JP4026848B2 - 免疫原の受容体特異的経上皮輸送 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、概して、抗原に対して免疫応答を開始する方法および製品に関し、特に、寛容性および免疫性を引き起こす抗原の経上皮供給に関する。
発明の背景
哺乳動物の免疫系は妊娠中に現れ、そして後期哺乳動物胎児において活発になる。活発ではあるが、それは抗原によってほとんど刺激されていないので、すなわち、胎児は主として母親によって抗原から保護されているので、それはまだ「未熟」と特徴付けられるかもしれない。しかしながら、この「未熟な」免疫系は、母性免疫グロブリンの胎児への（または若干の場合、新生児への）伝達によって補足されて、生命が独立して最初の何週間かの間に体液性免疫を与える。
ラットおよびマウスは、大部分の母性免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を初乳および乳から哺乳しながら得るが、ある程度は出生前に獲得している。ウシもまた、初乳からＩｇＧを得る。ウサギでは、ＩｇＧは卵黄嚢を通過して胎児へ輸送される。ヒトにおけるＩｇＧの胎児または新生児への伝達についてはほとんど知られていない。多くの結果は、ヒト母親は体液性免疫を子に対して誕生前にしか伝達しないことを示唆しているが、母乳によって新生児へ伝達されるＩｇＡは、新生児を腸内感染から保護することにおいてある役割を果たしていると考えられる。
母性ＩｇＧの哺乳動物および／または新生児への供給は、巨大分子をほとんど通さない上皮関門を通過する輸送を必要とする。このような上皮関門を通過する巨大分子の輸送は、非特異的および特異的受容体依存性機序によって引き起こすことができる。受容体非特異的機序は、傍細胞（paracellular）篩現象によって示され、その効率は、輸送される分子の分子量と逆の関係にある。この傍細胞経路を通過するＩｇＧなどの巨大分子の輸送は極めて非能率的である。腸内上皮細胞による免疫グロブリンの受容体依存性輸送の説明は、今までのところ、ポリマー免疫グロブリン受容体およびＩｇＧの腸細胞受容体（主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連Ｆｃ受容体）に限定されている。これら二つの受容体系は、それらの免疫グロブリンイソタイプ、上皮細胞を通るそれらの免疫グロブリン輸送の方向およびそれらの組織特異的発現が異なる。両方とも、未熟な免疫系を形成させるのにある役割を果たすことができる。
ポリマー免疫グロブリン受容体は、腸細胞、肝細胞および／または胆管上皮細胞の基底外側表面上で発現される。それは、ポリマーＩｇＡおよびＩｇＭを先端（管腔）表面へ輸送して、抗微生物防御および抗原排除のためにこれらの免疫グロブリンを集中させる。
ＩｇＧの腸細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩ重鎖に対して相同性を有し且つβ2−ミクログロブリン（β2Ｍ）と結合していて、ラットおよびマウスの新生児腸細胞で発現される。ＩｇＧは、これらの齧歯類動物新生児の腸管上皮を通過して管腔中を漿膜方向へと細胞透過（transcellularly）輸送される。腸細胞の先端表面上において、ＩｇＧのＦｃ部分は、管腔の比較的酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）で腸細胞受容体に対して結合している。基底外側原形質膜への細胞透過（transcytosis）後、免疫グロブリンの放出は、間隙液の比較的中性ｐＨ（約ｐＨ７．４）で起こる。したがって、齧歯類動物新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、新生児への母性ＩｇＧの供給に関与することができたし、しかもそれ自体がこの期間中のＩｇＧの受動獲得に関与することができる。
ヒトにおいて、母性ＩｇＧは胎盤を越えて能動的に輸送される。この輸送に関与する受容体は何年間も探求されてきた。いくつかのＩｇＧ結合タンパク質が胎盤から単離されている。ＦｃγＲＩＩは胎盤内皮で検出され且つＦｃγＲＩＩＩは合胞体栄養細胞層で検出された。しかしながら、これら受容体は両方とも、モノマーＩｇＧに対して比較的低い親和性を示した。最近、ラットおよびマウスのＩｇＧ腸細胞受容体のヒト相同染色体をコードしているｃＤＮＡの胎盤からの単離が報告された。（スートリー（Story）,C.M. ら，J.Exp.Med.,180巻：2377-2381,1994年12月）完全なヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列が報告されている。ＩｇＧのこのＦｃ受容体は、その分子がラットＦｃＲｎ配列を含むその読み取り枠にわたって極めて相同であるので（ヌクレオチド同一６９％および推定アミノ酸同一６５％）、ヒト胎児への（そしておそらくは新生児にさえも）母性ＩｇＧの輸送に関与しうる。ヒト胎児（およびおそらくはヒト新生児）におけるいわゆる受動免疫感作は、ここでより良く理解されることになりうる。
宿主の免疫系を他に由来する抗体で補うことを必要とする受動免疫感作とは対照的に、能動免疫感作は、所望の免疫応答をin vivoで生じるために宿主自身の免疫系の刺激を必要とする。子供および成体における能動免疫感作の最も広く実施されている方法は、免疫原を初回量として１回、続いてブースター量として少なくとももう１回注射することを行う。これらの方法には、エイズおよび肝炎などの疾患を伝染することがある注射針の使用に関係した危険を含めた多数の重大な欠点がある。（患者をアレルゲンに対して寛容にさせた場合、長期間にわたる反復注射がしばしば必要とされることで、問題は大きくなる）これらの方法はまた、多数の病原体に対する第一線の防御、すなわち、粘膜免疫を必ずしも適当に引き起こさせるものではない。粘膜は、気道、生殖系および胃腸管の内側を覆っていて、そしてこの粘膜表面が多数の疾患の最初の入口である。供給するのに容易であり且つ粘膜免疫を引き起こす経口ワクチンは大いに望まれるであろう。
経口ワクチンを用いる免疫感作は問題が多い。しばしば、免疫応答がほとんどまたは全く得られない。免疫応答を促すために、目的の抗原は、免疫原性が強いことが知られている担体に対して結合されてきた。例えば、研究者らは、カルメット・ゲラン杆菌（Bacille Calmette-Gurein）（ＢＣＧ）を担体として用いて抗原を供給してきており、ＢＣＧは、結核に対する経口ワクチンとして最初に用いられた細菌である。このような担体での問題は、患者がその担体自体に対する抗体を生じるであろうということであり、それは、同じ患者に対して別の抗原を与えるためにその担体を再度用いる場合に厄介なことがありうる。これまでに、経口ワクチンの一般的な方策の成功は実証されていない。
従来、免疫グロブリンおよびその部分を薬物および造影剤に対して結合させて、細胞集団に集中させ且つそれらを破壊し、そして若干の薬剤の半減期を延長させてきた。免疫毒素はこのような結合体の一例である。しかしながら、このような結合体は、免疫応答を開始させるのに有用であると提案されたことはなかった。
研究の中心は僅かながら、自己免疫疾患に特有のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質に対して結合した免疫グロブリンの免疫寛容を生じる能力に集中してきた。（ＰＣＴ ＷＯ91/08773号を参照されたい）。この研究は、寛容性の誘導が担体分子によって強く影響を受けることがありうるおよび免疫グロリン担体が強く免疫寛容を生じるらしいという概念に基づく。同種同系ＩｇＧは好ましい担体であり、そして静脈内投与は、ＩｇＧの結合体を供給するのに用いられた方式であった。この研究内容は１０年間を越えているが、経口投与は一度だけ、しかもＩｇＡが免疫グロブリン担体である結合体についてだけ述べられている。このように、免疫寛容を生じる免疫グロブリン結合体は当該技術分野において知られているが、このような結合体は、病原体に特有の抗原に対して強い応答を引き起こすための薬剤として示唆されたことはなかった。（これに反して、当該技術分野は、このような結合体は、どんなものであっても、極めて望ましくないと考えられる病原体に対して対象を寛容にさせるであろうと示唆している）。更に、このような結合体は、免疫グロブリンがＩｇＧであり且つ供給方式が経口供給である場合に有効な寛容原性抗原であろうと示唆されたことはなかった。
発明の概要
本発明は、免疫グロブリンまたはその部分などの、ＦｃＲｎ受容体に結合する分子に対して抗原を結合させ、そしてそれを、ＦｃＲｎ受容体によって腸細胞を介する能動輸送によって上皮関門を通過して供給することができるという知見に関する。免疫グロブリンまたはその部分は、ＦｃＲｎ依存性輸送によって上皮関門を通過して輸送されるように、免疫グロブリンまたはその部分はＦｃＲｎ受容体に結合し且つ抗原の担体として働く。ＦｃＲｎ受容体は、ヒトの子供および成人の上皮組織中に存在し、したがって、本発明は、ヒトを免疫感作するのに有効な方策を可能にする。
本発明の一つの態様により、哺乳動物の免疫系を調節する方法を提供する。抗原およびＦｃＲｎ結合パートナーの結合体の有効量を、このような免疫調節を必要としている哺乳動物の上皮関門に対して投与する。抗原は、病原体の特徴を示す抗原、自己免疫疾患の特徴を示す抗原、アレルゲンの特徴を示す抗原および腫瘍の特徴を示す抗原から成る群より選択される。好ましい実施態様において、ＦｃＲｎ結合パートナーは、非特異的ＩｇＧ、またはＩｇＧのＦｃＲｎ結合フラグメントである。最も好ましくは、ＦｃＲｎ結合パートナーはＩｇＧのＦｃフラグメントである。更に、抗原がＦｃＲｎ結合パートナーに対して共有結合していることは好ましい。好ましくは、結合体は、経口によって腸管上皮に、エアゾルで肺にまたは鼻腔内に投与される。このような製剤は無菌でなくてよい。以下に記載のような補足増強剤を更に投与してよい。
本発明のもう一つの態様により、製剤を提供する。該製剤は、抗原およびＦｃＲｎ結合パートナーの結合体を含み、この抗原は、病原体の特徴を示す抗原、自己免疫疾患の特徴を示す抗原、アレルゲンの特徴を示す抗原および腫瘍の特徴を示す抗原から成る群より選択される。好ましいＦｃＲｎ結合パートナーは上記の通りである。結合体は、哺乳動物の免疫応答を調節する有効量で存在する。該製剤は、更に、薬学的に許容しうる担体を含む。本発明の製剤は、腸管上皮への経口供給、肺上皮へのエアゾル供給および鼻腔上皮への鼻腔内供給などの上皮輸送担体への供給用に構築され且つ調整された単位剤形で製剤化されうる。したがって、上記で特徴付けられる抗原のいずれかに結合したＩｇＧ（またはそのＦｃＲｎ結合部分）を含有する錠剤は、本発明によって包含される。
前述の製剤は、アジュバント、サイトカイン、生体接着剤等を含めた補足増強剤と一緒に供給することができる。補足増強剤自体、ＦｃＲｎ結合パートナーに結合して、上皮関門を通過するこのような薬剤の供給を促進することができる。好ましい投与方式は、概して、腸管上皮への経口投薬、肺へのエアゾル剤および鼻腔内投薬を含む。
本発明のもう一つの態様により、上記の結合体を、哺乳動物の免疫系を調節するための薬剤の製造において用いる。好ましい成分および製剤は上記の通りである。
本発明の更にもう一つの態様により、免疫調節剤を製造する方法を提供する。該方法は、抗原または補足増強剤をＦｃＲｎ結合パートナーに共有結合させることを行い、この抗原または補足増強剤は上記の通り選択される。好ましいＦｃＲｎ結合パートナーも上記の通りである。次に、その結合体を用いて、上記のように哺乳動物の免疫応答を調節するための製剤を製造することができる。
本発明の更にもう一つの態様において、抗原を含む結合体は、その抗原が非結合型で上皮関門を通過する範囲の少なくとも２倍の量で上皮関門を通過する。したがって、本発明の目的は、上皮関門を通過する抗原の能力を増加させる機序を開発することである。
本発明のもう一つの目的は、経口によって能動的な免疫原および寛容原性抗原の新規な種類を開発することである。
本発明のもう一つの目的は、粘膜免疫を刺激する改良された方法を開発することである。
本発明のこれらのおよび他の態様を、以下に更に詳細に記載する。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトＦｃＲｎ受容体が成体上皮組織において活性であるという知見およびＩｇＧまたはＦｃフラグメントなどのＦｃＲｎ結合パートナーを用いて、抗原を含めた他の分子を上皮関門を通過して輸送することができるという知見に関する。この方式において、ＩｇＧまたはそのＦｃＲｎ結合部分などのＦｃＲｎ結合パートナーを用いて、上皮関門を通過して抗原を対象の免疫系に供給することができ、それによって免疫応答を開始させることができる。
本発明は、上皮関門を越えて免疫系への抗原の供給を促進することが望まれる場合にはいつでも有用である。したがって、本発明は、腸管上皮組織、肺上皮組織、並びに鼻腔表面、腟表面、結腸表面および胆管樹状構造表面を含めた他の粘膜表面を通過して抗原を供給するのに用いることができる。本発明は、抗原に対する体液性抗体反応を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、または抗原に対する寛容性を刺激することなどによって対象の免疫系を調節するのに用いることができる。本明細書中で用いられる対象とは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ニワトリおよび齧歯類動物を意味する。
腫瘍抗原を供給する場合、本発明は、小形の非充実腫瘍または充実腫瘍などの免疫依存性拒絶反応に従う疾患を有する対象を治療するのに用いることができる。更に、本明細書中に記載の方法による腫瘍抗原の供給は、大形の充実腫瘍の除去を伴う治療に有用であろうと考えられる。本発明は、更に、癌を有すると疑われる対象を治療するのに用いることができる。
本発明は、ＦｃＲｎ結合パートナーおよび抗原の結合体の形成に関する。結合体とは、抗原と抗体分子の非特異的疎水性部分との間の疎水的相互作用、抗体−抗原特異的結合、および共有結合を含めた何等かの物理化学的手段によって互いに結合した二つの物質を意味する。好ましい結合の性質は、特に、選択された上皮関門に対して結合体を供給するのに用いられる投与方式および薬剤担体に依るであろう。例えば、若干の結合は、胃などのある種の環境に耐える他のものほど充分に適していないが、胃を回避する供給システムによってそこから保護されることができる。当然ながら、ＦｃＲｎ結合パートナーと抗原との間の結合は、それが、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃＲｎ結合パートナーの能力を破壊しない性質を有することが重要である。このような結合は当業者に周知であり、例を以下に更に詳細に与える。結合体は、更に、以下に更に詳細に論及される融合タンパク質としても形成されうる。
ＦｃＲｎ結合パートナーとは、ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体による結果としての能動輸送を伴ってＦｃＲｎ受容体によって特異的に結合することができる任意の物質を意味する。上述のように、ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含めた数種類の哺乳動物種について単離されてきた。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎおよびマウスＦｃＲｎの配列は、スートリー,C.M．ら，J.Exp.Med.,180巻：2377-2381,1994年12月で見出されうる。ＦｃＲｎ受容体分子はここで充分に特性決定されている。ＦｃＲｎ受容体は、比較的低いｐＨで（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥなどの他の免疫グロブリンクラスではなく）ＩｇＧを結合し、そのＩｇＧを漿膜方向へと管腔中を細胞透過によって能動的に輸送した後、腸管液で見られる比較的高いｐＨでＩｇＧを放出する。当業者によって理解されるように、ＦｃＲｎ受容体は、クローニングによってかまたは、例えば、単クローン性抗体を用いるアフィニティー精製によって単離することができる。次に、このような単離されたＦｃＲｎ受容体を用いて、以下に記載のようにＦｃＲｎ結合パートナーを識別し且つ単離することができる。
ＦｃＲｎ結合パートナーとしては、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃフラグメント、およびＦｃＲｎ受容体の完全な結合部分を含むＩｇＧの他のフラグメントがある。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の範囲は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されてきた（ビルマイスター（Burmeister）,W.P．ら，Nature,1994;372:379-378）。ＦｃとＦｃＲｎ受容体との主な接触部分は、ＣH２およびＣH３ドメインの結合部付近である。可能な接触は、ＣH２の残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１および３１４並びにＣH３中の３８５〜３８７、４２８および４３３〜４３６である。（これらの部位は、白血球ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩに対するＦｃ結合に重要であるようなサブクラス比較によってまたは部位特異的突然変異誘発によって識別されたものとは異なる。）前述のＦｃ−ＦｃＲｎ接触は全て、単一のＩｇ重鎖中である。二つのＦｃＲｎ受容体が一つのＦｃ分子を結合することができるということは以前に注目されていた。結晶学データは、このような複合体において、それぞれのＦｃＲｎ分子がＦｃホモ二量体の一つのポリペプチドを結合することを示唆している。
前述の情報が与えられると、当業者は、部位特異的突然変異誘発等のような充分に理解された手順にしたがってＩｇＧのＦｃ部分を修飾して、ＦｃＲｎ受容体によって結合されるであろう修飾されたＩｇＧまたはその修飾されたＦｃフラグメント若しくは部分を生じることができるということを容易に理解するであろう。このような修飾には、ＦｃＲｎ接触部位から遠く離れた修飾並びに結合を保存するかまたは増強することさえある接触部位中の修飾が含まれる。更に、他の結合パートナーが識別され且つ単離されうる。ＦｃＲｎ受容体に特異的で且ついったん結合したＦｃＲｎによって輸送されることができる抗体またはそれらの部分は、充分に確立された技術を用いて識別され且つ単離されうる。同様に、無作為に生じた分子的に異なったライブラリーをスクリーニングすることができるし、そしてＦｃＲｎ受容体によって結合され且つ輸送される分子を、慣用的な技法を用いて単離することができる。本発明は、何等かの特定のＦｃＲｎ結合パートナーの選択によって制限されるものではない。結合パートナーがＩｇＧまたはそのＦｃＲｎ結合部分である場合、ＩｇＧまたはその部分は、以下に更に詳細に記載される慣用法にしたがって製造することができる。
ＦｃＲｎ結合パートナーを抗原と結合させる。本明細書中で用いられる抗原は、４種類のクラス、すなわち、（１）病原体の特徴を示す抗原；（２）自己免疫疾患の特徴を示す抗原；（３）アレルゲンの特徴を示す抗原；および（４）腫瘍の特徴を示す抗原に分かれる。抗原には、概して、細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリア等からの多糖、糖脂質、糖タンパク質、ペプチド、タンパク質、炭水化物および脂質が含まれる。
病原体の特徴を示す抗原としては、ウイルス、細菌、寄生生物または真菌に由来する抗原がある。重要な病原体の例としては、コレラ菌（Vibrio cholerae）、腸毒素原性大腸菌（Escherichia coli）、ロタウイルス、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、赤痢菌属（Shigella）種、チフス菌（Salmonella typhi）、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ボレラ・バーグドルフェリ（Borella burgdorferi）、ＨＩＶ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、狂犬病ウイルスおよびエプスタイン・バールウイルスがある。
ウイルスとしては、概して、次の科に限定されるわけではないが、ピコルナウイルス科；カリチウイルス科；トガウイルス科；フラビウイルス科；コロナウイルス科；ラブドウイルス科；フィロウイルス科（filoviridae）；パラミクソウイルス科；オルソミクソウイルス科；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科；ヘパドナウイルス科（hepadonaviridae）；パルボウイルス科；パポバウイルス科；アデノウイルス科；ヘルペスウイルス科；およびポキシスウイルス科（poxyviridae）がある。
細菌としては、概して、限定されるわけではないが、緑膿菌（P.aeruginosa）；大腸菌；クレブシエラ属（Klebsiella）種；セラチア属（Serratia）種；シュードモナス属（Pseudomonas）種；Ｐ．セパシア（cepacia）；アシネトバクター属（Acinetobacter）種；表皮ブドウ球菌（S.epidemis）；Ｅ．フェカリス（faecalis）；肺炎連鎖球菌；黄色ブドウ球菌；ヘモフィルス属（Haemophilus）種；ナイセリア属（Neisseria）種；髄膜炎菌（N.meningitidis）；バクテロイデス属（Bacteroides）種；シトロバクター属（Citrobacter）種；ブランハメラ属（Branhamella）種；サルモネラ属（Salmonella）種；赤痢菌属種；Ｓ．ピオジェネス（pyogenes）；プロテウス属（Proteus）種；クロストリジウム属（Clostridium）種；エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）種；レステリア属（Lesteria）種；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；ストレプトバシラス属（Streptobacillus）種；スピリルム属（Spirillum）種；フソスピロヘータ属（Fusospirocheta）種；梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）；ボレリア属（Borrelia）種；放線菌（Actinomycetes）；マイコプラスマ属（Mycoplasma）種；クラミジア属（Chlamydia）種；リケッチア属（Rickettsia）種；スピロヘータ属（Spirochaeta）；レジュネラ属（Legionella）種；ミコバクテリア（Mycobacteria）種；ウレアプラスマ属（Ureaplasma）種；ストレプトミセス属（Streptomyces）種；トリコモラス属（Trichomoras）種；およびＰ．ミラビリス（mirabilis）がある。
寄生生物としては、限定されるわけではないが、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫（P.vivax）、卵形マラリア原虫（P.ovale）、四日熱マラリア原虫（P.malaria）；トキソプラスマ（Toxoplasma gondii）；メキシコリーシュマニア（Leishmania mexicana）、熱帯リーシュマニア（L.tropica）、Ｌ．メジャー（major）、Ｌ．エチオピカ（aethiopica）、ドノヴァンリーシュマニア（L.donovani）；トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）、Ｔ．ブルセイ（brucei）；マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、ビルハルツ住血吸虫（S.haematobium）、日本住血吸虫（S.japonium）；旋毛虫（Trichinella spiralis）；バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）；マレー糸状虫（Brugia malayi）；赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）；蟯虫（Enterobius vermiculoarus）；有鉤条虫（Taenia solium）、無鉤条虫（T.saginata）；腟トリコモナス（Trichomonas vaginatis）、腸トリコモナス（T.hominis）、口腔トリコモナス（T.tenax）；ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）；クリプトスポリジウム・パルヴム（Cryptosporidium parvum）；ニューモシティス・カリニイ（Pneumocystis carinii）；バベシア・ボビス（Babesia bovis）、Ｂ．ダイバージェンス（divergens）、Ｂ．ミクロティ（microti）；イソスポラ・ベリ（Isospora belli）、Ｉ．ホミニス（hominis）；二核アメーバ（Dientamoeba fragilis）；回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）；回虫（Ascaris lumbricoides）；アメリカ鉤虫（Necator americanis）；十二指腸鉤虫（Ancylostoma duodenale）；糞線虫（Strongyloides stercoralis）；フィリピン毛頭虫（Capillaria philippinensis）；広東住血線虫（Angiostrongylus cantonensis）；矮小条虫（Hymenolepis nana）；広節裂頭条虫（Diphyllobothrium latum）；単包条虫（Echinococcus granulosus）、多包条虫（E.multilocularis）；ヴェステルマン肺吸虫（Paragonimus westermani）、Ｐ．カリエンシス（caliensis）；クロノルキス・シネンシス（Chlonorchis sinensis）；オピストルキス・フェリネウス（Opisthorchis felinus）、Ｏ．ビベリニ（viverrini）；肝蛭（Fasciola hepatica）；疥癬虫（Sarcoptes scabiei）；ヒトジラミ（Pediculus humanus）；ケジラミ（Phthirius pubis）；およびヒトヒフバエ（Dermatobia hominis）がある。
真菌としては、概して、限定されるわけではないが、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）；ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）；真菌（Ajellomyces dermatitidis）；ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）；コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）；カンジダアルビカンス（C.albicans）、Ｃ．トロピカリス（tropicalis）、Ｃ．パラプシローシス（parapsilosis）、Ｃ．ギリエルモンディイ（guilliermondii）およびＣ．クルセイ（krusei）を含めたカンジダ属（Candida）種；Ａ．フミガツス（fumigatus）、黄色アスペルギルス（A.flavus）および黒色アスペルギルス（A.niger）を含めたアスペルギルス属（Aspergillus）種；クモノスカビ属（Rhizopus）種；リゾムコール属（Rhizomucor）種；カニンガメラ属（Cunninghammella）種；Ａ．サクセネア（saksenaea）、Ａ．ムコール（mucor）およびＡ．アブシジア（absidia）を含めたアポフィソミセス属（Apophysomyces）種；スポロトリクス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）；ブラジルパラコクシジオイデス（Paracoccidioides brasiliensis）；シューダルエシェリア・ボイディイ（Pseudallescheria boydii）；トルロプシス・グラブラタ（Torulopsis glabrata）；および皮膚糸状菌（Dermatophytes）種がある。
自己免疫疾患の特徴を示す抗原は、典型的に、哺乳動物組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリア等に由来するであろう。例としては、ブドウ膜炎（例えば、Ｓ抗原）、真性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、慢性関節リウマチ、悪性貧血、アディソン病、強皮症、自己免疫委縮性胃炎、早発閉経（希な症例）、雄性不妊症（希な症例）、若年型糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天庖瘡、類天庖瘡、交感性眼炎、水晶体原性ブドウ膜炎、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変（希な症例）、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、多／皮膚筋炎および円板状エリテマトーデスに特有の抗原がある。
アレルゲンであるである抗原は、概して、タンパク質または糖タンパク質であるが、アレルゲンは、タンパク質担体と共有結合した後にアレルギーを引き起こす低分子量アレルゲン性ハプテンであってもよい（Remington′s Pharmaceutical Sciences）。アレルゲンとしては、花粉、塵、黴、胞子、ふけ、昆虫および食物に由来する抗原がある。具体的な例としては、毒アイビー、毒オークおよび毒シューマックなどのトキシコデンドロン属（Toxicodendron）種のウルシオール（ペンタデシルカテコールまたはヘプタデシルカテコール）、並びにブタクサおよび関連種のセスキテルペノイドラクトンがある。
腫瘍抗原の特徴を示す抗原は、典型的に、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、オルガネラ等に由来するであろう。例としては、突然変異癌遺伝子によってコードされたタンパク質；腫瘍に関係したウイルスタンパク質；並びに腫瘍ムチンおよび糖脂質を含めた腫瘍タンパク質に特有の抗原がある。腫瘍としては、限定されるわけではないが、次の癌部位および癌種類からのもの、すなわち、唇、鼻咽頭、咽頭および口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝、胆嚢、胆管樹状構造、膵臓、喉頭、肺および気管支、皮膚の黒色腫、乳房、頸部、子宮（uteri，uterus）、卵巣、膀胱、腎臓、脳および神経系の他の部分、甲状腺、前立腺、精巣、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫並びに白血病がある。腫瘍に関係したウイルスタンパク質は、上記のウイルスの種類からのものであると考えられる。腫瘍に特有の抗原は、腫瘍前駆細胞によって通常は発現されないタンパク質でありうるし、または腫瘍前駆細胞中で通常発現されるが腫瘍に特有の突然変異を有するタンパク質でありうる。腫瘍に特有の抗原は、変更された活性または細胞下分布を有する普通のタンパク質の突然変異型でありうる。腫瘍抗原を生じる遺伝子の突然変異は、上に規定されたものの他に、コーディング部分、５′若しくは３′非コーディング部分、または遺伝子のイントロン中でありうるし、そして点突然変異、フレームシフト、欠失、付加、重複、染色体再配列等の結果でありうる。当業者は、腫瘍抗原を生じる正常な遺伝子構造および発現の種々の変更を熟知している。腫瘍抗原の具体的な例としては、Ｂ細胞リンパ腫のＩｇイディオタイプ、黒色腫の突然変異体サイクリン依存性キナーゼ４、黒色腫のＰｍｅｌ−１７（ｇｐ１００）、黒色腫のＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、黒色腫のｐ１５タンパク質、黒色腫のチロシナーゼ、黒色腫、甲状腺髄様、小細胞肺癌、結腸および／または気管支偏平上皮細胞癌のＭＡＧＥ１、２および３、膀胱、黒色腫、乳房および偏平上皮癌のＢＡＧＥ、黒色腫のｇｐ７５、黒色腫の腫瘍胎児（oncofetal）抗原などのタンパク質；乳房、膵臓および卵巣癌のｍｕｃｌムチン、黒色腫のＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシドなどの炭水化物／脂質；癌の突然変異体ｐ５３、結腸癌の突然変異体ｒａｓおよび乳癌のＨＥＲ−２／ｎｅｕ原始癌遺伝子などの癌遺伝子；頸部および食道の偏平上皮細胞癌のヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物がある。タンパク質性腫瘍抗原は、タンパク質全体に由来する独特のペプチドとしてＨＬＡ分子によって与えられうることも考えられる。抗原性ペプチドを生じるタンパク質の代謝プロセッシングは当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第5,342,774号明細書（ブーン（Boon）ら）を参照されたい。したがって、本方法は、抗原性ペプチドおよび、抗原性ペプチドを生じるより大形のポリペプチドまたはタンパク質全体中のこのようなペプチドの供給を包含する。抗原性ペプチドまたはタンパク質の供給は、体液性または細胞性免疫を生じることができる。
概して、対象は、以下に詳述される方法の一つまたはそれ以上によって有効量の腫瘍抗原および／またはそれに由来するペプチドを与えられることができる。初回量は、当該技術分野において標準的な免疫感作プロトコルにしたがって、ブースター量を伴うことができる。したがって、腫瘍抗原の供給は、細胞溶解性Ｔリンパ球の増殖を刺激することができる。
タンパク質およびペプチド抗原の場合、ＦｃＲｎパートナーに対する共有結合は、１本のポリペプチド鎖のペプチド結合による結合を含むことを意味する。確立された方法（サムブルック（Sambrook）ら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press），コールド・スプリング・ハーバー，ＮＹ 1989年）は、抗原性ペプチドまたはタンパク質およびＦｃＲｎパートナーから成る融合タンパク質をコードしているＤＮＡを処理するのに用いられるであろう。このＤＮＡは、発現ベクター中に入れられ、そして確立された方法によって細菌または真核生物細胞中に導入される。融合タンパク質は、確立された方法によって細胞からまたは培地から精製されるであろう。
投与される場合、本発明の結合体は、薬学的に許容しうる製剤中で投与される。このような製剤は、常套によって、薬学的に許容しうる濃度の塩、緩衝剤、保存剤、相溶性担体、アジュバントおよびサイトカインなどの補足免疫増強剤、そして場合により、他の治療薬を含んでいてよい。したがって、結合体および薬剤を含めた「カクテル」が考えられる。薬剤自体が、ＦｃＲｎ結合パートナーに結合して、上皮関門を通過する薬剤の供給を促進することができる。
本発明の結合体は、それだけで（純粋のまま）または薬学的に許容しうる塩の形で投与することができる。医薬品中で用いられる場合、その塩は薬学的に許容できなければならないが、薬学的に許容できない塩は、それらの薬学的に許容しうる塩を製造するのに好都合に用いることがでるし、しかも本発明の範囲から除外されない。このような薬学的に許容しうる塩としては、限定されるわけではないが、次の酸、すなわち、塩酸、塩化臭素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸から製造されるものがある。更に、薬学的に許容しうる塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルキリン金属またはアルキリン土類塩として製造することができる。
適当な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％Ｗ／Ｖ）；クエン酸および塩１〜３％Ｗ／Ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％Ｗ／Ｖ）；重炭酸ナトリウム（０．５〜１．０％Ｗ／Ｖ）；並びにリン酸および塩（０．８〜２％Ｗ／Ｖ）がある。適当な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％Ｗ／Ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％Ｗ／Ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％Ｗ／Ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％Ｗ／Ｖ）がある。
本明細書中で用いられ且つ以下で更に充分に記載される「担体」という用語は、ヒトまたは他の哺乳動物に対する投与に適している１種類またはそれ以上の固体または液体賦形剤、希釈剤またはカプセル封入物質を意味する。「担体」は、投与を容易にするように活性成分と混合される天然のまたは合成の有機または無機成分であってよい。
薬剤組成物の成分は、所望の薬剤効率を実質的に損なうと考えられる相互作用が存在しないようにして、本発明の結合体とおよび互いに組合わせることができる。経口薬物製剤の成分としては、希釈剤、結合剤、滑沢剤、滑剤（glidants）、崩壊剤、着色剤および着香剤がある。腸溶性経口製剤の製造のためのカプセル封入物質としては、酢酸フタル酸セルロース、ポリ酢酸フタル酸ビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびメタクリル酸エステルコポリマーがある。カプセル剤または錠剤などの固形経口製剤が好ましい。エリキシル剤およびシロップ剤もまた、周知の経口製剤である。エアゾル製剤の成分としては、可溶化活性成分、酸化防止剤、溶媒配合物および溶液製剤用の噴射剤、並びに超微粉の且つ懸濁した活性成分、分散助剤および懸濁製剤用の噴射剤がある。注射可能な製剤は無菌でなければならないのに、本発明の経口用、エアゾル用および鼻腔用製剤は無菌でないことがあるので、このような製剤は先行技術の注射可能な製剤と区別されることがある。
「アジュバント」という用語は、本発明の結合体中に包含されるかまたはそれと同時に投与され且つ対象の免疫応答を非特異的に増強する任意の物質を含むことを意味する。アジュバントとしては、アルミニウム化合物、例えば、ゲル、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、並びにフロイントの完全または不完全アジュバント（ここにおいて、結合体は、安定化したパラフィン油中水エマルジョンの水性相中に包含されている）がある。パラフィン油は、別の種類の油、例えば、スクアレンまたはピーナッツ油で置換えることができる。アジュバント性を有する他の材料としては、ＢＣＧ（弱毒化ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis））、リン酸カルシウム、レバミゾール、イソプリノシン、ポリアニオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）ロイティナン、百日咳毒素、コレラ毒素、リピドＡ、サポニンおよびペプチド、例えば、ムラミルジペプチドがある。ランタンおよびセリウムなどの希土類塩類も、アジュバントとして用いることができる。アジュバントの量は、対象および用いられる具体的な結合体に依り、過度に実験を行うことなく当業者によって容易に決定されうる。
サイトカインなどの他の補足免疫増強剤は、本発明の結合体と一緒に供給することができる。考えられるサイトカインは、本発明にしたがって免疫調節剤を投与することから生じる有益な作用を増強するものである。サイトカインは、リンホカインを含めた、細胞の増殖および成熟を支持する因子である。サイトカインの添加は、本発明の方法を実施することによってin vivoで刺激されたサイトカイン活性を増大させると考えられる。好ましいサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子αである。他の有用なサイトカインは、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、エリトロポエチン、白血病抑制因子、オンコスタチン−Ｍ、毛様体神経栄養因子、成長ホルモン、プロラクチン、ＣＤ４０−リガンド、ＣＤ２７−リガンド、ＣＤ３０−リガンド、α−インターフェロン、β−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子βであると考えられる。本発明によって有用であると考えられるようにＴ細胞活性を調節することが知られている他のサイトカインは、顆粒球および／またはマクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１）、並びに血小板由来成長因子、表皮成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子および線維芽細胞成長因子を含めたコロニー刺激因子および成長因子である。特定のサイトカインの選択は、望まれる免疫系の特定の調節に依るであろう。特定の細胞種類に対するサイトカインの活性は、当業者に知られている。
本発明で用いられる前述のサイトカインの正確な量は、選択された結合体、選択された投薬量および投薬タイミング、投与方式および対象の特徴を含めた様々な因子に依るであろう。選択された正確な量は、特に、限界量が所望の免疫応答を促進するであろう任意の量であるので、過度に実験を行うことなく決定することができる。したがって、供給方式に応じて、ナノグラム〜ミリグラム量は有用であると考えられるが、サイトカインの生理学的濃度は同様に低いので、ナノグラム〜ミリグラム量が最も有用であると考えられる。
本発明の製剤は、有効量で投与される。有効量とは、単独でかまたは追加量と一緒に、所望のように免疫応答を刺激するであろう結合体の量である。これは、血清中の抗体力価の増加を引き起こす体液性抗体反応、向上した粘膜免疫、細胞障害性Ｔリンパ球のクローン増加、または自己抗原を含めた抗原に対する寛容性の刺激に関与することができる。１ナノグラム／キログラム〜１００ミリグラム／キログラムの範囲の用量は、投与方式に応じて有効であると考えられる。好ましい範囲は、約５００ナノグラム〜５００マイクログラム／キログラム、最も好ましくは、１マイクログラム〜１００マイクログラム／キログラムであると考えられる。その絶対量は、選択された結合体、望まれる免疫調節、投与が１回量であるか多数回量であるかということ、並びに年令、身体的症状、体格および体重を含む個々の患者のパラメーターを含めた種々の因子に依るであろう。腫瘍がある対象の治療のために、投与する結合体の量を決定する場合、腫瘍の寸法、種類、位置および転移が因子となりうる。これらの因子は当業者に周知であり、常套実験だけで示されうる。
種々の投与経路が利用可能である。選択される特定の方式は、当然ながら、選択される特定の結合体、治療される特定の症状、および治療効力に必要な投薬量に依るであろう。本発明の方法は、概していえば、本発明の結合体を上皮表面に対して供給することに関する。好ましい投与方式は、経口、肺内、胆管内および鼻腔内である。
組成物は、単位剤形で好都合に与えられることができ、そして当薬剤学技術分野において周知のいずれの方法によっても製造することができる。方法はいずれも、結合体を、１種類またはそれ以上の補助的成分を構成する担体と一緒にさせる工程を含む。概して、組成物は、結合体を、液状担体、微粉固形担体または両方と一緒にして均一に且つ密にさせた後、必要ならば、製品を造形することによって製造される。
他の供給システムとしては、時間放出、遅延放出または徐放供給システムを挙げることができる。このようなシステムは、本発明の結合体の反復投与を避けることができ、対象および医師にとってますます好都合である。多くの種類の放出／供給システムが利用可能であり且つ当業者に知られている。それらには、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリ酸無水物およびポリカプロラクトンなどのポリマー基剤システム；ロウコーティング、慣用的な結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠剤等がある。腸管上皮に対する物質の供給を促進する生体接着ポリマーシステムが知られており且つ公開されたＰＣＴ出願ＷＯ93/21906号で記載されている。腸管上皮に対して薬剤を供給するカプセル剤もまた、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ93/19660号で記載されている。
実施例
材料
略語
ＢＳＡ，ウシ血清アルブミン；ｃＤＮＡ，相補的デオキシリボ核酸；ＣＴ−Ｂ，コレラ毒素Ｂサブユニット；ＤＭＥＭ，ダルベッコ修飾イーグル培地；ＤＭＳＯ，ジメチルスルホキシド；ＤＯＣ，デソキシコレート；ＥＣＬ，増大化学発光；ＥＬＩＳＡ，酵素結合イムノソルベント検定法；ＨＢＳＳ，カルシウムまたはマグネシウム不含のハンクス平衡塩溶液；ＨＥＰＥＳ，Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−［２−エタンスルホン酸］；ｈＧＨ，ヒト成長ホルモン；ＩＥＣ，腸管上皮細胞；ＫＩ，ヨウ化カリウム；ＭＨＣ，主要組織適合性遺伝子複合体；ＮａＯＨ，水酸化ナトリウム；ＮＨ4Ｃｌ，塩化アンモニウム；ＮＨＳ−ローダミン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ローダミン；ＲＮＡ−リボ核酸；ＲＴ−ＰＣＲ，逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応；ＳＡＴＡ，Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法；スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ，スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート；スルホ−ＮＨＳ−ビオチン，スルホスクシンイミドビオチン；スルホ−ＳＭＣＣ，スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート。
化学薬品
ｃＤＮＡサイクルキットは、インビトロジェン（Invitrogen）（サン・ディエゴ，ＣＡ）から購入した。Ｔａｑポリメラーゼは、パーキン・エルマー・シータス（Perkin-Elmer Cetus）（ノーウォーク，ＣＴ）から購入した。Circum VentTMキットは、ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）（ビバリー，ＭＡ）から購入した。放射性核種および放射性化学薬品は、デュポン（DuPont）／ＮＥＮ（ボストン，ＭＡ）から購入した。ＨＢＳＳおよびＤＭＥＭは、ＧＩＢＣＯ／ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）（ゲイサーズバーグ，ＭＤ）から購入した。ＲＰＭＩ １６４０は、セルグロ（Cellgro）（ハーンドン，ＶＡ）から購入した。Ｌ−グルタミンはセルグロから購入した。プロテインＡ−セファロースは、ファーマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech）（ピスカタウェイ，ＮＪ）から購入した。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＡＴＡおよび固定化フィシンは、ピアース（Pierce）（ロックフォード，ＩＬ）から購入した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories）（ウィルミントン，ＭＡ）から購入した。ＥＣＬキットは、アマーシャム（Amersham）（アーリントン・ハイツ，ＩＬ）から購入した。プラスミン、AvidChrom−プロテインＡ、プロテインＧ−セファロース、ＢＳＡ、コレラ毒素Ｂサブユニット、抗ｈＧＨ抗体および他の全ての化学薬品は、シグマ（Sigma）（セント・ルイス，ＭＯ）から購入した。
実施例１：ヒト腸管上皮一次細胞および細胞系におけるＦｃＲｎ ｍＲＮＡの発現
全ＲＮＡを、当該技術分野において周知の標準法（サムブルックら、上記）によって成人腸細胞から抽出した。それぞれの細胞種からのＲＮＡ １マイクログラムを鋳型として用いて、ｃＤＮＡサイクルキット（インビトロジェン，サン・ディエゴ，ＣＡ）を用いる逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのｃＤＮＡ基質を製造した。そのｃＤＮＡで、Ｔａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータス，ノーウォーク，ＣＴ）を用いて製造者の指示にしたがって、プライマーＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＡＣＴＧおよびＣＧＣＴＴＴＴＡＧＣＡＧＴＣＧＧＡＡを用いて３０回のＰＣＲサイクルを行った。そのＰＣＲサイクル条件は、９４℃で１分間の変性、５５℃で２分間のアニーリングおよび７２℃で３分間の伸長であった。増幅生成物は、１．５％アガロースゲル上の電気泳動によって分離され、そして臭化エチジウム染色によって可視化され、それは、成人結腸上皮細胞を除く全部の試料中において予想された約８００塩基対増幅生成物の存在を示した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅生成物の同一性を確証するために、ＤＮＡバンドをアガロースゲルから切取り、ｐＣＲ II（インビトロジェン，サン・ディエゴ，ＣＡ）中にサブクローン化し、そしてPrismTM色素−デオキシターミネーターサイクル配列決定用キット（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems），フォスター・シティー，ＣＡ）を用い、ベクターおよびヒトＦｃＲｎ配列両方からのプライマーを用いて配列決定した。反応生成物は、アプライド・バイオシステムズシークエンサーで分析された。増幅生成物の配列は、ＦｃＲｎ遺伝子配列と正確に対合し、発現された遺伝子の同一性が確証された。
実施例２：ノーザンブロットによるＦｃＲｎ ｍＲＮＡの検出
ヒト腸管上皮細胞および細胞系におけるＦｃＲｎの発現を確証するために、実施例１で記載のように製造されたＲＮＡ試料を用いて、成人腸細胞から、並びに結腸起原の２種類のヒト腺癌細胞系ＣａＣＯ−２およびＨＴ−２９からノーザンブロットを作成した。そのＲＮＡ試料は、ホルムアルデヒド／アガロースゲル電気泳動によって分離され、そして標準法（サムブルックら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハーバー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ＮＹ 1989年）によってナイロン膜に移された。その膜を、32Ｐで放射性標識された１２０塩基対プローブを用いて、標準法によってＦｃＲｎの３′非翻訳部分からプローブした。ノーザンブロットのオートラジオグラムは、腸細胞および両細胞系における１．５キロベースのｈＦｃＲｎ転写物の存在を実証した。したがって、成人腸管上皮細胞および細胞系におけるＦｃＲｎの発現は、二つの異なったＲＮＡ検出法によって実証された。
実施例３：腸管上皮細胞からのＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の標識付けおよび免疫沈降
ヒト腸管上皮細胞におけるＦｃＲｎの発現は、タンパク質の免疫沈降によって確証された。Ｃａｃｏ−２細胞を、35Ｓ−メチオニン（デュポン／ＮＥＮ，ボストン，ＭＡ）を用いて代謝的に標識し、そしてタンパク質を当該技術分野において周知の方法（ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane），Antibodies:A Laboratory Manual）によって抽出した。プロテインＡ−セファロースに結合した多クローン性ウサギ抗ラットＭＨＣクラスＩ関連ＦｃＲ重鎖特異的抗血清を用い、標準法を用いて細胞抽出物からＦｃＲｎを免疫沈降させた（ＦｃＲｎは、シミスター（Simister）およびレス（Ress），1985年，European J.Immunology,15:733-8の充分に確立された方法によって精製され、そしてそれを用いてラットを免疫感作した後、血清を集めることができる、ハーロウおよびレーン，上記）。免疫沈降物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてオートラジオグラフィーによって可視化された。４８キロダルトンのＦｃＲｎタンパク質が見られ、そのＲＮＡ濃度で見られた発現が確証された。
実施例４：ヒト腸管上皮細胞の細胞表面上でのＦｃＲｎタンパク質の発現
ＨＴ−２９腸管表皮細胞約３Ｘ１０7個を、非酵素的方法によって組織培養プレートから分離し、そしてカルシウムまたはマグネシウム不含の氷冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ−，ＧＩＢＣＯ／ライフ・テクノロジーズ，ゲイサーズバーグ，ＭＤ）で４回洗浄した。細胞表面タンパク質を標識するために、その洗浄された細胞を、ＤＭＳＯ中０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ピアース，ロックフォード，ＩＬ）１．５ｍｌと一緒に２０分間２回インキュベートした。標識された細胞を５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌで５回洗浄し、１ｍＭ Ｌ−グルタミン（メディアテク（Mediatech），ワシントン，ＤＣ）を含有するＲＰＭＩ １６４０（セルグロ，シティー，米国）１０ｍｌと一緒に２０分間インキュベートし、そしてＨＢＳＳ−で４回洗浄した。その細胞を溶解させた後、当該技術分野において周知の標準的な技法を用いて、プロテインＡ−セファロースビーズ（ファーマシア・バイオテク，ピスカタウェイ，ＮＪ）を用いて一晩中予め清澄にした。ＳＤＳおよびデソキシコール酸（ＤＯＣ）をその上澄みに加えて、最終濃度をそれぞれ０．１％および０．５％にした。溶解産物を、正常ウサギ血清を用いて予め清澄にし、そして当該技術分野において周知の方法によって多クローン性ウサギ抗ラットＭＨＣクラスＩ関連ＦｃＲ抗体と一緒に免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜は、製造者によって提示されたように、１：１０，０００に希釈されたストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ピアース，ロックフォード，ＩＬ）と一緒にインキュベーションするために処理された。次に、その膜を、ＥＣＬキット（アマーシャム，アーリントン・ハイツ，ＩＬ）を用いて、結合した西洋ワサビペルオキシダーゼの検出のために処理した。化学発光基質の開裂による発光を、感光性フィルムへの膜の暴露によって検出した。フィルム暴露は、ＦｃＲｎがＨＴ−２９腸管上皮細胞の表面で発現されたことを示した。
実施例５：腸管上皮細胞の細胞表面上のヒトＦｃＲｎの機能活性
腸管上皮細胞の細胞表面上で発現されたＦｃＲｎが機能性であったことを示すために、Ｃａｃｏ−２細胞および成人空腸腸管上皮細胞（ＩＥＣ）を、抗体のＦｃフラグメントを結合するその能力について調べた。Ｃａｃｏ−２および空腸ＩＥＣをミクロ遠心管に分配し（細胞２Ｘ１０6個／管）、そして４℃において２０００ｒｐｍで２〜３分間ペレットにした。細胞ペレットを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ，ｐＨ６．０またはｐＨ８．０中において４℃で１回洗浄し、そして同培養液０．２ｍｌ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を検定用の１２ウェルプレートに移した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ ＫＩおよび０．１％フィッシュゼラチンを含有するＤＭＥＭ，ｐＨ６．０またはｐＨ８．０中の125Ｉ−Ｆｃフラグメント（２００ｎｇ／ｍｌ，４Ｘ１０-9Ｍ）を、未標識ヒトＩｇＧ（３．３Ｘ１０-6Ｍ）０．５ｍｇ／ｍｌと一緒にまたは含むことなくそれぞれのウェルに加えた。細胞に、５％ＣＯ2給湿雰囲気中において３７℃で２時間ＩｇＧまたはＦｃを結合させた。細胞をミクロ遠心管に移し、そして４℃において２０００ｒｐｍで２〜３分間ペレットにした。非結合125Ｉ−Ｆｃは、細胞ペレットを、４℃において２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する冷ＤＭＥＭ，ｐＨ６．０またはｐＨ８．０で１回洗浄することによって除去された。細胞を０．１Ｍ ＮａＯＨ ０．５ｍｌ中で破壊し、そして得られた溶液をシンチレーションバイアルに移した。125Ｉは、CliniGamma 1272 γ計数計（ＬＫＢワラク（Wallac），ピスカタウェイ，ＮＪ）を用いて定量した。Ｃａｃｏ−２細胞および成人空腸ＩＥＣは両方とも、ｐＨ８．０ではなくｐＨ６．０で125Ｉ−Ｆｃを特異的に結合し、ラット新生児ＦｃＲｎおよびクローン化ヒトＦｃＲｎについて見られるような機能性ｐＨ依存性結合が実証された（スートリーら，J.Exp.Med.,180:2377-2381;1994年12月）。
実施例６：ヒト免疫グロブリンＧの製造
ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ブタ、ウシおよび他の種からの非特異的精製免疫グロブリンＧは、シグマ・ケミカル・カンパニー、ピアース・ケミカル、ハイクローン・ラボラトリーズ（HyClone Laboratories）、ＩＣＮバイオメディカルズ（Biomedicals）およびオルガノン・テクニカ・カペル（Organon Teknika-Cappel）などの販売者から購入することができる。
免疫グロブリンＧは、血清の硫酸アンミニウム沈降によって単離することもできる。タンパク質沈降物をイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーによって更に分別して、実質的に精製された非特異的ＩｇＧを単離する。非特異的ＩｇＧとは、抗体集団またはプール中で支配的である単一の特異性がないことを意味する。
免疫グロブリンＧはまた、プロテインＡ−セファロース（ファーマシア）、AvidChrom−プロテインＡ（シグマ）またはプロテインＧ−セファロース（シグマ）などの固体支持体に結合したプロテインＡに対する吸着によって血清から精製することができる。ＩｇＧの他の精製法は当業者に周知であり、非特異的ＩｇＧの単離のために用いることができる。
実施例７：ヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃフラグメントの製造
ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントを製造するために、実施例６でのように単離されたＩｇＧを、固定化パパイン（ピアース）を用いてその製造者に提示されたプロトコルにしたがって消化する。Ｆｃ受容体に結合しうる完全なＦｃフラグメントを生じるようにＩｇＧを消化する他のプロテアーゼ、例えば、プラスミン（シグマ）または固定化フィシン（ピアース）は当業者に知られており、Ｆｃフラグメントを製造するのに用いることができる。次に、消化された免疫グロブリンを、プロテインＡ−セファロースまたはプロテインＧ−セファロースなどの親和性基質と一緒にインキュベートする。ＩｇＧの非結合部分は、バッチまたはカラム形式で充分に洗浄することによって親和性基質から溶離される。次に、Ｆｃ吸着結合と不相溶性である緩衝液の添加によってＩｇＧのＦｃフラグメントを溶離する。Ｆｃフラグメントの精製において有効な他の方法もまた用いることができる。
実施例８：ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントに対する化合物の結合
ＦｃＲｎ輸送機序によって化合物を供給するために、このような化合物を、完全なＩｇＧまたはＦｃフラグメントに対して結合させることができる。架橋の化学およびこのような目的に有効な試薬は、当該技術分野において周知である。完全なＩｇＧまたはＦｃフラグメントおよび供給される化合物を結合させるのに用いられる架橋性試薬の性状は、本発明によって制限されない。いずれの架橋性試薬も、（ａ）化合物の活性が保持される、および（ｂ）結合体のＦｃ部分のＦｃＲｎによる結合が悪影響を受けないという条件ならば用いることができる。
Ｆｃおよび化合物の有効な一段法架橋の例は、過ヨウ素酸ナトリウムをリン酸ナトリウム緩衝液中において室温で３０分間用いた後、結合される化合物と一緒に４℃で一晩中インキュベーションするＦｃの酸化である。結合は、化合物およびＦｃフラグメント両方を、スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ，ピアース）によって室温で１８時間誘導体化することによって行うこともできる。結合はまた、Ｆｃフラグメントおよび供給される所望の化合物を、引き続き共有結合を形成するであろう種々の架橋性試薬によって誘導体化することによって行うことができる。この反応の例は、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ，ピアース）によるＦｃフラグメントの誘導体化であり、Ｆｃに対して結合される化合物は、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）によってチオール化される。これらの誘導体成分は、架橋剤不含で精製され、そして室温で１時間混合されて架橋する。アルデヒド、イミド、シアノ、ハロゲン、カルボキシル、活性カルボキシル、酸無水物およびマレイミド官能基を含む他の架橋性試薬は当業者に知られており、Ｆｃフラグメントに化合物を結合させるのに用いることもできる。架橋性試薬の選択は、当然ながら、Ｆｃに対して結合されることが望まれる化合物の性状に依るであろう。上記の架橋性試薬は、タンパク質−タンパク質結合に有効である。結合される化合物が炭水化物であるかまたは炭水化物残基を有する場合、タンパク質性ＦｃＲｎ結合分子との結合には、ＡＢＨ、Ｍ2Ｃ2Ｈ、ＭＰＢＨおよびＰＤＰＨなどのヘテロ二官能性架橋性試薬が有用である（ピアース・ケミカル・カンパニー，ロックフォード，ＩＬ）。タンパクおよび炭水化物を結合するもう一つの方法は、ブルミーヌ（Brumeanu）ら（Genetic Engineering News, 1995年10月1日, 16頁）によって開示されている。結合される化合物が脂質であるかまたは脂質残基を有し、それがＦｃＲｎ結合分子への結合部位として好都合である場合、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＢおよびそれらの誘導体などの架橋剤を用いることができる（ピアース・ケミカル・カンパニー，ロックフォード，ＩＬ）。非共有結合手段によって供給されるべきである何等かの分子を結合することも可能である。非共有結合を達成するのに好都合な一つの方法は、当該技術分野において周知の方法によって、供給される化合物に対して単クローン性抗体のような抗体を生じさせ、そして正しいＦｃ部分および望ましい抗原結合性を有する単クローン性抗体を選択することである。次に、供給される抗原をその単クローン性抗体担体に対して予備結合させる。上の架橋反応のいずれにおいても、架橋性試薬を含まないで誘導体化合物を精製することは重要である。非結合反応体を実質的に含まないで最終結合体を精製することもまた重要である。精製は、結合体のそれぞれの成分の性質に基づいて、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって達成することができる。特に好ましい方法は、最初に、プロテインＡ−セファロースを用いてＦｃおよびＦｃ化合物結合体を保持するアフィニティー精製工程を行った後、Ｆｃ結合体の質量、寸法または電荷に基づいてゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを行う。この精製スキームの最初の工程は、結合体がＦｃＲｎに結合することを確実にし、これは本発明の不可欠な必要条件である。
実施例９：腸管上皮関門を通過するＩｇＧに助けられた外来抗原の供給
上皮関門を越えて輸送されるＦｃ結合パートナー−抗原結合体の能力を調べるために、マウスへ投与するための外来抗原をＩｇＧ分子に結合させる。好都合な外来抗原は蛍光色素ローダミンであり、それは、腸管上皮の凍結半薄切片で可視化することができるためである。スクシニルローダミン（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes），ユージーン，ＯＲ）を用いる製造者によって提示されたようなインキュベーションによって、実施例６で記載のように製造された非特異的マウスＩｇＧ、コレラ毒素Ｂサブユニット（シグマ）およびオボアルブミン（シグマ）に対してローダミンを共有結合させる。ＩｇＧ−ローダミン結合体は、プロテインＧ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。非結合スクシニルローダミンを除去する透析の後、コレラ毒素Ｂ（ＣＴ−Ｂ）−ローダミンおよびオボアルブミン−ローダミン結合体を、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。溶出液の画分の蛍光を測定することによって結合体の存在について検定する。ＩｇＧおよびＣＴ−Ｂサブユニット結合体の機能性結合は、それぞれ、ＦｃＲｎおよびガングリオシドＧＭＩに対する結合によって調べることができる。コレラ毒素Ｂ−ローダミンおよびオボアルブミン−ローダミンはそれぞれ、正および負の対照として役立つ。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．２ナノモルの上記３種類のローダミン結合体を、非特異的アジュバントとして０．２ナノモルの未標識コレラ毒素と一緒にまたは不含で、胃分解を阻止するように７５マイクロモルＮａＨＣＯ3およびダイズトリプシン阻害剤２０ｍｇ／ｍｌの存在下において胃内投与によって投与する。６時間後にマウスを屠殺し、そして腸管を取出し、凍結させ、そして半薄切片用に処理する。腸管上皮の切片を蛍光顕微鏡で照明し、そして細胞内蛍光について調べた。ＩｇＧ−ローダミンを与えられたマウスの腸管上皮細胞中における蛍光の存在は、ＩｇＧ結合体が、先端において基底外側方向へと腸管上皮関門を越えて効果的に輸送されることを示す。ＦｃＲｎは、ＦｃＲｎ結合パートナーと一緒に結合体として免疫原を輸送することができる。
実施例１０：ＦｃＲｎ依存性細胞透過によって経口供給される抗原−ＩｇＧ結合体に対するマウス粘膜免疫応答
β2−ミクログロブリン（Ｆｃ受容体機能の臨界的成分）の欠失に対してホモ接合のトランスジェニックマウスおよびそれらの正常な野生型同腹子を、粘膜免疫応答発生の研究に用いる。ローダミン−ＩｇＧが先端膜Ｆｃ受容体に対して結合することによって粘膜免疫応答を引き起こす場合、正の免疫応答は、β2−ミクログロブリン「ノックアウト」マウスではなく野生型で見出されるはずである。これに対して、上皮関門を越えるＣＴ−Ｂの細胞透過は先端膜Ｆｃ受容体に対する結合に依らないので、ローダミン−コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ）は、野生型および「ノックアウト」マウス両方で正の免疫応答を引き起こすはずである。ローダミン−オボアルブミンは、（液相エンドサイトーシスによって腸管上皮に入ることはあるが）細胞透過性小胞に入らないし、どのマウスでも免疫応答を引き起こさないはずである。
野生型およびβ2−ミクログロブリンノックアウトマウスの３群を、実施例９で記載の３種類のローダミン結合体で経口によって免疫感作する。非特異的アジュバントとして０．２ナノモルのコレラ毒素を加えて、平行実験を行う。等モル量のローダミン結合体を胃内投与する。マウスは、この方法によって１０日ごとに全部で３回「免疫感作」される。３回目の経口免疫感作の２週間後に、マウスを屠殺し、そしてローダミン特異的免疫応答を、ＥＬＩＳＡによって腸分泌および血清について標準法で確認する。抗ローダミン血清免疫グロブリンは、ＣＴ−ＢおよびＩｇＧのローダミン結合体を与えられた野生型マウスで最も明らかである。β2−ミクログロブリンを欠いたノックアウトマウスは、ローダミン−ＩｇＧに対してではなくローダミン−ＣＴ−Ｂに対して粘膜免疫応答を生じ、受容体依存性細胞透過は粘膜免疫応答において本質的な役割を果たしていることが示される。対照のローダミン−オボアルブミン結合体は、野生型においてもβ2−ミクログロブリンノックアウトマウスにおいてもほとんどまたは全く免疫応答を引き起こさない。
当業者は、上記の独特の生成物および処理に対する多数の同等物を常套実験だけで理解するかまたは確認することができるであろう。このような同等物は、本発明の範囲内であると考えられるし且つ請求の範囲によって包含されるものである。
本発明は、概して、抗原に対して免疫応答を開始する方法および製品に関し、特に、寛容性および免疫性を引き起こす抗原の経上皮供給に関する。
発明の背景
哺乳動物の免疫系は妊娠中に現れ、そして後期哺乳動物胎児において活発になる。活発ではあるが、それは抗原によってほとんど刺激されていないので、すなわち、胎児は主として母親によって抗原から保護されているので、それはまだ「未熟」と特徴付けられるかもしれない。しかしながら、この「未熟な」免疫系は、母性免疫グロブリンの胎児への（または若干の場合、新生児への）伝達によって補足されて、生命が独立して最初の何週間かの間に体液性免疫を与える。
ラットおよびマウスは、大部分の母性免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を初乳および乳から哺乳しながら得るが、ある程度は出生前に獲得している。ウシもまた、初乳からＩｇＧを得る。ウサギでは、ＩｇＧは卵黄嚢を通過して胎児へ輸送される。ヒトにおけるＩｇＧの胎児または新生児への伝達についてはほとんど知られていない。多くの結果は、ヒト母親は体液性免疫を子に対して誕生前にしか伝達しないことを示唆しているが、母乳によって新生児へ伝達されるＩｇＡは、新生児を腸内感染から保護することにおいてある役割を果たしていると考えられる。
母性ＩｇＧの哺乳動物および／または新生児への供給は、巨大分子をほとんど通さない上皮関門を通過する輸送を必要とする。このような上皮関門を通過する巨大分子の輸送は、非特異的および特異的受容体依存性機序によって引き起こすことができる。受容体非特異的機序は、傍細胞（paracellular）篩現象によって示され、その効率は、輸送される分子の分子量と逆の関係にある。この傍細胞経路を通過するＩｇＧなどの巨大分子の輸送は極めて非能率的である。腸内上皮細胞による免疫グロブリンの受容体依存性輸送の説明は、今までのところ、ポリマー免疫グロブリン受容体およびＩｇＧの腸細胞受容体（主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連Ｆｃ受容体）に限定されている。これら二つの受容体系は、それらの免疫グロブリンイソタイプ、上皮細胞を通るそれらの免疫グロブリン輸送の方向およびそれらの組織特異的発現が異なる。両方とも、未熟な免疫系を形成させるのにある役割を果たすことができる。
ポリマー免疫グロブリン受容体は、腸細胞、肝細胞および／または胆管上皮細胞の基底外側表面上で発現される。それは、ポリマーＩｇＡおよびＩｇＭを先端（管腔）表面へ輸送して、抗微生物防御および抗原排除のためにこれらの免疫グロブリンを集中させる。
ＩｇＧの腸細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩ重鎖に対して相同性を有し且つβ2−ミクログロブリン（β2Ｍ）と結合していて、ラットおよびマウスの新生児腸細胞で発現される。ＩｇＧは、これらの齧歯類動物新生児の腸管上皮を通過して管腔中を漿膜方向へと細胞透過（transcellularly）輸送される。腸細胞の先端表面上において、ＩｇＧのＦｃ部分は、管腔の比較的酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）で腸細胞受容体に対して結合している。基底外側原形質膜への細胞透過（transcytosis）後、免疫グロブリンの放出は、間隙液の比較的中性ｐＨ（約ｐＨ７．４）で起こる。したがって、齧歯類動物新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、新生児への母性ＩｇＧの供給に関与することができたし、しかもそれ自体がこの期間中のＩｇＧの受動獲得に関与することができる。
ヒトにおいて、母性ＩｇＧは胎盤を越えて能動的に輸送される。この輸送に関与する受容体は何年間も探求されてきた。いくつかのＩｇＧ結合タンパク質が胎盤から単離されている。ＦｃγＲＩＩは胎盤内皮で検出され且つＦｃγＲＩＩＩは合胞体栄養細胞層で検出された。しかしながら、これら受容体は両方とも、モノマーＩｇＧに対して比較的低い親和性を示した。最近、ラットおよびマウスのＩｇＧ腸細胞受容体のヒト相同染色体をコードしているｃＤＮＡの胎盤からの単離が報告された。（スートリー（Story）,C.M. ら，J.Exp.Med.,180巻：2377-2381,1994年12月）完全なヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列が報告されている。ＩｇＧのこのＦｃ受容体は、その分子がラットＦｃＲｎ配列を含むその読み取り枠にわたって極めて相同であるので（ヌクレオチド同一６９％および推定アミノ酸同一６５％）、ヒト胎児への（そしておそらくは新生児にさえも）母性ＩｇＧの輸送に関与しうる。ヒト胎児（およびおそらくはヒト新生児）におけるいわゆる受動免疫感作は、ここでより良く理解されることになりうる。
宿主の免疫系を他に由来する抗体で補うことを必要とする受動免疫感作とは対照的に、能動免疫感作は、所望の免疫応答をin vivoで生じるために宿主自身の免疫系の刺激を必要とする。子供および成体における能動免疫感作の最も広く実施されている方法は、免疫原を初回量として１回、続いてブースター量として少なくとももう１回注射することを行う。これらの方法には、エイズおよび肝炎などの疾患を伝染することがある注射針の使用に関係した危険を含めた多数の重大な欠点がある。（患者をアレルゲンに対して寛容にさせた場合、長期間にわたる反復注射がしばしば必要とされることで、問題は大きくなる）これらの方法はまた、多数の病原体に対する第一線の防御、すなわち、粘膜免疫を必ずしも適当に引き起こさせるものではない。粘膜は、気道、生殖系および胃腸管の内側を覆っていて、そしてこの粘膜表面が多数の疾患の最初の入口である。供給するのに容易であり且つ粘膜免疫を引き起こす経口ワクチンは大いに望まれるであろう。
経口ワクチンを用いる免疫感作は問題が多い。しばしば、免疫応答がほとんどまたは全く得られない。免疫応答を促すために、目的の抗原は、免疫原性が強いことが知られている担体に対して結合されてきた。例えば、研究者らは、カルメット・ゲラン杆菌（Bacille Calmette-Gurein）（ＢＣＧ）を担体として用いて抗原を供給してきており、ＢＣＧは、結核に対する経口ワクチンとして最初に用いられた細菌である。このような担体での問題は、患者がその担体自体に対する抗体を生じるであろうということであり、それは、同じ患者に対して別の抗原を与えるためにその担体を再度用いる場合に厄介なことがありうる。これまでに、経口ワクチンの一般的な方策の成功は実証されていない。
従来、免疫グロブリンおよびその部分を薬物および造影剤に対して結合させて、細胞集団に集中させ且つそれらを破壊し、そして若干の薬剤の半減期を延長させてきた。免疫毒素はこのような結合体の一例である。しかしながら、このような結合体は、免疫応答を開始させるのに有用であると提案されたことはなかった。
研究の中心は僅かながら、自己免疫疾患に特有のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質に対して結合した免疫グロブリンの免疫寛容を生じる能力に集中してきた。（ＰＣＴ ＷＯ91/08773号を参照されたい）。この研究は、寛容性の誘導が担体分子によって強く影響を受けることがありうるおよび免疫グロリン担体が強く免疫寛容を生じるらしいという概念に基づく。同種同系ＩｇＧは好ましい担体であり、そして静脈内投与は、ＩｇＧの結合体を供給するのに用いられた方式であった。この研究内容は１０年間を越えているが、経口投与は一度だけ、しかもＩｇＡが免疫グロブリン担体である結合体についてだけ述べられている。このように、免疫寛容を生じる免疫グロブリン結合体は当該技術分野において知られているが、このような結合体は、病原体に特有の抗原に対して強い応答を引き起こすための薬剤として示唆されたことはなかった。（これに反して、当該技術分野は、このような結合体は、どんなものであっても、極めて望ましくないと考えられる病原体に対して対象を寛容にさせるであろうと示唆している）。更に、このような結合体は、免疫グロブリンがＩｇＧであり且つ供給方式が経口供給である場合に有効な寛容原性抗原であろうと示唆されたことはなかった。
発明の概要
本発明は、免疫グロブリンまたはその部分などの、ＦｃＲｎ受容体に結合する分子に対して抗原を結合させ、そしてそれを、ＦｃＲｎ受容体によって腸細胞を介する能動輸送によって上皮関門を通過して供給することができるという知見に関する。免疫グロブリンまたはその部分は、ＦｃＲｎ依存性輸送によって上皮関門を通過して輸送されるように、免疫グロブリンまたはその部分はＦｃＲｎ受容体に結合し且つ抗原の担体として働く。ＦｃＲｎ受容体は、ヒトの子供および成人の上皮組織中に存在し、したがって、本発明は、ヒトを免疫感作するのに有効な方策を可能にする。
本発明の一つの態様により、哺乳動物の免疫系を調節する方法を提供する。抗原およびＦｃＲｎ結合パートナーの結合体の有効量を、このような免疫調節を必要としている哺乳動物の上皮関門に対して投与する。抗原は、病原体の特徴を示す抗原、自己免疫疾患の特徴を示す抗原、アレルゲンの特徴を示す抗原および腫瘍の特徴を示す抗原から成る群より選択される。好ましい実施態様において、ＦｃＲｎ結合パートナーは、非特異的ＩｇＧ、またはＩｇＧのＦｃＲｎ結合フラグメントである。最も好ましくは、ＦｃＲｎ結合パートナーはＩｇＧのＦｃフラグメントである。更に、抗原がＦｃＲｎ結合パートナーに対して共有結合していることは好ましい。好ましくは、結合体は、経口によって腸管上皮に、エアゾルで肺にまたは鼻腔内に投与される。このような製剤は無菌でなくてよい。以下に記載のような補足増強剤を更に投与してよい。
本発明のもう一つの態様により、製剤を提供する。該製剤は、抗原およびＦｃＲｎ結合パートナーの結合体を含み、この抗原は、病原体の特徴を示す抗原、自己免疫疾患の特徴を示す抗原、アレルゲンの特徴を示す抗原および腫瘍の特徴を示す抗原から成る群より選択される。好ましいＦｃＲｎ結合パートナーは上記の通りである。結合体は、哺乳動物の免疫応答を調節する有効量で存在する。該製剤は、更に、薬学的に許容しうる担体を含む。本発明の製剤は、腸管上皮への経口供給、肺上皮へのエアゾル供給および鼻腔上皮への鼻腔内供給などの上皮輸送担体への供給用に構築され且つ調整された単位剤形で製剤化されうる。したがって、上記で特徴付けられる抗原のいずれかに結合したＩｇＧ（またはそのＦｃＲｎ結合部分）を含有する錠剤は、本発明によって包含される。
前述の製剤は、アジュバント、サイトカイン、生体接着剤等を含めた補足増強剤と一緒に供給することができる。補足増強剤自体、ＦｃＲｎ結合パートナーに結合して、上皮関門を通過するこのような薬剤の供給を促進することができる。好ましい投与方式は、概して、腸管上皮への経口投薬、肺へのエアゾル剤および鼻腔内投薬を含む。
本発明のもう一つの態様により、上記の結合体を、哺乳動物の免疫系を調節するための薬剤の製造において用いる。好ましい成分および製剤は上記の通りである。
本発明の更にもう一つの態様により、免疫調節剤を製造する方法を提供する。該方法は、抗原または補足増強剤をＦｃＲｎ結合パートナーに共有結合させることを行い、この抗原または補足増強剤は上記の通り選択される。好ましいＦｃＲｎ結合パートナーも上記の通りである。次に、その結合体を用いて、上記のように哺乳動物の免疫応答を調節するための製剤を製造することができる。
本発明の更にもう一つの態様において、抗原を含む結合体は、その抗原が非結合型で上皮関門を通過する範囲の少なくとも２倍の量で上皮関門を通過する。したがって、本発明の目的は、上皮関門を通過する抗原の能力を増加させる機序を開発することである。
本発明のもう一つの目的は、経口によって能動的な免疫原および寛容原性抗原の新規な種類を開発することである。
本発明のもう一つの目的は、粘膜免疫を刺激する改良された方法を開発することである。
本発明のこれらのおよび他の態様を、以下に更に詳細に記載する。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトＦｃＲｎ受容体が成体上皮組織において活性であるという知見およびＩｇＧまたはＦｃフラグメントなどのＦｃＲｎ結合パートナーを用いて、抗原を含めた他の分子を上皮関門を通過して輸送することができるという知見に関する。この方式において、ＩｇＧまたはそのＦｃＲｎ結合部分などのＦｃＲｎ結合パートナーを用いて、上皮関門を通過して抗原を対象の免疫系に供給することができ、それによって免疫応答を開始させることができる。
本発明は、上皮関門を越えて免疫系への抗原の供給を促進することが望まれる場合にはいつでも有用である。したがって、本発明は、腸管上皮組織、肺上皮組織、並びに鼻腔表面、腟表面、結腸表面および胆管樹状構造表面を含めた他の粘膜表面を通過して抗原を供給するのに用いることができる。本発明は、抗原に対する体液性抗体反応を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、または抗原に対する寛容性を刺激することなどによって対象の免疫系を調節するのに用いることができる。本明細書中で用いられる対象とは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ニワトリおよび齧歯類動物を意味する。
腫瘍抗原を供給する場合、本発明は、小形の非充実腫瘍または充実腫瘍などの免疫依存性拒絶反応に従う疾患を有する対象を治療するのに用いることができる。更に、本明細書中に記載の方法による腫瘍抗原の供給は、大形の充実腫瘍の除去を伴う治療に有用であろうと考えられる。本発明は、更に、癌を有すると疑われる対象を治療するのに用いることができる。
本発明は、ＦｃＲｎ結合パートナーおよび抗原の結合体の形成に関する。結合体とは、抗原と抗体分子の非特異的疎水性部分との間の疎水的相互作用、抗体−抗原特異的結合、および共有結合を含めた何等かの物理化学的手段によって互いに結合した二つの物質を意味する。好ましい結合の性質は、特に、選択された上皮関門に対して結合体を供給するのに用いられる投与方式および薬剤担体に依るであろう。例えば、若干の結合は、胃などのある種の環境に耐える他のものほど充分に適していないが、胃を回避する供給システムによってそこから保護されることができる。当然ながら、ＦｃＲｎ結合パートナーと抗原との間の結合は、それが、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃＲｎ結合パートナーの能力を破壊しない性質を有することが重要である。このような結合は当業者に周知であり、例を以下に更に詳細に与える。結合体は、更に、以下に更に詳細に論及される融合タンパク質としても形成されうる。
ＦｃＲｎ結合パートナーとは、ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体による結果としての能動輸送を伴ってＦｃＲｎ受容体によって特異的に結合することができる任意の物質を意味する。上述のように、ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含めた数種類の哺乳動物種について単離されてきた。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎおよびマウスＦｃＲｎの配列は、スートリー,C.M．ら，J.Exp.Med.,180巻：2377-2381,1994年12月で見出されうる。ＦｃＲｎ受容体分子はここで充分に特性決定されている。ＦｃＲｎ受容体は、比較的低いｐＨで（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥなどの他の免疫グロブリンクラスではなく）ＩｇＧを結合し、そのＩｇＧを漿膜方向へと管腔中を細胞透過によって能動的に輸送した後、腸管液で見られる比較的高いｐＨでＩｇＧを放出する。当業者によって理解されるように、ＦｃＲｎ受容体は、クローニングによってかまたは、例えば、単クローン性抗体を用いるアフィニティー精製によって単離することができる。次に、このような単離されたＦｃＲｎ受容体を用いて、以下に記載のようにＦｃＲｎ結合パートナーを識別し且つ単離することができる。
ＦｃＲｎ結合パートナーとしては、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃフラグメント、およびＦｃＲｎ受容体の完全な結合部分を含むＩｇＧの他のフラグメントがある。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の範囲は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されてきた（ビルマイスター（Burmeister）,W.P．ら，Nature,1994;372:379-378）。ＦｃとＦｃＲｎ受容体との主な接触部分は、ＣH２およびＣH３ドメインの結合部付近である。可能な接触は、ＣH２の残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１および３１４並びにＣH３中の３８５〜３８７、４２８および４３３〜４３６である。（これらの部位は、白血球ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩに対するＦｃ結合に重要であるようなサブクラス比較によってまたは部位特異的突然変異誘発によって識別されたものとは異なる。）前述のＦｃ−ＦｃＲｎ接触は全て、単一のＩｇ重鎖中である。二つのＦｃＲｎ受容体が一つのＦｃ分子を結合することができるということは以前に注目されていた。結晶学データは、このような複合体において、それぞれのＦｃＲｎ分子がＦｃホモ二量体の一つのポリペプチドを結合することを示唆している。
前述の情報が与えられると、当業者は、部位特異的突然変異誘発等のような充分に理解された手順にしたがってＩｇＧのＦｃ部分を修飾して、ＦｃＲｎ受容体によって結合されるであろう修飾されたＩｇＧまたはその修飾されたＦｃフラグメント若しくは部分を生じることができるということを容易に理解するであろう。このような修飾には、ＦｃＲｎ接触部位から遠く離れた修飾並びに結合を保存するかまたは増強することさえある接触部位中の修飾が含まれる。更に、他の結合パートナーが識別され且つ単離されうる。ＦｃＲｎ受容体に特異的で且ついったん結合したＦｃＲｎによって輸送されることができる抗体またはそれらの部分は、充分に確立された技術を用いて識別され且つ単離されうる。同様に、無作為に生じた分子的に異なったライブラリーをスクリーニングすることができるし、そしてＦｃＲｎ受容体によって結合され且つ輸送される分子を、慣用的な技法を用いて単離することができる。本発明は、何等かの特定のＦｃＲｎ結合パートナーの選択によって制限されるものではない。結合パートナーがＩｇＧまたはそのＦｃＲｎ結合部分である場合、ＩｇＧまたはその部分は、以下に更に詳細に記載される慣用法にしたがって製造することができる。
ＦｃＲｎ結合パートナーを抗原と結合させる。本明細書中で用いられる抗原は、４種類のクラス、すなわち、（１）病原体の特徴を示す抗原；（２）自己免疫疾患の特徴を示す抗原；（３）アレルゲンの特徴を示す抗原；および（４）腫瘍の特徴を示す抗原に分かれる。抗原には、概して、細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリア等からの多糖、糖脂質、糖タンパク質、ペプチド、タンパク質、炭水化物および脂質が含まれる。
病原体の特徴を示す抗原としては、ウイルス、細菌、寄生生物または真菌に由来する抗原がある。重要な病原体の例としては、コレラ菌（Vibrio cholerae）、腸毒素原性大腸菌（Escherichia coli）、ロタウイルス、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、赤痢菌属（Shigella）種、チフス菌（Salmonella typhi）、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ボレラ・バーグドルフェリ（Borella burgdorferi）、ＨＩＶ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、狂犬病ウイルスおよびエプスタイン・バールウイルスがある。
ウイルスとしては、概して、次の科に限定されるわけではないが、ピコルナウイルス科；カリチウイルス科；トガウイルス科；フラビウイルス科；コロナウイルス科；ラブドウイルス科；フィロウイルス科（filoviridae）；パラミクソウイルス科；オルソミクソウイルス科；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科；ヘパドナウイルス科（hepadonaviridae）；パルボウイルス科；パポバウイルス科；アデノウイルス科；ヘルペスウイルス科；およびポキシスウイルス科（poxyviridae）がある。
細菌としては、概して、限定されるわけではないが、緑膿菌（P.aeruginosa）；大腸菌；クレブシエラ属（Klebsiella）種；セラチア属（Serratia）種；シュードモナス属（Pseudomonas）種；Ｐ．セパシア（cepacia）；アシネトバクター属（Acinetobacter）種；表皮ブドウ球菌（S.epidemis）；Ｅ．フェカリス（faecalis）；肺炎連鎖球菌；黄色ブドウ球菌；ヘモフィルス属（Haemophilus）種；ナイセリア属（Neisseria）種；髄膜炎菌（N.meningitidis）；バクテロイデス属（Bacteroides）種；シトロバクター属（Citrobacter）種；ブランハメラ属（Branhamella）種；サルモネラ属（Salmonella）種；赤痢菌属種；Ｓ．ピオジェネス（pyogenes）；プロテウス属（Proteus）種；クロストリジウム属（Clostridium）種；エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）種；レステリア属（Lesteria）種；パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）；ストレプトバシラス属（Streptobacillus）種；スピリルム属（Spirillum）種；フソスピロヘータ属（Fusospirocheta）種；梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）；ボレリア属（Borrelia）種；放線菌（Actinomycetes）；マイコプラスマ属（Mycoplasma）種；クラミジア属（Chlamydia）種；リケッチア属（Rickettsia）種；スピロヘータ属（Spirochaeta）；レジュネラ属（Legionella）種；ミコバクテリア（Mycobacteria）種；ウレアプラスマ属（Ureaplasma）種；ストレプトミセス属（Streptomyces）種；トリコモラス属（Trichomoras）種；およびＰ．ミラビリス（mirabilis）がある。
寄生生物としては、限定されるわけではないが、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫（P.vivax）、卵形マラリア原虫（P.ovale）、四日熱マラリア原虫（P.malaria）；トキソプラスマ（Toxoplasma gondii）；メキシコリーシュマニア（Leishmania mexicana）、熱帯リーシュマニア（L.tropica）、Ｌ．メジャー（major）、Ｌ．エチオピカ（aethiopica）、ドノヴァンリーシュマニア（L.donovani）；トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）、Ｔ．ブルセイ（brucei）；マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、ビルハルツ住血吸虫（S.haematobium）、日本住血吸虫（S.japonium）；旋毛虫（Trichinella spiralis）；バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）；マレー糸状虫（Brugia malayi）；赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）；蟯虫（Enterobius vermiculoarus）；有鉤条虫（Taenia solium）、無鉤条虫（T.saginata）；腟トリコモナス（Trichomonas vaginatis）、腸トリコモナス（T.hominis）、口腔トリコモナス（T.tenax）；ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）；クリプトスポリジウム・パルヴム（Cryptosporidium parvum）；ニューモシティス・カリニイ（Pneumocystis carinii）；バベシア・ボビス（Babesia bovis）、Ｂ．ダイバージェンス（divergens）、Ｂ．ミクロティ（microti）；イソスポラ・ベリ（Isospora belli）、Ｉ．ホミニス（hominis）；二核アメーバ（Dientamoeba fragilis）；回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）；回虫（Ascaris lumbricoides）；アメリカ鉤虫（Necator americanis）；十二指腸鉤虫（Ancylostoma duodenale）；糞線虫（Strongyloides stercoralis）；フィリピン毛頭虫（Capillaria philippinensis）；広東住血線虫（Angiostrongylus cantonensis）；矮小条虫（Hymenolepis nana）；広節裂頭条虫（Diphyllobothrium latum）；単包条虫（Echinococcus granulosus）、多包条虫（E.multilocularis）；ヴェステルマン肺吸虫（Paragonimus westermani）、Ｐ．カリエンシス（caliensis）；クロノルキス・シネンシス（Chlonorchis sinensis）；オピストルキス・フェリネウス（Opisthorchis felinus）、Ｏ．ビベリニ（viverrini）；肝蛭（Fasciola hepatica）；疥癬虫（Sarcoptes scabiei）；ヒトジラミ（Pediculus humanus）；ケジラミ（Phthirius pubis）；およびヒトヒフバエ（Dermatobia hominis）がある。
真菌としては、概して、限定されるわけではないが、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）；ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）；真菌（Ajellomyces dermatitidis）；ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）；コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）；カンジダアルビカンス（C.albicans）、Ｃ．トロピカリス（tropicalis）、Ｃ．パラプシローシス（parapsilosis）、Ｃ．ギリエルモンディイ（guilliermondii）およびＣ．クルセイ（krusei）を含めたカンジダ属（Candida）種；Ａ．フミガツス（fumigatus）、黄色アスペルギルス（A.flavus）および黒色アスペルギルス（A.niger）を含めたアスペルギルス属（Aspergillus）種；クモノスカビ属（Rhizopus）種；リゾムコール属（Rhizomucor）種；カニンガメラ属（Cunninghammella）種；Ａ．サクセネア（saksenaea）、Ａ．ムコール（mucor）およびＡ．アブシジア（absidia）を含めたアポフィソミセス属（Apophysomyces）種；スポロトリクス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）；ブラジルパラコクシジオイデス（Paracoccidioides brasiliensis）；シューダルエシェリア・ボイディイ（Pseudallescheria boydii）；トルロプシス・グラブラタ（Torulopsis glabrata）；および皮膚糸状菌（Dermatophytes）種がある。
自己免疫疾患の特徴を示す抗原は、典型的に、哺乳動物組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリア等に由来するであろう。例としては、ブドウ膜炎（例えば、Ｓ抗原）、真性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、慢性関節リウマチ、悪性貧血、アディソン病、強皮症、自己免疫委縮性胃炎、早発閉経（希な症例）、雄性不妊症（希な症例）、若年型糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天庖瘡、類天庖瘡、交感性眼炎、水晶体原性ブドウ膜炎、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変（希な症例）、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、多／皮膚筋炎および円板状エリテマトーデスに特有の抗原がある。
アレルゲンであるである抗原は、概して、タンパク質または糖タンパク質であるが、アレルゲンは、タンパク質担体と共有結合した後にアレルギーを引き起こす低分子量アレルゲン性ハプテンであってもよい（Remington′s Pharmaceutical Sciences）。アレルゲンとしては、花粉、塵、黴、胞子、ふけ、昆虫および食物に由来する抗原がある。具体的な例としては、毒アイビー、毒オークおよび毒シューマックなどのトキシコデンドロン属（Toxicodendron）種のウルシオール（ペンタデシルカテコールまたはヘプタデシルカテコール）、並びにブタクサおよび関連種のセスキテルペノイドラクトンがある。
腫瘍抗原の特徴を示す抗原は、典型的に、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、オルガネラ等に由来するであろう。例としては、突然変異癌遺伝子によってコードされたタンパク質；腫瘍に関係したウイルスタンパク質；並びに腫瘍ムチンおよび糖脂質を含めた腫瘍タンパク質に特有の抗原がある。腫瘍としては、限定されるわけではないが、次の癌部位および癌種類からのもの、すなわち、唇、鼻咽頭、咽頭および口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝、胆嚢、胆管樹状構造、膵臓、喉頭、肺および気管支、皮膚の黒色腫、乳房、頸部、子宮（uteri，uterus）、卵巣、膀胱、腎臓、脳および神経系の他の部分、甲状腺、前立腺、精巣、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫並びに白血病がある。腫瘍に関係したウイルスタンパク質は、上記のウイルスの種類からのものであると考えられる。腫瘍に特有の抗原は、腫瘍前駆細胞によって通常は発現されないタンパク質でありうるし、または腫瘍前駆細胞中で通常発現されるが腫瘍に特有の突然変異を有するタンパク質でありうる。腫瘍に特有の抗原は、変更された活性または細胞下分布を有する普通のタンパク質の突然変異型でありうる。腫瘍抗原を生じる遺伝子の突然変異は、上に規定されたものの他に、コーディング部分、５′若しくは３′非コーディング部分、または遺伝子のイントロン中でありうるし、そして点突然変異、フレームシフト、欠失、付加、重複、染色体再配列等の結果でありうる。当業者は、腫瘍抗原を生じる正常な遺伝子構造および発現の種々の変更を熟知している。腫瘍抗原の具体的な例としては、Ｂ細胞リンパ腫のＩｇイディオタイプ、黒色腫の突然変異体サイクリン依存性キナーゼ４、黒色腫のＰｍｅｌ−１７（ｇｐ１００）、黒色腫のＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、黒色腫のｐ１５タンパク質、黒色腫のチロシナーゼ、黒色腫、甲状腺髄様、小細胞肺癌、結腸および／または気管支偏平上皮細胞癌のＭＡＧＥ１、２および３、膀胱、黒色腫、乳房および偏平上皮癌のＢＡＧＥ、黒色腫のｇｐ７５、黒色腫の腫瘍胎児（oncofetal）抗原などのタンパク質；乳房、膵臓および卵巣癌のｍｕｃｌムチン、黒色腫のＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシドなどの炭水化物／脂質；癌の突然変異体ｐ５３、結腸癌の突然変異体ｒａｓおよび乳癌のＨＥＲ−２／ｎｅｕ原始癌遺伝子などの癌遺伝子；頸部および食道の偏平上皮細胞癌のヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物がある。タンパク質性腫瘍抗原は、タンパク質全体に由来する独特のペプチドとしてＨＬＡ分子によって与えられうることも考えられる。抗原性ペプチドを生じるタンパク質の代謝プロセッシングは当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第5,342,774号明細書（ブーン（Boon）ら）を参照されたい。したがって、本方法は、抗原性ペプチドおよび、抗原性ペプチドを生じるより大形のポリペプチドまたはタンパク質全体中のこのようなペプチドの供給を包含する。抗原性ペプチドまたはタンパク質の供給は、体液性または細胞性免疫を生じることができる。
概して、対象は、以下に詳述される方法の一つまたはそれ以上によって有効量の腫瘍抗原および／またはそれに由来するペプチドを与えられることができる。初回量は、当該技術分野において標準的な免疫感作プロトコルにしたがって、ブースター量を伴うことができる。したがって、腫瘍抗原の供給は、細胞溶解性Ｔリンパ球の増殖を刺激することができる。
タンパク質およびペプチド抗原の場合、ＦｃＲｎパートナーに対する共有結合は、１本のポリペプチド鎖のペプチド結合による結合を含むことを意味する。確立された方法（サムブルック（Sambrook）ら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press），コールド・スプリング・ハーバー，ＮＹ 1989年）は、抗原性ペプチドまたはタンパク質およびＦｃＲｎパートナーから成る融合タンパク質をコードしているＤＮＡを処理するのに用いられるであろう。このＤＮＡは、発現ベクター中に入れられ、そして確立された方法によって細菌または真核生物細胞中に導入される。融合タンパク質は、確立された方法によって細胞からまたは培地から精製されるであろう。
投与される場合、本発明の結合体は、薬学的に許容しうる製剤中で投与される。このような製剤は、常套によって、薬学的に許容しうる濃度の塩、緩衝剤、保存剤、相溶性担体、アジュバントおよびサイトカインなどの補足免疫増強剤、そして場合により、他の治療薬を含んでいてよい。したがって、結合体および薬剤を含めた「カクテル」が考えられる。薬剤自体が、ＦｃＲｎ結合パートナーに結合して、上皮関門を通過する薬剤の供給を促進することができる。
本発明の結合体は、それだけで（純粋のまま）または薬学的に許容しうる塩の形で投与することができる。医薬品中で用いられる場合、その塩は薬学的に許容できなければならないが、薬学的に許容できない塩は、それらの薬学的に許容しうる塩を製造するのに好都合に用いることがでるし、しかも本発明の範囲から除外されない。このような薬学的に許容しうる塩としては、限定されるわけではないが、次の酸、すなわち、塩酸、塩化臭素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸から製造されるものがある。更に、薬学的に許容しうる塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルキリン金属またはアルキリン土類塩として製造することができる。
適当な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％Ｗ／Ｖ）；クエン酸および塩１〜３％Ｗ／Ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％Ｗ／Ｖ）；重炭酸ナトリウム（０．５〜１．０％Ｗ／Ｖ）；並びにリン酸および塩（０．８〜２％Ｗ／Ｖ）がある。適当な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％Ｗ／Ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％Ｗ／Ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％Ｗ／Ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％Ｗ／Ｖ）がある。
本明細書中で用いられ且つ以下で更に充分に記載される「担体」という用語は、ヒトまたは他の哺乳動物に対する投与に適している１種類またはそれ以上の固体または液体賦形剤、希釈剤またはカプセル封入物質を意味する。「担体」は、投与を容易にするように活性成分と混合される天然のまたは合成の有機または無機成分であってよい。
薬剤組成物の成分は、所望の薬剤効率を実質的に損なうと考えられる相互作用が存在しないようにして、本発明の結合体とおよび互いに組合わせることができる。経口薬物製剤の成分としては、希釈剤、結合剤、滑沢剤、滑剤（glidants）、崩壊剤、着色剤および着香剤がある。腸溶性経口製剤の製造のためのカプセル封入物質としては、酢酸フタル酸セルロース、ポリ酢酸フタル酸ビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびメタクリル酸エステルコポリマーがある。カプセル剤または錠剤などの固形経口製剤が好ましい。エリキシル剤およびシロップ剤もまた、周知の経口製剤である。エアゾル製剤の成分としては、可溶化活性成分、酸化防止剤、溶媒配合物および溶液製剤用の噴射剤、並びに超微粉の且つ懸濁した活性成分、分散助剤および懸濁製剤用の噴射剤がある。注射可能な製剤は無菌でなければならないのに、本発明の経口用、エアゾル用および鼻腔用製剤は無菌でないことがあるので、このような製剤は先行技術の注射可能な製剤と区別されることがある。
「アジュバント」という用語は、本発明の結合体中に包含されるかまたはそれと同時に投与され且つ対象の免疫応答を非特異的に増強する任意の物質を含むことを意味する。アジュバントとしては、アルミニウム化合物、例えば、ゲル、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、並びにフロイントの完全または不完全アジュバント（ここにおいて、結合体は、安定化したパラフィン油中水エマルジョンの水性相中に包含されている）がある。パラフィン油は、別の種類の油、例えば、スクアレンまたはピーナッツ油で置換えることができる。アジュバント性を有する他の材料としては、ＢＣＧ（弱毒化ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis））、リン酸カルシウム、レバミゾール、イソプリノシン、ポリアニオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）ロイティナン、百日咳毒素、コレラ毒素、リピドＡ、サポニンおよびペプチド、例えば、ムラミルジペプチドがある。ランタンおよびセリウムなどの希土類塩類も、アジュバントとして用いることができる。アジュバントの量は、対象および用いられる具体的な結合体に依り、過度に実験を行うことなく当業者によって容易に決定されうる。
サイトカインなどの他の補足免疫増強剤は、本発明の結合体と一緒に供給することができる。考えられるサイトカインは、本発明にしたがって免疫調節剤を投与することから生じる有益な作用を増強するものである。サイトカインは、リンホカインを含めた、細胞の増殖および成熟を支持する因子である。サイトカインの添加は、本発明の方法を実施することによってin vivoで刺激されたサイトカイン活性を増大させると考えられる。好ましいサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子αである。他の有用なサイトカインは、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、エリトロポエチン、白血病抑制因子、オンコスタチン−Ｍ、毛様体神経栄養因子、成長ホルモン、プロラクチン、ＣＤ４０−リガンド、ＣＤ２７−リガンド、ＣＤ３０−リガンド、α−インターフェロン、β−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子βであると考えられる。本発明によって有用であると考えられるようにＴ細胞活性を調節することが知られている他のサイトカインは、顆粒球および／またはマクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１）、並びに血小板由来成長因子、表皮成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子および線維芽細胞成長因子を含めたコロニー刺激因子および成長因子である。特定のサイトカインの選択は、望まれる免疫系の特定の調節に依るであろう。特定の細胞種類に対するサイトカインの活性は、当業者に知られている。
本発明で用いられる前述のサイトカインの正確な量は、選択された結合体、選択された投薬量および投薬タイミング、投与方式および対象の特徴を含めた様々な因子に依るであろう。選択された正確な量は、特に、限界量が所望の免疫応答を促進するであろう任意の量であるので、過度に実験を行うことなく決定することができる。したがって、供給方式に応じて、ナノグラム〜ミリグラム量は有用であると考えられるが、サイトカインの生理学的濃度は同様に低いので、ナノグラム〜ミリグラム量が最も有用であると考えられる。
本発明の製剤は、有効量で投与される。有効量とは、単独でかまたは追加量と一緒に、所望のように免疫応答を刺激するであろう結合体の量である。これは、血清中の抗体力価の増加を引き起こす体液性抗体反応、向上した粘膜免疫、細胞障害性Ｔリンパ球のクローン増加、または自己抗原を含めた抗原に対する寛容性の刺激に関与することができる。１ナノグラム／キログラム〜１００ミリグラム／キログラムの範囲の用量は、投与方式に応じて有効であると考えられる。好ましい範囲は、約５００ナノグラム〜５００マイクログラム／キログラム、最も好ましくは、１マイクログラム〜１００マイクログラム／キログラムであると考えられる。その絶対量は、選択された結合体、望まれる免疫調節、投与が１回量であるか多数回量であるかということ、並びに年令、身体的症状、体格および体重を含む個々の患者のパラメーターを含めた種々の因子に依るであろう。腫瘍がある対象の治療のために、投与する結合体の量を決定する場合、腫瘍の寸法、種類、位置および転移が因子となりうる。これらの因子は当業者に周知であり、常套実験だけで示されうる。
種々の投与経路が利用可能である。選択される特定の方式は、当然ながら、選択される特定の結合体、治療される特定の症状、および治療効力に必要な投薬量に依るであろう。本発明の方法は、概していえば、本発明の結合体を上皮表面に対して供給することに関する。好ましい投与方式は、経口、肺内、胆管内および鼻腔内である。
組成物は、単位剤形で好都合に与えられることができ、そして当薬剤学技術分野において周知のいずれの方法によっても製造することができる。方法はいずれも、結合体を、１種類またはそれ以上の補助的成分を構成する担体と一緒にさせる工程を含む。概して、組成物は、結合体を、液状担体、微粉固形担体または両方と一緒にして均一に且つ密にさせた後、必要ならば、製品を造形することによって製造される。
他の供給システムとしては、時間放出、遅延放出または徐放供給システムを挙げることができる。このようなシステムは、本発明の結合体の反復投与を避けることができ、対象および医師にとってますます好都合である。多くの種類の放出／供給システムが利用可能であり且つ当業者に知られている。それらには、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリ酸無水物およびポリカプロラクトンなどのポリマー基剤システム；ロウコーティング、慣用的な結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠剤等がある。腸管上皮に対する物質の供給を促進する生体接着ポリマーシステムが知られており且つ公開されたＰＣＴ出願ＷＯ93/21906号で記載されている。腸管上皮に対して薬剤を供給するカプセル剤もまた、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ93/19660号で記載されている。
実施例
材料
略語
ＢＳＡ，ウシ血清アルブミン；ｃＤＮＡ，相補的デオキシリボ核酸；ＣＴ−Ｂ，コレラ毒素Ｂサブユニット；ＤＭＥＭ，ダルベッコ修飾イーグル培地；ＤＭＳＯ，ジメチルスルホキシド；ＤＯＣ，デソキシコレート；ＥＣＬ，増大化学発光；ＥＬＩＳＡ，酵素結合イムノソルベント検定法；ＨＢＳＳ，カルシウムまたはマグネシウム不含のハンクス平衡塩溶液；ＨＥＰＥＳ，Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−［２−エタンスルホン酸］；ｈＧＨ，ヒト成長ホルモン；ＩＥＣ，腸管上皮細胞；ＫＩ，ヨウ化カリウム；ＭＨＣ，主要組織適合性遺伝子複合体；ＮａＯＨ，水酸化ナトリウム；ＮＨ4Ｃｌ，塩化アンモニウム；ＮＨＳ−ローダミン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ローダミン；ＲＮＡ−リボ核酸；ＲＴ−ＰＣＲ，逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応；ＳＡＴＡ，Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法；スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ，スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート；スルホ−ＮＨＳ−ビオチン，スルホスクシンイミドビオチン；スルホ−ＳＭＣＣ，スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート。
化学薬品
ｃＤＮＡサイクルキットは、インビトロジェン（Invitrogen）（サン・ディエゴ，ＣＡ）から購入した。Ｔａｑポリメラーゼは、パーキン・エルマー・シータス（Perkin-Elmer Cetus）（ノーウォーク，ＣＴ）から購入した。Circum VentTMキットは、ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）（ビバリー，ＭＡ）から購入した。放射性核種および放射性化学薬品は、デュポン（DuPont）／ＮＥＮ（ボストン，ＭＡ）から購入した。ＨＢＳＳおよびＤＭＥＭは、ＧＩＢＣＯ／ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）（ゲイサーズバーグ，ＭＤ）から購入した。ＲＰＭＩ １６４０は、セルグロ（Cellgro）（ハーンドン，ＶＡ）から購入した。Ｌ−グルタミンはセルグロから購入した。プロテインＡ−セファロースは、ファーマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech）（ピスカタウェイ，ＮＪ）から購入した。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＡＴＡおよび固定化フィシンは、ピアース（Pierce）（ロックフォード，ＩＬ）から購入した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories）（ウィルミントン，ＭＡ）から購入した。ＥＣＬキットは、アマーシャム（Amersham）（アーリントン・ハイツ，ＩＬ）から購入した。プラスミン、AvidChrom−プロテインＡ、プロテインＧ−セファロース、ＢＳＡ、コレラ毒素Ｂサブユニット、抗ｈＧＨ抗体および他の全ての化学薬品は、シグマ（Sigma）（セント・ルイス，ＭＯ）から購入した。
実施例１：ヒト腸管上皮一次細胞および細胞系におけるＦｃＲｎ ｍＲＮＡの発現
全ＲＮＡを、当該技術分野において周知の標準法（サムブルックら、上記）によって成人腸細胞から抽出した。それぞれの細胞種からのＲＮＡ １マイクログラムを鋳型として用いて、ｃＤＮＡサイクルキット（インビトロジェン，サン・ディエゴ，ＣＡ）を用いる逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのｃＤＮＡ基質を製造した。そのｃＤＮＡで、Ｔａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータス，ノーウォーク，ＣＴ）を用いて製造者の指示にしたがって、プライマーＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＡＣＴＧおよびＣＧＣＴＴＴＴＡＧＣＡＧＴＣＧＧＡＡを用いて３０回のＰＣＲサイクルを行った。そのＰＣＲサイクル条件は、９４℃で１分間の変性、５５℃で２分間のアニーリングおよび７２℃で３分間の伸長であった。増幅生成物は、１．５％アガロースゲル上の電気泳動によって分離され、そして臭化エチジウム染色によって可視化され、それは、成人結腸上皮細胞を除く全部の試料中において予想された約８００塩基対増幅生成物の存在を示した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅生成物の同一性を確証するために、ＤＮＡバンドをアガロースゲルから切取り、ｐＣＲ II（インビトロジェン，サン・ディエゴ，ＣＡ）中にサブクローン化し、そしてPrismTM色素−デオキシターミネーターサイクル配列決定用キット（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems），フォスター・シティー，ＣＡ）を用い、ベクターおよびヒトＦｃＲｎ配列両方からのプライマーを用いて配列決定した。反応生成物は、アプライド・バイオシステムズシークエンサーで分析された。増幅生成物の配列は、ＦｃＲｎ遺伝子配列と正確に対合し、発現された遺伝子の同一性が確証された。
実施例２：ノーザンブロットによるＦｃＲｎ ｍＲＮＡの検出
ヒト腸管上皮細胞および細胞系におけるＦｃＲｎの発現を確証するために、実施例１で記載のように製造されたＲＮＡ試料を用いて、成人腸細胞から、並びに結腸起原の２種類のヒト腺癌細胞系ＣａＣＯ−２およびＨＴ−２９からノーザンブロットを作成した。そのＲＮＡ試料は、ホルムアルデヒド／アガロースゲル電気泳動によって分離され、そして標準法（サムブルックら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハーバー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ＮＹ 1989年）によってナイロン膜に移された。その膜を、32Ｐで放射性標識された１２０塩基対プローブを用いて、標準法によってＦｃＲｎの３′非翻訳部分からプローブした。ノーザンブロットのオートラジオグラムは、腸細胞および両細胞系における１．５キロベースのｈＦｃＲｎ転写物の存在を実証した。したがって、成人腸管上皮細胞および細胞系におけるＦｃＲｎの発現は、二つの異なったＲＮＡ検出法によって実証された。
実施例３：腸管上皮細胞からのＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の標識付けおよび免疫沈降
ヒト腸管上皮細胞におけるＦｃＲｎの発現は、タンパク質の免疫沈降によって確証された。Ｃａｃｏ−２細胞を、35Ｓ−メチオニン（デュポン／ＮＥＮ，ボストン，ＭＡ）を用いて代謝的に標識し、そしてタンパク質を当該技術分野において周知の方法（ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane），Antibodies:A Laboratory Manual）によって抽出した。プロテインＡ−セファロースに結合した多クローン性ウサギ抗ラットＭＨＣクラスＩ関連ＦｃＲ重鎖特異的抗血清を用い、標準法を用いて細胞抽出物からＦｃＲｎを免疫沈降させた（ＦｃＲｎは、シミスター（Simister）およびレス（Ress），1985年，European J.Immunology,15:733-8の充分に確立された方法によって精製され、そしてそれを用いてラットを免疫感作した後、血清を集めることができる、ハーロウおよびレーン，上記）。免疫沈降物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてオートラジオグラフィーによって可視化された。４８キロダルトンのＦｃＲｎタンパク質が見られ、そのＲＮＡ濃度で見られた発現が確証された。
実施例４：ヒト腸管上皮細胞の細胞表面上でのＦｃＲｎタンパク質の発現
ＨＴ−２９腸管表皮細胞約３Ｘ１０7個を、非酵素的方法によって組織培養プレートから分離し、そしてカルシウムまたはマグネシウム不含の氷冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ−，ＧＩＢＣＯ／ライフ・テクノロジーズ，ゲイサーズバーグ，ＭＤ）で４回洗浄した。細胞表面タンパク質を標識するために、その洗浄された細胞を、ＤＭＳＯ中０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ピアース，ロックフォード，ＩＬ）１．５ｍｌと一緒に２０分間２回インキュベートした。標識された細胞を５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌで５回洗浄し、１ｍＭ Ｌ−グルタミン（メディアテク（Mediatech），ワシントン，ＤＣ）を含有するＲＰＭＩ １６４０（セルグロ，シティー，米国）１０ｍｌと一緒に２０分間インキュベートし、そしてＨＢＳＳ−で４回洗浄した。その細胞を溶解させた後、当該技術分野において周知の標準的な技法を用いて、プロテインＡ−セファロースビーズ（ファーマシア・バイオテク，ピスカタウェイ，ＮＪ）を用いて一晩中予め清澄にした。ＳＤＳおよびデソキシコール酸（ＤＯＣ）をその上澄みに加えて、最終濃度をそれぞれ０．１％および０．５％にした。溶解産物を、正常ウサギ血清を用いて予め清澄にし、そして当該技術分野において周知の方法によって多クローン性ウサギ抗ラットＭＨＣクラスＩ関連ＦｃＲ抗体と一緒に免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜は、製造者によって提示されたように、１：１０，０００に希釈されたストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ピアース，ロックフォード，ＩＬ）と一緒にインキュベーションするために処理された。次に、その膜を、ＥＣＬキット（アマーシャム，アーリントン・ハイツ，ＩＬ）を用いて、結合した西洋ワサビペルオキシダーゼの検出のために処理した。化学発光基質の開裂による発光を、感光性フィルムへの膜の暴露によって検出した。フィルム暴露は、ＦｃＲｎがＨＴ−２９腸管上皮細胞の表面で発現されたことを示した。
実施例５：腸管上皮細胞の細胞表面上のヒトＦｃＲｎの機能活性
腸管上皮細胞の細胞表面上で発現されたＦｃＲｎが機能性であったことを示すために、Ｃａｃｏ−２細胞および成人空腸腸管上皮細胞（ＩＥＣ）を、抗体のＦｃフラグメントを結合するその能力について調べた。Ｃａｃｏ−２および空腸ＩＥＣをミクロ遠心管に分配し（細胞２Ｘ１０6個／管）、そして４℃において２０００ｒｐｍで２〜３分間ペレットにした。細胞ペレットを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ，ｐＨ６．０またはｐＨ８．０中において４℃で１回洗浄し、そして同培養液０．２ｍｌ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を検定用の１２ウェルプレートに移した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ ＫＩおよび０．１％フィッシュゼラチンを含有するＤＭＥＭ，ｐＨ６．０またはｐＨ８．０中の125Ｉ−Ｆｃフラグメント（２００ｎｇ／ｍｌ，４Ｘ１０-9Ｍ）を、未標識ヒトＩｇＧ（３．３Ｘ１０-6Ｍ）０．５ｍｇ／ｍｌと一緒にまたは含むことなくそれぞれのウェルに加えた。細胞に、５％ＣＯ2給湿雰囲気中において３７℃で２時間ＩｇＧまたはＦｃを結合させた。細胞をミクロ遠心管に移し、そして４℃において２０００ｒｐｍで２〜３分間ペレットにした。非結合125Ｉ−Ｆｃは、細胞ペレットを、４℃において２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する冷ＤＭＥＭ，ｐＨ６．０またはｐＨ８．０で１回洗浄することによって除去された。細胞を０．１Ｍ ＮａＯＨ ０．５ｍｌ中で破壊し、そして得られた溶液をシンチレーションバイアルに移した。125Ｉは、CliniGamma 1272 γ計数計（ＬＫＢワラク（Wallac），ピスカタウェイ，ＮＪ）を用いて定量した。Ｃａｃｏ−２細胞および成人空腸ＩＥＣは両方とも、ｐＨ８．０ではなくｐＨ６．０で125Ｉ−Ｆｃを特異的に結合し、ラット新生児ＦｃＲｎおよびクローン化ヒトＦｃＲｎについて見られるような機能性ｐＨ依存性結合が実証された（スートリーら，J.Exp.Med.,180:2377-2381;1994年12月）。
実施例６：ヒト免疫グロブリンＧの製造
ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ブタ、ウシおよび他の種からの非特異的精製免疫グロブリンＧは、シグマ・ケミカル・カンパニー、ピアース・ケミカル、ハイクローン・ラボラトリーズ（HyClone Laboratories）、ＩＣＮバイオメディカルズ（Biomedicals）およびオルガノン・テクニカ・カペル（Organon Teknika-Cappel）などの販売者から購入することができる。
免疫グロブリンＧは、血清の硫酸アンミニウム沈降によって単離することもできる。タンパク質沈降物をイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーによって更に分別して、実質的に精製された非特異的ＩｇＧを単離する。非特異的ＩｇＧとは、抗体集団またはプール中で支配的である単一の特異性がないことを意味する。
免疫グロブリンＧはまた、プロテインＡ−セファロース（ファーマシア）、AvidChrom−プロテインＡ（シグマ）またはプロテインＧ−セファロース（シグマ）などの固体支持体に結合したプロテインＡに対する吸着によって血清から精製することができる。ＩｇＧの他の精製法は当業者に周知であり、非特異的ＩｇＧの単離のために用いることができる。
実施例７：ヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃフラグメントの製造
ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントを製造するために、実施例６でのように単離されたＩｇＧを、固定化パパイン（ピアース）を用いてその製造者に提示されたプロトコルにしたがって消化する。Ｆｃ受容体に結合しうる完全なＦｃフラグメントを生じるようにＩｇＧを消化する他のプロテアーゼ、例えば、プラスミン（シグマ）または固定化フィシン（ピアース）は当業者に知られており、Ｆｃフラグメントを製造するのに用いることができる。次に、消化された免疫グロブリンを、プロテインＡ−セファロースまたはプロテインＧ−セファロースなどの親和性基質と一緒にインキュベートする。ＩｇＧの非結合部分は、バッチまたはカラム形式で充分に洗浄することによって親和性基質から溶離される。次に、Ｆｃ吸着結合と不相溶性である緩衝液の添加によってＩｇＧのＦｃフラグメントを溶離する。Ｆｃフラグメントの精製において有効な他の方法もまた用いることができる。
実施例８：ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントに対する化合物の結合
ＦｃＲｎ輸送機序によって化合物を供給するために、このような化合物を、完全なＩｇＧまたはＦｃフラグメントに対して結合させることができる。架橋の化学およびこのような目的に有効な試薬は、当該技術分野において周知である。完全なＩｇＧまたはＦｃフラグメントおよび供給される化合物を結合させるのに用いられる架橋性試薬の性状は、本発明によって制限されない。いずれの架橋性試薬も、（ａ）化合物の活性が保持される、および（ｂ）結合体のＦｃ部分のＦｃＲｎによる結合が悪影響を受けないという条件ならば用いることができる。
Ｆｃおよび化合物の有効な一段法架橋の例は、過ヨウ素酸ナトリウムをリン酸ナトリウム緩衝液中において室温で３０分間用いた後、結合される化合物と一緒に４℃で一晩中インキュベーションするＦｃの酸化である。結合は、化合物およびＦｃフラグメント両方を、スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ，ピアース）によって室温で１８時間誘導体化することによって行うこともできる。結合はまた、Ｆｃフラグメントおよび供給される所望の化合物を、引き続き共有結合を形成するであろう種々の架橋性試薬によって誘導体化することによって行うことができる。この反応の例は、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ，ピアース）によるＦｃフラグメントの誘導体化であり、Ｆｃに対して結合される化合物は、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）によってチオール化される。これらの誘導体成分は、架橋剤不含で精製され、そして室温で１時間混合されて架橋する。アルデヒド、イミド、シアノ、ハロゲン、カルボキシル、活性カルボキシル、酸無水物およびマレイミド官能基を含む他の架橋性試薬は当業者に知られており、Ｆｃフラグメントに化合物を結合させるのに用いることもできる。架橋性試薬の選択は、当然ながら、Ｆｃに対して結合されることが望まれる化合物の性状に依るであろう。上記の架橋性試薬は、タンパク質−タンパク質結合に有効である。結合される化合物が炭水化物であるかまたは炭水化物残基を有する場合、タンパク質性ＦｃＲｎ結合分子との結合には、ＡＢＨ、Ｍ2Ｃ2Ｈ、ＭＰＢＨおよびＰＤＰＨなどのヘテロ二官能性架橋性試薬が有用である（ピアース・ケミカル・カンパニー，ロックフォード，ＩＬ）。タンパクおよび炭水化物を結合するもう一つの方法は、ブルミーヌ（Brumeanu）ら（Genetic Engineering News, 1995年10月1日, 16頁）によって開示されている。結合される化合物が脂質であるかまたは脂質残基を有し、それがＦｃＲｎ結合分子への結合部位として好都合である場合、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＢおよびそれらの誘導体などの架橋剤を用いることができる（ピアース・ケミカル・カンパニー，ロックフォード，ＩＬ）。非共有結合手段によって供給されるべきである何等かの分子を結合することも可能である。非共有結合を達成するのに好都合な一つの方法は、当該技術分野において周知の方法によって、供給される化合物に対して単クローン性抗体のような抗体を生じさせ、そして正しいＦｃ部分および望ましい抗原結合性を有する単クローン性抗体を選択することである。次に、供給される抗原をその単クローン性抗体担体に対して予備結合させる。上の架橋反応のいずれにおいても、架橋性試薬を含まないで誘導体化合物を精製することは重要である。非結合反応体を実質的に含まないで最終結合体を精製することもまた重要である。精製は、結合体のそれぞれの成分の性質に基づいて、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって達成することができる。特に好ましい方法は、最初に、プロテインＡ−セファロースを用いてＦｃおよびＦｃ化合物結合体を保持するアフィニティー精製工程を行った後、Ｆｃ結合体の質量、寸法または電荷に基づいてゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを行う。この精製スキームの最初の工程は、結合体がＦｃＲｎに結合することを確実にし、これは本発明の不可欠な必要条件である。
実施例９：腸管上皮関門を通過するＩｇＧに助けられた外来抗原の供給
上皮関門を越えて輸送されるＦｃ結合パートナー−抗原結合体の能力を調べるために、マウスへ投与するための外来抗原をＩｇＧ分子に結合させる。好都合な外来抗原は蛍光色素ローダミンであり、それは、腸管上皮の凍結半薄切片で可視化することができるためである。スクシニルローダミン（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes），ユージーン，ＯＲ）を用いる製造者によって提示されたようなインキュベーションによって、実施例６で記載のように製造された非特異的マウスＩｇＧ、コレラ毒素Ｂサブユニット（シグマ）およびオボアルブミン（シグマ）に対してローダミンを共有結合させる。ＩｇＧ−ローダミン結合体は、プロテインＧ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。非結合スクシニルローダミンを除去する透析の後、コレラ毒素Ｂ（ＣＴ−Ｂ）−ローダミンおよびオボアルブミン−ローダミン結合体を、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。溶出液の画分の蛍光を測定することによって結合体の存在について検定する。ＩｇＧおよびＣＴ−Ｂサブユニット結合体の機能性結合は、それぞれ、ＦｃＲｎおよびガングリオシドＧＭＩに対する結合によって調べることができる。コレラ毒素Ｂ−ローダミンおよびオボアルブミン−ローダミンはそれぞれ、正および負の対照として役立つ。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．２ナノモルの上記３種類のローダミン結合体を、非特異的アジュバントとして０．２ナノモルの未標識コレラ毒素と一緒にまたは不含で、胃分解を阻止するように７５マイクロモルＮａＨＣＯ3およびダイズトリプシン阻害剤２０ｍｇ／ｍｌの存在下において胃内投与によって投与する。６時間後にマウスを屠殺し、そして腸管を取出し、凍結させ、そして半薄切片用に処理する。腸管上皮の切片を蛍光顕微鏡で照明し、そして細胞内蛍光について調べた。ＩｇＧ−ローダミンを与えられたマウスの腸管上皮細胞中における蛍光の存在は、ＩｇＧ結合体が、先端において基底外側方向へと腸管上皮関門を越えて効果的に輸送されることを示す。ＦｃＲｎは、ＦｃＲｎ結合パートナーと一緒に結合体として免疫原を輸送することができる。
実施例１０：ＦｃＲｎ依存性細胞透過によって経口供給される抗原−ＩｇＧ結合体に対するマウス粘膜免疫応答
β2−ミクログロブリン（Ｆｃ受容体機能の臨界的成分）の欠失に対してホモ接合のトランスジェニックマウスおよびそれらの正常な野生型同腹子を、粘膜免疫応答発生の研究に用いる。ローダミン−ＩｇＧが先端膜Ｆｃ受容体に対して結合することによって粘膜免疫応答を引き起こす場合、正の免疫応答は、β2−ミクログロブリン「ノックアウト」マウスではなく野生型で見出されるはずである。これに対して、上皮関門を越えるＣＴ−Ｂの細胞透過は先端膜Ｆｃ受容体に対する結合に依らないので、ローダミン−コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ）は、野生型および「ノックアウト」マウス両方で正の免疫応答を引き起こすはずである。ローダミン−オボアルブミンは、（液相エンドサイトーシスによって腸管上皮に入ることはあるが）細胞透過性小胞に入らないし、どのマウスでも免疫応答を引き起こさないはずである。
野生型およびβ2−ミクログロブリンノックアウトマウスの３群を、実施例９で記載の３種類のローダミン結合体で経口によって免疫感作する。非特異的アジュバントとして０．２ナノモルのコレラ毒素を加えて、平行実験を行う。等モル量のローダミン結合体を胃内投与する。マウスは、この方法によって１０日ごとに全部で３回「免疫感作」される。３回目の経口免疫感作の２週間後に、マウスを屠殺し、そしてローダミン特異的免疫応答を、ＥＬＩＳＡによって腸分泌および血清について標準法で確認する。抗ローダミン血清免疫グロブリンは、ＣＴ−ＢおよびＩｇＧのローダミン結合体を与えられた野生型マウスで最も明らかである。β2−ミクログロブリンを欠いたノックアウトマウスは、ローダミン−ＩｇＧに対してではなくローダミン−ＣＴ−Ｂに対して粘膜免疫応答を生じ、受容体依存性細胞透過は粘膜免疫応答において本質的な役割を果たしていることが示される。対照のローダミン−オボアルブミン結合体は、野生型においてもβ2−ミクログロブリンノックアウトマウスにおいてもほとんどまたは全く免疫応答を引き起こさない。
当業者は、上記の独特の生成物および処理に対する多数の同等物を常套実験だけで理解するかまたは確認することができるであろう。このような同等物は、本発明の範囲内であると考えられるし且つ請求の範囲によって包含されるものである。
Claims (27)
- 患者の上皮関門に対して投与して、上皮関門を通過して分子を輸送するための、前記分子と結合したIgGのFcフラグメントの結合体を含む医薬製剤であって、ここで当該結合体中のIgGのFcフラグメントがヒトFcRnと結合し、そして製剤が上皮関門への供給用に製剤化される、前記医薬製剤。
- 製剤が上皮関門への供給用に、カプセル剤、錠剤、エリキシル剤、またはシロップ剤として製剤化される、請求項1に記載の医薬製剤。
- 製剤が上皮関門への供給用に、エアロゾル剤として製剤化される、請求項1に記載の医薬製剤。
- 前記分子が、抗原または治療剤である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 前記分子がサイトカインである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 前記サイトカインが、インターロイキン、成長因子、インターフェロン、または腫瘍壊死因子である、請求項5に記載の医薬製剤。
- 前記サイトカインがエリスロポエチンである、請求項5に記載の医薬製剤。
- 前記分子が腫瘍の特徴を示す抗原である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 前記分子が病原体の特徴を示す抗原である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 前記分子がアレルゲンの特徴を示す抗原である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 前記分子が自己免疫疾患の特徴を示す抗原である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- IgGのFcフラグメントが、前記分子に対して共有結合される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 上皮関門への供給用に、経口投薬として構築されそして調整された、請求項1、2および4〜12のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 上皮関門への供給用に、エアロゾル投薬として構築されそして調整された、請求項1、および4〜12のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 上皮関門への供給用に、鼻腔内投薬として構築されそして調整された、請求項1、および4〜12のいずれか1項に記載の医薬製剤。
- 患者の上皮関門に対して投与して、前記患者の上皮関門を通過して分子を輸送するために適合させた患者の経上皮治療のための医薬を調製するための、ヒトFcRnに結合するIgGのFcフラグメントに結合した分子の結合体の使用。
- 患者の免疫系の経上皮修飾のための医薬を調製するための、請求項16に記載の結合体の使用。
- 前記分子が、抗原または治療剤である、請求項16または17に記載の使用。
- 前記分子がサイトカインである、請求項16または17に記載の使用。
- 前記分子が、腫瘍の特徴を示す抗原、病原体の特徴を示す抗原、アレルゲンの特徴を示す抗原、または自己免疫疾患の特徴を示す抗原である、請求項16または17に記載の使用。
- IgGのFcフラグメントが、前記分子に対して共有結合される、請求項16〜20のいずれか1項に記載の使用。
- 医薬が、上皮関門への供給用に、経口投薬、エアロゾル投薬、または鼻腔内投薬として構築されそして調整された、請求項16〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記サイトカインがα-インターフェロンである、請求項5に記載の医薬製剤。
- 前記サイトカインがβ-インターフェロンである、請求項5に記載の医薬製剤。
- 前記サイトカインがエリスロポエチンである、請求項19に記載の使用。
- 前記サイトカインがα-インターフェロンである、請求項19に記載の使用。
- 前記サイトカインがβ-インターフェロンである、請求項19に記載の使用。
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