JP4173628B2

JP4173628B2 - Surface plasmon resonance measuring device

Info

Publication number: JP4173628B2
Application number: JP2000379897A
Authority: JP
Inventors: 昌之納谷
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2000-12-14
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2020-12-14
Also published as: JP2002181700A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面プラズモンの発生を利用して試料中の物質を定量分析する表面プラズモン共鳴測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。
【０００３】
従来より、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、試料中の物質を定量分析する表面プラズモン共鳴測定装置が種々提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、 Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号参照）。
【０００４】
上記の系を用いる表面プラズモン共鳴測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件となり、かつ、表面プラズモン共鳴条件を含む種々の入射角が得られるように入射させる入射光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０００５】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを偏向させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面で集束するように入射させてもよい。前者の場合は、光ビームの偏向にともなって反射角が変化する光ビームを、光ビームの偏向に同期移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０００６】
上記構成の表面プラズモン共鳴測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角θ_ＳＰで入射させると、該金属膜に接している試料中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と試料との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く減衰する。この光強度の減衰は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。
【０００７】
図５には、この全反射減衰現象が生じた際の入射角θと反射光強度Ｉとの関係を概略的に示してある。ここに示す入射角θ_ＳＰが、上述の全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角である。
【０００８】
なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０００９】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角θ_ＳＰより表面プラズモンの波数が分かると、試料の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫ_ＳＰ、表面プラズモンの角周波数をω、ｃを真空中の光速、ε_ｍとε_ｓをそれぞれ金属、試料の誘電率とすると、以下の関係がある。
【００１０】
【数１】

試料の誘電率ε_ｓが分かれば、所定の較正曲線等に基づいて試料中の特定物質の濃度が分かるので、結局、上記反射光強度が低下する入射角θ_ＳＰを知ることにより、試料中の特定物質を定量分析することができる。
【００１１】
また、上述の表面プラズモン共鳴測定装置においては、光ビームが誘電体ブロックと金属膜との界面の中の２次元領域を照射するように前記入射光学系を構成するとともに、前記光検出手段として、上記界面で全反射した光ビームの強度を上記２次元領域内の各位置毎に検出する２次元光検出器からなるものを用いることにより、上記２次元領域に対応して配置された試料の該領域内における誘電率分布が求められるので、それに基づいて試料中の特定物質の濃度分布を求めることができる。
【００１２】
なお、このように光ビームを、誘電体ブロックと金属膜との界面の中の２次元領域に照射させる表面プラズモン共鳴測定装置については、NATURE Vol.332,14,APRIL 1988 pp.615-617に一例が示されている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、この表面プラズモン共鳴測定装置において、特に上記の２次元光検出器を用いて試料中の特定物質の濃度分布を求める場合は、誘電体ブロックと金属膜との界面に対する光ビームの入射角が固定されることになるが、その場合は、光検出信号のＳ／Ｎが良くないという不具合が認められている。
【００１４】
本発明は上記の事情に鑑みて、光ビームの入射角を固定としても、高Ｓ／Ｎの光検出信号を得ることができる表面プラズモン共鳴測定装置を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明による表面プラズモン共鳴測定装置は、前述したような誘電体ブロックと、金属膜と、光ビームを発する光源と、該光ビームを前記誘電体ブロックと金属膜との界面に対して、全反射条件が得られる固定の入射角で誘電体ブロック側から入射させる入射光学系と、光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置において、上記光源として、互いに異なる２つ以上の波長の光ビームの各々を発する、併設された複数の光源が用いられ、光検出手段として、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光ビームの強度を各波長毎に測定可能なものが用いられた上で、この光検出手段が出力する、互いに異なる２つの波長の光ビームについての光検出信号の差分を求める演算手段が設けられ、さらに前記光源が、前記２つ以上の波長の光ビームを互いに時間間隔をおいて射出するように構成され、前記入射光学系が、前記２つ以上の波長の光ビームを前記界面に対して、共通の入射角で入射させるように構成され、前記光検出手段が、前記光源の光ビーム射出タイミングと同期したタイミングで検出動作することにより、前記光ビームの強度を各波長毎に測定する１つの光検出器から構成されたことを特徴とするものである。
【００１６】
なお、上記構成を有する本発明の表面プラズモン共鳴測定装置においては、
前記複数の光源として、互いに異なる３つ以上の波長の光ビームを各々発するものが適用された上で、
前記演算手段が、それらの波長のうち表面プラズモン共鳴条件を満たす２つの波長の光ビームについての光検出信号の差分を求めるように構成されることが望ましい。
【００１９】
また、上述した各波長の光ビームを発する複数の光源を、互いに別々の位置に固定して、それらから各々発せられた光ビームが例えばダイクロイックミラー等の手段によって途中から互いに同じ光路を辿るように（時間的には分離されているから合波されることはない）構成してもよい。あるいはこれら複数の光源を、点灯時には、入射光学系に対して所定の相対位置関係となる共通の位置に移動させて、その位置で点灯動作させるようにしてもよい。
【００２０】
また本発明の表面プラズモン共鳴測定装置においては、入射光学系が、光ビームにより前記界面の中の２次元領域を照射するように構成されるとともに、
光検出手段が、前記界面で全反射した光ビームの強度を、前記２次元領域内の各位置毎に検出する２次元光検出器から構成されることが望ましい。
【００２１】
さらに本発明の表面プラズモン共鳴測定装置においては、前記金属膜の表面上に、試料中の特定成分と相互作用を生じるセンシング媒体が配されていることが望ましい。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の表面プラズモン共鳴測定装置における光ビームの波長と、光検出手段が出力する光検出信号の強度（検出した全反射光の強度に対応する）との関係を図６に示す。前述したエバネッセント光と表面プラズモンとが共鳴するのは、このエバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立する場合であるから、誘電体ブロックと金属膜との界面に入射させる光ビームの波長を変化させると、この界面に対する光ビームの入射角θを変化させた場合と同様に全反射光強度が変化する。つまり、例えば曲線ａの特性の場合は、光ビームの波長がλ_ＳＰのときに全反射減衰が生じる。
【００２３】
そしてこの波長対全反射光強度の関係は、上記入射角θを固定しておけば、試料の誘電率ε_ｓに応じて、つまり試料中の特定物質の濃度に応じて、図６に曲線ａやｂで示すように変化する。そこで、光ビームの波長がλ1とλ2の場合について考えると、波長λ1の光に関する光検出信号と波長λ2の光に関する光検出信号との差分は、上記特定物質の濃度に応じて変わることになる。すなわち、例えば曲線ａの場合の差分は（Ｓ1a−Ｓ2a）であるのに対し、曲線ｂの場合の差分は（Ｓ1b−Ｓ2b）となって、両者の値は明確に異なる。
【００２４】
したがって、予め求めてある各試料毎の検量線等を参照すれば、この差分に基づいて波長対全反射光強度の関係を推定可能となり、試料中の特定物質を定量分析できるようになる。
【００２５】
そして、上述のように２つの光検出信号の差分を求めると、各信号に乗っていた雑音成分が相殺されるので、この差分信号はＳ／Ｎが十分に高いものとなり、該差分信号に基づいて特定物質の定量分析を高精度で行なえるようになる。
【００２６】
なお本発明の表面プラズモン共鳴測定装置のうち、特に前記光源として、互いに異なる３つ以上の波長の光ビームを発するものが用いられた上で、前記演算手段が、それらの波長のうち表面プラズモン共鳴条件を満たす２つの波長の光ビームについての光検出信号の差分を求めるように構成されたものにおいては、波長を３つ以上用意しておくことにより、ある波長が表面プラズモン共鳴条件から外れているようなことがあっても、表面プラズモン共鳴条件を満たす別の波長２つを確保しやすくなるので、多種の試料に対応可能となる。
【００２７】
また本発明の表面プラズモン共鳴測定装置のうち、特に入射光学系が、光ビームにより前記界面の中の２次元領域を照射するように構成される一方、光検出手段が、上記界面で全反射した光ビームの強度を上記２次元領域内の各位置毎に検出する２次元光検出器から構成されたものにおいては、差分信号が上記２次元領域内の各位置毎に求められるので、この差分信号に基づいて該領域内の特定物質の濃度分布等を求めることが可能になる。
【００２８】
また本発明の表面プラズモン共鳴測定装置のうち、特に金属膜の表面上に試料中の特定成分と相互作用を生じるセンシング媒体を配したものにおいては、このセンシング媒体の上に試料を保持させた際に、上記相互作用によって表面プラズモン共鳴の状態が変化するので、この変化を捕えることによって、試料中の特定成分とセンシング媒体との特異反応を検出することができる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明に対する参考例としての表面プラズモン共鳴測定装置の概略側面形状を示すものである。
【００３０】
図示の通りこの表面プラズモン共鳴測定装置は、例えば三角柱状に形成された透明誘電体プリズム11と、この誘電体プリズム11の上面に屈折率マッチング液12を介して固定された透明誘電体プレート13と、この誘電体プレート13の上面に形成された例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる金属薄膜14とを有している。そしてこの金属薄膜14の上に、分析対象の試料15が配置される。なお本例では、透明誘電体プリズム11、屈折率マッチング液12および透明誘電体プレート13によって誘電体ブロックが形成されている。
【００３１】
また、波長λ1の光ビームＬ1を発する第１のレーザ光源16と、波長λ2の光ビームＬ2を発する第２のレーザ光源17とが設けられ、これらの光ビームＬ1およびＬ2は、前者を透過させて後者を反射させる入射光学系としてのダイクロイックミラー18によって１本の光ビームＬに合波される。この合波された光ビームＬは、細い平行光状態で誘電体プリズム11に入射し、誘電体プレート13と金属薄膜14との界面13ａに入射する。このときの入射角θは、上記界面13ａにおいて光ビームＬの全反射条件が得られ、かつ、表面プラズモン共鳴が生じ得る範囲内の値とされる。
【００３２】
なお光ビームＬは、界面13ａに対してｐ偏光で入射する必要がある。そのようにするためには、予め第１のレーザ光源16および第２のレーザ光源17を、光ビームＬ1およびＬ2の偏光方向が所定方向となるように配設すればよい。その他、波長板や偏光板で光ビームＬ1およびＬ2の偏光の向きを制御してもよい。
【００３３】
界面13ａに入射した光ビームＬはそこで全反射し、全反射した光ビームＬは、波長λ1の光を透過させる一方波長λ2の光は反射させるダイクロイックミラー20により、波長λ1の光ビームＬ1と波長λ2の光ビームＬ2とに分波される。光ビームＬ1と光ビームＬ2はそれぞれ、例えばフォトダイオード等からなる第１の光検出器21、第２の光検出器22によって検出される。
【００３４】
第１の光検出器21が出力する光検出信号Ｓ1および、第２の光検出器22が出力する光検出信号Ｓ2は、ともに差分演算回路23に入力される。この差分演算回路23は、入力された光検出信号Ｓ1とＳ2との差分を求めて、差分信号Ｓｓを出力する。
【００３５】
以下、上記構成の表面プラズモン共鳴測定装置による試料分析について説明する。分析に供される試料15は、金属薄膜14の上に配される。そしてレーザ光源16および17が駆動され、それらから各々発せられた光ビームＬ1およびＬ2がダイクロイックミラー18で合波され、合波された光ビームＬが誘電体プレート13と金属薄膜14との界面13ａに一定の入射角θで入射する。この入射角θは前述の通りに設定されているから、光ビームＬは界面13ａで全反射する。
【００３６】
このように光ビームＬが全反射するとき、界面13ａから金属薄膜14側にエバネッセント波がしみ出す。入射角θが固定されている場合、全反射光の強度（つまり光検出器21、22が出力する光検出信号Ｓ1、Ｓ2の強度）は、前述した通り光波長λに応じて図６に示すように変化する。すなわち、光波長λがλ_ＳＰの場合、上記エバネッセント波が金属薄膜14の表面に励起する表面プラズモンと共鳴するので、この波長λ_ＳＰの光については反射光強度が鋭く減衰する。
【００３７】
そしてこの波長対全反射光強度の関係は、入射角θが固定されていれば、試料の誘電率ε_ｓに応じて、つまり試料中の特定物質の濃度に応じて、図６に曲線ａやｂで示すように変化する。そこで、光検出信号Ｓ1、Ｓ2の差分を取った差分信号Ｓｓの値は、上記特定物質の濃度に応じて変わることになる。したがって、予め求めてある各試料毎の検量線等を参照すれば、この差分信号Ｓｓの値に基づいて波長対全反射光強度の関係を推定可能となり、試料15中の特定物質を定量分析できる。
【００３８】
そして、上述のように２つの光検出信号Ｓ1、Ｓ2の差分を求めると、各信号Ｓ1、Ｓ2に乗っていた雑音成分が相殺されるので、差分信号ＳｓはＳ／Ｎが十分に高いものとなり、該差分信号Ｓｓに基づいて特定物質の定量分析を高精度で行なえるようになる。
【００３９】
次に図２を参照して、本発明の第１の実施形態について説明する。図２は、この第１の実施形態の表面プラズモン共鳴測定装置の概略側面形状を示している。なおこの図２において、図１中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。
【００４０】
この第１実施形態の表面プラズモン共鳴測定装置においては、第１のレーザ光源16および第２のレーザ光源17の駆動が駆動制御回路25によって制御され、第１のレーザ光源16が所定時間駆動して停止した後、時間間隔をおいて第２のレーザ光源17が駆動されるようになっている。それにより、波長λ1の光ビームＬ1が誘電体プレート13と金属薄膜14との界面13ａに入射した後、時間間隔をおいて波長λ2の光ビームＬ2が該界面13ａに入射する。
【００４１】
一方、光検出手段としては第１の光検出器21のみが設けられ、この光検出器21の動作も上記駆動制御回路25によって制御される。すなわち該光検出器21は、第１のレーザ光源16が駆動されたとき、そして第２のレーザ光源17が駆動されたときに同期を取って検出動作し、まず波長λ1の光ビームＬ1に関する光検出信号Ｓ1を出力し、次いで波長λ2の光ビームＬ2に関する光検出信号Ｓ2を出力する。
【００４２】
このように、時間間隔をおいて光検出器21から出力される光検出信号Ｓ1、および光検出信号Ｓ2は、ともに差分演算回路23に入力される。この差分演算回路23は、入力された光検出信号Ｓ1とＳ2を一旦内部メモリ（図示せず）に記憶し、次いでそれらの差分を求めて、差分信号Ｓｓを出力する。
【００４３】
この場合も上述の差分信号Ｓｓを用いることにより、前述した参考例と同様の効果を得ることができる。
【００４４】
次に図３は、本発明の第２の実施形態による表面プラズモン共鳴測定装置の概略側面形状を示すものである。この第２実施形態の表面プラズモン共鳴測定装置においては、ダイクロイックミラー18で合波された後の光ビームＬがビームエキスパンダ30によって拡径され、その状態で誘電体プレート13と金属薄膜14との界面13ａに入射する。そこで光ビームＬは、この界面13ａの中の２次元領域を照射する。
【００４５】
また界面13ａで全反射した光ビームＬはダイクロイックミラー20により、波長λ1の光ビームＬ1と波長λ2の光ビームＬ2とに分波される。光ビームＬ1と光ビームＬ2はそれぞれ、例えば２次元ＣＣＤセンサからなる第１の２次元光検出器41、第２の２次元光検出器42によって検出される。
【００４６】
そしてこの場合も、第１の２次元光検出器41が出力する光検出信号Ｓ1および、第２の２次元光検出器42が出力する光検出信号Ｓ2は、ともに差分演算回路43に入力される。この差分演算回路43は、入力された光検出信号Ｓ1とＳ2から、同じ画素に関する（つまり界面13ａ内の同じ位置に関する）信号毎に両信号Ｓ1、Ｓ2間の差分を求めて、差分信号Ｓｓを出力する。
【００４７】
この第２の実施形態の表面プラズモン共鳴測定装置において、２次元光検出器41および42がそれぞれ出力する光検出信号Ｓ1、Ｓ2は、光ビームＬが照射された界面13ａの中の２次元領域内における試料15の誘電率分布を示すもの、つまりは該試料15中の特定物質の濃度分布を示すものとなっている。
【００４８】
そして、そのような光検出信号Ｓ1と光検出信号Ｓ2との間の差分を求めると、各信号Ｓ1、Ｓ2に乗っていた雑音成分が相殺されるので、差分信号ＳｓはＳ／Ｎが十分に高いものとなり、該差分信号Ｓｓに基づいて上記特定物質の濃度分布を精度良く求めることが可能となる。
【００４９】
なお、本実施形態の表面プラズモン共鳴測定装置は、上述の通りにして１つの試料15中の特定物質の濃度分布を求める他、多数のセンサチップを２次元的に配置してなるセンサアレイを用いて、それらのセンサチップに保持された試料の定量分析をまとめて行なうために使用することもできる。
【００５０】
図４は、そのようなセンサアレイの一例を示している。このセンサアレイ50は、多数のセンサチップ51を２次元的に配置してなるものであり、図３の装置において試料15に換えて金属薄膜14の上に配して用いられる。センサチップ51は、例えば、分析対象の試料中の特定物質と結合するセンシング媒体を保持したものである。このような特定物質とセンシング媒体との組合せとしては、例えば抗原と抗体とが挙げられる。その場合は、光検出信号Ｓ1と光検出信号Ｓ2との間の差分を取った差分信号Ｓｓに基づいて、抗原抗体反応を検出することができる。
【００５１】
そして光検出信号Ｓ1、Ｓ2はそれぞれ、光ビームＬが照射された界面13ａの中の２次元情報を担持しているので、多数のセンサチップ51の各位置に対応する差分信号Ｓｓを抽出すれば、抽出された差分信号Ｓｓはそれぞれセンサチップ51毎の情報（上記の例では抗原抗体反応）を示すものとなる。
【００５２】
そしてこの場合も、光検出信号Ｓ1と光検出信号Ｓ2との間の差分を求めると、各信号Ｓ1、Ｓ2に乗っていた雑音成分が相殺されるので、差分信号ＳｓはＳ／Ｎが十分に高いものとなり、該差分信号Ｓｓに基づいて上記抗原抗体反応等を精度良く検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に対する参考例としての表面プラズモン共鳴測定装置の概略側面図
【図２】本発明の第１の実施形態による表面プラズモン共鳴測定装置の概略側面図
【図３】本発明の第２の実施形態による表面プラズモン共鳴測定装置の概略側面図
【図４】本発明の表面プラズモン共鳴測定装置において使用されるセンサアレイの平面図
【図５】表面プラズモン共鳴測定装置における光ビーム入射角と、光検出手段による検出光強度との概略関係を示すグラフ
【図６】表面プラズモン共鳴測定装置における光ビームの波長と、光検出手段による検出光強度との概略関係を示すグラフ
【符号の説明】
11 誘電体プリズム
12 屈折率マッチング液
13 誘電体プレート
13ａ誘電体プレートと金属薄膜との界面
14 金属薄膜
15 試料
16 第１のレーザ光源
17 第２のレーザ光源
18、20 ダイクロイックミラー
21 第１の光検出器
22 第２の光検出器
23 差分演算回路
25 駆動制御回路
30 ビームエキスパンダ
41 第１の２次元光検出器
42 第２の２次元光検出器
43 差分演算回路
50 センサアレイ
51 センサチップ
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ光ビーム
Ｓ1、Ｓ2 光検出信号
Ｓｓ差分信号[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a surface plasmon resonance measuring apparatus that quantitatively analyzes a substance in a sample using generation of surface plasmons.
[0002]
[Prior art]
In the metal, free electrons collectively vibrate to generate a dense wave called a plasma wave. A quantized version of this dense wave generated on the metal surface is called surface plasmon.
[0003]
Conventionally, various surface plasmon resonance measuring apparatuses for quantitatively analyzing a substance in a sample using a phenomenon in which the surface plasmon is excited by a light wave have been proposed. Among them, one that uses a system called a Kretschmann arrangement is particularly well known (see, for example, JP-A-6-167443).
[0004]
A surface plasmon resonance measuring apparatus using the above system basically generates a light beam, for example, a dielectric block formed in a prism shape, a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a sample, and the like. The light source and the light beam are incident on the dielectric block so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the metal film and various incident angles including a surface plasmon resonance condition are obtained. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the surface plasmon resonance state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
[0005]
In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be deflected and incident on the interface, or a component that is incident on the light beam at various angles may be included. A relatively thick light beam may be incident so as to be focused at the interface. In the former case, a light beam whose reflection angle changes with the deflection of the light beam is detected by a small photodetector that moves synchronously with the deflection of the light beam, or by an area sensor that extends along the direction of change of the reflection angle. Can be detected. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
[0006]
In the surface plasmon resonance measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on the metal film at a specific incident angle θ _SP that is equal to or greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the sample in contact with the metal film. As a result, surface plasmons are excited at the interface between the metal film and the sample by the evanescent wave. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon, so that the entire energy is transferred to the interface between the dielectric block and the metal film. The intensity of the reflected light is sharply attenuated. This attenuation of light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means.
[0007]
FIG. 5 schematically shows the relationship between the incident angle θ and the reflected light intensity I when the total reflection attenuation phenomenon occurs. The incident angle θ _SP shown here is an incident angle at which the above-described total reflection attenuation (ATR) occurs.
[0008]
The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
[0009]
If the wave number of attenuated total reflection (ATR) surface plasmon than the incident angle theta _SP to occur is known, the dielectric constant of the sample can be determined. That is, when the wave number of the surface plasmon is K _SP , the angular frequency of the surface plasmon is ω, c is the speed of light in vacuum, ε _m and ε _s are each a metal, and the dielectric constant of the sample is as follows.
[0010]
[Expression 1]

If the dielectric constant ε _s of the sample is known, the concentration of the specific substance in the sample can be known based on a predetermined calibration curve or the like, so that by knowing the incident angle θ _{SP at} which the reflected light intensity decreases, Specific substances can be quantitatively analyzed.
[0011]
In the surface plasmon resonance measuring apparatus described above, the incident optical system is configured so that a light beam irradiates a two-dimensional region in the interface between the dielectric block and the metal film, and as the light detection means, By using a two-dimensional photodetector that detects the intensity of the light beam totally reflected at the interface at each position in the two-dimensional region, the sample placed in correspondence with the two-dimensional region Since the dielectric constant distribution in the region is obtained, the concentration distribution of the specific substance in the sample can be obtained based on the obtained dielectric constant distribution.
[0012]
As for the surface plasmon resonance measuring apparatus that irradiates the light beam to the two-dimensional region in the interface between the dielectric block and the metal film in this way, see NATURE Vol.332,14, APRIL 1988 pp.615-617. An example is shown.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, in this surface plasmon resonance measuring apparatus, in particular, when obtaining the concentration distribution of a specific substance in a sample using the above-described two-dimensional photodetector, the incident angle of the light beam with respect to the interface between the dielectric block and the metal film is In this case, there is a problem that the S / N of the light detection signal is not good.
[0014]
In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a surface plasmon resonance measuring apparatus capable of obtaining a high S / N light detection signal even when the incident angle of a light beam is fixed.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The surface plasmon resonance measuring apparatus according to the present invention includes a dielectric block, a metal film, a light source that emits a light beam, and a total reflection of the light beam with respect to the interface between the dielectric block and the metal film. In a surface plasmon resonance measuring apparatus comprising an incident optical system that is incident from a dielectric block side at a fixed incident angle that provides a condition, and a light detection means, a light beam having two or more different wavelengths is used as the light source. A plurality of adjacent light sources that emit each of the above are used, and light detection means that can measure the intensity of the light beam totally reflected at the interface between the dielectric block and the metal film for each wavelength is used. In the above, there is provided arithmetic means for obtaining a difference between light detection signals for light beams of two different wavelengths output from the light detection means, and the light source further comprises the two or more waves. It consists of an optical beam to emit at a mutually time interval, the incident optical system, with respect to the interface a light beam of the two or more wavelengths, is configured to be incident at a common angle of incidence The light detection means comprises a single photodetector that measures the intensity of the light beam for each wavelength by performing a detection operation in synchronization with the light beam emission timing of the light source. To do.
[0016]
In the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention having the above configuration,
As the plurality of light sources, after being applied as it emits each light beam of the three or more different wavelengths,
It is desirable that the calculating means is configured to obtain a difference between the light detection signals for light beams having two wavelengths that satisfy the surface plasmon resonance condition among the wavelengths.
[0019]
In addition, a plurality of light sources that emit light beams having the respective wavelengths described above are fixed at different positions so that the light beams emitted from the light sources follow the same optical path from the middle by means of, for example, a dichroic mirror. It may be configured (it is not multiplexed because it is separated in time). Alternatively, at the time of lighting, the plurality of light sources may be moved to a common position having a predetermined relative positional relationship with respect to the incident optical system, and the lighting operation may be performed at that position.
[0020]
In the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention, the incident optical system is configured to irradiate a two-dimensional region in the interface with a light beam,
It is desirable that the light detection means is composed of a two-dimensional photodetector that detects the intensity of the light beam totally reflected at the interface at each position in the two-dimensional region.
[0021]
Furthermore, in the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention, it is desirable that a sensing medium that interacts with a specific component in the sample is disposed on the surface of the metal film.
[0022]
【The invention's effect】
FIG. 6 shows the relationship between the wavelength of the light beam and the intensity of the light detection signal output from the light detection means (corresponding to the intensity of the detected total reflection light) in the surface plasmon resonance measurement apparatus of the present invention. The evanescent light and the surface plasmon resonate when the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established. When the wavelength of the light beam is changed, the total reflected light intensity changes as in the case where the incident angle θ of the light beam with respect to the interface is changed. That is, for example in the case of characteristic curves a, attenuated total reflection when the wavelength of the light beam is lambda _SP occurs.
[0023]
The relationship between the wavelength and the total reflected light intensity is shown in FIG. 6 in accordance with the dielectric constant ε _s of the sample, that is, according to the concentration of the specific substance in the sample. It changes as shown by b. Therefore, considering the case where the wavelength of the light beam is λ1 and λ2, the difference between the light detection signal relating to the light of wavelength λ1 and the light detection signal relating to the light of wavelength λ2 will vary depending on the concentration of the specific substance. . That is, for example, the difference in the case of the curve a is (S1a-S2a), whereas the difference in the case of the curve b is (S1b-S2b), and both values are clearly different.
[0024]
Therefore, by referring to a calibration curve or the like for each sample obtained in advance, the relationship between the wavelength and the total reflected light intensity can be estimated based on this difference, and the specific substance in the sample can be quantitatively analyzed.
[0025]
Then, as described above, when the difference between the two light detection signals is obtained, the noise component on each signal is canceled out. Therefore, this difference signal has a sufficiently high S / N, and is based on the difference signal. This enables quantitative analysis of specific substances with high accuracy.
[0026]
Of the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention, in particular, as the light source, one that emits light beams having three or more different wavelengths is used, and the calculation means includes surface plasmon resonance of those wavelengths. In the configuration in which the difference between the light detection signals for the light beams having two wavelengths satisfying the condition is obtained, a certain wavelength deviates from the surface plasmon resonance condition by preparing three or more wavelengths. Even in such a case, since it becomes easy to secure two other wavelengths that satisfy the surface plasmon resonance condition, it is possible to deal with various samples.
[0027]
In the surface plasmon resonance measurement apparatus of the present invention, in particular, the incident optical system is configured to irradiate a two-dimensional region in the interface with a light beam, while the light detection means is totally reflected at the interface. Since the difference signal is obtained for each position in the two-dimensional region in the case of the two-dimensional photodetector configured to detect the intensity of the light beam for each position in the two-dimensional region, the difference signal is obtained. The concentration distribution of the specific substance in the region can be obtained based on the above.
[0028]
In the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention, in particular, in the case where a sensing medium that interacts with a specific component in the sample is arranged on the surface of the metal film, the sample is held on the sensing medium. Furthermore, since the state of surface plasmon resonance changes due to the above interaction, a specific reaction between a specific component in the sample and the sensing medium can be detected by capturing this change.
[0029]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 shows a schematic side shape of a surface plasmon resonance measuring apparatus as a reference example for the present invention.
[0030]
As shown in the figure, the surface plasmon resonance measuring apparatus includes, for example, a transparent dielectric prism 11 formed in a triangular prism shape, and a transparent dielectric plate 13 fixed to the upper surface of the dielectric prism 11 via a refractive index matching liquid 12. And a metal thin film 14 made of, for example, gold, silver, copper, aluminum, or the like, formed on the upper surface of the dielectric plate 13. A sample 15 to be analyzed is placed on the metal thin film 14. In this example , a dielectric block is formed by the transparent dielectric prism 11, the refractive index matching liquid 12, and the transparent dielectric plate 13.
[0031]
A first laser light source 16 that emits a light beam L1 having a wavelength λ1 and a second laser light source 17 that emits a light beam L2 having a wavelength λ2 are provided. These light beams L1 and L2 transmit the former. Then, the light beam L is combined into one light beam L by a dichroic mirror 18 as an incident optical system for reflecting the latter. The combined light beam L enters the dielectric prism 11 in a thin parallel light state, and enters the interface 13a between the dielectric plate 13 and the metal thin film 14. The incident angle θ at this time is set to a value within a range where the total reflection condition of the light beam L is obtained at the interface 13a and surface plasmon resonance can occur.
[0032]
The light beam L needs to be incident on the interface 13a as p-polarized light. In order to do so, the first laser light source 16 and the second laser light source 17 may be disposed in advance so that the polarization directions of the light beams L1 and L2 become a predetermined direction. In addition, the direction of polarization of the light beams L1 and L2 may be controlled by a wave plate or a polarizing plate.
[0033]
The light beam L incident on the interface 13a is totally reflected there, and the totally reflected light beam L is transmitted to the light beam L1 having the wavelength λ1 by the dichroic mirror 20 that transmits the light having the wavelength λ1 and reflects the light having the wavelength λ2. It is demultiplexed into a light beam L2 of λ2. The light beam L1 and the light beam L2 are detected by a first light detector 21 and a second light detector 22 each made of, for example, a photodiode.
[0034]
Both the light detection signal S 1 output from the first light detector 21 and the light detection signal S 2 output from the second light detector 22 are input to the difference calculation circuit 23. The difference calculation circuit 23 obtains a difference between the input light detection signals S1 and S2 and outputs a difference signal Ss.
[0035]
Hereinafter, sample analysis by the surface plasmon resonance measuring apparatus having the above configuration will be described. A sample 15 to be analyzed is placed on the metal thin film 14. Then, the

laser light sources

16 and 17 are driven, and light beams L1 and L2 respectively emitted from them are combined by the dichroic mirror 18, and the combined light beam L is an interface 13a between the dielectric plate 13 and the metal thin film 14. Is incident at a constant incident angle θ. Since the incident angle θ is set as described above, the light beam L is totally reflected at the interface 13a.
[0036]
Thus, when the light beam L is totally reflected, an evanescent wave oozes out from the interface 13a to the metal thin film 14 side. When the incident angle θ is fixed, the intensity of the total reflected light (that is, the intensity of the light detection signals S1 and S2 output from the photodetectors 21 and 22) is shown in FIG. 6 according to the light wavelength λ as described above. To change. That is, when the light wavelength λ is λ _SP , the evanescent wave resonates with the surface plasmon excited on the surface of the metal thin film 14, so that the reflected light intensity sharply attenuates for the light with the wavelength λ _SP .
[0037]
The relationship between the wavelength and the total reflected light intensity is shown in FIG. 6 in accordance with the dielectric constant ε _s of the sample, that is, according to the concentration of the specific substance in the sample. It changes as shown by b. Therefore, the value of the difference signal Ss obtained by taking the difference between the light detection signals S1 and S2 changes according to the concentration of the specific substance. Accordingly, by referring to a calibration curve or the like for each sample obtained in advance, the relationship between the wavelength and the total reflected light intensity can be estimated based on the value of the difference signal Ss, and the specific substance in the sample 15 can be quantitatively analyzed. .
[0038]
When the difference between the two light detection signals S1 and S2 is obtained as described above, the noise component on each of the signals S1 and S2 is canceled, so that the difference signal Ss has a sufficiently high S / N. Based on the difference signal Ss, quantitative analysis of a specific substance can be performed with high accuracy.
[0039]
Next, a first embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. FIG. 2 shows a schematic side surface shape of the surface plasmon resonance measuring apparatus according to the first embodiment. In FIG. 2, the same elements as those in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals, and description thereof will be omitted unless necessary (the same applies hereinafter).
[0040]
In the surface plasmon resonance measuring apparatus of the first embodiment, the driving of the first laser light source 16 and the second laser light source 17 is controlled by the drive control circuit 25, and the first laser light source 16 is driven for a predetermined time. After stopping, the second laser light source 17 is driven with a time interval. Thus, after the light beam L1 having the wavelength λ1 is incident on the interface 13a between the dielectric plate 13 and the metal thin film 14, the light beam L2 having the wavelength λ2 is incident on the interface 13a with a time interval.
[0041]
On the other hand, only the first light detector 21 is provided as the light detecting means, and the operation of the light detector 21 is also controlled by the drive control circuit 25. That is, the photodetector 21 performs detection operation in synchronism when the first laser light source 16 is driven and when the second laser light source 17 is driven. First, the light relating to the light beam L1 having the wavelength λ1 is detected. The detection signal S1 is output, and then the light detection signal S2 relating to the light beam L2 having the wavelength λ2 is output.
[0042]
As described above, both the light detection signal S1 and the light detection signal S2 output from the light detector 21 with a time interval are input to the difference calculation circuit 23. The difference calculation circuit 23 temporarily stores the input photodetection signals S1 and S2 in an internal memory (not shown), then obtains a difference between them, and outputs a difference signal Ss.
[0043]
Also in this case, the same effect as that of the reference example described above can be obtained by using the above-described difference signal Ss.
[0044]
Next, FIG. 3 shows a schematic side surface shape of a surface plasmon resonance measuring apparatus according to a second embodiment of the present invention. In the surface plasmon resonance measuring apparatus according to the second embodiment, the light beam L after being combined by the dichroic mirror 18 is expanded in diameter by the beam expander 30, and the dielectric plate 13 and the metal thin film 14 are in this state. Incident on the interface 13a. Therefore, the light beam L irradiates a two-dimensional region in the interface 13a.
[0045]
The light beam L totally reflected at the interface 13a is split by the dichroic mirror 20 into a light beam L1 having a wavelength λ1 and a light beam L2 having a wavelength λ2. The light beam L1 and the light beam L2 are detected by a first two-dimensional photodetector 41 and a second two-dimensional photodetector 42, each of which is composed of a two-dimensional CCD sensor, for example.
[0046]
Also in this case, the light detection signal S1 output from the first two-dimensional photodetector 41 and the light detection signal S2 output from the second two-dimensional photodetector 42 are both input to the difference calculation circuit 43. . The difference calculation circuit 43 obtains a difference signal Ss by obtaining a difference between the signals S1 and S2 for each signal related to the same pixel (that is, related to the same position in the interface 13a) from the input light detection signals S1 and S2. Output.
[0047]
In the surface plasmon resonance measuring apparatus according to the second embodiment, the light detection signals S1 and S2 output from the two-

dimensional photodetectors

41 and 42 respectively are in a two-dimensional region in the interface 13a irradiated with the light beam L. 2 shows the dielectric constant distribution of the sample 15, that is, the concentration distribution of the specific substance in the sample 15.
[0048]
When the difference between the photodetection signal S1 and the photodetection signal S2 is obtained, noise components on the signals S1 and S2 are canceled out, so that the differential signal Ss has a sufficient S / N ratio. Therefore, the concentration distribution of the specific substance can be obtained with high accuracy based on the difference signal Ss.
[0049]
The surface plasmon resonance measuring apparatus of the present embodiment uses a sensor array in which a large number of sensor chips are two-dimensionally arranged in addition to obtaining the concentration distribution of a specific substance in one sample 15 as described above. Thus, it can also be used to collectively perform quantitative analysis of the samples held in these sensor chips.
[0050]
FIG. 4 shows an example of such a sensor array. The sensor array 50 is formed by two-dimensionally arranging a large number of sensor chips 51, and is used by being arranged on the metal thin film 14 instead of the sample 15 in the apparatus of FIG. The sensor chip 51 holds, for example, a sensing medium that binds to a specific substance in a sample to be analyzed. Examples of the combination of the specific substance and the sensing medium include an antigen and an antibody. In that case, the antigen-antibody reaction can be detected based on the difference signal Ss obtained by taking the difference between the light detection signal S1 and the light detection signal S2.
[0051]
Since each of the light detection signals S1 and S2 carries two-dimensional information in the interface 13a irradiated with the light beam L, if the difference signal Ss corresponding to each position of the multiple sensor chips 51 is extracted. The extracted difference signal Ss indicates information for each sensor chip 51 (antigen-antibody reaction in the above example).
[0052]
In this case as well, if the difference between the light detection signal S1 and the light detection signal S2 is obtained, the noise components on the signals S1 and S2 are canceled out, so that the difference signal Ss has a sufficient S / N ratio. Therefore, the antigen-antibody reaction and the like can be detected with high accuracy based on the difference signal Ss.
[Brief description of the drawings]
The disclosed exemplary schematic side view of the invention with respect to the surface plasmon resonance measuring apparatus according to a first embodiment of a schematic side view of a surface plasmon resonance measuring apparatus [2] The present invention as reference example 3 shows the present invention FIG. 4 is a schematic side view of a surface plasmon resonance measuring apparatus according to the second embodiment. FIG. 4 is a plan view of a sensor array used in the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention. FIG. 6 is a graph showing a schematic relationship between the light intensity detected by the light detection means and FIG. 6 is a graph showing a schematic relationship between the wavelength of the light beam and the light intensity detected by the light detection means in the surface plasmon resonance measurement apparatus.
11 Dielectric prism
12 Refractive index matching liquid
13 Dielectric plate
13a Interface between dielectric plate and metal thin film
14 Metal thin film
15 samples
16 First laser source
17 Second laser source
18, 20 Dichroic mirror
21 First photodetector
22 Second photodetector
23 Difference calculation circuit
25 Drive control circuit
30 beam expander
41 First two-dimensional photodetector
42 Second two-dimensional photodetector
43 Difference calculation circuit
50 sensor array
51 Sensor chips L1, L2, L Light beams S1, S2 Photodetection signal Ss Difference signal

Claims

A dielectric block;
A metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with the sample;
A plurality of light sources provided to emit light beams of two or more wavelengths different from each other;
The light beams having two or more wavelengths are incident on the interface between the dielectric block and the metal film at the same position on the interface from the dielectric block side at a fixed incident angle at which a total reflection condition is obtained. An incident optical system;
Light detection means for measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface for each wavelength;
In the surface plasmon resonance measuring apparatus comprising the calculating means for obtaining the difference between the light detection signals for the light beams having two different wavelengths outputted from the light detecting means,
The light source is configured to emit light beams of the two or more wavelengths at time intervals from each other;
The incident optical system is configured to make the light beams having the two or more wavelengths incident on the interface at a common incident angle;
The light detection means is composed of one light detector that measures the intensity of the light beam for each wavelength by performing a detection operation at a timing synchronized with the light beam emission timing of the light source. Surface plasmon resonance measuring device.

The plurality of light sources each emit light beams having three or more wavelengths different from each other;
2. The surface plasmon resonance according to claim 1, wherein the calculating means is configured to obtain a difference between light detection signals for light beams having two wavelengths satisfying a surface plasmon resonance condition among the wavelengths. measuring device.

The incident optical system is configured to irradiate a two-dimensional region in the interface with the light beam;
Said light detecting means, the intensity of the light beam totally reflected at the interface, according to claim 1, characterized in that it is composed of the two-dimensional photodetector for detecting each position of said 2-dimensional area or The surface plasmon resonance measuring apparatus described.

Wherein on the surface of the metal film, the surface plasmon resonance measuring apparatus that 3 any of the preceding claims 1, wherein the sensing media produces a specific component and the interaction of the sample is disposed.