JP3921271B2 - グルクロン酸転移酵素をコードするｄｎａ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルクロン酸転移酵素（グルクロニルトランスフェラーゼ）をコードする塩基配列を有する新規なＤＮＡに関するものである。より詳しくは神経細胞及び免疫系細胞で特異的に発現するＨＮＫ−１エピトープの合成に関与するグルクロン酸転移酵素をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経系組織及び免疫系細胞に特異的に存在することが知られているＨＮＫ−１抗原は、神経系の伸展や相互の接着などに重要な役割を果たすこと及び自己免疫疾患に伴う末梢神経障害の発症の際に上記抗原に対する抗体が増加することが知られている（ファルマシア,32,11,1361-1369(1996)）。また、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ細胞）に上記抗原は発現しており、また腫瘍細胞に選択的に集まる細胞は上記抗原が発現したＴ細胞であることが知られている為（Clin. Exp. Immunol.,102,159-166(1995)）、上記抗原はＮＫ細胞の異物認識機構及び異物除去機構に関与していると考えられるが、従来の研究においては、ＮＫ細胞上に発現した当該抗原は当該細胞のマーカーとして利用されているのみであり、その機能は全く解明されていない。上記抗原はその特異的構造として通常の糖タンパク質や糖脂質には見られない３位が硫酸化されたグルクロン酸を有し、当該抗原の生体内における合成には、グルクロン酸転移酵素が働いていることが明らかである。グルクロン酸転移酵素はグルクロン酸転移酵素−Ｌとグルクロン酸転移酵素−Ｐの２種類に大別される（J. Biol. Chem., 267, 32, 22711-22714(1992)）が、これらの酵素について詳細は未だ不明である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のようにＨＮＫ−１抗原が神経系の発達、障害に大きく関与していることは明かであるが、そのメカニズムの解明が未だなされていない。特に自己免疫疾患に伴う末梢神経障害は深刻な問題となっているが、その根本的治療法の解明は遅れており、この点からも上記メカニズムの解明が期待される。また、免疫系細胞の異物認識機構及び異物除去機構の解明はされておらず、その解明にはＨＮＫ−１抗原の機能を解明することが必要とされる。
【０００４】
本発明者らは、ＨＮＫ−１抗原の機能を解明するために、その生体内での合成において律速段階となる反応を制御するグルクロン酸転移酵素−Ｐ（以下「ＧｌｃＡＴ−Ｐ」とも記載する）を生体組織から抽出・精製することに既に成功していたが、その操作は複雑であり、さらに当該酵素は微量しか得ることができなかった。また、ｃＤＮＡが未だクローニングされていなかったため、特に生体（細胞）内でのＨＮＫ−１抗原の機能解明を進めることが不可能であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題に鑑み、ＨＮＫ−１抗原の機能解明を早期に実現するべく、その生体内及び生体外での合成の律速段階となるグルクロン酸転移反応を制御する酵素であるグルクロン酸転移酵素−Ｐの大量生産及び細胞内における当該酵素の機能の解明を可能とするために、グルクロン酸転移酵素−Ｐの遺伝子を得るべく鋭意検討した結果、上記酵素のｃＤＮＡのクローニングに成功し、該ｃＤＮＡによりＧｌｃＡＴ−Ｐが発現することを確認して本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の性質を有するグルクロン酸転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを提供する。
▲１▼作用：
グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体にグルクロン酸を転移する。
▲２▼基質特異性：
アシアロオロソムコイド及び神経細胞接着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグルクロン酸を転移する。
▲３▼至適反応ｐＨ：
ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM ＭＥＳ緩衝液、３７℃）。
▲４▼阻害及び活性化：
Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭのネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ14Ｈ29共存下において活性が維持される。
▲５▼分子量：
還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約４５,０００。ゲルろ過により測定される分子量が約９０，０００。
【０００７】
本発明は、また、配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、グルクロン酸供与体から、受容体であるアシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいグルクロン酸転移酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードする塩基配列を有するＤＮＡを提供する。
【０００８】
本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番号２においてアミノ酸番号１〜３４７及び７５〜３４７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【０００９】
また、本発明は、上記ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地で培養し、該ＤＮＡが有する塩基配列によってコードされる本酵素のポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から前記ポリペプチドを採取することを含む、ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明のグルクロン酸転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（本発明ＤＮＡ）
本発明のＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むグルクロン酸転移酵素は、本発明者らによってラットの脳から抽出、精製されたグルクロン酸転移酵素−Ｐ（Oka, S., Terayama, K., Kawashima, C., and Kawasaki, T.(1992) J. Biol. Chem. 267, 22711-22714）であり、下記のような理化学的性質を有する。
▲１▼作用：
グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体にグルクロン酸を転移する。
▲２▼基質特異性：
アシアロオロソムコイド及び神経細胞接着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグルクロン酸を転移する。
▲３▼至適反応ｐＨ：
ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM ＭＥＳ緩衝液、３７℃）。
▲４▼阻害及び活性化：
Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭのネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ14Ｈ29共存下において活性が維持される。
▲５▼分子量：
還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約４５,０００。ゲルろ過による分子量が約９０，０００。
【００１１】
上記グルクロン酸転移酵素−Ｐの活性は上記文献に記載の方法に従って測定することができる。グルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイド及び神経細胞接着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的であるとは、一般に、その残基へのグルクロン酸転移活性が、上記グルクロン酸受容体をグルクロン酸の受容体として使用した際に糖脂質のＮ−アセチルラクトサミン残基を受容体として使用した際と比較して５倍以上であることをいう。至適ｐＨは同文献に記載の反応液において、100mMＨＥＰＥＳ緩衝液を100mM ＭＥＳ緩衝液で置き換えて測定することが可能である。阻害及び活性化は、同反応液に種々の試験物質を加えて活性を測定することにより判定できる。Ｍｎ2+での活性化は少なくとも20 mMの濃度で認められる。また、活性の維持とは通常には糖脂質性阻害剤非存在下に比べ７０％以上の活性を維持することをいう。糖脂質性阻害剤の例としては、ネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ14Ｈ29が挙げられる。
【００１２】
また、上記グルクロン酸転移酵素−Ｐは、通常は、次の性質も有する。２価陽イオン非存在下では活性が著しく低下する。Ｎ−エチルマレイミドにより活性が阻害される。スフィンゴミエリンにより活性化される。
【００１３】
分子量の測定は、酵素タンパク質について一般に採用される条件で行われる。
本発明のＤＮＡは、本発明により初めて単離されたＤＮＡであり、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部をコードしているのであればその塩基配列は特に限定はされない。また、本発明ＤＮＡが有する塩基配列がコードするＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドはグルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよく、そのようなＤＮＡの何れもが本発明のＤＮＡに包含される。該活性の測定方法は公知であり（例えば、J. Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)など）、当業者であれば、目的とする酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び転位をアミノ酸配列に有する本酵素を容易に選択することができる。
【００１４】
本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２においてアミノ酸番号１〜３４７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。本発明ＤＮＡが有する塩基配列として更に具体的には、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも一部又は全てを有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号に示す塩基配列における塩基番号１９５〜１２３８の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１５】
配列番号１に示す塩基配列において、ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡのオープンリーディングフレームには７つのイン・フレームのＡＴＧコドンが含まれている。第１番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は、真核細胞の翻訳開始部位の共通配列と比較すると、−３の位置のプリンが保存されており、＋４の位置のＧ（グアニン）も保存されている。このことは、効率的な翻訳に関するKozakの知見（Kozak, M. (1986)Cell, 44,283-292）を満足している。また、第２、第５〜第７番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列も、−３の位置がプリン（それぞれＧ、Ａ（アデニン）、Ｇ、Ｇ）であり、第４番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は−３の位置がプリンではない（Ｃ（シトシン））が、＋４の位置のＧが保存されており、第３番目のＡＴＧコドン以外は何れのＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能性がある。
【００１６】
ところで、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988) J. Biochem. 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaperらは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いものとの両方の形態が合成されることを示している。さらに、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在することを示唆する証拠を示している。（Lopez, L. et al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15991）。同様に、ＧｌｃＡＴ−Ｐについても、複数のＡＴＧコドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定かではない。しかし、何れのＡＴＧコドンが開始コドンであっても、上記のグルクロン酸転位酵素−Ｐをコードする点では同じであり、第２番目、第４番目〜第７番目のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本発明に包含されるものである。
【００１７】
第１番目のＡＴＧコドンで始まる単一のオープンリーディングフレームからは、３４７アミノ酸残基からなり、３９，７０６Ｄａのタンパク質が予測される。このアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロットから、Ｎ−末端から２０〜３６番目のアミノ酸残基に渡る長さ１７残基の１つの顕著な疎水性部分を認められ、トランスメンブレン（膜貫通）ドメインを有するＴｙｐｅIIの膜タンパク質であることが予想される。また、この膜貫通ドメインのすぐＣ末端側には比較的プロリンが多く存在することが認められる。このようなプロリンに富む領域は、他のいくつかの糖転移酵素においてもみつかっており、膜貫通ドメインと活性ドメインを結ぶネック領域を形成していると考えられる。したがって、この領域よりＮ末端側を短縮化しても活性には影響しないと考えられ、また、膜貫通ドメインのほとんどを短縮化により欠失させれば、可溶化形態のグルクロン酸転移酵素を得ることができる。本発明は、このような可溶化タンパク質形態のグルクロン酸転移酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡも包含する。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２においてアミノ酸番号７５〜３４７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１８】
本発明ＤＮＡは、このＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドが、グルクロン酸供与体からグルクロン酸受容体である糖タンパク質の構成糖にグルクロン酸を転移する活性を実質的に害さない限り、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を起こすようなヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに挿入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987);Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、欠失、挿入又は転位を導入することができる。本酵素の活性の測定方法は公知であり（例えば、J. Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)など）、当業者であれば、目的とする酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位をアミノ酸配列に有する本酵素をコードするＤＮＡにおける塩基配列の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００１９】
なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
さらに、染色体由来のＧｌｃＡＴ−Ｐ遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部をコードする限り、本発明のＤＮＡ断片に包含される。すなわち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプロセッシングを受けて最終的に目的のポリペプチドを生じうる塩基配列を有することも包含する。
【００２０】
また、本明細書において「ポリペプチドの少なくとも一部をコードする」とは、好ましくは、ＧｌｃＡＴ−Ｐ活性を有する、抗原性を有するなどの何らかの活性ないし機能を有する部分、あるいは、その部分に相当する塩基配列がそのＧｌｃＡＴ−Ｐに特異的であって、プライマーやプローブとして使用できる部分をコードすることを意味する。
【００２１】
なお、本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明のＤＮＡは、ＧｌｃＡＴ−Ｐをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖及びこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００２２】
また、本発明ＤＮＡは、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を有していてもよく、またＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの一部分をコードする塩基配列を有するものであってもよい。
【００２３】
以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説明する。本発明により本発明ＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発明のＤＮＡを増幅することによって取得することも可能であり、また、特に以下の工程からなるｃＤＮＡクローニングにより製造することも可能である。
（１）精製したＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部のアミノ酸を決定する。
（２）上記アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを作成する。（３）哺乳類の組織より抽出したＲＮＡから上記プライマーを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅することによって前記転移酵素のプローブを作成する。
（４）上記プローブによって哺乳類の組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。スクリーニングによって、通常には上記転移酵素の完全長ｃＤＮＡを選択する。
【００２４】
しかし、本発明のＤＮＡの製造方法はこれに限定されるものではなく、上記ＰＣＲ法や、他の公知のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡを製造することができる。
【００２５】
以下に、本発明のＤＮＡを製造する方法を具体的に説明する。
（１）グルクロン酸転移酵素−Ｐ（ＧｌｃＡＴ−Ｐ）のアミノ酸配列の決定
(i)ＧｌｃＡＴ−Ｐの精製
ＧｌｃＡＴ−Ｐは、例えばヒト、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ等の哺乳類の脳などのＧｌｃＡＴ−Ｐを発現する組織の細胞から、通常のタンパク質の精製方法、およびＧｌｃＡＴ−Ｐの基質（例えばウリジン２リン酸（ＵＤＰ）−グルクロン酸など）あるいは阻害剤（前記糖脂質性阻害剤など）を用いたアフィニティークロマトグラフィを組み合わせることによって精製することが可能であるが、ラットの脳を使用することが好ましい。具体的には、例えばJ. Biol. Chem. 267, (32),22711-22714(1992)に記載された方法に従って行うことができる。
【００２６】
(ii)ＧｌｃＡＴ−Ｐの部分アミノ酸配列の決定
精製したＧｌｃＡＴ−Ｐを断片化する方法は特に限定はされず、タンパク質分解酵素と共にインキュベートするなど公知の方法でタンパク質を断片化することができる。具体的なタンパク質分解酵素の例としてはトリプシンが挙げられる。トリプシンでＧｌｃＡＴ−Ｐを処理し、その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いて分離することができる。タンパク質分解酵素消化後に生じたペプチドは、公知の方法によりアミノ末端配列決定を行うことが可能である。具体的には例えばモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド バイオシステムス(Applied Biosystems)製）などを用いてアミノ酸の配列を分析することが好ましいがこれに限定はされない。なお、業者に依頼してアミノ酸配列を決定してもらうことも可能である。
【００２７】
(iii)オリゴヌクレオチドプライマーの合成
ＧｌｃＡＴ−Ｐの部分的アミノ酸配列に基づき、ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを作成する。アミノ酸配列のうち、なるべくコドンの縮重の少ない部位を用いることが好ましい。このような縮重オリゴヌクレオチドプライマーの例を、図１に示す（センスプライマー：配列番号６、９、１０；アンチセンスプライマー：配列番号７、８、１１）。
【００２８】
（２）ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡの調製とプローブの作成
▲１▼ｍＲＮＡは、公知の方法（Kingston, R. S., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkなど）で得ることができる。材料は、ＧｌｃＡＴ−ＰのｍＲＮＡを発現している材料であれば限定はされないが、前記例示の哺乳類の組織が好ましく特にラットの大脳皮質が好ましい。特に上記酵素のｍＲＮＡを強く発現していることから、２週齢前後のラットの大脳皮質が好ましい。
【００２９】
全ＲＮＡは、前述の材料から通常用いられるｍＲＮＡの調製法により得ることができるが、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston, R. B., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York）あるいはグアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162, 156-159(1987)）で調製することが簡便なため好ましい。
【００３０】
▲２▼逆転写反応及びＰＣＲ法を用いたＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡの増幅
上記ｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマー或いはオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により鋳型ＤＮＡを作成し、この鋳型ＤＮＡを基にＰＣＲ法により、ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡを増幅することができる。逆転写反応は、通常の方法と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すならば以下の通りである。２０μｇのｍＲＮＡ、４０ｐｍｏｌのランダムプライマー又は縮重オリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコ(Gibco BRL)）、１０ｍＭジチオスレートール（ＤＴＴ）、３０単位のヒト胎盤由来リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）インヒビターを含む緩衝液（終体積４０μ）を、４２℃で１時間インキュベートする。このようにして得られた逆転写反応産物を基に、前述の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ法を行う。具体的には上記の逆転写反応混合液２μｌ（ｍＲＮＡ１μｇ相当）、１００ｐｍｏｌの上記の縮重オリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積２５μｌ）に対し、９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０秒を３５サイクル繰り返し行う。その後、更に上記縮重オリゴヌクレオチドプライマーの内部プライマーを用いて９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０秒を２０サイクル繰り返し行う。このＰＣＲ法による産物を例えばｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクローニングして既知の一般的な方法により塩基配列を決定する。この塩基配列より上記縮重オリゴヌクレオチドプライマーの内、正確な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーのみを合成する。上記オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ法を行う。上記逆転写反応混合液１μｌ、２０ｐｍｏｌの上記の正確な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積２５μｌ）に対し、９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０秒を３５サイクル繰り返し行う。このようにして得られた部分的ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡ（コード領域全長を含むｃＤＮＡ）をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。特にハイブリダイゼーションプローブとして使用する部分的ｃＤＮＡを増幅する際は、例えばランダムプライマーラベル法などにより[32P]ｄＣＴＰで標識したｃＤＮＡライブラリースクリーニングのための放射性プローブを作成することができる。
【００３１】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの作成
(i)ｃＤＮＡの合成と組み換えＤＮＡの作成
ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により通常の方法を用いて合成することができる。合成する際は市販のｃＤＮＡ合成用キットを用いるのが便利である。例えばＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー）を用いると、ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡをクローニングベクターに連結することもできる。また、市販のｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、より簡便にｃＤＮＡを得ることも可能である。本発明においては、クロンテック製の１８日齢のＳＤ−ラットの胎児脳から得られたｍＲＮＡから構築したｃＤＮＡをλｇｔ１１に導入したライブラリーを用いている。クローニングベクターに結合した状態のこれらの組み換えＤＮＡを宿主細菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。用いる宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターにより選択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コリ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とするクローニングベクターと大腸菌との組合せが頻用されているがこれに限定はされない。トランスフェクションは通常、組み換えＤＮＡと３０ｍＭ塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透過性を変化させた大腸菌とを混合することにより行われる。λｇｔ１１やＬａｍｄａ ＺＡＰのようなλファージベクターの場合、組み換えＤＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入もできるが、予め試験管中でファージ外殻にいれて（in vitroパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染させる方法が一般に使用されており、市販されているパッケージング用のキット（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン（Stratagene）製など）を用いてパッケージングを行うことも可能である。パッケージングした組み換えＤＮＡは、大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクローニングベクターによって用いる大腸菌株を選択する必要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質に対する耐性の性質があってはならず、また、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）などの遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しない大腸菌を選択する必要がある。このことは、組み換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌をスクリーニングするために必要なことである。例えば、λｇｔ１１やＬａｍｄａ ＺＡＰクローニングベクターを用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０r-やＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を選択すればよい。組み換えＤＮＡや組み換えプラスミドが導入された大腸菌は抗生物質に対する耐性の獲得や、β−ガラクトシダーゼ活性の獲得などによりスクリーニングすることが可能である。具体的には、大腸菌を寒天培地にまき、形成されたプラークを選択すればよい。生育した大腸菌（組み換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。プラスミドにブルースクリプトを用いた場合は、指示菌と共に、軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラークを形成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを保持するファージプラークはβ−ガラクトシダーゼ活性を発現しないので、容易に選択することができる。
【００３２】
(ii)ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡスクリーニング
次に上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーから、ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡを有するファージクローンを、ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。スクリーニングは例えば、上記のプラスミドを保持した大腸菌のコロニーをニトロセルロース膜やナイロン膜等にレプリカし、当該膜上で部分的ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることによって容易に行うことができる。選択された陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによりＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを切り出すことができる。
【００３３】
(iii)ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡの塩基配列の決定
上述のＰＣＲ法を様々なオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴｄＴプライマーの組合せにより行い作成したＤＮＡ断片及び上記のクローニングにより得られたｃＤＮＡをそのまま、あるいはｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクローニングして、既知の一般的な方法により塩基配列を決定する。
【００３４】
上記のようにして決定されたＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００３５】
可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−ＰのポリペプチドをコードするＤＮＡは以下のようにして取得できる。すなわち、先ず、配列番号１に示す塩基配列に基づき、Ｎ−末端側で適当な短縮化形態となるように選択したプライマーを合成し、クローン化したＧｌｃＡＴ−ＰのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅する。例えば、Ｎ−末端の７４残基が欠失した短縮化形態のポリペプチドをコードするＤＮＡを得る場合には、配列番号１９及び２０に示す塩基配列を有するプライマーをそれぞれ５’プライマー及び３’プライマーとして用いてＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰＣＲ産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得る。
【００３６】
＜２＞本発明ＤＮＡを利用したＧｌｃＡＴ−Ｐポリペプチドの製造方法
上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から本発明ポリペプチドを採取することによって、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドを製造することができる。
【００３７】
本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組み換えプラスミドを構築し、この組み換えプラスミドを用いて形質転換を行うことによって得ることができる。細胞としては大腸菌などの原核細胞や、哺乳類などの真核細胞が例示される。
【００３８】
組み換えプラスミドの構築の具体例としては以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明のＤＮＡをｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulson,J.C.,J. Biol. Chem.,269,1394-1401(1994)）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域に通常の方法により組み込み、ＧｌｃＡＴ−Ｐとインスリンシグナル配列及びプロテインＡの融合タンパク質の遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを構築する。次いで、このベクターから融合タンパク質をコードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記と同様の操作によりｐＥＦ−ＢＯＳ(Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322(1990))のＸｂａＩ領域に連結させる。
【００３９】
本製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができ、例えば、ＣＯＳ−１細胞などの哺乳類細胞と、ｐＥＦ−ＢＯＳなどの哺乳類細胞用発現ベクターの組合せを採用することが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００４０】
本発明ＤＮＡは、直接発現させてもよいし、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよく、また、本発明ＤＮＡは、全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。上記のようなポリペプチドを発現させるためのＤＮＡやそのＤＮＡを発現させるための方法も本発明に包含される。
【００４１】
培養物からの上記ポリペプチドの採取は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことができる。具体的には例えば、アシアロオロソムコイドあるいはＵＤＰ−グルクロン酸などを結合したセファロースカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。なお培養物には、培地及び当該培地中の細胞が包含される。
【００４２】
このようにして得られるＧｌｃＡＴ−Ｐ及びその融合タンパク質を用いて前述のＨＮＫ−１を大量に合成することが可能である。合成したＨＮＫ−１抗原は、例えば該抗原に対する抗体が血中で増加することが知られている自己免疫疾患に伴う末梢神経障害を検出する診断薬としての医薬用途などに使用することが可能である。すなわち具体的には、前記抗体を該抗原に結合させ、結合した抗体量を測定することにより前記疾患を検出することができる。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐ、その融合タンパク質及び本発明ＤＮＡを組み込んだ細胞などは、ＨＮＫ−１抗原の神経系の発達や機能、免疫系の機構、更に生体内におけるＧｌｃＡＴ−Ｐの機能の解明を進める為の試薬として研究用途に使用することも可能である。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はその要旨を超えない限りこれに限定されるものではない。
＜１＞ラットのＧｌｃＡＴ−Ｐの調製及びアミノ酸配列の分析
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， ２２７１１−２２７１４に記載の方法に準じ、ＵＤＰ−グルクロン酸を結合したセファロースカラムを使ったアフィニティークロマトグラフィーによりＧｌｃＡＴ−Ｐを精製した。ＧｌｃＡＴ−Ｐは、同文献に記載された条件でＵＤＰ−グルクロン酸を結合したセファロースカラムを使ったアフィニティークロマトグラフィーを行うと、０．４％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（商品名）、１Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．５）で溶出される。
【００４４】
精製したＧｌｃＡＴ−ＰをｐＨ９．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で３７℃の条件下で一晩トリプシンにより消化した。この消化産物を回収してフィルターにかけ、凍結乾燥した。１％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含む移動相Ａ（０．０６％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））１８μｌにこの凍結乾燥物を溶解し、逆相カラム（２．１×１５０ｍｍ）でＨＰＬＣを行った。ペプチドの溶出は、流速３．３μｌ／ｍｉｎ、１００分間で２％〜１００％までの移動相Ｂ（０．０５２％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡを含む８０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル）の濃度勾配により行った。ペプチドの画分は２１４ｎｍの吸光度をモニターしながら手作業で回収して、アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列決定はモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド バイオシステムス（Applied Biosystems）製）で行った。表−１に結果を示す。下線は縮重オリゴヌクレオチドプライマーの合成の基となったアミノ酸配列である。また、小文字で表したアミノ酸は同定が不確かであったものを示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
＜２＞ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分ｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅
（１）ＰＣＲ用プライマーの作成
上記ペプチドの１、２及び３の下線のアミノ酸配列に基づいて、図１に示すデオキシイノシン置換を有する末端及び内部のプライマーの縮重オリゴヌクレオチドを作成した（鋳型ＤＮＡ配列を持つプライマーPr.1-s（配列番号６）、Pr.2-so（配列番号９）、Pr.2-si（配列番号１０）、鋳型の相補的配列を持つプライマーPr.1-ao（配列番号７）、Pr.1-ai（配列番号８）、Pr.2-a（配列番号１１））。
【００４７】
（２）ＰＣＲ法
２週齢のラットの大脳皮質からグアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム法により調製した全ＲＮＡ（２０μｇ）を鋳型とし、ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡの一本鎖を合成し（全量４０μｌ）、これを逆転写反応混合液としてＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ反応液は、２μｌの上記逆転写反応混合液、１００ｐｍｏｌの末端プライマーpr.1-s及びpr.1-aoの混合物（又はpr.2-so及びpr.2-a）、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、及び１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン エルマー(Perkin Elmer)製）を含む混合液２５μｌとした。増幅は以下のように行った。解離反応は９４℃で３０秒、アニーリングは４５℃で６０秒、伸長反応は７２℃で９０秒の条件で３５サイクル行った。この操作によって生じた増幅物質１μｌに対し、プライマーとしてpr.1-s及びpr.1-aiの混合物（又はpr.2-si及びpr.2-a）を用いて再度ＰＣＲを行った。増幅は、９４℃で３０秒、４５℃で６０秒、７２℃で９０秒のサイクルを２０回繰り返して行った。この操作によって生じた増幅物質を常法によりアガロースゲル電気泳動を行い解析すると、pr.1-s及びpr.1-aiを用いて作製した増幅物質では約２６０ｂｐ（Ａ１）、pr.2-si及びpr.2-aを用いて作製した増幅物質では約２１０ｂｐ（Ａ２）のＤＮＡのバンドが検出された。
【００４８】
＜３＞ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡ
（１）ハイブリダイゼーション用プローブの作成
上記Ａ１及びＡ２の増幅物質を常法によりｐＣＲＩＩ（インビトロゲン(Invitrogen)製）にサブクローンし、塩基配列を解析した。塩基配列はABI PRISM Dyeterminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（パーキン エルマー(PERKIN ELMER)製）を使用して解析した。解析結果に基づいて、Ａ１増幅時に使用したプライマーpr.1-sの隣に位置する配列（pr.a（配列番号１２））及びＡ２増幅時に使用したプライマーpr.2-siの隣に位置する配列（pr.b（配列番号１３））を合成した。２０ｐｍｏｌのpr.a及びpr.b、２μｌの逆転写反応混合液、ならびに５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む最終量２５μｌの溶液でＰＣＲを行い増幅物質を調製した（gf.a）。ＰＣＲは上記同様、９４℃３０秒、４７℃６０秒、７２℃５０秒のサイクルを３５回繰り返すことによって行った。このようにして増幅されたgf.aをｐＣＲIIへサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号１６）。また、このプラスミドを大量に調製後、ＥｃｏＲＩで消化して切り出し、大量のgf.aを得て、スクリーニングに使用した。
【００４９】
（２）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡクローンのスクリーニング
ＳＤラットの１８日齢の胎児の脳由来のｍＲＮＡから構築したλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをクロ−ンテック(Clonetec)社から購入した。このラット胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを、宿主の大腸菌（Escherichia coli）Ｙ１０９０r-に感染させ、プレートに重層し、プラークを形成させた。１５０ｍｍのディッシュ１０枚を用いて約５×１０5個のプラークをスクリーニングした。生じたプラークをＯＰＴＩＴＲＡＮ ＢＡ−Ｓ ８５ ニトロセルロース膜（シュライシャーアンド シュエル(Schleicher & Schuell)製）に転写した後ＵＶクロスリンクを行った後、５０％ホルムアミド、５０ｍＭ、ｐＨ７．０リン酸緩衝液、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、０．５％ スキムミルク、０．１％ ＳＤＳと１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含む溶液中、４２℃で１６時間プレハイブリダイズした。その後、32Ｐでラベルしたgf.aを上記バッファーに加え、４２℃で１６時間ハイブリダイズした。フィルターを、室温で２×ＳＳＣ、０．５×ＳＤＳ、６５℃で１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、更に６５℃で０．２×ＳＳＣにより洗浄し、オートラジオグラフィーにより１７個の陽性クローンを検出し、８つのクローンを単離した。
【００５０】
（３）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡクローンの塩基配列
上記８つのクローンからファージＤＮＡを調製し、ベクターＤＮＡからｃＤＮＡ挿入断片をＰＣＲ法を行うことにより得た。このｃＤＮＡ断片を鋳型としてABI PRISM Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（パーキン エルマー(PERKIN ELMER)製）を用いたデオキシチェーンターミネーション法（Sanger, F., Nicklens, S., and Coulson, A. R.(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467）により、両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。その結果、全てに共通した部位gf.bの塩基配列（配列番号１７）が決定された。
【００５１】
（４）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡ５’末端部の合成と塩基配列の決定
上記gf.bの塩基配列より、５’末端部の塩基配列が欠損していることが明らかとなったため、ｃＤＮＡの５’末端側は２週齢のラットの大脳皮質由来のｍＲＮＡから直接増幅した。pr.bを用いて逆転写反応を行った後、その３’末端にターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いてポリＡを付加した。この反応生成物を、オリゴｄＴとpr.c-1（配列番号１４）をプライマーとして上記と同条件でＰＣＲ法を行い、その後、オリゴｄＴとpr.c-2（配列番号１５）をプライマーとして更に上記と同条件でＰＣＲ法により増幅した。その結果、約６００ｂｐのＤＮＡ断片が得られ（gf.c（配列番号１８））、この断片を既知の方法により増幅した後、インビトロゲン製のｐＣＲIIにサブクローニングして、上記同様の方法により両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。
【００５２】
（５）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡ全長に渡る塩基配列の決定
gf.bとgf.cの塩基配列を組み合わせることによりＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡの全塩基配列が決定された。なお、gf.a、gf.b及びgf.cの各断片並びに各プライマーの位置関係を図２に示す。
【００５３】
このようにして判明したＧｌｃＡＴ−ＰのｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）から推定されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。１つのオープンリーディングフレームは３４７アミノ酸残基からなり、このｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの分子量はそのアミノ酸構成から３９７０６と推定される。また、このポリペプチドはＮ−結合グリコシレーションが可能な部位を３カ所有する。このポリペプチドが膜貫通領域を有するか否か、有するとすればその位置を決定するために、推定されたアミノ酸配列からハイドロパシープロットを作成した。ハイドロパシープロットは、Hopp and Woodsの方法（Hopp,T.P. and Woods,K.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78,3824-3828(1981)）により、５アミノ酸のウィンドウで計算した。プロットの解析から、アミノ末端側に、長さ１７残基からなる１つの顕著な疎水領域が認められ、膜貫通領域であることが推定された。このポリペプチドは膜貫通領域のＮ末端側には１９アミノ酸残基からなる領域を有するタイプIIの膜タンパク質であることが明らかになった。
【００５４】
（６）ノザンブロッティング
成体ラットの組織（大脳皮質、小脳、脳全体、肺、肝臓、腎臓、回腸、精巣、リンパ節、胸腺、脾臓、心臓及びマクロファージ）からAnal. Biochem. 162, 156-159記載のグアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法により全ＲＮＡを調製した。１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により各レーン１０μｇずつの各ＲＮＡを分子量分画し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+ ナイロン膜（アマシャム(Amersham)製）にブロッティングした。このナイロン膜に32ＰラベルしたＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを６５℃で１４時間、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）溶液中でハイブリダイズさせた。洗浄は、室温で２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、更に６５℃で０．１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣで行った。その後、放射活性をイメージアナライザー（Ｂａｓ ２０００、富士フィルム製）で解析した。この結果、大脳皮質、小脳及び脳全体でＧｌｃＡＴ−ＰのＲＮＡ（主要成分の4.0kb及びマイナー成分の9.1kb）が発現していることが明らかになった。肝臓、腎臓などの末梢組織では発現は認められなかった。
【００５５】
（７）発現用ベクターの構築
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、２週齢のラットの脳のｍＲＮＡから５’側プライマーと、終止コドンの１８ｂｐ５’寄りにＢａｍＨＩ領域を有する３’側プライマーを用いて上記同様の手法を用いて逆転写反応によりＤＮＡの一本鎖を合成した後、上記ＰＣＲ法と同様の条件で増幅して得た。このＤＮＡ断片を既知の方法により平滑化した後、ＢｓｔＸＩで消化して平滑化し、次いで、脱リン酸化した哺乳類細胞用ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（Nagata,S.(大阪バイオサイエンス研究所)より入手）に既知の方法により連結させた。
【００５６】
（８）可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを組み込んだ発現用ベクターの構築
ＧｌｃＡＴ−Ｐのトランスメンブレン領域にあたると考えられるＮ末端から７４アミノ酸残基までが欠失したＧｌｃＡＴ−Ｐの短縮化形態をコードするＤＮＡを、クローン化したＧｌｃＡＴ−ＰのｃＤＮＡを鋳型として、インフレームのＥｃｏＲＩ領域を含む５’側プライマー（配列番号１９）と３’側プライマー（配列番号２０）を用いてＰＣＲ法により増幅した。増幅して得られたＤＮＡ断片をｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulson,J.C.,J. Biol. Chem.,269,1394-1401(1994)）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域に通常の方法により組み込み、ＧｌｃＡＴ−Ｐとインスリンシグナル配列及びプロテインＡの融合タンパク質の遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを構築した。正確な配列を有するクローンを選択し、融合タンパク質をコードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記発現ベクターの構築方法同様の操作により目的ＤＮＡ断片をｐＥＦ−ＢＯＳ(Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322(1990))のＸｂａＩ領域に連結させた。
【００５７】
（９）ＣＯＳ−１細胞における可溶化タンパク質形態ＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現
１００ｍｍのディッシュ上でＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）を培養し、２４時間後に上記可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結した発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ８．２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Technologies)製）を用いトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に当該細胞の培養上清を回収し、アシアロオロソムコイドをグルクロン酸受容体として使用してＧｌｃＡＴ−Ｐ活性を測定した。活性の測定はJ. Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)に従って行った。対照として組換え遺伝子を含まないｐＥＦ−ＢＯＳベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の培養上清を用いた。結果を表−２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
また、培地中の可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐはアシアロオロソムコイドを結合したセファロースカラムで単離することができた。通常のＧｌｃＡＴ−Ｐは７０位と３１７位にシステイン残基を有するが、精製した可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐは３１７位のシステイン残基のみを有している。可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐが活性を有すること及びＳＨ基のブロッキング剤であるＮ−エチルマレイミドを添加して当該タンパク質の活性を調べた際に活性が完全に失われるという２つの結果より、それぞれのシステインはジスルフィド結合は形成しておらず、３１７位のシステイン残基のＳＨ基は当該酵素の活性と関連する部位であることが判明した。
【００６０】
（１０）Ｌｅｃ２細胞におけるＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現
ＣＨＯ細胞の変異体であり、グルクロン酸の受容体である糖タンパク質のＮ−アセチルラクトサミン残基を有するＬｅｃ２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７３６）に完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを接続したｐＥＦ−ＢＯＳベクターをトランスフェクションした。Ｌｅｃ２はＣＭＰ−シアル酸の輸送系を欠き、細胞表面にＮ−ラクトサミン残基の末端のシアル酸を欠く糖タンパク質を発現している。その為、ＧｌｃＡＴ−ＰによるＮ−ラクトサミン構造へのグルクロン酸転移活性が、内在性のシアル酸転移酵素活性との競争による阻害が起こらないため、よりＧｌｃＡＴ−Ｐの生理活性が顕著に表れやすいと考えられる。６０ｍｍの培養皿に２４時間上記細胞を培養し、完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結、または何も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Technologies)製）を用いトランスフェクションした。７２時間後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で回収し、抗パラグロボシド抗体であるＨ１１（Taki,T(東京医科歯科大学)より入手）、ＨＮＫ−１エピトープ中のグルクロン酸を認識するＭ６７４９（Tanaka,H.(熊本大学)より入手）、硫酸化されたグルクロン酸を認識するＨＮＫ−１抗体（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−２００）及び対照のマウスＩｇＭ抗体をそれぞれ一次抗体として４℃で１時間反応させた。ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇＭ抗体を二次抗体としてそれぞれの一次抗体により処理した細胞に反応させ、ＦＡＣＳで解析した。その結果を図３に示す。完全長ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを導入してもＨ１１抗体による染色が変化しないことから、ＧｌｃＡＴ−Ｐは糖脂質性のグルクロン酸受容体であるパラグロボシドにはグルクロン酸を転移しないことが明らかであり、ＨＮＫ−１抗体による染色が変化しないことから、Ｌｅｃ２には転移されたグルクロン酸を硫酸化する酵素が欠損していることが明らかである。Ｍ６７４９による染色量が増加していることから、当該ｃＤＮＡから生じるＧｌｃＡＴが正常にグルクロン酸を転移していることが明らかである。
【００６１】
（１１）ＣＯＳ−１細胞におけるＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現
ラミニンコートした６０ｍｍ培養皿にＣＯＳ−１細胞を培養し、２４時間後に完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結したｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Technologies)製）を用いトランスフェクションした。対照としては何も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクターを用いた。７２時間後、３％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ緩衝液で上記トランスフェクションした細胞を固定し、１０μｇ／ｍｌのＭ６７４９又はＨＮＫ−１抗体により室温で２時間インキュベートし、ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇＭで上記抗体を染色した。対照の細胞は全く染色されなかったが、ＧｌｃＡＴ−Ｐをトランスフェクションした細胞は、Ｍ６７４９及びＨＮＫ−１双方の抗体によって染色された。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐを発現させたＣＯＳ−１細胞は対照と比較して大きな形態の変化が見られた。ＧｌｃＡＴ−Ｐを発現させたＣＯＳ−１細胞は多数のマイクロスパイクを有する長く伸長した突起を有していた。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、糖タンパク質のラクトサミン残基にグルクロン酸を選択的に転移するグルクロン酸転移酵素−Ｐ（ＧｌｃＡＴ−Ｐ）をコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られる。本発明により、ＧｌｃＡＴ−Ｐをコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られたので、ＧｌｃＡＴ−Ｐを工業的に使用可能な程度まで大量生産できることが期待される。また、生体内においては細胞膜上に存在する前記酵素を、本発明ＤＮＡを利用することによって、その酵素活性を保ったままの状態で可溶化タンパク質形態で得ることが可能となり、当該酵素を利用したＨＮＫ−１エピトープの人工的な合成、当該酵素の生体内における働きの解明が容易になる。
【００６３】
【配列表】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
配列番号：18
配列の長さ：560
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
鎖の数：二本鎖
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
GCGCGCGCAT CGCAGGGCAG CAGCCCTGGG TCTCTGGGGC CAGGGCATAG GACTGCCACC 60
CGCTATGGAC CGCGCCAGGG ACGATATGGA CTCGCTGCCG CAGGTATCAA CCTCCGAAGG 120
TTCCTGACCC TGCGCTGGAC TACTTCCCCT TCGCAGACTC CCATCAGGCC GGACTCTGCA 180
AACCTGCTGC CACAATGGGT AATGAGGAGC TGTGGGCGCA GCCAGCCTTG GAGATGCCGA 240
AGAGAAGGGA CATCCTCGCG ATTGTCCTCA TTGTGCTTCC CTGGACACTG CTCATCACCG 300
TCTGGCACCA GAGCAGCCTC GCACCTCTGC TTGCTGTGCA CAAGGATGAG GGAAGTGACC 360
CCCGCCATGA GGCACCACCC GGTGCGGACC CTAGGGAGTA CTGCATGTCC GACCGTGACA 420
TCGTGGAGGT GGTGCGCACA GAGTACGTGT ACACGAGGCC GCCACCGTGG TCCGACACGC 480
TGCCCACCAT CCATGTGGTG ACGCCCACCT ACAGTAGACC GGTGCAGAAG GCAGAGCTGA 540
CGCGAATGGC CAACACGCTA 560
【００８１】
【００８２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分アミノ酸配列とＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す。
【図２】 各ＤＮＡ断片並びに各プライマーの位置関係を示す。
【図３】 各種抗体による染色のＧｌｃＡＴ−Ｐの発現による変化を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルクロン酸転移酵素（グルクロニルトランスフェラーゼ）をコードする塩基配列を有する新規なＤＮＡに関するものである。より詳しくは神経細胞及び免疫系細胞で特異的に発現するＨＮＫ−１エピトープの合成に関与するグルクロン酸転移酵素をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経系組織及び免疫系細胞に特異的に存在することが知られているＨＮＫ−１抗原は、神経系の伸展や相互の接着などに重要な役割を果たすこと及び自己免疫疾患に伴う末梢神経障害の発症の際に上記抗原に対する抗体が増加することが知られている（ファルマシア,32,11,1361-1369(1996)）。また、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ細胞）に上記抗原は発現しており、また腫瘍細胞に選択的に集まる細胞は上記抗原が発現したＴ細胞であることが知られている為（Clin. Exp. Immunol.,102,159-166(1995)）、上記抗原はＮＫ細胞の異物認識機構及び異物除去機構に関与していると考えられるが、従来の研究においては、ＮＫ細胞上に発現した当該抗原は当該細胞のマーカーとして利用されているのみであり、その機能は全く解明されていない。上記抗原はその特異的構造として通常の糖タンパク質や糖脂質には見られない３位が硫酸化されたグルクロン酸を有し、当該抗原の生体内における合成には、グルクロン酸転移酵素が働いていることが明らかである。グルクロン酸転移酵素はグルクロン酸転移酵素−Ｌとグルクロン酸転移酵素−Ｐの２種類に大別される（J. Biol. Chem., 267, 32, 22711-22714(1992)）が、これらの酵素について詳細は未だ不明である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のようにＨＮＫ−１抗原が神経系の発達、障害に大きく関与していることは明かであるが、そのメカニズムの解明が未だなされていない。特に自己免疫疾患に伴う末梢神経障害は深刻な問題となっているが、その根本的治療法の解明は遅れており、この点からも上記メカニズムの解明が期待される。また、免疫系細胞の異物認識機構及び異物除去機構の解明はされておらず、その解明にはＨＮＫ−１抗原の機能を解明することが必要とされる。
【０００４】
本発明者らは、ＨＮＫ−１抗原の機能を解明するために、その生体内での合成において律速段階となる反応を制御するグルクロン酸転移酵素−Ｐ（以下「ＧｌｃＡＴ−Ｐ」とも記載する）を生体組織から抽出・精製することに既に成功していたが、その操作は複雑であり、さらに当該酵素は微量しか得ることができなかった。また、ｃＤＮＡが未だクローニングされていなかったため、特に生体（細胞）内でのＨＮＫ−１抗原の機能解明を進めることが不可能であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題に鑑み、ＨＮＫ−１抗原の機能解明を早期に実現するべく、その生体内及び生体外での合成の律速段階となるグルクロン酸転移反応を制御する酵素であるグルクロン酸転移酵素−Ｐの大量生産及び細胞内における当該酵素の機能の解明を可能とするために、グルクロン酸転移酵素−Ｐの遺伝子を得るべく鋭意検討した結果、上記酵素のｃＤＮＡのクローニングに成功し、該ｃＤＮＡによりＧｌｃＡＴ−Ｐが発現することを確認して本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の性質を有するグルクロン酸転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを提供する。
▲１▼作用：
グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体にグルクロン酸を転移する。
▲２▼基質特異性：
アシアロオロソムコイド及び神経細胞接着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグルクロン酸を転移する。
▲３▼至適反応ｐＨ：
ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM ＭＥＳ緩衝液、３７℃）。
▲４▼阻害及び活性化：
Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭのネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ14Ｈ29共存下において活性が維持される。
▲５▼分子量：
還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約４５,０００。ゲルろ過により測定される分子量が約９０，０００。
【０００７】
本発明は、また、配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、グルクロン酸供与体から、受容体であるアシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいグルクロン酸転移酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードする塩基配列を有するＤＮＡを提供する。
【０００８】
本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番号２においてアミノ酸番号１〜３４７及び７５〜３４７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【０００９】
また、本発明は、上記ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地で培養し、該ＤＮＡが有する塩基配列によってコードされる本酵素のポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から前記ポリペプチドを採取することを含む、ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明のグルクロン酸転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（本発明ＤＮＡ）
本発明のＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むグルクロン酸転移酵素は、本発明者らによってラットの脳から抽出、精製されたグルクロン酸転移酵素−Ｐ（Oka, S., Terayama, K., Kawashima, C., and Kawasaki, T.(1992) J. Biol. Chem. 267, 22711-22714）であり、下記のような理化学的性質を有する。
▲１▼作用：
グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体にグルクロン酸を転移する。
▲２▼基質特異性：
アシアロオロソムコイド及び神経細胞接着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグルクロン酸を転移する。
▲３▼至適反応ｐＨ：
ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM ＭＥＳ緩衝液、３７℃）。
▲４▼阻害及び活性化：
Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭのネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ14Ｈ29共存下において活性が維持される。
▲５▼分子量：
還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約４５,０００。ゲルろ過による分子量が約９０，０００。
【００１１】
上記グルクロン酸転移酵素−Ｐの活性は上記文献に記載の方法に従って測定することができる。グルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイド及び神経細胞接着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的であるとは、一般に、その残基へのグルクロン酸転移活性が、上記グルクロン酸受容体をグルクロン酸の受容体として使用した際に糖脂質のＮ−アセチルラクトサミン残基を受容体として使用した際と比較して５倍以上であることをいう。至適ｐＨは同文献に記載の反応液において、100mMＨＥＰＥＳ緩衝液を100mM ＭＥＳ緩衝液で置き換えて測定することが可能である。阻害及び活性化は、同反応液に種々の試験物質を加えて活性を測定することにより判定できる。Ｍｎ2+での活性化は少なくとも20 mMの濃度で認められる。また、活性の維持とは通常には糖脂質性阻害剤非存在下に比べ７０％以上の活性を維持することをいう。糖脂質性阻害剤の例としては、ネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ14Ｈ29が挙げられる。
【００１２】
また、上記グルクロン酸転移酵素−Ｐは、通常は、次の性質も有する。２価陽イオン非存在下では活性が著しく低下する。Ｎ−エチルマレイミドにより活性が阻害される。スフィンゴミエリンにより活性化される。
【００１３】
分子量の測定は、酵素タンパク質について一般に採用される条件で行われる。
本発明のＤＮＡは、本発明により初めて単離されたＤＮＡであり、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部をコードしているのであればその塩基配列は特に限定はされない。また、本発明ＤＮＡが有する塩基配列がコードするＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドはグルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよく、そのようなＤＮＡの何れもが本発明のＤＮＡに包含される。該活性の測定方法は公知であり（例えば、J. Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)など）、当業者であれば、目的とする酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び転位をアミノ酸配列に有する本酵素を容易に選択することができる。
【００１４】
本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２においてアミノ酸番号１〜３４７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。本発明ＤＮＡが有する塩基配列として更に具体的には、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも一部又は全てを有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号に示す塩基配列における塩基番号１９５〜１２３８の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１５】
配列番号１に示す塩基配列において、ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡのオープンリーディングフレームには７つのイン・フレームのＡＴＧコドンが含まれている。第１番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は、真核細胞の翻訳開始部位の共通配列と比較すると、−３の位置のプリンが保存されており、＋４の位置のＧ（グアニン）も保存されている。このことは、効率的な翻訳に関するKozakの知見（Kozak, M. (1986)Cell, 44,283-292）を満足している。また、第２、第５〜第７番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列も、−３の位置がプリン（それぞれＧ、Ａ（アデニン）、Ｇ、Ｇ）であり、第４番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は−３の位置がプリンではない（Ｃ（シトシン））が、＋４の位置のＧが保存されており、第３番目のＡＴＧコドン以外は何れのＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能性がある。
【００１６】
ところで、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988) J. Biochem. 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaperらは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いものとの両方の形態が合成されることを示している。さらに、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在することを示唆する証拠を示している。（Lopez, L. et al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15991）。同様に、ＧｌｃＡＴ−Ｐについても、複数のＡＴＧコドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定かではない。しかし、何れのＡＴＧコドンが開始コドンであっても、上記のグルクロン酸転位酵素−Ｐをコードする点では同じであり、第２番目、第４番目〜第７番目のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本発明に包含されるものである。
【００１７】
第１番目のＡＴＧコドンで始まる単一のオープンリーディングフレームからは、３４７アミノ酸残基からなり、３９，７０６Ｄａのタンパク質が予測される。このアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロットから、Ｎ−末端から２０〜３６番目のアミノ酸残基に渡る長さ１７残基の１つの顕著な疎水性部分を認められ、トランスメンブレン（膜貫通）ドメインを有するＴｙｐｅIIの膜タンパク質であることが予想される。また、この膜貫通ドメインのすぐＣ末端側には比較的プロリンが多く存在することが認められる。このようなプロリンに富む領域は、他のいくつかの糖転移酵素においてもみつかっており、膜貫通ドメインと活性ドメインを結ぶネック領域を形成していると考えられる。したがって、この領域よりＮ末端側を短縮化しても活性には影響しないと考えられ、また、膜貫通ドメインのほとんどを短縮化により欠失させれば、可溶化形態のグルクロン酸転移酵素を得ることができる。本発明は、このような可溶化タンパク質形態のグルクロン酸転移酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードするＤＮＡも包含する。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２においてアミノ酸番号７５〜３４７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１８】
本発明ＤＮＡは、このＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドが、グルクロン酸供与体からグルクロン酸受容体である糖タンパク質の構成糖にグルクロン酸を転移する活性を実質的に害さない限り、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を起こすようなヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに挿入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987);Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、欠失、挿入又は転位を導入することができる。本酵素の活性の測定方法は公知であり（例えば、J. Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)など）、当業者であれば、目的とする酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位をアミノ酸配列に有する本酵素をコードするＤＮＡにおける塩基配列の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００１９】
なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
さらに、染色体由来のＧｌｃＡＴ−Ｐ遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部をコードする限り、本発明のＤＮＡ断片に包含される。すなわち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプロセッシングを受けて最終的に目的のポリペプチドを生じうる塩基配列を有することも包含する。
【００２０】
また、本明細書において「ポリペプチドの少なくとも一部をコードする」とは、好ましくは、ＧｌｃＡＴ−Ｐ活性を有する、抗原性を有するなどの何らかの活性ないし機能を有する部分、あるいは、その部分に相当する塩基配列がそのＧｌｃＡＴ−Ｐに特異的であって、プライマーやプローブとして使用できる部分をコードすることを意味する。
【００２１】
なお、本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明のＤＮＡは、ＧｌｃＡＴ−Ｐをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖及びこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００２２】
また、本発明ＤＮＡは、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を有していてもよく、またＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの一部分をコードする塩基配列を有するものであってもよい。
【００２３】
以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説明する。本発明により本発明ＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発明のＤＮＡを増幅することによって取得することも可能であり、また、特に以下の工程からなるｃＤＮＡクローニングにより製造することも可能である。
（１）精製したＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部のアミノ酸を決定する。
（２）上記アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを作成する。（３）哺乳類の組織より抽出したＲＮＡから上記プライマーを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅することによって前記転移酵素のプローブを作成する。
（４）上記プローブによって哺乳類の組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。スクリーニングによって、通常には上記転移酵素の完全長ｃＤＮＡを選択する。
【００２４】
しかし、本発明のＤＮＡの製造方法はこれに限定されるものではなく、上記ＰＣＲ法や、他の公知のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡを製造することができる。
【００２５】
以下に、本発明のＤＮＡを製造する方法を具体的に説明する。
（１）グルクロン酸転移酵素−Ｐ（ＧｌｃＡＴ−Ｐ）のアミノ酸配列の決定
(i)ＧｌｃＡＴ−Ｐの精製
ＧｌｃＡＴ−Ｐは、例えばヒト、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ等の哺乳類の脳などのＧｌｃＡＴ−Ｐを発現する組織の細胞から、通常のタンパク質の精製方法、およびＧｌｃＡＴ−Ｐの基質（例えばウリジン２リン酸（ＵＤＰ）−グルクロン酸など）あるいは阻害剤（前記糖脂質性阻害剤など）を用いたアフィニティークロマトグラフィを組み合わせることによって精製することが可能であるが、ラットの脳を使用することが好ましい。具体的には、例えばJ. Biol. Chem. 267, (32),22711-22714(1992)に記載された方法に従って行うことができる。
【００２６】
(ii)ＧｌｃＡＴ−Ｐの部分アミノ酸配列の決定
精製したＧｌｃＡＴ−Ｐを断片化する方法は特に限定はされず、タンパク質分解酵素と共にインキュベートするなど公知の方法でタンパク質を断片化することができる。具体的なタンパク質分解酵素の例としてはトリプシンが挙げられる。トリプシンでＧｌｃＡＴ−Ｐを処理し、その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いて分離することができる。タンパク質分解酵素消化後に生じたペプチドは、公知の方法によりアミノ末端配列決定を行うことが可能である。具体的には例えばモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド バイオシステムス(Applied Biosystems)製）などを用いてアミノ酸の配列を分析することが好ましいがこれに限定はされない。なお、業者に依頼してアミノ酸配列を決定してもらうことも可能である。
【００２７】
(iii)オリゴヌクレオチドプライマーの合成
ＧｌｃＡＴ−Ｐの部分的アミノ酸配列に基づき、ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを作成する。アミノ酸配列のうち、なるべくコドンの縮重の少ない部位を用いることが好ましい。このような縮重オリゴヌクレオチドプライマーの例を、図１に示す（センスプライマー：配列番号６、９、１０；アンチセンスプライマー：配列番号７、８、１１）。
【００２８】
（２）ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡの調製とプローブの作成
▲１▼ｍＲＮＡは、公知の方法（Kingston, R. S., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkなど）で得ることができる。材料は、ＧｌｃＡＴ−ＰのｍＲＮＡを発現している材料であれば限定はされないが、前記例示の哺乳類の組織が好ましく特にラットの大脳皮質が好ましい。特に上記酵素のｍＲＮＡを強く発現していることから、２週齢前後のラットの大脳皮質が好ましい。
【００２９】
全ＲＮＡは、前述の材料から通常用いられるｍＲＮＡの調製法により得ることができるが、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston, R. B., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York）あるいはグアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162, 156-159(1987)）で調製することが簡便なため好ましい。
【００３０】
▲２▼逆転写反応及びＰＣＲ法を用いたＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡの増幅
上記ｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマー或いはオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により鋳型ＤＮＡを作成し、この鋳型ＤＮＡを基にＰＣＲ法により、ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡを増幅することができる。逆転写反応は、通常の方法と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すならば以下の通りである。２０μｇのｍＲＮＡ、４０ｐｍｏｌのランダムプライマー又は縮重オリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコ(Gibco BRL)）、１０ｍＭジチオスレートール（ＤＴＴ）、３０単位のヒト胎盤由来リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）インヒビターを含む緩衝液（終体積４０μ）を、４２℃で１時間インキュベートする。このようにして得られた逆転写反応産物を基に、前述の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ法を行う。具体的には上記の逆転写反応混合液２μｌ（ｍＲＮＡ１μｇ相当）、１００ｐｍｏｌの上記の縮重オリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積２５μｌ）に対し、９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０秒を３５サイクル繰り返し行う。その後、更に上記縮重オリゴヌクレオチドプライマーの内部プライマーを用いて９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０秒を２０サイクル繰り返し行う。このＰＣＲ法による産物を例えばｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクローニングして既知の一般的な方法により塩基配列を決定する。この塩基配列より上記縮重オリゴヌクレオチドプライマーの内、正確な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーのみを合成する。上記オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ法を行う。上記逆転写反応混合液１μｌ、２０ｐｍｏｌの上記の正確な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積２５μｌ）に対し、９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０秒を３５サイクル繰り返し行う。このようにして得られた部分的ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡ（コード領域全長を含むｃＤＮＡ）をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。特にハイブリダイゼーションプローブとして使用する部分的ｃＤＮＡを増幅する際は、例えばランダムプライマーラベル法などにより[32P]ｄＣＴＰで標識したｃＤＮＡライブラリースクリーニングのための放射性プローブを作成することができる。
【００３１】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの作成
(i)ｃＤＮＡの合成と組み換えＤＮＡの作成
ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により通常の方法を用いて合成することができる。合成する際は市販のｃＤＮＡ合成用キットを用いるのが便利である。例えばＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー）を用いると、ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡをクローニングベクターに連結することもできる。また、市販のｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、より簡便にｃＤＮＡを得ることも可能である。本発明においては、クロンテック製の１８日齢のＳＤ−ラットの胎児脳から得られたｍＲＮＡから構築したｃＤＮＡをλｇｔ１１に導入したライブラリーを用いている。クローニングベクターに結合した状態のこれらの組み換えＤＮＡを宿主細菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。用いる宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターにより選択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コリ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とするクローニングベクターと大腸菌との組合せが頻用されているがこれに限定はされない。トランスフェクションは通常、組み換えＤＮＡと３０ｍＭ塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透過性を変化させた大腸菌とを混合することにより行われる。λｇｔ１１やＬａｍｄａ ＺＡＰのようなλファージベクターの場合、組み換えＤＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入もできるが、予め試験管中でファージ外殻にいれて（in vitroパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染させる方法が一般に使用されており、市販されているパッケージング用のキット（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン（Stratagene）製など）を用いてパッケージングを行うことも可能である。パッケージングした組み換えＤＮＡは、大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクローニングベクターによって用いる大腸菌株を選択する必要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質に対する耐性の性質があってはならず、また、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）などの遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しない大腸菌を選択する必要がある。このことは、組み換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌をスクリーニングするために必要なことである。例えば、λｇｔ１１やＬａｍｄａ ＺＡＰクローニングベクターを用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０r-やＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を選択すればよい。組み換えＤＮＡや組み換えプラスミドが導入された大腸菌は抗生物質に対する耐性の獲得や、β−ガラクトシダーゼ活性の獲得などによりスクリーニングすることが可能である。具体的には、大腸菌を寒天培地にまき、形成されたプラークを選択すればよい。生育した大腸菌（組み換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。プラスミドにブルースクリプトを用いた場合は、指示菌と共に、軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラークを形成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを保持するファージプラークはβ−ガラクトシダーゼ活性を発現しないので、容易に選択することができる。
【００３２】
(ii)ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡスクリーニング
次に上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーから、ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡを有するファージクローンを、ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。スクリーニングは例えば、上記のプラスミドを保持した大腸菌のコロニーをニトロセルロース膜やナイロン膜等にレプリカし、当該膜上で部分的ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることによって容易に行うことができる。選択された陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断することによりＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを切り出すことができる。
【００３３】
(iii)ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡの塩基配列の決定
上述のＰＣＲ法を様々なオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴｄＴプライマーの組合せにより行い作成したＤＮＡ断片及び上記のクローニングにより得られたｃＤＮＡをそのまま、あるいはｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクローニングして、既知の一般的な方法により塩基配列を決定する。
【００３４】
上記のようにして決定されたＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００３５】
可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−ＰのポリペプチドをコードするＤＮＡは以下のようにして取得できる。すなわち、先ず、配列番号１に示す塩基配列に基づき、Ｎ−末端側で適当な短縮化形態となるように選択したプライマーを合成し、クローン化したＧｌｃＡＴ−ＰのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅する。例えば、Ｎ−末端の７４残基が欠失した短縮化形態のポリペプチドをコードするＤＮＡを得る場合には、配列番号１９及び２０に示す塩基配列を有するプライマーをそれぞれ５’プライマー及び３’プライマーとして用いてＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰＣＲ産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得る。
【００３６】
＜２＞本発明ＤＮＡを利用したＧｌｃＡＴ−Ｐポリペプチドの製造方法
上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から本発明ポリペプチドを採取することによって、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドを製造することができる。
【００３７】
本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組み換えプラスミドを構築し、この組み換えプラスミドを用いて形質転換を行うことによって得ることができる。細胞としては大腸菌などの原核細胞や、哺乳類などの真核細胞が例示される。
【００３８】
組み換えプラスミドの構築の具体例としては以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明のＤＮＡをｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulson,J.C.,J. Biol. Chem.,269,1394-1401(1994)）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域に通常の方法により組み込み、ＧｌｃＡＴ−Ｐとインスリンシグナル配列及びプロテインＡの融合タンパク質の遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを構築する。次いで、このベクターから融合タンパク質をコードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記と同様の操作によりｐＥＦ−ＢＯＳ(Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322(1990))のＸｂａＩ領域に連結させる。
【００３９】
本製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができ、例えば、ＣＯＳ−１細胞などの哺乳類細胞と、ｐＥＦ−ＢＯＳなどの哺乳類細胞用発現ベクターの組合せを採用することが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００４０】
本発明ＤＮＡは、直接発現させてもよいし、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよく、また、本発明ＤＮＡは、全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。上記のようなポリペプチドを発現させるためのＤＮＡやそのＤＮＡを発現させるための方法も本発明に包含される。
【００４１】
培養物からの上記ポリペプチドの採取は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことができる。具体的には例えば、アシアロオロソムコイドあるいはＵＤＰ−グルクロン酸などを結合したセファロースカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。なお培養物には、培地及び当該培地中の細胞が包含される。
【００４２】
このようにして得られるＧｌｃＡＴ−Ｐ及びその融合タンパク質を用いて前述のＨＮＫ−１を大量に合成することが可能である。合成したＨＮＫ−１抗原は、例えば該抗原に対する抗体が血中で増加することが知られている自己免疫疾患に伴う末梢神経障害を検出する診断薬としての医薬用途などに使用することが可能である。すなわち具体的には、前記抗体を該抗原に結合させ、結合した抗体量を測定することにより前記疾患を検出することができる。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐ、その融合タンパク質及び本発明ＤＮＡを組み込んだ細胞などは、ＨＮＫ−１抗原の神経系の発達や機能、免疫系の機構、更に生体内におけるＧｌｃＡＴ−Ｐの機能の解明を進める為の試薬として研究用途に使用することも可能である。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はその要旨を超えない限りこれに限定されるものではない。
＜１＞ラットのＧｌｃＡＴ−Ｐの調製及びアミノ酸配列の分析
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， ２２７１１−２２７１４に記載の方法に準じ、ＵＤＰ−グルクロン酸を結合したセファロースカラムを使ったアフィニティークロマトグラフィーによりＧｌｃＡＴ−Ｐを精製した。ＧｌｃＡＴ−Ｐは、同文献に記載された条件でＵＤＰ−グルクロン酸を結合したセファロースカラムを使ったアフィニティークロマトグラフィーを行うと、０．４％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（商品名）、１Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．５）で溶出される。
【００４４】
精製したＧｌｃＡＴ−ＰをｐＨ９．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で３７℃の条件下で一晩トリプシンにより消化した。この消化産物を回収してフィルターにかけ、凍結乾燥した。１％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含む移動相Ａ（０．０６％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））１８μｌにこの凍結乾燥物を溶解し、逆相カラム（２．１×１５０ｍｍ）でＨＰＬＣを行った。ペプチドの溶出は、流速３．３μｌ／ｍｉｎ、１００分間で２％〜１００％までの移動相Ｂ（０．０５２％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡを含む８０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル）の濃度勾配により行った。ペプチドの画分は２１４ｎｍの吸光度をモニターしながら手作業で回収して、アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列決定はモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド バイオシステムス（Applied Biosystems）製）で行った。表−１に結果を示す。下線は縮重オリゴヌクレオチドプライマーの合成の基となったアミノ酸配列である。また、小文字で表したアミノ酸は同定が不確かであったものを示す。
【００４５】
【表１】
＜２＞ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分ｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅
（１）ＰＣＲ用プライマーの作成
上記ペプチドの１、２及び３の下線のアミノ酸配列に基づいて、図１に示すデオキシイノシン置換を有する末端及び内部のプライマーの縮重オリゴヌクレオチドを作成した（鋳型ＤＮＡ配列を持つプライマーPr.1-s（配列番号６）、Pr.2-so（配列番号９）、Pr.2-si（配列番号１０）、鋳型の相補的配列を持つプライマーPr.1-ao（配列番号７）、Pr.1-ai（配列番号８）、Pr.2-a（配列番号１１））。
【００４７】
（２）ＰＣＲ法
２週齢のラットの大脳皮質からグアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム法により調製した全ＲＮＡ（２０μｇ）を鋳型とし、ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡの一本鎖を合成し（全量４０μｌ）、これを逆転写反応混合液としてＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ反応液は、２μｌの上記逆転写反応混合液、１００ｐｍｏｌの末端プライマーpr.1-s及びpr.1-aoの混合物（又はpr.2-so及びpr.2-a）、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、及び１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン エルマー(Perkin Elmer)製）を含む混合液２５μｌとした。増幅は以下のように行った。解離反応は９４℃で３０秒、アニーリングは４５℃で６０秒、伸長反応は７２℃で９０秒の条件で３５サイクル行った。この操作によって生じた増幅物質１μｌに対し、プライマーとしてpr.1-s及びpr.1-aiの混合物（又はpr.2-si及びpr.2-a）を用いて再度ＰＣＲを行った。増幅は、９４℃で３０秒、４５℃で６０秒、７２℃で９０秒のサイクルを２０回繰り返して行った。この操作によって生じた増幅物質を常法によりアガロースゲル電気泳動を行い解析すると、pr.1-s及びpr.1-aiを用いて作製した増幅物質では約２６０ｂｐ（Ａ１）、pr.2-si及びpr.2-aを用いて作製した増幅物質では約２１０ｂｐ（Ａ２）のＤＮＡのバンドが検出された。
【００４８】
＜３＞ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡ
（１）ハイブリダイゼーション用プローブの作成
上記Ａ１及びＡ２の増幅物質を常法によりｐＣＲＩＩ（インビトロゲン(Invitrogen)製）にサブクローンし、塩基配列を解析した。塩基配列はABI PRISM Dyeterminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（パーキン エルマー(PERKIN ELMER)製）を使用して解析した。解析結果に基づいて、Ａ１増幅時に使用したプライマーpr.1-sの隣に位置する配列（pr.a（配列番号１２））及びＡ２増幅時に使用したプライマーpr.2-siの隣に位置する配列（pr.b（配列番号１３））を合成した。２０ｐｍｏｌのpr.a及びpr.b、２μｌの逆転写反応混合液、ならびに５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む最終量２５μｌの溶液でＰＣＲを行い増幅物質を調製した（gf.a）。ＰＣＲは上記同様、９４℃３０秒、４７℃６０秒、７２℃５０秒のサイクルを３５回繰り返すことによって行った。このようにして増幅されたgf.aをｐＣＲIIへサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号１６）。また、このプラスミドを大量に調製後、ＥｃｏＲＩで消化して切り出し、大量のgf.aを得て、スクリーニングに使用した。
【００４９】
（２）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡクローンのスクリーニング
ＳＤラットの１８日齢の胎児の脳由来のｍＲＮＡから構築したλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをクロ−ンテック(Clonetec)社から購入した。このラット胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを、宿主の大腸菌（Escherichia coli）Ｙ１０９０r-に感染させ、プレートに重層し、プラークを形成させた。１５０ｍｍのディッシュ１０枚を用いて約５×１０5個のプラークをスクリーニングした。生じたプラークをＯＰＴＩＴＲＡＮ ＢＡ−Ｓ ８５ ニトロセルロース膜（シュライシャーアンド シュエル(Schleicher & Schuell)製）に転写した後ＵＶクロスリンクを行った後、５０％ホルムアミド、５０ｍＭ、ｐＨ７．０リン酸緩衝液、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、０．５％ スキムミルク、０．１％ ＳＤＳと１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含む溶液中、４２℃で１６時間プレハイブリダイズした。その後、32Ｐでラベルしたgf.aを上記バッファーに加え、４２℃で１６時間ハイブリダイズした。フィルターを、室温で２×ＳＳＣ、０．５×ＳＤＳ、６５℃で１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、更に６５℃で０．２×ＳＳＣにより洗浄し、オートラジオグラフィーにより１７個の陽性クローンを検出し、８つのクローンを単離した。
【００５０】
（３）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡクローンの塩基配列
上記８つのクローンからファージＤＮＡを調製し、ベクターＤＮＡからｃＤＮＡ挿入断片をＰＣＲ法を行うことにより得た。このｃＤＮＡ断片を鋳型としてABI PRISM Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（パーキン エルマー(PERKIN ELMER)製）を用いたデオキシチェーンターミネーション法（Sanger, F., Nicklens, S., and Coulson, A. R.(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467）により、両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。その結果、全てに共通した部位gf.bの塩基配列（配列番号１７）が決定された。
【００５１】
（４）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡ５’末端部の合成と塩基配列の決定
上記gf.bの塩基配列より、５’末端部の塩基配列が欠損していることが明らかとなったため、ｃＤＮＡの５’末端側は２週齢のラットの大脳皮質由来のｍＲＮＡから直接増幅した。pr.bを用いて逆転写反応を行った後、その３’末端にターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いてポリＡを付加した。この反応生成物を、オリゴｄＴとpr.c-1（配列番号１４）をプライマーとして上記と同条件でＰＣＲ法を行い、その後、オリゴｄＴとpr.c-2（配列番号１５）をプライマーとして更に上記と同条件でＰＣＲ法により増幅した。その結果、約６００ｂｐのＤＮＡ断片が得られ（gf.c（配列番号１８））、この断片を既知の方法により増幅した後、インビトロゲン製のｐＣＲIIにサブクローニングして、上記同様の方法により両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。
【００５２】
（５）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡ全長に渡る塩基配列の決定
gf.bとgf.cの塩基配列を組み合わせることによりＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡの全塩基配列が決定された。なお、gf.a、gf.b及びgf.cの各断片並びに各プライマーの位置関係を図２に示す。
【００５３】
このようにして判明したＧｌｃＡＴ−ＰのｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）から推定されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。１つのオープンリーディングフレームは３４７アミノ酸残基からなり、このｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの分子量はそのアミノ酸構成から３９７０６と推定される。また、このポリペプチドはＮ−結合グリコシレーションが可能な部位を３カ所有する。このポリペプチドが膜貫通領域を有するか否か、有するとすればその位置を決定するために、推定されたアミノ酸配列からハイドロパシープロットを作成した。ハイドロパシープロットは、Hopp and Woodsの方法（Hopp,T.P. and Woods,K.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78,3824-3828(1981)）により、５アミノ酸のウィンドウで計算した。プロットの解析から、アミノ末端側に、長さ１７残基からなる１つの顕著な疎水領域が認められ、膜貫通領域であることが推定された。このポリペプチドは膜貫通領域のＮ末端側には１９アミノ酸残基からなる領域を有するタイプIIの膜タンパク質であることが明らかになった。
【００５４】
（６）ノザンブロッティング
成体ラットの組織（大脳皮質、小脳、脳全体、肺、肝臓、腎臓、回腸、精巣、リンパ節、胸腺、脾臓、心臓及びマクロファージ）からAnal. Biochem. 162, 156-159記載のグアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法により全ＲＮＡを調製した。１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により各レーン１０μｇずつの各ＲＮＡを分子量分画し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+ ナイロン膜（アマシャム(Amersham)製）にブロッティングした。このナイロン膜に32ＰラベルしたＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを６５℃で１４時間、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）溶液中でハイブリダイズさせた。洗浄は、室温で２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、更に６５℃で０．１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣで行った。その後、放射活性をイメージアナライザー（Ｂａｓ ２０００、富士フィルム製）で解析した。この結果、大脳皮質、小脳及び脳全体でＧｌｃＡＴ−ＰのＲＮＡ（主要成分の4.0kb及びマイナー成分の9.1kb）が発現していることが明らかになった。肝臓、腎臓などの末梢組織では発現は認められなかった。
【００５５】
（７）発現用ベクターの構築
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、２週齢のラットの脳のｍＲＮＡから５’側プライマーと、終止コドンの１８ｂｐ５’寄りにＢａｍＨＩ領域を有する３’側プライマーを用いて上記同様の手法を用いて逆転写反応によりＤＮＡの一本鎖を合成した後、上記ＰＣＲ法と同様の条件で増幅して得た。このＤＮＡ断片を既知の方法により平滑化した後、ＢｓｔＸＩで消化して平滑化し、次いで、脱リン酸化した哺乳類細胞用ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（Nagata,S.(大阪バイオサイエンス研究所)より入手）に既知の方法により連結させた。
【００５６】
（８）可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを組み込んだ発現用ベクターの構築
ＧｌｃＡＴ−Ｐのトランスメンブレン領域にあたると考えられるＮ末端から７４アミノ酸残基までが欠失したＧｌｃＡＴ−Ｐの短縮化形態をコードするＤＮＡを、クローン化したＧｌｃＡＴ−ＰのｃＤＮＡを鋳型として、インフレームのＥｃｏＲＩ領域を含む５’側プライマー（配列番号１９）と３’側プライマー（配列番号２０）を用いてＰＣＲ法により増幅した。増幅して得られたＤＮＡ断片をｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulson,J.C.,J. Biol. Chem.,269,1394-1401(1994)）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域に通常の方法により組み込み、ＧｌｃＡＴ−Ｐとインスリンシグナル配列及びプロテインＡの融合タンパク質の遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを構築した。正確な配列を有するクローンを選択し、融合タンパク質をコードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記発現ベクターの構築方法同様の操作により目的ＤＮＡ断片をｐＥＦ−ＢＯＳ(Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322(1990))のＸｂａＩ領域に連結させた。
【００５７】
（９）ＣＯＳ−１細胞における可溶化タンパク質形態ＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現
１００ｍｍのディッシュ上でＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）を培養し、２４時間後に上記可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結した発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ８．２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Technologies)製）を用いトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に当該細胞の培養上清を回収し、アシアロオロソムコイドをグルクロン酸受容体として使用してＧｌｃＡＴ−Ｐ活性を測定した。活性の測定はJ. Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)に従って行った。対照として組換え遺伝子を含まないｐＥＦ−ＢＯＳベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の培養上清を用いた。結果を表−２に示す。
【００５８】
【表２】
また、培地中の可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐはアシアロオロソムコイドを結合したセファロースカラムで単離することができた。通常のＧｌｃＡＴ−Ｐは７０位と３１７位にシステイン残基を有するが、精製した可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐは３１７位のシステイン残基のみを有している。可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐが活性を有すること及びＳＨ基のブロッキング剤であるＮ−エチルマレイミドを添加して当該タンパク質の活性を調べた際に活性が完全に失われるという２つの結果より、それぞれのシステインはジスルフィド結合は形成しておらず、３１７位のシステイン残基のＳＨ基は当該酵素の活性と関連する部位であることが判明した。
【００６０】
（１０）Ｌｅｃ２細胞におけるＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現
ＣＨＯ細胞の変異体であり、グルクロン酸の受容体である糖タンパク質のＮ−アセチルラクトサミン残基を有するＬｅｃ２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７３６）に完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを接続したｐＥＦ−ＢＯＳベクターをトランスフェクションした。Ｌｅｃ２はＣＭＰ−シアル酸の輸送系を欠き、細胞表面にＮ−ラクトサミン残基の末端のシアル酸を欠く糖タンパク質を発現している。その為、ＧｌｃＡＴ−ＰによるＮ−ラクトサミン構造へのグルクロン酸転移活性が、内在性のシアル酸転移酵素活性との競争による阻害が起こらないため、よりＧｌｃＡＴ−Ｐの生理活性が顕著に表れやすいと考えられる。６０ｍｍの培養皿に２４時間上記細胞を培養し、完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結、または何も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Technologies)製）を用いトランスフェクションした。７２時間後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で回収し、抗パラグロボシド抗体であるＨ１１（Taki,T(東京医科歯科大学)より入手）、ＨＮＫ−１エピトープ中のグルクロン酸を認識するＭ６７４９（Tanaka,H.(熊本大学)より入手）、硫酸化されたグルクロン酸を認識するＨＮＫ−１抗体（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−２００）及び対照のマウスＩｇＭ抗体をそれぞれ一次抗体として４℃で１時間反応させた。ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇＭ抗体を二次抗体としてそれぞれの一次抗体により処理した細胞に反応させ、ＦＡＣＳで解析した。その結果を図３に示す。完全長ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを導入してもＨ１１抗体による染色が変化しないことから、ＧｌｃＡＴ−Ｐは糖脂質性のグルクロン酸受容体であるパラグロボシドにはグルクロン酸を転移しないことが明らかであり、ＨＮＫ−１抗体による染色が変化しないことから、Ｌｅｃ２には転移されたグルクロン酸を硫酸化する酵素が欠損していることが明らかである。Ｍ６７４９による染色量が増加していることから、当該ｃＤＮＡから生じるＧｌｃＡＴが正常にグルクロン酸を転移していることが明らかである。
【００６１】
（１１）ＣＯＳ−１細胞におけるＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現
ラミニンコートした６０ｍｍ培養皿にＣＯＳ−１細胞を培養し、２４時間後に完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結したｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Technologies)製）を用いトランスフェクションした。対照としては何も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクターを用いた。７２時間後、３％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ緩衝液で上記トランスフェクションした細胞を固定し、１０μｇ／ｍｌのＭ６７４９又はＨＮＫ−１抗体により室温で２時間インキュベートし、ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇＭで上記抗体を染色した。対照の細胞は全く染色されなかったが、ＧｌｃＡＴ−Ｐをトランスフェクションした細胞は、Ｍ６７４９及びＨＮＫ−１双方の抗体によって染色された。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐを発現させたＣＯＳ−１細胞は対照と比較して大きな形態の変化が見られた。ＧｌｃＡＴ−Ｐを発現させたＣＯＳ−１細胞は多数のマイクロスパイクを有する長く伸長した突起を有していた。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、糖タンパク質のラクトサミン残基にグルクロン酸を選択的に転移するグルクロン酸転移酵素−Ｐ（ＧｌｃＡＴ−Ｐ）をコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られる。本発明により、ＧｌｃＡＴ−Ｐをコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られたので、ＧｌｃＡＴ−Ｐを工業的に使用可能な程度まで大量生産できることが期待される。また、生体内においては細胞膜上に存在する前記酵素を、本発明ＤＮＡを利用することによって、その酵素活性を保ったままの状態で可溶化タンパク質形態で得ることが可能となり、当該酵素を利用したＨＮＫ−１エピトープの人工的な合成、当該酵素の生体内における働きの解明が容易になる。
【００６３】
【配列表】
配列番号：18
配列の長さ：560
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
鎖の数：二本鎖
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
GCGCGCGCAT CGCAGGGCAG CAGCCCTGGG TCTCTGGGGC CAGGGCATAG GACTGCCACC 60
CGCTATGGAC CGCGCCAGGG ACGATATGGA CTCGCTGCCG CAGGTATCAA CCTCCGAAGG 120
TTCCTGACCC TGCGCTGGAC TACTTCCCCT TCGCAGACTC CCATCAGGCC GGACTCTGCA 180
AACCTGCTGC CACAATGGGT AATGAGGAGC TGTGGGCGCA GCCAGCCTTG GAGATGCCGA 240
AGAGAAGGGA CATCCTCGCG ATTGTCCTCA TTGTGCTTCC CTGGACACTG CTCATCACCG 300
TCTGGCACCA GAGCAGCCTC GCACCTCTGC TTGCTGTGCA CAAGGATGAG GGAAGTGACC 360
CCCGCCATGA GGCACCACCC GGTGCGGACC CTAGGGAGTA CTGCATGTCC GACCGTGACA 420
TCGTGGAGGT GGTGCGCACA GAGTACGTGT ACACGAGGCC GCCACCGTGG TCCGACACGC 480
TGCCCACCAT CCATGTGGTG ACGCCCACCT ACAGTAGACC GGTGCAGAAG GCAGAGCTGA 540
CGCGAATGGC CAACACGCTA 560
【００８１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分アミノ酸配列とＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す。
【図２】 各ＤＮＡ断片並びに各プライマーの位置関係を示す。
【図３】 各種抗体による染色のＧｌｃＡＴ−Ｐの発現による変化を示す。
Claims (9)
- 以下の（１）又は（２）の塩基配列からなるＤＮＡ。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する酵素活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列。 - 以下の（１）又は（２）の塩基配列からなるＤＮＡ。
（１）配列番号２においてアミノ酸番号７５〜３４７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（２）上記配列番号２のアミノ酸番号７５〜３４７で示されるアミノ酸配列において、グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する酵素活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列。 - 配列番号１において塩基番号１９５〜１２３５で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号１において塩基番号４１７〜１２３５で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
- 以下の（１）又は（２）のタンパク質。
（１）配列番号２においてアミノ酸番号７５〜３４７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（２）上記配列番号２のアミノ酸番号７５〜３４７で示されるアミノ酸配列において、グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する酵素活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
- 請求項６に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡで形質転換された細胞又は請求項７に記載の形質転換体を好適な培地で培養し、前記ＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるグルクロン酸転移酵素のポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から前記ポリペプチドを採取することを含む、ポリペプチドの製造方法。
- 配列番号２においてアミノ酸番号７５〜３４７で示されるアミノ酸配列及びプロテインＡ配列を含有し、グルクロン酸供与体からグルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する酵素活性を有する、融合ポリペプチド。
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