JP4306816B2 - 新規生理活性物質、その製造法および用途 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドポリペプチド、及びこれをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプターを通じて生体の機能を調節している。これらのレセプターの多くは共役している guanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行い、また７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプターあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。
このようなホルモンや神経伝達物質とＧ蛋白質共役型レセプターによる生体の機能を調節する経路の一つとして視床下部−下垂体系がある。これは、視床下部ホルモン（向下垂体性ホルモン）によって下垂体からの下垂体ホルモンの分泌が調節され、血中に放出された下垂体ホルモンを介して標的細胞・器官の機能調節が行われるものである。この経路によって、ホメオスタシスの維持や生殖系、個体の発達、代謝、成長の調節などの生体にとって重要な機能調節が行われている。下垂体ホルモンは視床下部ホルモンと標的内分泌腺より分泌される末梢ホルモンによるポジティブフィードバック機構またはネガティブフィードバック機構によって分泌調節されている。下垂体に存在する各種のレセプター蛋白質は、視床下部−下垂体系を調節する上で中心的な役割を担っている。
【０００３】
また、これらのホルモン・因子およびそのレセプターは視床下部−下垂体系だけに限局して存在するのではなく、一般に脳内に広く分布することが知られている。このことは視床下部ホルモンと呼ばれている物質が、中枢神経系においては神経伝達物質あるいは神経調節物質として機能していると考えられている。また、末梢組織においても同様に分布し、それぞれ重要な機能を担っていると考えられている。
膵臓は消化液を分泌する他にグルカゴンやインスリンを分泌することにより糖代謝に重要な役割を果たしている。インスリンは膵臓のβ細胞から分泌されるが、主としてグルコースにより促進される。しかしβ細胞には様々なレセプターが存在し、グルコース以外の様々な因子、ペプチドホルモン（ガラニン、ソマトスタチン、ガストリック・インヒビトリー・ポリペプチド、グルカゴン、アミリンなど）、糖（マンノースなど）、アミノ酸、神経伝達物質などにより、インスリンの分泌が制御されていることが知られている。
これまでに上記Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドを決定する一般的な手段としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一次構造上の類似性から推定するしかなかった。
最近、動物細胞にリガンドが不明な、いわゆるオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡを導入し、新規オピオイドペプチドを探索した例が報告されている（Reinsheid, R. K. et al. , Science、270巻、792-794頁、1995年、Menular, J.-C., et al. , Nature 377巻、532-535頁、1995年）。しかしこの場合は既知Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との類似性や組織分布から、容易にリガンドはオピオイドペプチドのファミリーに属することが予想されていた。オピオイドレセプターを介して生体に作用する物質の研究・開発の歴史は長く、種々のアンタゴニスト・アゴニストが開発されていた。そこで人為的に合成した化合物群の中からこの受容体に対するアゴニストを見出し、それをプローブとして受容体ｃＤＮＡ導入細胞における受容体の発現を検証した後に、アゴニストと同じ様な細胞内情報伝達系の活性化物質を探索し、これを精製し、リガンドの構造を決定している。しかし、このようにオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の中でリガンドがおおよそ推定されうるものはほとんどなく、特に、既知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ファミリーと類似性が低い場合、リガンドに関する情報はほとんどなく、リガンドを推定することは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
下垂体、中枢神経系および膵臓β細胞等で発現しているオーファンＧ蛋白質共役型レセプターに対するリガンドは、医薬として有用であると考えられるが、これまでにその構造および機能については明らかにされていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡを適当な手段で発現させた細胞を用い、特異的な細胞刺激（シグナル伝達）活性の測定等を指標に、該レセプター蛋白質がリガンドとして認識するポリペプチドをスクリーニングすることに成功した。
さらに、本発明者らは、該活性因子であるリガンドと上記レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができることを見いだした。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩、
（２）配列番号：３、４、５、６、７、８、９、１０、４７、４８、４９、５０、５１、５２、６１、６２、６３、６４、６５または６６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである第（１）項記載のポリペプチド。
（３）配列番号：１、４４、４５または５９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである第（１）項記載のポリペプチド、
（４）第（１）項記載のポリペプチドの部分ペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩。
（５）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（６）配列番号：２、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、４６、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６７、６８、６９、７０、７１または７２で表される塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮＡ、
（７）第（５）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（８）第（５）項記載のＤＮＡまたは第（７）項記載の組換えベクターを保持する形質転換体、
（９）第（８）項記載の形質転換体を培養することを特徴とする第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチドの製造法、
（１０）第（１）項記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩を含有してなる医薬、
（１１）第（４）項記載の部分ペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩を含有してなる医薬、
（１２）第（５）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（１３）下垂体機能調節剤である第（１０）項、第（１１）項または第（１２）項記載の医薬、
（１４）中枢神経機能調節剤である第（１０）項、第（１１）項または第（１２）項記載の医薬、
（１５）膵臓機能調節剤である第（１０）項、第（１１）項または第（１２）項記載の医薬、
（１６）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチドに対する抗体、
（１７）（ｉ）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に、第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチドを接触させた場合と（ii）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に、第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチド、および試験化合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴とする第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチドと、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（１８）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチドと、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キット、
（１９）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチドと、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、および
（２０）第（１）項記載のポリペプチドまたは第（４）項記載の部分ペプチドをリガンドとして認識するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、
（２１）ポリペプチドが、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列に１個以上８０個以下、好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するペプチドである第（１）項記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩、
（２２）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドのＮ末端にさらに配列番号：７４で表されるペプチドが付加したアミノ酸配列を含有するポリペプチドである第（１）項記載のポリペプチド、
（２３）ウシ、ラットまたはヒト由来である第（１）項記載のポリペプチド、
および
（２４）痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、糖尿病、癌、膵炎、腎疾患、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症または乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤である第（１０）項、第（１１）項または第（１２）項記載の医薬を提供するものである。
【０００８】
本発明におけるリガンドポリペプチドに対するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に関して、具体的には、
（２５）配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列または（および）配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする、第（２０）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（２６）配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする第（２５）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（２７）配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする第（２５）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（２８）配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする第（２５）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（２９）第（２５）項〜第（２８）項記載のいずれかのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
【０００９】
（３０）第（２５）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（３１）第（２６）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（３２）第（２７）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（３３）第（２８）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（３４）配列番号：２４で表わされる塩基配列または（および）配列番号：２５で表わされる塩基配列を有する第（３０）項記載のＤＮＡ、
（３５）配列番号：２６で表わされる塩基配列で表される塩基配列を有する第（３１）項記載のＤＮＡ、
（３６）配列番号：２７で表わされる塩基配列で表される塩基配列を有する第（３２）項記載のＤＮＡ、
（３７）配列番号：２８で表わされる塩基配列で表される塩基配列を有する第（３３）項記載のＤＮＡ、
（３８）第（３０）項〜第（３３）項記載のいずれかのＤＮＡを含有する組換えベクター、
（３９）第（３８）項記載の組換えベクターを保持する形質転換体、
（４０）第（３９）項記載の形質転換体を培養し、形質転換体の細胞膜にＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を生成せしめることを特徴とする第（２５）項〜第（２８）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造方法、
および
（４１）第（２５）項〜第（２８）項記載のいずれかのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または第（２９）項記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体を提供する。
【００１０】
さらに具体的には、
（４２）蛋白質が、（ｉ）配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列または（および）（ii）配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列、配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である第（２５）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（４３）蛋白質が、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である第（２６）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（４４）蛋白質が、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である第（２７）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、および
（４５）蛋白質が、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、あるいは配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である第（２８）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に関する。
本明細書において、「実質的に同一」とはタンパク質の活性、例えば、リガンドと受容体の結合活性、生理的な特性などが、実質的に同じことを意味する。アミノ酸の置換、欠失あるいは挿入はしばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をもたらさないが、こうした場合その置換、欠失あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができうる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のリガンドポリペプチドは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合することができる、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくは該部分ペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩が挙げられる。ここで、配列番号：７３において第１０番目のXaaはAlaまたはThr、第１１番目のXaaはGlyまたはSer、第２１番目のXaaはH、Gly、またはGlyArgを示す。
本発明のリガンドポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩（以下、単にリガンドポリペプチドまたはポリペプチドと略称する場合がある）、その製造法および用途を以下にさらに詳細に説明する。
本発明の上記リガンドポリペプチドとしては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（たとえば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または細胞などに由来するポリペプチドであって、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものであればよい。例えば、本発明のリガンドポリペプチドとしては、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列と約５０〜９９．９％（好ましくは７０〜９９．９％、より好ましくは８０〜９９．９％、さらに好ましくは９０〜９９．９％）の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。実質的に同質の活性としては、例えばレセプター結合活性、シグナル伝達活性などが挙げられる。実質的に同質とは、レセプター結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、レセプター結合活性の強さなどの強弱、ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１２】
さらに具体的には、本発明のリガンドポリペプチドとしては、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を含有するラット全脳、ウシ視床下部またはヒト全脳由来のポリペプチドなどが挙げられる。また、本発明のリガンドポリペプチドとしては、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列に１個以上８０個以下、好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの実質的に同一のアミノ酸配列も挙げられる。
配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を示せば、配列番号：８，９，１０，５０，５１，５２，６４，６５または６６である。また、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、具体的には配列番号：１，３，４，５，６，７，４４，４５，４７，４８，４９，５９，６１，６２または６３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどを挙げることができる。
上記のうち好ましくは配列番号：７３で表されるアミノ酸を含有するポリペプチド及び配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドのＮ末端に配列番号：７４で表されるペプチドがさらに付加したアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどを挙げることができる。
さらに、本発明のポリペプチドもしくは部分ペプチドには、ＧｌｎのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇｌｎがピログルタミン酸化したものなども含まれる。
本明細書におけるペプチドはペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：７３で表されるポリペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（-COOH)またはカルボキシレート(-COO^-)であるが、Ｃ末端がアミド（-CONH₂)またはエステル(-COOR)であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが挙げられる。配列番号：７３で表されるポリペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この時のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
本発明のリガンドポリペプチドとしては特にＣ末端がアミドであるペプチドが好ましい。なかでも、配列番号：５、８、４７、５０、６１、６４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端がアミドであるポリペプチドが好ましい。
本発明のポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のリガンドポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩は、ヒトや温血動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する方法によって製造することもできるし、後述のポリペプチド合成法に準じて製造することもできる。また、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
ヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
上記したように本発明のリガンドポリペプチドは、自体公知のポリペプチドの合成法に従って製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１４】
ポリペプチドのアミド体は、アミド形成に適したペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のポリペプチドを取得する。
上記した保護されたアミノ酸を縮合させるには、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることがしられている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5-4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーアミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえば上記したＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基、Ｃ_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl₂-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
【００１５】
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばPd黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、α−アミノ基の保護基を除いたカルボキシル末端側ペプチドと所望ペプチドからカルボキシル末端側を除いたアミノ末端側ペプチドのα−カルボキシル基の保護基のみを除去し、α−アミノ基や側鎖官能基に上記したような適当な保護基を付けた保護ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
ポリペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１６】
本発明のリガンドポリペプチドの部分ペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩としては、上記した配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドと同様の作用（下垂体機能調節作用、中枢神経機能調節作用または膵臓機能調節作用など）を有しているものであれば、どのようなペプチドであってもよい。このようなペプチドとしてはたとえば、上記した配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドから１ないし１５個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。具体的には、▲１▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第２番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、▲２▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第３番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、▲３▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第４番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、▲４▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第５番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、▲５▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第６番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、▲６▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第７番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、▲７▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第８番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、▲８▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第９番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、▲９▼配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１０番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、■配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１１番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、■配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１２番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、■配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１３番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、■配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１４番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、■配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第１５番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。さらに、配列番号：７４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなども好ましい。
リガンドポリペプチドまたは該部分ペプチドはさらに抗リガンドポリペプチド抗体の調製のための抗原として用いることができる。このような抗原としてのポリペプチドは上記したリガンドポリペプチドまたは該部分ペプチドの他に、上記リガンドポリペプチドのＮ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、中央部分のペプチドが用いられ、より具体的にはたとえば配列番号：９２、９３、９４で表される部分ペプチドが好ましく用いられる。
部分ペプチドとしては、個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本明細書における部分ペプチドもＣ末端がアミド（-CONH₂)またはエステル(-COOR)であってもよい。ここでエステル基の例としては上記したポリペプチドの場合と同様である。該部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この時のエステルとしては、例えば、上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
本発明のリガンドポリペプチドまたはその部分ペプチドは、さらに、機能あるいは性質がよく知られているタンパク質との融合タンパク質であってもよい。
本発明のリガンドポリペプチドの部分ペプチドの塩としては、前述のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
本発明のリガンドポリペプチドの部分ペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩は、上記したポリペプチドの場合と同様の合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
【００１７】
本発明のリガンドポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、本発明の配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、組織・細胞由来のｃＤＮＡ、組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
より具体的には、配列番号：１または配列番号：４４のアミノ酸配列を含有するラット全脳あるいはウシ視床下部由来のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
ここで、配列番号：２において第１２９番目のＲはＧまたはＡを、第１７９番目および２４０番目のＹはＣまたはＴを示す。第１７９番目のＹがＣのとき、配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードし、第１７９番目のＹがＴのとき、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列をコードする。
また、配列番号：３、４、５、６、７、８、９または１０で表されるアミノ酸配列を含有するウシ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。ここで、配列番号：１１、１３、１４、１５の第６３番目のＲおよび配列番号：１２、１６、１７、１８の第２９番目のＲはＧあるいはＡを示す。
また、配列番号：４５、４７、４８、４９、５０、５１または５２で表されるラット由来ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４６、５３、５４、５５、５６、５７または５８で表される塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
さらに、配列番号：５９、６１、６２、６３、６４、６５または６６で表されるヒト由来ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６０、６７、６８、６９、７０、７１または７２で表される塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
また、本発明の配列番号：１、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有するウシ型ポリペプチド、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を含有するラット型ポリペプチド、または配列番号：５９で表されるアミノ酸配列を含有するヒト型ポリペプチドをコードするＤＮＡの中で例えば６個以上９０個以下（好ましくは６個以上６０個以下、より好ましくは９個以上３０個以下、さらに好ましくは１２個以上３０個以下）の部分塩基配列を含有するＤＮＡ断片はＤＮＡ検出プローブとしても好ましく用いられる。
【００１８】
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ポリペプチドまたはその部分ペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを例えばヒト由来ポリペプチドの一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別する。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molecular Cloning （２nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。
クローン化されたポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
ポリペプチドまたはその部分ペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
【００１９】
形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合は、trp プロモーター、lac プロモーター、recＡプロモーター、λＰＬプロモーター、lpp プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、penＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどがそれぞれ利用できる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する。
【００２０】
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
【００２１】
酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウスミエローマ細胞，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれる。
【００２２】
昆虫細胞を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。
このようにして、ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２４】
宿主が昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Jounal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２５】
上記培養物からポリペプチドまたはその部分ペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
ポリペプチドまたはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドまたはその部分ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にポリペプチドまたはその部分ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドまたはその部分ペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるポリペプチドまたはその部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成するポリペプチドまたはその部分ペプチドの活性はレセプターとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００２６】
本発明のリガンドポリペプチドをコードするＤＮＡ、リガンドポリペプチドまたは該部分ペプチドは、▲１▼Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドの一部、あるいは全長の合成、▲２▼本発明のリガンドポリペプチドまたは該部分ペプチドの有する生理作用の探索、▲３▼合成オリゴヌクレオチドプローブあるいはＰＣＲのプライマーの作成、▲４▼Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドや前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの入手、▲５▼組換え型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、▲６▼抗体および抗血清の入手、▲７▼該抗体または抗血清を用いた診断薬の開発、▲８▼下垂体機能調節剤、中枢神経機能調節剤あるいは膵臓機能調節剤などの医薬の開発、▲９▼遺伝子治療等に用いることができる。
特に、後述の組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系によって、ヒトなどの温血動物に特異的なＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。
【００２７】
さらに、上記▲８▼に関し、本発明のリガンドポリペプチド、該部分ペプチド、またはそれをコードするＤＮＡは下垂体、中枢神経系、膵臓β細胞などで発現しているＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質がリガンドとして認識するものであるので、安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のリガンドポリペプチド、該部分ペプチド、またはそれをコードするＤＮＡは下垂体機能調節作用、中枢神経機能調節作用あるいは膵臓機能調節作用に関与していることから、たとえば老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症など）、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病、癌（例：乳癌、リンパ性白血病、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症または乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤として用いることができる。さらに手術後の栄養状態改善剤、昇圧剤などとしても用いることができる。
本発明のポリペプチド、該部分ペプチド、またはそれをコードするＤＮＡを上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００２８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のポリペプチド、該部分ペプチド、またはそれをコードするＤＮＡの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００２９】
上記本発明のリガンドポリペプチドに対するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（例えば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または細胞などに由来するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であって、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくはこれらのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。すなわち、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列と約９０〜９９．９％の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。これらの蛋白質が示す活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナル伝達などが挙げられる。実質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプター蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００３０】
さらに具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、配列番号：１９または（および）配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質などが挙げられる。そして、配列番号：１９および配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、具体的には配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質などが挙げられる。また、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列中の１以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども挙げられる。
ここで、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質は、ヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の全アミノ酸配列を含有するものである。配列番号：１９または（および）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質は、該配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質の断片あるいは部分ペプチドである。さらに、配列番号：２２または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質は、マウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるが、配列番号：１９または（および）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列に非常に高い類似性を示す（実施例８、特に〔図１３〕）ことから、配列番号：２２または２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質も同様に、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質の断片あるいは部分ペプチドの中に含まれる。
すなわち、上述の配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは後述する該蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、配列番号：１９、２０、２２または２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をも含むものである。
さらに、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質には、Ｎ末端のMetが保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、ＧｌｕのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇｌｕがピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００３１】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の塩としては、上記したリガンドポリペプチドと同様のものが挙げられる。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩または該部分ペプチドは、ヒトや温血動物の組織または細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、前述のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養する方法と同じ方法によっても製造することができる。また、前述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位などが用いられる。具体的には、〔図３〕、〔図４〕、〔図８〕、〔図１１〕または〔図１４〕で示される本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドの塩としては、上記したリガンドポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００３２】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、組織・細胞由来のｃＤＮＡ、組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
具体的には、配列番号：１９のアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２０のアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２１のアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２２のアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２３のアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３３】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を完全にコードするＤＮＡのクローニングの方法、用い得るベクター、プロモーター、宿主、形質転換方法、培養方法、分離精製の方法については上記したリガンドポリペプチドの場合と同様である。
たとえば、後述する実施例５で得られるプラスミドｐｈＧＲ３を制限酵素SalIで消化し、ｈＧＲ３をコードするｃＤＮＡの完全長の翻訳枠部分を取り出す。これを同じくSalI消化後に自己閉環を防止するためにＢＡＰ(Bacterial Alkaline Phosphatase)処理を施した動物細胞用発現ベクターpAKKO-111等とライゲーション反応を行う。ライゲーション反応完了後は反応液の一部を用いて大腸菌ＤＨ５等を形質転換する。得られた形質転換体のうち、ｈＧＲ３をコードするｃＤＮＡが発現ベクターにあらかじめ組み込んであるＳＲαなどのプロモーターに対して順方向に挿入されているものを制限酵素切断によるマッピングあるいは塩基配列の決定によって選別しそのプラスミドＤＮＡを大量に調製する。
作成した発現ベクターのＤＮＡを用い、リン酸カルシウム法あるいはリポソーム法などにもとづく動物細胞への遺伝子導入用のキットを用いてＣＨＯ dhfr^-細胞に導入してＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｈＧＲ３）高発現ＣＨＯ細胞株を得る。
得られたＣＨＯ細胞を核酸不含の選択培地でCO₂インキュベーターで３７℃、５％CO₂の条件下で１〜４日培養することによりＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｈＧＲ３）を産生させる。
該ＣＨＯ細胞からＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を担体に架橋させて作製されたアフィニティーカラムあるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドを担体に架橋させたアフィニティーカラムを用いてＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を分離精製する。
【００３４】
かくして生成するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の活性は標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡおよびＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、▲１▼Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、▲２▼抗体および抗血清の入手、▲３▼組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、▲４▼同発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、▲５▼構造的に類似したリガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインの実施、▲６▼遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマーの作成、▲７▼遺伝子治療等に用いることができる。
特に、組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系によって、ヒトなどの温血動物に特異的なＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。
本発明のリガンドポリペプチドおよびそれに対するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、リガンドポリペプチドおよびＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡおよび抗体等の用途について、以下にさらに具体的に説明する。
【００３５】
（１）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、該リガンドの製造法および用途
上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または該部分ペプチドもしくはその塩は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドを探索しまたは決定するための試薬として有用である。
すなわち、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドと、試験化合物とを接触させることを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。
【００３６】
試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニンなど）の他に、例えばヒトや温血動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などをＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
【００３７】
具体的には、上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、または該部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞外ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性）を有する化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を決定する方法を提供する。細胞刺激活性の測定としては上記した中でも特にアラキドン酸遊離を促進する活性または抑制する活性を測定するのが好ましい。
【００３８】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合するリガンドを決定する具体的な方法としては、
▲１▼標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、標識した試験化合物の該蛋白質もしくはその塩、または該部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、
▲２▼標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した試験化合物の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、
▲３▼標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、標識した試験化合物の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を測定しすることを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、
【００３９】
▲４▼試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞外ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、および
▲５▼試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞外ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定することを特徴とする方法を挙げることができる。
リガンド決定方法の具体的な説明を以下にする。
まず、リガンド決定方法に用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適している。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造するには、前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行うことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができる。
【００４０】
したがって、リガンド決定方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該蛋白質を含有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
リガンド決定方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
【００４１】
該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合するリガンドを決定する前記の▲１▼〜▲３▼の方法を実施するためには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分と、標識した試験化合物が必要である。Ｇ蛋白質共役型レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセプター画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。
標識した試験化合物としては、〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した上記の試験化合物などが好適である。
【００４２】
具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合するリガンドの決定方法を行うには、まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種蛋白質をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍlの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドとして選択することができる。
【００４３】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合するリガンドを決定する前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞外ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００４４】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合するリガンド決定用キットは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、その部分ペプチドまたはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分を含有するものである。
リガンド決定用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．リガンド決定用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質標品
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識試験化合物
市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難溶性を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。
▲４▼非標識試験化合物
標識化合物を同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に調製する。
【００４５】
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物を５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した
標識試験化合物を０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定する。
【００４６】
（２）リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤
上記（１）の方法において、明らかにされたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドポリペプチドが有する作用に応じて、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤としても使用することができる。
例えば、生体内において、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が減少しているためにリガンドの生理作用（下垂体機能調節作用、中枢神経機能調節作用あるいは膵臓機能調節作用など）が期待できない患者がいる場合に、（イ）リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）脳細胞などにリガンドポリペプチドもしくはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該脳細胞を該患者に移植することなどによって、該患者の脳細胞におけるリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の量を増加させ、リガンドポリペプチドの作用を充分に発揮させることができる。したがって、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡは、安全で低毒性なリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤などとして用いることができる。
上記ＤＮＡを上記治療剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記したリガンドポリペプチドもしくは該部分ペプチドをコードするＤＮＡを医薬として使用する場合と同様の手段に従って実施することができる。
【００４７】
（３）リガンドポリペプチドに対するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の定量法本発明のリガンドポリペプチドはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩や該レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩に対して結合性を有しているので、生体内におけるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、または該レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩の濃度を感度良く定量することができる。
この定量法は、例えば競合法と組み合わせることによって用いることができる。すなわち、被検体を本発明のリガンドポリペプチドと接触させることによって被検体中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩の濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以下の▲１▼または▲２▼などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
▲１▼入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）
▲２▼入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）
【００４８】
（４）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質と、本発明のリガンドポリペプチド、該部分ペプチドまたはそれらのアミド、エステルもしくはそれら塩（以下、リガンドまたはリガンドポリペプチドと略称する場合がある。）との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩や該部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。このような化合物には、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（即ちＧ蛋白質共役型レセプターアゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ちＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）などが含まれる。「リガンドとの結合性を変化させる」とは、リガンドとの結合を阻害する場合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
【００４９】
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または該レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に、本発明のリガンドを接触させた場合と（ii）上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または該レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に、本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のリガンドと上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該レセプター蛋白質の部分ペプチドに、本発明のリガンドポリペプチドを接触させた場合と（ii）上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該レセプター蛋白質の部分ペプチドに、本発明のリガンドポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該レセプター蛋白質の部分ペプチドに対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
▲１▼標識した本発明のリガンドポリペプチドを、上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、標識した本発明のリガンドポリペプチドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、標識した本発明のリガンドポリペプチドの該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、または該部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識した本発明のリガンドポリペプチドを、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のリガンドポリペプチドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のリガンドポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識した本発明のリガンドポリペプチドを、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、標識した本発明のリガンドポリペプチドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、標識した本発明のリガンドポリペプチドの該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００５１】
▲４▼Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性化する化合物（例えば、本発明のリガンドポリペプチド）をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物および試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物（例えば、本発明のリガンドポリペプチドなど）をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物、および試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法である。
【００５２】
Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする場合、まずラットなどのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含む細胞、組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合物を得て（一次スクリーニング）、その後に該候補化合物が実際にヒトのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認する試験（二次スクリーニング）が必要である。しかし、細胞、組織または細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプター蛋白質も混在するために、目的とするレセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを実際にスクリーニングすることは困難である。しかしながら、ヒト由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を用いることによって、一次スクリーニングの必要がなくなり、リガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプターとの結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。さらに、スクリーニングされた化合物がＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストかＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニストかを評価することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、上記のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適している。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造するには、前述の方法が用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞あるいは該細胞膜画分を用いる場合、前述の調製法に従えばよい。
【００５３】
本発明のリガンドとＧ蛋白質共役型レセプターとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分と、標識した本発明のリガンドポリペプチドが必要である。Ｇ蛋白質共役型レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセプター画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。
標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用することができる。
具体的には、リガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ml〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０^-4Ｍ〜１０^-10 Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００５４】
本発明のリガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞が必要である。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞としては、天然型の本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を有する細胞株（例えば、マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６など）、前述の組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００５５】
本発明のリガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分、および本発明のリガンドポリペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼Ｇ蛋白質共役型レセプター標品
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識リガンド
市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識したリガンド
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼リガンド標準液
リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００５６】
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０^-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
【数１】

ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ₀ ：最大結合量
【００５７】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプターとの結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体的にはＧ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニストは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドポリペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、Ｇ蛋白質共役型レセプターアンタゴニストは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドポリペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のリガンドポリペプチドは下垂体機能調節作用、中枢神経機能調節作用または膵臓機能調節作用に関与していることから、上記したアゴニストあるいはアンタゴニストをたとえば老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症など）、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、低血糖症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、糖尿病（例：糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症など）、癌（例：乳癌、リンパ性白血病、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症または乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤として用いることができる。さらに催眠鎮静剤、手術後の栄養状態改善剤、昇圧剤、降圧剤などとしても用いることができる。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、上記のリガンドポリペプチドを医薬として実施する場合と同様にして実施することができる。
【００５９】
（５）本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する抗体または抗血清の製造
本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血清は、本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
例えば、ポリクローナル抗体は、後述の方法に従って製造することができる。
【００６０】
［ポリクローナル抗体の作製］
上記抗原としてのペプチドもしくは蛋白質は、キャリアー用蛋白と結合される。該キャリアー用蛋白としては、例えば、牛チログロブリン、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、ヘモシアニン、フロインドの完全アジュバント（ディフコ社製）などがあげられる。
該抗原としての蛋白質とキャリアー用蛋白との結合には、公知の常套手段を用いて実施し得る。結合に用いる試薬としては、例えば、グルタールアルデヒド、水溶性カルボジイミドなどがあげられる。抗原としての蛋白質とキャリアー用蛋白との使用比は、約１対１ないし約１対１０が適当であり、反応のｐＨは、中性付近、特に約６〜８前後が良好な結果を与える場合が多い。また、反応に要する時間は、約１〜１２時間が良い場合が多いが、特に、約２〜６時間が適当である。このようにして作成された複合物は、常套手段で約０〜１８℃前後で水に対して透析し、凍結して保存しても良いし、凍結乾燥して保存しても良い。
ポリクローナル抗体を製造するためには、上記のようにして製造した免疫原を温血動物に接種される。上記抗体の製造に用いられる温血動物としては、例えば、哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。免疫原を、温血動物に接種する方法としては、動物に接種する免疫原は、抗体産生をする有効な量でよく、例えば、ウサギに１回１mgを１mlの生理食塩水およびフロインドの完全アジュバントで乳化して、背部ならびに後肢掌皮下に４週間おきに５回接種すると抗体を産生させる場合が多い。このようにして、温血動物中に形成された抗体を採取する方法としては、例えばウサギでは、通常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から採取し、遠心分離して血清として得られる。得られた抗血清は、通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を用いるアフィニティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収することによりポリクローナル抗体を精製することができる。
【００６１】
また、モノクローナル抗体は、後述の方法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
【００６２】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ポリペプチドまたは標識化Ｇ蛋白質共役型レセプターと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
抗リガンドポリペプチド抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、たとえばリガンドポリペプチド抗原またはＧ蛋白質共役型レセプター抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗リガンドポリペプチドモノクローナル抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターを加え、固相に結合した抗リガンドポリペプチドモノクローナル抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
抗リガンドポリペプチドモノクローナル抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なわれる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗リガンドポリペプチド抗体価または抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００６３】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
抗リガンドポリペプチドモノクローナル抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。
以上の（ａ）および（ｂ）の方法に従って製造させる本発明のリガンドポリペプチド抗体またはＧ蛋白質共役型レセプター抗体は、それぞれリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターを特異的に認識することができるので、被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、
（ｉ）本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターに反応する抗体と、被検液および、標識化リガンドポリペプチドまたは標識化Ｇ蛋白質共役型レセプターとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化リガンドポリペプチドまたは標識化Ｇ蛋白質共役型レセプターの割合を測定することを特徴とする被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの定量法、（ii）被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの定量法において、一方の抗体が、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターのＣ端部に反応する抗体であることを特徴とする被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの定量法を提供する。
【００６４】
本発明のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターを認識するモノクローナル抗体（以下、抗リガンドポリペプチド抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体と称する場合がある）を用いてリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えばリガンドポリペプチド量またはＧ蛋白質共役型レセプター量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００６５】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した抗リガンドポリペプチド抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化抗リガンドポリペプチド抗体または標識化抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる抗リガンドポリペプチド抗体または抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体はリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００６６】
本発明のリガンドポリペプチド抗体またはＧ蛋白質共役型レセプター抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００６７】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明のリガンドポリペプチド抗体またはＧ蛋白質共役型レセプター抗体を用いることによって、リガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターを感度良く定量することができる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００６８】
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ
ＧｌｙまたはＧ ：グリシン
ＡｌａまたはＡ ：アラニン
ＶａｌまたはＶ ：バリン
ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ ：セリン
【００６９】
ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ ：システイン
ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ ：リジン
ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【００７０】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
ＢＨＡ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ：ホルミル
ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル
Ｂｚｌ：ベンジル
Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル
Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＮＰ：ジニトロフェニル
Ｂｕｍ：ターシャリーブトキシメチル
Ｔｒｔ：トリチル
【００７１】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ｐＢＯＶ３に含まれるウシ視床下部由来リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドを精製し、P-3画分のＮ末端配列分析をした結果得られたアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５１番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：４〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドを精製、P-2画分のＮ末端配列分析をした結果得られたアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５２番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：５〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５３番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：６〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５４番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：７〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５５番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：８〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５３番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：９〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５４番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：１０〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５５番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：１１〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチド（配列番号：３）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチド（配列番号：４）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチド（配列番号：５）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチド（配列番号：６）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチド（配列番号：７）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチド（配列番号：８）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチド（配列番号：９）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ウシ視床下部由来リガンドポリペプチド（配列番号：１０）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡにコードされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそれぞれ含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列から導きだした塩基配列（配列番号：２７）を有するマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそれぞれ含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列をもとに導き出したマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
ｐ５Ｓ３８に含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ
〔配列番号：３０〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ
〔配列番号：３１〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ
〔配列番号：３２〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ
〔配列番号：３３〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ
〔配列番号：３４〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ
〔配列番号：３５〕
本発明のウシ視床下部由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（Ｐ５−１）
〔配列番号：３６〕
本発明のウシ視床下部由来ポリガンドリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（Ｐ３−１）
〔配列番号：３７〕
本発明のウシ視床下部由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（Ｐ３−２）
〔配列番号：３８〕
本発明のウシ視床下部由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＰＥ）
〔配列番号：３９〕
本発明のウシ視床下部由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＰＤＮ）
〔配列番号：４０〕
本発明のウシ視床下部由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＦＢ）
〔配列番号：４１〕
本発明のウシ視床下部由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＦＣ）
〔配列番号：４２〕
本発明のウシ視床下部由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＢＯＶＦ）
〔配列番号：４３〕
本発明のウシ視床下部由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＢＯＶＲ）
〔配列番号：４４〕
ウシゲノム由来リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４５〕
ｐＲＡＶ３に含まれるラット型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４６〕
ラット型リガンドポリペプチドｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５２番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：４８〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５３番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：４９〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５４番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：５０〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３３〜５２番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：５１〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３３〜５３番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：５２〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３３〜５４番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：５３〕
ラット型リガンドポリペプチド（配列番号：４７）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
ラット型リガンドポリペプチド（配列番号：４８）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
ラット型リガンドポリペプチド（配列番号：４９）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
ラット型リガンドポリペプチド（配列番号：５０）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
ラット型リガンドポリペプチド（配列番号：５１）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
ラット型リガンドポリペプチド（配列番号：５２）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
ｐＨＯＢ７に含まれるヒト型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６０〕
ヒト型リガンドポリペプチドｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３〜５３番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：６２〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３〜５４番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：６３〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３〜５５番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：６４〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５３番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：６５〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５４番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：６６〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５５番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号：６７〕
ヒト型リガンドポリペプチド（配列番号：６１）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６８〕
ヒト型リガンドポリペプチド（配列番号：６２）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６９〕
ヒト型リガンドポリペプチド（配列番号：６３）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７０〕
ヒト型リガンドポリペプチド（配列番号：６４）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７１〕
ヒト型リガンドポリペプチド（配列番号：６５）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７２〕
ヒト型リガンドポリペプチド（配列番号：６６）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７３〕
本発明のリガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、第１０番目のXaaはAlaまたはThr、第１１番目のXaaはGlyまたはSer、第２１番目のXaaはH、Gly、またはGlyArgを示す。
〔配列番号：７４〕
本発明のリガンドポリペプチド断片のアミノ酸配列を示す。ここで、第３番目のXaaはAlaまたはThrを示し、第５番目のXaaはGlnまたはArgを示し、第１０番目のXaaはIleまたはThrを示す。
〔配列番号：７５〕
本発明のラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＲＡ）
〔配列番号：７６〕
本発明のラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＲＣ）
〔配列番号：７７〕
本発明のラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ｒＦ）
〔配列番号：７８〕
本発明のラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ｒＲ）
〔配列番号：７９〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（Ｒ１）
〔配列番号：８０〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（Ｒ３）
〔配列番号：８１〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（Ｒ４）
〔配列番号：８２〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＨＡ）
〔配列番号：８３〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＨＢ）
〔配列番号：８４〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＨＥ）
〔配列番号：８５〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＨＦ）
〔配列番号：８６〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（５Ｈ）
〔配列番号：８７〕
本発明のヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（３ＨＮ）
〔配列番号：８８〕
ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ｒＲＥＣＦ）
〔配列番号：８９〕
ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ（ｒＲＥＣＲ）
〔配列番号：９０〕
Ｇ３ＰＤＨ，ＵＨＲ−１，リガンドの増幅に使用した合成ＤＮＡ（ｒ１９Ｆ）〔配列番号：９１〕
Ｇ３ＰＤＨ，ＵＨＲ−１，リガンドの増幅に使用した合成ＤＮＡ（ｒ１９Ｒ）〔配列番号：９２〕
抗原として使用したリガンドポリペプチドのＮ末端側ペプチド（ペプチド−I）
〔配列番号：９３〕
抗原として使用したリガンドポリペプチドのＣ末端側ペプチド（ペプチド−II）
〔配列番号：９４〕
抗原として使用したリガンドポリペプチドの中央部分のペプチド（ペプチド−III）
〔配列番号：９５〕
ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ
〔配列番号：９６〕
ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ
【００７２】
後述の実施例２で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ２および実施例４で得られた形質転換体エシェリヒアコリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’／ｐＧ３−２は、それぞれ平成６年８月９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にそれぞれ寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７６およびＦＥＲＭ ＢＰ−４７７５として寄託されており、また平成６年８月２２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれＩＦＯ １５７３９およびＩＦＯ １５７４０として寄託されている。
後述の実施例５で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｈＧＲ３は、平成６年９月２７日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８０７として寄託されており、また平成６年９月２２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５７４８として寄託されている。
後述の実施例８で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐ５Ｓ３８は、平成６年１０月２７日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８５６として寄託されており、また平成６年１０月２５日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５７５４として寄託されている。
後述の実施例２０で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐＢＯＶ３は、平成８年２月１３日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５３９１として寄託されており、また平成８年１月２５日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５９１０として寄託されている。
後述の実施例２９で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３は、平成８年９月１２日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６６５として寄託されており、また平成８年９月３日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １６０１２として寄託されている。
後述の実施例３２で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐＨＯＶ７は、平成８年９月１２日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６６６として寄託されており、また平成８年９月５日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １６０１３として寄託されている。
【００７３】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００７４】
【参考例１】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの製造
公知のヒト由来ＴＲＨレセプター蛋白質（ＨＴＲＨＲ）、ヒト由来ＲＡＮＴＥＳレセプター蛋白質（Ｌ１０９１８、ＨＵＭＲＡＮＴＥＳ）、ヒトバーキットリンパ腫由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６８１４９、ＨＳＢＬＲ１Ａ）、ヒト由来ソマトスタチンレセプター蛋白質（Ｌ１４８５６、ＨＵＭＳＯＭＡＴ）、ラット由来μ−オピオイドレセプター蛋白質（Ｕ０２０８３、ＲＮＵ０２０８３）、ラット由来κ−オピオイドレセプター蛋白質（Ｕ００４４２、Ｕ００４４２）、ヒト由来ニューロメジンＢレセプター蛋白質（Ｍ７３４８２、ＨＵＭＮＭＢＲ）、ヒト由来ムスカリン作動性アセチルコリンレセプター蛋白質（Ｘ１５２６６、ＨＳＨＭ４）、ラット由来アドレナリンα₁Ｂレセプター蛋白質（Ｌ０８６０９、ＲＡＴＡＡＤＲＥ０１）、ヒト由来ソマトスタチン３レセプター蛋白質（Ｍ９６７３８、ＨＵＭＳＳＴＲ３Ｘ）、ヒト由来Ｃ₅ａレセプター蛋白質（ＨＵＭＣ５ＡＡＲ）、ヒト由来リガンド不明レセプター蛋白質（ＨＵＭＲＤＣ１Ａ）、ヒト由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｍ８４６０５、ＨＵＭＯＰＩＯＤＲＥ）およびラット由来アドレナリンα₂Ｂ（Ｍ９１４６６、ＲＡＴＡ２ＢＡＲ）の第１膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い部分を見いだした。
【００７５】
また、公知のマウス由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｍ８０４８１、ＭＵＳＧＩＲ）、ヒト由来ボンベジンレセプター蛋白質（Ｌ０８８９３、ＨＵＭＢＯＭＢ３Ｓ）、ヒト由来アデノシンＡ２レセプター蛋白質（Ｓ４６９５０、Ｓ４６９５０）、マウス由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｄ２１０６１、ＭＵＳＧＰＣＲ）、マウス由来ＴＲＨレセプター蛋白質（Ｓ４３３８７、Ｓ４３３８７）、ラット由来ニューロメジンＫレセプター蛋白質（Ｊ０５１８９、ＲＡＴＮＥＵＲＡ）、ラット由来アデノシンＡ１レセプター蛋白質（Ｍ６９０４５、ＲＡＴＡ１ＡＲＡ）、ヒト由来ニューロキニンＡレセプター蛋白質（Ｍ５７４１４、ＨＵＭＮＥＫＡＲ）、ラット由来アデノシンＡ３レセプター蛋白質（Ｍ９４１５２、ＲＡＴＡＤＥＮＲＥＣ）、ヒト由来ソマトスタチン１レセプター蛋白質（Ｍ８１８２９、ＨＵＭＳＲＩ１Ａ）、ヒト由来ニューロキニン３レセプター蛋白質（Ｓ８６３９０、Ｓ８６３７１Ｓ４）、ラット由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６１４９６、ＲＮＣＧＰＣＲ）、ヒト由来ソマトスタチン４レセプター蛋白質（Ｌ０７０６１、ＨＵＭＳＳＴＲ４Ｚ）およびラット由来ＧｎＲＨレセプター蛋白質（Ｍ３１６７０、ＲＡＴＧＮＲＨＡ）の第６膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い部分を見いだした。
【００７６】
上記の（ ）内の略語はDNASIS Gene/Proteinシークエンスデータベース（ＣＤ０１９、日立ソフトウエアエンジニアリング）を用いて GenBank/EMBL Data Bank を検索した際に示される整理番号であり、それぞれ通常Accession Numberおよびエントリーネームと呼ばれるものである。ただし、ＨＴＲＨＲは特開平７−３０４７９７号に記載されている配列である。
特に、多くのレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡで一致する塩基部分を基準とし、その他の部分においてもなるべく多くのレセプターｃＤＮＡと配列の一致性を高めるために混合塩基の導入を計画した。この配列をもとに、共通する塩基配列に相補的である配列番号：２９または配列番号：３０で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本を作成した。

（ ）内は合成時に複数の塩基に混合して合成する。
【００７７】
【実施例１】
ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法による受容体ｃＤＮＡの増幅
ヒト下垂体由来ｃＤＮＡ（QuickClone、クロンテック社）を鋳型として用い、参考例１で合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー（配列：５’プライマー配列および３’プライマー配列）各１μＭ、鋳型ｃＤＮＡ １ｎｇ、０.２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase １μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応溶液量は１００μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用い、９５℃・１分、５５℃・１分、７２℃・１分のサイクルを３０回繰り返した。Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase を添加する前に、残りの反応液を混合し、９５℃・５分、６５℃・５分の加熱を行った。増幅産物の確認は１.２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって行った。
【００７８】
【実施例２】
ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読による新規レセプター蛋白質候補クローンの選択実施例１で行なったＰＣＲ後の反応産物は０.８％の低融点アガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリで切り出した後、熱融解、フェノール抽出、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。ＴＡクローニングキット（インビトロゲン社）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ^TMII（ＴＭは登録商標を意味する）へサブクローニングした。これを大腸菌ＩＮＶαＦ’ competent cell（インビトロゲン社）に導入して形質転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ２を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、自動プラスミド抽出装置（クラボウ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部を用いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤＮＡの一部をさらにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用いて行った。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
決定した塩基配列〔配列番号：２４（図１の塩基配列から下線部分を除いた塩基配列）および配列番号：２５（図２の塩基配列から下線部分を除いた塩基配列）〕をもとにホモロジー検索を行なった結果、形質転換体Ｅ. Ｃｏｌｉ ＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ２の保有するプラスミドｐ１９Ｐ２に挿入されたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードすることが分かった。それをさらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変換した〔配列番号：１９（図１のアミノ酸配列から下線部分を除いたアミノ酸配列）および配列番号：２０（図２のアミノ酸配列から下線部分を除いたアミノ酸配列）〕。疎水性プロット〔図３および図４〕およびアミノ酸配列に基づくホモロジー検索を行ない、ニューロペプチドＹ受容体等との相同性を見いだした〔図５〕。
【００７９】
【実施例３】
マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６からのpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成
マウス膵β細胞株ＭＩＮ６（Jun-ichi Miyazaki et al. Endocrinology, Vol.127, No.1, p126-132）よりグアニジンイソチオシアネート法により Total ＲＮＡを調製後（Kaplan B.B. et al., Biochem. J. 183, 181-184（1979）)、ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社）を用いて、 poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次に、poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇにプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニイマウス白血病ウイルスの逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物はフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿を行った後、３０μｌのＴＥに溶解した。
【００８０】
【実施例４】
ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法による受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定
実施例３でマウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、参考例１で合成したＤＮＡプライマーを用いて実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られたＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プラスミドｐＧ３−２を得た。このプラスミドで大腸菌ＩＮＶαＦ’を形質転換し、形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’／ｐＧ３−２を得た。
また、マウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、Libert, Fら（Science 244:569-572, 1989）に記載されている合成ＤＮＡプライマー、すなわち、

〔Ｉをイノシンを示す。〕で表される合成プライマーを用いて、実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られたＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プラスミドｐＧ１−１０を得た。
【００８１】
塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用いて行った。ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０の配列をもとにマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：２７）およびこれにコードされるアミノ酸配列（配列番号：２２）を〔図６〕に示した。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
決定した塩基配列〔図６〕をもとにホモロジー検索を行なった結果、得られたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードすることが分かった。それをさらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変換した後〔図６〕、疎水性プロットを行なったところ、６個の疎水性領域の存在が確認できた〔図８〕。また、アミノ酸配列を実施例２で得たｐ１９Ｐ２と比較したところ、〔図７〕に示すとおり高い相同性を見いだした。その結果、ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とヒト下垂体由来ｐ１９Ｐ２にコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は由来する動物種は異なるが、同一のリガンドを認識するレセプター蛋白質であることが強く示唆された。
【００８２】
【実施例５】
ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーからのレセプター蛋白質の全コード領域を含むｃＤＮＡのクローニング
ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーとしては、クローンテック社製のλｇｔ１１ファージベクターを使ったライブラリーを用いた（クローンテック、ＣＬＨＬ１１３９ｂ）。２×１０⁶ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・ユニット）分のヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーを、硫酸マグネシウムで処理した大腸菌Ｙ１０９０^-と混ぜ、３７℃、１５分間インキュベートした後、０.５％アガロース（ファルマシア社）ＬＢを加え、１.５％寒天（和光純薬社）ＬＢプレート(５０μg/ml Ampicilin含有）に播いた。プラークのできたプレートにニトロセルロースフィルターを置き、フィルター上にプラークを転写した。このフィルターをアルカリ処理することによって変性させた後、８０℃、３時間の加熱によってＤＮＡの固定を行った。
このフィルターを、５０％ formamide，５×ＳＳＰＥ，５× Denhardt's溶液，０.１％ ＳＤＳ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを含むバッファー中で以下に述べるプローブと４２℃で一晩インキュベートし、ハイブリダイズさせた。プローブとしては、実施例２で得られたプラスミドｐ１９Ｐ２に挿入されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで切断し、回収後、ランダムプライムＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）を用いて〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（デュポン社）を取り込ませることによって標識して用いた。洗浄は、２×ＳＳＣ，０.１％ ＳＤＳで５５℃、１時間行い、その後、−８０℃でオートラジオグラフィを行ってハイブリダイズするプラークを検出した。
【００８３】
このスクリーニングにより、３個の独立したプラークにハイブリダイゼーションのシグナルが認められた。この３個のクローンからそれぞれＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化したものをアガロース電気泳動後、スクリーニングに用いたものと同じプローブを用いて、サザンブロットにより解析を行ったところ、各々約０.７ｋｂ，０.８ｋｂ，２.０ｋｂのところにそれぞれハイブリダイズするバンドを生じ、このうち約２.０ｋｂのバンドを生じるもの（λｈＧＲ３）を選択した。λｈＧＲ３のハイブリダイズするサイズのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした後、このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体 Ｅ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐｈＧＲ３を得た。このプラスミドｐｈＧＲ３を、実施例２で示された塩基配列から予想される制限酵素地図をもとにして制限酵素地図を作製したところ、実施例２で示されるレセプター蛋白質をコードするＤＮＡから予想されるレセプター蛋白質の全長をコードするＤＮＡを保持していることが分かった。
【００８４】
【実施例６】
ヒト下垂体由来レセプター蛋白質ｃＤＮＡの塩基配列の決定
実施例５で得られたプラスミドｐｈＧＲ３に挿入したＥｃｏＲＩ断片のうち、レセプター蛋白質をコードしていると考えられるＥｃｏＲＩサイトからＮｈｅＩサイトまでの約１３３０ｂｐの塩基配列を決定した。具体的には、ＥｃｏＲＩ断片中に存在する制限酵素サイトを利用して、不必要な部分を除き、または必要な断片をサブクローニングし、配列解析のための鋳型プラスミドを調製した。
塩基配列決定のための反応は Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて解読し、データー解析にはＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を使用した。
ｐｈＧＲ３のコードするＥｃｏＲＩサイト直後からＮｈｅＩサイトまでの塩基配列を〔図９〕に示した。そして、ヒト下垂体由来レセプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列は、〔図９〕の塩基配列の第１１８番目〜第１２２７番目の塩基配列（配列番号：２６）に対応する。そして、これにコードされるレセプター蛋白質のアミノ酸配列は配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列であることが分かった。
【００８５】
【実施例７】
ヒト下垂体由来レセプター蛋白質をコードするｐｈＧＲ３を用いたノーザンハイブリダイゼーション
実施例５で得られたプラスミドｐｈＧＲ３にコードされるヒト下垂体由来レセプター蛋白質の下垂体での発現をｍＲＮＡレベルで検出するため、ノーザンブロットを行った。ｍＲＮＡとしてはヒト下垂体ｍＲＮＡ（クローンテック社）２.５μｇを用い、プローブは実施例５で用いたものと同じものを用いた。また、ノーザンブロット用のフィルターは、Nylon membrane（Pall Biodyne, U.S.A.）を用い、ｍＲＮＡの泳動フィルターへの吸い上げは Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）の方法に従って作製した。ハイブリダイゼーションは、上に述べたフィルターとプローブを５０％ formamide，５×ＳＳＰＥ，５×Denhardt's溶液，０.１％ ＳＤＳ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを含むバッファー中で、４２℃一晩インキュベートした。フィルターの洗浄は０.１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳで５０℃にて行い、風乾後３日間−８０℃でＸ線フィルム（ＸＡＲ５，コダック）に感光させた。その結果を〔図１０〕に示した。〔図１０〕から、ｐｈＧＲ３がコードするレセプター遺伝子はヒト下垂体で発現していると考えられる。
【００８６】
【実施例８】
ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法による受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定
実施例３でマウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、実施例４で合成したLibert, F.ら（Science 244:569-572, 1989）に記載されている合成ＤＮＡプライマー、すなわち、

〔Ｉをイノシンを示す。〕で表される合成プライマーを用いて、実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られたＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プラスミドｐ５Ｓ３８を得た。このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐ５Ｓ３８を得た。
【００８７】
塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用いて行った。ｐ５Ｓ３８の配列をもとにマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：２８）およびこれにコードされるアミノ酸配列（配列番号：２３）を〔図１２〕に示した。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
決定した塩基配列〔図１２〕をもとにホモロジー検索を行なった結果、得られたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードすることが分かった。それをさらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変換した後〔図１２〕、疎水性プロットを行なったところ、４個の疎水性領域の存在が確認できた〔図１４〕。また、アミノ酸配列を実施例２で得たｐ１９Ｐ２および実施例４で得たｐＧ３−２と比較したところ、〔図１３〕に示すとおり高い相同性を見いだした。その結果、ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とｐ１９Ｐ２にコードされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、由来する動物種は異なるが、同一のリガンドを認識するレセプター蛋白質であることが強く示唆された。また、ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、同一のリガンドを認識するレセプター蛋白質であり、互いに近縁なレセプター蛋白質（いわゆる、サブタイプ）であることが示唆された。
【００８８】
【実施例９】
ｐｈＧＲ３発現ＣＨＯ細胞の作製
ヒト下垂体由来レセプター蛋白質の全長アミノ酸配列をコードするcDNAを組み込んだプラスミドｐｈＧＲ３（実施例５）を制限酵素Nco I で切断し、アガロースゲル電気泳動後に約1kbの断片を回収した。回収した断片の両端をDNA blunting kit（宝酒造）を用いて平滑化した後、Sal Iリンカーを付加しさらにSal Iで処理した後、pUC119のSal I siteに組み込んでプラスミドS10を得た。S10をSal IおよびSac IIで処理することにより約700bpの断片（N末端側のコード領域を含む）を調製した。次にｐｈＧＲ３よりSac II およびNhe I で切り出される約700bpの断片（終始コドンを含むＣ末端側コード領域を含む）を調製した。これらの２つの断片をSal IおよびNhe I処理した動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Biochim. Biophys. Acta, Hinuma, S., et al. 1219巻、251-259頁、1994年記載のpAKKO1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加えてligationを行い全長レセプター蛋白質発現用プラスミドｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２ を構築した。
ｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２で形質転換した大腸菌を培養後、ＱＵＩＡＧＥＮ Maxiによって大量にｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２のプラスミドＤＮＡを調製した。そのうち20μｇのプラスミドＤＮＡを1mlの滅菌ＰＢＳに溶解した後、ジーントランスファー（和光純薬）のバイアルに入れ、十分にボルテックスを行うことによってリポソームの形成を行わせた。24時間前に直径10cmシャーレに1×10⁶個ずつ継代し、直前に新鮮な培地に交換したＣＨＯdhfr^-細胞に125μlのリポソーム溶液を添加し、一晩培養した。新鮮な培地に交換してさらに一日培養した後、選択培地に交換して１日間培養した。形質転換体を効率良く選別するために、低細胞密度で継代を行い、選択培地中で増殖してくる細胞のみを選択し、全長レセプター蛋白質発現CHO細胞株 ＣＨＯ−１９Ｐ２を樹立した。
【００８９】
【実施例１０】
ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株での全長レセプター蛋白質の発現量の転写レベルでの確認
Fast Track kit (Invitrogen社）を用い、キットの処方にしたがってｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２を導入して形質転換したＣＨＯ細胞とｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞からpoly(A)⁺RNAを調製した。このpoly(A)⁺RNAを0.02μｇ用い、RNA PCR Kit (宝酒造）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。用いたプライマーの種類はrandom 9merで、反応液の全容量は40μlとした。また、ｃＤＮＡ合成のネガティブコントロールとして、リバーストランスクリプターゼを添加しない反応液も準備した。最初、30℃で10分間のインキュベートを行ってプライマーからの伸長反応をある程度行わせた。その後、42℃で３０分間インキュベートして十分に逆転写反応を進行させ、99℃で５分間加熱して酵素を失活し、さらに5℃で５分間冷却した。
逆転写反応終了後に反応液の一部を回収し、蒸留水で希釈した後、フェノール／クロロフォルム抽出、ジエチルエーテル抽出を行った。これをエタノール沈殿し、一定量の蒸留水に溶解したものをｃＤＮＡの試料とした。このｃＤＮＡ溶液およびプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２）を段階的に希釈したものを作成し、全長レセプター蛋白質に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。全長レセプター蛋白質のコード領域の塩基配列に基づいて作成したプライマーの配列は、５’側がＣＴＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣ（配列番号：３３）、３’側がＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＴＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ（配列番号：３４）である。
ＰＣＲ反応は、プライマー各1μMおよびTaq DNA polymerase (宝酒造）0.5μl、酵素に添付の反応バッファーおよびdNTPsと10μlの鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいはプラスミド溶液）を用いて全容量100μlで行った。最初に94℃で２分間熱処理を行って鋳型ＤＮＡの変性を十分に行った後に、95℃で30秒、65℃で30秒、72℃で60秒のサイクルを25回行った。反応終了後に10μlの反応液を用いてアガロースゲル電気泳動を行い増幅産物の検出および量的な比較を行った。その結果全長レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡの配列から推定される大きさ（400bp）のＰＣＲ産物が、検出された〔図１５〕。リバーストランスクリプターゼを添加しなかった逆転写反応産物を鋳型として用いたＰＣＲ反応液のレーンに特異的なバンドは検出されず、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物である可能性は除外され、また、ｍｏｃｋ細胞のレーンにも特異的なバンドが出現しないことから、ＣＨＯ細胞にもとから発現しているｍＲＮＡ由来ではないことが確認された〔図１５〕。
【００９０】
【実施例１１】
ラット全脳抽出液に含まれるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性の検出
ラット全脳よりペプチド粗画分を以下の方法で調整した。屠殺後、直ちに摘出したラット全脳を液体窒素にて凍結、-80℃にて保存した。凍結保存したラット全脳20g(ラット10匹分)を細かく砕き、蒸留水80mlで10分間煮沸した。煮沸後、氷上にて急冷し、終濃度 1.0M となるよう酢酸を4.7ml加え、ポリトロン(20,000rpm、6min)を用いてホモジナイズした。ホモジェネートは、一晩撹拌した後、遠心(10,000rpm、20min)により上清をとり、沈殿物を1.0M酢酸40mlでホモジナイズし遠心にて再度上清を得た。上清をまとめ、3倍量のアセトンを加え、氷上に30分間放置した後遠心(10,000rpm、20min)にて上清を回収した。回収したアセトン上清は、エバポレーションにて脱アセトン、濃縮を行った。濃縮された脱アセトン上清に、2倍量の0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)/H₂Oを加え、ガラス製カラムに詰めた逆相C18カラム(Prep C18 125Å 10ml：ミリポア)に添加した。上清を添加後、0.05%TFA/H₂O でカラムを洗浄、10%、20%、30%、40%、50%、60% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O で段階的に溶出し、それぞれの画分を10等分して凍結乾燥した。1匹分の全脳由来の乾燥標品を、ジメチルスルホキシド(DMSO)20μlにて溶解し、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)を加えたハンクス氏液(HBSS)1mlに懸濁し、ペプチド粗画分とした。
全長レセプター蛋白質発現CHO細胞およびｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞を、24well plateに0.5x10⁵cells/wellで播種し、24時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25μCi/well となるよう添加した。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞を0.05%BSAを含むHBSSで洗浄、上述のペプチド粗画分を400μl/wellで添加した。37℃で30分間インキュベートした後に、反応液400μl中300μlをシンチレーター4mlに加え、反応液中に遊離された[³H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーション・カウンターによりモニターした。その結果、30%CH₃CNの溶出画分に全長レセプター蛋白質発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−１９Ｐ２）特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が検出された〔図１６〕。
【００９１】
【実施例１２】
ウシ視床下部抽出液に含まれるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性の検出
実施例１１と同様の方法でウシ視床下部を含む脳組織片360g(10頭分)よりペプチド粗画分を調製した。0.5頭分由来の乾燥ペプチド標品を40μlのDMSO に溶解し、0.05%BSAを含む2mlのHBSSに懸濁し、実施例１１と同様の方法でアラキドン酸代謝物遊離活性の検出を試みた。その結果、ウシ視床下部ペプチド粗画分のC18カラム30%CH₃CN溶出画分に、ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された〔図１７〕。
【００９２】
【実施例１３】
ウシ視床下部からのＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性物質(ペプチド)の精製
ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的アラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性物質についてウシ視床下部から精製した代表例を以下に具体的に述べる。視床下部を含む凍結脳組織片4.0kg(80頭分)を小片化し、蒸留水8.0L中で20分間煮沸した。氷上にて急冷した後、終濃度1.0Mとなるように酢酸540mlを加え、ポリトロン(10,000rpm、12min)にてホモジナイズした。ホモジェネートを一晩撹拌した後、遠心(9,500rpm、20min)にて上清を得た。沈殿物は1.0M酢酸4.0Lに懸濁し、ポリトロンにてホモジナイズし遠心にて再度上清を得た。上清を一つにまとめ、終濃度0.05%となるようにTFAを加え、ガラス製カラムに詰めた逆相C18カラム(Prep C18 125Å 160ml:ミリポア)に添加した。添加後、0.05%TFA/H₂0 320ml でカラムを洗浄後、10%、30%、50% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O で3段階に溶出した。30% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O 溶出画分に２倍量の 20mM CH₃COONH₄/H₂O を加え、陽イオン交換カラム HiPrep CM-Sepharose FF (Pharmacia)に添加した。20mM CH₃COONH₄/10% CH₃CN/H₂O でカラムを洗浄後、100mM、200mM、500mM、1000mM CH₃COONH₄/10% CH₃CN/H₂O で４段階に溶出した。200mM CH₃COONH₄ 溶出画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が見いだされたので、この溶出画分に３倍量のアセトンを加え、遠心して除タンパク質を行った後、エバポレーションによる濃縮を行った。濃縮された画分にTFA(終濃度0.1%)を加えた後さらに 酢酸を加えてpH4に調製し、逆相カラム RESOURCE RPC 3ml(Pharmacia)に添加した。15%-30% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、19%-21% CH₃CN の画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された。RESOURCE RPC の活性画分を 凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち、50mM MES pH5.0/10% CH₃CN に懸濁し、陽イオン交換カラム RESOURCE S 1ml(Pharmacia)に添加した。0M-0.7M NaCl 濃度勾配による溶出で、0.32M-0.46M NaCl の画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された。RESOURCE S の活性画分を 凍結乾燥後、DMSOに溶解したのち、0.1%TFA/H₂O に懸濁し、逆相カラム C18 218TP5415(Vydac) に添加した。20%-30% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、22.5%、23%、23.5% CH₃CN の３つの画分（活性画分をそれぞれP-1、P-2、P-3とする）にそれぞれＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された〔図１８〕。３つに分離した活性のうちの 23.5% CH₃CN の画分（p-3)を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち、0.1%TFA/H₂O に懸濁し、逆相カラム diphenyl 219TP5415(Vydac) に添加した。22%-25% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、23% CH₃CN で溶出される１つのピークにＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性は収束した〔図１９〕。逆相カラムdiphenyl 219TP5415 で活性と一致したピークの画分を凍結乾燥後、0.1%TFA/H₂O に懸濁し、逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10(Pharmacia) に添加した。22%-23.5% CH₃CN 濃度勾配による溶出で 23.0% と 23.2% CH₃CN で溶出される二つのピークにそれぞれＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された〔図２０〕。
【００９３】
【実施例１４】
ウシ視床下部から精製したＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性ペプチドのアミノ酸配列決定
実施例１３で精製されたＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性ペプチド(P-3)のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10 で活性と一致したピークの画分を凍結乾燥後、70% CH₃CN 20μl に溶解し、ペプチドシークエンサー(ABI.491) によるアミノ酸配列の分析を行った。その結果、配列番号：３が得られた。ただし、７番目と１９番目の配列はアミノ酸配列の分析のみでは決定されていない。
【００９４】
【実施例１５】
ウシ視床下部からのＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性物質（ペプチド）の精製
実施例１３において Vydac Ｃ１８ ２１８ＴＰ５４１５ で分離された３つの活性のうち２３.０％ ＣＨ₃ＣＮの活性画分（Ｐ-２）のさらなる精製を行った。この活性画分を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち０.１％ ＴＦＡ／蒸留水に懸濁し、逆相カラムdiphenyl ２１９ＴＰ５４１５（Vydac）に添加した。２１.０％−２４.０％ ＣＨ₃ＣＮ濃度勾配による溶出で、２１.９％ ＣＨ₃ＣＮで溶出される一つのピークにＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された。この画分を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち０.１％ ＴＦＡ／蒸留水に懸濁し、逆相カラムμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.１／１０（Pharmacia）に添加した。２１.５％−２３.０％ ＣＨ₃ＣＮ濃度勾配による溶出で、２２.０％ ＣＨ₃ＣＮで溶出される一つのピークにＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が収束した〔図２１〕。
【００９５】
【実施例１６】
ウシ視床下部から精製されたＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するペプチド（Ｐ-２）のアミノ酸配列決定実施例１５で精製されたＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するペプチド（Ｐ-２）のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラムμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.１／１０で活性と一致したピークの画分を凍結乾燥後、７０％ ＣＨ₃ＣＮ ２０μｌに溶解し、ペプチドシークエンサー（ＡＢＩ，４９２）によるアミノ酸配列の分析を行った（配列番号：４）。
【００９６】
【実施例１７】
ウシ視床下部からの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成
ウシ１頭分の視床下部より Isogen（ニッポンジーン社）により total ＲＮＡを調製後、FastTrack（Invitrogen社）を用いて poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次にこの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分１μｇから、３' ＲＡＣＥ system（GIBCO BRL）および Marathon cDNA amplification kit（Clontech）により、マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、それぞれ２０および１０μｌに溶解した。
【００９７】
【実施例１８】
実施例１４で明らかとなったアミノ酸配列部分をコードするｃＤＮＡの取得
実施例１４で明らかとなったアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡを取得するため、まず配列番号：１をコードする塩基配列の取得をめざした。そこでプライマーＰ５-１（配列番号：３５）、Ｐ３-１（配列番号：３６）、Ｐ３-２（配列番号：３７）を合成した（配列表においてＩはイノシンを示す）。実施例１７で３' ＲＡＣＥ system を用いて調製したｃＤＮＡ ０.５μｌを鋳型として、ＤＮＡ polymerase としてＥＸＴaq（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌ、ｄＮＴＰ ２００μＭと、プライマーＰ５-１，Ｐ３-１をそれぞれ２００ｎＭとなるように加え水で２５μｌとして、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、５０℃・３０秒、６８℃・１０秒のサイクルを３０回繰り返した。この反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマーをＰ５-１とＰ３-２に組み合わせに換え、その他は同じ条件で反応を行った。サーマルサイクラーは GeneAmp9600（パーキンエルマー社）を用いた。増幅産物を４％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約７０ｂｐ のバンドを切り出し、熱融解、フェノール抽出、エタノール沈殿した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキット（Invitrogen）のマニュアルに従い、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、自動プラスミド抽出器（クラボウ）でプラスミドを調製した。このプラスミドを Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ）でマニュアルに従い反応し、蛍光自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ）により解読した。その結果〔図２２〕に示す配列が得られ、これが配列番号：１をコードする塩基配列の一部であることを確認した。
【００９８】
【実施例１９】
実施例１８で明らかになった配列を用いてのＲＡＣＥ法による生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの取得
まず５'側の配列を増幅する（５’ＲＡＣＥ）のために〔図２２〕に示した配列を利用してＰＥ（配列番号：３８）とＰＤＮ（配列番号：３９）の２本のプライマーを合成した。実施例１７で Marathon cDNA amplification kit により調製したｃＤＮＡをトリシン・ＥＤＴＡバッファーで１００倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、実施例２と同様の方法で反応液を調製し、キット添付のアダプタープライマーＡＰ１とＰＥの組み合わせで、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・５分のサイクルを３０回繰り返した。さらにこの反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマーをＡＰ１とＰＤＮの組み合わせに換え、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、７０℃・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、６８℃・５分のサイクルを２６回繰り返した。増幅産物を１.２％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約１５０ｂｐ のバンドを切り出し、遠心濾過チューブ（ミリポア社）で遠心濾過後、フェノール抽出、エタノール沈殿した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキット（Invitrogen）のマニュアルに従い、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られた形質転換体を実施例１８と同様の方法で挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析した。その結果、〔図２３〕に示す配列が得られた。さらにこの配列を基にプライマーＦＢ（配列番号：４０），ＦＣ（配列番号：４１）を合成し、３'側の配列取得を行った（３’ＲＡＣＥ）。鋳型は５’ＲＡＣＥと同じものを同量用い、キット添付のアダプタープライマーＡＰ１とＦＣの組み合わせで、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・５分のサイクルを５回、９８℃・１０秒、７０℃・５分のサイクルを５回、９８℃・１０秒、６８℃・５分のサイクルを２５回繰り返した。さらにこの反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマーを、やはりキット添付のＡＰ２とＦＢの組み合わせに換え、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、７０℃・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、６８℃・５分のサイクルを２７回繰り返した。増幅産物を１.２％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約４００ｂｐ のバンドを切り出し、５’ＲＡＣＥのときと同様の方法でＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニング後、大腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られた形質転換体に挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析した。５'および３’ＲＡＣＥの結果から、配列番号：１に示した生理活性ポリペプチドの全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列〔図２４〕を得た。具体的には、図２４（ａ）および（ｂ）において、第１３４番目の塩基がＧのものであって、第１８４番目の塩基がＴおよびＣのもの、第２４５番目の塩基がＴおよびＣのものが得られた。
図２４に示したｃＤＮＡは９８アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。第１から第２２番目のアミノ酸が疎水的なアミノ酸が集合していることと実施例１４に示したように活性ペプチドのＮ末端が第２３番目のSerから始まっていることを考え合わせると、第１から２２番目のアミノ酸は分泌シグナルの配列であると推定された。一方、ポリペプチドの第５４番目から５７番目に存在するGlyArgArgArg配列は生理活性ペプチドが切断される場合に存在する典型的なアミノ酸配列モチーフであることが分かった。またこの切断モチーフの場合にはGlyが存在するためしばしば生成するペプチドのＣ末端はアミド化されることが知られている。
実施例１４のP-3のＮ末端配列および実施例１６のP-2のＮ末端配列情報とこのGlyArgArgArg配列を考え合わせるとこのｃＤＮＡにコードされるポリペプチドから切り出されてくる生理活性ペプチドの少なくとも一部は配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９もしくは配列番号：１０であると考えられた。
【００９９】
【実施例２０】
ＰＣＲ法によるウシ型生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の取得
実施例１７で Marathon cDNA amplification kit により調製したｃＤＮＡを鋳型として生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の取得を行った。まず実施例１９で明らかとなったｃＤＮＡの配列を基に、配列番号：４２、配列番号：４３で表される塩基配列を有するプライマーを２本合成した。

ＢＯＶＦは生理活性ポリペプチドｃＤＮＡのスタートコドンを含み、制限酵素ＳａｌＩ部位を付加した−２〜＋２２（スタートコドンＡＴＧのＡを＋１とする）に対応するセンス配列で、ＢＯＶＲは生理活性ポリペプチドｃＤＮＡのストップコドンを含む＋２８５〜＋３０９に対応するアンチセンス配列である。
ＰＣＲ反応は実施例１７で Marathon cDNA amplification kit により調製したｃＤＮＡをトリシン・ＥＤＴＡバッファーで１００倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、実施例２と同様の方法で反応液を調製し、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・５分のサイクルを３回、９８℃・１０秒、７０℃・５分のサイクルを３回、９８℃・１０秒、６８℃・５分のサイクルを２７回繰り返した。増幅産物を２％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約３２０ｂｐ のバンドを切り出し、実施例３と同様の方法でＤＮＡを回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入して、形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐＢＯＶ３を得た。得られた形質転換体に挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析した。その結果このＤＮＡ断片は生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全コード領域を含む断片であることが確認された。
【０１００】
【実施例２１】
Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ２−Ｌ３１）の合成。
１）Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Ala-His(Bom)-Gln-His(Bom)-Ser(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin の合成。
市販ｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド バイオシテムズ、現パ−キンエルマ−社製）0.71g(0.5 m mole)をペプチド合成機（アプライド バイオシテムズ社製４３０Ａ）の反応器に入れ、ＤＣＭで膨潤させた後、最初のアミノ酸Boc-PheをHOBt/DCC法で活性化しｐ−メチルＢＨＡ樹脂に導入した。樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し、Boc基を除去してアミノ基を遊離させ、DIEAで中和した。このアミノ基に次のアミノ酸Boc-Arg(Tos)をHOBt/DCC法で縮合した。未反応アミノ基の有無をニンヒドリンテストで調べ反応完了を確認後同様に、Boc-Gly、Boc-Val、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Gly、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Ala、Boc-Tyr(Br-Z)を順次縮合、ニンヒドリンテストで縮合が不十分であると判明したBoc-Ala、 Boc-Tyr(Br-Z)は再縮合し反応を完了した。樹脂を乾燥して半量の樹脂を取り出した残りに、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Glu(OcHex)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom)、Boc-Gln、Boc-His(Bom)、Boc-Ala、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)を同様にニンヒドリンテストで十分な縮合が得られるまで再縮合をくり返した。１９Ｐ２−Ｌ３１の全配列アミノ酸が導入され樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し樹脂上のBoc基を除去後、樹脂を乾燥し1.28gのペプチド樹脂を合成した。
２）Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ２−Ｌ３１）の合成。
１）で得た樹脂をｐ−クレゾール3.8g、1、4-ブタンジチオ−ル１ml、弗化水素10mlと共にテフロン製弗化水素反応装置中で０℃ ６０分間反応した。弗化水素、1、4-ブタンジチオ−ル１mlを減圧留去し、残留物にジエチルエーテル100mlを加え撹袢後、グラスフィルター上に濾取、乾燥した。これを50%酢酸水溶液50ml中に懸濁、撹袢し、ペプチドを抽出した後樹脂と分離し減圧下に約５mlまでに濃縮した後、セファデックスG-25（２ｘ９０ｃｍ）のカラムに付し50%酢酸水で展開し114 ml〜181 mlの画分を集め凍結乾燥し、１９Ｐ２−Ｌ３１を含む白色粉末290 ｍｇを得た。これをLiChroprep RP-18（ＭＥＲＣＫ社製）を充填した逆相系カラムにつけ0.1% ＴＦＡ水と0.1% ＴＦＡ含有3０％アセトニトリル水溶液を用いたグラジエント溶出での精製をくり返し、アセトニトリル濃度２５％前後に溶出される部分を集め凍結乾燥し、白色粉末７１ｍｇを得た。

【０１０１】
【実施例２２】
Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met(O)-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ））の合成。
合成１９Ｐ２−Ｌ３１ ６ｍｇを５％−酢酸水溶液２０ｍｌに溶解し３０％−過酸化水素水４０μｌを加えMet部分のみを酸化し、反応終了後直ちにLiChroprep RP-18（ＭＥＲＣＫ社製）を充填した逆相系カラムにつけて精製し目的物 ５．８ｍｇをえた。

【０１０２】
【実施例２３】
Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ２−Ｌ２０）の合成。
実施例２１の１）でBoc-Tyr(Br-Z)までを縮合した樹脂にさらにBoc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)を同様に縮合し、 Boc-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin１．１４ｇを得た。これを実施例２１の２）と同様に弗化水素処理、カラム精製し、白色粉末６０ｍｇを得た。

【０１０３】
【実施例２４】
合成ペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３１）によるアラキドン酸代謝物遊離活性の測定
実施例１１と同様に、実施例２１で合成されたペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３１）によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキドン酸代謝物の遊離を測定した。合成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで希釈して、それぞれの濃度におけるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からのアラキドン酸代謝物の遊離を［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を指標に測定した。その結果、１０^-12Ｍ〜１０^-6Ｍで濃度依存的なアラキドン酸代謝物遊離の活性が検出された〔図２５〕。さらに、実施例２２で合成された１９Ｐ２−Ｌ３１のメチオニン酸化体であるペプチド１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）について１９Ｐ２−Ｌ３１とのアラキドン酸代謝物遊離活性の比較を行った結果、〔図２６〕に示すように１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）は１９Ｐ２−Ｌ３１と同等の活性を示すことが分かった。
【０１０４】
【実施例２５】
合成ペプチド（１９Ｐ２−Ｌ２０）によるアラキドン酸代謝物遊離活性の測定
実施例１１と同様に、実施例２３で合成された天然品Ｐ−２に相当するペプチド（１９Ｐ２−Ｌ２０）によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキドン酸代謝物の遊離を測定した。合成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで希釈して、それぞれの濃度におけるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からのアラキドン酸代謝物の遊離を［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を指標に測定した。
その結果、１０^-12〜１０^-6Ｍで濃度依存的なアラキドン酸代謝物遊離の活性が１９Ｐ２−Ｌ３１とほぼ同程度に検出された〔図２７〕。
【０１０５】
【実施例２６】
ウシゲノムＤＮＡにおけるコード領域の塩基配列の解析
pBOV3を制限酵素EcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、cDNA断片部分のDNAを回収してプローブを調製した。これをマルチプライムＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）を用いて³²Ｐ標識した。クローニングベクターEMBL3 SP6/T7を用いて構築したBovine Genomic Library (CLONTECH社 BL1015j)の約2.0x10⁶個のファージを大腸菌K802を宿主としてＬＢ寒天培地プレートに播種し、一晩培養してプラークを形成させた。これをニトロセルロースフィルターに転写し、アルカリ変性、中和処理を行った後、熱処理（80℃、2時間)によってＤＮＡを固定化した。このフィルターを５０％ホルムアミドを含むハイブリバッファー（50％formamide、5ｘDenhardt's溶液、4ｘSSPE、0.1mg/ml Salmon sperm ＤＮＡ、0.1%SDS)中で標識プローブと４２℃で一晩インキュベーションし、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後のフィルターを室温で2ｘSSC、0.1%SDS中で１．５時間洗浄した後、さらに５５℃の同バッファー中で３０分間洗浄した。プローブとハイブリダイズするクローンの検出は、コダック社のＸ線フィルム(X-OMAT^TMAR)と増感スクリーンを用い、−８０℃で４日間の露光によって行った。Ｘ線フィルムを現像した後、フィルムとプレートの位置を対応させながらハイブリダイズしている部分のファージを回収した。さらに上記の方法によって再プレーティングとハイブリダイゼーションを繰り返して行い、ファージのクローン化を行った。
クローン化したファージをプレートライセート法によって大量に調製し、ファージＤＮＡを抽出した後、ベクターのクローニングサイトの両端に存在する制限酵素SalIおよびBamHI切断部位で切断してウシゲノムDNA由来の挿入断片の検出を１．２％アガロースゲル電気泳動によって行った〔図２８〕。その結果、BamHI消化では３本の断片がファージ由来のバンドの他に検出された。また、SalI消化ではファージ由来のバンドに重なって１本のバンドが検出された。SalI消化断片が全長を保持していると考え、この断片をプラスミドベクターにサブクローニングするために、SalI消化後にBAP(大腸菌由来のアルカリフォスフォターゼ）処理したプラスミドベクターpUC18（ファルマシア社）とライゲーション反応を行い、大腸菌JM109に導入した。この菌からゲノム由来のSalI断片が挿入されたプラスミドＤＮＡを大量に調製し、パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社の370A蛍光式シーケンサーおよび同社のキットを用いてコード領域付近の塩基配列の解析を行った。その結果、〔図２９〕に示すような配列が得られた。ｃＤＮＡのコード領域と比較すると、ゲノムＤＮＡ由来であるために472bpのイントロンによってコード領域が２つに分割されている〔図３０〕。〔図３１〕および配列番号：４４には、このウシのゲノムのコード領域（イントロン部分を除いたもの）から推定されるアミノ酸配列を示す。
【０１０６】
【実施例２７】
ラット延髄背側部poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成
ラットの延髄背側部よりIsogen（ニッポンジーン社）によりtotal ＲＮＡを調製後、FastTrack（Invitrogen社）を用いてpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次にこのpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ ５μｇにプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物はエタノール沈殿を行った後、１２μｌの蒸留水に溶解した。またこのpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ １μｇから、Marathon ｃＤＮＡ amplification kit（Clontech）により、マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、１０μｌに溶解した。
【０１０７】
【実施例２８】
ＲＡＣＥ法によるラット型生理活性ポリペプチドのｃＤＮＡの取得
ラット型生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全コード領域を取得するため、ウシ型を取得した方法に準じて実験を行った。まず実施例１８で使用したプライマーＰ５−１（配列番号：３５）、Ｐ３−１（配列番号：３６）をプライマーとし、鋳型には実施例２７でプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により合成した相補ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応液は鋳型ｃＤＮＡを１.２５μｌ、ｄＮＴＰ２００μＭ，プライマーを各１μＭ，ＤＮＡ polymeraseとしてExTaq（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌを加えて、さらに水で全量を２５μｌとした。反応は９４℃・１分後、９８℃・１０秒、５０℃・３０秒、７２℃・５秒のサイクルを４０回繰り返した後、７２℃で２０秒放置した。サーマルサイクラーはGeneAmp2400（パーキンエルマー社）を用いた。増幅産物を４％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約８０ｂｐのバンドを切り出し、実施例１９に示した方法でＤＮＡを回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニング、大腸菌ＪＭ１０９へ導入し挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析した。その結果ラット型生理活性ポリペプチドの部分配列を得ることができた。この配列を基に３' ＲＡＣＥ用にＲＡ（配列番号：７５），５' ＲＡＣＥ用にＲＣ（配列番号：７６）の２本のプライマーを合成し、５'および３' ＲＡＣＥを行った。

鋳型は実施例２７でMarathon ｃＤＮＡ amplification kit（Clontech）により合成したものを添付のトリシン−ＥＤＴＡバッファーで４０倍に希釈したもの２.５μｌを使用した。プライマーには３' ＲＡＣＥにはＲＡとキット付属のアダプタープライマーＡＰ１を、また５' ＲＡＣＥにはＲＣとＡＰ１をそれぞれ用いたほかは上記と同様に反応液を調製した。反応条件は９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・４５秒のサイクルを５回、９８℃・１０秒、７０℃・４５秒のサイクルを３回、９８℃・１０秒、６８℃・４５秒のサイクルを４０回繰り返した。その結果３' ＲＡＣＥからは約４００ｂｐ、５' ＲＡＣＥからは約４００ｂｐと２５０ｂｐのバンドが得られた。これらを上記と同様の方法で回収し、これらを鋳型として反応に用いたプライマーでDye Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ）により反応し配列を解析した。その結果５'ノンコーディング領域と推定される部分からpolyＡまでの配列を得ることができた。
【０１０８】
【実施例２９】
ＰＣＲによるラット型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡの取得
実施例２８で得られた配列を基に開始コドンを含む領域にｒＦ（配列番号：７７）、また終止コドンより３'側にｒＲ（配列番号：７８）の２本のプライマーを合成し全長ｃＤＮＡを含む断片を増幅することとした。

実施例２７でモロニーマウス白血病の逆転写酵素を用いて調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ExTaq（宝酒造）を用いて、９５℃・３０秒、６８℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返してＰＣＲを行った。増幅産物をアガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約３５０ｂｐのバンドを切り出し、実施例１９に示した方法でＤＮＡを回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニング、大腸菌ＪＭ１０９へ導入した。生じた形質転換体からプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した結果、ラット型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを保有するE. coli ＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３を得た〔図３２〕。
【０１０９】
【実施例３０】
ヒト Brain poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分からのｃＤＮＡの合成
ヒト Brain poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分（Clontech）１μｇから、Marathon ｃＤＮＡ amplification kit（Clontech）により、マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、１０μｌに溶解した。また同poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇにプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物はエタノール沈殿を行った後、３０μｌのＴＥに溶解した。
【０１１０】
【実施例３１】
ＲＡＣＥ法によるヒト型生理活性ポリペプチドのｃＤＮＡの取得
実施例２８で明らかになったラット型生理活性ポリペプチドのアミノ酸配列から〔図３３〕に示したように特にラット型とウシ型で保存性の高かった領域を選び以下のＲ１（配列番号：７９）、Ｒ３（配列番号：８０ ）、Ｒ４（配列番号：８１）の３本のプライマーを合成し、ヒトのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲをすることによりこれらに挟まれた領域の増幅を試みた。ここで、図３３においてbovine.aaはウシ型ポリペプチドのアミノ酸配列、bovine.seqはウシ型ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列、rat.seqはラット型ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。

実施例３０でMarathon ｃＤＮＡ amplification kit（Clontech）により調製したｃＤＮＡをトリシン−ＥＤＴＡバッファーで３０倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型として使用した。反応液はｄＮＴＰ２００μＭ，プライマーをＲ１とＲ４を各０.２μＭ，Taq Start Antibody（Clontech）と等量混合したＤＮＡ polymerase ExTaq（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌを加えて、さらに水で全量を２５μｌとした。反応は９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・４０秒のサイクルを４２回繰り返した後、７２℃で１分間放置した。さらにこの反応液をトリシン−ＥＤＴＡバッファーで１００倍に希釈したもの１μｌを鋳型として、プライマーの組み合わせをＲ１とＲ３に変えた以外は上記と同様の反応液を調製して９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・４０秒のサイクルを２５回繰り返した。増幅産物を４％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色したところ、期待される約１３０ｂｐのバンドが得られたため、これを実施例２８と同様の方法で回収し、その回収した断片を鋳型として、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ）を用いて反応し配列を解析した結果、ヒト型生理活性ポリペプチドの部分配列を得ることができた。そこでこの配列を基に３' ＲＡＣＥ用にプライマーＨＡ（配列番号：８２），ＨＢ（配列番号：８３）を、５' ＲＡＣＥ用にプライマーＨＥ（配列番号：８４），ＨＦ（配列番号：８５）を合成し、５'および３' ＲＡＣＥを行った。

鋳型は実施例３０で調製したものをトリシン−ＥＤＴＡバッファーで２０倍に希釈したもの２.５μｌを使用した。１回目のＰＣＲは３' ＲＡＣＥにはＨＡとアダプタープライマーＡＰ１を、５' ＲＡＣＥにはＨＥとＡＰ１を用いこれまでと同様に反応液を調製した。反応条件は９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・３５秒のサイクルを５回、９８℃・１０秒、７０℃・３５秒のサイクルを５回、９８℃・１０秒、６８℃・３５秒のサイクルを４０回繰り返した。さらにこの反応液をトリシン−ＥＤＴＡバッファーで１００倍に希釈したもの１μｌを鋳型として、１回目の反応サイクルと同じサイクルで２回目のＰＣＲを行った。ただし３' ＲＡＣＥはプライマーをＨＢとＡＰ１に、５' ＲＡＣＥはＨＦとＡＰ２に変え、またＤＮＡ polymeraseとしてKlen Taq(Clontech)を使用し、添付のバッファーで反応液を調製した。その結果、３' ＲＡＣＥでは約２５０ｂｐのバンドまた５' ＲＡＣＥでは約１５０ｂｐのバンドが得られ、これらを上記と同様の方法で配列を読み、先に得られた部分配列と併せてヒト型生理活性ポリペプチドの、５'ノンコーディング領域と推定される部分からpolyＡまでの配列を得ることができた。
【０１１１】
【実施例３２】
ＰＣＲ法によるヒト型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡの取得
実施例３１で得られた配列を基に５Ｈ（配列番号：８６）と３ＨＮ（配列番号：８７）の２本のプライマーを合成し全長ｃＤＮＡを含む断片を増幅することとした。

実施例３０でモロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）を用いて調製したｃＤＮＡ２.５μｌを鋳型とし、Klen Taq ＤＮＡ polymerase（Clontech）を用いた反応液で、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・３０秒のサイクルを４０回繰り返した。得られた約３６０ｂｐの断片を実施例２９と同様の方法で、回収、サブクローニング（ただし、ベクターはｐＣＲ^TM２.１を用いた。）、プラスミド回収し、塩基配列を決定した結果、ヒト型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを保有するE. coli ＪＭ１０９／ｐＨＯＶ７を得た〔図３４〕。またこのヒト型生理活性ポリペプチドと実施例２０に示したウシ型、および実施例２９に示したラット型の翻訳領域についてアミノ酸配列を比較した〔図３５〕。
【０１１２】
【実施例３３】
（１）ＵＨＲ−１発現ＣＨＯ細胞の作製
最近、Susan K. Welchらによってラット視交叉上核よりオーファンレセプターであるＵＨＲ−１がクローニングされている（Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.209, No.2, pp.606-613, 1995）。
本発明者らは、この報告をもとにＵＨＲ−１遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列とｈＧＲ３によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列の比較を行った。
その結果、両者は３５９アミノ酸にわたり９１.６％のアイデンティティーを有することから、ＵＨＲ−１はｐｈＧＲ３のホモログであることが推定された。ＵＨＲ−１によりコードされる蛋白が１９Ｐ２−Ｌ３１のレセプターとして機能することを確認するために以下に述べるように、本発明者らはＵＨＲ−１ ｃＤＮＡをクローニングし、それをＣＨＯ細胞に導入して安定的な発現細胞株を作製した。
ラットの下垂体前葉からＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ^TM ｋｉｔ（Invitrogen社）を用いて抽出した poly(Ａ)⁺ＲＮＡを調製した。次に、得られた poly(Ａ)⁺ＲＮＡ ０.２μgを鋳型とし、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（宝酒造）を用いて全量４０μｌの反応スケールでｃＤＮＡを合成した。反応産物は、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈澱を行った後、１０μｌの蒸留水に溶解した。既知のラット・ＵＨＲ−１ ｃＤＮＡの塩基配列(GenBank, Accession Number Ｓ７７８６７）をもとに、以下に示す２種の合成ＤＮＡプライマーを作成した。
（１）５'−ＧＴＴＣＡＣＡＧ（ＧＴＣＧＡＣ）ＡＴＧＡＣＣＴＣＡＣ−３'
（括弧内はＳａｌＩ認識配列を示す） （配列番号：９５）
（２）５’−ＣＴＣＡＧＡ（ＧＣＴＡＧＣ）ＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＣＡＧ−３’
（括弧内はＮｈｅＩ認識配列を示す） （配列番号：９６）
上記のプライマー（１）と（２）を一組として用いて、上述の方法で合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応には、調製したｃＤＮＡ溶液を５倍に希釈したものを５μｌ、Ex Taq（宝酒造）とTaq Start Antibody（クロンテック）を１：１で混合したものを１μｌ、Ex Taqに添付の１０×反応バッファーを５μｌおよびｄＮＴＰを４μｌ、５０μＭの濃度に調製したプライマーを各１μｌ使用し、蒸留水にて液量を５０μｌに調製した。
ＰＣＲは、９５℃・２分ののち、９５℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃・１分の３ステップを１サイクルとして２７回繰り返して行い、その後に７２℃・７分の伸長反応を加えた。反応終了後に、反応液の一部を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。エチジウムブロマイド染色し約１.１ｋｂｐのバンドを切り出し、遠心濾過チューブ（ミリポア社）で遠心濾過し、フェノール抽出次いでエタノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキット（Invitrogen社）のマニュアルに従い、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニングし（以下、ｐＣＲII−ＵＨＲ−１と称する）、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、自動プラスミド抽出器（クラボウ社）でプラスミドを得た。
このプラスミドをABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing kit，FS（パーキンエルマー社）を用い、マニュアルに従い反応させ、塩基配列を蛍光自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）により解読した。
塩基配列の解析の結果、ＰＣＲによって入手したｃＤＮＡ断片は１１１６ｂｐから成ることが確認された〔図５２〕。〔図５２〕は、発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１上で構築されたラット・ＵＨＲ−１の完全なコード領域の塩基配列と、それにコードされるアミノ酸配列を示す。図中、アンダーラインを付したprimer(1),(2)は、それぞれのプライマー配列の一部に相当する部分を示す。また、二重線は公知の塩基配列と異なる部分を示す（６６４番目のＣ、８６５番目のＧ、８９７番目のＧ）。ここで、公知の塩基配列はデータバンクGenBank Accession No. Ｓ７７８６７を引用したものである。
これらの塩基置換のうち、一つは²⁸⁹Ｌｅｕ（ＣＴＣ）→²⁸⁹Ｖａｌ（ＧＴＣ）のアミノ酸置換を伴うものであった。ＵＨＲ−１発現ベクターの構築は以下の様にして行った。
ｐＣＲII−ＵＨＲ−１を制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）およびＳａｌＩ（宝酒造）で切断した。切断したサンプルをアガロースゲル電気泳動した後エチジウムブロマイド染色し、そのバンド部分をカミソリで切り出した。このゲル断片をフィルター付き遠心チューブ（ミリポア）に入れ、冷凍庫内で凍結、その後に室温にて融解させた後、チューブを８０００回転で１分間遠心して、フィルターの下部にＤＮＡ断片を含む溶液を溶出させた。この溶液を、定法に従ってフェノール抽出、フェノール・クロロホルム（１：１）抽出、ジエチルエーテル抽出して不純物を除去した後、エタノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させｃＤＮＡ断片を得た。
ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）およびＳａｌＩ（宝酒造）で切断した後、上述と同様の方法によりベクター部分をアガロースゲルから分離、抽出した。こうして得られたｃＤＮＡ断片とｐＡＫＫＯ−１１１Ｈの制限酵素消化物をライゲーション・システム（宝酒造）を用い、１６℃で３０分反応させた。ライゲーション反応産物の一部を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、形質転換体Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１を得た。得られた形質転換体Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１をアンピシリン（５０μg/ml）を含むＬＢ培地２ml中で一晩培養し、プラスミド自動抽出装置（クラボウ社）によってプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１）を調製した。蛍光式シーケンサーを用いて、ｃＤＮＡ断片とｐＡＫＫＯ−１１１Ｈの連結部位の塩基配列を解析し、発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１の構築が完了したことを確認した。
（２）ＣＨＯｄｈｆｒ^-細胞へのＵＨＲ−１発現ベクターの導入
直径１０cmの組織培養用シャーレに１×１０⁶個のＣＨＯｄｈｆｒ^-細胞を播種し、２４時間培養した。（１）で得られたＵＨＲ−１発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１を２０μｇ用い、リポソーム法による遺伝子導入キット（ジーントランスファー、ニッポンジーン社）を用いて、ＤＮＡ・リポソームの複合体を形成させた。培地を新鮮なものに交換し、これにＤＮＡ・リポソームの複合体を添加して一晩インキュベートした。培地を新鮮なものと交換してさらに１日間培養した後、形質転換体選択用の培地に交換して２日間培養した。さらに、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によってシャーレ内の細胞を回収し、細胞密度が希薄な状態にて再培養を行うことによって、形質転換体の割合の増加を図った。これにより、ＵＨＲ−１を安定に高発現する細胞株ＣＨＯ−ＵＨＲ−１のクローンを得た。
【０１１３】
【実施例３４】
１９Ｐ２−Ｌ３１の¹²⁵Ｉによる標識および標識体を用いたレセプター結合実験
１９Ｐ２−Ｌ３１のヨードラベル化は〔¹²⁵Ｉ〕−Bolton−Hunter Reagent（NEN/DuPont；NEX-120）を用いて行った。まず、〔¹²⁵Ｉ〕−Bolton−Hunter Reagent（２２００Ci/mmol）２００μlを５００μlエッペンドルフチューブに移し、窒素ガスにて完全に乾燥させた。アセトニトリル２μlにて再溶解し、さらに５０mMリン酸バッファーｐＨ８.０ ４μl、合成１９Ｐ２−Ｌ３１ ３×１０^-4Ｍ ４μlを加え、混和し、室温にて４０分間反応させた。反応後、１.０Ｍグリシン５μlを加えて反応を停止し、反応液全量を逆相カラム（TOSO；TSKgel ODS−80TMCTP）にかけ、〔¹²⁵Ｉ〕標識１９Ｐ２−Ｌ３１（〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１）を分離した。〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１を含む画分は、２倍量の５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、０.１％ＢＳＡ、０.０５％ＣＨＡＰＳにて希釈し、少量ずつ分注の後、−２０℃にて保存した。
レセプター結合実験ではレセプター発現ＣＨＯ細胞としてＣＨＯ−１９Ｐ２−９、ＣＨＯ−ＵＨＲ−１およびｍｏｃｋ ＣＨＯを用いた。ＣＨＯ−１９Ｐ２−９細胞はＣＨＯ−１９Ｐ２細胞を９６穴マイクロプレートを用いた限界希釈法により、１９Ｐ２−Ｌ３１によるアラキドン酸代謝物の遊離促進反応がより強いクローンとして選択したものである。ｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞は、発現ベクターｐＡＫＫＯ単独でトランスフォームしたコントロール細胞である。組織培養用フラスコで培養したこれらの細胞を５mM ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて剥離し、０.０５％ＢＳＡ、０.０５％ＣＨＡＰＳを含むＨＢＳＳに０.５×１０⁷cells/mlとなるよう再懸濁した。この細胞浮遊液１００μlに、〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１を２００pMとなるように、さらに一部の細胞浮遊液にはＮＳＢ（non specific binding；非特異的結合）として１９Ｐ２−Ｌ３１を２００nMとなるように追加し、室温にて２.５時間反応させた。反応後、ガラスフィルターＧＦ／Ｆ（Wattman）を用いて、Ｂ／Ｆ分離を行い、フィルターにトラップされたカウントをレセプター結合量としてγ−カウンターにて測定した。
〔図３６〕には、生細胞における〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１を用いたレセプター結合実験の結果を示す。
細胞浮遊液０.５×１０⁷cells/ml １００μlに〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１を２００pMとなるように加え、室温２.５時間の反応でレセプターに結合した〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１の量および非特異的結合量をγ−カウンターで測定した。実験はtriplicateで行い、その平均値および標準偏差を示した。
ｈＧＲ３とＵＨＲ−１を発現させたＣＨＯ細胞において、〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１の特異的結合が観察された。これらの結果はｈＧＲ３およびＵＨＲ−１によってコードされる蛋白質が１９Ｐ２−Ｌ３１の特異的なレセプターとして機能していることを示している。
【０１１４】
【実施例３５】
１９Ｐ２−Ｌ３１によるＣＨＯ−１９Ｐ２−９およびＣＨＯ−ＵＨＲ１からの特異的なアラキドン酸代謝物の遊離促進
実施例１１と同様の方法でＣＨＯ−１９Ｐ２−９、ＣＨＯ−ＵＨＲ１およびｍｏｃｋ ＣＨＯにおける１９Ｐ２−Ｌ３１によるアラキドン酸代謝物遊離活性を測定した。
〔図３７〕にはＣＨＯ−１９Ｐ２−９およびＣＨＯ−ＵＨＲ１における１９Ｐ２−Ｌ３１によるアラキドン酸代謝物遊離活性の測定結果を示す。実験はduplicateで行い、その平均値を示した。
ＵＨＲ１を発現させたＣＨＯ細胞でも、ＣＨＯ−１９Ｐ２−９と同様の１９Ｐ２−Ｌ３１によるアラキドン酸代謝物遊離の活性が確認された。これらの結果はＵＨＲ−１によってコードされる蛋白質がｈＧＲ３と同様に１９Ｐ２−Ｌ３１の特異的なレセプターとして機能していることを示している。
【０１１５】
【実施例３６】
ＲＴ−ＰＣＲによるラット組織のリガンドポリペプチドおよびラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＵＨＲ−１）の発現定量
（１）ラットの組織からの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ調製
８週齢のラット（♂）より各種組織の poly(Ａ)⁺ＲＮＡを、Ｉｓｏｇｅｎ（Nippon gene）による total ＲＮＡ調製に引き続き、オリゴｄＴセルロースカラム（Pharmacia）を用いて約５〜３０μg調製した。
poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分中の genome ＤＮＡを完全に除くため、ＤＮａｓｅＩ（Gibco BRL. amplification grade）を１ユニット用いて室温でＤＮＡを分解した。２５mM ＥＤＴＡを加え、６５℃で１０分処理し、ＤＮａｓｅＩを不活性化した。水で４０ng/μlに希釈し、その１６０ngから１０ユニットＡＭＶ reverse transcriptase XL（Takara），２．５μＭ ｒａｎｄｏｍ ９ｍｅｒ（Takara、終濃度２.５μＭ），１０ｍＭ Tris-HCl（pH 8.3），０．４ｍＭの各ｄＮＴＰを用いてｃＤＮＡを合成した。合成反応は３０℃・１０分の後、４２℃・３０分、９９℃・５分、５℃・５分とした。反応産物をエタノール沈殿しトリシン−ＥＤＴＡバッファーで４０μlに溶解した（４ng poly(Ａ)⁺ＲＮＡ/μl）。
（２）ポジティブコントロール用プラスミドベクターの調製
ラットのグリセロールアルデヒド−３−リン酸−脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ，GenBank accession number Ｍ１７７０１）は、ＦａｓｔＴｒａｃｋ（Invitrogen）で調製したラット下垂体由来細胞株ＧＨ３の poly(Ａ)⁺ＲＮＡから、上記（１）と同様の方法で合成したｃＤＮＡを鋳型として、Clontech社のＧ３ＰＤＨ増幅用プライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅させた。ＵＨＲ−１はやはりＧＨ３のｃＤＮＡを鋳型として、

を用いて増幅し、ＴＡクローニングキット(Invitrogen)のｐＣＲ^TM２.１ベクターへサブクローニングして得た。これらを大腸菌ＪＭ１０９に導入して形質転換体を得た。またリガンドペプチドはＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３として寄託したものを用いた。これらの形質転換体はアンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（QIAGEN）でプラスミドを精製し、吸光度により濃度を定量してポジティブコントロール用プラスミドベクターとした。
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
上記（１）および（２）で調製したｃＤＮＡ溶液およびポジティブコントロール用プラスミドベクターをそのままあるいは適当な濃度に水で希釈して鋳型とした。Ｇ３ＰＤＨ，ＵＨＲ−１およびリガンドペプチド増幅用プライマーは、それぞれClontech社のＧ３ＰＤＨ増幅用プライマーセット、ｒＲＥＣＦとｒＲＥＣＲ、

を終濃度２００nMで使用した。反応液は希釈した鋳型４μｌ、各２００ｎＭプライマー、ｄＮＴＰ（終濃度各１００μＭ）、ＤＮＡ polymeraseとしてＫｌｅｎＴａｑ（Clontech）を用い、KlenTaq添付のバッファーと水で２５μlとした。反応はＧ３ＰＤＨは９４℃・１分の後、９８℃・１０秒、６５℃・２０秒、７２℃・４０秒のサイクルを２６回、ＵＨＲ−１とリガンドペプチドは９４℃・１分の後、９８℃・１０秒、６８℃・２５秒のサイクルを３４回繰り返した。増幅産物をあらかじめエチジウムブロマイド染色した１.２％あるいは４％のアガロースゲルを用いて電気泳動し、得られた泳動図をＣＣＤカメラ（FOTODYNE，Foto/Ecrips）で取り込み、解析ソフト（Advanced American Biotechnology）でバンドの濃さを数値化、定量した。定量値はＧ３ＰＤＨは４ng poly(Ａ)⁺ＲＮＡあたりのpgで、またＵＨＲ−１とリガンドペプチドは４ng poly(Ａ)⁺ＲＮＡあたりのpgおよびその値をＧ３ＰＤＨのpgで割った値として算出した〔図３８、３９〕。
その結果、ＵＨＲ−１とリガンドペプチドは調べた組織全てで発現が確認された。ＵＨＲ−１は下垂体で発現量が多く、脳全体にも広く分布していたが、末梢の組織では副腎を除いて発現はあまり高くなかった。一方、リガンドペプチドは、脳では延髄、視床下部で発現が高く、下垂体での発現は低かった。末梢組織においても肺、胸腺、膵臓、腎臓、副腎、精巣などで比較的高い発現が認められた。これらの結果はＵＨＲ−１とそのリガンドペプチドが様々な組織においてその機能調節に重要な役割を果たしていることを示している。
【０１１６】
【実施例３７】
１９Ｐ２−Ｌ３１のグルコースによる血漿インスリン濃度の増加に及ぼす影響
ペントバルビタール（６５mg/kg、腹腔内投与）で麻酔したWistarラット（８−１０週齢 ♂）に総頸静脈から一過性にグルコース（８６mg/ラット）を単独で、あるいは同グルコースと１９Ｐ２−Ｌ３１（ラットあたり各６７５pmol、２.２５nmol、６.７５nmol、６７.５nmol）を同時投与し、投与した反対側の総頸静脈から経時的に採血し血漿中のインスリン濃度をラジオイムノアッセイで測定した。測定にはアマシャム社のインスリンアッセイキットを使用した。
１９Ｐ２−Ｌ３１は投与量６７５pmol、２.２５nmol、６.７５nmolでは、グルコースによる投与２分後の急激な第一相目のインスリン濃度の増加、および投与後６分以降に見られる緩徐な第二相目の血漿インスリン濃度の増加を部分的に抑制した。６７.５nmolの１９Ｐ２−Ｌ３１は第一相と第二相両方のインスリン濃度の増加を完全に抑制した〔図４０〕。
【０１１７】
【実施例３８】
マウスの行動量に及ぼすリガンドポリペプチドの影響
本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１、１９Ｐ２−Ｌ２０のマウス側脳室内投与が行動量に及ぼす影響を検討した。成熟ＩＣＲ系雄性マウス（手術時体重：約３５ｇ）をペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、脳定位固定装置に固定した。頭蓋骨を露出し、一側脳室にガイドカニューレを埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。側脳室内薬液注入用のステンレス製ガイドカニューレ（２４Ｇ、長さ５mm）の先端をＡＰ：＋０.６mm（ブレグマより）、Ｌ：左１mm、Ｈ：−１mm（硬膜より）の位置に挿入した。ガイドカニューレは頭蓋骨に接着剤で固定した。術後、マウスは３日以上飼育して術後の回復を待ってから行動解析実験を行った。
マウスの自発運動量の測定には、防音箱内の２４×３７×３０cmの透明アクリル製の自発運動測定用ケージを用いた。マウスを該ケージに一匹ずつ入れ、１２時間毎の明暗条件（明：６−１８時）で、また、水と餌は自由に摂取できる条件下で自発運動量と立ち上がり行動量をそれぞれ測定した。行動量の測定には、Ｓｕｐｅｒｍｅｘ（室町機械）を用いた。薬物あるいはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は午後２：３０±３０分に投与した。投与時には、ステンレス製マイクロインジェクションカニューレ（３０Ｇ、長さ６mm）をガイドカニューレに挿入した。マイクロインジェクションカニューレは、テフロンチューブを用いてマイクロシリンジポンプにつなぎ、ＰＢＳあるいはペプチドを溶解したＰＢＳを流速２μl/分で２分間注入した。注入後は、２分間以上待ってからマイクロインジェクションカニューレを外し、行動量を測定した。
結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表し、これらペプチド処置とＰＢＳ処置とが体温に及ぼす影響に有意差があるか否かの検定は Student's t-testによって行った。判定は、両側検定で危険率（ｐ）が５％以下を統計的に有意であるとした。〔図４１〕に示すごとく、１９Ｐ２−Ｌ３１を１０nmol投与した場合、マウスの自発運動量は投与後７０分後から１０５分後まで、有意に増加した。立ち上がり行動も同様に有意な変化を示した。１９Ｐ２−Ｌ３１を１nmol投与した場合、自発運動量には変化が認められず、立ち上がり行動量が投与１０５分後で有意な低下を示したのみであった〔図４２〕。１９Ｐ２−Ｌ３１を０.１nmol投与した場合、自発運動量は、投与後２５分および４０分、７０分において有意な増加を示した。立ち上がり行動量にも同様の増加傾向は認められたが有意ではなかった〔図４３〕。また、１９Ｐ２−Ｌ３１を０.０１nmol投与した場合、自発運動量は、投与後２０分および４０分で有意に増加した。立ち上がり行動も同じように増加傾向を示したが有意な変化は認められなかった〔図４４〕。
【０１１８】
【実施例３９】
マウスのレセルピン誘発低体温に及ぼすリガンドポリペプチドの影響
成熟ＩＣＲ系雄性マウス（手術時体重：約３５ｇ）をペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、脳定位固定装置に固定した。頭蓋骨を露出し、一側脳室にガイドカニューレを埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。側脳室内薬液注入用のステンレス製ガイドカニューレ（２４Ｇ、長さ５mm）の先端をＡＰ：＋０.６mm（ブレグマより）、Ｌ：左１mm、Ｈ：−１mm（硬膜より）の位置に挿入した。ガイドカニューレは頭蓋骨に接着剤で固定した。術後、マウスは３日以上飼育して術後の回復を待ってから体温測定を行った。レセルピン（アポプロン注１mg、第一製薬）３mg/kgを皮下注射し、その１５時間後にマウスを個別の測定用ケージに移した。ステンレス製マイクロインジェクションカニューレ（３０Ｇ、長さ６mm）をガイドカニューレに挿入した。マイクロインジェクションカニューレは、テフロンチューブを用いてマイクロシリンジポンプにつなぎ、ＰＢＳあるいはペプチドを溶解したＰＢＳを流速２μl/分で２分間注入した。注入後は、２分間以上待ってからマイクロインジェクションカニューレを外し、直腸温を測定した。
結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表し、これらペプチド処置とＰＢＳ処置とが体温に及ぼす影響に有意差があるか否かの検定は Student's t-testによって行った。判定は、両側検定で危険率（ｐ）が５％以下を統計的に有意であるとした。〔図４５〕に示すように、１９Ｐ２−Ｌ３１を１０nmol投与した場合、レセルピンによって低下していた体温はＰＢＳを投与した対照群に比し有意に上昇した。この体温の上昇は、１９Ｐ２−Ｌ３１投与後４５分でピークに達した。一方、１nmolの１９Ｐ２−Ｌ２０投与群と対照群との間には差が認められなかった。
【０１１９】
【実施例４０】
リガンドポリペプチドがラットの血圧に及ぼす影響
本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１の延髄最後野への注入が血圧に及ぼす影響を検討した。成熟Wistar系雄性ラット（手術時体重：約３００ｇ）をペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインから３.３mm低くした。頭蓋骨を露出し、ガイドカニューレを埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲の２ケ所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−１２（内径０.４mm、外径０.５mm、エイコム社）を、その先端が最後野の上部に位置するように挿入した。そのために、ガイドカニューレは垂直方向から２０度の角度をつけて前方より挿入した（〔図４６〕、但し図中にはガイドカニューレより１.０mm長いマイクロインジェクションカニューレを示す）。定位座標は、PaxinosとWatson（1986）のアトラスを参考にしてＡＰ：−０.６mm（インターオーラルラインより）、Ｌ：０.０mm、Ｈ：＋１.５mm（インターオーラルラインより）とした。ガイドカニューレは瞬間接着剤と歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニューレ、ＡＤ−１２（外径０.３５mm、エイコム社）を挿入し、キャップナット（エイコム社）で固定した。その後、ラットは個別のケージで飼育した。
ガイドカニューレを埋め込んでから約１週間飼育して術後の回復を待ち、無麻酔血圧測定用の手術を行った。ラットをペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、解剖用パッドの上に背位に固定して左側の大腿動脈を露出させた。ポリエチレンチューブＳＰ３５（内径０.５mm、外径０.９mm、夏目製作所）を約６０cmの長さに切り、２００単位/mlヘパリン含有生理食塩水で満たした後、大腿動脈に約２.５cm挿入し固定した。チューブのもう一端は背側の皮下を通して頸部（背側）より露出させた。
術後一晩待ってからポリエチレンチューブをトランスデューサー（Spectramed）に接続し、血圧を測定した。安定した血圧が測定可能になった後、ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを取り外し、代わりにテフロンチューブ（長さ５０cm、内径０.１mm、外径０.４mm、エイコム社）につなげたステンレス製マイクロインジェクションカニューレ、AMI13（内径０.１７mm、外径０.３５mm、エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端１mmがガイドカニューレから露出するように調節しておいた〔図４６〕。テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、ＰＢＳまたは１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳを１.０μl/分の流速で計２μｌを最後野に注入した。
血圧測定後、１９Ｐ−Ｌ３１を注入したマイクロインジェクションカニューレを外し、色素（エバンスブルー）注入用マイクロインジェクションカニューレに替えた。色素は、１９Ｐ−Ｌ３１と同様に流速１.０μl/分で２分間注入した後約３分間待ってからマイクロインジェクションカニューレを外した。ラットを断頭し、速やかに脳を摘出し、凍結した。クリオスタットを用いて凍結切片を作製し、色素の注入位置を確認した。
上記実験の結果、延髄最後野に１９Ｐ２−Ｌ３１を１０nmol注入すると血圧の上昇が認められた。脈波および平均血圧の典型例を〔図４７〕に示す。
【０１２０】
【実施例４１】
リガンドポリペプチドが血漿中下垂体ホルモン量に及ぼす影響
本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１の第三脳室内投与が血漿中の下垂体ホルモン量に及ぼす影響を検討した。成熟Wistar系雄性ラット（手術時体重：約２９０〜３５０ｇ）をペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインから３.３mm低くした。頭蓋骨を露出し、ガイドカニューレを埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲の一ケ所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−１２（内径０.４mm、外径０.５mm、エイコム社）を、その先端が第三脳室の上部に位置するように挿入した。定位座標は、PaxinosとWatson（1986）のアトラスに従い、ＡＰ：＋７.２mm（インターオーラルラインより）、Ｌ：０.０mm、Ｈ：＋２.０mm（インターオーラルラインより）とした。ガイドカニューレは瞬間接着剤と歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニューレ、ＡＤ−１２（外径０.３５mm、エイコム社）を挿入し、キャップナット（エイコム社）で固定した。術後、ラットを個別のケージで３日以上飼育し、術後の回復を待ってから、実験を行った。
上記手術を施したラットをペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、解剖用パッドの上に背位に固定した。両側の頸静脈を露出させた後、容量１mlのツベルクリン用注射筒と２４Ｇ注射針（いずれもテルモ社）を用いて４００μｌの血液を採取した。血液凝固を防止するため、注射筒には予め２００単位/mlのヘパリンを含有する生理食塩水を２０μl入れておいた。ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを取り外し、代わりにテフロンチューブ（長さ５０cm、内径０.１mm、外径０.４mm、エイコム社）につなげたステンレス製マイクロインジェクションカニューレ、AMI13（内径０.１７mm、外径０.３５mm、エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端１mmがガイドカニューレから露出するように調節しておいた。テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、ＰＢＳまたは１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳを２.５μl/分の流速で計１０μｌを第三脳室に注入した。注入終了後１分間待ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキャップナットで固定した。脳室内投与を開始する直前、および脳室内投与の開始時点から１０、２０、３０、４０、６０分後に頸静脈より４００μlずつ採血した。採取した血液は微量高速冷却遠心機（MR-150，トミー精工）を用いて遠心（５,０００rpm、１０分間）し、上清（血漿）を回収した。血漿中に含まれる下垂体ホルモン（プロラクチン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、成長ホルモン（ＧＨ））量をそれぞれラジオイムノアッセイを用いて測定した。
結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表した。１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳ投与群とＰＢＳのみを投与した対照群との間に有意差があるか否かの検定には Student's t-testを用いた。判定は、両側検定で危険率５％以下を統計的に有意であるとした。〔図４８〕に示すごとく、血漿中成長ホルモン量は、５０nmolの１９Ｐ２−Ｌ３１を第三脳室に投与後２０分において対照群に比し有意に減少した。投与後１０、３０、４０分においても減少傾向は認められたが、有意ではなかった。また、投与６０分後では対照群との間に差は認められなかった。また、血漿中プロラクチン、ＬＨ、ＡＣＴＨ、ＴＳＨ量は有意な変化を示さなかった。
【０１２１】
【実施例４２】
リガンドポリペプチドが自由行動下ラットにおける血漿中成長ホルモン量に及ぼす影響
成熟Wistar系雄性ラットをペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、実施例４１と同様にステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−１２（内径０.４mm、外径０.５mm、エイコム社）を、その先端が第三脳室の上部に位置するように固定した。術後、ラットを個別のケージで３日以上飼育し、術後の回復を待ってからペントバルビタール麻酔下（５０mg/kg、i.p.）でヘパリン（２００単位/ml）含有生理食塩水を満たしたカニューレ（長さ３０cm、内径０.５mm、外径０.９mm、夏目製作所）を右頸静脈より右心房に挿入した。ラットを一晩飼育して完全に麻酔から覚醒させた後、透明アクリル製ケージ（３０×３０×３５cm）に移した。容量１mlのツベルクリン用注射筒と２４Ｇ注射針（いずれもテルモ社）を心房に挿入したカニューレに接続し、３００μｌの血液を採取した。血液凝固を防止するため、注射筒には予め２００単位/mlのヘパリンを含有する生理食塩水を２０μl入れておいた。第三脳室に挿入したガイドカニューレにテフロンチューブ（長さ５０cm、内径０.１mm、外径０.４mm、エイコム社）につなげたステンレス製マイクロインジェクションカニューレ、AMI13（内径０.１７mm、外径０.３５mm、エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端１mmがガイドカニューレから露出するように調節しておいた。テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、ＰＢＳまたは１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳを２.５μl/分の流速で計１０μｌを第三脳室に注入した。第三脳室内投与開始１０分後に心房に挿入したカニューレを通して生理食塩水に溶解させた成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）を５μg/kg投与した。脳室内投与を開始する直前、およびＧＨＲＨ投与時点から１０、２０、３０、４０、６０分後に頸静脈より３００μlずつ採血した。採取した血液は遠心（５,０００rpm、１０分間）し、上清（血漿）を回収した。血漿中に含まれる成長ホルモン（ＧＨ）量はラジオイムノアッセイを用いて測定した。
結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表した。１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳ投与群とＰＢＳのみを投与した対照群との間に有意差があるか否かの検定には Student's t-testを用いた。判定は、両側検定で危険率５％以下を統計的に有意であるとした。〔図４９〕に示すごとく、５μg/kgのＧＨＲＨ投与は血漿中ＧＨ量を増加させた。しかし、５０nmolの１９Ｐ２−Ｌ３１を第三脳室に投与するとＧＨＲＨによる血漿中ＧＨ量の増加は有意に抑制された。
【０１２２】
【実施例４３】
ウサギポリクローナル抗体の作製
ウシ１９Ｐ２−Ｌ３１のＮ末端側ペプチド［ペプチド−I、SRAHQHSMEIRTPDC（配列番号：９２）］、ｃ末端側ペプチド［ペプチド−II、CAWYAGRGIRPVGRFNH₂（配列番号：９３）］および中央部分のペプチド［ペプチド-III、CEIRTPDINPAWYAG（配列番号：９４）］を化学合成し、常法通りKLHと結合した。フロインドの完全アジュバント(FCA)と生理食塩水に溶解した上記ペプチド６００μｇを混合し、均一なエマルジョンにした後、それぞれ３羽ずつのウサギ(NZW、♂、２．５ｋｇ）の背部に皮下注射した。さらに３週間後追加免疫として、フロインドの不完全アジュバント(FIA)と生理食塩水に溶解した上記のペプチドとKLHのコンジュゲイトを混合し、均一なエマルジョンにした後ウサギ背部に皮下注射した。３週間間隔で計３回追加免疫を行った。
抗体価の測定は以下のように行った。最終免疫の２週間後、ウサギ耳の静脈から採血し、血液を３７℃で１時間保温後、４℃で１昼夜放置したのち遠心し、抗血清を得た。抗血清を各濃度に希釈し、予め、ヤギ抗ウサギIgG(Fc)抗体を固定したポリスチレン性９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ加え、４℃で１６時間インキュベートした。抗血清を除去し、洗浄後、HRP標識ペプチド−I、II、IIIを添加した。室温で４時間インキュベートし、十分にウエルを洗浄した後、反応基質を加え、呈色反応を行った。酵素反応停止溶液１００μｌを加えて反応を停止させた後、マイクロプレート用比色計を用い４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。〔図５０〕に示すように免疫後の血清中に各ペプチドに対する結合活性が検出された。
抗体は以下のようにして調製した。抗血清は硫安塩析によりIgG画分を濃縮し、ホウ酸バッファーに溶解後、透析した。抗ペプチド−IのIgG画分をペプチド−Iセルロファインカラムに、さらに抗ペプチド−IIおよび抗ペプチド−IIIのIgG画分を１９Ｐ２−Ｌ３１−セファロ−ズ４Ｂカラムに負荷し、ホウ酸バッファーおよび酢酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ４．５）で洗浄後、グリシン塩酸バッファー（２００ｍＭ、ｐＨ２．０）でそれぞれ溶出した。溶出液には１Ｍのトリスを加えて中和した後、精製抗体として使用した。
【０１２３】
【実施例４４】
ウサギポリクローナル抗１９Ｐ２−Ｌ３１抗体による１９Ｐ２−Ｌ３１の生物活性の中和作用
実施例４３の方法で調製した３種類のIgG抗体の１９Ｐ２−Ｌ３１に対する中和活性を実施例１１記載のアラキドン酸代謝物放出活性測定系により検討した。すなわち、IgG抗体を各濃度に希釈し、１９Ｐ２−Ｌ３１（５ｘ１０^-10Ｍ）と室温で１時間インキュベーション後、残存活性を１９Ｐ２レセプター発現ＣＨＯ細胞を使用して測定した〔図５１〕。ペプチド−IIに対するポリクローナル抗体に最も強い１９Ｐ２−Ｌ３１に対する中和活性が認められた。
【０１２４】
【製剤例１】
日局注射用蒸留水５０ｍｌに実施例２１で得られた化合物５０ｍｇを溶解した後、日局注射用蒸留水を加えて１００ｍｌとする。この溶液を滅菌条件下で瀘過し、次にこの溶液１ｍｌずつを取り滅菌条件下注射用バイアルに充填し凍結乾燥し密閉する。
【製剤例２】
日局注射用蒸留水５０ｍｌに実施例２１で得られた化合物１００ｍｇを溶解した後、日局注射用蒸留水を加えて１００ｍｌとする。この溶液を滅菌条件下で瀘過し、次にこの溶液１ｍｌずつを取り滅菌条件下注射用バイアルに充填し凍結乾燥し密閉する。
【０１２５】
【発明の効果】
本発明の生理活性物質であるリガンドポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩、該部分ペプチドまたは該リガンドポリペプチドをコードするＤＮＡは、下垂体、中枢神経系あるいは膵臓をはじめ様々な組織・臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓、胸腺、腎臓、副腎、骨格筋、精巣など）の機能調節作用を有し、医薬として有用である。また、該リガンドポリペプチドは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニスト化合物のスクリーニングに有用である。該スクリーニングにより得られる化合物もまた上記した組織・臓器の機能調節作用を有し、医薬として有用である。
本発明のリガンドポリペプチド、該アゴニストまたはアンタゴニストの作用について以下に詳細に説明する。
上記の実施例３７〜４１は、リガンドポリペプチドの局所投与により、自発運動量、立ち上がり行動量の増加、体温の上昇、血圧上昇、血漿中成長ホルモン量の低下などを引き起こすことを証明したものである。これらの生理活性は、リガンドポリペプチドが中枢神経系および下垂体内分泌系に作用した場合に生じる種々の顕著な生理学的変化を最初に証明したものである。
このように、本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩は、ヒトあるいは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の中枢神経系に作用し、種々の薬理学的変化を惹起するので、脳内神経系あるいは内分泌系を変化させるものである。
１９Ｐ２−Ｌ３１をマウスに側脳室内投与したところ、０.０１〜１０nmolで行動量が増加した。この事実は、リガンドポリペプチドが中枢神経系のＧ蛋白質共役型レセプターを介して運動系の変化を引き起こさせたものである。また、本ペプチドのマウス側脳室内投与では体温上昇が認められ、ラットの延髄最後野に投与した場合には血圧が上昇した。これらの作用は既知の中枢神経系刺激剤（例えば、アンフェタミン、コカイン、メチルフェニデートなど）の薬理作用と類似している。したがって、リガンドポリペプチドは、主として生体アミン（ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン）を神経終末の貯蔵部位から放出させるものであることがわかる（融道男と吉川武男 生体の科学 42：535-536；1991）。
さらに、ラットの第三脳室に１９Ｐ２−Ｌ３１を注入したところ、血漿中の成長ホルモン量が減少した。このことは、本リガンドポリペプチドが視床下部に作用し、視床下部−下垂体系を介した下垂体ホルモン分泌に関与していることを示すものである。第三脳室近傍には下垂体からの成長ホルモン分泌を調節する作用を有する成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）やソマトスタチンが存在する（遠山正弥ら 化学的神経機能解剖学：167-216；1987）。したがって、１９Ｐ２−Ｌ３１は神経系を介してあるいは直接下垂体に作用して、これらの物質の放出を調節しているものである。
上記の事実は、リガンドポリペプチドが中枢神経系に作用して自律神経系を調節しているペプチドであることを示すものである。本リガンドポリペプチドおよびその受容体のｍＲＮＡが視床下部や延髄に高発現しているという事実も、リガンドポリペプチドが自律神経系の調節に関与していることを示す。事実、自律神経末梢路に対する上位中枢は延髄と視床下部であり、ここで交感神経系と副交感神経系の統合が行われ、神経性調節、体液性調節の両方に重要な役割を果たしていることが知られている。
これらの知見に基づけば、リガンドポリペプチド、該アゴニストまたはそれらの塩は、自発運動亢進を生ずる中枢神経系刺激剤として有用であり、例えば老人性痴呆、脳血管性痴呆（脳血管障害に起因する痴呆）、系統変性型の退行変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウィルス感染症）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例えば、甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例えば、脳腫瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例えば、慢性硬膜下血腫など）に起因する痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群もしくは意識障害の予防・治療剤などとして用いることができる。一方、リガンドポリペプチドのアンタゴニストあるいはその塩は、中枢神経系抑制剤などとして有用であり、例えば抗精神病剤、抗ハンチントン病剤、抗不安剤、催眠鎮静剤などとして用いることができる。
延髄最後野にリガンドポリペプチドを注入すると血圧が上昇することが明らかになった。したがって、リガンドポリペプチド、リガンドポリペプチドのアゴニストまたはそれらの塩は、昇圧剤などとして有用である。一方、リガンドポリペプチドのアンタゴニストあるいはその塩は、降圧剤などとして有用である。
リガンドポリペプチドが視床下部に作用すると血漿中の成長ホルモン量が低下することが観察された。成長ホルモンの過剰な分泌は巨人症や末端肥大症を引き起こす（片桝ら 内分泌症候群：78-80；1993、廣井ら 内分泌症候群：149-151；1993）。したがって、成長ホルモンの分泌を抑制するリガンドポリペプチド、リガンドポリペプチドのアゴニストまたはそれらの塩は、巨人症、末端肥大症などの予防・治療剤などとして用いることができる。また、成長ホルモンは肝臓からのグルコースの放出を促進し、筋肉や脂肪組織による血中からのグルコースの取り込みを抑制する結果、高血糖や糖尿を引き起こす（小林英司 内分泌現象、1980）。実際、糖尿病患者では成長ホルモン分泌量が増加しているといわれている（清野裕 内分泌・代謝病学：385-402；1994）。したがって、リガンドポリペプチド、リガンドポリペプチドのアゴニストまたはそれらの塩は、糖尿病などの予防・治療剤などとして用いることができる。
一方、上記実施例で得られた結果から、リガンドポリペプチドのアンタゴニストは成長ホルモンの分泌を促進する。したがって、リガンドポリペプチドのアンタゴニストまたはその塩は、成長ホルモンが減少する下垂体機能低下症や下垂体性小人症、低血糖症などの予防・治療剤などとして用いることができる。また、成長ホルモンや成長ホルモンによって分泌されるインスリン様成長因子は筋委縮性側索硬化症、骨粗鬆症、腎不全、手術後の栄養状態改善などに効果がある（鎮目ら 内分泌症候群：84-87；1993、日経バイオ年鑑96：453-454；1996、飛梅らホルモンと臨床 44：1205-1214；1996）ので、リガンドポリペプチドのアンタゴニストまたはその塩はこれら疾患の予防・治療剤として用いることができる。
【０１２６】
【配列表】
【配列番号：１】

【０１２７】
【配列番号：２】

【０１２８】
【配列番号：３】

【０１２９】
【配列番号：４】

【０１３０】
【配列番号：５】

【０１３１】
【配列番号：６】

【０１３２】
【配列番号：７】

【０１３３】
【配列番号：８】

【０１３４】
【配列番号：９】

【０１３５】
【配列番号：１０】

【０１３６】
【配列番号：１１】

【０１３７】
【配列番号：１２】

【０１３８】
【配列番号：１３】

【０１３９】
【配列番号：１４】

【０１４０】
【配列番号：１５】

【０１４１】
【配列番号：１６】

【０１４２】
【配列番号：１７】

【０１４３】
【配列番号：１８】

【０１４４】
【配列番号：１９】

【０１４５】
【配列番号：２０】

【０１４６】
【配列番号：２１】

【０１４７】
【配列番号：２２】

【０１４８】
【配列番号：２３】

【０１４９】
【配列番号：２４】

【０１５０】
【配列番号：２５】

【０１５１】
【配列番号：２６】

【０１５２】
【配列番号：２７】

【０１５３】
【配列番号：２８】

【０１５４】
【配列番号：２９】

【０１５５】
【配列番号：３０】

【０１５６】
【配列番号：３１】

【０１５７】
【配列番号：３２】

【０１５８】
【配列番号：３３】

【０１５９】
【配列番号：３４】

【０１６０】
【配列番号：３５】

【０１６１】
【配列番号：３６】

【０１６２】
【配列番号：３７】

【０１６３】
【配列番号：３８】

【０１６４】
【配列番号：３９】

【０１６５】
【配列番号：４０】

【０１６６】
【配列番号：４１】

【０１６７】
【配列番号：４２】

【０１６８】
【配列番号：４３】

【０１６９】
【配列番号：４４】

【０１７０】
【配列番号：４５】

【０１７１】
【配列番号：４６】

【０１７２】
【配列番号：４７】

【０１７３】
【配列番号：４８】

【０１７４】
【配列番号：４９】

【０１７５】
【配列番号：５０】

【０１７６】
【配列番号：５１】

【０１７７】
【配列番号：５２】

【０１７８】
【配列番号：５３】

【０１７９】
【配列番号：５４】

【０１８０】
【配列番号：５５】

【０１８１】
【配列番号：５６】

【０１８２】
【配列番号：５７】

【０１８３】
【配列番号：５８】

【０１８４】
【配列番号：５９】

【０１８５】
【配列番号：６０】

【０１８６】
【配列番号：６１】

【０１８７】
【配列番号：６２】

【０１８８】
【配列番号：６３】

【０１８９】
【配列番号：６４】

【０１９０】
【配列番号：６５】

【０１９１】
【配列番号：６６】

【０１９２】
【配列番号：６７】

【０１９３】
【配列番号：６８】

【０１９４】
【配列番号：６９】

【０１９５】
【配列番号：７０】

【０１９６】
【配列番号：７１】

【０１９７】
【配列番号：７２】

【０１９８】
【配列番号：７３】

【０１９９】
【配列番号：７４】

【０２００】
【配列番号：７５】

【０２０１】
【配列番号：７６】

【０２０２】
【配列番号：７７】

【０２０３】
【配列番号：７８】

【０２０４】
【配列番号：７９】

【０２０５】
【配列番号：８０】

【０２０６】
【配列番号：８１】

【０２０７】
【配列番号：８２】

【０２０８】
【配列番号：８３】

【０２０９】
【配列番号：８４】

【０２１０】
【配列番号：８５】

【０２１１】
【配列番号：８６】

【０２１２】
【配列番号：８７】

【０２１３】
【配列番号：８８】

【０２１４】
【配列番号：８９】

【０２１５】
【配列番号：９０】

【０２１６】
【配列番号：９１】

【０２１７】
【配列番号：９２】

【０２１８】
【配列番号：９３】

【０２１９】
【配列番号：９４】

【０２２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって単離したｃＤＮＡクローンｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。配列決定に用いたプライマーは−２１Ｍ１３である。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
【図２】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって単離したｃＤＮＡクローンｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。配列決定に用いたプライマーはＭ１３ＲＶ-Ｎ（タカラ）である。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
【図３】図１に示したアミノ酸配列をもとに作成した、ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部分疎水性プロットを示す。
【図４】図２に示したアミノ酸配列をもとに作成した、ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部分疎水性プロットを示す。
【図５】図１および図２に示したｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列を、公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＳ１２８６３と比較した図を示す。黒く塗った部分は一致している部分を示す。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列に対応し、第１５６番目〜第２３０番目のアミノ酸配列は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応する。
【図６】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって単離したｃＤＮＡクローンｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそれぞれ含まれるＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
【図７】図６に示したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐＧ３−２／ｐＧ１−１０）を、図１および図２に示したｐ１９Ｐ２にコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列と比較した図を示す。黒塗りの部分は配列が一致している部分を示す。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列に対応し、第１５６番目〜第２２３番目のアミノ酸配列は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応する。ｐＧ３−２／ｐＧ１−１０の第１番目〜第２２３番目のアミノ酸配列は図６の第１番目〜第２２３番目のアミノ酸配列に対応する。
【図８】図６に示した部分アミノ酸配列をもとに作成した、ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分疎水性プロットを示す。
【図９】ｐ１９Ｐ２に挿入されているＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーよりプラークハイブリダイゼーション法によって単離したｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１０】ヒト下垂体由来のｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ３がコードするレセプター遺伝子のヒト下垂体ｍＲＮＡに対するノーザンブロットの結果を示す。
【図１１】図９に示したアミノ酸配列をもとに作成した、ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の疎水性プロットを示す。
【図１２】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって単離したｃＤＮＡクローンｐ５Ｓ３８に含まれるＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
【図１３】図１２に示したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐ５Ｓ３８）を、図１および図２に示したｐ１９Ｐ２に含まれるｃＤＮＡ断片にコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列、および図６に示したｐＧ３−２ならびにｐＧ１−１０にそれぞれ含まれるｃＤＮＡ断片の塩基配列から導きだした塩基配列にコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列と比較した図を示す。黒塗りの部分は配列が一致している部分を示す。ｐ５Ｓ３８の第１番目〜第１４４番目のアミノ酸配列は図１２の第１番目〜第１４４番目のアミノ酸配列に対応する。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列に対応し、第１５６番目〜第２２３番目のアミノ酸配列は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応する。ｐＧ３−２／ｐＧ１−１０の第１番目〜第２２３番目のアミノ酸配列は図６の第１番目〜第２２３番目のアミノ酸配列に対応する。
【図１４】図１２に示した部分アミノ酸配列をもとに作成した、ｐ５Ｓ３８に含まれるＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部分疎水性プロットを示す。
【図１５】pAKKO-19P2を導入したCHO細胞でmRNAが発現していることを確認するためにRT-PCRを行った。レーン１から７は比較のためにpAKKO-19P2を段階的に希釈してPCRを行ったもので、10μg/μlのプラスミドをそれぞれ原液（レーン１）、1/2希釈（レーン２）、1/4希釈（レーン３）、1/64希釈（レーン４）、1/256希釈（レーン５）、1/1024希釈（レーン６）、１/4096希釈（レーン７）した鋳型を使ってPCRを行ったものについて1.2％アガロースゲル電気泳動により解析した結果である。レーン８から11はCHO-19P2細胞株から調製したcDNAをそれぞれ1/10希釈（レーン８）、1/100希釈（レーン９）、1/1000希釈（レーン10）したものを鋳型としてPCRを行ったものを電気泳動した。レーン11はcDNA の合成をreverse transcriptaseなしで行ったものを鋳型としてPCRを行ったものを電気泳動した。レーン12および13はそれぞれmock CHO細胞からreverse transcriptase添加および無添加で調製したcDNAを鋳型としてPCRを行ったものを電気泳動した。MはDNAのサイズマーカーであり両端のレーンはλ/Sty I digest（ニッポンジーン）を右から２番目はφχ174/Hinc II digest（ニッポンジーン）をそれぞれ1μgを電気泳動した。矢印は約400bpのPCRにより増幅されたバンドの位置を示している。
【図１６】ラット全脳から抽出した粗リガンドペプチド画分についてCHO-19P2細胞株からのアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。アラキドン酸代謝物の遊離促進活性は0.05%BSAを含むHBSSを加えた時に遊離された[³H]アラキドン酸代謝物の量を100％として、リガンドペプチド粗画分を加えた時に放出されるアラキドン酸代謝物の量を％として表した。30% CH₃CN の画分にCHO-19P2細胞株からアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が認められた。
【図１７】ウシ視床下部から抽出した粗リガンドペプチド画分についてCHO-19P2細胞株からのアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。アラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性は0.05%BSAを含むHBSSを加えた時に遊離された[³H]アラキドン酸代謝物の量を100％として、リガンドペプチド粗画分を加えた時に放出されるアラキドン酸代謝物の量を％として表した。ラット全脳から抽出した粗リガンドペプチド画分と同様に30% CH₃CN の画分にCHO-19P2細胞株からアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が認められた。
【図１８】逆相カラム C18 218TP5415 で精製した画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。RESOURCE S の活性画分を C18 218TP5415 で分離した。流速 1ml/min、20%-30% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィーを行い、溶出液を1ml ずつ分取し、凍結乾燥後、各フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活性は、３つ(溶出順にそれぞれP-1、P-2、P-3と呼ぶ)に分離した。
【図１９】逆相カラム diphenyl 219TP5415 で精製した画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。C18 218TP5415 のP-3活性画分を diphenyl 219TP5415 で分離した。流速 1ml/min、22%-25% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィーを行い、溶出液を1ml ずつ分取し、凍結乾燥後、各フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活性は１つのピークに収束した。
【図２０】逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10 で精製した画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。diphenyl 219TP5415 で活性と一致したピークの画分を μRPC C2/C18 SC 2.1/10 で分離した。流速 100μl/min、22%-23.5% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィーを行い、溶出液を100μl ずつ分取し、凍結乾燥後、各フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活性は単一の物質(ペプチド)と思われる二つのピークに一致した。
【図２１】逆相カラムμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.１／１０で精製したＰ-２画分についてＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。流速１００μl/min、２１.５％−２３.０％ ＣＨ₃ＣＮ／０.１％ ＴＦＡ／蒸留水の濃度勾配でクロマトグラフィーを行い、溶出液を１００μｌずつ分取し、凍結乾燥後、各フラクションに含まれるＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。その結果、活性は、単一のペプチドと思われるペプチドのピークに一致した。
【図２２】ウシ視床下部由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって単離したｃＤＮＡクローンに含まれるウシ視床下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出した該ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。矢印で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
【図２３】ウシ視床下部由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって単離したｃＤＮＡクローンに含まれるウシ視床下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出した該ウシ視床下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。矢印で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
【図２４】ウシ視床下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドのアミノ酸配列（ａ），（ｂ）および配列番号：１、配列番号４４に示したリガンドポリペプチドの全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列である。
【図２５】合成リガンドポリペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３１）についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離活性は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。その結果、１９Ｐ２−Ｌ３１によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存的に認められた。
【図２６】合成リガンドポリペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ））についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合成リガンドポリペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離活性は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。その結果、１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存的に認められた。
【図２７】合成リガンドポリペプチド１９Ｐ２−Ｌ２０についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離活性は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。その結果、１９Ｐ２−Ｌ２０によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存的に認められた。
【図２８】ウシゲノムライブラリーよりクローン化したファージのＤＮＡを制限酵素BamHI（Ｂ）およびSalI（Ｓ）で切断し、１．２％アガロースゲル電気泳動を行ったパターンを示す。ＤＮＡのサイズマーカー（Ｍ）にはλファージＤＮＡのStyI消化物を用いた。Ｂのレーンではマーカーの１番目（19,329bp)と２番目(7,743bp)のバンドの間に相当する位置にベクター由来の２本のバンドが検出され、その他に３番目(6,223bp)から５番目(3,472bp)の間に挿入断片由来の３本のバンドが検出された。Ｓのレーンでは同じくベクター由来の２本のバンドが検出されているが、挿入断片由来のバンドが重なっているために上側のバンドがＢのレーンに比べて太くなっている。
【図２９】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付近の塩基配列を示す。１〜３番目の塩基（ＡＴＧ）が翻訳開始コドンに相当し、７６７〜７６９番目の塩基（ＴＡＡ）が翻訳終止コドンに相当する。
【図３０】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付近の塩基配列(genome)をＰＣＲ法によってクローニングしたウシｃＤＮＡの塩基配列(cDNA)と比較した結果を示す。配列の一致している部分は網掛けで示した。１０１番目〜５７２番目の部分はｃＤＮＡの塩基配列には相当する部分が無く、イントロンであることが判明した。
【図３１】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付近の塩基配列からイントロン部分を除き、コードされるアミノ酸配列に翻訳した結果を示す。
【図３２】ラット型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列および全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列である。
【図３３】ウシ型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列およびウシ型ポリペプチド、ラット型ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。矢印で示した部分は合成プライマーに相当する部分である。
【図３４】ヒト型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列および全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列である。
【図３５】ウシ型リガンドポリペプチド、ラット型リガンドポリペプチドおよびヒト型リガンドポリペプチドの翻訳領域についてアミノ酸配列を比較したものである。
【図３６】生細胞におけるヨードラベル化リガンドポリペプチドを用いたレセプター結合実験の結果を示す。
【図３７】ＣＨＯ−１９Ｐ２−９およびＣＨＯ−ＵＨＲ１におけるリガンドポリペプチドによるアラキドン酸代謝物遊離活性の測定結果を示す。
【図３８】ラット組織におけるＵＨＲ−１のＲＴ−ＰＣＲによる定量結果を示す。定量値は３回のＰＣＲの平均値S.E.M.で表した。
【図３９】ラット組織におけるリガンドポリペプチドのＲＴ−ＰＣＲによる発現定量結果を示す。定量値は３回のＰＣＲの平均値S.E.M.で表した。
【図４０】リガンドポリペプチドのグルコースによる血漿インスリン濃度の増加をラジオイムノアッセイで測定した結果を示す。
【図４１】リガンドポリペプチド１０nmolをマウスに投与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自発運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示す。
【図４２】リガンドポリペプチド１nmolをマウスに投与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自発運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示す。
【図４３】リガンドポリペプチド０．１nmolをマウスに投与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自発運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示す。
【図４４】リガンドポリペプチド０．０１nmolをマウスに投与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自発運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示す。
【図４５】３mg/kgのレセルピンを皮下投与した１５時間後のマウスにリガンドポリペプチドを脳室内投与したときの体温変化を測定した結果を示す。図中、一つの星印は危険率：p<0.05、二つの星印はp<0.01を示す。
【図４６】延髄最後野（area postrema: AP）に角度２０度でマイクロインジェクションカニューレを刺した場合の模式図を示す。
【図４７】リガンドポリペプチドを延髄最後野に注入したときの脈波および平均血圧の典型例を示す。ラットの延髄最後野にリガンドポリペプチドを１０nmol（流速１μｌ／ｍｉｎ）注入し、無麻酔下で測定したものである。
【図４８】ペントバルビタール麻酔下ラットの第三脳室に５０nmolのリガンドポリペプチドを投与したときの血漿中のＧＨ量を測定した結果を示す。
【図４９】第三脳室へのリガンドポリペプチドの投与による血漿中成長ホルモン量の変化を示す。
自由行動下のラットに５μｇ／ｋｇのGHRHを静脈下投与し、１０分後に第三脳室へリガンドポリペプチドまたはＰＢＳを投与した。ペプチドを投与した時間を０分とした。図中、一つの星印は危険率：p<0.05、二つの星印はp<0.01を示す。
【図５０】リガンドポリペプチド抗血清と吸光度の関係を示す。
【図５１】抗リガンドポリペプチドポリクローナル抗体によるアラキドン酸代謝物放出活性の測定結果を示す。
【図５２】発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１上で構築されたラットＵＨＲ−１の完全なコード領域の塩基配列と、それにコードされるアミノ酸配列を示す。

Claims (16)

1. 以下の（1）〜（3）からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩：
   （1）配列番号：５または配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
   （2）配列番号：５で表されるアミノ酸配列中の１〜３個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２１で表されるアミノ酸配列からなる受容体蛋白質またはその塩に結合することができるポリペプチド；および
   （3）配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２１で表されるアミノ酸配列からなる受容体蛋白質またはその塩に結合することができるポリペプチド。
2. 以下の（1）〜（3）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩：
   （1）配列番号：５または配列番号：８で表されるアミノ酸配列；
   （2）配列番号：６１で表されるアミノ酸配列；および
   （3）配列番号：６４で表されるアミノ酸配列。
3. 配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質またはその塩に結合することにより細胞からのアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を有する請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するＤＮＡ。
5. 配列番号：１３、配列番号：１６、配列番号：６７または配列番号：７０で表される塩基配列からなる請求項４記載のＤＮＡ。
6. 請求項４記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
7. 請求項４記載のＤＮＡまたは請求項６記載の組換えベクターを保持する形質転換体。
8. 請求項７記載の形質転換体を培養することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドの製造法。
9. 請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩を含有してなる医薬。
10. 下垂体機能調節剤である請求項９記載の医薬。
11. 中枢神経機能調節剤である請求項９記載の医薬。
12. 膵臓機能調節剤である請求項９記載の医薬。
13. 請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドに対する抗体。
14. （ｉ）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質またはその塩に、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを接触させた場合と（ii）配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質またはその塩に、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド、および試験化合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドと、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法。
15. 請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを含有する、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドと、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列からなる受容体蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キット。
16. さらに配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質またはその塩を含有する、請求項１５記載のキット。

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