JPH10313867A - グルクロン酸転移酵素をコードするｄｎａ - Google Patents
グルクロン酸転移酵素をコードするｄｎａInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＨＮＫ−１抗原の機能解明に有用なグルクロ
ン酸転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、
グルクロン酸供与体からグルクロン酸を、グルクロン酸
受容体であるアシアロオロソムコイドに転移する酵素活
性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入又は転位を有していても良いグルクロン酸転
移酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードする塩
基配列を有するＤＮＡ。
ン酸転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、
グルクロン酸供与体からグルクロン酸を、グルクロン酸
受容体であるアシアロオロソムコイドに転移する酵素活
性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入又は転位を有していても良いグルクロン酸転
移酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードする塩
基配列を有するＤＮＡ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グルクロン酸転移
酵素（グルクロニルトランスフェラーゼ）をコードする
塩基配列を有する新規なＤＮＡに関するものである。よ
り詳しくは神経細胞及び免疫系細胞で特異的に発現する
ＨＮＫ−１エピトープの合成に関与するグルクロン酸転
移酵素をコードするＤＮＡに関する。
酵素（グルクロニルトランスフェラーゼ）をコードする
塩基配列を有する新規なＤＮＡに関するものである。よ
り詳しくは神経細胞及び免疫系細胞で特異的に発現する
ＨＮＫ−１エピトープの合成に関与するグルクロン酸転
移酵素をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】神経系組織及び免疫系細胞に特異的に存
在することが知られているＨＮＫ−１抗原は、神経系の
伸展や相互の接着などに重要な役割を果たすこと及び自
己免疫疾患に伴う末梢神経障害の発症の際に上記抗原に
対する抗体が増加することが知られている（ファルマシ
ア,32,11,1361-1369(1996)）。また、ナチュラルキラー
Ｔ細胞（ＮＫ細胞）に上記抗原は発現しており、また腫
瘍細胞に選択的に集まる細胞は上記抗原が発現したＴ細
胞であることが知られている為（Clin. Exp. Immunol.,
102,159-166(1995)）、上記抗原はＮＫ細胞の異物認識
機構及び異物除去機構に関与していると考えられるが、
従来の研究においては、ＮＫ細胞上に発現した当該抗原
は当該細胞のマーカーとして利用されているのみであ
り、その機能は全く解明されていない。上記抗原はその
特異的構造として通常の糖タンパク質や糖脂質には見ら
れない３位が硫酸化されたグルクロン酸を有し、当該抗
原の生体内における合成には、グルクロン酸転移酵素が
働いていることが明らかである。グルクロン酸転移酵素
はグルクロン酸転移酵素−Ｌとグルクロン酸転移酵素−
Ｐの２種類に大別される（J. Biol. Chem., 267, 32, 2
2711-22714(1992)）が、これらの酵素について詳細は未
だ不明である。
在することが知られているＨＮＫ−１抗原は、神経系の
伸展や相互の接着などに重要な役割を果たすこと及び自
己免疫疾患に伴う末梢神経障害の発症の際に上記抗原に
対する抗体が増加することが知られている（ファルマシ
ア,32,11,1361-1369(1996)）。また、ナチュラルキラー
Ｔ細胞（ＮＫ細胞）に上記抗原は発現しており、また腫
瘍細胞に選択的に集まる細胞は上記抗原が発現したＴ細
胞であることが知られている為（Clin. Exp. Immunol.,
102,159-166(1995)）、上記抗原はＮＫ細胞の異物認識
機構及び異物除去機構に関与していると考えられるが、
従来の研究においては、ＮＫ細胞上に発現した当該抗原
は当該細胞のマーカーとして利用されているのみであ
り、その機能は全く解明されていない。上記抗原はその
特異的構造として通常の糖タンパク質や糖脂質には見ら
れない３位が硫酸化されたグルクロン酸を有し、当該抗
原の生体内における合成には、グルクロン酸転移酵素が
働いていることが明らかである。グルクロン酸転移酵素
はグルクロン酸転移酵素−Ｌとグルクロン酸転移酵素−
Ｐの２種類に大別される（J. Biol. Chem., 267, 32, 2
2711-22714(1992)）が、これらの酵素について詳細は未
だ不明である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述のようにＨＮＫ−
１抗原が神経系の発達、障害に大きく関与していること
は明かであるが、そのメカニズムの解明が未だなされて
いない。特に自己免疫疾患に伴う末梢神経障害は深刻な
問題となっているが、その根本的治療法の解明は遅れて
おり、この点からも上記メカニズムの解明が期待され
る。また、免疫系細胞の異物認識機構及び異物除去機構
の解明はされておらず、その解明にはＨＮＫ−１抗原の
機能を解明することが必要とされる。
１抗原が神経系の発達、障害に大きく関与していること
は明かであるが、そのメカニズムの解明が未だなされて
いない。特に自己免疫疾患に伴う末梢神経障害は深刻な
問題となっているが、その根本的治療法の解明は遅れて
おり、この点からも上記メカニズムの解明が期待され
る。また、免疫系細胞の異物認識機構及び異物除去機構
の解明はされておらず、その解明にはＨＮＫ−１抗原の
機能を解明することが必要とされる。
【０００４】本発明者らは、ＨＮＫ−１抗原の機能を解
明するために、その生体内での合成において律速段階と
なる反応を制御するグルクロン酸転移酵素−Ｐ（以下
「ＧｌｃＡＴ−Ｐ」とも記載する）を生体組織から抽出
・精製することに既に成功していたが、その操作は複雑
であり、さらに当該酵素は微量しか得ることができなか
った。また、ｃＤＮＡが未だクローニングされていなか
ったため、特に生体（細胞）内でのＨＮＫ−１抗原の機
能解明を進めることが不可能であった。
明するために、その生体内での合成において律速段階と
なる反応を制御するグルクロン酸転移酵素−Ｐ（以下
「ＧｌｃＡＴ−Ｐ」とも記載する）を生体組織から抽出
・精製することに既に成功していたが、その操作は複雑
であり、さらに当該酵素は微量しか得ることができなか
った。また、ｃＤＮＡが未だクローニングされていなか
ったため、特に生体（細胞）内でのＨＮＫ−１抗原の機
能解明を進めることが不可能であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題に
鑑み、ＨＮＫ−１抗原の機能解明を早期に実現するべ
く、その生体内及び生体外での合成の律速段階となるグ
ルクロン酸転移反応を制御する酵素であるグルクロン酸
転移酵素−Ｐの大量生産及び細胞内における当該酵素の
機能の解明を可能とするために、グルクロン酸転移酵素
−Ｐの遺伝子を得るべく鋭意検討した結果、上記酵素の
ｃＤＮＡのクローニングに成功し、該ｃＤＮＡによりＧ
ｌｃＡＴ−Ｐが発現することを確認して本発明を完成し
た。
鑑み、ＨＮＫ−１抗原の機能解明を早期に実現するべ
く、その生体内及び生体外での合成の律速段階となるグ
ルクロン酸転移反応を制御する酵素であるグルクロン酸
転移酵素−Ｐの大量生産及び細胞内における当該酵素の
機能の解明を可能とするために、グルクロン酸転移酵素
−Ｐの遺伝子を得るべく鋭意検討した結果、上記酵素の
ｃＤＮＡのクローニングに成功し、該ｃＤＮＡによりＧ
ｌｃＡＴ−Ｐが発現することを確認して本発明を完成し
た。
【０００６】すなわち本発明は、以下の性質を有するグ
ルクロン酸転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配
列を有するＤＮＡを提供する。 作用：グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体
にグルクロン酸を転移する。 基質特異性：アシアロオロソムコイド及び神経細胞接
着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグル
クロン酸を転移する。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM Ｍ
ＥＳ緩衝液、３７℃）。 阻害及び活性化：Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭ
のネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ 14Ｈ29共存下
において活性が維持される。 分子量：還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定される分子量が約４５,０
００。ゲルろ過により測定される分子量が約９０，００
０。
ルクロン酸転移酵素のポリペプチドをコードする塩基配
列を有するＤＮＡを提供する。 作用：グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体
にグルクロン酸を転移する。 基質特異性：アシアロオロソムコイド及び神経細胞接
着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグル
クロン酸を転移する。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM Ｍ
ＥＳ緩衝液、３７℃）。 阻害及び活性化：Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭ
のネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ 14Ｈ29共存下
において活性が維持される。 分子量：還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定される分子量が約４５,０
００。ゲルろ過により測定される分子量が約９０，００
０。
【０００７】本発明は、また、配列番号２に示すアミノ
酸配列を有し、グルクロン酸供与体から、受容体である
アシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する活性
を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入又は転位を有していてもよいグルクロン酸転移
酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードする塩基
配列を有するＤＮＡを提供する。
酸配列を有し、グルクロン酸供与体から、受容体である
アシアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する活性
を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入又は転位を有していてもよいグルクロン酸転移
酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードする塩基
配列を有するＤＮＡを提供する。
【０００８】本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番
号２においてアミノ酸番号１〜３４７及び７５〜３４７
で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
ＤＮＡが挙げられる。
号２においてアミノ酸番号１〜３４７及び７５〜３４７
で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
ＤＮＡが挙げられる。
【０００９】また、本発明は、上記ＤＮＡで形質転換さ
れた細胞を、好適な培地で培養し、該ＤＮＡが有する塩
基配列によってコードされる本酵素のポリペプチドを培
養物中に生成蓄積させ、その培養物から前記ポリペプチ
ドを採取することを含む、ポリペプチドの製造方法を提
供する。
れた細胞を、好適な培地で培養し、該ＤＮＡが有する塩
基配列によってコードされる本酵素のポリペプチドを培
養物中に生成蓄積させ、その培養物から前記ポリペプチ
ドを採取することを含む、ポリペプチドの製造方法を提
供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
する。 ＜１＞本発明のグルクロン酸転移酵素のポリペプチドを
コードする塩基配列を有するＤＮＡ（本発明ＤＮＡ） 本発明のＤＮＡが有する塩基配列によってコードされる
ポリペプチドを含むグルクロン酸転移酵素は、本発明者
らによってラットの脳から抽出、精製されたグルクロン
酸転移酵素−Ｐ（Oka, S., Terayama, K., Kawashima,
C., and Kawasaki, T.(1992) J. Biol. Chem. 267, 227
11-22714）であり、下記のような理化学的性質を有す
る。 作用：グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体
にグルクロン酸を転移する。 基質特異性：アシアロオロソムコイド及び神経細胞接
着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグル
クロン酸を転移する。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM Ｍ
ＥＳ緩衝液、３７℃）。 阻害及び活性化：Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭ
のネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ 14Ｈ29共存下
において活性が維持される。 分子量：還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による分子量が約４５,０００。ゲル
ろ過による分子量が約９０，０００。
する。 ＜１＞本発明のグルクロン酸転移酵素のポリペプチドを
コードする塩基配列を有するＤＮＡ（本発明ＤＮＡ） 本発明のＤＮＡが有する塩基配列によってコードされる
ポリペプチドを含むグルクロン酸転移酵素は、本発明者
らによってラットの脳から抽出、精製されたグルクロン
酸転移酵素−Ｐ（Oka, S., Terayama, K., Kawashima,
C., and Kawasaki, T.(1992) J. Biol. Chem. 267, 227
11-22714）であり、下記のような理化学的性質を有す
る。 作用：グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体
にグルクロン酸を転移する。 基質特異性：アシアロオロソムコイド及び神経細胞接
着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグル
クロン酸を転移する。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM Ｍ
ＥＳ緩衝液、３７℃）。 阻害及び活性化：Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭ
のネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ 14Ｈ29共存下
において活性が維持される。 分子量：還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による分子量が約４５,０００。ゲル
ろ過による分子量が約９０，０００。
【００１１】上記グルクロン酸転移酵素−Ｐの活性は上
記文献に記載の方法に従って測定することができる。グ
ルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイド及び神
経細胞接着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異
的であるとは、一般に、その残基へのグルクロン酸転移
活性が、上記グルクロン酸受容体をグルクロン酸の受容
体として使用した際に糖脂質のＮ−アセチルラクトサミ
ン残基を受容体として使用した際と比較して５倍以上で
あることをいう。至適ｐＨは同文献に記載の反応液にお
いて、100mMＨＥＰＥＳ緩衝液を100mM ＭＥＳ緩衝液で
置き換えて測定することが可能である。阻害及び活性化
は、同反応液に種々の試験物質を加えて活性を測定する
ことにより判定できる。Ｍｎ2+での活性化は少なくとも
20 mMの濃度で認められる。また、活性の維持とは通常
には糖脂質性阻害剤非存在下に比べ７０％以上の活性を
維持することをいう。糖脂質性阻害剤の例としては、ネ
オラクトテトラオース−フェニル−Ｃ14Ｈ29が挙げられ
る。
記文献に記載の方法に従って測定することができる。グ
ルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイド及び神
経細胞接着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異
的であるとは、一般に、その残基へのグルクロン酸転移
活性が、上記グルクロン酸受容体をグルクロン酸の受容
体として使用した際に糖脂質のＮ−アセチルラクトサミ
ン残基を受容体として使用した際と比較して５倍以上で
あることをいう。至適ｐＨは同文献に記載の反応液にお
いて、100mMＨＥＰＥＳ緩衝液を100mM ＭＥＳ緩衝液で
置き換えて測定することが可能である。阻害及び活性化
は、同反応液に種々の試験物質を加えて活性を測定する
ことにより判定できる。Ｍｎ2+での活性化は少なくとも
20 mMの濃度で認められる。また、活性の維持とは通常
には糖脂質性阻害剤非存在下に比べ７０％以上の活性を
維持することをいう。糖脂質性阻害剤の例としては、ネ
オラクトテトラオース−フェニル−Ｃ14Ｈ29が挙げられ
る。
【００１２】また、上記グルクロン酸転移酵素−Ｐは、
通常は、次の性質も有する。２価陽イオン非存在下では
活性が著しく低下する。Ｎ−エチルマレイミドにより活
性が阻害される。スフィンゴミエリンにより活性化され
る。
通常は、次の性質も有する。２価陽イオン非存在下では
活性が著しく低下する。Ｎ−エチルマレイミドにより活
性が阻害される。スフィンゴミエリンにより活性化され
る。
【００１３】分子量の測定は、酵素タンパク質について
一般に採用される条件で行われる。本発明のＤＮＡは、
本発明により初めて単離されたＤＮＡであり、ＧｌｃＡ
Ｔ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部をコードしてい
るのであればその塩基配列は特に限定はされない。ま
た、本発明ＤＮＡが有する塩基配列がコードするＧｌｃ
ＡＴ−Ｐのポリペプチドはグルクロン酸供与体から、グ
ルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイドにグル
クロン酸を転移する活性を実質的に害さない１つ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していて
もよく、そのようなＤＮＡの何れもが本発明のＤＮＡに
包含される。該活性の測定方法は公知であり（例えば、
J. Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)など）、当業
者であれば、目的とする酵素活性の有無を指標として、
該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸の置換、
欠失、挿入及び転位をアミノ酸配列に有する本酵素を容
易に選択することができる。
一般に採用される条件で行われる。本発明のＤＮＡは、
本発明により初めて単離されたＤＮＡであり、ＧｌｃＡ
Ｔ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部をコードしてい
るのであればその塩基配列は特に限定はされない。ま
た、本発明ＤＮＡが有する塩基配列がコードするＧｌｃ
ＡＴ−Ｐのポリペプチドはグルクロン酸供与体から、グ
ルクロン酸受容体であるアシアロオロソムコイドにグル
クロン酸を転移する活性を実質的に害さない１つ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していて
もよく、そのようなＤＮＡの何れもが本発明のＤＮＡに
包含される。該活性の測定方法は公知であり（例えば、
J. Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)など）、当業
者であれば、目的とする酵素活性の有無を指標として、
該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸の置換、
欠失、挿入及び転位をアミノ酸配列に有する本酵素を容
易に選択することができる。
【００１４】本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２
においてアミノ酸番号１〜３４７で表されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、か
つ好ましい。本発明ＤＮＡが有する塩基配列として更に
具体的には、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも一
部又は全てを有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。
このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号に示す塩
基配列における塩基番号１２２〜１１６５の塩基配列を
有するＤＮＡが挙げられる。
においてアミノ酸番号１〜３４７で表されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、か
つ好ましい。本発明ＤＮＡが有する塩基配列として更に
具体的には、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも一
部又は全てを有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。
このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号に示す塩
基配列における塩基番号１２２〜１１６５の塩基配列を
有するＤＮＡが挙げられる。
【００１５】配列番号１に示す塩基配列において、Ｇｌ
ｃＡＴ−ＰｃＤＮＡのオープンリーディングフレームに
は７つのイン・フレームのＡＴＧコドンが含まれてい
る。第１番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は、真核
細胞の翻訳開始部位の共通配列と比較すると、−３の位
置のプリンが保存されており、＋４の位置のＧ（グアニ
ン）も保存されている。このことは、効率的な翻訳に関
するKozakの知見（Kozak, M. (1986)Cell, 44,283-29
2）を満足している。また、第２、第５〜第７番目のＡ
ＴＧコドンの周囲の塩基配列も、−３の位置がプリン
（それぞれＧ、Ａ（アデニン）、Ｇ、Ｇ）であり、第４
番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は−３の位置がプ
リンではない（Ｃ（シトシン））が、＋４の位置のＧが
保存されており、第３番目のＡＴＧコドン以外は何れの
ＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能性があ
る。
ｃＡＴ−ＰｃＤＮＡのオープンリーディングフレームに
は７つのイン・フレームのＡＴＧコドンが含まれてい
る。第１番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は、真核
細胞の翻訳開始部位の共通配列と比較すると、−３の位
置のプリンが保存されており、＋４の位置のＧ（グアニ
ン）も保存されている。このことは、効率的な翻訳に関
するKozakの知見（Kozak, M. (1986)Cell, 44,283-29
2）を満足している。また、第２、第５〜第７番目のＡ
ＴＧコドンの周囲の塩基配列も、−３の位置がプリン
（それぞれＧ、Ａ（アデニン）、Ｇ、Ｇ）であり、第４
番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は−３の位置がプ
リンではない（Ｃ（シトシン））が、＋４の位置のＧが
保存されており、第３番目のＡＴＧコドン以外は何れの
ＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能性があ
る。
【００１６】ところで、β−１，４−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを
含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988)
J.Biochem. 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988)
J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaper
らは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いもの
との両方の形態が合成されることを示している。さら
に、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に
標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在
することを示唆する証拠を示している。（Lopez, L. et
al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15991）。同
様に、ＧｌｃＡＴ−Ｐについても、複数のＡＴＧコドン
が開始コドンとして機能する可能性はあるが、定かでは
ない。しかし、何れのＡＴＧコドンが開始コドンであっ
ても、上記のグルクロン酸転位酵素−Ｐをコードする点
では同じであり、第２番目、第４番目〜第７番目のＡＴ
Ｇコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本発明に
包含されるものである。
ンスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを
含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988)
J.Biochem. 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988)
J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaper
らは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いもの
との両方の形態が合成されることを示している。さら
に、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に
標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在
することを示唆する証拠を示している。（Lopez, L. et
al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15991）。同
様に、ＧｌｃＡＴ−Ｐについても、複数のＡＴＧコドン
が開始コドンとして機能する可能性はあるが、定かでは
ない。しかし、何れのＡＴＧコドンが開始コドンであっ
ても、上記のグルクロン酸転位酵素−Ｐをコードする点
では同じであり、第２番目、第４番目〜第７番目のＡＴ
Ｇコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本発明に
包含されるものである。
【００１７】第１番目のＡＴＧコドンで始まる単一のオ
ープンリーディングフレームからは、３４７アミノ酸残
基からなり、３９，７０６Ｄａのタンパク質が予測され
る。このアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロ
ットから、Ｎ−末端から２０〜３６番目のアミノ酸残基
に渡る長さ１７残基の１つの顕著な疎水性部分を認めら
れ、トランスメンブレン（膜貫通）ドメインを有するＴ
ｙｐｅIIの膜タンパク質であることが予想される。ま
た、この膜貫通ドメインのすぐＣ末端側には比較的プロ
リンが多く存在することが認められる。このようなプロ
リンに富む領域は、他のいくつかの糖転移酵素において
もみつかっており、膜貫通ドメインと活性ドメインを結
ぶネック領域を形成していると考えられる。したがっ
て、この領域よりＮ末端側を短縮化しても活性には影響
しないと考えられ、また、膜貫通ドメインのほとんどを
短縮化により欠失させれば、可溶化形態のグルクロン酸
転移酵素を得ることができる。本発明は、このような可
溶化タンパク質形態のグルクロン酸転移酵素のポリペプ
チドの少なくとも一部をコードするＤＮＡも包含する。
このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号２においてアミノ酸番号７５〜３４７で表され
るアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが
挙げられる。
ープンリーディングフレームからは、３４７アミノ酸残
基からなり、３９，７０６Ｄａのタンパク質が予測され
る。このアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロ
ットから、Ｎ−末端から２０〜３６番目のアミノ酸残基
に渡る長さ１７残基の１つの顕著な疎水性部分を認めら
れ、トランスメンブレン（膜貫通）ドメインを有するＴ
ｙｐｅIIの膜タンパク質であることが予想される。ま
た、この膜貫通ドメインのすぐＣ末端側には比較的プロ
リンが多く存在することが認められる。このようなプロ
リンに富む領域は、他のいくつかの糖転移酵素において
もみつかっており、膜貫通ドメインと活性ドメインを結
ぶネック領域を形成していると考えられる。したがっ
て、この領域よりＮ末端側を短縮化しても活性には影響
しないと考えられ、また、膜貫通ドメインのほとんどを
短縮化により欠失させれば、可溶化形態のグルクロン酸
転移酵素を得ることができる。本発明は、このような可
溶化タンパク質形態のグルクロン酸転移酵素のポリペプ
チドの少なくとも一部をコードするＤＮＡも包含する。
このようなポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号２においてアミノ酸番号７５〜３４７で表され
るアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが
挙げられる。
【００１８】本発明ＤＮＡは、このＤＮＡが有する塩基
配列によってコードされるＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチ
ドが、グルクロン酸供与体からグルクロン酸受容体であ
る糖タンパク質の構成糖にグルクロン酸を転移する活性
を実質的に害さない限り、１つ又は２つ以上のアミノ酸
残基の置換、欠失、挿入又は転位を起こすようなヌクレ
オチドの置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよ
い。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位は、両末
端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列
を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列の相当する部
分と入れ換えることにより、ＤＮＡに挿入することがで
きる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,
H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987);Kunkel,
T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987)）な
どの方法によっても、ＤＮＡに置換、欠失、挿入又は転
位を導入することができる。本酵素の活性の測定方法は
公知であり（例えば、J. Biol. Chem., 267,22711-2271
4(1992)など）、当業者であれば、目的とする酵素活性
の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以
上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位をアミノ
酸配列に有する本酵素をコードするＤＮＡにおける塩基
配列の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択すること
ができる。
配列によってコードされるＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチ
ドが、グルクロン酸供与体からグルクロン酸受容体であ
る糖タンパク質の構成糖にグルクロン酸を転移する活性
を実質的に害さない限り、１つ又は２つ以上のアミノ酸
残基の置換、欠失、挿入又は転位を起こすようなヌクレ
オチドの置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよ
い。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位は、両末
端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列
を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列の相当する部
分と入れ換えることにより、ＤＮＡに挿入することがで
きる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,
H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987);Kunkel,
T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987)）な
どの方法によっても、ＤＮＡに置換、欠失、挿入又は転
位を導入することができる。本酵素の活性の測定方法は
公知であり（例えば、J. Biol. Chem., 267,22711-2271
4(1992)など）、当業者であれば、目的とする酵素活性
の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以
上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位をアミノ
酸配列に有する本酵素をコードするＤＮＡにおける塩基
配列の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択すること
ができる。
【００１９】なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基
配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されること
は、当業者であれば容易に理解されるところである。さ
らに、染色体由来のＧｌｃＡＴ−Ｐ遺伝子は、コード領
域にイントロンを含むことが予想されるが、そのような
イントロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、Ｇ
ｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部をコード
する限り、本発明のＤＮＡ断片に包含される。すなわ
ち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプ
ロセッシングを受けて最終的に目的のポリペプチドを生
じうる塩基配列を有することも包含する。
配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されること
は、当業者であれば容易に理解されるところである。さ
らに、染色体由来のＧｌｃＡＴ−Ｐ遺伝子は、コード領
域にイントロンを含むことが予想されるが、そのような
イントロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、Ｇ
ｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なくとも一部をコード
する限り、本発明のＤＮＡ断片に包含される。すなわ
ち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプ
ロセッシングを受けて最終的に目的のポリペプチドを生
じうる塩基配列を有することも包含する。
【００２０】また、本明細書において「ポリペプチドの
少なくとも一部をコードする」とは、好ましくは、Ｇｌ
ｃＡＴ−Ｐ活性を有する、抗原性を有するなどの何らか
の活性ないし機能を有する部分、あるいは、その部分に
相当する塩基配列がそのＧｌｃＡＴ−Ｐに特異的であっ
て、プライマーやプローブとして使用できる部分をコー
ドすることを意味する。
少なくとも一部をコードする」とは、好ましくは、Ｇｌ
ｃＡＴ−Ｐ活性を有する、抗原性を有するなどの何らか
の活性ないし機能を有する部分、あるいは、その部分に
相当する塩基配列がそのＧｌｃＡＴ−Ｐに特異的であっ
て、プライマーやプローブとして使用できる部分をコー
ドすることを意味する。
【００２１】なお、本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明
のＤＮＡは、ＧｌｃＡＴ−Ｐをコードするコード鎖のみ
の一本鎖であってもよく、この一本鎖及びこれと相補的
な配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖
であってもよい。
相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明
のＤＮＡは、ＧｌｃＡＴ−Ｐをコードするコード鎖のみ
の一本鎖であってもよく、この一本鎖及びこれと相補的
な配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖
であってもよい。
【００２２】また、本発明ＤＮＡは、ＧｌｃＡＴ−Ｐの
ポリペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配
列を有していてもよく、またＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプ
チドの一部分をコードする塩基配列を有するものであっ
てもよい。
ポリペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配
列を有していてもよく、またＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプ
チドの一部分をコードする塩基配列を有するものであっ
てもよい。
【００２３】以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説
明する。本発明により本発明ＤＮＡが有する塩基配列に
よってコードされるアミノ酸配列が明らかにされたの
で、その配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮ
Ａから本発明のＤＮＡを増幅することによって取得する
ことも可能であり、また、特に以下の工程からなるｃＤ
ＮＡクローニングにより製造することも可能である。 （１）精製したＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なく
とも一部のアミノ酸を決定する。 （２）上記アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチド
プライマーを作成する。 （３）哺乳類の組織より抽出したＲＮＡから上記プライ
マーを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅することに
よって前記転移酵素のプローブを作成する。 （４）上記プローブによって哺乳類の組織由来のｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングする。スクリーニング
によって、通常には上記転移酵素の完全長ｃＤＮＡを選
択する。
明する。本発明により本発明ＤＮＡが有する塩基配列に
よってコードされるアミノ酸配列が明らかにされたの
で、その配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮ
Ａから本発明のＤＮＡを増幅することによって取得する
ことも可能であり、また、特に以下の工程からなるｃＤ
ＮＡクローニングにより製造することも可能である。 （１）精製したＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペプチドの少なく
とも一部のアミノ酸を決定する。 （２）上記アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチド
プライマーを作成する。 （３）哺乳類の組織より抽出したＲＮＡから上記プライ
マーを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅することに
よって前記転移酵素のプローブを作成する。 （４）上記プローブによって哺乳類の組織由来のｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングする。スクリーニング
によって、通常には上記転移酵素の完全長ｃＤＮＡを選
択する。
【００２４】しかし、本発明のＤＮＡの製造方法はこれ
に限定されるものではなく、上記ＰＣＲ法や、他の公知
のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡ
を製造することができる。
に限定されるものではなく、上記ＰＣＲ法や、他の公知
のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡ
を製造することができる。
【００２５】以下に、本発明のＤＮＡを製造する方法を
具体的に説明する。 （１）グルクロン酸転移酵素−Ｐ（ＧｌｃＡＴ−Ｐ）の
アミノ酸配列の決定 (i)ＧｌｃＡＴ−Ｐの精製 ＧｌｃＡＴ−Ｐは、例えばヒト、ラット、マウス、ウ
シ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ等の哺乳類の脳などのＧｌ
ｃＡＴ−Ｐを発現する組織の細胞から、通常のタンパク
質の精製方法、およびＧｌｃＡＴ−Ｐの基質（例えばウ
リジン２リン酸（ＵＤＰ）−グルクロン酸など）あるい
は阻害剤（前記糖脂質性阻害剤など）を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィを組み合わせることによって精
製することが可能であるが、ラットの脳を使用すること
が好ましい。具体的には、例えばJ.Biol. Chem. 267,
(32),22711-22714(1992)に記載された方法に従って行う
ことができる。
具体的に説明する。 （１）グルクロン酸転移酵素−Ｐ（ＧｌｃＡＴ−Ｐ）の
アミノ酸配列の決定 (i)ＧｌｃＡＴ−Ｐの精製 ＧｌｃＡＴ−Ｐは、例えばヒト、ラット、マウス、ウ
シ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ等の哺乳類の脳などのＧｌ
ｃＡＴ−Ｐを発現する組織の細胞から、通常のタンパク
質の精製方法、およびＧｌｃＡＴ−Ｐの基質（例えばウ
リジン２リン酸（ＵＤＰ）−グルクロン酸など）あるい
は阻害剤（前記糖脂質性阻害剤など）を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィを組み合わせることによって精
製することが可能であるが、ラットの脳を使用すること
が好ましい。具体的には、例えばJ.Biol. Chem. 267,
(32),22711-22714(1992)に記載された方法に従って行う
ことができる。
【００２６】(ii)ＧｌｃＡＴ−Ｐの部分アミノ酸配列の
決定 精製したＧｌｃＡＴ−Ｐを断片化する方法は特に限定は
されず、タンパク質分解酵素と共にインキュベートする
など公知の方法でタンパク質を断片化することができ
る。具体的なタンパク質分解酵素の例としてはトリプシ
ンが挙げられる。トリプシンでＧｌｃＡＴ−Ｐを処理
し、その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
などを用いて分離することができる。タンパク質分解酵
素消化後に生じたペプチドは、公知の方法によりアミノ
末端配列決定を行うことが可能である。具体的には例え
ばモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライ
ド バイオシステムス(Applied Biosystems)製）などを
用いてアミノ酸の配列を分析することが好ましいがこれ
に限定はされない。なお、業者に依頼してアミノ酸配列
を決定してもらうことも可能である。
決定 精製したＧｌｃＡＴ−Ｐを断片化する方法は特に限定は
されず、タンパク質分解酵素と共にインキュベートする
など公知の方法でタンパク質を断片化することができ
る。具体的なタンパク質分解酵素の例としてはトリプシ
ンが挙げられる。トリプシンでＧｌｃＡＴ−Ｐを処理
し、その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
などを用いて分離することができる。タンパク質分解酵
素消化後に生じたペプチドは、公知の方法によりアミノ
末端配列決定を行うことが可能である。具体的には例え
ばモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライ
ド バイオシステムス(Applied Biosystems)製）などを
用いてアミノ酸の配列を分析することが好ましいがこれ
に限定はされない。なお、業者に依頼してアミノ酸配列
を決定してもらうことも可能である。
【００２７】(iii)オリゴヌクレオチドプライマーの合
成 ＧｌｃＡＴ−Ｐの部分的アミノ酸配列に基づき、ＰＣＲ
用オリゴヌクレオチドプライマーを作成する。アミノ酸
配列のうち、なるべくコドンの縮重の少ない部位を用い
ることが好ましい。このような縮重オリゴヌクレオチド
プライマーの例を、図１に示す（センスプライマー：配
列番号６、９、１０；アンチセンスプライマー：配列番
号７、８、１１）。
成 ＧｌｃＡＴ−Ｐの部分的アミノ酸配列に基づき、ＰＣＲ
用オリゴヌクレオチドプライマーを作成する。アミノ酸
配列のうち、なるべくコドンの縮重の少ない部位を用い
ることが好ましい。このような縮重オリゴヌクレオチド
プライマーの例を、図１に示す（センスプライマー：配
列番号６、９、１０；アンチセンスプライマー：配列番
号７、８、１１）。
【００２８】（２）ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡの調
製とプローブの作成 ｍＲＮＡは、公知の方法（Kingston, R. S., (1991)
in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl.
14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wil
ey Interscience, New Yorkなど）で得ることができ
る。材料は、ＧｌｃＡＴ−ＰのｍＲＮＡを発現している
材料であれば限定はされないが、前記例示の哺乳類の組
織が好ましく特にラットの大脳皮質が好ましい。特に上
記酵素のｍＲＮＡを強く発現していることから、２週齢
前後のラットの大脳皮質が好ましい。
製とプローブの作成 ｍＲＮＡは、公知の方法（Kingston, R. S., (1991)
in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl.
14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wil
ey Interscience, New Yorkなど）で得ることができ
る。材料は、ＧｌｃＡＴ−ＰのｍＲＮＡを発現している
材料であれば限定はされないが、前記例示の哺乳類の組
織が好ましく特にラットの大脳皮質が好ましい。特に上
記酵素のｍＲＮＡを強く発現していることから、２週齢
前後のラットの大脳皮質が好ましい。
【００２９】全ＲＮＡは、前述の材料から通常用いられ
るｍＲＮＡの調製法により得ることができるが、グアニ
ジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston, R. B.,
(1991) in Current Protocols in Molecular Biology,
Suppl. 14, Unit 4.2, GreenePublishing Associates a
nd Wiley Interscience, New York）あるいはグアニジ
ウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（Ch
omczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162,
156-159(1987)）で調製することが簡便なため好まし
い。
るｍＲＮＡの調製法により得ることができるが、グアニ
ジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston, R. B.,
(1991) in Current Protocols in Molecular Biology,
Suppl. 14, Unit 4.2, GreenePublishing Associates a
nd Wiley Interscience, New York）あるいはグアニジ
ウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（Ch
omczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162,
156-159(1987)）で調製することが簡便なため好まし
い。
【００３０】逆転写反応及びＰＣＲ法を用いたＧｌｃ
ＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡの増幅 上記ｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマー或いは
オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により鋳型Ｄ
ＮＡを作成し、この鋳型ＤＮＡを基にＰＣＲ法により、
ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡを増幅することができ
る。逆転写反応は、通常の方法と同様にして行えばよい
が、具体的方法を示すならば以下の通りである。２０μ
ｇのｍＲＮＡ、４０ｐｍｏｌのランダムプライマー又は
縮重オリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μ
Ｍの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、２００単
位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコ(Gibco BRL)）、１
０ｍＭジチオスレートール（ＤＴＴ）、３０単位のヒト
胎盤由来リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）インヒビター
を含む緩衝液（終体積４０μ）を、４２℃で１時間イン
キュベートする。このようにして得られた逆転写反応産
物を基に、前述の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを
用いてＰＣＲ法を行う。具体的には上記の逆転写反応混
合液２μｌ（ｍＲＮＡ１μｇ相当）、１００ｐｍｏｌの
上記の縮重オリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５
００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、
１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体
積２５μｌ）に対し、９４℃３０秒、４５℃６０秒、７
２℃９０秒を３５サイクル繰り返し行う。その後、更に
上記縮重オリゴヌクレオチドプライマーの内部プライマ
ーを用いて９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０秒
を２０サイクル繰り返し行う。このＰＣＲ法による産物
を例えばｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクロー
ニングして既知の一般的な方法により塩基配列を決定す
る。この塩基配列より上記縮重オリゴヌクレオチドプラ
イマーの内、正確な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
プライマーのみを合成する。上記オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いてＰＣＲ法を行う。上記逆転写反応混合
液１μｌ、２０ｐｍｏｌの上記の正確な塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭ
の４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単
位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積２５μ
ｌ）に対し、９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０
秒を３５サイクル繰り返し行う。このようにして得られ
た部分的ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから完全長
ｃＤＮＡ（コード領域全長を含むｃＤＮＡ）をスクリー
ニングするためのハイブリダイゼーションプローブとし
て用いられる。特にハイブリダイゼーションプローブと
して使用する部分的ｃＤＮＡを増幅する際は、例えばラ
ンダムプライマーラベル法などにより[32P]ｄＣＴＰで
標識したｃＤＮＡライブラリースクリーニングのための
放射性プローブを作成することができる。
ＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡの増幅 上記ｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマー或いは
オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により鋳型Ｄ
ＮＡを作成し、この鋳型ＤＮＡを基にＰＣＲ法により、
ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡを増幅することができ
る。逆転写反応は、通常の方法と同様にして行えばよい
が、具体的方法を示すならば以下の通りである。２０μ
ｇのｍＲＮＡ、４０ｐｍｏｌのランダムプライマー又は
縮重オリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μ
Ｍの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、２００単
位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコ(Gibco BRL)）、１
０ｍＭジチオスレートール（ＤＴＴ）、３０単位のヒト
胎盤由来リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）インヒビター
を含む緩衝液（終体積４０μ）を、４２℃で１時間イン
キュベートする。このようにして得られた逆転写反応産
物を基に、前述の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを
用いてＰＣＲ法を行う。具体的には上記の逆転写反応混
合液２μｌ（ｍＲＮＡ１μｇ相当）、１００ｐｍｏｌの
上記の縮重オリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５
００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、
１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体
積２５μｌ）に対し、９４℃３０秒、４５℃６０秒、７
２℃９０秒を３５サイクル繰り返し行う。その後、更に
上記縮重オリゴヌクレオチドプライマーの内部プライマ
ーを用いて９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０秒
を２０サイクル繰り返し行う。このＰＣＲ法による産物
を例えばｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクロー
ニングして既知の一般的な方法により塩基配列を決定す
る。この塩基配列より上記縮重オリゴヌクレオチドプラ
イマーの内、正確な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
プライマーのみを合成する。上記オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いてＰＣＲ法を行う。上記逆転写反応混合
液１μｌ、２０ｐｍｏｌの上記の正確な塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭ
の４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単
位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積２５μ
ｌ）に対し、９４℃３０秒、４５℃６０秒、７２℃９０
秒を３５サイクル繰り返し行う。このようにして得られ
た部分的ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから完全長
ｃＤＮＡ（コード領域全長を含むｃＤＮＡ）をスクリー
ニングするためのハイブリダイゼーションプローブとし
て用いられる。特にハイブリダイゼーションプローブと
して使用する部分的ｃＤＮＡを増幅する際は、例えばラ
ンダムプライマーラベル法などにより[32P]ｄＣＴＰで
標識したｃＤＮＡライブラリースクリーニングのための
放射性プローブを作成することができる。
【００３１】（３）ｃＤＮＡライブラリーの作成 (i)ｃＤＮＡの合成と組み換えＤＮＡの作成 ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により通
常の方法を用いて合成することができる。合成する際は
市販のｃＤＮＡ合成用キットを用いるのが便利である。
例えばＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｋｉｔ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ー）を用いると、ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡをクロー
ニングベクターに連結することもできる。また、市販の
ｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、より簡便に
ｃＤＮＡを得ることも可能である。本発明においては、
クロンテック製の１８日齢のＳＤ−ラットの胎児脳から
得られたｍＲＮＡから構築したｃＤＮＡをλｇｔ１１に
導入したライブラリーを用いている。クローニングベク
ターに結合した状態のこれらの組み換えＤＮＡを宿主細
菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。用いる
宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターにより選
択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コ
リ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とするクロー
ニングベクターと大腸菌との組合せが頻用されているが
これに限定はされない。トランスフェクションは通常、
組み換えＤＮＡと３０ｍＭ塩化カルシウムの存在下で細
胞膜の透過性を変化させた大腸菌とを混合することによ
り行われる。λｇｔ１１やＬａｍｄａ ＺＡＰのような
λファージベクターの場合、組み換えＤＮＡを直接塩化
カルシウム処理した大腸菌に導入もできるが、予め試験
管中でファージ外殻にいれて（in vitroパッケージング
という）、大腸菌に効率よく感染させる方法が一般に使
用されており、市販されているパッケージング用のキッ
ト（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン
（Stratagene）製など）を用いてパッケージングを行う
ことも可能である。パッケージングした組み換えＤＮＡ
は、大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクロ
ーニングベクターによって用いる大腸菌株を選択する必
要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクロー
ニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質に対
する耐性の性質があってはならず、また、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）などの遺伝子を含むクロー
ニングベクターを用いる場合は、β−ガラクトシダーゼ
活性を発現しない大腸菌を選択する必要がある。このこ
とは、組み換えＤＮＡがトランスフェクションされた大
腸菌をスクリーニングするために必要なことである。例
えば、λｇｔ１１やＬａｍｄａ ＺＡＰクローニングベ
クターを用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０r-や
Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を選択
すればよい。組み換えＤＮＡや組み換えプラスミドが導
入された大腸菌は抗生物質に対する耐性の獲得や、β−
ガラクトシダーゼ活性の獲得などによりスクリーニング
することが可能である。具体的には、大腸菌を寒天培地
にまき、形成されたプラークを選択すればよい。生育し
た大腸菌（組み換えＤＮＡがトランスフェクションされ
た大腸菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。プラ
スミドにブルースクリプトを用いた場合は、指示菌と共
に、軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラー
クを形成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたプラス
ミドを保持するファージプラークはβ−ガラクトシダー
ゼ活性を発現しないので、容易に選択することができ
る。
常の方法を用いて合成することができる。合成する際は
市販のｃＤＮＡ合成用キットを用いるのが便利である。
例えばＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｋｉｔ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ー）を用いると、ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡをクロー
ニングベクターに連結することもできる。また、市販の
ｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、より簡便に
ｃＤＮＡを得ることも可能である。本発明においては、
クロンテック製の１８日齢のＳＤ−ラットの胎児脳から
得られたｍＲＮＡから構築したｃＤＮＡをλｇｔ１１に
導入したライブラリーを用いている。クローニングベク
ターに結合した状態のこれらの組み換えＤＮＡを宿主細
菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。用いる
宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターにより選
択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コ
リ：Escherichia coli(E. coli)）を宿主とするクロー
ニングベクターと大腸菌との組合せが頻用されているが
これに限定はされない。トランスフェクションは通常、
組み換えＤＮＡと３０ｍＭ塩化カルシウムの存在下で細
胞膜の透過性を変化させた大腸菌とを混合することによ
り行われる。λｇｔ１１やＬａｍｄａ ＺＡＰのような
λファージベクターの場合、組み換えＤＮＡを直接塩化
カルシウム処理した大腸菌に導入もできるが、予め試験
管中でファージ外殻にいれて（in vitroパッケージング
という）、大腸菌に効率よく感染させる方法が一般に使
用されており、市販されているパッケージング用のキッ
ト（Gigapack II packaging extract、ストラタジーン
（Stratagene）製など）を用いてパッケージングを行う
ことも可能である。パッケージングした組み換えＤＮＡ
は、大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクロ
ーニングベクターによって用いる大腸菌株を選択する必
要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクロー
ニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質に対
する耐性の性質があってはならず、また、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）などの遺伝子を含むクロー
ニングベクターを用いる場合は、β−ガラクトシダーゼ
活性を発現しない大腸菌を選択する必要がある。このこ
とは、組み換えＤＮＡがトランスフェクションされた大
腸菌をスクリーニングするために必要なことである。例
えば、λｇｔ１１やＬａｍｄａ ＺＡＰクローニングベ
クターを用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０r-や
Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を選択
すればよい。組み換えＤＮＡや組み換えプラスミドが導
入された大腸菌は抗生物質に対する耐性の獲得や、β−
ガラクトシダーゼ活性の獲得などによりスクリーニング
することが可能である。具体的には、大腸菌を寒天培地
にまき、形成されたプラークを選択すればよい。生育し
た大腸菌（組み換えＤＮＡがトランスフェクションされ
た大腸菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。プラ
スミドにブルースクリプトを用いた場合は、指示菌と共
に、軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラー
クを形成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたプラス
ミドを保持するファージプラークはβ−ガラクトシダー
ゼ活性を発現しないので、容易に選択することができ
る。
【００３２】(ii)ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡスクリ
ーニング 次に上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーか
ら、ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡを有するファージク
ローンを、ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡをプローブと
してハイブリダイゼーションによりスクリーニングする
ことができる。スクリーニングは例えば、上記のプラス
ミドを保持した大腸菌のコロニーをニトロセルロース膜
やナイロン膜等にレプリカし、当該膜上で部分的ｃＤＮ
Ａプローブとハイブリダイゼーションすることによって
容易に行うことができる。選択された陽性クローンか
ら、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断す
ることによりＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを切り出すことが
できる。
ーニング 次に上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーか
ら、ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡを有するファージク
ローンを、ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分的ｃＤＮＡをプローブと
してハイブリダイゼーションによりスクリーニングする
ことができる。スクリーニングは例えば、上記のプラス
ミドを保持した大腸菌のコロニーをニトロセルロース膜
やナイロン膜等にレプリカし、当該膜上で部分的ｃＤＮ
Ａプローブとハイブリダイゼーションすることによって
容易に行うことができる。選択された陽性クローンか
ら、ファージＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断す
ることによりＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを切り出すことが
できる。
【００３３】(iii)ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡの塩基配列
の決定 上述のＰＣＲ法を様々なオリゴヌクレオチドプライマー
及びオリゴｄＴプライマーの組合せにより行い作成した
ＤＮＡ断片及び上記のクローニングにより得られたｃＤ
ＮＡをそのまま、あるいはｐＣＲIIなどの適当なプラス
ミドにサブクローニングして、既知の一般的な方法によ
り塩基配列を決定する。
の決定 上述のＰＣＲ法を様々なオリゴヌクレオチドプライマー
及びオリゴｄＴプライマーの組合せにより行い作成した
ＤＮＡ断片及び上記のクローニングにより得られたｃＤ
ＮＡをそのまま、あるいはｐＣＲIIなどの適当なプラス
ミドにサブクローニングして、既知の一般的な方法によ
り塩基配列を決定する。
【００３４】上記のようにして決定されたＧｌｃＡＴ−
ＰｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予想される
アミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列
番号２に示す。
ＰｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予想される
アミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列
番号２に示す。
【００３５】可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐの
ポリペプチドをコードするＤＮＡは以下のようにして取
得できる。すなわち、先ず、配列番号１に示す塩基配列
に基づき、Ｎ−末端側で適当な短縮化形態となるように
選択したプライマーを合成し、クローン化したＧｌｃＡ
Ｔ−ＰのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅す
る。例えば、Ｎ−末端の７４残基が欠失した短縮化形態
のポリペプチドをコードするＤＮＡを得る場合には、配
列番号１９及び２０に示す塩基配列を有するプライマー
をそれぞれ５’プライマー及び３’プライマーとして用
いてＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰ
ＣＲ産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得る。
ポリペプチドをコードするＤＮＡは以下のようにして取
得できる。すなわち、先ず、配列番号１に示す塩基配列
に基づき、Ｎ−末端側で適当な短縮化形態となるように
選択したプライマーを合成し、クローン化したＧｌｃＡ
Ｔ−ＰのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅す
る。例えば、Ｎ−末端の７４残基が欠失した短縮化形態
のポリペプチドをコードするＤＮＡを得る場合には、配
列番号１９及び２０に示す塩基配列を有するプライマー
をそれぞれ５’プライマー及び３’プライマーとして用
いてＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰ
ＣＲ産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得る。
【００３６】＜２＞本発明ＤＮＡを利用したＧｌｃＡＴ
−Ｐポリペプチドの製造方法 上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地
で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培
養物中に生成蓄積させ、その培養物から本発明ポリペプ
チドを採取することによって、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペ
プチドを製造することができる。
−Ｐポリペプチドの製造方法 上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地
で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培
養物中に生成蓄積させ、その培養物から本発明ポリペプ
チドを採取することによって、ＧｌｃＡＴ−Ｐのポリペ
プチドを製造することができる。
【００３７】本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、発
現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組み換えプ
ラスミドを構築し、この組み換えプラスミドを用いて形
質転換を行うことによって得ることができる。細胞とし
ては大腸菌などの原核細胞や、哺乳類などの真核細胞が
例示される。
現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組み換えプ
ラスミドを構築し、この組み換えプラスミドを用いて形
質転換を行うことによって得ることができる。細胞とし
ては大腸菌などの原核細胞や、哺乳類などの真核細胞が
例示される。
【００３８】組み換えプラスミドの構築の具体例として
は以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明のＤＮＡ
をｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulso
n,J.C.,J. Biol. Chem.,269,1394-1401(1994)）のＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域に通常の方法により組み込み、
ＧｌｃＡＴ−Ｐとインスリンシグナル配列及びプロテイ
ンＡの融合タンパク質の遺伝子を同一読み出し領域に有
するベクターを構築する。次いで、このベクターから融
合タンパク質をコードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上
記と同様の操作によりｐＥＦ−ＢＯＳ(Mizushima, S. a
nd Nagata, S.,Nucleic Acids Res., 18, 5322(1990))
のＸｂａＩ領域に連結させる。
は以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明のＤＮＡ
をｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulso
n,J.C.,J. Biol. Chem.,269,1394-1401(1994)）のＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域に通常の方法により組み込み、
ＧｌｃＡＴ−Ｐとインスリンシグナル配列及びプロテイ
ンＡの融合タンパク質の遺伝子を同一読み出し領域に有
するベクターを構築する。次いで、このベクターから融
合タンパク質をコードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上
記と同様の操作によりｐＥＦ−ＢＯＳ(Mizushima, S. a
nd Nagata, S.,Nucleic Acids Res., 18, 5322(1990))
のＸｂａＩ領域に連結させる。
【００３９】本製造方法においては、タンパク質の製造
に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することがで
き、例えば、ＣＯＳ−１細胞などの哺乳類細胞と、ｐＥ
Ｆ−ＢＯＳなどの哺乳類細胞用発現ベクターの組合せを
採用することが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿
主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することがで
き、例えば、ＣＯＳ−１細胞などの哺乳類細胞と、ｐＥ
Ｆ−ＢＯＳなどの哺乳類細胞用発現ベクターの組合せを
採用することが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿
主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００４０】本発明ＤＮＡは、直接発現させてもよい
し、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現
させてもよく、また、本発明ＤＮＡは、全長を発現させ
てもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよ
い。上記のようなポリペプチドを発現させるためのＤＮ
ＡやそのＤＮＡを発現させるための方法も本発明に包含
される。
し、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現
させてもよく、また、本発明ＤＮＡは、全長を発現させ
てもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよ
い。上記のようなポリペプチドを発現させるためのＤＮ
ＡやそのＤＮＡを発現させるための方法も本発明に包含
される。
【００４１】培養物からの上記ポリペプチドの採取は、
公知のポリペプチドの精製方法によって行うことができ
る。具体的には例えば、アシアロオロソムコイドあるい
はＵＤＰ−グルクロン酸などを結合したセファロースカ
ラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーが挙げ
られる。なお培養物には、培地及び当該培地中の細胞が
包含される。
公知のポリペプチドの精製方法によって行うことができ
る。具体的には例えば、アシアロオロソムコイドあるい
はＵＤＰ−グルクロン酸などを結合したセファロースカ
ラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーが挙げ
られる。なお培養物には、培地及び当該培地中の細胞が
包含される。
【００４２】このようにして得られるＧｌｃＡＴ−Ｐ及
びその融合タンパク質を用いて前述のＨＮＫ−１を大量
に合成することが可能である。合成したＨＮＫ−１抗原
は、例えば該抗原に対する抗体が血中で増加することが
知られている自己免疫疾患に伴う末梢神経障害を検出す
る診断薬としての医薬用途などに使用することが可能で
ある。すなわち具体的には、前記抗体を該抗原に結合さ
せ、結合した抗体量を測定することにより前記疾患を検
出することができる。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐ、その融合
タンパク質及び本発明ＤＮＡを組み込んだ細胞などは、
ＨＮＫ−１抗原の神経系の発達や機能、免疫系の機構、
更に生体内におけるＧｌｃＡＴ−Ｐの機能の解明を進め
る為の試薬として研究用途に使用することも可能であ
る。
びその融合タンパク質を用いて前述のＨＮＫ−１を大量
に合成することが可能である。合成したＨＮＫ−１抗原
は、例えば該抗原に対する抗体が血中で増加することが
知られている自己免疫疾患に伴う末梢神経障害を検出す
る診断薬としての医薬用途などに使用することが可能で
ある。すなわち具体的には、前記抗体を該抗原に結合さ
せ、結合した抗体量を測定することにより前記疾患を検
出することができる。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐ、その融合
タンパク質及び本発明ＤＮＡを組み込んだ細胞などは、
ＨＮＫ−１抗原の神経系の発達や機能、免疫系の機構、
更に生体内におけるＧｌｃＡＴ−Ｐの機能の解明を進め
る為の試薬として研究用途に使用することも可能であ
る。
【００４３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳述する
が、本発明はその要旨を超えない限りこれに限定される
ものではない。 ＜１＞ラットのＧｌｃＡＴ−Ｐの調製及びアミノ酸配列
の分析 J. Biol. Chem. 267, 22711-22714に記載の方法により
ＵＤＰ−グルクロン酸を結合したセファロースカラムを
使ったアフィニティクロマトグラフィーによりＧｌｃＡ
Ｔ−Ｐを精製した。ＧｌｃＡＴ−Ｐは、同文献に記載さ
れた条件でＵＤＰ−グルクロン酸を結合したセファロー
スカラムを使ったアフィニティークロマトグラフィーを
行うと、0.4%(v/v)Nonidet P-40（商品名）、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液(pH 6.5)で溶出される。
が、本発明はその要旨を超えない限りこれに限定される
ものではない。 ＜１＞ラットのＧｌｃＡＴ−Ｐの調製及びアミノ酸配列
の分析 J. Biol. Chem. 267, 22711-22714に記載の方法により
ＵＤＰ−グルクロン酸を結合したセファロースカラムを
使ったアフィニティクロマトグラフィーによりＧｌｃＡ
Ｔ−Ｐを精製した。ＧｌｃＡＴ−Ｐは、同文献に記載さ
れた条件でＵＤＰ−グルクロン酸を結合したセファロー
スカラムを使ったアフィニティークロマトグラフィーを
行うと、0.4%(v/v)Nonidet P-40（商品名）、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液(pH 6.5)で溶出される。
【００４４】精製したＧｌｃＡＴ−ＰをｐＨ９．０の５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で３７℃の条件下で
一晩トリプシンにより消化した。この消化産物を回収し
てフィルターにかけ、凍結乾燥した。１％（Ｖ／Ｖ）ア
セトニトリルを含む移動相Ａ（０．０６％（Ｖ／Ｖ）ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ））１８μｌにこの凍結乾燥物
を溶解し、逆相カラム（２．１×１５０ｍｍ）でＨＰＬ
Ｃを行った。ペプチドの溶出は、流速３．３μｌ／ｍｉ
ｎ、１００分間で２％〜１００％までの移動相Ｂ（０．
０５２％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡを含む８０％（Ｖ／Ｖ）アセ
トニトリル）の濃度勾配により行った。ペプチドの画分
は２１４ｎｍの吸光度をモニターしながら手作業で回収
して、アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列決定はモ
デル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド
バイオシステムス（Applied Biosystems）製）で行っ
た。表−１に結果を示す。下線は縮重オリゴヌクレオチ
ドプライマーの合成の基となったアミノ酸配列である。
また、小文字で表したアミノ酸は同定が不確かであった
ものを示す。
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で３７℃の条件下で
一晩トリプシンにより消化した。この消化産物を回収し
てフィルターにかけ、凍結乾燥した。１％（Ｖ／Ｖ）ア
セトニトリルを含む移動相Ａ（０．０６％（Ｖ／Ｖ）ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ））１８μｌにこの凍結乾燥物
を溶解し、逆相カラム（２．１×１５０ｍｍ）でＨＰＬ
Ｃを行った。ペプチドの溶出は、流速３．３μｌ／ｍｉ
ｎ、１００分間で２％〜１００％までの移動相Ｂ（０．
０５２％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡを含む８０％（Ｖ／Ｖ）アセ
トニトリル）の濃度勾配により行った。ペプチドの画分
は２１４ｎｍの吸光度をモニターしながら手作業で回収
して、アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列決定はモ
デル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド
バイオシステムス（Applied Biosystems）製）で行っ
た。表−１に結果を示す。下線は縮重オリゴヌクレオチ
ドプライマーの合成の基となったアミノ酸配列である。
また、小文字で表したアミノ酸は同定が不確かであった
ものを示す。
【００４５】
【表１】 表−１ ──────────────────────────────────── ヘ゜フ゜チト゛番号 アミノ酸配列 配列番号 ──────────────────────────────────── 1 MANTLLHVPNLHWLVVEDAPR 3 2 STQPGVVYFADDDNTYsLELFEEMs 4 3 TVFDPHvPFAIDMAGFAVNLgr 5 ────────────────────────────────────
【００４６】＜２＞ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分ｃＤＮＡのＰＣ
Ｒによる増幅 （１）ＰＣＲ用プライマーの作成 上記ペプチドの１、２及び３の下線のアミノ酸配列に基
づいて、図１に示すデオキシイノシン置換を有する末端
及び内部のプライマーの縮重オリゴヌクレオチドを作成
した（鋳型ＤＮＡ配列を持つプライマーPr.1-s（配列番
号６）、Pr.2-so（配列番号９）、Pr.2-si（配列番号１
０）、鋳型の相補的配列を持つプライマーPr.1-ao（配
列番号７）、Pr.1-ai（配列番号８）、Pr.2-a（配列番
号１１））。
Ｒによる増幅 （１）ＰＣＲ用プライマーの作成 上記ペプチドの１、２及び３の下線のアミノ酸配列に基
づいて、図１に示すデオキシイノシン置換を有する末端
及び内部のプライマーの縮重オリゴヌクレオチドを作成
した（鋳型ＤＮＡ配列を持つプライマーPr.1-s（配列番
号６）、Pr.2-so（配列番号９）、Pr.2-si（配列番号１
０）、鋳型の相補的配列を持つプライマーPr.1-ao（配
列番号７）、Pr.1-ai（配列番号８）、Pr.2-a（配列番
号１１））。
【００４７】（２）ＰＣＲ法 ２週齢のラットの大脳皮質からグアニジンチオシアネー
ト−フェノール−クロロホルム法により調製した全ＲＮ
Ａ（２０μｇ）を鋳型とし、ランダムプライマーを用い
てｃＤＮＡの一本鎖を合成し（全量４０μｌ）、これを
逆転写反応混合液としてＰＣＲの鋳型として使用した。
ＰＣＲ反応液は、２μｌの上記逆転写反応混合液、１０
０ｐｍｏｌの末端プライマーpr.1-s及びpr.1-aoの混合
物（又はpr.2-so及びpr.2-a）、それぞれ５００μＭの
４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、及び１．２５
ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン エルマ
ー(Perkin Elmer)製）を含む混合液２５μｌとした。増
幅は以下のように行った。解離反応は９４℃で３０秒、
アニーリングは４５℃で６０秒、伸長反応は７２℃で９
０秒の条件で３５サイクル行った。この操作によって生
じた増幅物質１μｌに対し、プライマーとしてpr.1-s及
びpr.1-aiの混合物（又はpr.2-si及びpr.2-a）を用いて
再度ＰＣＲを行った。増幅は、９４℃で３０秒、４５℃
で６０秒、７２℃で９０秒のサイクルを２０回繰り返し
て行った。この操作によって生じた増幅物質を常法によ
りアガロースゲル電気泳動を行い解析すると、pr.1-s及
びpr.1-aiを用いて作製した増幅物質では約２６０ｂｐ
（Ａ１）、pr.2-si及びpr.2-aを用いて作製した増幅物
質では約２１０ｂｐ（Ａ２）のＤＮＡのバンドが検出さ
れた。
ト−フェノール−クロロホルム法により調製した全ＲＮ
Ａ（２０μｇ）を鋳型とし、ランダムプライマーを用い
てｃＤＮＡの一本鎖を合成し（全量４０μｌ）、これを
逆転写反応混合液としてＰＣＲの鋳型として使用した。
ＰＣＲ反応液は、２μｌの上記逆転写反応混合液、１０
０ｐｍｏｌの末端プライマーpr.1-s及びpr.1-aoの混合
物（又はpr.2-so及びpr.2-a）、それぞれ５００μＭの
４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、及び１．２５
ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン エルマ
ー(Perkin Elmer)製）を含む混合液２５μｌとした。増
幅は以下のように行った。解離反応は９４℃で３０秒、
アニーリングは４５℃で６０秒、伸長反応は７２℃で９
０秒の条件で３５サイクル行った。この操作によって生
じた増幅物質１μｌに対し、プライマーとしてpr.1-s及
びpr.1-aiの混合物（又はpr.2-si及びpr.2-a）を用いて
再度ＰＣＲを行った。増幅は、９４℃で３０秒、４５℃
で６０秒、７２℃で９０秒のサイクルを２０回繰り返し
て行った。この操作によって生じた増幅物質を常法によ
りアガロースゲル電気泳動を行い解析すると、pr.1-s及
びpr.1-aiを用いて作製した増幅物質では約２６０ｂｐ
（Ａ１）、pr.2-si及びpr.2-aを用いて作製した増幅物
質では約２１０ｂｐ（Ａ２）のＤＮＡのバンドが検出さ
れた。
【００４８】＜３＞ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡ （１）ハイブリダイゼーション用プローブの作成 上記Ａ１及びＡ２の増幅物質を常法によりｐＣＲＩＩ
（インビトロゲン(Invitrogen)製）にサブクローンし、
塩基配列を解析した。塩基配列はABI PRISM Dyetermina
tor Cycle Sequencing Ready Reaction kit（パーキン
エルマー(PERKIN ELMER)製）を使用して解析した。解
析結果に基づいて、Ａ１増幅時に使用したプライマーp
r.1-sの隣に位置する配列（pr.a（配列番号１２））及
びＡ２増幅時に使用したプライマーpr.2-siの隣に位置
する配列（pr.b（配列番号１３））を合成した。２０ｐ
ｍｏｌのpr.a及びpr.b、２μｌの逆転写反応混合液、な
らびに５００μＭの４種類のデオキシヌクレオチド三リ
ン酸を含む最終量２５μｌの溶液でＰＣＲを行い増幅物
質を調製した（gf.a）。ＰＣＲは上記同様、９４℃３０
秒、４７℃６０秒、７２℃５０秒のサイクルを３５回繰
り返すことによって行った。このようにして増幅された
gf.aをｐＣＲIIへサブクローニングし、塩基配列を決定
した（配列番号１６）。また、このプラスミドを大量に
調製後、ＥｃｏＲＩで消化して切り出し、大量のgf.aを
得て、スクリーニングに使用した。
（インビトロゲン(Invitrogen)製）にサブクローンし、
塩基配列を解析した。塩基配列はABI PRISM Dyetermina
tor Cycle Sequencing Ready Reaction kit（パーキン
エルマー(PERKIN ELMER)製）を使用して解析した。解
析結果に基づいて、Ａ１増幅時に使用したプライマーp
r.1-sの隣に位置する配列（pr.a（配列番号１２））及
びＡ２増幅時に使用したプライマーpr.2-siの隣に位置
する配列（pr.b（配列番号１３））を合成した。２０ｐ
ｍｏｌのpr.a及びpr.b、２μｌの逆転写反応混合液、な
らびに５００μＭの４種類のデオキシヌクレオチド三リ
ン酸を含む最終量２５μｌの溶液でＰＣＲを行い増幅物
質を調製した（gf.a）。ＰＣＲは上記同様、９４℃３０
秒、４７℃６０秒、７２℃５０秒のサイクルを３５回繰
り返すことによって行った。このようにして増幅された
gf.aをｐＣＲIIへサブクローニングし、塩基配列を決定
した（配列番号１６）。また、このプラスミドを大量に
調製後、ＥｃｏＲＩで消化して切り出し、大量のgf.aを
得て、スクリーニングに使用した。
【００４９】（２）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡクローンの
スクリーニング ＳＤラットの１８日齢の胎児の脳由来のｍＲＮＡから構
築したλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをクロ−ンテッ
ク(Clonetec)社から購入した。このラット胎児脳ｃＤＮ
Ａライブラリーを、宿主の大腸菌（Escherichia coli）
Ｙ１０９０r-に感染させ、プレートに重層し、プラーク
を形成させた。１５０ｍｍのディッシュ１０枚を用いて
約５×１０5個のプラークをスクリーニングした。生じ
たプラークをＯＰＴＩＴＲＡＮ ＢＡ−Ｓ ８５ ニト
ロセルロース膜（シュライシャーアンド シュエル(Sch
leicher & Schuell)製）に転写した後ＵＶクロスリンク
を行った後、５０％ホルムアミド、５０ｍＭ、ｐＨ７．
０リン酸緩衝液、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン
酸ナトリウム）、０．５％ スキムミルク、０．１％
ＳＤＳと１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含む溶液
中、４２℃で１６時間プレハイブリダイズした。その
後、32Ｐでラベルしたgf.aを上記バッファーに加え、４
２℃で１６時間ハイブリダイズした。フィルターを、室
温で２×ＳＳＣ、０．５×ＳＤＳ、６５℃で１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ ＳＤＳ、更に６５℃で０．２×ＳＳＣに
より洗浄し、オートラジオグラフィーにより１７個の陽
性クローンを検出し、８つのクローンを単離した。
スクリーニング ＳＤラットの１８日齢の胎児の脳由来のｍＲＮＡから構
築したλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをクロ−ンテッ
ク(Clonetec)社から購入した。このラット胎児脳ｃＤＮ
Ａライブラリーを、宿主の大腸菌（Escherichia coli）
Ｙ１０９０r-に感染させ、プレートに重層し、プラーク
を形成させた。１５０ｍｍのディッシュ１０枚を用いて
約５×１０5個のプラークをスクリーニングした。生じ
たプラークをＯＰＴＩＴＲＡＮ ＢＡ−Ｓ ８５ ニト
ロセルロース膜（シュライシャーアンド シュエル(Sch
leicher & Schuell)製）に転写した後ＵＶクロスリンク
を行った後、５０％ホルムアミド、５０ｍＭ、ｐＨ７．
０リン酸緩衝液、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン
酸ナトリウム）、０．５％ スキムミルク、０．１％
ＳＤＳと１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含む溶液
中、４２℃で１６時間プレハイブリダイズした。その
後、32Ｐでラベルしたgf.aを上記バッファーに加え、４
２℃で１６時間ハイブリダイズした。フィルターを、室
温で２×ＳＳＣ、０．５×ＳＤＳ、６５℃で１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ ＳＤＳ、更に６５℃で０．２×ＳＳＣに
より洗浄し、オートラジオグラフィーにより１７個の陽
性クローンを検出し、８つのクローンを単離した。
【００５０】（３）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡクローンの
塩基配列 上記８つのクローンからファージＤＮＡを調製し、ベク
ターＤＮＡからｃＤＮＡ挿入断片をＰＣＲ法を行うこと
により得た。このｃＤＮＡ断片を鋳型としてABI PRISM
Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit
（パーキン エルマー(PERKIN ELMER)製）を用いたデオ
キシチェーンターミネーション法（Sanger, F., Nickle
ns, S., and Coulson, A. R.(1977)Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 74, 5463-5467）により、両方の鎖のヌク
レオチド配列を独立に決定した。その結果、全てに共通
した部位gf.bの塩基配列（配列番号１７）が決定され
た。
塩基配列 上記８つのクローンからファージＤＮＡを調製し、ベク
ターＤＮＡからｃＤＮＡ挿入断片をＰＣＲ法を行うこと
により得た。このｃＤＮＡ断片を鋳型としてABI PRISM
Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit
（パーキン エルマー(PERKIN ELMER)製）を用いたデオ
キシチェーンターミネーション法（Sanger, F., Nickle
ns, S., and Coulson, A. R.(1977)Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 74, 5463-5467）により、両方の鎖のヌク
レオチド配列を独立に決定した。その結果、全てに共通
した部位gf.bの塩基配列（配列番号１７）が決定され
た。
【００５１】（４）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡ５’末端部
の合成と塩基配列の決定 上記gf.bの塩基配列より、５’末端部の塩基配列が欠損
していることが明らかとなったため、ｃＤＮＡの５’末
端側は２週齢のラットの大脳皮質由来のｍＲＮＡから直
接増幅した。pr.bを用いて逆転写反応を行った後、その
３’末端にターミナルデオキシトランスフェラーゼを用
いてポリＡを付加した。この反応生成物を、オリゴｄＴ
とpr.c-1（配列番号１４）をプライマーとして上記と同
条件でＰＣＲ法を行い、その後、オリゴｄＴとpr.c-2
（配列番号１５）をプライマーとして更に上記と同条件
でＰＣＲ法により増幅した。その結果、約６００ｂｐの
ＤＮＡ断片が得られ（gf.c（配列番号１８））、この断
片を既知の方法により増幅した後、インビトロゲン製の
ｐＣＲIIにサブクローニングして、上記同様の方法によ
り両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。
の合成と塩基配列の決定 上記gf.bの塩基配列より、５’末端部の塩基配列が欠損
していることが明らかとなったため、ｃＤＮＡの５’末
端側は２週齢のラットの大脳皮質由来のｍＲＮＡから直
接増幅した。pr.bを用いて逆転写反応を行った後、その
３’末端にターミナルデオキシトランスフェラーゼを用
いてポリＡを付加した。この反応生成物を、オリゴｄＴ
とpr.c-1（配列番号１４）をプライマーとして上記と同
条件でＰＣＲ法を行い、その後、オリゴｄＴとpr.c-2
（配列番号１５）をプライマーとして更に上記と同条件
でＰＣＲ法により増幅した。その結果、約６００ｂｐの
ＤＮＡ断片が得られ（gf.c（配列番号１８））、この断
片を既知の方法により増幅した後、インビトロゲン製の
ｐＣＲIIにサブクローニングして、上記同様の方法によ
り両方の鎖のヌクレオチド配列を独立に決定した。
【００５２】（５）ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡ全長に渡る
塩基配列の決定 gf.bとgf.cの塩基配列を組み合わせることによりＧｌｃ
ＡＴ−ＰｃＤＮＡの全塩基配列が決定された。なお、g
f.a、gf.b及びgf.cの各断片並びに各プライマーの位置
関係を図２に示す。
塩基配列の決定 gf.bとgf.cの塩基配列を組み合わせることによりＧｌｃ
ＡＴ−ＰｃＤＮＡの全塩基配列が決定された。なお、g
f.a、gf.b及びgf.cの各断片並びに各プライマーの位置
関係を図２に示す。
【００５３】このようにして判明したＧｌｃＡＴ−Ｐの
ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）から推定されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。１つのオ
ープンリーディングフレームは３４７アミノ酸残基から
なり、このｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
分子量はそのアミノ酸構成から３９７０６と推定され
る。また、このポリペプチドはＮ−結合グリコシレーシ
ョンが可能な部位を３カ所有する。このポリペプチドが
膜貫通領域を有するか否か、有するとすればその位置を
決定するために、推定されたアミノ酸配列からハイドロ
パシープロットを作成した。ハイドロパシープロット
は、Hopp and Woodsの方法（Hopp,T.P. andWoods,K.R.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78,3824-3828(1981)）に
より、５アミノ酸のウィンドウで計算した。プロットの
解析から、アミノ末端側に、長さ１７残基からなる１つ
の顕著な疎水領域が認められ、膜貫通領域であることが
推定された。このポリペプチドは膜貫通領域のＮ末端側
には１９アミノ酸残基からなる領域を有するタイプIIの
膜タンパク質であることが明らかになった。
ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）から推定されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。１つのオ
ープンリーディングフレームは３４７アミノ酸残基から
なり、このｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
分子量はそのアミノ酸構成から３９７０６と推定され
る。また、このポリペプチドはＮ−結合グリコシレーシ
ョンが可能な部位を３カ所有する。このポリペプチドが
膜貫通領域を有するか否か、有するとすればその位置を
決定するために、推定されたアミノ酸配列からハイドロ
パシープロットを作成した。ハイドロパシープロット
は、Hopp and Woodsの方法（Hopp,T.P. andWoods,K.R.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78,3824-3828(1981)）に
より、５アミノ酸のウィンドウで計算した。プロットの
解析から、アミノ末端側に、長さ１７残基からなる１つ
の顕著な疎水領域が認められ、膜貫通領域であることが
推定された。このポリペプチドは膜貫通領域のＮ末端側
には１９アミノ酸残基からなる領域を有するタイプIIの
膜タンパク質であることが明らかになった。
【００５４】（６）ノザンブロッティング 成体ラットの組織（大脳皮質、小脳、脳全体、肺、肝
臓、腎臓、回腸、精巣、リンパ節、胸腺、脾臓、心臓及
びマクロファージ）からAnal. Biochem. 162, 156-159
記載のグアニジウムチオシアネート−フェノール−クロ
ロホルム法により全ＲＮＡを調製した。１％アガロース
−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により各レーン１０μ
ｇずつの各ＲＮＡを分子量分画し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+
ナイロン膜（アマシャム(Amersham)製）にブロッティ
ングした。このナイロン膜に32ＰラベルしたＧｌｃＡＴ
−ＰｃＤＮＡを６５℃で１４時間、７％ ＳＤＳ、１ｍ
ＭＥＤＴＡ及び１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
含む０．５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）溶液中でハ
イブリダイズさせた。洗浄は、室温で２×ＳＳＣ、１％
ＳＤＳ、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、更
に６５℃で０．１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣで行った。
その後、放射活性をイメージアナライザー（Ｂａｓ ２
０００、富士フィルム製）で解析した。この結果、大脳
皮質、小脳及び脳全体でＧｌｃＡＴ−ＰのＲＮＡ（主要
成分の4.0kb及びマイナー成分の9.1kb）が発現している
ことが明らかになった。肝臓、腎臓などの末梢組織では
発現は認められなかった。
臓、腎臓、回腸、精巣、リンパ節、胸腺、脾臓、心臓及
びマクロファージ）からAnal. Biochem. 162, 156-159
記載のグアニジウムチオシアネート−フェノール−クロ
ロホルム法により全ＲＮＡを調製した。１％アガロース
−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により各レーン１０μ
ｇずつの各ＲＮＡを分子量分画し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+
ナイロン膜（アマシャム(Amersham)製）にブロッティ
ングした。このナイロン膜に32ＰラベルしたＧｌｃＡＴ
−ＰｃＤＮＡを６５℃で１４時間、７％ ＳＤＳ、１ｍ
ＭＥＤＴＡ及び１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
含む０．５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）溶液中でハ
イブリダイズさせた。洗浄は、室温で２×ＳＳＣ、１％
ＳＤＳ、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、更
に６５℃で０．１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣで行った。
その後、放射活性をイメージアナライザー（Ｂａｓ ２
０００、富士フィルム製）で解析した。この結果、大脳
皮質、小脳及び脳全体でＧｌｃＡＴ−ＰのＲＮＡ（主要
成分の4.0kb及びマイナー成分の9.1kb）が発現している
ことが明らかになった。肝臓、腎臓などの末梢組織では
発現は認められなかった。
【００５５】（７）発現用ベクターの構築 配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、２週
齢のラットの脳のｍＲＮＡから５’側プライマーと、終
止コドンの１８ｂｐ５’寄りにＢａｍＨＩ領域を有する
３’側プライマーを用いて上記同様の手法を用いて逆転
写反応によりＤＮＡの一本鎖を合成した後、上記ＰＣＲ
法と同様の条件で増幅して得た。このＤＮＡ断片を既知
の方法により平滑化した後、ＢｓｔＸＩで消化して平滑
化し、次いで、脱リン酸化した哺乳類細胞用ベクターｐ
ＥＦ−ＢＯＳ（Nagata,S.(大阪バイオサイエンス研究
所)より入手）に既知の方法により連結させた。
齢のラットの脳のｍＲＮＡから５’側プライマーと、終
止コドンの１８ｂｐ５’寄りにＢａｍＨＩ領域を有する
３’側プライマーを用いて上記同様の手法を用いて逆転
写反応によりＤＮＡの一本鎖を合成した後、上記ＰＣＲ
法と同様の条件で増幅して得た。このＤＮＡ断片を既知
の方法により平滑化した後、ＢｓｔＸＩで消化して平滑
化し、次いで、脱リン酸化した哺乳類細胞用ベクターｐ
ＥＦ−ＢＯＳ（Nagata,S.(大阪バイオサイエンス研究
所)より入手）に既知の方法により連結させた。
【００５６】（８）可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ
−ＰｃＤＮＡを組み込んだ発現用ベクターの構築 ＧｌｃＡＴ−Ｐのトランスメンブレン領域にあたると考
えられるＮ末端から７４アミノ酸残基までが欠失したＧ
ｌｃＡＴ−Ｐの短縮化形態をコードするＤＮＡを、クロ
ーン化したＧｌｃＡＴ−ＰのｃＤＮＡを鋳型として、イ
ンフレームのＥｃｏＲＩ領域を含む５’側プライマー
（配列番号１９）と３’側プライマー（配列番号２０）
を用いてＰＣＲ法により増幅した。増幅して得られたＤ
ＮＡ断片をｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. an
d Paulson,J.C.,J. Biol. Chem.,269,1394-1401(199
4)）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域に通常の方法により
組み込み、ＧｌｃＡＴ−Ｐとインスリンシグナル配列及
びプロテインＡの融合タンパク質の遺伝子を同一読み出
し領域に有するベクターを構築した。正確な配列を有す
るクローンを選択し、融合タンパク質をコードするＮｈ
ｅＩ断片を切り出し、上記発現ベクターの構築方法同様
の操作により目的ＤＮＡ断片をｐＥＦ−ＢＯＳ(Mizushi
ma, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 532
2(1990))のＸｂａＩ領域に連結させた。
−ＰｃＤＮＡを組み込んだ発現用ベクターの構築 ＧｌｃＡＴ−Ｐのトランスメンブレン領域にあたると考
えられるＮ末端から７４アミノ酸残基までが欠失したＧ
ｌｃＡＴ−Ｐの短縮化形態をコードするＤＮＡを、クロ
ーン化したＧｌｃＡＴ−ＰのｃＤＮＡを鋳型として、イ
ンフレームのＥｃｏＲＩ領域を含む５’側プライマー
（配列番号１９）と３’側プライマー（配列番号２０）
を用いてＰＣＲ法により増幅した。増幅して得られたＤ
ＮＡ断片をｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. an
d Paulson,J.C.,J. Biol. Chem.,269,1394-1401(199
4)）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域に通常の方法により
組み込み、ＧｌｃＡＴ−Ｐとインスリンシグナル配列及
びプロテインＡの融合タンパク質の遺伝子を同一読み出
し領域に有するベクターを構築した。正確な配列を有す
るクローンを選択し、融合タンパク質をコードするＮｈ
ｅＩ断片を切り出し、上記発現ベクターの構築方法同様
の操作により目的ＤＮＡ断片をｐＥＦ−ＢＯＳ(Mizushi
ma, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 532
2(1990))のＸｂａＩ領域に連結させた。
【００５７】（９）ＣＯＳ−１細胞における可溶化タン
パク質形態ＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現 １００ｍｍのディッシュ上でＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣ
Ｃ：ＣＲＬ−１６５０）を培養し、２４時間後に上記可
溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結し
た発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ８．２μｇをＬｉｐｏｆ
ｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Techno
logies)製）を用いトランスフェクションした。トラン
スフェクション５日後に当該細胞の培養上清を回収し、
アシアロオロソムコイドをグルクロン酸受容体として使
用してＧｌｃＡＴ−Ｐ活性を測定した。活性の測定はJ.
Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)に従って行っ
た。対照として組換え遺伝子を含まないｐＥＦ−ＢＯＳ
ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の
培養上清を用いた。結果を表−２に示す。
パク質形態ＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現 １００ｍｍのディッシュ上でＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣ
Ｃ：ＣＲＬ−１６５０）を培養し、２４時間後に上記可
溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結し
た発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ８．２μｇをＬｉｐｏｆ
ｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Techno
logies)製）を用いトランスフェクションした。トラン
スフェクション５日後に当該細胞の培養上清を回収し、
アシアロオロソムコイドをグルクロン酸受容体として使
用してＧｌｃＡＴ−Ｐ活性を測定した。活性の測定はJ.
Biol. Chem., 267,22711-22714(1992)に従って行っ
た。対照として組換え遺伝子を含まないｐＥＦ−ＢＯＳ
ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の
培養上清を用いた。結果を表−２に示す。
【００５８】
【表２】 表−２ ──────────────────────────────────── トランスフェクション 対照 酵素活性 ７０μｕｎｉｔ／ｍｌ ＜０．７μｕｎｉｔ／ｍｌ ────────────────────────────────────
【００５９】また、培地中の可溶化タンパク質形態のＧ
ｌｃＡＴ−Ｐはアシアロオロソムコイドを結合したセフ
ァロースカラムで単離することができた。通常のＧｌｃ
ＡＴ−Ｐは７０位と３１７位にシステイン残基を有する
が、精製した可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐは
３１７位のシステイン残基のみを有している。可溶化タ
ンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐが活性を有すること及び
ＳＨ基のブロッキング剤であるＮ−エチルマレイミドを
添加して当該タンパク質の活性を調べた際に活性が完全
に失われるという２つの結果より、それぞれのシステイ
ンはジスルフィド結合は形成しておらず、３１７位のシ
ステイン残基のＳＨ基は当該酵素の活性と関連する部位
であることが判明した。
ｌｃＡＴ−Ｐはアシアロオロソムコイドを結合したセフ
ァロースカラムで単離することができた。通常のＧｌｃ
ＡＴ−Ｐは７０位と３１７位にシステイン残基を有する
が、精製した可溶化タンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐは
３１７位のシステイン残基のみを有している。可溶化タ
ンパク質形態のＧｌｃＡＴ−Ｐが活性を有すること及び
ＳＨ基のブロッキング剤であるＮ−エチルマレイミドを
添加して当該タンパク質の活性を調べた際に活性が完全
に失われるという２つの結果より、それぞれのシステイ
ンはジスルフィド結合は形成しておらず、３１７位のシ
ステイン残基のＳＨ基は当該酵素の活性と関連する部位
であることが判明した。
【００６０】（１０）Ｌｅｃ２細胞におけるＧｌｃＡＴ
−Ｐのトランジェントな発現 ＣＨＯ細胞の変異体であり、グルクロン酸の受容体であ
る糖タンパク質のＮ−アセチルラクトサミン残基を有す
るＬｅｃ２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７３６）に完全
長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを接続したｐＥＦ−ＢＯＳ
ベクターをトランスフェクションした。Ｌｅｃ２はＣＭ
Ｐ−シアル酸の輸送系を欠き、細胞表面にＮ−ラクトサ
ミン残基の末端のシアル酸を欠く糖タンパク質を発現し
ている。その為、ＧｌｃＡＴ−ＰによるＮ−ラクトサミ
ン構造へのグルクロン酸転移活性が、内在性のシアル酸
転移酵素活性との競争による阻害が起こらないため、よ
りＧｌｃＡＴ−Ｐの生理活性が顕著に表れやすいと考え
られる。６０ｍｍの培養皿に２４時間上記細胞を培養
し、完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結、または何
も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇ
をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー
(Life Technologies)製）を用いトランスフェクション
した。７２時間後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝
液で回収し、抗パラグロボシド抗体であるＨ１１（Tak
i,T(東京医科歯科大学)より入手）、ＨＮＫ−１エピト
ープ中のグルクロン酸を認識するＭ６７４９（Tanaka,
H.(熊本大学)より入手）、硫酸化されたグルクロン酸を
認識するＨＮＫ−１抗体（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−２００）
及び対照のマウスＩｇＭ抗体をそれぞれ一次抗体として
４℃で１時間反応させた。ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液
で細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇ
Ｍ抗体を二次抗体としてそれぞれの一次抗体により処理
した細胞に反応させ、ＦＡＣＳで解析した。その結果を
図３に示す。完全長ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを導入して
もＨ１１抗体による染色が変化しないことから、Ｇｌｃ
ＡＴ−Ｐは糖脂質性のグルクロン酸受容体であるパラグ
ロボシドにはグルクロン酸を転移しないことが明らかで
あり、ＨＮＫ−１による染色が変化しないことから、Ｌ
ｅｃ２には転移されたグルクロン酸を硫酸化する酵素が
欠損していることが明らかである。Ｍ６７４９による染
色量が増加していることから、当該ｃＤＮＡから生じる
ＧｌｃＡＴが正常にグルクロン酸を転移していることが
明らかである。
−Ｐのトランジェントな発現 ＣＨＯ細胞の変異体であり、グルクロン酸の受容体であ
る糖タンパク質のＮ−アセチルラクトサミン残基を有す
るＬｅｃ２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７３６）に完全
長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを接続したｐＥＦ−ＢＯＳ
ベクターをトランスフェクションした。Ｌｅｃ２はＣＭ
Ｐ−シアル酸の輸送系を欠き、細胞表面にＮ−ラクトサ
ミン残基の末端のシアル酸を欠く糖タンパク質を発現し
ている。その為、ＧｌｃＡＴ−ＰによるＮ−ラクトサミ
ン構造へのグルクロン酸転移活性が、内在性のシアル酸
転移酵素活性との競争による阻害が起こらないため、よ
りＧｌｃＡＴ−Ｐの生理活性が顕著に表れやすいと考え
られる。６０ｍｍの培養皿に２４時間上記細胞を培養
し、完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結、または何
も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇ
をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー
(Life Technologies)製）を用いトランスフェクション
した。７２時間後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝
液で回収し、抗パラグロボシド抗体であるＨ１１（Tak
i,T(東京医科歯科大学)より入手）、ＨＮＫ−１エピト
ープ中のグルクロン酸を認識するＭ６７４９（Tanaka,
H.(熊本大学)より入手）、硫酸化されたグルクロン酸を
認識するＨＮＫ−１抗体（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−２００）
及び対照のマウスＩｇＭ抗体をそれぞれ一次抗体として
４℃で１時間反応させた。ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液
で細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇ
Ｍ抗体を二次抗体としてそれぞれの一次抗体により処理
した細胞に反応させ、ＦＡＣＳで解析した。その結果を
図３に示す。完全長ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを導入して
もＨ１１抗体による染色が変化しないことから、Ｇｌｃ
ＡＴ−Ｐは糖脂質性のグルクロン酸受容体であるパラグ
ロボシドにはグルクロン酸を転移しないことが明らかで
あり、ＨＮＫ−１による染色が変化しないことから、Ｌ
ｅｃ２には転移されたグルクロン酸を硫酸化する酵素が
欠損していることが明らかである。Ｍ６７４９による染
色量が増加していることから、当該ｃＤＮＡから生じる
ＧｌｃＡＴが正常にグルクロン酸を転移していることが
明らかである。
【００６１】（１１）ＣＯＳ−１細胞におけるＧｌｃＡ
Ｔ−Ｐのトランジェントな発現 ラミニンコートした６０ｍｍ培養皿にＣＯＳ−１細胞を
培養し、２４時間後に完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡ
を連結したｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをＬｉｐｏｆ
ｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Techno
logies)製）を用いトランスフェクションした。対照と
しては何も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクタ
ーを用いた。７２時間後、３％パラホルムアルデヒドを
含むＰＢＳ緩衝液で上記トランスフェクションした細胞
を固定し、１０μｇ／ｍｌのＭ６７４９又はＨＮＫ−１
により室温で２時間インキュベートし、ＦＩＴＣを結合
した抗マウスＩｇＭで上記抗体を染色した。対照の細胞
は全く染色されなかったが、ＧｌｃＡＴ−Ｐをトランス
フェクションした細胞は、Ｍ６７４９及びＨＮＫ−１双
方の抗体によって染色された。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐを
発現させたＣＯＳ−１細胞は対照と比較して大きな形態
の変化が見られた。ＧｌｃＡＴ−Ｐを発現させたＣＯＳ
−１細胞は多数のマイクロスパイクを有する長く伸長し
た突起を有していた。
Ｔ−Ｐのトランジェントな発現 ラミニンコートした６０ｍｍ培養皿にＣＯＳ−１細胞を
培養し、２４時間後に完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡ
を連結したｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをＬｉｐｏｆ
ｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Techno
logies)製）を用いトランスフェクションした。対照と
しては何も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクタ
ーを用いた。７２時間後、３％パラホルムアルデヒドを
含むＰＢＳ緩衝液で上記トランスフェクションした細胞
を固定し、１０μｇ／ｍｌのＭ６７４９又はＨＮＫ−１
により室温で２時間インキュベートし、ＦＩＴＣを結合
した抗マウスＩｇＭで上記抗体を染色した。対照の細胞
は全く染色されなかったが、ＧｌｃＡＴ−Ｐをトランス
フェクションした細胞は、Ｍ６７４９及びＨＮＫ−１双
方の抗体によって染色された。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐを
発現させたＣＯＳ−１細胞は対照と比較して大きな形態
の変化が見られた。ＧｌｃＡＴ−Ｐを発現させたＣＯＳ
−１細胞は多数のマイクロスパイクを有する長く伸長し
た突起を有していた。
【００６２】
【発明の効果】本発明により、糖タンパク質のラクトサ
ミン残基にグルクロン酸を選択的に転移するグルクロン
酸転移酵素−Ｐ（ＧｌｃＡＴ−Ｐ）をコードする塩基配
列を有するＤＮＡが得られる。本発明により、ＧｌｃＡ
Ｔ−Ｐをコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られた
ので、ＧｌｃＡＴ−Ｐを工業的に使用可能な程度まで大
量生産できることが期待される。また、生体内において
は細胞膜上に存在する前記酵素を、本発明ＤＮＡを利用
することによって、その酵素活性を保ったままの状態で
可溶化タンパク質形態で得ることが可能となり、当該酵
素を利用したＨＮＫ−１エピトープの人工的な合成、当
該酵素の生体内における働きの解明が容易になる。
ミン残基にグルクロン酸を選択的に転移するグルクロン
酸転移酵素−Ｐ（ＧｌｃＡＴ−Ｐ）をコードする塩基配
列を有するＤＮＡが得られる。本発明により、ＧｌｃＡ
Ｔ−Ｐをコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られた
ので、ＧｌｃＡＴ−Ｐを工業的に使用可能な程度まで大
量生産できることが期待される。また、生体内において
は細胞膜上に存在する前記酵素を、本発明ＤＮＡを利用
することによって、その酵素活性を保ったままの状態で
可溶化タンパク質形態で得ることが可能となり、当該酵
素を利用したＨＮＫ−１エピトープの人工的な合成、当
該酵素の生体内における働きの解明が容易になる。
【００６３】
配列番号：1 配列の長さ：2090 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ウィスターラット 組織の種類：大脳皮質 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：95..1238 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：transmembrane domain 存在位置：252..302 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：651..659 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：783..791 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1140..1148 特徴を決定した方法：S 配列 GCGCGCGCAT CGCAGGGCAG CAGCCCTGGG TCTCTGGGGC CAGGGCATAG GACTGCCACC 60 CGCTATGGAC CGCGCCAGGG ACGATATGGA CTCGCTGCCG CAGGTATCAA CCTCCGAAGG 120 TTCCTGACCC TGCGCTGGAC TACTTCCCCT TCGCAGACTC CCATCAGGCC GGACTCTGCA 180 AACCTGCTGC CACA ATG GGT AAT GAG GAG CTG TGG GCG CAG CCA GCC TTG 230 Met Gly Asn Glu Glu Leu Trp Ala Gln Pro Ala Leu 1 5 10 GAG ATG CCG AAG AGA AGG GAC ATC CTC GCG ATT GTC CTC ATT GTG CTT 278 Glu Met Pro Lys Arg Arg Asp Ile Leu Ala Ile Val Leu Ile Val Leu 15 20 25 CCC TGG ACA CTG CTC ATC ACC GTC TGG CAC CAG AGC AGC CTC GCA CCT 326 Pro Trp Thr Leu Leu Ile Thr Val Trp His Gln Ser Ser Leu Ala Pro 30 35 40 CTG CTT GCT GTG CAC AAG GAT GAG GGA AGT GAC CCC CGC CAT GAG GCA 374 Leu Leu Ala Val His Lys Asp Glu Gly Ser Asp Pro Arg His Glu Ala 45 50 55 60 CCA CCC GGT GCG GAC CCT AGG GAG TAC TGC ATG TCC GAC CGT GAC ATC 422 Pro Pro Gly Ala Asp Pro Arg Glu Tyr Cys Met Ser Asp Arg Asp Ile 65 70 75 GTG GAG GTG GTG CGC ACA GAG TAC GTG TAC ACG AGG CCG CCA CCG TGG 470 Val Glu Val Val Arg Thr Glu Tyr Val Tyr Thr Arg Pro Pro Pro Trp 80 85 90 TCC GAC ACG CTG CCC ACC ATC CAT GTG GTG ACG CCC ACC TAC AGT AGA 518 Ser Asp Thr Leu Pro Thr Ile His Val Val Thr Pro Thr Tyr Ser Arg 95 100 105 CCG GTG CAG AAG GCA GAG CTG ACG CGA ATG GCC AAC ACG CTA TTG CAT 566 Pro Val Gln Lys Ala Glu Leu Thr Arg Met Ala Asn Thr Leu Leu His 110 115 120 GTG CCC AAC CTT CAC TGG CTG GTG GTG GAG GAT GCT CCA CGT AGG ACG 614 Val Pro Asn Leu His Trp Leu Val Val Glu Asp Ala Pro Arg Arg Thr 125 130 135 140 CCC CTC ACA GCG CGC CTG CTG CGC GAC ACT GGC CTC AAC TAT ACA CAC 662 Pro Leu Thr Ala Arg Leu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Asn Tyr Thr His 145 150 155 CTG CAC GTA GAG ACA CCA CGC AAC TAC AAG CTG CGA GGT GAC GCC CGA 710 Leu His Val Glu Thr Pro Arg Asn Tyr Lys Leu Arg Gly Asp Ala Arg 160 165 170 GAC CCT CGC ATC CCA CGT GGC ACC ATG CAG CGC AAT CTG GCC CTG CGC 758 Asp Pro Arg Ile Pro Arg Gly Thr Met Gln Arg Asn Leu Ala Leu Arg 175 180 185 TGG TTG CGG GAG ACC TTC CCA CGG AAC TCC ACT CAG CCG GGT GTA GTG 806 Trp Leu Arg Glu Thr Phe Pro Arg Asn Ser Thr Gln Pro Gly Val Val 190 195 200 TAC TTC GCA GAT GAC GAC AAC ACG TAC AGT CTG GAG CTC TTT GAA GAG 854 Tyr Phe Ala Asp Asp Asp Asn Thr Tyr Ser Leu Glu Leu Phe Glu Glu 205 210 215 220 ATG CGC AGC ACA AGA AGG GTG TCC GTG TGG CCT GTG GCC TTT GTT GGC 902 Met Arg Ser Thr Arg Arg Val Ser Val Trp Pro Val Ala Phe Val Gly 225 230 235 GGC CTT CGG TAT GAG GCC CCC CGG GTG AAT GGG GCA GGG AAA GTG GTT 950 Gly Leu Arg Tyr Glu Ala Pro Arg Val Asn Gly Ala Gly Lys Val Val 240 245 250 GGC TGG AAG ACA GTC TTC GAC CCC CAC CGG CCA TTT GCA ATA GAC ATG 998 Gly Trp Lys Thr Val Phe Asp Pro His Arg Pro Phe Ala Ile Asp Met 255 260 265 GCT GGA TTT GCT GTC AAC CTC CGG CTC ATC TTG CAA CGA AGC CAG GCC 1046 Ala Gly Phe Ala Val Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gln Arg Ser Gln Ala 270 275 280 TAC TTT AAG CTA CGT GGG GTA AAA GGA GGC TAC CAG GAA AGC AGT CTC 1094 Tyr Phe Lys Leu Arg Gly Val Lys Gly Gly Tyr Gln Glu Ser Ser Leu 285 290 295 300 CTT CGA GAA CTT GTC ACC CTC AAT GAT CTA GAG CCC AAG GCA GCA AAC 1142 Leu Arg Glu Leu Val Thr Leu Asn Asp Leu Glu Pro Lys Ala Ala Asn 305 310 315 TGT ACC AAG ATC CTG GTC TGG CAT ACG CGA ACA GAG AAG CCA GTG CTG 1190 Cys Thr Lys Ile Leu Val Trp His Thr Arg Thr Glu Lys Pro Val Leu 320 325 330 GTG AAT GAG GGG AAG AAG GGC TTC ACT GAC CCC TCG GTG GAG ATC TGA 1238 Val Asn Glu Gly Lys Lys Gly Phe Thr Asp Pro Ser Val Glu Ile 335 340 345 AACTACACAT GCAGGAATCA CCTTCTCAGA CCCTGATCTT GGCTTCCATC CTCTCCCATG 1298 ACTGACAGTG ACTCTGAGGC AGACTCCTGA GGAATACCTA TTATGTATAC TGAAGGCTTC 1358 CAAGAGAGCC CAGCTTGACG CCAGGACAAA AGACAGAGAA TTTAAGCACA GAATCCCAGA 1418 CCTGTGGTTC TCTACATCAA CAAGGCCAGG GGCTTGAAAG ACCCAAGTTC TGGGGATTCC 1478 CGTTGCCAGC AAAGCCTGTG CTCAGCACAC CTCCTTGGAA GCTTCCTGCA TTGATGGGGC 1538 TGTGTAAGCA AGGGGACCCT GCCTTCGAGT GATGCTGGGG TGAGGGAGGT CAGAAAACGC 1598 CACTATTGAG TGCAGCATGG CTGTCCATGG CTCCCTGCTC TTGGGCCCAG CATGACTACA 1658 CAGCATGTGC CCAGCCAGGA CATCCTGAAG ACCAGAGAGC AGCCTGGGGC ATGAAGATGC 1718 CCCAACACTT GTCTTTCACA CCTGCTCTTC CTCAGAGCTG CTCCCAAATC AGAAATACCT 1778 CTGGCTCTCC TCTGGTTCGT GTTTACAGGG CATAAGGCTG TCTTGGATCC CACCTGGCAC 1838 CCAGCCCTGC ATTGGGGGAG CCTGGGCCTA CCTACAGCTC CCCTTGTACC TCAGGCTGTA 1898 GAAGAACCAA GCCCTTCCCC GTGTCCTTCA AGCCTCCTGT GCCAGAATCA GTCAGGTGGT 1958 GGGCCTAGAG CCAGCACAGG TCATGGATTG ACCTGGATTG AGAACCAAGT CACCCCACAG 2018 TCCACACTGC CTCTCCAATA CCCCTGGGCT GCAATGCCCC TTGCTGGGTT TGGACTGGGG 2078 AGGCAATTGC CC 2090
【００６４】配列番号：2 配列の長さ：347 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Gly Asn Glu Glu Leu Trp Ala Gln Pro Ala Leu Glu Met Pro Lys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ile Leu Ala Ile Val Leu Ile Val Leu Pro Trp Thr Leu 20 25 30 Leu Ile Thr Val Trp His Gln Ser Ser Leu Ala Pro Leu Leu Ala Val 35 40 45 His Lys Asp Glu Gly Ser Asp Pro Arg His Glu Ala Pro Pro Gly Ala 50 55 60 Asp Pro Arg Glu Tyr Cys Met Ser Asp Arg Asp Ile Val Glu Val Val 65 70 75 80 Arg Thr Glu Tyr Val Tyr Thr Arg Pro Pro Pro Trp Ser Asp Thr Leu 85 90 95 Pro Thr Ile His Val Val Thr Pro Thr Tyr Ser Arg Pro Val Gln Lys 100 105 110 Ala Glu Leu Thr Arg Met Ala Asn Thr Leu Leu His Val Pro Asn Leu 115 120 125 His Trp Leu Val Val Glu Asp Ala Pro Arg Arg Thr Pro Leu Thr Ala 130 135 140 Arg Leu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Asn Tyr Thr His Leu His Val Glu 145 150 155 160 Thr Pro Arg Asn Tyr Lys Leu Arg Gly Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ile 165 170 175 Pro Arg Gly Thr Met Gln Arg Asn Leu Ala Leu Arg Trp Leu Arg Glu 180 185 190 Thr Phe Pro Arg Asn Ser Thr Gln Pro Gly Val Val Tyr Phe Ala Asp 195 200 205 Asp Asp Asn Thr Tyr Ser Leu Glu Leu Phe Glu Glu Met Arg Ser Thr 210 215 220 Arg Arg Val Ser Val Trp Pro Val Ala Phe Val Gly Gly Leu Arg Tyr 225 230 235 240 Glu Ala Pro Arg Val Asn Gly Ala Gly Lys Val Val Gly Trp Lys Thr 245 250 255 Val Phe Asp Pro His Arg Pro Phe Ala Ile Asp Met Ala Gly Phe Ala 260 265 270 Val Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gln Arg Ser Gln Ala Tyr Phe Lys Leu 275 280 285 Arg Gly Val Lys Gly Gly Tyr Gln Glu Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu 290 295 300 Val Thr Leu Asn Asp Leu Glu Pro Lys Ala Ala Asn Cys Thr Lys Ile 305 310 315 320 Leu Val Trp His Thr Arg Thr Glu Lys Pro Val Leu Val Asn Glu Gly 325 330 335 Lys Lys Gly Phe Thr Asp Pro Ser Val Glu Ile 340 345
【００６５】配列番号：3 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Asn Thr Leu Leu His Val Pro Asn Leu His Trp Leu Val Val 1 5 10 15 Glu Asp Ala Pro Arg 20
【００６６】配列番号：4 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Thr Gln Pro Gly Val Val Tyr Phe Ala Asp Asp Asp Asn Thr Tyr 1 5 10 15 Xaa Leu Glu Leu Phe Glu Glu Met Xaa 20 25
【００６７】配列番号：5 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Val Phe Asp Pro His Xaa Pro Phe Ala Ile Asp Met Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Xaa Xaa 20
【００６８】配列番号：6 配列の長さ：18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：3 他の情報：N=イノシン 配列 GTNCCNAAYY TNCAYTGG 18
【００６９】配列番号：7 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TANGTRTTRT CRTCRTC 17
【００７０】配列番号：8 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCRTCRTCNG CRAARTA 17
【００７１】配列番号：9 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAYTTYGCNG AYGAYGA 17
【００７２】配列番号：10 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTGCNGAYG AYGAYAA 17
【００７３】配列番号：11 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACNGCRAANC CNGCCAT 17
【００７４】配列番号：12 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGGTGGTGG AGGATGC 17
【００７５】配列番号：13 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCTATTGCA AATGGCC 17
【００７６】配列番号：14 配列の長さ：16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGAAGGTTGG GCACAT 16
【００７７】配列番号：15 配列の長さ：16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAGVGTGTTG GCCATT 16
【００７８】配列番号：16 配列の長さ：411 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：二本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CTGGTGGTGG AGGATGCTCC ACGTAGGACG CCCCTCACAG CGCGCCTGCT GCGCGACACT 60 GGCCTCAACT ATACACACCT GCACGTAGAG ACACCACGCA ACTACAAGCT GCGAGGTGAC 120 GCCCGAGACC CTCGCATCCC ACGTGGCACC ATGCAGCGCA ATCTGGCCCT GCGCTGGTTG 180 CGGGAGACCT TCCCACGGAA CTCCACTCAG CCGGGTGTAG TGTACTTCGC AGATGACGAC 240 AACACGTACA GTCTGGAGCT CTTTGAAGAG ATGCGCAGCA CAAGAAGGGT GTCCGTGTGG 300 CCTGTGGCCT TTGTTGGCGG CCTTCGGTAT GAGGCCCCCC GGGTGAATGG GGCAGGGAAA 360 GTGGTTGGCT GGAAGACAGT CTTCGACCCC CACCGGCCAT TTGCAATAGA C 411
【００７９】配列番号：17 配列の長さ：1674 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：二本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GACATCGTGG AGGTGGTGCG CACAGAGTAC GTGTACACGA GGCCGCCACC GTGGTCCGAC 60 ACGCTGCCCA CCATCCATGT GGTGACGCCC ACCTACAGTA GACCGGTGCA GAAGGCAGAG 120 CTGACGCGAA TGGCCAACAC GCTATTGCAT GTGCCCAACC TTCACTGGCT GGTGGTGGAG 180 GATGCTCCAC GTAGGACGCC CCTCACAGCG CGCCTGCTGC GCGACACTGG CCTCAACTAT 240 ACACACCTGC ACGTAGAGAC ACCACGCAAC TACAAGCTGC GAGGTGACGC CCGAGACCCT 300 CGCATCCCAC GTGGCACCAT GCAGCGCAAT CTGGCCCTGC GCTGGTTGCG GGAGACCTTC 360 CCACGGAACT CCACTCAGCC GGGTGTAGTG TACTTCGCAG ATGACGACAA CACGTACAGT 420 CTGGAGCTCT TTGAAGAGAT GCGCAGCACA AGAAGGGTGT CCGTGTGGCC TGTGGCCTTT 480 GTTGGCGGCC TTCGGTATGA GGCCCCCCGG GTGAATGGGG CAGGGAAAGT GGTTGGCTGG 540 AAGACAGTCT TCGACCCCCA CCGGCCATTT GCAATAGACA TGGCTGGATT TGCTGTCAAC 600 CTCCGGCTCA TCTTGCAACG AAGCCAGGCC TACTTTAAGC TACGTGGGGT AAAAGGAGGC 660 TACCAGGAAA GCAGTCTCCT TCGAGAACTT GTCACCCTCA ATGATCTAGA GCCCAAGGCA 720 GCAAACTGTA CCAAGATCCT GGTCTGGCAT ACGCGAACAG AGAAGCCAGT GCTGGTGAAT 780 GAGGGGAAGA AGGGCTTCAC TGACCCCTCG GTGGAGATCT GAAACTACAC ATGCAGGAAT 840 CACCTTCTCA GACCCTGATC TTGGCTTCCA TCCTCTCCCA TGACTGACAG TGACTCTGAG 900 GCAGACTCCT GAGGAATACC TATTATGTAT ACTGAAGGCT TCGAAGAGAG CCCAGCTTGA 960 CGCCAGGACA AAAGACAGAG AATTTAAGCA CAGAATCCCA GACCTGTGGT TCTCTACATC 1020 AACAAGGCCA GGGGCTTGAA AGACCCAAGT TCTGGGGATT CCCGTTGCCA GCAAAGCCTG 1080 TGCTCAGCAC ACCTCCTTGG AAGCTTCCTG CATTGATGGG GCTGTGTAAG CAAGGGGACC 1140 CTGCCTTCGA GTGATGCTGG GGTGAGGGAG GTCAGAAAAC GCCACTATTG AGTGCAGCAT 1200 GGCTGTCCAT GGCTCCCTGC TCTTGGGCCC AGCATGACTA CACAGCATGT GCCCAGCCAG 1260 GACATCCTGA AGACCAGAGA GCAGCCTGGG GCATGAAGAT GCCCCAACAC TTGTCTTTCA 1320 CACCTGCTCT TCCTCAGAGC TGCTCCCAAA TCAGAAATAC CTCTGGCTCT CCTCTGGTTC 1380 GTGTTTACAG GGCATAAGGC TGTCTTGGAT CCCACCTGGC ACCCAGCCCT GCATTGGGGG 1440 AGCCTGGGCC TACCTACAGC TCCCCTTGTA CCTCAGGCTG TAGAAGAACC AAGCCCTTCC 1500 CCGTGTCCTT CAAGCCTCCT GTGCCAGAAT CAGTCAGGTG GTGGGCCTAG AGCCAGCACA 1560 GGTCATGGAT TGACCTGGAT TGAGAACCAA GTCACCCCAC AGTCCACACT GCCTCTCCAA 1620 TACCCCTGGG CTGCAATGCC CCTTGCTGGG TTTGGACTGG GGAGGCAATT GCCC 1674
【００８０】配列番号：18 配列の長さ： 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：二本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GCGCGCGCAT CGCAGGGCAG CAGCCCTGGG TCTCTGGGGC CAGGGCATAG GACTGCCACC 60 CGCTATGGAC CGCGCCAGGG ACGATATGGA CTCGCTGCCG CAGGTATCAA CCTCCGAAGG 120 TTCCTGACCC TGCGCTGGAC TACTTCCCCT TCGCAGACTC CCATCAGGCC GGACTCTGCA 180 AACCTGCTGC CACAATGGGT AATGAGGAGC TGTGGGCGCA GCCAGCCTTG GAGATGCCGA 240 AGAGAAGGGA CATCCTCGCG ATTGTCCTCA TTGTGCTTCC CTGGACACTG CTCATCACCG 300 TCTGGCACCA GAGCAGCCTC GCACCTCTGC TTGCTGTGCA CAAGGATGAG GGAAGTGACC 360 CCCGCCATGA GGCACCACCC GGTGCGGACC CTAGGGAGTA CTGCATGTCC GACCGTGACA 420 TCGTGGAGGT GGTGCGCACA GAGTACGTGT ACACGAGGCC GCCACCGTGG TCCGACACGC 480 TGCCCACCAT CCATGTGGTG ACGCCCACCT ACAGTAGACC GGTGCAGAAG GCAGAGCTGA 540 CGCGAATGGC CAACACGCTA 560
【００８１】配列番号：19 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCGAATTCT GACATCGTGG AGGTGGTGCG CACA 24
【００８２】配列番号：20 配列の長さ：23 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTGGATCCT GTGTAGTTTC AGATCTCCAC CGA 23
【図１】 ＧｌｃＡＴ−Ｐ部分アミノ酸配列とＰＣＲ用
プライマーの塩基配列を示す。
プライマーの塩基配列を示す。
【図２】 各ＤＮＡ断片並びに各プライマーの位置関係
を示す。
を示す。
【図３】 各種抗体による染色のＧｌｃＡＴ−Ｐの発現
による変化を示す。
による変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】 以下の性質を有するグルクロン酸転移酵
素のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮ
Ａ。 作用：グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体
にグルクロン酸を転移する。 基質特異性：アシアロオロソムコイド及び神経細胞接
着分子のＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的にグル
クロン酸を転移する。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６．０〜６．５付近（100mM Ｍ
ＥＳ緩衝液、３７℃）。 阻害及び活性化：Ｍｎ2+により活性化される。５ｍＭ
のネオラクトテトラオース−フェニル−Ｃ 14Ｈ29共存下
において活性が維持される。 分子量：還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定される分子量が約４５,０
００。ゲルろ過により測定される分子量が約９０，００
０。 - 【請求項２】 グルクロン酸転移酵素−Ｐをコードする
塩基配列を有するＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、
グルクロン酸供与体から、グルクロン酸受容体であるア
シアロオロソムコイドにグルクロン酸を転移する酵素活
性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入又は転位を有していても良いグルクロン酸転
移酵素のポリペプチドの少なくとも一部をコードする塩
基配列を有するＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号２においてアミノ酸番号１〜３
４７で表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコード
する塩基配列を有する請求項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号２においてアミノ酸番号７５〜
３４７で表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコー
ドする塩基配列を有する請求項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤ
ＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地で培養し、該
ＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるグルクロ
ン酸転移酵素のポリペプチドを培養物中に生成蓄積さ
せ、その培養物から前記ポリペプチドを採取することを
含む、ポリペプチドの製造方法。
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