranded) sample nucleic acid fragment or to a double stranded sample nucleic acid fragment contained in the sample. After completion, it is desirable to remove unreacted sample nucleic acid fragments and then contact them. The same applies to hybrid PNA-binding electrochemically active molecules. The hybrid DNA-binding electrochemically active molecule or the hybrid PNA-binding electrochemically active molecule is preferably used in a concentration range of 10 nM to 10 mM. Hybridization is preferably performed in the temperature range of room temperature to 70 ° C. and in the range of 0.5 to 20 hours. However, depending on the length of the DNA fragment immobilized on the conductive substrate, the type of the sample nucleic acid fragment, etc. Therefore, it is desirable to set optimum conditions for hybridization. For example, when analyzing gene expression, it is preferable to perform hybridization for a long time so that low-expressing genes can be sufficiently detected, and when detecting single-base mutations, It is preferable to perform hybridization for a short time.
After completion of hybridization, washing with a mixed solution of a surfactant (preferably sodium dodecyl sulfate) and a buffer (preferably citrate buffer) to remove unreacted sample nucleic acid fragments preferable.
[0047]
[Sample nucleic acid fragment]
Sample nucleic acid fragments include DNA fragments extracted from biological samples, DNA fragments prepared by genetic manipulation, etc., cleaved with restriction enzymes, etc., and then purified by electrophoresis separation or the like, or obtained by chemical synthesis It is preferable to use a double-stranded DNA fragment. In the case of a DNA fragment obtained from a biological sample or the like, it is preferably dissociated into a single-stranded DNA fragment by heat treatment or alkali treatment.
A DNA fragment cleaved by a restriction enzyme is generally a plurality of types of DNA fragments. When this is used as a sample DNA fragment, even if there is only one type, there are a plurality of types. May be. The sample DNA fragment is preferably in the range of several pM to several mM, and particularly preferably in the range of several pM to several nM.
[0048]
[Hybrid DNA-binding electrochemically active molecule and hybrid PNA-binding electrochemically active molecule]
Any hybrid DNA-binding electrochemically active molecule can be used as long as it binds to hybrid DNA and has an electroactive activity. As shown in FIG. 1 (3), the hybrid DNA is preferably obtained by bringing a sample nucleic acid fragment into contact with a masked DNA analysis element. However, the hybrid DNA is masked without using such a method. It may be prepared separately by a method not involving the DNA analysis element. The same applies to the case where the masked DNA analysis element is replaced with a masked PNA analysis element.
Hybrid DNA-binding electrochemically active molecule (or hybrid PNA-binding electrochemically active molecule) is a method of immersing a masked DNA analysis element (masked PNA analysis element) in a solution containing the corresponding electrochemically active molecule, or mask The solution containing the corresponding electrochemically active molecule can be brought into contact with the hybrid DNA (or hybrid PNA) by dropping the solution containing the corresponding electrochemically active molecule on the prepared DNA analysis element (masked PNA analysis element). The mode of binding to the hybrid DNA may be any of an intercalation type, a groove (main groove or sub groove) binding type to the hybrid, and the like.
Any hybrid PNA-binding electrochemically active molecule can be used as long as it binds to hybrid PNA and has electroactive activity. The binding mode to hybrid PNA is the same as that of hybrid DNA.
Both the hybrid DNA-binding electrochemically active molecule and the hybrid PNA-binding electrochemically active molecule are preferably used in a concentration range of 10 nM to 10 mM.
[0049]
The same molecule can be used as the hybrid DNA-binding electrochemically active molecule and the hybrid PNA-binding electrochemically active molecule, and specific examples of such a molecule include an embedded type labeled with a conductive group. Intercalators can be mentioned.
The sewn intercalator labeled with a conductive group is preferably a substance having redox activity. The redox active moiety is preferably a ferrocene compound, a catecholamine compound, a metal bipyridine complex, a metal phenanthroline complex, a viologen compound, or the like, and particularly preferably a ferrocene compound. The intercalator part is preferably naphthalene diimide, anthracene, anthraquinone or the like, and particularly preferably naphthalene diimide. Therefore, as the intercalator, a ferrocene naphthalenediimide derivative represented by the following formula (S. Takenaka et al., J. Chem.) Synthesized by reaction of ferrocenecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester with a corresponding amine form is used. Soc., Commun., 1111 (1998)).
[0050]
[Formula 4]

[0051]
Moreover, the ferrocene naphthalene diimide derivative represented by a following formula is also used preferably.
[0052]
[Chemical formula 5]

[0053]
However, X is a ferrocene derivative having one bond represented by the following formula.
[0054]
[Chemical 6]

[0055]
[Chemical 7]

[0056]
[Chemical 8]

[0057]
[Chemical 9]

[0058]
A sewn intercalator labeled with a conductive group has a linker portion that connects the redox active portion and the intercalator portion. The 1,4-dipropylpiperazinyl group represented by the above formula corresponds to this linker moiety. Instead of this piperazinyl group, a quaternized imino group can also be introduced. Since the intercalator represented by the following formula into which the quaternized imino group is introduced is cationic with respect to the pH of the reaction system, the binding of hybrid DNA or hybrid PNA becomes stronger. An intercalator into which a quaternized imino group has been introduced is particularly effective when a PNA analytical element is used. The group corresponding to the linker moiety is not limited to those described above. For example, instead of a piperazinyl group, an N-alkyl group (the alkyl group is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably a methyl group, an ethyl group or an n-propyl group). ) Is also preferred. The redox potential of the ferrocene molecule varies depending on the structure of the group corresponding to the linker moiety.
[0059]
[Chemical Formula 10]

[0060]
When the above naphthalene diimide derivative is used as a stitched intercalator, the naphthalene diimide derivative binds to the hybrid DNA with high specificity, and is arranged every two bases and is saturated with the hybrid DNA. This means that the two ferrocene molecules of the naphthalenediimide derivative are closely arranged in the main groove and the minor groove of the hybrid DNA, respectively. For this reason, the naphthalene diimide derivative has a very slow dissociation rate from the hybrid DNA, and a stable complex of the hybrid DNA and the naphthalene diimide derivative can be formed. In addition, the binding of the naphthalene diimide derivative to the hybrid DNA is generally confirmed by the change in viscosity when the intercalator is brought into contact with the hybrid DNA. For example, it is known that when an intercalation occurs in a closed circular plasmid typified by the virus SV40, the viscosity changes with a change in the super helix. On the other hand, the intercalator does not bind to a single-stranded DNA fragment, or even once bound, it immediately dissociates to become a free intercalator.
[0061]
[Sensitive quantification of sample nucleic acid fragments]
FIG. 1 also schematically shows a typical method of the high sensitivity quantitative method of the present invention. When a sample aqueous solution in which a sample nucleic acid fragment 61 complementary to the DNA fragment 21 is dissolved or dispersed is brought into contact with the masked DNA analysis element 51, the sample nucleic acid fragment 61 forms a hybrid DNA 71 with the DNA fragment 21. . When the hybrid DNA-binding electrochemically active molecule 81 is brought into contact therewith, the electrochemically active molecule 81a binds to 71. Next, by applying a potential to the conductive substrate 11 and measuring the amount of current flowing between 81b and the conductive substrate 11, the hybrid DNA 71, that is, the sample nucleic acid fragment 61 can be detected and quantified. The following description will focus on the case of using a DNA analysis element, but the same applies to a PNA analysis element.
[0062]
In the high-sensitivity quantification method of the present invention, sample nucleic acid fragments having complementarity adjusted to satisfy a certain relationship with the amount of DNA fragments immobilized on the masked DNA analysis element are dissolved or dispersed. Contact the sample aqueous solution. Hybridization is initiated by contact. The contact method may be either a method of spotting the aqueous liquid on the surface of the analytical element or a method of immersing the analytical element in the aqueous liquid, but the former is preferred. The certain relationship means that the ratio of the amount of the sample nucleic acid fragment that is complementary to the DNA fragment to the DNA fragment that is in contact with the fixed amount of the DNA fragment is about 1 to 10^FourIt is in the range. However, the ratio is 10^FourIf it is larger, there will be a large number of DNA fragments that do not participate in hybridization on the conductive substrate. When a hybrid DNA-binding electrochemically active molecule is brought into contact therewith, the non-participating DNA fragments are electrostatically charged. Due to the presence of the electrochemically active molecule bound to, it becomes difficult to identify the presence of a complex formed by hybrid DNA and the electrochemically active molecule. This causes a decrease in detection sensitivity. Since the electrochemically active molecule has the property of binding to hybrid DNA with high specificity, the closer the ratio is to 1, the lower the binding of the electrochemically active molecule to non-participating DNA fragments. .
[0063]
The amount of DNA fragment immobilized is 10^-TenMol / mm²In the case of the above amount, the DNA fragment is presumed to be in a dense state on the conductive substrate. At this time, the DNA fragments are not fixed in a state where all of them are extended in a direction perpendicular to the surface of the conductive substrate. It is considered that they are in an agglomerated state that is entangled with each other. On the other hand, the amount of DNA fragments immobilized is 10^-12Mol / mm²In the following cases, the DNA fragments are fixed at a slight interval, but a region where the DNA fragments are not fixed (hereinafter referred to as “a gap”) occurs on the surface of the conductive substrate. Therefore, it is considered that the DNA fragment falls along the surface of the conductive substrate and is difficult to extend in the vertical direction. It is considered that the DNA fragment falling along the surface of the conductive substrate causes a weak interaction between the polar group of the DNA fragment and the surface of the conductive substrate, thereby reducing the efficiency of the double strand formation reaction.
[0064]
Conductive substrate 1mm on masked DNA analysis element²10 per hit^-16In order that the amount of the sample nucleic acid fragment can be brought into contact with each other and the amount of this level can be quantified, the amount of DNA fragment immobilized on the conductive substrate is 10^-20Thru 10^-12Mol / mm²It is preferable that it exists in the range. At this time, more gaps are generated on the surface of the conductive substrate. This further leads to an unfavorable immobilization state of the DNA fragment. Therefore, one of the effects of the mask processing is considered to be the vertical alignment of the DNA fragments on the surface of the conductive substrate.
Conductive mask surface 1mm by applying mask treatment²10 per hit^-20Thru 10^-16Sample nucleic acid fragments having amounts in the molar range of complementarity can be quantified. Furthermore, by using a conductive substrate with a small area, 10^{-twenty one}Mol / mm²Can improve the limit of quantification. In the method described in JP-A-9-288080, 10^-15Mol / mm²Since the amount of is the limit of quantification, the quantification method of the present invention is 10^-16This is the first electrochemical method that can detect and quantify sub-molar amounts of the sample nucleic acid fragment.
[0065]
Other effects include an effect of preventing nonspecific adsorption of the sample nucleic acid fragment and the hybrid DNA-binding electrochemically active molecule to the surface of the conductive substrate. By performing mask processing on the DNA analysis element, the mask processing compound is fixed at or near one end of the gap, so that the gap is filled, thereby preventing nonspecific adsorption of the sample nucleic acid fragment and the electrochemically active molecule. can do. It has been confirmed that the background current is greatly reduced when the DNA analysis element is masked. The hydrophilic group of the mask processing compound contributes to prevention of hydrophobic adsorption of the hybrid DNA-binding electrochemically active molecule. Furthermore, another effect of the mask processing is to suppress a decrease in the modification amount of the DNA fragment in the DNA analysis element.
[0066]
As described above, when there are many DNA fragments that are not involved in the formation of double strands among the DNA fragments immobilized on the conductive substrate, when the DNA-binding electrochemically active molecule is brought into contact therewith, Non-specific adsorption of chemically active molecules to DNA fragments occurs. In order to avoid such adsorption, the salt concentration of the aqueous solution containing the electrochemically active molecule is preferably 0.1 M or more, and particularly preferably in the range of 0.1 to 1.0 M.
[0067]
It is preferable not to wash the conductive substrate after contact with the hybrid DNA-binding electrochemically active molecule. This is because although the free electrochemically active molecule can be removed by washing, the electrochemically active molecule once bound to the hybrid DNA may be removed.
[0068]
Binding of the hybrid DNA binding electrochemically active molecule to the hybrid DNA is detected by measuring the current. Any method can be used to measure the current as long as it can measure the flowing current by applying a potential, such as cyclic voltammography (CV), differential pulse voltammography (DPV), or potentiostat. It is particularly preferable to use differential pulse voltammography.
[0069]
In the highly sensitive quantification method of the present invention, the amount of the sample nucleic acid fragment is 1 mm on the conductive substrate relative to the masked DNA analysis element.²10 per hit^{-twenty one}Thru 10^-16It is preferable to use an aqueous sample solution prepared to be in the molar range.^-20Thru 10^-18It is particularly preferable to use a sample aqueous solution prepared so as to be in the molar range.
[0071]
【Example】
[Example 1]
(1) Preparation of DNA analysis element
Area is 1mm²The gold electrode was immersed in a 2N aqueous sodium hydroxide solution for 1 hour, washed with water, immersed in concentrated nitric acid, and stirred for 15 minutes. After washing the gold electrode with ultrapure water, the 20-mer (HS-dA) of adenine having a mercaptohexyl group at the 5 'end was formed on the gold electrode surface.₂₀(10^-141 μL of an aqueous solution (mol / μL) was spotted and allowed to stand for 2 hours, and then washed with ultrapure water to prepare a DNA analysis element. HS-dA₂₀Was synthesized according to the method described in JP-A-9-288080.
(2) DNA analysis element mask processing
On the DNA analysis element obtained in (1) above, 1 μL of an aqueous solution of 2-mercaptoethanol (1 mM) was dropped, and the analysis element was capped and left for 2 hours. Next, the cap was removed and the substrate was washed with ultrapure water to obtain a masked DNA analysis element.
(3) Synthesis of ferrocene stitched intercalator
Ferrocene naphthalene diimide represented by the following formula was synthesized according to the method described in JP-A-9-288080.
[0072]
Embedded image

[0073]
(4) Detection of sample DNA fragments
As a sample DNA fragment, thymine 20-mer (dT₂₀) In accordance with the method described in the above publication, dT₂₀(10^-201 μL of the aqueous solution (mol / μL) was spotted on the surface of the masked DNA analysis element obtained in (2) above, and left at 25 ° C. for 30 minutes. Next, an electrolyte solution in a constant temperature cell maintained at 20 ° C. (0.1 M acetic acid / potassium acetate aqueous solution (pH 5.6) -0.1 M potassium chloride aqueous solution containing ferrocene naphthalenediimide (50 μM) obtained in (3) above) The above-mentioned analytical element (working electrode), platinum (counter electrode) and silver / silver chloride reference electrode were immersed in the mixed solution to form three electrodes, and differential pulse voltammography (DPV) was measured. And the peak current value in 460mV was calculated | required from the DPV.
Sample DNA fragment (dT₂₀) Concentration of 10^-1910^-18Each DPV was measured in the same manner as described above except that it was changed to mol / μL, and each peak current value was obtained. The peak current value with respect to the spotted amount of the sample DNA fragment is shown as -O- in FIG.
[0074]
Next, the sample DNA fragment is dA.₂₀The peak current value with respect to the spotted amount of the sample DNA fragment was determined by performing the same operation as above except that it was changed to (adenine 20-mer, synthesized according to the method described in the above publication) (-□-in FIG. 2). ).
[0075]
From FIG. 2, the relationship between the amount of sample DNA fragment spotted and the peak current value indicates that the sample DNA fragment spot amount is 1 mm on the electrode surface.²10 per hit^-20-10^-18It can be seen that an almost good linear relationship is exhibited in the molar range. Therefore, the amount of spotting is 10^-20-10^-18Mol / mm²The sample DNA fragment whose concentration is adjusted to be in the range can be sufficiently quantified.
[0076]
[Example 2]
(1) Production of PNA analysis element
The area having a mercapto group on the surface is 2.25 mm.²1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane phosphate buffer is added dropwise to the gold electrode, and the gold sulfonyl group at one end is free from the gold electrode and is represented by the following formula of 50 nM. PNA fragment: PNA-T_TenAn aqueous solution (1 nL) of PNA-T that was not fixed to the electrode was allowed to stand at room temperature for 1 hour._TenWas washed with distilled water to produce a PNA analytical element. PNA-T_TenWas synthesized according to the method described in the literature (P.E. Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1897 (1992) and 114, 9677-9678 (1992)). T represents thymine.
[0077]
Embedded image

[0078]
(2) PNA analysis element mask processing
On the PNA analytical element obtained in (1) above, 1 μL of an aqueous solution of 2-mercaptoethanol (1 mM) was dropped, and the analytical element was capped and left for 2 hours. Next, the cap was removed and the plate was washed with ultrapure water to obtain a masked PNA analytical element.
(3) Detection of sample DNA fragments
The same operation as in (4) of Example 1 was performed except that the masked PNA analytical element obtained in (2) above was used instead of the masked DNA analytical element. Results were obtained.
[0079]
【The invention's effect】
  The present inventionUsed inThe masked DNA analysis element is obtained by masking a gap generated in a DNA analysis element formed by immobilizing an extremely small amount of DNA fragments. This mask process is performed so that efficient hybridization can be performed. In addition to aligning the fragments, it has the effect of preventing nonspecific adsorption of the sample nucleic acid fragments and the hybrid DNA-binding electrochemically active molecules to the surface of the conductive substrate. By using a masked DNA analysis element, the efficiency of hybridization can be improved and the sensitivity of detection can be improved. Therefore, the present inventor has established an ultrasensitive quantification method capable of quantifying a sample nucleic acid fragment at a zeptomole level with high reproducibility for the first time by an electrochemical method, along with the quantification limit of the current DNA chip technology. Successful. By using the quantification method of the present invention, gene expression monitoring, gene analysis, and the like can be performed with high sensitivity, speed, and simplicity.
[0080]
  In addition, the inventor of the present inventionUsed inEven in the case of using a masked PNA analysis element, the present inventionUsed inAs in the case of the masked DNA analysis element, the sample nucleic acid fragment was successfully quantified with extremely high sensitivity. In particular, in the method using a masked PNA analysis element, electrical repulsion between the PNA fragment and the sample nucleic acid fragment can be suppressed, so that more efficient hybridization is possible. This is because detection sensitivity is increased because binding between a PNA fragment not forming a hybrid PNA and a hybrid PNA-binding electrochemically active molecule can be avoided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the present invention.Used inIt is the figure which represented typically the highly sensitive determination method of the sample masked DNA analysis element and the sample nucleic acid fragment which has the typical complementarity of this invention.
2 is a graph showing the relationship between the amount of spotted sample nucleic acid fragments and the peak current value when hybrid DNA is formed and not formed in Example 1. FIG.
[Explanation of symbols]
  11 Conductive substrate
  21 immobilized DNA fragments
  31 DNA analysis element
  41a Mask processing compound
  41b Chain molecules immobilized on DNA analysis element
  42 Hydrophilic groups
  51 Masked DNA analysis element
  61 Sample nucleic acid fragment having complementarity with DNA fragment
  71 Hybrid DNA
  81a Hybrid DNA binding electrochemically active molecule
  81b Hybrid DNA-binding electrochemically active molecule bound to hybrid DNA

Claims (10)

An aqueous liquid in which a DNA fragment is dissolved or dispersed is spotted on the surface of the conductive substrate, and the DNA fragment is fixed at one end thereof. Then, one end of the DNA fragment is fixed on the surface of the conductive substrate on which the DNA fragment is fixed. A chain group that has a hydrophilic group at or near its part, has a cyclic group in the middle, or has no reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate at or near the other end 10 ^{−20 to} 10 ⁻¹² mol per 1 mm ² of the surface of the conductive substrate produced by dropping a solution containing the compound and immobilizing the chain molecules via the reactive group. An amount of DNA fragment in the range is fixed at one end thereof, and has a hydrophilic group at one end or in the vicinity thereof on the surface other than the fixing region of the DNA fragment, or has a cyclic group in the middle or is present. do it In the presence of a hybrid DNA-binding electrochemically active molecule, a potential is applied to the surface of the conductive substrate in the presence of a hybrid DNA-binding electrochemically active molecule on a DNA analysis element in which no chain molecules are immobilized at or near the other end. By contacting an aqueous solution in which a sample nucleic acid fragment having a complementarity to the DNA fragment is dissolved or dispersed, the sample nucleic acid fragment is bound and the electrochemically active molecule is also bound. A highly sensitive quantification method for a sample nucleic acid fragment having complementarity to a DNA fragment, wherein the amount of current flowing between the sample and the conductive substrate is measured.   The highly sensitive quantification method of a sample nucleic acid fragment according to claim 1, wherein the hydrophilic group of the chain molecule of the DNA analysis element is a hydroxyl group.   The chain molecule of the DNA analysis element is fixed to the surface of the conductive substrate through the mercapto group provided at the end opposite to the hydrophilic group side end of the chain molecule. The highly sensitive quantification method of the sample nucleic acid fragment of Claim 1 or 2 characterized by these.   The chain molecule of the DNA analysis element is selected from the group consisting of 2-mercaptoethanol, 3-mercaptopropanol, 6-mercaptohexanol and N, N′-di (3-hydroxy-n-propyl) -imidazole-2-thione The method for sensitive quantification of a sample nucleic acid fragment according to any one of claims 1 to 3, wherein the molecule is a molecule derived from a compound. 2. The sample nucleic acid fragment having high complementarity to the DNA fragment is quantified with high sensitivity in a range of 10 ^{−20 to} 10 ⁻¹⁶ mol per 1 mm ^{2 of the} surface of the conductive substrate. Sensitivity quantification method . An aqueous liquid in which a PNA fragment is dissolved or dispersed is spotted on the surface of the conductive substrate, and the PNA fragment is fixed at one end thereof. Then, one end of the PNA fragment is fixed on the surface of the conductive substrate on which the PNA fragment is fixed. A chain group that has a hydrophilic group at or near its part, has a cyclic group in the middle, or has no reactive group capable of binding to the surface of the conductive substrate at or near the other end 10 ^{−20 to} 10 ⁻¹² mol per 1 mm ² of the surface of the conductive substrate produced by dropping a solution containing the compound and immobilizing the chain molecules via the reactive group. An amount of PNA fragment in the range is fixed at one end thereof, and has a hydrophilic group at one end or in the vicinity thereof on the surface other than the fixing region of the PNA fragment, or has a cyclic group in the middle or is present. do it In the presence of a hybrid PNA-binding electrochemically active molecule, a potential is applied to the surface of the conductive substrate in the presence of a hybrid PNA-binding electrochemically active molecule on a PNA analytical element in which no chain molecule is immobilized at or near the other end. The sample nucleic acid fragment is bound to the aqueous solution formed by dissolving or dispersing the sample nucleic acid fragment complementary to the PNA fragment, and the electrochemically active molecule is bound to the electrochemically active molecule. A highly sensitive quantification method for a sample nucleic acid fragment having complementarity to a PNA fragment, characterized in that the amount of current flowing between the sample and the conductive substrate is measured . The highly sensitive quantification method for a sample nucleic acid fragment according to claim 6, wherein the hydrophilic group of the chain molecule of the PNA analysis element is a hydroxyl group . The chain molecule of the PNA analytical element is fixed to the surface of the conductive substrate through the mercapto group provided at the end opposite to the hydrophilic group side end of the chain molecule. A highly sensitive quantification method for a sample nucleic acid fragment according to claim 6 or 7 . The chain molecule of the PNA analytical element is selected from the group consisting of 2-mercaptoethanol, 3-mercaptopropanol, 6-mercaptohexanol and N, N′-di (3-hydroxy-n-propyl) -imidazole-2-thione. The highly sensitive quantification method of a sample nucleic acid fragment according to any one of claims 6 to 8, wherein the molecule is a molecule derived from a compound to be obtained . The sample nucleic acid fragment having complementarity to the PNA fragment is quantified with high sensitivity in the range of 10 ^{−20 to} 10 ⁻¹⁶ mol per 1 mm ^{2 of the} surface of the conductive substrate. Sensitivity quantification method .

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