JP2001309792A

JP2001309792A - スクリーニング方法

Info

Publication number: JP2001309792A
Application number: JP2000361017A
Authority: JP
Inventors: Kuniji Hinuma; 州司日沼; Masaki Hosoya; 昌樹細谷; Yuji Kawamata; 裕二川俣; Masashi Fukuzumi; 昌司福住
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-11-29
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2001-11-06

Abstract

(57)【要約】【課題】高血圧症、ストレス性疾患の予防・治療薬のス
クリーニング方法などの提供。【解決手段】ニューロメジンＵもしくはその誘導体また
はその塩およびＦＭ−３またはその塩を用いることを特
徴とするニューロメジンＵまたはその塩とＦＭ−３また
はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング方法など。【効果】本発明のニューロメジンＵもしくはその誘導体
またはその塩およびＦＭ−３またはその塩を用いること
を特徴とするニューロメジンＵまたはその塩とＦＭ−３
またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその
塩のスクリーニング方法は、高血圧症、ストレス性疾患
等の予防・治療薬などをスクリーニングするために用い
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オーファンレセプ
ター蛋白質であるＦＭ−３（Tan, C.P. et al.,Genomic
s 52, 223-229, 1998など）またはその塩とニューロメ
ジンＵ（Minamino, N. et al., Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 130, 1078-1085, 1985など）もしくはその
誘導体またはその塩を用いることを特徴とする高血圧
症、ストレス性疾患の予防・治療薬または食欲調節剤な
どのスクリーニング方法などに関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプターを通じて生体の機能を調
節している。これらのレセプターの多くは共役している
guanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質
と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグ
ナル伝達を行い、また７個の膜貫通領域を有する共通し
た構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ーあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。この
ようなホルモンや神経伝達物質とＧ蛋白質共役型レセプ
ターとの相互作用を通じて生体のホメオスタシスの維
持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器
系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの
生体にとって重要な機能調節が行われている。このよう
に生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質に
対するレセプター蛋白質が存在し、その機能調節に重要
な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作
用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対
するレセプターが存在するかどうかについては未だ不明
なことが多い。近年、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
がその構造の一部にアミノ酸配列の類似性を示すことを
利用して、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(Pol
ymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法
によって新規レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを探
索する方法が行われるようになり、数多くの、リガンド
が不明ないわゆるオーファンＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質がクローニングされている(Libert, F., et al.
Science, 244, 569-572, 1989, Welch, S.K., etal., B
iochem. Biophys. Res. Commun., 209, 606-613, 1995,
Marchese, A.,et al., Genomics, 23, 609-618, 1994,
Marchese, A., Genomics, 29, 335-344, 1995)。ま
た、ゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのランダムな配列決
定によっても、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が
次々と見出されている(Nomura, N.,et al., DNA Resear
ch 1巻、27-35頁、1994年）。これらのオーファンＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質のリガンドを決定する一般
的な手段としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
一次構造上の類似性から推定するしかなかった。しか
し、多くのオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
は既知のレセプターとのホモロジーが低いものが多く、
実際は既知リガンドのレセプターサブタイプである場合
を除いては一次構造上の類似性だけでそのリガンドを推
定することは困難であった。一方、遺伝子解析から多く
のオーファンＧ蛋白質共役型レセプターがみつかってい
ることから対応する未知のリガンドがまだ数多く存在し
ていることが推定されているが、これまで実際にオーフ
ァンＧ蛋白質共役型レセプターのリガンドを同定した例
は数少ない。ＦＭ−３はgrowth hormone secretagogues
(GHSs)受容体(GHS-R)およびニューロテンシン受容体(N
T-R)に類似の受容体として取得された７回膜貫通型の受
容体であり、アミノ酸配列の一致度（identity）として
は、GHS-Rに対して33%、NT-Rtype1に対して29%と報告さ
れている (Tan, C.P.et al., Genomics 52, 223-229, 1
998)。GHS-Rに類似の受容体としては、他にGPR38、GPR3
9などが報告されており（McKee, K.K. et al., Genomic
s 46, 426-434, 1997）、これらを合わせて一種の受容
体ファミリーを形成していると考えられる。さて、一般
に構造の類似する受容体間でリガンドが互いに交差反応
を示す場合があるが、ＦＭ−３を導入し、細胞膜上に当
該受容体が発現していることを確認したHEK-293細胞に
対しては、標識化したMK-0677（GHSsの一種）およびニ
ューロテンシンはいずれも結合しないと報告されている
（Tan, C.P.et al., Genomics52, 223-229, 1998）。ま
た、エンドセリン、VIP (vasoactive intestinal pepti
de)、ガストリン、成長ホルモン放出ホルモン(GH-RH)、
ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TR
H)、カルシトニン、ガラニン等のペプチドについて検討
したが、細胞内カルシウムイオンの遊離を指標としたア
ッセイにおいてＦＭ−３の活性化は検出されなかった
（ Tan, C.P.et al., Genomics 52, 223-229, 1998）。
このように、これまでＦＭ−３の内因性のリガンドに対
する知見は全く得られていなかった。一方、ニューロメ
ジンＵはラットの子宮平滑筋収縮活性を指標とし、ブタ
の脊髄より単離・精製されたペプチドで、８アミノ酸残
基からなるニューロメジンＵ-８および２５アミノ酸残
基からなるニューロメジンＵ-２５の２種が最初に報告
されている（Minamino, N. et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 130, 1078-1085, 1985）。ニューロメジ
ンＵ-８の配列はニューロメジンＵ-２５のＣ末端部分に
一致し、その上流にはプロセッシングによって切断を受
ける部位によく見られるような塩基性アミノ酸ペアが存
在することから、両者は共通の前駆体に由来するものと
考えられる。さて、平滑筋収縮作用の他にもニューロメ
ジンＵの生理作用は広く知られており、例えば、血圧上
昇（Minamino, N. et al.）、内臓の血流量の低下（Sum
i, S. et al., Life Sci. 41, 1585-1590, 1987）、腸
管におけるイオン輸送の調節（Brown, D.R. and Quito,
F.L., Eur. J. Pharmacol.155, 159-162, 1988）、皮
下投与後のACTHおよびそれに引き続くコルチコステロン
の上昇（Malendowicz, L.K. et al., In Vivo, 7, 419-
422, 1993）などが報告されている。一般に生理活性ペ
プチドはその作用を特異的な受容体を介して発揮するこ
とから、受容体の性状・分布等を知ることはその作用の
メカニズムを明らかにする上で重要であるが、ニューロ
メジンＵの受容体はこれまで知られていなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これまでＦＭ−３のリ
ガンドは不明であったが、ＦＭ−３を介した生理作用の
解明およびそれに基づく医薬の開発のためには、ＦＭ−
３の内因性のリガンド、あるいはアゴニスト、アンタゴ
ニストが必要であった。また、これまでニューロメジン
Ｕの受容体は不明であったが、ニューロメジンＵの生理
的役割をさらに明らかにし、その機構を活性化、あるい
は修飾、阻害する化合物をスクリーニングして新たな医
薬を開発するためには、受容体の構造を明らかにする必
要があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＦＭ−３発
現CHO細胞に対してニューロメジンＵが特異的な細胞刺
激活性を有することを見出した。さらに、ラット型新規
ＦＭ−３のｃＤＮＡを単離し、その全塩基配列を解析す
ることに成功した。これらの知見に基づいてさらに検討
を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）ニューロメジ
ンＵもしくはその誘導体またはその塩およびＦＭ−３ま
たはその塩を用いることを特徴とするニューロメジンＵ
またはその塩とＦＭ−３またはその塩との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）ニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその
塩およびＦＭ−３またはその塩を含有することを特徴と
するニューロメジンＵまたはその塩とＦＭ−３またはそ
の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク
リーニング用キット、（３）上記（１）記載のスクリー
ニング方法または上記（２）記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる、ニューロメジンＵまたはその
塩とＦＭ−３またはその塩との結合性を変化させる化合
物またはその塩、（４）上記（３）記載の化合物または
その塩を含有してなる医薬、（５）高血圧症またはスト
レス性疾患の予防・治療薬である上記（４）記載の医
薬、（６）上記（３）記載の化合物またはその塩を含有
してなる食欲調節剤、（７）ニューロメジンＵが配列番
号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである上記
（１）記載のスクリーニング方法または上記（２）記載
のスクリーニング用キット、（８）ＦＭ−３が配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記（１）
記載のスクリーニング方法または上記（２）記載のスク
リーニング用キット、（９）配列番号：１９で表わさ
れるアミノ酸配列、配列番号：１９で表わされるアミ
ノ酸配列に１個以上３０個以下のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配
列中の１個以上３０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列、または配列番号：１９で表
わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下のアミノ酸
が付加し、かつ配列番号：１９で表わされるアミノ酸配
列中の１個以上３０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋
白質またはその塩、

【０００６】（１０）上記（９）記載の蛋白質をコード
するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（１１）配列番号：２０
で表される塩基配列を有する上記（１０）記載のＤＮ
Ａ、（１２）上記（１０）記載のＤＮＡを含有する組換
えベクター、（１３）上記（１２）記載の組換えベクタ
ーで形質転換させた形質転換体、（１４）上記（１３）
記載の形質転換体を培養し、上記（９）記載の蛋白質を
生成せしめることを特徴とする上記（９）記載の蛋白質
またはその塩の製造法、および（１５）上記（９）記載
の蛋白質またはその塩に対する抗体などを提供するもの
である。本発明におけるＦＭ−３に関して、具体的に
は、上述のＦＭ−３またはその塩などがあげられるのみ
ならず、（１６）配列番号：３または配列番号：１９で
表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有する蛋白質であるＦＭ−３またはそ
の塩、または（１７）配列番号：１、配列番号：３また
は配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以
上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ
酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１、配列番号：
３または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列に１
個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のア
ミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、
あるいは配列番号：１、配列番号：３または配列番号：
１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以
下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のア
ミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質であ
るＦＭ−３またはその塩などがあげられる。また、本発
明におけるニューロメジンＵに関して、具体的には、上
述のニューロメジンＵまたはその塩などがあげられるの
みならず、（１８）配列番号：５、配列番号：６、配列
番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１
０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４
または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を含有
するペプチドであるニューロメジンＵもしくはその誘導
体またはその塩などがあげられる。また、本発明のニュ
ーロメジンＵはそのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル
基がアミド化されたものが好ましい。本発明におけるラ
ット型ＦＭ−３に関しては、配列番号：１９で表わさ
れるアミノ酸配列、配列番号：１９で表わされるアミ
ノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１
０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個
以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または配列番
号：１９で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以
下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加
し、かつ配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の
１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下の
アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含
有する蛋白質であるラット型ＦＭ−３またはその塩など
があげられる。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で用いられるＦＭ−３（上
記のラット型ＦＭ−３も含む）またはその塩（以下、単
にＦＭ−３と略称する場合がある）およびニューロメジ
ンＵもしくはその誘導体またはその塩（以下、単にニュ
ーロメジンＵと略称する場合がある）の製造法を以下に
さらに詳細に説明する。本発明で用いられるＦＭ−３お
よびニューロメジンＵとしては、温血動物（例えば、ヒ
ト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サル、イヌ、ニワトリなど）、両生類（例えば、カ
エルなど）および魚類などのあらゆる組織（たとえば、
下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆の
う、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓
など）または細胞などに由来する蛋白質（（ポリ）ペプ
チド）であって、ＦＭ−３としては、配列番号：１、ニ
ューロメジンＵとしては配列番号：１１で表わされるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有する蛋白質（（ポリ）ペプチド）であれば如何な
るものであってもよい。例えば、本発明のＦＭ−３とし
ては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有す
る蛋白質などの他に、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質
と実質的に同質の活性を有する蛋白質などがあげられ
る。該「実質的に同一」とは、例えば、リガンド（ニュ
ーロメジンＵ）と受容体（ＦＭ−３）の結合活性、生理
的な特性などが、実質的に同じことを意味する。アミノ
酸の置換、欠失、付加あるいは挿入はしばしばポリペプ
チドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をもた
らさないが、こうした場合その置換、欠失、付加あるい
は挿入を施された蛋白質（（ポリ）ペプチド））（いわ
ゆるニューロメジンＵ改変体、ＦＭ−３改変体など）
は、そうした置換、欠失、付加あるいは挿入のされてい
ないものと実質的に同一であるとされるであろう。該ア
ミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物として
は、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのう
ち他のアミノ酸類から選ぶことができる。非極性（疎水
性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプト
ファン、メチオニンなどがあげられる。極性（中性）ア
ミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システ
イン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげ
られる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアル
ギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷
をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸などがあげられる。

【０００８】したがって、受容体結合活性の強さなどの
強弱、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていても
よい。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有す
る蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質として具
体的には、例えば、配列番号：３で表されるアミノ酸配
列を含有するタンパク質、配列番号：１９で表されるア
ミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。一
方、本発明のニューロメジンＵとしては、配列番号：１
１で表わされるアミノ酸配列を含有する（ポリ）ペプチ
ドなどの他に、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する（ポリ）ペ
プチドと実質的に同質の活性を有する（ポリ）ペプチド
などがあげられる。実質的に同質の活性としては、例え
ばレセプター結合活性などがあげられる。実質的に同質
とは、レセプター結合活性などが性質的に同質であるこ
とを示す。したがって、レセプター結合活性の強さなど
の強弱、（ポリ）ペプチドの分子量などの量的要素は異
なっていてもよい。配列番号：１１で表されるアミノ酸
配列を含有する（ポリ）ペプチドと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有する（ポリ）ペプチドとして具体的に
は、例えば、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチド、配列番号：６で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチド、配列番号：７で表される
アミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：８で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番
号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ド、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有する
ポリペプチド、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチド、配列番号：１２で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：１３で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番
号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ド、および配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドなどがあげられる。本明細書におけ
るＦＭ−３およびニューロメジンＵはペプチド標記の慣
例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端
（カルボキシル末端）である。例えば、配列番号：１ま
たは配列番号：１１で表されるアミノ酸配列などを含有
する蛋白質または（ポリ）ペプチドはＣ末端が通常カル
ボキシル基（-COOH）またはカルボキシレート(-COO^-)で
あるが、Ｃ末端がアミド（-CONH₂）またはエステル(-CO
OR)であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ
−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、シクロペンチル、シ
クロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、ベンジル、
フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_1-2ア
ルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチ
ル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキル基のほか、
経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチ
ル基などがあげられる。本発明で用いられるニューロメ
ジンＵとしてはＣ末端がアミド（-CONH₂）であるものが
好ましい。

【０００９】本発明で用いられるＦＭ−３およびニュー
ロメジンＵの塩としては、生理学的に許容される塩基
（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）と
の塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸
付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明で
用いられるＦＭ−３およびニューロメジンＵは、公知の
方法（例、FEBS Letters 398 (1996) 253-258、WO 96/1
8651号公報記載の方法）に準じた方法、即ち、ヒトや温
血動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する方
法によって製造することもできるし、後述の蛋白質（ペ
プチド）合成法に準じて製造することもできる。また、
後述する蛋白質（ペプチド）をコードするＤＮＡを含有
する形質転換体を培養することによっても製造すること
ができる。ヒト、温血動物、両生類、魚類などの組織ま
たは細胞から製造する場合、ヒト、温血動物、両生類、
魚類などの組織または細胞をホモジナイズした後、酸、
有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、
ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど
のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単
離することができる。上記したように本発明で用いられ
るＦＭ−３およびニューロメジンＵは、自体公知の蛋白
質（（ポリ）ペプチド）の合成法に従って、あるいはＦ
Ｍ−３および／またはニューロメジンＵを含有する蛋白
質（（ポリ）ペプチド）を適当なペプチダーゼで切断す
ることによって製造することができる。蛋白質（（ポ
リ）ペプチド）の合成法としては、例えば固相合成法、
液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ＦＭ−
３および／またはニューロメジンＵを構成し得る部分ペ
プチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成
物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより
目的の蛋白質（（ポリ）ペプチド）を製造することがで
きる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、
以下の〜に記載された方法があげられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タ
ンパク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合
成広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて蛋白質（（ポリ）ペプチ
ド）を精製単離することができる。上記方法で得られる
蛋白質（（ポリ）ペプチド）が遊離体である場合は、公
知の方法によって適当な塩に変換することができるし、
逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に
変換することができる。

【００１０】ＦＭ−３およびニューロメジンＵのアミド
体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を
用いることができる。そのような樹脂としては例えば、
クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒド
リルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキ
シベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリル
アミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフ
ェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹
脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメ
チル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェ
ニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげる
ことができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と
側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペ
プチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、
樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質
（（ポリ）ペプチド）を切り出すと同時に各種保護基を
除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィ
ド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質（（ポリ）ペプ
チド）を取得する。上記した保護されたアミノ酸の縮合
に関しては、蛋白質（（ポリ）ペプチド）合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDC
C、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-
(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどがあ
げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤
（例えば、HOBT、HOOBTなど)とともに保護されたアミノ
酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または
HOBTエステルあるいはHOOBTエステルとしてあらかじめ
保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加
することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂
との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質（（ポリ）
ペプチド）縮合反応に使用しうることが知られている溶
媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチ
ルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロ
ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタ
ノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなど
のスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオ
キサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセト
ニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メ
チル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適
宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合
形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適
宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選
択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５な
いし４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いた
テストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を
行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合
を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が
得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾ
ールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反
応に影響を及ぼさないようにすることができる。

【００１１】原料アミノ酸のアミノ基の保護基として
は、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシ
カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メト
キシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Fmocなどがあげられる。
カルボキシル基の保護基としては、たとえばＲとして上
記したＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基、Ｃ
_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロ
ベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジ
ル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒド
ラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、
トリチルヒドラジドなどがあげられる。セリンおよびス
レオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテ
ル化によって保護することができる。このエステル化に
適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノ
イル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキ
シカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から
誘導される基などがあげられる。また、エーテル化に適
する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピ
ラニル基、ターシャリーブチル基などである。チロシン
のフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBz
l、Cl₂-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリー
ブチルなどがあげられる。ヒスチジンのイミダゾールの
保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチル
ベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bu
m、Boc、Trt、Fmocなどがあげられる。原料のカルボキ
シル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する
酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえ
ば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノ
ール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコー
ル、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシ
ミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBT）とのエステ
ル］などがあげられる。原料のアミノ基の活性化された
ものとしては、たとえば対応するリン酸アミドなどがあ
げられる。

【００１２】保護基の除去（脱離）方法としては、たと
えばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元などもあげられる。上記酸
処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で
行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノー
ル、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾー
ル、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-
エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効
である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として
用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処
理により除去され、トリプトファンのインドール保護基
として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオ
ール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ
る脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアな
どによるアルカリ処理によっても除去される。原料の反
応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、なら
びにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化
などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しう
る。ＦＭ−３およびニューロメジンＵのアミド体を得る
別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸の
α−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペ
プチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖の
Ｎ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドと
Ｃ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド
（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記
したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細に
ついては上記と同様である。縮合により得られた保護ペ
プチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を
除去し、所望の粗蛋白質（（ポリ）ペプチド）を得るこ
とができる。この粗蛋白質（（ポリ）ペプチド）は既知
の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥
することで所望の蛋白質（（ポリ）ペプチド）のアミド
体を得ることができる。ＦＭ−３およびニューロメジン
Ｕのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα
−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ
酸エステルとした後、蛋白質（（ポリ）ペプチド）のア
ミド体と同様にして所望の蛋白質（（ポリ）ペプチド）
のエステル体を得ることができる。

【００１３】本発明で用いられるニューロメジンＵの誘
導体としては、ニューロメジンＵの部分ペプチド、
ニューロメジンＵの構成アミノ酸が欠失したペプチド、
構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加したペプチド、構成
アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチド、または
ニューロメジンＵ、上記記載の部分ペプチドまたは
上記記載のペプチドが標識化されたものなど、ＦＭ−
３との結合能を有するものであれば何れのものであって
もよい。ニューロメジンＵの部分ペプチドとして具体的
には、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有す
るペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま
たはその塩などがあげられる。なかでも、配列番号：１
６で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドのアミド
またはその塩が好ましい。該ニューロメジンＵの部分ペ
プチドは、上述のニューロメジンＵを適当なペプチダー
ゼで切断することによって製造することができるし、上
記の蛋白質（（ポリ）ペプチド）の合成法に従って製造
することができる。ニューロメジンＵの部分ペプチドの
アミドまたはエステルも上述のアミド体またはエステル
体の製造方法に準じて製造することができる。さらにニ
ューロメジンＵの部分ペプチドの塩としては、上記のＦ
Ｍ−３およびニューロメジンＵの塩と同様のものなどが
あげられる。また、ニューロメジンＵの構成アミノ酸が
欠失したペプチド、構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加
したペプチド、構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換され
たペプチドとしては、配列番号：１１で表されるアミノ
酸配列中の１個以上３個以下、好ましくは１個または２
個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、または、配列番
号：１１で表されるアミノ酸配列に１個以上３個以下、
好ましくは１個または２個のアミノ酸が付加した（また
は挿入された）アミノ酸配列、あるいは配列番号：１１
で表されるアミノ酸配列中の１個以上３個以下、好まし
くは１個または２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられ
る。

【００１４】さらに、構成アミノ酸が欠失したペプチ
ド、構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加したペプチド、
構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチドとし
ては、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配
列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番
号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列
番号：１５で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３個
以下、好ましくは１個または２個のアミノ酸が欠失した
アミノ酸配列、配列番号：５、配列番号：６、配列番
号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１
０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４
または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列に１個
以上３個以下、好ましくは１個または２個のアミノ酸が
付加した（または挿入された）アミノ酸配列、あるいは
配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番
号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１
２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：
１５で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３個以下、
好ましくは１個または２個のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を含有するペプチドなどもあげ
られる。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な
置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところ
のクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができる。
非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシ
ン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニ
ン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極
性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオ
ニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミ
ンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸
としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげら
れる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。ニューロメ
ジンＵ、上記記載の部分ペプチドまたは上記記載の
ペプチドが標識化されたものとしては、自体公知の方法
で、アイソトープラベル化されたもの、蛍光標識された
もの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、
ビオチン化されたもの、酵素標識されたものなどがあげ
られる。具体的には、例えば公知の方法によって、〔³
Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔 ³⁵Ｓ〕などで標識され
たニューロメジンＵなどを利用することができる。ニュ
ーロメジンＵの誘導体の塩としては、上記のＦＭ−３お
よびニューロメジンＵの塩と同様のものなどがあげられ
る。本発明で用いられるＦＭ−３をコードするＤＮＡと
しては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質
をコードするＤＮＡ、本発明で用いられるニューロメジ
ンＵをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１で表
わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡであ
ればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由
来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライ
ブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー
に使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミ
ド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製し
たものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase
Chain Reaction (以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する)に
よって増幅することもできる。配列番号：１で表される
アミノ酸配列を含有するＦＭ−３をコードするＤＮＡと
しては、例えば配列番号：２で表される塩基配列を含有
するＤＮＡなどがあげられ、配列番号：３で表されるア
ミノ酸配列を含有するＦＭ−３をコードするＤＮＡとし
ては、例えば配列番号：４で表される塩基配列を含有す
るＤＮＡなどがあげられる。さらに、配列番号：１９で
表されるアミノ酸配列を含有するＦＭ−３をコードする
ＤＮＡとしては、例えば配列番号：２０で表される塩基
配列を含有するＤＮＡなどがあげられる。

【００１５】より具体的には、(1)ストリンジェントな
条件下で、配列番号：１または配列番号：１１で表わさ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有する蛋白質または（ポリ）ペプチドをコー
ドするＤＮＡの有する配列とハイブリダイズするＤＮ
Ａ、(2)遺伝コードの縮重のため、配列番号：１または
配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列と同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または
（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡの有する配列およ
び(1)に定められている配列とハイブリッド形成しない
が、同一アミノ酸配列をもつ蛋白質または（ポリ）ペプ
チドをコードするＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダ
イゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じた
方法に従って行うことができる。上記ストリンジェント
な条件としては、例えば４２℃、５０％ホルムアミド、
４×ＳＳＰＥ(１×ＳＳＰＥ＝150mM NaCl, 10mM NaH₂PO
₄・H₂O, 1mM EDTA pH7.4)、５×デンハート溶液、０．１
％ＳＤＳである。本発明で用いられるＦＭ−３またはニ
ューロメジンＵをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学
的手法によっても製造することができる。本発明のＦＭ
−３またはニューロメジンＵを完全にコードするＤＮＡ
のクローニングの手段としては、本発明のポリペプチド
の部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を有する
合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によ
って前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを
増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ
を例えばＦＭ−３またはニューロメジンＵをコードする
ＤＮＡの塩基配列の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ
断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイ
ブリダイゼーションによって選別することができる。ハ
イブリダイゼーションの方法は、例えば Molecular Clo
ning（２nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Ha
rbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行
われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添
付の使用説明書に記載の方法に従って行う。

【００１６】ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキッ
ト、例えば、Mutan^TM-super ExpressKm（宝酒造
（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA
-LA PCR法やGapped duplex法やKunkel法等の自体公知の
方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことが
できる。クローン化された本発明で用いられるＦＭ−３
またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡは目的によ
りそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、
リンカーを付加したりして使用することができる。該Ｄ
ＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧ
を有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮ
Ａアダプターを用いて付加することもできる。本発明で
用いられるＦＭ−３またはニューロメジンＵの発現ベク
ターは、例えば、（イ）本発明で用いられるＦＭ−３ま
たはニューロメジンＵをコードするＤＮＡから目的とす
るＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な
発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することに
より製造することができる。ベクターとしては、大腸菌
由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，
ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド
（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由
来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファ
ージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワク
シニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス
などが用いられる。用いられるプロモーターとしては、
遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。形質転換する際の宿
主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモー
ター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイト
メガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなど
が利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、
Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、
ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である
場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモ
ーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、
ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが
好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望により
エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シ
グナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、
ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有して
いるものを用いることができる。選択マーカーとして
は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと
略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴ
Ｘ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^r
と略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以
下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等
があげられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用い
てＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、
チミジンを含まない培地によっても選択できる。また、
必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプ
チドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿
主がエシェリヒア属菌である場合は、phoA・シグナル配
列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌
である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチ
リシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合
は、メイテイングファクターα(ＭＦα)・シグナル配
列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細
胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配
列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・
シグナル配列などがそれぞれ利用できる。

【００１７】このようにして構築されたＦＭ−３または
ニューロメジンＵをコードするＤＮＡを含有するベクタ
ーを用いて、形質転換体を製造することができる。宿主
としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、
酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられ
る。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ
１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nuclei
c Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ
２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５
１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６
９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３
９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。バチルス
属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus
subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９
８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８
７(１９８４)〕などが用いられる。酵母としては、たと
えばサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１
Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。昆
虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前
田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９
８５)〕。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃ
ＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodopte
ra frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの
中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHig
h Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEs
tigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルス
がＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori
N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞として
は、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細
胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitr
o），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕など
が用いられる。動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ
−７細胞，Ｖero細胞，チャイニーズハムスター細胞Ｃ
ＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウ
ス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９
３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、Ｂ
ＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられ
る。エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Pro
c. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１
９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)
などに記載の方法に従って行なわれる。

【００１８】バチルス属菌を形質転換するには、たとえ
ばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック
ス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１
１１(１９７９)などに記載の方法に従って行われる。酵
母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイ
ズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci.
ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に
従って行なわれる。昆虫細胞または昆虫を形質転換する
には、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technolog
y）,６巻, ４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方
法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、
たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６
(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。発現ベク
ターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェク
ション法〔Felgner, P.L. et al. プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of The N
ational Academy of Sciences of The United States o
f America），８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、
リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb,
A. J.ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６−４
６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et
al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.），１巻，８４１−
８４５頁（１９８２年）〕等があげられる。このように
して、本発明で用いられるＦＭ−３またはニューロメジ
ンＵをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質
転換された形質転換体が得られる。なお、動物細胞を用
いて、本発明で用いられるＦＭ−３またはニューロメジ
ンＵを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞
に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞
をクローン選択によって選択する方法がある。具体的に
は、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択
する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られ
た動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうこ
とにより本発明で用いられるＦＭ−３またはニューロメ
ジンＵの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ること
ができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして
用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株
を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発
明で用いられるＦＭ−３またはニューロメジンＵをコー
ドするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動
物細胞株を得ることもできる。上記の形質転換体を本発
明で用いられるＦＭ−３またはニューロメジンＵをコー
ドするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明で用
いられるＦＭ−３またはニューロメジンＵを生成、蓄積
せしめることによって、本発明で用いられるＦＭ−３ま
たはニューロメジンＵを製造することができる。

【００１９】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵
母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。
培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を
培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミ
ノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・
オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネ
ティックス（Journal of Experiments in Molecular Ge
netics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Labor
atory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要に
よりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば
３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えること
ができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常
約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通
気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の
場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行な
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bo
stian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミ
ノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８
４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整する
のが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜
７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主
が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地として
は、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャ
ー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ
血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培
地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。
培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて
通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体
を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の
胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Scienc
e），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地
〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５
９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ
・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Jo
urnal of The American Medical Association）１９９
巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング
・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカ
ル・メディスン（Proceeding ofThe Society for The B
iological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが
用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要
に応じて通気や撹拌を加える。特にＣＨＯ（dhfr^-）細
胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合に
は、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含
むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。上記培養物から
本発明で用いられるＦＭ−３またはニューロメジンＵを
分離精製するには、例えば下記の方法により行なうこと
ができる。本発明で用いられるＦＭ−３またはニューロ
メジンＵを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび
／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊
したのち、遠心分離やろ過により本発明で用いられるＦ
Ｍ−３またはニューロメジンＵの粗抽出液を得る方法な
どが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン
などのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００^TM など
の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明
で用いられるＦＭ−３またはニューロメジンＵが分泌さ
れる場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体ある
いは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このように
して得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本
発明で用いられるＦＭ−３またはニューロメジンＵの精
製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの
等電点の差を利用する方法などが用いられる。かくして
得られる本発明で用いられるＦＭ−３またはニューロメ
ジンＵが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あ
るいはそれに準じる方法によって塩に変換することがで
き、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいは
それに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換す
ることができる。なお、組換え体が産生する本発明で用
いられるＦＭ−３またはニューロメジンＵを、精製前ま
たは精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることによ
り、任意に修飾を加えたり、蛋白質（（ポリ）ペプチ
ド）を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素と
しては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギ
ニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコ
シダーゼなどが用いられる。またＮ末端アミノ酸を欠失
させるためには、エドマン(Edman)試薬（フェニルイソ
チオシアネート）を用いた公知のエドマン法を用いるこ
とが可能である。かくして生成する本発明で用いられる
ＦＭ−３またはニューロメジンＵの存在は特異抗体を用
いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定すること
ができる。ニューロメジンＵおよびＦＭ−３を用いるこ
とを特徴とするニューロメジンとＦＭ−３との結合性を
変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法ま
たはニューロメジンＵおよびＦＭ−３を含有することを
特徴とするニューロメジンＵとＦＭ−３との結合性を変
化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット
（以下、本発明のスクリーニング方法、本発明のスクリ
ーニング用キットと略記する場合がある）について以下
に詳述する。ＦＭ−３を用いるか、または組換え型ＦＭ
−３の発現系を構築し、該発現系を用いたニューロメジ
ンＵとの結合アッセイ系（リガンド・レセプターアッセ
イ系）を用いることによって、ニューロメジンＵとＦＭ
−３との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチ
ド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生
産物など）またはその塩をスクリーニングすることがで
きる。

【００２０】このような化合物には、ＦＭ−３を介して
細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコ
リン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を有する化合
物（即ちＦＭ−３アゴニスト）と該細胞刺激活性を有し
ない化合物（即ちＦＭ−３アンタゴニスト）などが含ま
れる。また、「ニューロメジンＵとＦＭ−３との結合性
を変化させる」とは、ニューロメジンＵとＦＭ−３との
結合を阻害する場合と結合を促進する（結合時間を長く
する）場合の両方を包含するものである。すなわち、本
発明は、（ｉ）ＦＭ−３に、ニューロメジンＵを接触さ
せた場合と（ii）上記したＦＭ−３に、ニューロメジン
Ｕおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なう
ことを特徴とするニューロメジンＵとＦＭ−３との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法を提供する。本発明のスクリーニング方法において
は、（ｉ）上記したＦＭ−３に、ニューロメジンＵを接
触させた場合と（ii）上記したＦＭ−３に、ニューロメ
ジンＵおよび試験化合物を接触させた場合における、例
えば該ＦＭ−３に対するリガンドの結合量、細胞刺激活
性などを測定して、比較する。

【００２１】本発明のスクリーニング方法は具体的に
は、上記のニューロメジンの誘導体として表される標識し
たニューロメジンＵ（以下、単に「標識したニューロメ
ジンＵ」とする）を、上記したＦＭ−３に接触させた場
合と、標識したニューロメジンＵおよび試験化合物をＦ
Ｍ−３に接触させた場合における、標識したニューロメ
ジンＵの該ＦＭ−３に対する結合量を測定し、比較する
ことを特徴とするニューロメジンＵとＦＭ−３との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、標識したニューロメジンＵを、ＦＭ−３を含有する細
胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した
ニューロメジンＵおよび試験化合物をＦＭ−３を含有す
る細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合におけ
る、標識したニューロメジンＵの該細胞または該膜画分
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするニ
ューロメジンＵとＦＭ−３との結合性を変化させる化合
物またはその塩のスクリーニング方法、標識したニューロメジンＵを、ＦＭ−３をコードする
ＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細
胞膜上に発現したＦＭ−３に接触させた場合と、標識し
たニューロメジンＵおよび試験化合物をＦＭ−３をコー
ドするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによ
って細胞膜上に発現したＦＭ−３に接触させた場合にお
ける、標識したニューロメジンＵのＦＭ−３に対する結
合量を測定し、比較することを特徴とするニューロメジ
ンＵとＦＭ−３との結合性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、ＦＭ−３を活性化する化合物（例えば、ニューロメジ
ンＵ）をＦＭ−３を含有する細胞に接触させた場合と、
ＦＭ−３を活性化する化合物および試験化合物をＦＭ−
３を含有する細胞に接触させた場合における、ＦＭ−３
を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ
生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ
の活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を測定
し、比較することを特徴とするニューロメジンＵとＦＭ
−３との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク
リーニング方法、およびＦＭ−３を活性化する化合物（例えば、ニューロメジ
ンＵなど）をＦＭ−３をコードするＤＮＡを含有する形
質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＦ
Ｍ−３に接触させた場合と、ＦＭ−３を活性化する化
合物および試験化合物を、ＦＭ−３をコードするＤＮＡ
を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上
に発現したＦＭ−３に接触させた場合における、ＦＭ−
３を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、
アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭ
Ｐ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を
測定し、比較することを特徴とするニューロメジンＵと
ＦＭ−３との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング方法などである。本発明のスクリーニン
グ方法の具体的な説明を以下にする。まず、本発明のス
クリーニング方法に用いるＦＭ−３としては、上記のＦ
Ｍ−３を含有するものであれば何れのものであってもよ
いが、ヒト、温血動物、両生類、魚類などの臓器の膜画
分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入
手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられ
るものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＦＭ
−３などが適している。ＦＭ−３を製造するには、前述
の方法などが用いられる。

【００２２】本発明のスクリーニング方法において、Ｆ
Ｍ−３を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用い
る場合、後述の調製法に従えばよい。ＦＭ−３を含有す
る細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホ
ルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自
体公知の方法に従って行うことができる。ＦＭ−３を含
有する細胞としては、ＦＭ−３を発現した宿主細胞をい
うが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵
母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。膜画分とし
ては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られ
る細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕
方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細
胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン
（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フ
レンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから
噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の
分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの
遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細
胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短
時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高
速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０
分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜
画分中には、発現したＦＭ−３と細胞由来のリン脂質や
膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該ＦＭ−３を含
有する細胞や膜画分中のＦＭ−３の量は、１細胞当たり
１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分
子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画
分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高
感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでな
く、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
ニューロメジンＵとＦＭ−３との結合性を変化させる化
合物またはその塩をスクリーニングする前記の〜を
実施するためには、適当なＦＭ−３画分と、標識したリ
ガンドまたはリガンド活性を有する化合物（ニューロメ
ジンＵ、その誘導体など）が用いられる。ＦＭ−３画分
としては、天然型のＦＭ−３画分か、またはそれと同等
の活性を有する組換え型ＦＭ−３画分などが望ましい。
ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性など
を示す。標識したリガンドまたはリガンド活性を有する
化合物としては、標識したリガンドまたはリガンド活性
を有する化合物（ニューロメジンＵ、その誘導体など）
などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、
〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガンド（ニュー
ロメジンＵ誘導体として表されるニューロメジンＵの標
識体）などを利用することができる。具体的には、ニュ
ーロメジンＵとＦＭ−３との結合性を変化させる化合物
のスクリーニングを行うには、まずＦＭ−３を含有する
細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバ
ッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製す
る。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６
〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーな
どのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッフ
ァーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低
減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花
王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなど
の界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さら
に、プロテアーゼによるＦＭ−３やニューロメジンＵの
分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４
（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアー
ゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０
ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜
５０００００ｃｐｍ）の標識したニューロメジンＵ（ニ
ューロメジンＵ誘導体として表されるニューロメジンＵ
の標識体）を添加し、同時に１０^-4〜１０^-1μＭの試験
化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知る
ために大過剰の未標識のニューロメジンＵを加えた反応
チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましく
は４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３
０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過
し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙
に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター
またはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない
場合のカウント(Ｂ₀)から非特異的結合量（ＮＳＢ）を
引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、
特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば８０％以下になる
試験化合物をＦＭ−３とニューロメジンＵとの結合性を
変化させる能力のある候補物質として選択することがで
きる。

【００２３】また、ＦＭ−３とニューロメジンＵとの結
合を測定する方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマシャム
ファルマシアバイオテク社製）を用いることもできる。
この方法では、ニューロメジンＵを装置に添付のプロト
コルに従ったアミノカップリング法によってセンサーチ
ップに固定し、ＦＭ−３を含有する細胞またはＦＭ−３
をコードするＤＮＡを含有する形質変換体から精製した
ＦＭ−３またはＦＭ−３を含む膜画分、あるいは精製し
たＦＭ−３またはＦＭ−３を含む膜画分および試験化合
物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなど
の緩衝液をセンサーチップ上を毎分２−２０μｌの流量
で通過させる。センサーチップ上のニューロメジンＵ
とＦＭ−３とが結合することによって生じる表面プラズ
モン共鳴の変化を共存する試験化合物が変化させること
を観察することによってＦＭ−３とニューロメジンＵと
の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうこ
とができる。この方法は、ＦＭ−３をセンサーチップに
固定し、ニューロメジンＵおよび試験化合物を含むリン
酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセ
ンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測定
することができる。試験化合物としては、上記と同様の
ものなどがあげられる。ニューロメジンＵとＦＭ−３と
の結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記
の〜の方法を実施するためには、ＦＭ−３を介する
細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコ
リン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性
など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて
測定することができる。具体的には、まず、ＦＭ−３を
含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。ス
クリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あ
るいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換
し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベート
した後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成し
た産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活
性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生
成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合
は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行
なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性につ
いては、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増
大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す
ることができる。

【００２４】細胞刺激活性を測定してスクリーニングを
行なうには、適当なＦＭ−３を発現した細胞が用いられ
る。本発明のＦＭ−３を発現した細胞としては、前述の
組換え型ＦＭ−３発現細胞株などが望ましい。形質変換
体であるＦＭ−３発現細胞は安定発現株でも一過性発現
株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様の
ものが用いられる。試験化合物としては、例えばペプチ
ド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵
生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など
があげられる。上記のリガンド・レセプターアッセイ系
について、さらに具体的に記載すると以下のようなアッ
セイ系が用いられる。

【００２５】（１）受容体発現細胞が受容体アゴニスト
によって刺激されると細胞内のＧタンパクが活性化され
てＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画
分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解され
てＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγ
Ｓを添加しておくとＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタン
パクに結合するが、加水分解されずにＧタンパクを含む
細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγ
Ｓを用いると細胞膜に残存した放射活性を測定すること
によって受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を
測定することができる。この反応を利用してニューロメ
ジンＵのＦＭ−３発現細胞に対する刺激活性を測定する
ことができる。この方法は、前記〜のようにＦＭ−
３を含む細胞を用いるものではなく、〜のようにＦ
Ｍ−３を含む膜画分を用いるアッセイ法であるが、〜
のように細胞刺激活性を測定するものであり、本測定
法においてＦＭ−３膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性
を示す物質はアゴニストである。ここにおいて、ニュー
ロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物
を添加し、ニューロメジンＵの単独投与に比べてＦＭ−
３細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性に変化が生じ
ることを観察することによってニューロメジンＵとＦＭ
−３との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす
ることができる。このとき、ニューロメジンＵによるＦ
Ｍ−３細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制す
る活性を示す化合物をＦＭ−３とニューロメジンＵとの
結合性を変化させる能力のある候補物質として選択する
ことができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＦＭ−
３細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を観察するこ
とによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともで
きる。スクリーニング法の一例についてより具体的に以
下に述べる。上述の方法によって調製したＦＭ−３を含
む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgC
l₂, 150 mM NaCl, 1 μM GDP, 0.1% BSA pH 7.4）で希
釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これ
をFalconb 2053に0.2mlずつ分注し、ニューロメジンＵ
あるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を加え、さ
らに終濃度200pMとなるように[³⁵S]GTPγSを加える。25
℃で1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（50 mM T
ris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0.1% BSA , 0.05% CHA
PS pH 7.4 1.5ml）を加えて、ガラス繊維ろ紙GF/Fでろ
過する。65℃、30分保温して乾燥後、液体シンチレーシ
ョンカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した
[³⁵S]GTPγSの放射活性を測定する。ニューロメジンＵ
のみを加えた実験区の放射活性を１００％、ニューロメ
ジンＵを加えなかった実験区の放射活性を０％とし、ニ
ューロメジンＵによるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する
試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性
が例えば８０％以下になる試験化合物をＦＭ−３とニュ
ーロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物
質として選択することができる。

【００２６】（２）ＦＭ−３発現細胞はニューロメジン
Ｕ刺激によって細胞内cAMP量が減少する場合、この反応
を利用してニューロメジンＵのＦＭ−３発現細胞に対す
る刺激活性を測定することができる。ＦＭ−３を発現さ
せた種々の動物細胞のcAMP産生量はマウス、ラット、ウ
サギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗cAMP抗体と
¹²⁵I標識cAMP（ともに市販品）を使用することによって
RIAあるいは抗cAMP抗体と標識cAMPとを組み合わせた他
のEIA系でも測定することができる。また抗cAMP抗体をp
rotein Aあるいは抗cAMP抗体産生に用いた動物のIgGな
どに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを
含むビーズと¹²⁵I標識cAMPとを使用するSPA法による定
量も可能である（アマシャムファルマシアバイオテク製
のキットを使用する）。本方法において、フォルスコリ
ンまたはカルシトニンなど細胞内cAMP量を増加させるよ
うなリガンドなどによって細胞内cAMP量を上昇させ、ニ
ューロメジンＵまたはニューロメジンＵおよび試験化合
物を添加することによってニューロメジンＵの単独投与
による細胞内cAMP量の抑制が変化することを観察し、ニ
ューロメジンＵとＦＭ−３の結合を変化させる化合物の
スクリーニングを行なうことができる。このとき、ニュ
ーロメジンＵによるＦＭ−３発現細胞のcAMP産生抑制活
性を阻害する活性を示す化合物をＦＭ−３とニューロメ
ジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質とし
て選択することができる。一方、試験化合物のみを添加
してcAMP産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活
性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができ
る。スクリーニング法をより具体的に以下に記載する。
ＦＭ−３を発現させたＣＨＯ細胞を24穴プレートに5 x
10⁴ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM
３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20
mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する
（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと
0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH
7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反
応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反
応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファ
ーを細胞に加えた後、2μMフォルスコリンを含む0.25ml
の反応用バッファーに1 nMのニューロメジンＵあるいは
1 nMのニューロメジンＵおよび試験化合物を添加したも
のを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。100μl
の20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１
時間置くことにより細胞内cAMPを抽出する。抽出液中の
cAMP量は、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバ
イオテク）を用いて測定する。フォルスコリン刺激によ
って産生されたcAMP量を100%とし、1 nMのニューロメジ
ンＵの添加によって抑制されたcAMP量を0%として、ニュ
ーロメジンＵによるcAMP産生抑制活性に対する試験化合
物の影響を算出する。ニューロメジンＵの活性を阻害し
てcAMP産生活性が例えば８０％以下になる試験化合物を
ＦＭ−３とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能
力のある候補物質として選択することができる。cAMP産
生促進活性を測定するには、フォルスコリンを添加せず
にＦＭ−３を発現させたＣＨＯ細胞に試験化合物を添加
して産生されたcAMPを上記の方法で定量する。この場合
は、ｃＡＭＰの産生活性が例えば１０％以上の試験化合
物をＦＭ−３とニューロメジンＵとの結合性を変化させ
る能力のある候補物質として選択することができる。

【００２７】（３）CRE（cAMP response element）を含
むＤＮＡを、ピッカジーンベイシックベクターまたは
ピッカジーンエンハンサーベクター（東洋インキ製造
（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニ
ングサイトに挿入し、これをCRE−レポーター遺伝子ベ
クターとする。CRE−レポーター遺伝子ベクターをトラ
ンスフェクションした細胞において、cAMP上昇を伴う刺
激は、CREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに
引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。
つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、CR
E−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のcAMP量の変
動を検出することができる。CRE−レポーター遺伝子ベ
クターをＦＭ−３発現細胞にトランスフェクションした
細胞を利用してニューロメジンＵとＦＭ−３の結合を変
化させる化合物のスクリーニングを行なうことができ
る。具体的なスクリーニング法を以下に記す。CRE−レ
ポーター遺伝子導入ＦＭ−３発現細胞を24穴プレートに
5 x 10³ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を
0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BS
Aと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄
する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチ
ンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー
(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの
反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。
反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッフ
ァーを細胞に加えた後、1 nMのニューロメジンＵあるい
は1 nMのニューロメジンＵおよび試験化合物と2μMフォ
ルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを細胞に加
え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン
用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解
液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ル
シフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シン
チレーションカウンターまたはトップカウンターにより
測定する。ニューロメジンＵとＦＭ−３の結合を変化
させる化合物の影響はルシフェラーゼによる発光量をニ
ューロメジンＵを単独で投与した場合と比較することに
よって測定することができる。このとき、ニューロメジ
ンＵの投与によりフォルスコリン刺激による発光量の増
加が抑制されるが、この抑制を回復させる化合物をＦＭ
−３とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力の
ある候補物質として選択することができる。一方、試験
化合物のみを投与し、フォルスコリン刺激によって上昇
した発光量のニューロメジンＵと同様な抑制を観察する
ことによりアゴニストのスクリーニングを行なうことも
できる。レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外
に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラク
トシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター
遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測
定キットを用いて容易に測定することができる。アルカ
リフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Pho
s 530によって、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferas
e）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenico
l Acetyltransferase Assay Kitによって、β−ガラク
トシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEに
よって測定することができる。

【００２８】（４）ＦＭ−３発現細胞がニューロメジン
Ｕ刺激によってアラキドン酸代謝物を細胞外に放出する
場合、あらかじめ、放射活性を有するアラキドン酸を細
胞に取り込ませておくことによって、この活性を細胞外
に放出された放射活性を測定することによって測定する
ことができる。このとき、ニューロメジンＵあるいはニ
ューロメジンＵおよび試験化合物を添加して、ニューロ
メジンＵのアラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を
調べることにより、ニューロメジンＵとＦＭ−３の結合
に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことが
できる。このとき、ニューロメジンＵによるアラキドン
酸代謝物放出活性を阻害する化合物をＦＭ−３とニュー
ロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質
として選択することができる。また、試験化合物のみを
添加し、ＦＭ−３発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活
性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のス
クリーニングを行なうこともできる。ニューロメジンＵ
とＦＭ−３の結合に影響を与える化合物のスクリーニン
グ法より具体的に以下に述べる。ＦＭ−３を発現させた
ＣＨＯ細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種
し、24時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25 μCi/well
となるよう添加する。[³H]アラキドン酸添加16時間後、
細胞を0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファ
ー(pH7.4)で洗浄し、各wellに0.05% BSAと20mM HEPES
を含むハンクスバッファー(pH7.4)に溶解した終濃度10
nMのニューロメジンＵあるいは10 nMのニューロメジン
Ｕおよび試験化合物を含むバッファー500 μlを添加す
る。以降、0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッ
ファー(pH7.4)を反応用バッファーと呼ぶ。37℃で60分
間インキュベートした後に、反応液400 μlをシンチレ
ーターに加え、反応液中に遊離した[³H]アラキドン酸代
謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定す
る。ニューロメジンＵの非添加反応バッファーによる培
地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を０％とし、10 nM
のニューロメジンＵを添加したときのたときの培地中の
[³H]アラキドン酸代謝物の量を１００％として試験化合
物のニューロメジンＵとＦＭ−３の結合に対する影響を
算出する。アラキドン酸代謝物産生活性が例えば５０％
以下になる試験化合物をＦＭ−３とニューロメジンＵと
の結合性を変化させる能力のある候補物質として選択す
ることができる。

【００２９】（５）ＦＭ−３発現細胞をニューロメジン
Ｕによって刺激することによって細胞内のCa²⁺濃度が上
昇する場合、これを利用することによってニューロメジ
ンＵとＦＭ−３の結合に対する試験化合物の影響を調べ
ることができる。ＦＭ−３発現細胞を、滅菌した顕微鏡
用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を4 mM Fura-
2 AM（同仁化学研究所）を縣濁したHBSSに置換し、室温
で2時間30分おく。HBSSで洗浄した後、キュベットにカ
バーグラスをセットし、蛍光測定器で、ニューロメジン
ＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を加えた
ときの励起波長340nm及び380nmでの505nmの蛍光強度の
比の上昇を測定する。このとき、ニューロメジンＵを単
独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって生
じる蛍光強度の変化を測定することによりニューロメジ
ンＵとＦＭ−３の結合に対して影響を与える化合物のス
クリーニングを行なうことができる。また、以下のよう
にFLIPR（モレキュラーデバイス社製）を使うこともで
きる。すなわち、細胞縣濁液にFluo-3 AM（同仁化学研
究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心
により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。FLIP
R装置にセットし、Fura-2 AMの場合と同様にニューロメ
ジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を加
え、ニューロメジンＵを単独で投与したときに比べて試
験化合物の添加によって観測される蛍光強度が変化する
ことを測定することにより、ニューロメジンＵとＦＭ−
３の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニング
を行なうことができる。これらにおいて、ニューロメジ
ンＵによる蛍光強度の上昇を抑制する化合物をＦＭ−３
とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある
候補物質として選択することができる。一方、試験化合
物のみの添加による蛍光強度の上昇を観察することによ
ってアゴニストのスクリーニングを行なうこともでき
る。ＦＭ−３発現細胞にaequorinなどのように細胞内Ca
²⁺イオンの上昇によって発光するようなタンパク質の遺
伝子を共発現させておき、細胞内Ca²⁺イオン濃度の上昇
によってaequorinがCa²⁺結合型となり発光することを利
用して、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵお
よび試験化合物を加え、ニューロメジンＵを単独で投与
したときに比べて試験化合物の添加によって観測される
発光強度が変化することを測定することにより、ニュー
ロメジンＵとＦＭ−３の結合に対して影響を与える化合
物のスクリーニングを行なうことができる。方法は、蛍
光物質を取り込ませないこと以外は上記と同様である。

【００３０】（６）受容体を発現する細胞に受容体アゴ
ニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度
が上昇することが知られている。ニューロメジンＵによ
って生じるＦＭ−３細胞におけるこの反応を観察するこ
とによりニューロメジンＵとＦＭ−３の結合に影響を与
える化合物のスクリーニングを行なうことができる。２
４穴プレートに播いて１日目の細胞にmyo-[2-³H]inosit
ol (2.5マイクロCi/well)を添加した培地中で１日培養
した細胞を、よく洗浄後、ニューロメジンＵあるいはニ
ューロメジンＵおよび試験化合物を添加した後、10%過
塩素酸を加え反応を止める。1.5 M KOH, 60mM HEPES溶
液で中和し、0.5mlのAG1x8樹脂 (Bio-Rad)を詰めたカラ
ムに通し、5mM Na₂BO₃ 60mM HCOONH₄で洗浄した後、１M
HCOONH₄0.1M HCOOHで溶出した放射活性を液体シンチ
レーションカウンターで測定する。ニューロメジンＵの
非添加反応バッファーによる培地中の放射活性を0%と
し、ニューロメジンＵを添加したときの培地中の放射活
性を１００％として試験化合物のニューロメジンＵとＦ
Ｍ−３の結合に対する影響を算出する。イノシトール三
リン酸産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物を
ＦＭ−３とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能
力のある候補物質として選択することができる。一方、
試験化合物のみの添加によるイノシトール三リン酸産生
上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニン
グを行なうこともできる。

【００３１】（７）TRE（TPA response element）を含
むＤＮＡを、ピッカジーンベイシックベクターまたは
ピッカジーンエンハンサーベクター（東洋インキ製造
（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニ
ングサイトに挿入し、これをTRE−レポーター遺伝子ベ
クターとする。 TRE−レポーター遺伝子ベクターをトラ
ンスフェクションした細胞において、細胞内Ca²⁺上昇
を伴う刺激は、 TREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現
とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘
導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することに
より、TRE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカ
ルシウム量の変動を検出することができる。 TRE−レポ
ーター遺伝子ベクターをＦＭ−３発現細胞にトランスフ
ェクションした細胞を利用したニューロメジンＵとＦＭ
−３の結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニン
グ法を以下に記す。TRE−レポーター遺伝子導入ＦＭ−
３発現細胞を24穴プレートに5 x 10³ cell/wellで播種
し、48時間培養する。細胞を0.05% BSAと20mM HEPESを
含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した後、10 nMの
ニューロメジンＵあるいは10 nMのニューロメジンＵお
よび試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させ
る。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造
（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造
（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ル
ミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたは
トップカウンターにより測定する。ニューロメジンＵ
とＦＭ−３の結合を変化させる化合物の影響は、ルシフ
ェラーゼによる発光量をニューロメジンＵを単独で投与
した場合と比較することによって測定することができ
る。このとき、ニューロメジンＵの投与により細胞内Ca
²⁺の上昇によって発光量が増加するが、この増加を抑制
する化合物をＦＭ−３とニューロメジンＵとの結合性を
変化させる能力のある候補物質として選択することがで
きる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジン
Ｕと同様な発光量の増加を観察することによりアゴニス
トのスクリーニングを行なうこともできる。レポーター
遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフ
ォスファターゼ、クロランフェニコールアシルトラン
スフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いるこ
ともできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の
酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易
に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活
性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chlo
ramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光
純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase A
ssay Kitによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例え
ば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することがで
きる。（８）ニューロメジンＵに応答したＦＭ−３発現細胞に
ついてMAP kinase活性化によって増殖が観察される場
合、この増殖をMAP kinase活性、チミジン取り込み、細
胞数測定（MTTなど）によって測定することができる。
これを利用してニューロメジンＵとＦＭ−３の結合を変
化させる化合物のスクリーニングを行なうことができ
る。MAP kinase活性は、ニューロメジンＵあるいはニュ
ーロメジンＵおよび試験化合物を細胞に添加した後、細
胞溶解液から抗MAP kinase抗体を用いた免疫沈降によっ
てMAP kinase分画を得た後、例えば和光純薬製MAP Kina
se Assay Kitとγ-[ ³²P]-ATPを使用して容易に測定でき
る。チミジン取り込み活性は、ＦＭ−３発現細胞を播
き、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび
試験化合物を添加した後、[methyl-³H]-チミジンを加
え、その後、細胞内に取り込まれた標識チミジンの放射
活性を細胞を溶解して液体シンチレーションカウンター
で計数することによって測定することができる。ＦＭ−
３発現細胞の増殖は、発現細胞を播き、ニューロメジン
ＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を添加し
た後にMTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphen
yl-2H-tetrazolium bromide) を添加し、細胞内に取り
込まれてMTTが変化したMTTホルマザンを塩酸酸性とした
イソプロパノールで細胞を溶解した後、570 nmの吸収を
測定することによっても測定できる。ニューロメジンＵ
とＦＭ−３の結合を変化させる化合物の、標識チミジン
取り込み活性を利用した具体的なスクリーニング法を以
下に記す。ＦＭ−３発現細胞を２４穴プレートにウェル
当たり５０００個まき一日間培養する。次に血清を含ま
ない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。ニュ
ーロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合
物を細胞に添加して２４時間培養した後、[methyl-³H]-
チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し６時間
培養する。細胞をＰＢＳ（−）で洗った後、メタノール
を添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸
を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で
４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解
し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウン
ターで測定する。ニューロメジンＵとＦＭ−３の結合を
変化させる化合物の影響は、チミジン取り込みによる放
射活性の上昇をニューロメジンＵを単独で投与した場合
と比較することによって測定することができる。このと
き、ニューロメジンＵの投与による放射活性の増加を抑
制する化合物をＦＭ−３とニューロメジンＵとの結合性
を変化させる能力のある候補物質として選択することが
できる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジ
ンＵと同様な放射活性の増加を観察することによりアゴ
ニストのスクリーニングを行なうこともできる。

【００３２】（９）ＦＭ−３発現細胞にニューロメジン
Ｕを添加すると、K channelが活性化し、細胞内にあるK
イオンが、細胞外に流出する場合、Kイオンと同族元素
であるRbイオンは、Kイオンと区別無くK channelを通っ
て細胞外に流出するので、細胞に標識Rb ([⁸⁶Rb])を添
加して取り込ませておいた後、ニューロメジンＵの刺激
によって流出する[⁸⁶Rb]の流れを測定することでニュー
ロメジンＵの作用を測定できる。ニューロメジンＵとＦ
Ｍ−３の結合を変化させる化合物の、[⁸⁶Rb]流出活性を
利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。２４
穴にまいて２日後のＦＭ−３発現細胞を１mCi/mlの⁸⁶Rb
Clを含む培地中で２時間保温する。培地をよく洗浄し、
外液中の⁸⁶RbClを完全に除く。ニューロメジンＵあるい
はニューロメジンＵおよび試験化合物を細胞に添加して
３０分後の外液を回収し、γカウンターで放射活性を測
定する。ニューロメジンＵとＦＭ−３の結合を変化させ
る化合物の影響は、[⁸⁶Rb]流出による放射活性の上昇を
ニューロメジンＵを単独で投与した場合と比較すること
によって測定することができる。このとき、ニューロメ
ジンＵの投与による放射活性の上昇を抑制する化合物を
ＦＭ−３とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能
力のある候補物質として選択することができる。一方、
試験化合物のみを投与し、ニューロメジンＵと同様な放
射活性の上昇を観察することによりアゴニストのスクリ
ーニングを行なうこともできる。

【００３３】（１０）ＦＭ−３発現細胞がニューロメジ
ンＵに反応して変化する細胞外のpH（acidification ra
te）をサイトセンサー装置（モレキュラーデバイス社）
を使用して測定することによって、ニューロメジンＵ
の活性を測定することができる。サイトセンサー装置を
利用した、細胞外ｐＨ変化の測定をすることによるニュ
ーロメジンＵとＦＭ−３の結合を変化させる化合物の具
体的なスクリーニング法を以下に記す。ＦＭ−３発現細
胞をサイトセンサー装置用のカプセル内で終夜培養し、
装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するま
で約2時間0.1% BSAを含むRPMI1640培地（モレキュラー
デバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、ニュ
ーロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合
物を含む培地を細胞上に灌流させることによって生じる
培地のpH変化を測定する。ニューロメジンＵとＦＭ−３
の結合を変化させる化合物の影響は、ＦＭ−３発現細胞
の細胞外ｐＨ変化をニューロメジンＵを単独で投与した
場合と比較することによって測定することができる。こ
のとき、ニューロメジンＵの投与による細胞外ｐＨ変化
を抑制する化合物をＦＭ−３とニューロメジンＵとの結
合性を変化させる能力のある候補物質として選択するこ
とができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロ
メジンＵと同様な細胞外ｐＨ変化を観察することにより
アゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

【００３４】（１１）酵母（Saccharomyces cerevisia
e）のhaploidα-mating Type (MATα)の性フェロモン受
容体STe2はG蛋白Gpa1とカップルしており、性フェロモ
ンα-mating factorに応答してMAP kinaseを活性化し、
以下、Far1 (cell-cycle arrest) および転写活性化因
子Ste12が活性化される。Ste12は接合に関与するFUS1を
含む種々の蛋白の発現を誘導する。一方、制御因子Sst2
は以上の過程に抑制的に機能する。この系において、受
容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニスト
刺激によって酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、
その結果生じる増殖などの指標を用いた、受容体アゴニ
ストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている
（Pausch, M. H., Trends in Biotechnology, vol. 15,
pp. 487-494(1997)）。このような受容体遺伝子導入酵
母の系を利用してニューロメジンＵおよびＦＭ−３の結
合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことが
できる。MATα酵母のSte2およびGpa1をコードする遺伝
子を除去し、代わりにＦＭ−３遺伝子およびGpa1-Gai2
融合蛋白をコードする遺伝子を導入する。Farをコード
する遺伝子を除去してcell-cycle arrestが生じないよ
うにし、また、Sstをコードする遺伝子を除去すること
によってニューロメジンＵに対する応答の感度を向上さ
せておく。さらに、FUS1にヒスチジン生合成遺伝子HIS3
をつなげたFUS1-HIS3遺伝子を導入する。以上の遺伝子
組換え操作は例えば、Priceら（Price, L. A.et al., M
olecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188-6
195 (1995)）の報告に記載の方法において、ソマトスタ
チン受容体タイプ２（SSTR2）遺伝子をＦＭ−３遺伝子
に置き換えて実施することによって容易に行なうことが
できる。こうして構築された形質転換酵母はＦＭ−３の
リガンドであるニューロメジンＵに高感度で反応し、そ
の結果MAPキナーゼの活性化が起きてヒスチジン生合成
酵素が合成されるようになって、ヒスチジン欠乏培地で
生育可能になる。これを利用して、ヒスチジン欠乏培地
での酵母の生育を指標としてニューロメジンＵによるＦ
Ｍ−３発現酵母の応答を観察することができる。以下に
ニューロメジンＵおよびＦＭ−３の結合を変化させる化
合物のスクリーニング法を述べる。上記のようにして作
製された形質変換酵母を完全合成培地の液体培地で終夜
培養し、2 x 10⁴ cell/mlの濃度でヒスチジンを除去し
た溶解寒天培地に加え、9 x9 cmの角形シャーレに播
く。寒天が固化した後、ニューロメジンＵあるいはニュ
ーロメジンＵおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙
を寒天表面におき、30℃で３日間培養する。ニューロメ
ジンＵとＦＭ−３の結合を変化させる化合物の影響は、
濾紙の周囲の酵母の生育をニューロメジンＵを単独で投
与した場合と比較することによって測定することができ
る。このとき、ニューロメジンＵの投与による酵母の生
育を抑制する化合物をＦＭ−３とニューロメジンＵとの
結合性を変化させる能力のある候補物質として選択する
ことができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニュー
ロメジンＵと同様な酵母の生育を観察することによりア
ゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。ま
た、あらかじめ、寒天培地にニューロメジンＵを添加し
ておいて滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて培養
し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を
受けることを観察することによってもニューロメジンＵ
とＦＭ−３の結合を変化させる化合物の影響を調べるこ
とができる。

【００３５】（１２）ＦＭ−３遺伝子ＲＮＡをアフリ
カツメガエル卵母細胞に注入し、ニューロメジンＵによ
って刺激すると細胞内Ca²⁺イオン濃度が上昇して、calc
ium-activated chloride currentが生じる。これを膜電
位の変化としてとらえることが出来る（Kイオン濃度勾
配に変化がある場合も同様）。ニューロメジンＵによっ
て生じるＦＭ−３導入アフリカツメガエル卵母細胞にお
けるこの反応を観察することによりニューロメジンＵと
ＦＭ−３の結合に影響を与える化合物のスクリーニング
を行なうことができる。氷冷して動けなくなった雌のア
フリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊を,ＭＢ
Ｓ液（88mM NaCl, 1mM KCl, 0.41mM CaCl₂, 0.33mM Ca
(NO₃)₂, 0.82mM MgSO₄, 2.4mM NaHCO₃, 10mM HEPES, pH
7.4）に溶かしたコラーゲナーゼ(0.5mg/ml)で卵塊がほ
ぐれるまで１９℃、1-６時間、 150rpmで処理する。外
液をMBS液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニ
ピュレーターでＦＭ−３mRNA (50ng/50nl)をマイクロイ
ンジェクションする。ＦＭ−３mRNAは、組織や細胞から
調製しても、plasmidからin vitroで転写してもよい。
これをMBS液中で２０℃で３日培養する。これをRinger
液を流しているvoltage clamp装置のくぼみに置き、電
位固定用ガラス微小電極、電位測定用ガラス微小電極を
細胞内に刺入し、(-)極は、細胞外に置く。電位が安定
したら、ニューロメジンＵまたはニューロメジンＵおよ
び試験化合物を含むRinger液を流して電位変化を記録す
る。ニューロメジンＵとＦＭ−３の結合を変化させる化
合物の影響は、ＦＭ−３導入アフリカツメガエル卵母細
胞の細胞膜電位変化をニューロメジンＵを単独で投与し
た場合と比較することによって測定することができる。
このとき、ニューロメジンＵの投与による細胞膜電位変
化を抑制する化合物をＦＭ−３とニューロメジンＵとの
結合性を変化させる能力のある候補物質として選択する
ことができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニュー
ロメジンＵと同様な細胞膜電位変化を観察することによ
りアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
この系において、反応を変化量を増大して測定しやすい
ように各種のＧタンパク質遺伝子のpoly(A)⁺ RNAを導入
することもできる。またaequorinのようなCa²⁺存在下で
発光を生じるようなタンパクの遺伝子のpoly(A)⁺RNAを
共インジェクションすることにより膜電位変化ではなく
発光を観察してこの反応を測定することもできる。ニュ
ーロメジンＵとＦＭ−３との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング用キットは、ＦＭ−３、
ＦＭ−３を含有する細胞、あるいはＦＭ−３を含有する
細胞の膜画分、およびニューロメジンＵを含有するもの
である。

【００３６】本発明のスクリーニング用キットの例とし
ては、次のものがあげられる。１．スクリーニング用試薬測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。ＦＭ−３標品ＦＭ−３を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに
５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％
ａｉｒで２日間培養したもの。標識リガンド〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
たニューロメジンＵ。適当な溶媒または緩衝液に溶解し
たものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定
用緩衝液にて１μＭに希釈する。リガンド標準液ニューロメジンＵを０.１％ウシ血清アルブミン（シグ
マ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−
２０℃で保存する。２．測定法１２穴組織培養用プレートにて培養したＦＭ−３を発
現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した
後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識したニューロメジンＵを５μｌ加え、室温にて
１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験
化合物のかわりに１０^-3ＭのニューロメジンＵを５μｌ
加えておく。反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識したニューロメジンＵを０.２
ＮＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シン
チレーターＡ（和光純薬製）と混合する。液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式で求める。式ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１０
０ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ：検体を加えた時の値ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）Ｂ₀ ：最大結合量本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キ
ットを用いて得られる化合物またはその塩は、ニューロ
メジンＵとＦＭ−３との結合を変化させる（結合を阻害
あるいは促進する）化合物であり、具体的にはＦＭ−３
を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆるＦＭ−
３アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物
（いわゆるＦＭ−３アンタゴニスト）である。該化合物
としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物
は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっ
てもよい。

【００３７】上記ＦＭ−３アゴニストであるかアンタゴ
ニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）また
は（ii）に従えばよい。（ｉ）前記〜のスクリーニング方法で示されるバイ
ンディング・アッセイを行い、ニューロメジンＵとＦＭ
−３との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）
化合物を得た後、該化合物が上記したＦＭ−３を介する
細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激
活性を有する化合物またはその塩はＦＭ−３アゴニスト
であり、該活性を有しない化合物またはその塩はＦＭ−
３アンタゴニストである。 (a)試験化合物をＦＭ−３を含有する細胞に接触させ、
上記ＦＭ−３を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺
激活性を有する化合物またはその塩はＦＭ−３アゴニス
トである。 (b)ＦＭ−３を活性化する化合物（例えば、ニューロメ
ジンＵまたはＦＭ−３アゴニストなど）をＦＭ−３を含
有する細胞に接触させた場合と、ＦＭ−３を活性化する
化合物および試験化合物をＦＭ−３を含有する細胞に接
触させた場合における、ＦＭ−３を介した細胞刺激活性
を測定し、比較する。ＦＭ−３を活性化する化合物に
よる細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は
ＦＭ−３アンタゴニストである。該ＦＭ−３アゴニスト
は、ＦＭ−３に対するニューロメジンＵが有する生理活
性と同様の作用を有しているので、ニューロメジンＵ
と同様に安全で低毒性な医薬として有用である。逆に、
ＦＭ−３アンタゴニストは、ＦＭ−３に対するニューロ
メジンＵが有する生理活性を抑制することができるの
で、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬と
して有用である。

【００３８】ニューロメジンＵまたはその塩は平滑筋収
縮作用、血圧上昇作用、腸管におけるイオン輸送の調
節、皮下投与後のＡＣＴＨおよびそれに引き続くコルチ
コステロンの上昇などに関与していることから、低血圧
症予防・治療剤や局所血管収縮剤、下垂体ホルモン分泌
不全治療薬などとして利用できるため、上記のスクリー
ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら
れる化合物のうち、ＦＭ−３アゴニストは低血圧症予防
・治療剤や局所血管収縮剤、下垂体ホルモン分泌不全治
療薬などとして用いることができ、ＦＭ−３アンタゴニ
ストは高血圧症、心筋梗塞、急性腎不全、ストレス性疾
患（例えば、心血管系の疾患（狭心症、心筋梗塞、不
整脈など）呼吸器系の疾患（気管支喘息、過呼吸症候
群など）筋骨格系の疾患（慢性関節リウマチ、腰痛
症、片頭痛、緊張性頭痛など）、その他（糖尿病、更
年期障害、慢性疼痛、免疫力低下など）、消化器系疾患
（胃潰瘍、潰瘍性大腸炎など）などの予防・治療薬など
として用いることができる。また、ニューロメジンＵま
たはその塩は食欲調節作用を有していることから、その
食欲調節作用に基づいて、上記のスクリーニング方法ま
たはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物の
うち、ＦＭ−３アゴニストは食欲抑制剤、抗肥満剤、過
食症治療薬、多食症治療薬などとして、またＦＭ３アン
タゴニストは食欲促進剤などとして用いることができ
る。上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用
キットを用いて得られうる化合物の塩としては、例え
ば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、
無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機
酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげ
られる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナ
トリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシ
ウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、な
らびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ
る。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメ
チルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、
２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールア
ミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、
ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレ
ンジアミンなどとの塩あげられる。無機酸との塩の好適
な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸
などとの塩があげられる。有機酸との塩の好適な例とし
ては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シ
ュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リ
ンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息
香酸などとの塩があげられる。塩基性アミノ酸との塩の
好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチ
ニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例
としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などと
の塩があげられる。本発明のスクリーニング方法または
スクリーニング用キットを用いて得られうる化合物また
はその塩を上述の医薬として使用する場合には、以下に
記載するとおりに使用することができる。

【００３９】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその
塩を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って
実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸
溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マ
イクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もし
くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、
または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき
る。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認めら
れる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定
剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要
求される単位用量形態で混和することによって製造する
ことができる。これら製剤における有効成分量は指示さ
れた範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加
剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガ
ントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロ
ースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アル
ギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウム
のような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのよう
な甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーの
ような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセ
ルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよ
うな液状担体を含有することができる。注射のための無
菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡
麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解ま
たは懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方
することができる。注射用の水性液としては、例えば、
生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液
（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化
ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、
たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアル
コール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソ
ルベート８０（^TM）、ＨＣＯ−５０）などと併用しても
よい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、
溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコー
ルなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン
酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば温血動物（例えば、ヒト、モルモット、ラ
ット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワ
トリなど）、両生類（例えば、カエルなど）および魚類
などに対して投与することができる。本発明のスクリー
ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら
れる化合物（特にアンタゴニスト）またはその塩の投与
量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、
一般的に成人の高血圧症患者（体重６０ｋｇとして）に
おいては、一日につき約０.１から１０００ｍｇ、好ま
しくは約１．０から３００ｍｇ、より好ましくは約３．
０から５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、そ
の１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによって
も異なるが、たとえば注射剤の形では成人の高血圧症患
者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日に
つき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１
から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍ
ｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他
の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与す
ることができる。上記の本発明のラット型ＦＭ−３、即
ち、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列、配
列番号：１９で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０
個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個
以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配
列、または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列
に１個以上３０個以下のアミノ酸が付加し、かつ配列番
号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個
以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配
列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩に対
する抗体について、以下に詳細に説明する。本発明のラ
ット型ＦＭ−３またはその塩に対する抗体は、本発明の
ラット型ＦＭ−３またはその塩を認識し得る抗体であれ
ば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れで
あってもよい。

【００４０】本発明のラット型ＦＭ−３またはその塩
（以下、本発明のラット型ＦＭ−３と略記する場合もあ
る）に対する抗体は、本発明のラット型ＦＭ−３を抗原
として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従
って製造することができる。〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製本発明のラット型ＦＭ−３は、哺乳動物に対して投与に
より抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６
週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いら
れる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、
モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられ
るが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノ
クローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫
された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗
体価の測定は、例えば、標識化ラット型ＦＭ−３と抗血
清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を
測定することにより行なうことができる。融合操作は既
知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネ
イチャー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５
年）〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が
好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２
０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１００
０〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加
され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約
１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細
胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる
が、例えば、本発明のラット型ＦＭ−３抗原を直接ある
いは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレー
ト）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物
質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融
合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロ
ブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、
固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗
免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固
相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵
素などで標識したラット型ＦＭ−３を加え、固相に結合
したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられ
る。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそ
れに準じる方法に従って行なうことができるが、通常は
ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）
を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。
選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育
できるものならばどのような培地を用いても良い。例え
ば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血
清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイ
ブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製
薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通
常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００４１】（ｂ）モノクロナール抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のラット型ＦＭ−
３に対するポリクローナル抗体は、それ自体公知あるい
はそれに準じる方法にしたがって製造することができ
る。例えば、免疫抗原（レセプター蛋白質の抗原）とキ
ャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクロー
ナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該
免疫動物から本発明のラット型ＦＭ−３に対する抗体含
有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製
造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋
白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、
キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体
が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架
橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシ
サイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシア
ニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、
好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いら
れる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、
種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデ
ヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオ
ール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬
等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週
毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができ
る。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺
乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取する
ことができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定
は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定でき
る。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクロ
ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精
製法に従って行なうことができる。本発明のラット型Ｆ
Ｍ−３に対する抗体は、本発明のラット型ＦＭ−３を特
異的に認識することができるので、被検液中の本発明の
レセプター蛋白質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法
による定量などに使用することができる。すなわち、本
発明は、例えば、（ｉ）本発明のラット型ＦＭ−３に対
する抗体と、被検液および標識化ラット型ＦＭ−３とを
競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ラット型Ｆ
Ｍ−３の割合を測定することを特徴とする被検液中のラ
ット型ＦＭ−３の定量法、（ii）被検液と担体上に不溶
化した本発明のラット型ＦＭ−３に対する抗体および標
識化された本発明のラット型ＦＭ−３に対する抗体とを
同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の
標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本
発明のラット型ＦＭ−３の定量法を提供する。上記（i
i）においては、一方の抗体が本発明のラット型ＦＭ−
３のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のラ
ット型ＦＭ−３のＣ端部に反応する抗体であることが好
ましい。本発明のラット型ＦＭ−３に対するモノクロー
ナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する
場合がある）を用いて本発明のラット型ＦＭ−３の測定
を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうことも
できる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いて
もよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、ある
いはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明のラット型ＦＭ
−３に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべ
きものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ラット
型ＦＭ−３量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗
原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、
これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準
曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用
いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノ
メトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる
が、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用
いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用い
られる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵
素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位
元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、
〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記酵素として
は、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β
−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフ
ォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵
素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フル
オレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど
が用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノー
ル、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど
が用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との
結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。抗
原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いて
もよく、また通常、蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固
定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよ
い。担体としては、例えば、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が用いられる。サンドイッチ法においては不溶化
した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ
（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナ
ル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の
標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明の
ラット型ＦＭ−３量を定量することができる。１次反応
と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法によるレセプター蛋白質の測定法
においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の
モノクローナル抗体はラット型ＦＭ−３の結合する部位
が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応
および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応
で用いられる抗体が、ラット型ＦＭ−３のＣ端部を認識
する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ
端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測
定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法ある
いはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法
では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合
的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体
と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、
Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を
定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用
い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に
対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体
として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可
溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固
相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検
液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対し
て競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるい
は、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に
結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれ
かの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗
原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定す
る。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか
得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザー
ネフロメトリーなどが好適に用いられる。これら個々の
免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっ
ては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。そ
れぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通
常の技術的配慮を加えて本発明のラット型ＦＭ−３また
はその塩の測定系を構築すればよい。これらの一般的な
技術手段の詳細については、総説、成書などを参照する
ことができる〔例えば、入江寛編「ラジオイムノアッ
セイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラ
ジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石
川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年
発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）
（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免
疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、
「メソッズ・イン・エンジモノジー（Methods in ENZYM
OLOGY）」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part
A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part
B))、同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part
C))、同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part
D:Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92(Immunoche
mical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodiesand G
eneral Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121(Immun
ochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology a
nd Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレ
ス社発行)など参照〕。また、本発明のラット型ＦＭ−
３に対する抗体は、体液や組織などの被検体中に存在す
る本発明のラット型ＦＭ−３を特異的に検出するために
使用することができる。また、本発明のラット型ＦＭ−
３を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時
の各分画中の本発明のラット型ＦＭ−３の検出、被検細
胞内における本発明のラット型ＦＭ−３の挙動の分析な
どのために使用することができる。

【００４２】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＹ：チミンまたはシトシンＮ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニンＲ：アデニンまたはグアニンＭ：シトシンまたはアデニンＷ：チミンまたはアデニンＳ：シトシンまたはグアニンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＴＦＡ：トリフルオロ酢酸ＥＩＡ：エンザイムイムノアッセイＧｌｙまたはＧ：グリシンＡｌａまたはＡ：アラニンＶａｌまたはＶ：バリンＬｅｕまたはＬ：ロイシンＩｌｅまたはＩ：イソロイシンＳｅｒまたはＳ：セリンＴｈｒまたはＴ：スレオニンＣｙｓまたはＣ：システインＭｅtまたはＭ：メチオニンＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ：リジンＡｒｇまたはＲ：アルギニンＨｉｓまたはＨ：ヒスチジンＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニンＴｙｒまたはＹ：チロシンＴｒｐまたはＷ：トリプトファンＰｒｏまたはＰ：プロリンＡｓｎまたはＮ：アスパラギンＧｌｎまたはＱ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｍｅ：メチル基Ｅt ：エチル基Ｂｕ：ブチル基Ｐｈ：フェニル基ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチルＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドンＰＡＭ：フェニルアセトアミドメチル

【００４３】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミドＢｚｌ：ベンジルＺ：ベンジルオキシカルボニルＢｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルＣｌ−Ｚ：２−クロルベンジルオキシカルボニルＢｏｃ：t−ブチルオキシカルボニルＨＯＢt ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドＴＦＡ：トリフルオロ酢酸Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルＤＮＰ：ジニトロフェニルＢｕｍ：ターシャリーブトキシメチルＴｒt ：トリチルＢＳＡ：ウシ血清アルブミンＣＨＡＰＳ：３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１ −プロパンスルホナートＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリドＥ６４：（Ｌ−３−trans−カルボキオキシラン−２−カルボニル）Ｌ−ロイシル−アグマチンＧＤＰ：グアノシン−５’−二リン酸ＭＥＭα ：ミニマムエッセンシャルメジウムアルファＦｕｒａ−２ＡＭ：1-[6-アミノ-2-(5-カルボキシ-2-オキサゾリル)-5-ベンゾフラニロキシ]-2-(2-アミノ-5メチルフェノキシ)-エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステルＨＢＳＳ：ハンクス平衡塩液Ｆｌｕｏ−３ＡＭ：1-[2-アミノ-5-(2,7-ジクロロ-6-ヒドロキシ-3-オキシ-9- キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N' -四酢酸ペンタアセトキシメチルエステルＨＥＰＥＳ：２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル] エタンスルホン酸ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジルＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン

【００４４】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。〔配列番号：１〕ヒト型ＦＭ３をコードするアミノ酸配
列を示す。〔配列番号：２〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を含有するヒト型ＦＭ−３をコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。〔配列番号：３〕マウス型ＦＭ−３をコードするアミノ
酸配列を示す。〔配列番号：４〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を含有するマウス型ＦＭ−３をコードするＤＮＡの塩基
配列を示す。〔配列番号：５〕ブタ型ニューロメジンＵ−８をコード
するアミノ酸配列を示す。〔配列番号：６〕イヌ型ニューロメジンＵ−８をコード
するアミノ酸配列を示す。〔配列番号：７〕ニワトリ型ニューロメジンＵ−９をコ
ードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：８〕モルモット型ニューロメジンＵ−９を
コードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：９〕ラット型ニューロメジンＵ−２３をコ
ードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１０〕カエル型ニューロメジンＵ−２３を
コードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１１〕ヒト型ニューロメジンＵ−２５をコ
ードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１２〕ブタ型ニューロメジンＵ−２５をコ
ードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１３〕イヌ型ニューロメジンＵ−２５をコ
ードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１４〕ニワトリ型ニューロメジンＵ−２５
をコードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１５〕カエル型ニューロメジンＵ−２５を
コードするアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１６〕ニューロメジンＵ−２５の部分ペプ
チドをコードするアミノ酸配列を示す。配列番号：５で
表されるアミノ酸配列の第４番目〜第８番目のアミノ酸
配列を示す。〔配列番号：１７〕実施例１で用いられたＦＭ３Ｆ２の
塩基配列を示す。〔配列番号：１８〕実施例１で用いられたＦＭ３Ｒ２の
塩基配列を示す。〔配列番号：１９〕実施例３で得られたラット型ＦＭ３
のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：２０〕配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含有するラッ
ト型ＦＭ３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２１〕実施例３に記載のプライマーｒＦＭ
Ｆの塩基配列を示す。〔配列番号：２２〕実施例３に記載のプライマーｒＦＭ
Ｒの塩基配列を示す。

【００４５】後述の実施例３で得られたラットＦＭ３の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号：２０）を
有する形質転換体 Escherichia coli JM109/pTArFM3-1
は、２０００年１１月９日から日本国茨城県つくば市東
１−１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−７３５８
として、日本国大阪府大阪市十三本町２−１７−８５、
財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２０００年１０月２４
日から寄託番号ＩＦＯ１６４９１として寄託されてい
る。

【００４６】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００４７】実施例１ヒト型ＦＭ−３発現ＣＨＯ細胞
の作成ヒト型ＦＭ−３の取得は以下のように行った。Genomics
52,223-229(1998) に報告されているヒト型ＦＭ−３の
配列に基づき以下の２種類の合成DNAを合成した。 FM3F2:5’-GTCGACCATGGCTTGCAATGGCAGTGCGGCCAGG-3’（配列番号：１７） FM3R2:5’-GCTAGCTCAGGATGGATCGGTCTCTTGCTG-3’（配列番号：１８）これらの合成DNAを用いてヒト胎児脳ｃDNAよりPCRにて
取得した。PCRの反応液はラット視床下部cDNA溶液1 μl
（0.2 ng poly(A)⁺RNA由来）、１ μFM3F2（10μM）、
1 μl FM3R2（10 μM）、5μl添付の10 x反応液、5 μl
dNTP（10mM）、1 μl Ex Taq（タカラ）、36 μl 蒸留
水を加えて合計50μlにした。反応液をThermalCycler96
00を用いてPCR反応にかけた。PCRの条件は95℃・2 分の
変性の後、98℃・10 秒、65℃・10秒、72℃・90秒のサ
イクルを28回繰り返した。PCR産物の一部を用いて電気
泳動で約1,2 kbのPCR産物の増幅を確認した後、PCR産物
をTAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸
菌にサブクローニングした。サブクローニングで得られ
た大腸菌からプラスミドをプラスミド抽出機（クラボウ
社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、そ
の配列が上記の文献に報告されているものと同じヒト型
ＦＭ−３cDNA（配列番号：２）であることを確認した。
次にそのプラスミドから制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅ
Ｉによって消化後約1.2 kbのヒト型ＦＭ−３cDNA断片を
得た。さらに、動物細胞用の発現ベクターであるｐＡＫ
ＫＯ−１１１Ｈはマルチクローニングサイト部分の制限
酵素サイトＳａｌＩおよびＮｈｅＩによって消化後、電
気泳動を行い、ベクター部分を回収した。以上の操作に
よって調製したヒト型ＦＭ−３cDNA断片および発現ベク
ターをライゲーションによって連結し、大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換してE. coliＪＭ１０９／ｐＡＫＫＯＦＭ
３を得た。形質転換体E. coliＪＭ１０９／ｐＡＫＫＯ
ＦＭ３を培養し、プラスミドｐＡＫＫＯＦＭ３のＤＮＡ
を大量に調製した。そのプラスミドＤＮＡのうちの２０
μgを１mlの生理的食塩水（ＰＢＳ）に溶解後、ジーン
トランスファー（和光純薬）のバイアルに注入し、ボル
テックスミキサーを用いて激しく撹拌してＤＮＡを含有
するリポソームを形成させた。ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞１
ないし２×１０６個を直径３５mmの細胞培養用シャーレ
に播種し、２０時間培養した後に培養液を新鮮なものに
交換した。各シャーレに対して０.５μgのＤＮＡに相当
する量（２５μｌ）のリポソーム液を滴下し、１６時間
インキュベーションを行ってプラスミドＤＮＡの導入を
行った。さらに新鮮な培地に交換して１日間培養した
後、選択培地に交換して３日間培養を続け、最後にトリ
プシン消化を行って分散させた細胞を低密度で選択培地
（deoxyribonucleosidesおよびribonucleosidesを含有
しないminimum essential medium，alpha mediumに１０
％透析ウシ血清を加えたもの）中に播種し、形質転換体
の選択を行った。形質転換体のみが選択培地中で増殖す
ることが可能であり、継代を繰り返すことによって選択
を重ね、ＣＨＯ−ＦＭ３細胞を樹立した。

【００４８】実施例２ＦＭ−３発現CHO細胞に特異的
なニューロメジンＵ-２５の細胞刺激作用組織培養用容器にて培養したＦＭ−３発現CHO細胞およ
びmock CHO細胞をトリプシンで消化し、解離させた。細
胞数を計測した後、2.7×105cells/カプセルの密度でそ
れぞれサイトセンサー（モレキュラーデバイス社）用カ
プセルキットに播種して一晩培養した。細胞の入ったカ
プセルは、測定用のセンサーチャンバーに移し、それを
ワークステーションに装着した。細胞の入っている部分
を0.1%ウシ血清アルブミンを含有するlow buffered RPM
I培地で還流し、Acidification Rate の値が安定するま
で静置した。Acidification Rate の測定は、80秒間の
ポンプ作動および40秒間のポンプ停止の交互の繰り返し
（１サイクルあたり２分間）中に行ない、ポンプ停止後
８秒後から30秒間の間の細胞外ｐＨの変化率をサイトセ
ンサーによってAcidification Rateとして算出した。ブ
タ型ニューロメジンＵ-８（BACHEM社、H-5505、配列番
号：５）は10mMの濃度で蒸留水に溶解し、さらに0.1% B
SA を含有するlow buffered RPMI培地にて段階的に希釈
したものを調製した。希釈液をサイトセンサーの２系統
ある流路の一方にセットし、バルブの切り換えによって
ニューロメジンＵ-８溶液を細胞に暴露した。作用時間
は７分２秒間とした。個々のセンサーチャンバーの検出
感度の違いを平均化（normalize）するため、サイトセ
ンサーのソフトウエア上で細胞にサンプルを暴露する直
前の３サイクル間の値を100%としてAcidification Rate
を換算し、その値にて細胞の反応性の比較を行なった
（図１）。その結果、用量依存的かつＦＭ−３発現CHO
細胞特異的な細胞刺激活性が検出された。

【００４９】実施例３ラット型FM-3遺伝子の取得ラット型FM-3遺伝子の取得のために、ヒト型FM3取得の
ために用いた配列番号：１７または配列番号：１８で表
されるプライマーを参考にして、以下の２種類の合成DN
Aを合成した。 rFMF:5’-GTCGACCATGCTCTCCCCAAATGCTTCAACGGG -3’ （配列番号：２１） rFMR:5’-GCTAGCTTATTCAGGAGGGTCTGTCTCTTGCTC -3’ （配列番号：２２）これらの合成DNAを用いてラット脳ｃDNAよりPCRにて取
得した。PCRの反応液はcDNA溶液１ μl（0.1 ng poly
(A)+RNA由来）、0.5μl rFMF（10μM）、0.5μl rFMR
（10μM）、2.5μl添付の10x反応液、2.5 μldNTP（10m
M）、0.5μl Klen Taq DNA polymerase（クローンテッ
ク社）、17.5 μl蒸留水を加えて合計25μlにした。反
応液をThermalCycler9600を用いてPCR反応にかけた。PC
Rの条件は95℃2分の変性の後、98℃ 10秒、65℃ 10秒、
72℃ 60秒のサイクルを33回繰り返した。PCR産物の一部
を用いて電気泳動で約1.3kbのPCR産物の増幅を確認した
後、PCR産物を直接配列決定を行い配列番号：２０で示
す配列を得た。配列番号：２０で示すDNA配列から予測
されるアミノ酸配列は配列番号：１９に示すものであり
ラット型FM-3遺伝子であることが確認できた。

【００５０】

【発明の効果】本発明のニューロメジンＵおよびＦＭ−
３を用いることを特徴とするニューロメジンＵとＦＭ−
３との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法は、高血圧症、ストレス性疾患等の予防・
治療薬などをスクリーニングするために用いることがで
きる。ＦＭ−３アンタゴニストは高血圧症、ストレス性
疾患等の予防・治療薬として有用である。

【００５１】

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Screening Method <130> B00348 <150> JP 11-338387 <151> 1999-11-29 <150> JP 12-052251 <151> 2000-02-24 <160> 22 <210> 1 <211> 403 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ala Cys Asn Gly Ser Ala Ala Arg Gly His Phe Asp Pro Glu Asp 1 5 10 15 Leu Asn Leu Thr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln 20 25 30 Gln Thr Glu Leu Phe Met Pro Ile Cys Ala Thr Tyr Leu Leu Ile Phe 35 40 45 Val Val Gly Ala Val Gly Asn Gly Leu Thr Cys Leu Val Ile Leu Arg 50 55 60 His Lys Ala Met Arg Thr Pro Thr Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala 65 70 75 80 Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu Val Gly Leu Pro Leu Glu Leu Tyr 85 90 95 Glu Met Trp His Asn Tyr Pro Phe Leu Leu Gly Val Gly Gly Cys Tyr 100 105 110 Phe Arg Thr Leu Leu Phe Glu Met Val Cys Leu Ala Ser Val Leu Asn 115 120 125 Val Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Val Ala Val Val His Pro Leu 130 135 140 Gln Ala Arg Ser Met Val Thr Arg Ala His Val Arg Arg Val Leu Gly 145 150 155 160 Ala Val Trp Gly Leu Ala Met Leu Cys Ser Leu Pro Asn Thr Ser Leu 165 170 175 His Gly Ile Arg Gln Leu His Val Pro Cys Arg Gly Pro Val Pro Asp 180 185 190 Ser Ala Val Cys Met Leu Val Arg Pro Arg Ala Leu Tyr Asn Met Val 195 200 205 Val Gln Thr Thr Ala Leu Leu Phe Phe Cys Leu Pro Met Ala Ile Met 210 215 220 Ser Val Leu Tyr Leu Leu Ile Gly Leu Arg Leu Arg Arg Glu Arg Leu 225 230 235 240 Leu Leu Met Gln Glu Ala Lys Gly Arg Gly Ser Ala Ala Ala Arg Ser 245 250 255 Arg Tyr Thr Cys Arg Leu Gln Gln His Asp Arg Gly Arg Arg Gln Val 260 265 270 Thr Lys Met Leu Phe Val Leu Val Val Val Phe Gly Ile Cys Trp Ala 275 280 285 Pro Phe His Ala Asp Arg Val Met Trp Ser Val Val Ser Gln Trp Thr 290 295 300 Asp Gly Leu His Leu Ala Phe Gln His Val His Val Ile Ser Gly Ile 305 310 315 320 Phe Phe Tyr Leu Gly Ser Ala Ala Asn Pro Val Leu Tyr Ser Leu Met 325 330 335 Ser Ser Arg Phe Arg Glu Thr Phe Gln Glu Ala Leu Cys Leu Gly Ala 340 345 350 Cys Cys His Arg Leu Arg Pro Arg His Ser Ser His Ser Leu Ser Arg 355 360 365 Met Thr Thr Gly Ser Thr Leu Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Ser Trp 370 375 380 Val His Pro Leu Ala Gly Asn Asp Gly Pro Glu Ala Gln Gln Glu Thr 385 390 395 400 Asp Pro Ser 403 <210> 2 <211> 1209 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGGCTTGCA ATGGCAGTGC GGCCAGGGGG CACTTTGACC CTGAGGACTT GAACCTGACT 60 GACGAGGCAC TGAGACTCAA GTACCTGGGG CCCCAGCAGA CAGAGCTGTT CATGCCCATC 120 TGTGCCACAT ACCTGCTGAT CTTCGTGGTG GGCGCTGTGG GCAATGGGCT GACCTGTCTG 180 GTCATCCTGC GCCACAAGGC CATGCGCACG CCTACCAACT ACTACCTCTT CAGCCTGGCC 240 GTGTCGGACC TGCTGGTGCT GCTGGTGGGC CTGCCCCTGG AGCTCTATGA GATGTGGCAC 300 AACTACCCCT TCCTGCTGGG CGTTGGTGGC TGCTATTTCC GCACGCTACT GTTTGAGATG 360 GTCTGCCTGG CCTCAGTGCT CAACGTCACT GCCCTGAGCG TGGAACGCTA TGTGGCCGTG 420 GTGCACCCAC TCCAGGCCAG GTCCATGGTG ACGCGGGCCC ATGTGCGCCG AGTGCTTGGG 480 GCCGTCTGGG GTCTTGCCAT GCTCTGCTCC CTGCCCAACA CCAGCCTGCA CGGCATCCGG 540 CAGCTGCACG TGCCCTGCCG GGGCCCAGTG CCAGACTCAG CTGTTTGCAT GCTGGTCCGC 600 CCACGGGCCC TCTACAACAT GGTAGTGCAG ACCACCGCGC TGCTCTTCTT CTGCCTGCCC 660 ATGGCCATCA TGAGCGTGCT CTACCTGCTC ATTGGGCTGC GACTGCGGCG GGAGAGGCTG 720 CTGCTCATGC AGGAGGCCAA GGGCAGGGGC TCTGCAGCAG CCAGGTCCAG ATACACCTGC 780 AGGCTCCAGC AGCACGATCG GGGCCGGAGA CAAGTGACCA AGATGCTGTT TGTCCTGGTC 840 GTGGTGTTTG GCATCTGCTG GGCCCCGTTC CACGCCGACC GCGTCATGTG GAGCGTCGTG 900 TCACAGTGGA CAGATGGCCT GCACCTGGCC TTCCAGCACG TGCACGTCAT CTCCGGCATC 960 TTCTTCTACC TGGGCTCGGC GGCCAACCCC GTGCTCTATA GCCTCATGTC CAGCCGCTTC 1020 CGAGAGACCT TCCAGGAGGC CCTGTGCCTC GGGGCCTGCT GCCATCGCCT CAGACCCCGC 1080 CACAGCTCCC ACAGCCTCAG CAGGATGACC ACAGGCAGCA CCCTGTGTGA TGTGGGCTCC 1140 CTGGGCAGCT GGGTCCACCC CCTGGCTGGG AACGATGGCC CAGAGGCGCA GCAAGAGACC 1200 GATCCATCC 1209 <210> 3 <211> 405 <212> PRT <213> Mouse <400> 3 Met Val Cys Asn Ile Ser Glu Phe Lys Trp Pro Tyr Gln Pro Glu Asp 5 10 15 Leu Asn Leu Thr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln 20 25 30 Gln Met Lys Gln Phe Val Pro Ile Cys Val Thr Tyr Leu Leu Ile Phe 35 40 45 Val Val Gly Thr Leu Gly Asn Gly Leu Thr Cys Thr Val Ile Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Thr Met Arg Thr Pro Thr Asn Phe Tyr Leu Phe Ser Leu Ala 65 70 75 80 Val Ser Asp Met Leu Val Leu Leu Val Gly Leu Pro Leu Glu Leu Tyr 85 90 95 Glu Met Gln Gln Asn Tyr Pro Phe Gln Leu Gly Ala Ser Ala Cys Tyr 100 105 110 Phe Arg Ile Leu Leu Leu Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Val Leu Asn 115 120 125 Val Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Val Ala Val Val Arg Pro Leu 130 135 140 Gln Ala Lys Ser Val Met Thr Arg Ala His Val Arg Arg Met Val Gly 145 150 155 160 Ala Ile Trp Val Leu Ala Thr Leu Phe Ser Leu Pro Asn Thr Ser Leu 165 170 175 His Gly Leu Ser Gln Leu Thr Val Pro Cys Arg Gly Pro Val Pro Asp 180 185 190 Ser Ala Ile Cys Ser Leu Val Gly Pro Met Asp Phe Tyr Lys Leu Val 195 200 205 Val Leu Thr Thr Ala Leu Leu Phe Phe Cys Leu Pro Met Val Thr Ile 210 215 220 Ser Val Leu Tyr Leu Leu Ile Gly Leu Arg Leu Arg Arg Glu Arg Met 225 230 235 240 Leu Leu Gln Val Glu Val Lys Gly Arg Lys Thr Ala Ala Thr Gln Glu 245 250 255 Thr Ser His Arg Arg Ile Gln Leu Gln Asp Arg Gly Arg Arg Gln Val 260 265 270 Thr Lys Met Leu Phe Ala Leu Val Val Val Phe Gly Ile Cys Trp Ala 275 280 285 Pro Phe His Ala Asp Arg Ile Met Trp Ser Leu Val Tyr Gly His Ser 290 295 300 Thr Glu Gly Leu His Leu Ala Tyr Gln Cys Val His Ile Ala Ser Gly 305 310 315 320 Ile Phe Phe Tyr Leu Gly Ser Ala Ala Asn Pro Val Leu Tyr Ser Leu 325 330 335 Met Ser Thr Arg Phe Arg Glu Thr Phe Leu Gln Ala Leu Gly Leu Gly 340 345 350 Thr Gln Cys Cys His Arg Arg Gln Pro Tyr His Gly Ser His Asn His 355 360 365 Ile Arg Leu Thr Thr Gly Ser Thr Leu Cys Asp Val Gly His Arg Asn 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Pro Leu Ala Val Asn Glu Asp Pro Gly Cys Gln Gln 385 390 395 400 Glu Thr Asp Pro Ser 405 <210> 4 <211> 1215 <212> DNA <213> Mouse <400> 4 ATGGTCTGCA ATATCAGTGA GTTCAAGTGG CCCTATCAAC CTGAGGATCT GAACCTTACC 60 GATGAGGCCC TGAGGCTGAA GTATTTGGGG CCACAGCAGA TGAAACAGTT TGTCCCCATC 120 TGTGTCACGT ACCTGCTGAT CTTCGTGGTG GGCACTCTGG GCAACGGGCT GACCTGCACC 180 GTCATCCTGC GCAACAAGAC TATGCGCACG CCCACCAACT TCTACCTCTT CAGCCTCGCT 240 GTGTCCGATA TGCTGGTGCT CCTGGTGGGC TTGCCTCTGG AGCTTTATGA GATGCAGCAA 300 AATTACCCGT TCCAGCTGGG TGCGAGTGCC TGCTACTTCC GAATACTGCT CTTAGAGACC 360 GTCTGCCTAG CTTCAGTGCT CAATGTCACA GCCCTGAGTG TGGAGCGTTA TGTGGCCGTG 420 GTGCGCCCAC TCCAAGCCAA GTCTGTGATG ACACGGGCCC ATGTGCGCCG CATGGTGGGG 480 GCCATCTGGG TCCTCGCTAC TCTCTTCTCT CTGCCCAACA CCAGCCTGCA TGGCCTCAGT 540 CAACTAACTG TGCCCTGCCG GGGGCCGGTG CCCGACTCAG CTATATGTTC GCTGGTGGGT 600 CCCATGGACT TCTACAAGTT GGTGGTACTG ACTACCGCAC TGCTCTTCTT CTGTCTGCCC 660 ATGGTCACCA TCAGTGTGCT GTATCTGCTC ATTGGGCTGC GGCTGCGGAG GGAGAGGATG 720 TTGCTCCAAG TGGAGGTCAA GGGCAGGAAA ACCGCAGCAA CCCAGGAGAC CTCCCACAGA 780 AGGATTCAGC TGCAAGATAG GGGACGGAGA CAGGTGACCA AGATGCTGTT TGCACTGGTT 840 GTGGTATTCG GCATCTGCTG GGCTCCATTC CATGCTGACC GTATCATGTG GAGCCTGGTG 900 TATGGACACT CAACGGAAGG CCTGCACCTG GCCTACCAGT GTGTCCACAT TGCCTCTGGC 960 ATCTTCTTCT ATCTCGGCTC AGCAGCCAAC CCGGTGCTCT ACAGCCTCAT GTCTACTCGC 1020 TTCCGAGAGA CCTTCCTGCA AGCCCTGGGC CTTGGAACCC AGTGCTGTCA TCGCCGCCAA 1080 CCCTATCATG GCTCCCATAA CCACATCAGG TTGACCACAG GCAGCACCCT GTGTGACGTG 1140 GGCCACAGGA ACAGCAGGGA CGAACCTCTG GCTGTGAATG AGGATCCAGG GTGTCAGCAA 1200 GAGACAGACC CCTCC 1215 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Pig <400> 5 Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 8 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Dog <400> 6 Glu Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 8 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Chicken <400> 7 Gly Tyr Phe Phe Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 9 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Guinea pig <400> 8 Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 9 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Rat <400> 9 Tyr Lys Val Asn Glu Tyr Gln Gly Pro Val Ala Pro Ser Gly Gly Phe 1 5 10 15 Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 23 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Frog <400> 10 Ser Asp Glu Glu Val Gln Val Pro Gly Gly Val Ile Ser Asn Gly Tyr 1 5 10 15 Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 23 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Human <400> 11 Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Pig <400> 12 Phe Leu Val Asp Glu Glu Phe Gln Gly Pro Ile Val Ser Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Dog <400> 13 Phe Arg Leu Asp Glu Glu Phe Gln Gly Pro Ile Ala Ser Gln Val Arg 1 5 10 15 Arg Gln Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Chicken <400> 14 Tyr Lys Val Asp Glu Asp Leu Gln Gly Ala Gly Gly Ile Gln Ser Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Phe Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 15 <211> 25 <212> PRT <213> Frog <400> 15 Leu Lys Pro Asp Glu Glu Leu Gln Gly Pro Gly Gly Val Leu Ser Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Val Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 16 Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 17 GTCGACCATG GCTTGCAATG GCAGTGCGGC CAGG 34 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 18 GCTAGCTCAG GATGGATCGG TCTCTTGCTG 30 <210> 19 <211> 412 <212> PRT <213> Rat <400> 19 Met Leu Ser Pro Asn Ala Ser Thr Gly Leu Leu Ser Cys Asn Asp Ser 5 10 15 Glu Phe Lys Glu His Phe Asp Leu Glu Asp Leu Asn Leu Thr His Glu 20 25 30 Asp Leu Arg Leu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Gln Val Lys Gln Phe Leu 35 40 45 Pro Ile Cys Val Thr Tyr Leu Leu Ile Phe Val Val Gly Thr Leu Gly 50 55 60 Asn Gly Leu Thr Cys Thr Val Ile Leu Arg Gln Lys Ala Met His Thr 65 70 75 80 Pro Thr Asn Phe Tyr Leu Phe Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Val Gly Leu Pro Leu Glu Leu Tyr Glu Met Gln His Asn Tyr 100 105 110 Pro Phe Gln Leu Gly Ala Gly Gly Cys Tyr Phe Arg Ile Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Val Leu Asn Val Thr Ala Leu Ser Val 130 135 140 Glu Arg Tyr Val Ala Val Val His Pro Leu Gln Ala Lys Ser Val Met 145 150 155 160 Thr Arg Thr His Val Arg Arg Met Leu Gly Ala Ile Trp Val Phe Ala 165 170 175 Ile Leu Phe Ser Leu Pro Asn Thr Ser Leu His Gly Leu Ser Pro Leu 180 185 190 Tyr Val Pro Cys Arg Gly Pro Val Pro Asp Ser Val Thr Cys Thr Leu 195 200 205 Val Arg Pro Gln Phe Phe Tyr Lys Leu Val Ile Gln Thr Thr Ile Leu 210 215 220 Leu Phe Phe Cys Leu Pro Met Val Thr Ile Ser Val Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Ile Gly Leu Arg Leu Arg Arg Glu Arg Met Leu Leu Gln Glu Glu Val 245 250 255 Lys Gly Arg Ile Ser Ala Ala Ala Arg Gln Ala Ser His Arg Ser Ile 260 265 270 Gln Leu Arg Asp Arg Glu Arg Arg Gln Val Thr Lys Met Leu Ile Ala 275 280 285 Leu Val Ile Val Phe Gly Thr Cys Trp Val Pro Phe His Ala Asp Arg 290 295 300 Leu Met Trp Ser Met Val Ser His Trp Thr Asp Gly Leu Arg Leu Ala 305 310 315 320 Phe Gln Ser Val His Leu Ala Ser Gly Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser 325 330 335 Ala Ala Asn Pro Glu Leu Tyr Asn Leu Met Ser Thr Arg Phe Arg Glu 340 345 350 Ser Phe Arg Glu Thr Leu Gly Leu Gly Thr Arg Cys Cys His Arg His 355 360 365 Gln Pro Arg His Asp Ser His Ser His Leu Arg Leu Thr Thr Val Ser 370 375 380 Thr Leu Cys Asp Arg Asn Ser Arg Asp Val Pro Leu Ala Glu Asn Arg 385 390 395 400 Asp Pro Gly Cys Glu Gln Glu Thr Asp Pro Pro Glu 405 410 412 <210> 20 <211> 1239 <212> DNA <213> Rat <400> 20 ATGCTCTCCC CAAATGCTTC AACGGGCCTC TTGTCCTGCA ATGACAGTGA GTTCAAGGAG 60 CACTTTGACC TTGAGGACCT GAACCTTACT CATGAGGACC TGAGGCTGAA GTACTTGGGG 120 CCACAGCAGG TAAAACAATT TTTGCCCATC TGTGTCACGT ACCTGTTGAT CTTCGTAGTG 180 GGCACTCTGG GCAACGGGTT GACCTGCACC GTCATCCTGC GCCAGAAGGC AATGCACACG 240 CCCACCAACT TCTACCTCTT CAGTCTCGCG GTGTCCGATT TGCTGGTGCT CCTGGTGGGC 300 TTGCCCCTGG AACTTTATGA GATGCAGCAC AATTACCCAT TCCAGCTGGG TGCAGGTGGC 360 TGTTACTTCC GGATACTGCT TTTGGAGACT GTCTGCCTGG CTTCAGTGCT CAATGTCACA 420 GCCCTAAGTG TGGAGCGTTA TGTGGCCGTG GTGCACCCAC TCCAAGCCAA GTCTGTGATG 480 ACACGGACCC ATGTGCGCCG CATGTTGGGA GCCATCTGGG TCTTCGCTAT TCTCTTCTCT 540 CTGCCCAACA CCAGCTTACA TGGCCTCAGT CCACTCTATG TACCCTGCCG GGGGCCGGTG 600 CCCGATTCAG TTACGTGTAC GCTGGTGCGT CCCCAGTTCT TCTACAAGTT GGTAATACAG 660 ACGACCATAC TGCTCTTCTT CTGTCTGCCC ATGGTCACCA TCAGTGTGCT GTACCTGCTC 720 ATTGGGCTGA GGCTGCGGAG GGAGAGGATG TTGCTCCAAG AGGAGGTCAA GGGCAGGATA 780 TCTGCAGCAG CCAGGCAGGC CTCCCACAGA AGTATTCAGC TTCGAGATAG GGAACGCAGA 840 CAGGTGACCA AGATGCTAAT TGCTCTGGTT ATAGTATTTG GCACCTGCTG GGTTCCATTC 900 CATGCTGACC GTCTCATGTG GAGTATGGTG TCCCATTGGA CTGACGGCCT GCGCCTGGCC 960 TTCCAGTCTG TGCACCTTGC TTCTGGTGTC TTCTTGTACC TCGGCTCAGC GGCTAACCCG 1020 GAGCTCTACA ACCTCATGTC CACTCGCTTC CGAGAGTCCT TCCGGGAAAC CCTGGGCCTT 1080 GGGACACGGT GCTGTCATCG CCACCAACCG CGTCACGACT CCCATAGCCA CCTTAGGTTG 1140 ACCACAGTCA GCACCCTGTG TGACAGGAAC AGCAGGGATG TACCCCTGGC TGAGAACAGG 1200 GATCCAGGGT GTGAGCAAGA GACAGACCCT CCTGAATAA 1239 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 21 GTCGACCATG CTCTCCCCAA ATGCTTCAAC GGG 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 22 GCTAGCTTAT TCAGGAGGGT CTGTCTCTTG CTC 33

【００５２】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で行われたサイトセンサーによるＦＭ
−３特異的な細胞刺激活性の検出の結果を示す図を表
す。サイトセンサーアッセイにおいて、ＦＭ−３発現CH
O細胞（●）およびmock CHO細胞（○）に対して図に表
示の濃度のブタ型ニューロメジンＵ-８を７分２秒間作
用させ、その間のAcidification Rateの最大値をプロッ
トしている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/08 Ａ６１Ｐ 9/02 ４Ｃ０８４ 5/06 9/10 ４Ｈ０４５ 9/02 9/12 9/10 11/06 9/12 25/06 11/06 29/00 １０１ 25/06 37/04 29/00 １０１Ｃ０７Ｋ 14/705 37/04 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/04 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｐ 21/02 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/50 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者福住昌司茨城県つくば市並木３丁目17番地６ロイヤルシティ並木302号Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 CB01 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA11 BA63 CA04 DA02 EA04 GA13 HA01 HA14 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR48 QR77 QR80 QS28 QS38 QX07 4B064 AG20 AG27 CA10 CA19 CC24 CE09 CE11 CE12 CE14 DA13 4B065 AA26X AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC14 CA24 CA46 4C084 AA16 BA02 BA17 BA22 BA23 CA17 CA21 ZA031 ZA032 ZA421 ZA422 ZC781 ZC782 ZC801 ZC802 4H045 AA11 AA20 AA30 CA45 DA50 DA76 DA86 EA50 FA72 FA74 GA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ニューロメジンＵもしくはその誘導体また
はその塩およびＦＭ−３またはその塩を用いることを特
徴とするニューロメジンＵまたはその塩とＦＭ−３また
はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング方法。
【請求項２】ニューロメジンＵもしくはその誘導体また
はその塩およびＦＭ−３またはその塩を含有することを
特徴とするニューロメジンＵまたはその塩とＦＭ−３ま
たはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング用キット。
【請求項３】請求項１記載のスクリーニング方法または
請求項２記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
うる、ニューロメジンＵまたはその塩とＦＭ−３または
その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項４】請求項３記載の化合物またはその塩を含有
してなる医薬。
【請求項５】高血圧症またはストレス性疾患の予防・治
療薬である請求項４記載の医薬。
【請求項６】請求項３記載の化合物またはその塩を含有
してなる食欲調節剤。
【請求項７】ニューロメジンＵが配列番号：１１で表さ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するペプチドである請求項１記載のスクリ
ーニング方法または請求項２記載のスクリーニング用キ
ット。
【請求項８】ＦＭ−３が配列番号：１で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質である請求項１記載のスクリーニング方法
または請求項２記載のスクリーニング用キット。
【請求項９】配列番号：１９で表わされるアミノ酸配
列、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列に１個
以上３０個以下のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以上
３０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ
ノ酸配列、または配列番号：１９で表わされるアミノ
酸配列に１個以上３０個以下のアミノ酸が付加し、かつ
配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１個以上
３０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ
ノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその
塩。
【請求項１０】請求項９記載の蛋白質をコードするDNA
を含有するＤＮＡ。
【請求項１１】配列番号：２０で表される塩基配列を有
する請求項１０記載のＤＮＡ。
【請求項１２】請求項１０記載のＤＮＡを含有する組換
えベクター。
【請求項１３】請求項１２記載の組換えベクターで形質
転換させた形質転換体。
【請求項１４】請求項１３記載の形質転換体を培養し、
請求項９記載の蛋白質を生成せしめることを特徴とする
請求項９記載の蛋白質またはその塩の製造法。
【請求項１５】請求項９記載の蛋白質またはその塩に対
する抗体。