JP2002543760A

JP2002543760A - ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法

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Publication number: JP2002543760A
Application number: JP2000586923A
Authority: JP
Inventors: 敏臣吉田; 達治関; 和仁藤山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2002-12-24
Also published as: US7388081B2; JP5947142B2; US20130040391A1; AU771908B2; IL207261A0; EP1137789A1; US20080124798A1; EP2264177B1; US20050143564A1; WO2000034490A1; IL207261A; AU771908C; US6998267B1; DK1137789T3; ES2558160T3; BR9917026A; US8241909B2; CA2354377A1; JP2009028054A; AU1681300A

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト型の糖鎖をもつ有用糖タンパク質を提供すること。【解決手段】ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法であって、植物細胞に、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入することによって、形質転換植物細胞を得る工程、および得られた形質転換植物細胞を培養する工程を包含する。上記グリコシルトランスフェラーゼは、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る。上記ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、このコア糖鎖は複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを含み、そしてこの外部糖鎖は、非還元末端ガラクトースをもつ末端糖鎖部分を含み、直鎖状構造または分岐状構造をもつ。上記ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質は、フコースまたはキシロースを含まないため、ヒトに対する抗原性を示さない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、植物による異種糖タンパク質の発現に関する。

【０００２】

【従来の技術】

生体内の機能的タンパク質の多くは糖鎖を持つ糖タンパク質である。糖タンパ
ク質内の糖鎖の多様性は、いくつかの重要な役割を生理学的に担っていることが
明らかにされている（Ｌａｉｎ，Ｒ．Ａ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，７
５９−７６７，１９９４）。

【０００３】最近、糖鎖の作用が２つのカテゴリーに分けられ得ることが明確になった。１
つは、糖鎖が、血液からの糖タンパク質のクリアランス、リソソーム酵素のリソ
ソームへのターゲッティング、糖タンパク質による特定の組織および器官へのタ
ーゲッティングにおいて、細胞間接着のリガンドとして、および細菌およびウイ
ルスの受容体として直接的な機能を有する場合である。例えば、エイズウイルス
（ＨＩＶ）が標的細胞に感染する過程で、糖タンパク質の糖鎖が関与しているこ
とが示されている（Ｒａｂｅｈｉ，Ｌ．ら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１２，
７−１６，１９９５）。ＨＩＶ表面は、エンベロープタンパク質ｇｐ１２０で覆
われ、ｇｐ１２０の糖鎖が標的細胞のＣＤ４に結合することでＨＩＶウイルスの
感染が始まる。糖鎖のもう１つの働きは、糖鎖自体は機能的分子ではないが、タ
ンパク質の高次構造の形成、タンパク質の溶解性、タンパク質のプロテアーゼ抵
抗性、抗原性の抑制、タンパク質機能の修飾、タンパク質代謝速度の調節および
細胞膜における発現量の調節などに間接的に関与する場合である。例えば、神経
系に広く分布する神経細胞接着分子の接着性は糖鎖により調節されている（Ｅｄ
ｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４，１３５−１
６９，１９８５）。

【０００４】真核生物では、糖タンパク質の糖鎖は、小胞体の脂質上で前駆体型糖鎖として
合成される。糖鎖部分はタンパク質に転移され、次いでこのタンパク質上のいく
つかの糖残基が除去され、ゴルジ体に輸送される。ゴルジ体において、過剰の糖
残基が除去された後、さらなる糖残基（例えばマンノース）が付加され、そして
糖鎖が伸長される（Ｎａｒｉｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，３８，４８９−５０４，１９９４）。

【０００５】より詳細に述べれば、例えば、ドリコールアンカー（ｄｏｌｉｃｈｏｌａｎ
ｃｈｏｒｓ）上のＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は、小胞体（ＥＲ）膜中のタ
ンパク質に転移される（ＭｏｒｅｍｅｎＫ．Ｗ．，Ｔｒｉｍｂｌｅ、Ｒ．Ｂ．
およびＨｅｒｓｃｏｖｉｃｓＡ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１９９４４
月；４（２）：１１３−２５、アスパラギン連結オリゴサッカライドプロセッシ
ング経路のグリコシダーゼ；およびＳｔｕｒｍ，Ａ．１９９５植物タンパク質
のＮ−グリコシル化、ＮｅｗＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ．Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，第２９ａ巻、Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ、Ｊ
．，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ、Ｈ．およびＶｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ、Ｊ．Ｆ．Ｇ．
（編）．ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＢ．Ｖ．
，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄ、５２１−５４１頁）。小胞体グリコシダーゼ
ＩおよびＩＩは、３つのグルコース単位を除去する（Ｓｔｕｒｍ、Ａ．１９９５
、前述；およびＫａｕｓｈａｌＧ．Ｐ．およびＥｌｂｅｉｎＡ．Ｄ．，１９
８９、植物における糖タンパク質プロセッシング酵素。ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ１７９、ＣｏｍｐｌｅｘＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓＰａ
ｒｔＦ．ＧｉｎｓｂｕｒｇＶ．（編）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．ＮＹ、４５２−４７５頁）。得られる高マンノース構造（Ｍａｎ９Ｇｌｃ
ＮＡｃ２）は、小胞体マンノシダーゼによりトリミングされる（Ｍｏｒｅｍｅｎ
Ｋ．Ｗ．ら、前述；およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，
Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４、６３１−６６４、１９８５；
アスパラギン連結オリゴサッカライドのアセンブリ）。除去されるマンノース残
基の数は、プロセッシング酵素への接近可能性における差異に従って変動する。
アイソマー類であるＭａｎ８−、Ｍａｎ７−、Ｍａｎ６−およびＭａｎ５Ｇｌｃ
ＮＡｃ２が、小胞体マンノシダーゼおよびマンノシダーゼＩによるプロセッング
の間に生産される（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，前
述）。４つのマンノース残基がマンノシダーゼＩ（ＭａｎＩ）によって完全に
除去されるとき、産物は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。Ｎ−アセチルグルコ
サミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃＩ）は、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン（ＧｌｃＮＡｃ）を、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へ転
移し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じる（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｈ
．，Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ，Ｓ．，Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｐ．，およびＶｅｌｌａ，
Ｇ．，グリコシルトランスフェラーゼは、複合型またはＮ−アセチルガラクトサ
ミン型のＮ−グリコシル的に連結されたオリゴサッカライドの伸長に関与する。
ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ９８：ＢｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓＰａｒｔ
Ｌ．Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，およびＦｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．（編）、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ．９８−１３４頁、１９８３）。マ
ンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２か
ら２つのマンノース残基を除去し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生じ
る（Ｋａｕｓｈａｌ，Ｇ．Ｐ．およびＥｌｂｅｉｎ，Ａ．Ｄ．，前述；およびＫ
ｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，前述）。オリゴサッカラ
イドＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトラ
ンスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃＩＩ）の基質として用いられる（Ｍｏｒｅｍ
ｅｎ，Ｋ．Ｗ．ら、前述；Ｋａｕｓｈａｌ，Ｇ．Ｐ．およびＥｌｂｅｉｎ，Ａ．
Ｄ．，前述；およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，前
述）。図１９は、Ｎ−結合グリカンの上記の構造、ならびに小胞体およびゴルジ
体中の糖鎖修飾経路に関与する酵素を要約する。図１９において、白抜きの菱形
はグルコースを、白抜きの四角はＧｌｃＮＡｃを、白抜きの丸はマンノースを、
黒丸はガラクトースを、そして黒四角はシアル酸をそれぞれ示す。

【０００６】このゴルジ体における糖付加は末端部糖鎖合成と呼ばれ、このプロセスは、生
物種により大きく異なる。糖鎖生合成系は、真核生物の種によって異なり、その
結果糖鎖構造は種特異的であり、そして糖を付加する糖転移酵素およびゴルジ体
の進化を反映している（成松久、細胞工学、１５，８０２−８１０，１９９６）
。

【０００７】アスパラギン結合型（Ｎ−結合型）糖鎖に注目すると、動物には、高マンノー
ス型糖鎖、複合型糖鎖およびそのハイブリッド型が存在する。図１にそれらの構
造を示す。一方、植物の複合型糖鎖には、動物の糖鎖にはないα１−３フコース
とβ１−２キシロースが存在する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｄ．およびＣｈｒｉｓ
ｐｅｅｌｓ，Ｍ．Ｊ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，８４，１３０１−１３０
８，１８９７、Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，５６，２１５−２２２，１９９２）。また、Ｎ結合型糖鎖として
は植物糖鎖には動物糖鎖に見出されるシアル酸が存在せず、動物糖鎖に一般に存
在するガラクトースも、シカモア細胞のラッカーゼの糖鎖に見出されているが（
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．およびＨｏｔｔａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２５，３８８−３９５，１９８６）、その例は少なく、またその結合型もβ
１−３結合である（ＦＥＢＳＬｅｔｔ１９９７９月２９，４１５（２）
、１８６−１９１、植物細胞懸濁培養（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｍｙｔｉｌｌｕｓ
Ｌ．）からの分泌ペルオキシダーゼ中のヒトＬｅｗｉｓ（ａ）炭水化物モチー
フの同定、ＭｅｌｏＮＳ、ＮｉｍｔｚＭ、ＣｏｎｔｒａｄｔＨＳ、Ｆｅｖ
ｅｒｅｉｒｏＰＳ、ＣｏｓｔａＪ；ＰｌａｎｔＪ．１９９７１２月．１
２（６）１４１１−１４１７、Ｌｅｗｉｓａエピトープを保持するＮ−グリカ
ンは、植物細胞の表面で発現される。Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅ−ＬａｉｎｅＡＣ、
ＧｏｍｏｒｄＶ、ＣａｂａｎｅｓＭ、ＭｉｃｈａｌｓｋｉＪＣ、Ｓａｉｎ
ｔＭａｃａｒｙＭ、ＦｏｕｃｈｅｒＢ、ＣａｖｅｌｉｅｒＢ、Ｈａｗｅ
ｓＣ、ＬｅｒｏｕｇｅＰ、ＦａｙｅＬ）。この結合は、動物で見出される
結合とは異なる。

【０００８】一般に、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）などヒト由来の有用な糖タンパク質
は、ヒトに近い糖鎖構造を有する糖タンパク質を生産する動物細胞宿主で生産さ
れている。しかし、動物細胞で生産されたＥＰＯは、本来の糖鎖構造とは異なる
糖鎖構造を有し、生体内における活性が低下した（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ら
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７８１
９−７８２２，１９８９）。ホルモン、インターフェロンなどのヒト由来の他
の有用タンパク質の糖鎖構造が解析され、ＥＰＯと同じグルコシル化制限をとも
なって工業的に生産されている。

【０００９】近年、外来遺伝子を植物に導入する方法として、アグロバクテリウム法（Ｗｅ
ｉｓｉｎｇ，Ｋ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２２，４２１
，１９８８）、エレクトロポレーション法（Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら，Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１０７２，１９８８）、金粒子法（Ｇａ
ｓｓｅｒ，Ｃ．Ｇ．およびＦｒａｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
４，１２９３，１９８９）などが確立され、アルブミン（Ｓｉｊｍｏｎｓ，
Ｐ．Ｃ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，２１７，１９９０）
、エンケファリン（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｊ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，７，９２９，１９８９）、およびモノクローナル抗体（
Ｂｅｎｖｅｎｕｌｏ，Ｅ．ら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７，
８６５，１９９１およびＨｉａｔｔ，Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４２，
７６，１９８９）、が植物で生産され、そしてＢ型肝炎ウイルス主要表面抗原
（ＨＢｓＡｇ）（Ｍａｓｏｎ，Ｈ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９，１１７４５，１９９２）、および分泌
型ＩｇＡ（Ｈｉａｔｔ，Ａ．およびＭａ，Ｊ．Ｓ．Ｋ．，ＦＥＢＳＬｅｔ
ｔ．，３０７，７１，１９９２）を植物細胞中で生産し得ることも記載さ
れている。しかし、ヒト由来の糖タンパク質を植物で発現する場合、植物は、ヒ
トと異なる糖鎖付加機構を有するため、生産される糖タンパク質の糖鎖は、ヒト
で生産される糖鎖とは異なる構造を有し、本来の生理活性を示さず、また抗原と
なり得ることが指摘されている（ＷｉｌｓｏｎＩ．Ｂ．Ｈ．ら，Ｇｌｙｃｏｂ
ｉｏｌ．，ｖｏｌ．８，Ｎｏ．７，ｐｐ６５１−６６１，１９９８）。

【００１０】

【発明の開示】本発明の目的は、哺乳動物、例えば、ヒト型の糖鎖をもつ植物が生産する組換
え糖タンパク質を提供することにより、上記先行技術に関連する課題を解決する
ことである。

【００１１】本発明は、ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法に関する。この方法は、
植物細胞に、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移
反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転
換細胞を得る工程、および得られた形質転換植物細胞を培養する工程を包含する
。

【００１２】本発明において、上記ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質は、コア糖鎖および外部
糖鎖を含み、上記コア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンか
ら本質的になり、上記外部糖鎖は、非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分
を含み得る。

【００１３】本発明において、上記外部糖鎖は、直鎖状構造または分岐状構造を有し得る。

【００１４】本発明において、上記分岐糖鎖部分は、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造
であり得る。

【００１５】本発明において、上記糖タンパク質は、フコースまたはキシロースを含まなく
ともよい。

【００１６】本発明はまた、１つの局面で、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラ
クトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備えた植物細胞に関し、この
糖鎖付加機構は、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖であって、このコア糖鎖は
、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、この外部糖
鎖は非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む糖鎖を付加する。

【００１７】本発明はまた、１つの局面で上記の方法によって得られたヒト型糖鎖をもつ糖
タンパク質に関する。

【００１８】

【発明を実施する最良の形態】

以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】本発明を実施することにおいて、他に特定されない限り、当該分野で公知であ
る、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。こ
れらの手法は、市販のキット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。

【００２０】本発明の方法は、ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法に関する。本明細
書において、「ヒト型糖鎖」とは、Ｎ−アセチルグルコサミン残基と結合したガ
ラクトース残基を有する糖鎖をいう。ヒト型糖鎖におけるガラクトース残基は糖
鎖の末端であってもよいし、ガラクトース残基のさらに外側にシアル酸残基が結
合していてもよい。本発明の糖タンパク質は、ヒト型糖鎖のコア糖鎖部分、分岐
糖鎖部分、および末端糖鎖部分からなる１つ以上の部分において、キシロースお
よびフコースの少なくとも一方が結合していないことが好ましく、ヒト型糖鎖の
いずれの部分においてもキシロースおよびフコースの少なくとも一方が結合して
いないことがより好ましく、最も好ましくはヒト型糖鎖中にキシロースおよびフ
コースのいずれも含まないことがさらにより好ましい。

【００２１】植物細胞とは、所望の任意の植物細胞であり得る。植物細胞は、培養細胞、培
養組織中の細胞、培養器官中の細胞、または植物体中の細胞のいずれの形態であ
ってもよい。好ましくは、植物細胞は、培養細胞、培養組織中の細胞、または培
養器官中の細胞であり、最も好ましくは、この植物細胞は、ヒト型糖鎖をもつ糖
タンパク質を産生する、完全な植物、またはその一部にある細胞である。本発明
の生産方法に使用され得る植物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり
得る。本発明の生産方法に使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、
アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植
物が挙げられる。

【００２２】ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕ
ｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ
、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを
含む。

【００２３】イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、
Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙
げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシな
どを含む。

【００２４】アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が
挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含
む。

【００２５】バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａ
ｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リ
ンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。

【００２６】マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕ
ｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈ
ａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、
アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤ
シなどを含む。

【００２７】ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃ
ｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロ
ンなどを含む。

【００２８】シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅ
ｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどを
含む。

【００２９】ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕ
ｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリッ
プなどを含む。

【００３０】アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例
えば、ホウレンソウを含む。

【００３１】セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏ
ｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド
、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。

【００３２】本発明の生産方法に用いられる植物は、好ましくはタバコ、トマト、ジャガイ
モ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ウマゴヤシ、およびホ
ウレンソウであり、より好ましくは、タバコ、トマト、ジャガイモ、トウモロコ
シ、およびダイズである。

【００３３】本明細書において、「非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース
残基の転移反応を行い得る酵素」とは、植物細胞内の糖タンパク質のタンパク質
部分の合成後、糖鎖付加の際に生じる非還元末端アセチルグルコサミン残基へガ
ラクトース残基を転移し得る酵素である。このような酵素の例としては、ガラク
トシルトランスフェラーゼ、ラクトースシンターゼ、β−ガラクトシダーゼが挙
げられる。このような酵素は、任意の動物種に由来し得るが、哺乳動物に由来す
ることが好ましく、ヒトに由来することがより好ましい。

【００３４】本明細書において、「非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース
残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子」は、この酵素をコードすることが公知
のヌクレオチド配列を用いて任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のもの
を購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよ
い。

【００３５】本明細書では、「遺伝子」とは、構造遺伝子部分をいう。遺伝子には、植物で
の発現に適切なように、プロモーター、オペレーター、およびターミネーターな
どの制御配列が連結され得る。

【００３６】本明細書において、「異種糖タンパク質」とは、本発明に用いられる植物にお
いて本来発現されない糖タンパク質をいう。異種糖タンパク質の例としては、酵
素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質な
どが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、キナーゼ、
グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、α−ガラ
クトシダーゼ、フィターゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎ
ｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などが挙げられる。ホルモンおよびサイトカインの例
としては、エンケファリン、インターフェロンアルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ
ＳＦ、絨毛性性腺刺激ホルモン、インターロイキン−２、インターフェロン−ベ
ータ、インターフェロン−ガンマ、エリスロポイエチン、血管内皮細胞増殖因子
（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）
、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺
激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンなどが挙げられる。抗
体の例としては、ＩｇＧ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。ワクチンの例としては、
Ｂ型肝炎表面抗原、ロタウイルス抗原、大腸菌エンテロトキシン、マラリア抗原
、狂犬病ウイルスｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓのＧタンパク質、ＨＩＶウイルス糖
タンパク質（例えば、ｇｐ１２０）などが挙げられる。レセプターおよびマトリ
ックスタンパク質の例としては、ＥＧＦレセプター、フィブロネクチン、α１−
アンチトリプシン、凝固因子ＶＩＩＩなどが挙げられる。血清タンパク質の例と
しては、アルブミン、補体系タンパク質、プラスミノーゲン、コルチコステロイ
ド結合グロブリン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇｇｌｏｂ
ｕｌｉｎ）、スロキシン結合グロブリン（Ｔｈｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅｉｎＣ）などが挙げられる。

【００３７】本明細書において、「異種糖タンパク質の遺伝子」は、目的の異種糖タンパク
質をコードすることが公知のヌクレオチド配列を用いて任意の細胞から単離して
もよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なよう
に改変して用いてもよい。

【００３８】非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い
得る酵素および異種糖タンパク質の遺伝子は、当該分野で公知の方法により、植
物細胞へ導入される。これらの遺伝子は、別々に導入してもよいし、同時に導入
してもよい。植物細胞への遺伝子の導入方法の例としては、アグロバクテリウム
法、エレクトロポレーション法、金粒子法などが挙げられる。

【００３９】遺伝子が導入された植物細胞は、当該分野で公知の方法により、導入された遺
伝子の発現が確認され得る。このような確認方法としては、銀染色、ウェスタン
ブロッティング、ノザンハイブリダイゼーション、酵素活性の検出などが挙げら
れる。導入された遺伝子を発現する細胞は、形質転換細胞である。

【００４０】非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い
得る酵素および異種糖タンパク質を発現する形質転換細胞は、ヒト型の糖鎖を有
する異種糖タンパク質を発現する。つまり、このようにして得られた形質転換植
物は、ヒト型の糖鎖付加機構を有する。形質転換細胞を培養することにより、ヒ
ト型の糖タンパク質が大量に生産され得る。ヒト型の糖タンパク質は、コア糖鎖
および外部糖鎖を含み、このコア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグル
コサミンから本質的になる。得られる糖タンパク質の外部糖鎖は、非還元末端糖
鎖部分を含む。外部糖鎖は、直鎖状構造をもっていても分岐状構造をもっていて
もよい。分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造のいずれかであ
り得る。形質転換細胞により生産される糖タンパク質は、好ましくは、フコース
またはキシロースを含まない。

【００４１】得られた形質転換植物細胞は、培養細胞の状態で維持されてもよいし、特定の
組織または器官へと分化させてもよいし、完全な植物体に再生させてもよい。あ
るいは、完全な植物体から得られる、種子、果実、葉、根、茎、花などの部分で
あってもよい。

【００４２】形質転換植物細胞により生産された、ヒト型の糖鎖をもつ糖タンパク質は、植
物細胞から単離または抽出されてもよい。糖タンパク質の単離方法は、当該分野
で公知である。あるいは、本発明の糖タンパク質は、形質転換細胞中に含まれた
ままの状態で食用に供され得る。本発明の糖タンパク質は、ヒト型の糖鎖付加を
有するので、抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適している
。

【００４３】以後、本発明を、制限ではない例示の実施例によって詳細に記載する。

【００４４】

【実施例】

（実施例１）ヒトβ１−４ガラクトース転移酵素遺伝子のクローニング β１−４ガラクトース転移酵素（ｈＧＴ）（ＥＣ２．４．１．３８）は、すで
にクローン化されており、４００アミノ酸からなる一次構造が明らかにされてい
る（Ｍａｓｒｉ，Ｋ．Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５７，６５７−６６３，１９８８）。

【００４５】（１）プライマーの作製と鋳型ＤＮＡＭａｓｒｉ．らの報告を参考にし、以下のようなプライマーを作製した。ｈＧＴ−５Ｅｃｏ：５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧ
ＣＧＴＣＣＣＴ−３’（配列番号１）ｈＧＴ−２Ｓａｌ：３’−ＴＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴ
ＧＡＴＧ−５’（配列番号２）ｈＧＴ−７Ｓｐｅ：３’−ＡＣＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＡＴＧＡＴ
ＣＡＴＡＡ−５’（配列番号３）ｈＧＴ６Ｓｐｅ：５’−ＡＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴ
ＧＡ−３’（配列番号４）鋳型ＤＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したヒトゲノムＤＮＡ、ヒト胎盤
ｃＤＮＡ、ヒト腎臓ｃＤＮＡを用いた。

【００４６】（２）ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡのクローニング（ｉ）ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｈＧＴ−５ＥｃｏとｈＧＴ−７Ｓｐｅと
をプライマーに用い；および（ｉｉ）ヒト胎盤ｃＤＮＡを鋳型とし、ｈＧＴ−２
ＳａｌとｈＧＴ６Ｓｐｅとをプライマーに用いた、２つの組み合わせで以下の条
件でＰＣＲ反応を行い、ｈＧＴをコードする領域を含む０．４ｋｂおよび０．８
ｋｂの断片を得た。（ＰＣＲ反応系）鋳型ＤＮＡ１μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰｓ（
２００μＭ）４μｌ、プライマー（１０ｐｍｏｌ）、Ｔａｇポリメラーゼ（宝酒
造（株））０．５μｌ（Ｔｕｂポリメラーゼの場合は０．２μｌ）に水を加えて
５０μｌとした。（ＰＣＲ反応条件）第１段階：サイクル数１、変性（９４℃）５分、アニーリン
グ（５５℃）１分、伸長（７２℃）２分。第２段階：サイクル数３０、変性（９
４℃）１分、アニーリング（５５℃）１分、伸長（７２℃）２分。第３段階：サ
イクル数１、変性（９４℃）１分、アニーリング（５５℃）２分、伸長（７２℃
）５分。

【００４７】得られた２つの断片を組み合わせてｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡを構築し、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＳＫ）にサブクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＳＫ）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入した。図２に、
ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡを含むプラスミドの構築を示す。得られたｈＧＴ遺伝子の
塩基配列を配列番号５に、そして推定されるアミノ酸配列を配列番号６に示す。

【００４８】得られた配列は、Ｍａｓｒｉら（上述）に開示のｈＧＴ配列と比較して以下
の点で異なっていた。ａ）位置５２８のＡがＧに、位置５６２のＣがＴに、位置
１０４７のＡがＧにそれぞれ変わっていたがコードされるアミノ酸に変化はなか
った。ｂ）位置６２２から６３０の９塩基が欠失していた。ｃ）得られた上記の
０．４ｋｂおよび０．８ｋｂの断片を接続するためにプライマー作製時に位置４
０５のＧをＡに、位置４０８のＴをＡにそれぞれ変換した。なお、ｈＧＴ遺伝子
ｃＤＮＡには２つの開始コドン（ＡＴＧ）があるが、本実験では、第２番目の開
始コドン（位置３７）から翻訳が始まるように設計した。

【００４９】（実施例２）ｈＧＴ遺伝子のタバコ培養細胞への導入（１）ｈＧＴは大腸菌で活性型として発現することが報告されている（Ａｏｋ
ｉ，Ｄ．ら，ＥＭＢＯＪ．，９，３１７１，１９９０、およびＮａｋ
ａｚａｗａ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３，７４７，１９
９３）。

【００５０】ｈＧＴをタバコ培養細胞で発現するために、発現用ベクターｐＧＡｈＧＴを図
３に示すように構築した。プロモーターとしては、植物細胞内で構成的に発現す
るカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーター）を用いた。選択マーカーにはカナマイシン耐性遺伝子を用いた。ｐＧＡ
ｈＧＴをアグロバクテリウムを介してタバコ培養細胞に導入した。

【００５１】アグロバクテリウムの形質転換は、Ｂｅｖａｎ．ら，のｔｒｉｐａｒｅｎｔａ
ｌｍａｔｉｎｇ法（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．
，１２，８７１１，１９８４）を用いて行った。ｐＧＡ系プラスミド（Ａｎ，Ｇ
．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５３，２９２，１９８７）をもつ大
腸菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５α株（ｓｕＥ４４、ΔｌａｃＵ
１６９、（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓｄＲ１７）（ＢｅｔｈｅｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．：Ｆｏｃｕｓ８（２）
、９（１９８６））、およびヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Ｂｅｖａｎ，
Ｍ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１２，８７１１，１９８４）を
もつ大腸菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１を、それぞれ１２．
５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ培
地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株（Ｅｌｉｚａｎｂｅｔｈ，Ｅ．Ｈ．，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８，１２９１，１９８６）を、５０ｍｇ／ｌのカナマイ
シン、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地で２８℃で２晩
培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブにとり集菌した後、Ｌ
Ｂ培地で３回洗浄した。得られた菌体をそれぞれ１００μｌの２×ＹＴ培地に懸
濁した後、３種類の菌を混合し、２×ＹＴ寒天培地に塗抹し、２８℃で培養して
ｐＧＡ系プラスミドを大腸菌からアグロバクテリウムに接合伝達させた。２日後
、２×ＹＴ寒天培地上で一面に増殖した菌体の一部を白金耳でかきとり、５０ｍ
ｇ／ｌのカナマイシン、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン、２５ｍｇ／ｌの
クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養し
た後、単一コロニーを選択した。

【００５２】タバコ培養細胞の形質転換は、Ａｎ，Ｇ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ．Ｍ
ａｎｎｕａｌ，Ａ３，１．に記載の方法により行った。テトラサイクリン１２．
５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地で２８℃で３６時間培養したアグロバクテリウム（ｐ
ＧＡ系のプラスミドをもつＥＨＡ１０１株）と培養４日目のタバコ培養細胞Ｎｉ
ｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ．ｂｒｉｇｈｔｙｅｌｌｏｗ２
（理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター、ジーンバンク室植物細胞開
発銀行のカタログ番号RPC1より細胞株名ＢＹ−２として入手した）の懸濁液をそ
れぞれ１００μｌ、４ｍｌずつシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃に暗所で静置
した。２日後シャーレの中の培養液を遠心管に移して遠心分離（１０００ｒｐｍ
、５分）により上澄みを除いた。次に新しい培地を入れて遠心分離し、細胞を１
５０〜２００ｍｇ／ｌのカナマイシン、２５０ｇｍｇ／ｌのカルべニシリンの入
った改変ＬＳ寒天培地のプレートに塗抹し、２５℃暗黒下で静置した。約２〜３
週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを
選択した。さらに２〜３週間後に、カナマイシン、カルベニシリンを加えた改変
ＬＳ培地３０ｍｌに移し、継代培養を行った。約１ケ月間選択を繰り返した。得
られたいくつかの耐性株の中から無作為に６つの耐性株（ＧＴ１、４、５、６、
８、および９）を選択した。

【００５３】（２）導入されたｈＧＴ遺伝子の確認得られた耐性株についてＴ−ＤＮＡ中の、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−ｈＧ
Ｔ遺伝子ｃＤＮＡ−ＮＯＳターミネーターを含む２．２ｋｂの断片がタバコ培養
細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていることをサザン解析により確認した。上
記の各耐性株からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し
た後、サザン解析を行った。

【００５４】タバコ培養細胞からの染色体ＤＮＡの調製は、渡部の方法（渡部格、「クロー
ニングとシーケンス」、植物バイオテクノロジー実験マニュアル、農村分化社）
に従って行った。まず最初に、タバコ培養細胞１０ｍｌを液体窒素で凍結し、乳
鉢、乳棒を用いて、粉末状になるまで粉砕した。得られた約５ｇの粉末が融解し
ないうちに、遠心管（４０ｍｌ）中で６０℃に予熱した５ｍｌの２×ＣＴＡＢ（
セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍ
ｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ））液に入れてゆっくりよく混ぜ、６０℃で１０分
間以上、時々混ぜながら保温した。クロロホルム：イソアミルアルコール（２４
：１）５ｍｌを加え、エマルジョンができるまでよく混ぜてから、遠心分離（２
，８００ｒｐｍ、１５分、室温）した。上層を新しい４０ｍｌ遠心管に移し、ク
ロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて抽出操作を繰り返した
。得られた上層に１／１０容量の１０％ＣＴＡＢを入れてよく混合した後、遠心
分離操作を行った（２，８００ｒｐｍ、１５分、室温）。上層を新しい遠心管に
移し、１容量の冷イソプロパノールを入れて良く混ぜ、遠心分離（４，５００ｒ
ｐｍ、２０分、室温）した。上清液をアスピレータで除いた後、５ｍｌの１Ｍ塩
化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液を入れ、５５〜６０℃で完全に溶解した。これに
、５ｍｌの冷イソプロパノールを入れ、ＤＮＡが見えたら、チップの先に引っか
けてエッペンドルフチューブ（８０％冷エタノール入り）に移しリンスした。さ
らにＤＮＡを７０％エタノールでリンスし、乾燥した沈殿を、適当量のＴＥ緩衝
液に溶かし、５μｌのＲＮＡａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１時
間反応させた：２×ＣＴＡＢ液の組成；２％ＣＴＡＢ、０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１．４Ｍ塩化ナトリウム、１％ポリビニルピロリドン（Ｐ
ＶＰ）；１０％ＣＴＡＢ液の組成；１０％ＣＴＡＢ、０．７Ｍ塩化ナトリウム。

【００５５】サザン解析は、以下のように行った。

【００５６】（ｉ）ＤＮＡの電気泳動およびアルカリ変性：得られた染色体ＤＮＡ４０μｇ
を制限酵素で完全分解した後、標準的な方法を用い、１．５％アガロースゲル電
気泳動（５０Ｖ）を行った。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、写真撮影し
た後、４００ｍｌの０．２５ＭＨＣｌ中で２０分間振とうした後、液を捨て、
４００ｍｌの変性溶液（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨ）にゲルを浸
し、４５分間ゆっくり振とうした。次いで液を捨て、４００ｍｌの中和溶液（１
．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４））を入れて１５分
間ゆっくり振とうした後液を捨て、再び中和溶液を４００ｍｌ入れて１５分間ゆ
っくり振とうした。（ｉｉ）トランスファー：電気泳動後のＤＮＡを、２０×Ｓ
ＳＣを用いてナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−ＮＡｍｅｒｓｈａｍ）にト
ランスファーした。トランスファーは１２時間以上行った。プロットしたメンブ
レンを、室温で、１時間乾燥させた後、５分間ＵＶ固定を行った。２０×ＳＳＣ
の組成：３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム。（ｉｉｉ）ＤＮＡプロ
ーブの調製：ＤＮＡプローブの調製は、ＲａｎｄｏｍｐｒｉｍｅＬａｂｅｌ
ｉｎｇＫｉｔ（宝酒造）を用いて行った。エッペンドルフチューブに次の反応
液を調製し、９５℃、３分間加熱後、氷中で急冷した；鋳型ＤＮＡ２５ｎｇ、
ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ２μｌ、水を加えて５μｌとする。１０×緩衝液
、ｄＮＴＰをそれぞれ２．５μｌ、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（１．８５ＭＢｑ、５
０ｍＣｉ）を５μｌ加え、Ｈ₂Ｏで２４μｌにフィルアップした。Ｋｌｅｎｏｗ
ｆｒａｇｍｅｎｔ１μｌを加え、３７℃で１０分間保温した後、ＮＡＰ１０
カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で溶出させてＤＮＡを精製した。９５℃で３
分間加熱した後、氷中で急冷し、ハイブリダイゼーションブローブとした。（ｉ
ｖ）ハイブリダイゼーション：０．０５ｍｇ／ｍｌ０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ
を、以下のプレハイブリダイゼーション溶液に加えて、上記（ｉｉ）のメンブレ
ンを浸漬し、４２℃で２時間以上プレハイブリダイゼーションを行った。その後
、（ｉｉｉ）で調製したＤＮＡプローブを加え、４２℃で１２時間以上ハイブリ
ダイゼーションを行った：プレハイブリダイゼーション溶液の組成；５×ＳＳＣ
、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５×デンハルト
溶液（１００×デンハルト溶液を希釈して使用）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。
１００×デンハルト溶液の組成：２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃ
ｏｌ４００、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）。（ｖ）オート
ラジオグラフィー：以下の順で洗浄した後、標準的な方法によりオートラジオグ
ラフィーを行った。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間、２回、
次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間、１回。

【００５７】上記で得られた耐性株のそれぞれから調製したゲノムＤＮＡのサザン分析の結
果を図４に示す。図４に示されるように、ＧＴ１、６、８および９の４株につい
てｈＧＴ遺伝子が組み込まれていることが確認された。

【００５８】（実施例３）ガラクトシルトランスフェラーゼ形質転換体の解析培養５〜７日目の形質転換体（ＧＴ−１、６、８、および９）および野生型の
ＢＹ−２細胞の培養液からそれぞれ細胞を回収し、抽出緩衝液（２５ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；０．２５Ｍスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ₂、５０
ｍＭＫＣｌ）に懸濁し、そして超音波処理により破壊（２００Ｗ；Ｋａｉｊｏ
ＤｅｎｋｉＣｏ．，Ｊａｐａｎ）またはホモゲナイズした。細胞抽出液とミ
クロソーム画分を、Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，Ｔ．らの方法（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅ
ｋ，Ｔ．およびＥｒｎｓｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｇｅｎｅ１４５，２９９−３０３，１９
９４）に従って調製した。ｈＧＴタンパク質の発現は、抗ヒトガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ（ＧＴ）モノクローナル抗体（ＭＡｂ８６２８；１：５０００
）（Ｕｅｊｉｍａ，Ｔ．ら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，５２，６１５８−６１６３
，１９９２；Ｕｅｍｕｒａ，Ｍ．ら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５２，６１５３
−６１５７，１９９２）（創価大学成松博士より供与）を用いてウェスタンブロ
ッティングにより検出した。次いでブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合
ヤギ抗マウスＩｇＧ（５％スキムミルク中１：１０００；ＥＹＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）とインキュベートし、洗浄し、そして西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ発色反応は、ＰＯＤ免疫染色キット（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃ
ａｌｓ，Ｏｓａｋａ）を用いて実施した。

【００５９】植物特異的複合グリカンのイムノブロット分析は、ニンジン細胞壁β−フルク
トシダーゼに対して惹起されたポリクローナル抗血清および西洋ワサビペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（５％スキムミルク中１：１０００；Ｓｉ
ｇｍａ）を用いて実施した（Ｌａｕｒｉｅｒｅ，Ｍ．ら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓ
ｉｏｌ．９０，１１８２−１１８８，１９８９）。

【００６０】 β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性は、基質として、ＵＤＰ−ガラ
クトースおよびピリジルアミノ標識（ＰＡ−）ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡ
ｃ₂（ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡ）を用いてアッセイした（Ｍｏ
ｒｉｔａ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３，３３２−３３５，１９８８）
。酵素反応液は、１〜１２０μｇのタンパク質、２５ｍＭカコジル酸ナトリウム
（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｎＣｌ₂、２００μＭＵＤＰ−ガラクトース、
および１００ｎＭＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡを含んでいた。
反応産物は、ＰＡＬＰＡＫＴｙｐｅＲおよびＴｙｐｅＮカラム（Ｔａｋａ
ｒａ社製）を製造業者の推奨する処方に従って用いてＨＰＬＣにより分析した。
ＰＡ標識した標準として用いたＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡ、Ｇ
ａｌ₂ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡおよびＧａｌＧｌｃＮＡｃ₂Ｍ
ａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡの２つのアイソマーは、ＴＡＫＡＲＡＳＨＵＺＯお
よびＨｏｎｅｎ，Ｃｏ．から購入した。

【００６１】図５に、形質転換体および野生型由来のタンパク質のイムノブロッティングを
示す。図５に示すように、分子量約５０ｋＤａのポジティブシグナルが観察され
た。これは、アミノ酸配列から推定される分子量（約４０ｋＤａ）より大きく、
腹水から精製された、または酵母で発現されたウシガラクトシルトランスフェラ
ーゼ（Ｕｅｍｕｒａ，Ｍ．ら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２，６１５３−６１５
７，１９９２；Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１（７），３３９８−３４０５，１９９６）とほぼ等しかった。細胞溶解液（図
５、レーン１〜４）と比較してミクロソーム画分（図５、レーン６〜８）で観察
された強い免疫反応性バンドは、ｈＧＴが細胞内に優先的に局在化していたこと
を示す。野生型細胞には、免疫反応性のバンドは検出されなかった。

【００６２】形質転換体ＧＴ６および野生型ＢＹ−２のミクロソーム画分のタンパク質を、
ＲＣＡ₁₂₀アガロースカラム（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ）
に結合させ、１５容量の１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ６．０で洗浄した。次い
で０．２Ｍラクトースで結合したタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画
した後、銀染色（ＷａｋｏＳｉｌｖｅｒＳｔａｉｎｉｎｇＫｉｔ）（図６
）またはレクチン染色した（図７）。レクチン染色には、膜ブロットをＴＴＢＳ
緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；０．１５ＭＮａＣｌ、０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＲＣＡ ₁₂₀ （ＨｏｎｅｎＣｏ．社製）とインキュベートし、そしてＰＯＤ免疫染色キ
ット（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ）を用いてガラクトシル化さ
れたグリカンを可視化した（図７）。図７に示すように、野生型のＢＹ２細胞で
はＲＣＡ₁₂₀の結合は観察されなかったが、ＧＴ６は、グリカン成分の非還元末
端にガラクトースを持つ糖タンパク質を有していた。

【００６３】野生型ＢＹ２細胞およびＧＴ６細胞からのタンパク質抽出物およびＲＣＡ₁₂₀
アフィニティークロマトグラフィーからのＧＴ６の溶出タンパク質を、複合グリ
カンに特異的なポリクローナル抗血清でプローブした（図８）。用いた抗血清は
主に植物糖タンパク質上のβ１，２−キシロース残基に結合する（Ｌａｕｒｉｅ
ｒｅ，Ｍ．ら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９０，１１８２−１１８８，１９
８９）。図８に示すように、野生型ＢＹ２細胞（レーン１）は用いたポリクロー
ナル抗血清と反応するいくつかの糖タンパク質を含んでいた。ＧＴ６は抗血清と
反応する糖タンパク質の量が減少した（レーン２）。ＲＣＡ₁₂₀アフィニティー
クロマトグラフィーから溶出したＧＴ６糖タンパク質は、ポリクローナル抗血清
に結合せず、ガラクトシル化されたグリカンはβ１，２−キシロース残基を含ん
でいないことを示した（レーン３）。

【００６４】（実施例４）ｈＧＴ導入タバコ培養細胞への西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）遺伝子の導入上記で得られたＧＴ６株に西洋ワサビペルオキシダーゼを導入した。異なる型
の植物ペルオキシダーゼの中で、西洋ワサビペルオキシダーゼ、特に中性アイソ
ザイムＣは、いわゆるＨＲＰ（ＥＣ１．１１．１．７．）として、最もよく研究
されている。ＨＲＰは、基質特異性が広く、安定性に優れることから種々の酵素
反応、例えば、ウェスタンブロッティングの２次抗体などの酵素免疫法に利用さ
れている。現在、西洋ワサビペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子は多数クロー
ニングされている（Ｆｕｊｉｙａｍａ，Ｋ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，１７３，６８１−６８７，１９８８およびＦｕｊｉｙａｍａ，Ｋ．ら，Ｇｅｎ
ｅ，８９，１６３−１６９，１９９０）。それらのうちｐｒｘＣｌａがコードす
るＣｌａペルオキシダーゼ（ＣｌａＰＲＸ）は、Ｎ末端側の３０アミノ酸、Ｃ末
端側の１５アミノ酸からなるエキストラペプチドを含む３５３アミノ酸からなる
タンパク質として翻訳され、その後プロセッシングをうけて、３０８アミノ酸か
らなる成熟型酵素となることが明らかにされた（Ｆｕｊｉｙａｍａ，Ｋ．ら，Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７３，６８１−６８７，１９８８）。ＣｌａＰ
ＲＸの分子量は、４２，２００〜４４，０００であり、そのうち糖鎖が２２〜２
７％を占めており、Ｎ−結合型糖鎖は８本存在することが知られている（Ｗｅｌ
ｉｎｄｅｒ，Ｋ．Ｇ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９６，４８３−５０２
，１９７９）。ＣｌａＰＲＸ遺伝子の導入は、図９に示すＨＲＰ発現用バイナリ
ーベクターｐＢＩＨｍ−ＨＲＰを用いて行った。

【００６５】なお、このｐＢＩＨｍ−ＨＲＰは、以下のようにして調製した。まず、ＨＲＰ
ｃＤＮＡを保持する植物用発現ベクター３５Ｓ−ｐｒｘＣ１ａ（Ｋａｗａｏｋａ
Ａ．ら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７８，４９−５３，１９９４）
から１．９ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を切り出して調製した。この
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片は、０．８ｋｂｐのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
に続く完全長の１．１ｋｂｐのｐｒｘＣ１ａｃＤＮＡ断片を含む。１．９ｋｂｐ
のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を、バイナリーベクターであるｐＢＩ１０１Ｈ
ｍＢ（ＡｋａｍａＫ．ら，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１２，７−１１，
１９９２）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ部位に挿入した。ＨＰＴ遺伝子（ハイグ
ロマイシン耐性遺伝子）の３’末端側のＢａｍＨＩ部位は破壊してある。

【００６６】ＧＴ６株はカナマイシン耐性であるので、選択マーカーとしてハイグロマイシ
ン耐性遺伝子であるｈｐｔ遺伝子（Ｇｒｉｚ，Ｌ．およびＤａｖｉｅｓ，Ｊ．、
Ｇｅｎｅ，２５，１７９−１８８，１９８３）を用いた。ＨＲＰによるＧＴ６株
の形質転換は、Ｒｅｍｐｅｌ．Ｄ．Ｈ．およびＮｅｌｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．の方法（
Ｒｅｍｐｅｌ，Ｈ．Ｃ．およびＮｅｌｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｒｅｓ．４：１９９−２０７，１９９５）に記載の方法により行った。同様に
、コントロールのＨＲＰ形質転換体を得るために、野生型ＢＹ２細胞にＨＲＰ形
質転換体を導入して、ＢＹ２−ＨＲＰ株を得た。ｈＧＴとＨＲＰの二重形質転換
体ＧＴ６−ＨＲＰは、通常の形質転換体と同様の期間で取得することができた。

【００６７】（実施例５）二重形質転換タバコ培養細胞におけるＨＲＰの発現の確認得られた二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰ、コントロールのＢＹ２−ＨＲＰ、野
生型（ＷＴ）について、以下に示す方法で、ＨＲＰ活性発現について調べた。表
１に示すように、ＨＲＰ遺伝子導入形質転換体は、野生株に比べて、約５倍のペ
ルオキシダーゼ活性を示した。

【００６８】

【表１】野生型にＨＲＰ遺伝子を導入して得られたクローンＢＹ２−ＨＲＰは、ｈＧＴと
ＨＲＰの二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰと同程度のペルオキシダーゼ活性を示し
た。

【００６９】（ペルオキシダーゼ活性測定）タバコ培養細胞をＳｏｌｕｔｉｏｎＤの入ったエッペンドルフチューブに入
れ、ホモジナイザー（ＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒＳ−２０３、池田理化社製）を用
いて粉砕した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）により上清液
を回収し、これを粗酵素液とした。１ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＡ、１ｍｌのＳ
ｏｌｕｔｉｏｎＢおよび２ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＣを混合し、２５℃で５
分間保温した。これにＳｏｌｕｔｉｏｎＤで適当に希釈した粗酵素液を加え、
２５℃で３分間反応させた。０．５ｍｌの１ＮＨＣｌを加えることにより反応
を停止し、４８０ｎｍの吸光度を測定した。対照としては、酵素添加前に１Ｎ
ＨＣｌを添加した液を用いた：ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ；１ｍＭ ο−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌＳｏｌｕｔｉｏｎＢ；４ｍＭＨ₂Ｏ₂ ＳｏｌｕｔｉｏｎＣ；２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）ＳｏｌｕｔｉｏｎＤ；１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）次に、このペルオキシダーゼ活性の上昇が、ＨＲＰの発現によるものであるか
否かを確認するために、等電点電気泳動で分離後、ゲルの活性染色を行った。等
電点電気泳動は、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のモデル１１１ミニＩＥＦセルを用いて行
った。ＰＡＧＥゲルサポートフィルムの疎水面をガラスプレートに密着させた後
、キャスティングトレーにのせた。調製したゲル用溶液をサポートフィルムとキ
ャスティングトレーの間に流し込んで、蛍光灯の下４５分間光重合させた。作製
したゲルに試料を塗布し、蒸留水で湿らせた泳動槽にある両グラファイト電極に
ゲルが接するように置き、１００Ｖ１５分、２００Ｖ１５分、４５０Ｖ６
０分の条件で電気泳動を行った。ゲル用溶液（ゲル１枚分）の組成は以下の通り
である：蒸留水２．７５ｍｌ、アクリルアミド（２５％Ｔ、３％Ｃ）１．０ｍｌ
、２５％グリセロール１．０ｍｌ、バイオライト（４０％、ｐＨ３〜１０）０．
２５ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム７．５μｌ、０．１％リボフラビン−５’
−リン酸ナトリウム２５μｌ、ＴＥＭＥＤ１．５μｌ。

【００７０】ペルオキシダーゼの活性染色は、関根らの方法（関根ら，植物細胞工学、６、
７１−７５、１９９４）に従って行った。図１０に示すように、ＢＹ２−ＨＲＰ
株と、ＧＴ６−ＨＲＰ株において、野生株には存在しない顕著なバンドがｐＩ
７．８の位置に検出された。抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタン解析を行った結果
、同じｐＩ７．８に対応する位置にシグナルが検出され、ｈＧＴとＨＲＰの二
重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰにおいてＨＲＰが発現していることが確認された。

【００７１】（実施例６）形質転換細胞ＧＴ６細胞中のＮ−結合型糖鎖の構造解析（糖鎖構造の解析方法）形質転換細胞ＧＴ６細胞のＮ-結合型糖鎖構造を、逆相ＨＰＬＣとサイズ分画
ＨＰＬＣを組み合わせて、さらに二次元ＰＡ化糖鎖マッピング、エキソグリコシ
ダーゼ消化、イオンスプレータンデムマススペクトロメトリー（ＩＳ−ＭＳ/Ｍ
Ｓ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により解析した。まず、細胞抽出液をア
セトンで脱脂後、１００℃、１２時間ヒドラジン処理し、糖鎖部分を遊離させた
。ヒドラジン分解物を、Ｎ-アセチル化し、Ｄｏｗｅｘ５０Ｘ２およびＤｏｗ
ｅｘ１Ｘ２（それぞれ、代理店室町化学工業株式会社、ＴｈｅＤｏｗＣｈ
ｅｍｉｃａｌＣｏ．社製）により脱塩し、０.１ＮアンモニアによりＳｅｐｈ
ａｄｅｘＧ-２５ゲルろ過カラム（１.８×１８０ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社製）を用いて分画した。ピリジルアミノ化（ＰＡ化）は先に述べた通りである
。ＰＡ化糖鎖を、Ｊａｓｃｏ８２１-ＦＰＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔＳｐｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ付きＪａｓｃｏ８８０-ＰＵＨＰＬＣ装置（日
本分光社製）により、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−Ｐ及びＡｓａｈｉｐａｋ
ＮＨ２Ｐ−５０をカラムに用いて分離した。溶出位置を、自ら調製したか、ある
いは購入した（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓおよびＴＡＫＡＲＡＳＨＵＺＯ
）既知の標準品と比較した。

【００７２】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）あるいはマンノ
シダーゼ（タチナタマメ、Ｓｉｇｍａ）を用いたグリコシダーゼ消化は、Ｋｉｍ
ｕｒａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（２
）、２１５−２２２、１９９２で述べた方法と同様の条件下で約１ｎｍｏｌのＰ
Ａ化糖鎖について行った。β-ガラクトシダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）とＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓｓａｉｔｏｉ由来のα-１，２マンノシダーゼ（東北大学吉田孝
博士より分与）による消化については、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５.５）中に１ｎｍｏｌのＰＡ化糖鎖を２００ｍＵ β-ガラクトシダーゼあるい
は６０μｇ α-１，２マンノシダーゼを３７℃で加温した。酵素反応を沸騰さ
せて停止し、消化物の一部をサイズ分画ＨＰＬＣにより解析した。生じた消化物
の分子量はイオンスプレーマススペクトロメトリー（ＩＳ−ＭＳ/ＭＳ）により
解析し、そして/あるいはＰａｌａｃｐａｃ，Ｎ．Ｑ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３（１）３５−３９、１９９９およびＫｉｍｕ
ｒａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（２）、２１５
−２２２、１９９２に示されているように標準糖鎖と比較した。

【００７３】ＩＳ−ＭＳ/ＭＳ実験は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＳｃｉｅｘＡＰＩ−
ＩＩＩにより行った。ポジティブモードで、イオンスプレーの電圧を４２００Ｖ
にて行った。スキャンニングを０.５Ｄａ毎で行い、ｍ/ｚを２００から記録した
。

【００７４】（ＧＴ６細胞の糖鎖の解析）ＧＴ６細胞より調製したＰＡ化糖鎖を精製し、逆相ＨＰＬＣとサイズ分画ＨＰ
ＬＣを組み合わせて解析した。サイズ分画ＨＰＬＣのもとで、１０〜２０分の位
置のフラクションＩ（図１１）には、Ｎ-結合型糖鎖は溶出しておらず、ヒドラ
ジン分解による副産物を含む非吸着部分であることを示唆している。ＭＳ/ＭＳ
解析では、ＰＡ-ＧｌｃＮＡｃに相当する３００というｍ/ｚ値を持つフラグメン
トイオンを検出できなかった。同様に、５０〜６０分の位置のフラクションＸＩ
も、サイズ分画ＨＰＬＣで溶出を示すピークを検出できなかったので、Ｎ-結合
型糖鎖を含んでいないことがわかった。しかし、サイズ分画ＨＰＬＣ（図１１）
におけるフラクションＩＩからＸまでの解析から、図１２に示すＡ〜Ｑを含む全
部で１７のピークを回収および精製した。

【００７５】ＩＳ−ＭＳ/ＭＳ分析は、これらのピークのうち７つのピークがＮ-結合型糖鎖
であることを示した。以下各ピークの分析結果を示す。

【００７６】オリゴ糖-Ａ、-Ｅ、-Ｈ、-Ｉ、-Ｍ、-Ｏ、-Ｐ、及び-Ｑ（図１２）の溶出位置
及び分子量は、ＰＡ化糖鎖標準品と対応せず、ＭＳ/ＭＳ解析ではＰＡ-ＧｌｃＮ
Ａｃ及びＰＡ-ＧｌｃＮＡｃ₂に相当する３００及び５０３というｍ/ｚ値を有し
ていたが、Ｎ-結合型糖鎖一般的に認められるＭａｎＧｌｃＮＡ₂（Ｍ１）或いは
トリマンノースコア糖鎖Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂（Ｍ３）に相当するフラグメント
イオンを検出できなかった（データ未掲載）。他のピークのオリゴ糖-Ｂ，-Ｄ及
び-Ｎも、３００というｍ/ｚ値を持つフラグメントイオンを検出できなかったの
で、Ｎ-結合型ではなかった。そこで残りの７つのＮ-結合型糖鎖について調べた
。

【００７７】ピーク-Ｃ（ｍ/ｚ１６３７.５；モル存在比９.３％）、ピーク−Ｆ（［Ｍ＋２
Ｈ］２＋ｍ／ｚ８１９．５，［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ１６３９；モル存在比１５
．９％）、およびピーク−Ｇ（ｍ／ｚ１４７５．５モル存在比１９．５％）の
溶出位置と分子量はそれぞれ、高マンノース型糖鎖Ｍａｎ₇ＧｌｃＮＡＣ₂（アイ
ソマーＭ７Ａ及びＭ７Ｂ）、およびＭａｎ₆ＧｌｃＮＡｃ₂（Ｍ６Ｂ）であった。
タチナタマメ α−マンノシダーゼで消化すると、各Ｎ-結合型糖鎖は、サイズ
分画ＨＰＬＣによりＭａｎＧｌｃＮＡｃ（Ｍ１）へと分解されていることを示し
た（データ未掲載）。消化物のＩＳ−ＭＳ実験によりｍ/ｚ値６６５.５というイ
オンは、Ｍ１の計算値６６４.６６に対応していたことから、これらは対応する
個々のＰＡ化糖鎖標準品と構造的に同一であることを示している。

【００７８】ピーク-Ｊ（６.６％）は、分子量１１２１.５を有していたが、これはＭａｎ₃ Ｘｙｌ₁ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ（Ｍ３Ｘ）の分子量計算値ｍ/ｚ１１２１.０５と同
じであった。９８９.５、８２７.５、６６５.５、５０３.３及び３００に見られ
たフラグメントイオンの位置は、Ｍａｎ₃Ｘｙｌ₁ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡから逐次Ｘ
ｙｌ、Ｍａｎ、Ｍａｎ、Ｍａｎ及びＧｌｃＮＡｃがこの順序で遊離したことと矛
盾しない。タチナタマメα-マンノシダーゼで処理すると、非還元末端のマンノ
ース残基を除去でき、２次元マッピングはＭａｎ₁Ｘｙｌ₁ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡの
溶出位置と同じであった（データ未掲載）。

【００７９】ピーク-Ｋ（１３.２％）のＩＳ−ＭＳ実験の解析結果は、このフラクションが
２種のＮ-結合型糖鎖を含むことを示し、そのひとつは分子量が１３１４.０（１
.４％）で他方が１３５４.５（１１.８％）だった。このフラクションをさらに
逆相ＨＰＬＣに供し、精製し、更に解析した。分子量１３１４.０を有する糖鎖
ピーク-Ｋ-１は、糖鎖標準品Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ（Ｍ５）と二次元マッ
ピング及びｍ／ｚ測定値が同一だった。さらに、タチナタマメα-マンノシダー
ゼで処理すると、その分解産物の溶出位置が２次元マッピングでＭ１と同じ位置
に移動したことら、４つのマンノース残基が除去されたことを示した。

【００８０】（ＧＴ６細胞中のガラクトースが付加したＮ-結合型糖鎖）ｍ／ｚ１３５４.５を有する糖鎖ピーク-Ｋ-２は、Ｇａｌ₁ＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａ
ｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ３）の予想される分子量ｍ／ｚ１３５４.
３とよく一致していた。質量分析の結果から、親分子から派生したと考えられる
フラグメントイオンはそれぞれ、ｍ／ｚ１１９３.５がＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₃Ｇ
ｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ９８９.５がＭａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ８２
７.５がＭａｎ₂ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ６６５がＭａｎＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ
、ｍ／ｚ５０３がＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ３３６がＭａｎＧｌｃＮＡｃ、ｍ
／ｚ３００がＧｌｃＮＡｃ-ＰＡそしてｍ／ｚ２０４がＧｌｃＮＡｃであった。
推定されるＮ-結合型糖鎖構造から、ＧａｌＧＮＭ３の２種のアイソマーが考え
られる（図１３）。すなわち、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｍａｎ
α３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮａｃβ４ＧｌｃＮＡｃ-ＰＡ及びＭａｎα６（Ｇａｌ
β４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ-
ＰＡである。精製したＰＡ化糖鎖は、糖鎖標準品Ｍａｎα６（Ｇａｌβ４Ｇｌｃ
ＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ-ＰＡと同一
の逆相ＨＰＬＣの溶出位置であった（図１３のＢ）。

【００８１】糖鎖をエキソグリコシダーゼで処理し、そして糖鎖構造を確認した。Ｄ. ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ β-ガラクトシダーゼはＧａｌβ１-４ＧｌｃＮＡｃ結合特異
的であるが、本酵素による消化物はＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡと
サイズ分画ＨＰＬＣにて同一の位置に溶出した（図１４Ａ−ＩＩ）。また、ＩＳ
−ＭＳ/ＭＳ分析からｍ／ｚ１１９２.０が得られた。これらの結果は、１つのガ
ラクトース残基が、β１-４結合している非還元末端のＧｌｃＮＡｃから除去さ
れたことを示している。さらにこの産物を、β１-２ＧｌｃＮＡｃ結合特異的な
Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＮ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニダーゼ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．らＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９３
，１３５−１４７、１９８３）で消化すると、その消化物は標準品Ｍａｎ₃Ｇｌ
ｃＮＡｃ₂-ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同じ位置に溶出した（図１４Ａ−ＩＩ
Ｉ）。続いてタチナタマメα-マンノシダーゼで処理すると、標準品ＭａｎＧｌ
ｃＮＡｃ₂-ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同じ位置に溶出した（図１４Ａ−ＩＶ
）。糖鎖構造を図１５のＫ−２に示す。

【００８２】ピーク-Ｌ（３５.５％）は、質量分析結果から［Ｍ+２Ｈ］２+が８４０、［Ｍ
+Ｈ］+が１６８０.０であり、Ｇａｌ₁ＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ
（ＧａｌＧＮＭ５）の予想される分子量ｍ／ｚ１６７８.５５とよく一致してい
た。質量分析の結果から、親分子から派生したと考えられるフラグメントイオン
はそれぞれ、ｍ／ｚ１３１３.５がＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ１１５２
がＭａｎ₄ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ９８９.５がＭａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ
、ｍ／ｚ８２７.５がＭａｎ₂ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ６６５がＭａｎＧｌｃ
ＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ５０３がＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ３３６がＭａｎＧｌ
ｃＮＡｃ、ｍ／ｚ３００がＧｌｃＮＡｃ-ＰＡそしてｍ／ｚ２０４がＧｌｃＮＡ
ｃであった。Ｄ. ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ β-ガラクトシダーゼによる消化物は
ＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同一の位置
に溶出した（図１４Ｂ−ＩＩ）。この結果は、１つのガラクトース残基が、β１
-４結合している非還元末端のＧｌｃＮＡｃに結合していたことを示している。
ガラクトースが除去されたことを、ＩＳ−ＭＳ/ＭＳ分析により得られた分子量
が［Ｍ+２Ｈ］２+が７５９、［Ｍ+Ｈ］+が１５１８.０であることにより確認し
た。親シグナルｍ／ｚ１５１８.０であるＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂-
ＰＡから、フラグメントイオンｍ／ｚ１３１４がＭａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、
ｍ／ｚ１１５２がＭａｎ₄ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ９９０がＭａｎ₃ＧｌｃＮ
Ａｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ８２７.５がＭａｎ₂ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ６６５.５
がＭａｎ₁ＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ５０３がＧｌｃＮＡｃ₂-ＰＡ、ｍ／ｚ３
００がＧｌｃＮＡｃ-ＰＡとが派生していた。ＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡ
ｃ₂-ＰＡをＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼで消化すると、その消化物は標準品Ｍａｎ₅Ｇ
ｌｃＮＡｃ₂-ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同じ位置に溶出した（図１４Ｂ−Ｉ
ＩＩ）。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓａｉｔｏｉ由来のα-１，２マンノシダー
ゼで処理しても溶出位置が移動しなかった（図１４Ｂ−ＩＶ）。しかし、続いて
タチナタマメ α-マンノシダーゼで処理すると、標準品Ｍａｎ₁ＧｌｃＮＡｃ₂-
ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同じ位置に溶出した（図１４Ｂ−Ｖ）。このこと
は、非還元末端に存在する４つのマンノース残基が除去されたことを示している
。これらの結果から、ＰＡ化糖鎖は、５つのいずれのマンノース残基も、α１−
３結合したマンノース残基にα１−２結合していないことを示す。以上エキソグ
リコシダーゼ消化、２次元糖鎖マッピング、ＩＳ−ＭＳ/ＭＳ分析から導きださ
れる糖鎖構造は、ＧａｌＧＮＭ５で、図１５のＬに示す。

【００８３】図２０は、ＧＴ６細胞株におけるＮ−結合グリカンの構造と各Ｎ−結合グリカ
ンの比率に関する上記の結果を、同様に決定された野生型ＢＹ２細胞株における
それらとともに要約する。図２０において、白抜き四角はＧｌｃＮＡｃを、白抜
き丸はマンノースを、黒丸はガラクトースを、斜線をひいた四角はキシロースを
、そして点をつけた丸はフコースをそれぞれ示す。

【００８４】ＧＴ６細胞株では、アイソマー類であるＭａｎ７−、Ｍａｎ６−およびＭａｎ
５ＧｌｃＮＡｃ２が観察された。これらの高マンノース型オリゴサッカライドは
、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）の基質であるので、
ＧｌｃＮＡｃＩ、ＭａｎＩおよびＭａｎＩＩｃＤＮＡの導入は、オリゴサッカ
ライドＭａｎ７−５ＧｌｃＮＡｃ２を、ＧａｌＴの基質であり得るＧｌｃＮＡｃ
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へより効率的に導き得る（図２１）。

【００８５】ＧｎＴＩを欠くＡ．ｔｈａｌｉａｎａｃｇｌＩ変異体は、複合型Ｎ−グリ
カンを合成することができない（ｖｏｎＳｃｈａｅｗｅｎ，Ａ．，Ｓｔｕｒｍ
，Ａ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｊ．，およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、ＭＪ．，Ｐｌａ
ｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，１９９３Ａｕｇ；１０２（４）：１１０９−１１１
８、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを欠き、そしてゴルジ体
で修飾される複合体Ｎ−結合グリカンを合成できない変異体Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ植物の単離）。このｃｇｌＩ変異体におけるヒトＧｎＴでの相補性は、哺乳
動物酵素が、植物Ｎ−グリコシル化経路に寄与し得たことを示した（Ｇｏｍｅｚ
、Ｌ．およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９４３月１；９１（５）１８２９−１８３３、複合
アスパラギン結合グリカンを欠くＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａの
、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩをコードするヒトｃＤＮＡ
での相補性）。さらに、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａから単離されたＧｎＴＩｃＤ
ＮＡは、ＣＨＯＬｅｃ１細胞のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラー
ゼＩ欠損を相補した（Ｂａｋｋｅｒ，Ｈ．，Ｌｏｍｍｅｎ，Ａ．，Ｊｏｒｄｉ，
Ｗ．，Ｓｔｉｅｋｅｍａ，Ｗ．，およびＢｏｓｃｈ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９８月１１；２６１（３）
：８２９−３２、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａｃＤＮＡは、ＣＨＯＬｅｃ１細胞の
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ欠損を相補する）。ヒトＭａ
ｎＩおよびＭａｎＩＩをコードするｃＤＮＡが単離され、そして配列決定された
（Ｂａｕｓｅ，Ｅ．，Ｂｉｅｂｅｒｉｃｈ，Ｅ．，Ｒｏｌｆｓ，Ａ．，Ｖｏｌｋ
ｅｒ，Ｃ．およびＳｃｈｍｉｄｔ，Ｂ．，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１９９
３１０月１５；２１７（２）：５３５−４０、ヒト腎臓からのＭａｎ９−マ
ンノシダーゼの分子クローニングおよび一次構造；Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｌ．Ｏ．
，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄｙｋｅ，Ｎ．およびＨｅｒｓｃｏｖｉｃｓ，Ａ．，Ｇｌ
ｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１９８８６月；８（６）：５８５−９５、Ｎ−グリカ
ン成熟に関与する新規ヒトα１，２−マンノシダーゼ遺伝子の分子クローニング
、染色体マッピングおよび組織特異的発現；およびＭｉｓａｇｏ．Ｍ．，Ｌｉａ
ｏ，Ｙ．Ｆ．，Ｋｕｄｏ，Ｓ．，Ｅｔｏ，Ｓ．，Ｍａｔｔｅｉ，Ｍ．Ｇ．，Ｍｏ
ｒｅｍｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．Ｎ．，ヒトα−マンノシダーゼＩＩ
および従前には認識されていないα−マンノシダーゼＩＩｘアイソザイムをコー
ドするｃＤＮＡの分子クローニングおよび発現）。ヒトＭａｎＩは、２つのアイ
ソザイムＭａｎＩＡおよびＭａｎＩＢをもち、そしてアイソザイムのｃＤＮＡの
ヌクレオチド構造が示された（Ｂａｕｓｅ，Ｅ．，ら、およびＴｒｅｍｂｌａｙ
，Ｌ．Ｏ．，前述）。これらのｃＤＮＡを、ＢＹ細胞株中に形質転換することに
より、ヒト型糖タンパク質を産生する効率的な細胞株が得られ得る。β１，４−
ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）は、ＵＤＰ−ガラクトースをドナ
ー基質として用い、そしてＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をアクセプタ
ー基質として用いる。ＵＤＰ−ガラクトースの効率的な供給はＧａｌＴ酵素反応
を増大し、そしてより多くのガラクトシル化オリゴサッカライドが産生される（
図２２）。

【００８６】（実施例７）二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰ細胞中のＨＲＰの糖鎖の構造解析ＧＴ６−ＨＲＰ細胞またはコントロールのＢＹ２−ＨＲＰ細胞の７日間培養し
た培養液のそれぞれのホモゲナイズ物５０ｇから得た粗細胞溶解液を、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦＦカラム（１×１０ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけた。カラムを
洗浄後、溶出したペルオキシダーゼを４０３ｎｍの吸光度で測定した。プールし
た画分を限外濾過（分子量カット：１０，０００、Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）によ
り濃縮し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で透析し、そし
て平衡化したベンズヒドロキサミン酸−アガロースアフィニティーカラム（１×
１０ｃｍ）（ＫｅｍＥｎＴｅｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にかけた。カラムを１５倍
容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同じ緩衝
液中に調製した０．５Ｍのホウ酸で、結合したＨＲＰを溶出した。得られたペル
オキシダーゼ活性画分をプールし、透析および濃縮した。

【００８７】形質転換細胞ＧＴ６−ＨＲＰ細胞およびＢＹ２−ＨＲＰ細胞のそれぞれから得
た精製ＨＲＰを、１×１０ｃｍのＲＣＡ₁₂₀−アガロースカラムにかけた。次い
でカラムを、１５倍容量の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．０）で洗浄した
。結合タンパク質を、常法に従って溶出し、アッセイした。

【００８８】 β１−４結合ガラクトースに特異的であるＲＣＡ₁₂₀アフィニティークロマト
グラフィーから溶出された精製ＨＲＰのレクチン染色では、レクチンＲＣＡ₁₂₀
が、形質転換細胞ＧＴ６−ＨＲＰで産生されたＨＲＰのみを結合した。レクチン
を競合するガラクトースとプレインキュベートすることによりレクチン結合は劇
的に減少したので（図１６ｂＩＩＩ）、この結合は炭水化物特異的であった。Ｄ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ β−ガラクトシダーゼで精製ＨＲＰを前処理しても、
ＲＣＡ₁₂₀結合を阻害した。これらの結果は、ＲＣＡがＨＲＰ上のＮ結合型オリ
ゴ糖鎖の末端β１−４結合位置にあるガラクトースに特異的に結合したことを示
す。ＢＹ２−ＨＲＰ細胞中にＲＣＡ結合糖タンパク質がないことは、この細胞が
ＨＲＰグリカンの非還元末端にβ１−４結合ガラクトース残基を転移し得ないこ
とを示す。

【００８９】ＲＣＡ₁₂₀を用いて精製したＨＲＰ由来のＰＡ誘導体の逆相ＨＰＬＣ（Ｊａｓ
ｃｏ８２１−ＦＰＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅ
ｔｅｒを備えたＪａｓｃｏ８８０−ＰＵＨＰＬＣ装置上、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ１８−ＰカラムまたはＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐカラムを用いた)は、ＧＴ
６−ＨＲＰより精製されたＨＲＰタンパク質上の糖鎖が単一のピークを示した（
図１７）。一方、ＢＹ２−ＨＲＰより精製されたＨＲＰ画分からは、結合タンパ
ク質または検出可能なピークは観察されなかった。ＧＴ６−ＨＲＰから得られた
ピークは、サイズ分画ＨＰＬＣ上で均一であった。二次元マッピング分析および
標準糖鎖との同時クロマトグラフィーは、このオリゴサッカライドがＧａｌ₁Ｇ
ｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡと一致することが判明した。この構造
の確認は、連続的エクソグリコシダーゼ消化によりなされた。標準糖鎖としては
、先に調製された糖鎖（Ｋｉｍｕｒａ，Ｙら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（２），２１５−２２２，１９９２）または市販（Ｗａｋ
ｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ，ＯｓａｋａおよびＴＡＫＡＲＡＳＨＵＺＯ）の糖
鎖を用いた。

【００９０】ＰＡ糖鎖のβ−ガラクトシダーゼ（Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）消化は、標準
のＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡの溶出位置と一致し、１つの非還
元末端ＧｌｃＮＡｃにβ１−４結合した１つのガラクトース残基が除去されたこ
とを示した。Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼでのこの消化物のさらなる消化は、Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡの溶
出位置に等しい糖鎖を生じ、１つの非還元末端マンノース残基にβ１−２結合し
たＧｌｃＮＡｃ残基を損失したことを示した。植物におけるＮ結合型プロセッシ
ング経路に基づけば、除去されたＧｌｃＮＡｃ残基は、β１−４マンノース残基
に連結したα１−３マンノースにあると考えられる。ＧｌｃＮＡｃ残基の結合位
置を確立するために、Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂−ＰＡ（Ｍ５）を、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓｓａｉｔｏｉ由来α１−２マンノシダーゼとともにインキュベートし
た。予想されたように、溶出位置にシフトは見られず、Ｍ５が予想された構造Ｍ
ａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１
−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃを有することが確認された。糖鎖をタチ
ナタマメα−マンノシダーゼを用いてさらに切りそろえると、公知のＭａｎ₁Ｇ
ｌｃＮＡｃ₂−ＰＡの溶出位置になった。従って、この糖鎖構造は、Ｍａｎα１
−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２
Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌ₁
ＧｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂）に対応する。以上の結果から、ＧＴ６細
胞中に存在する糖鎖構造としては図１５に示される通りであり、二重形質転換体
ＧＴ６−ＨＲＰ細胞由来のＨＲＰタンパク質の有する糖鎖構造は、Ｍａｎα１−
６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍ
ａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌ₁Ｇ
ｌｃＮＡｃ₁Ｍａｎ₅ＧｌｃＮＡｃ₂）であることが導き出される。

【００９１】同様に、形質転換細胞ＧＴ６−ＨＲＰ由来のＨＲＰのガラクトシル化Ｎ−グリ
カンは、植物のＮ−グリカンに特徴的なβ１，２キシロース残基と特異的に反応
することが示されている抗血清と反応せず、植物の複合型グリカン中の抗原性を
引き起こすことが示されている糖残基（キシロース残基）（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａ
ｓａｄｏ，Ｇ．ら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６（４）：４７１−４７７，
１９９６）の１つが存在しないことを示した（図１８）。

【００９２】（発明の効果）本発明により、ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法；非還元末端アセチ
ルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を
備え、この糖鎖付加機構が、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖であって、コア
糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、外部糖
鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む糖鎖、を付加する、植物
細胞；およびこの方法によって得られたヒト型の糖鎖をもつ糖タンパク質が提供
される。本発明のヒト型の糖鎖をもつ糖タンパク質は、糖付加がヒト型であるた
めに、抗原性を有さない。それゆえ、ヒトを含む動物への投与のために有用であ
る。

【００９３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】代表的なＮ結合型糖鎖の構造を示す模式図である。

【図２】ｈＧＴのクローニングの方法の模式図である。

【図３】ｈＧＴ発現用ベクターｐＧＡｈＧＴの構築方法の模式図である。

【図４】形質転換体タバコ培養細胞のゲノムのサザン解析を示す写真である。図４（Ａ
）は、ゲノムＤＮＡ（４０μｇ）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した
後の電気泳動を示す。左側の数字はＤＮＡ分子量マーカーの位置を表す。図４（
Ｂ）は、各形質転換細胞に組み込まれた、プロモーター、ｈＧＴ、ターミネータ
ーを含む２．２ｋｂの断片の模式図を示す。

【図５】図５は、形質転換タバコＢＹ２細胞（ＷＴ）および野生型タバコＢＹ２細胞（
ＷＴ）からの免疫反応性タンパク質のウェスタンブロッティングの写真である。
タンパク質を変性させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、そしてニトロ
セルロース膜に電気的に転写した。レーンの数字は、サンプルがそれぞれ以下の
ものに由来したことを示す：１＝ＧＴ１の細胞抽出物；２＝ＧＴ６の細胞抽出物
；３＝ＧＴ８の細胞抽出物；４＝ＧＴ９の細胞抽出物；５＝野生型の細胞抽出物
；６＝ＧＴ１のミクロソーム画分；７＝ＧＴ６のミクロソーム画分；８＝ＧＴ８
のミクロソーム画分；９＝ＧＴ９のミクロソーム画分；および１０＝野生型のミ
クロソーム画分。

【図６】Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＲＣＡ₁₂₀）アフィニティークロマトグ
ラフィーを用いたガラクトシル化糖タンパク質の検出を示す電気泳動写真である
。電気泳動ゲルは、銀染色により可視化した。レーン１および２は野生型ＢＹ２
細胞からのタンパク質を示し、そしてレーン３および４は、形質転換ＧＴ６細胞
からのタンパク質を示す。分子量はＫＤａの単位である。

【図７】Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＲＣＡ₁₂₀）アフィニティークロマトグ
ラフィーを用いたガラクトシル化糖タンパク質の検出を示すウェスタンブロッテ
ィングの写真である。電気泳動したゲルをニトロセルロース膜上へブロットした
後、このブロットをレクチン（ＲＣＡ₁₂₀）染色して可視化した。レーン１およ
び２は野生型ＢＹ２細胞からのタンパク質を示し、そしてレーン３および４は、
形質転換ＧＴ６細胞からのタンパク質を示す。分子量はＫＤａの単位である。

【図８】Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＲＣＡ₁₂₀）アフィニティークロマトグ
ラフィーを用いたガラクトシル化糖タンパク質を、植物の複合型グリカンに存在
するキシロースに特異的な抗血清でプローブしたブロッティングの写真である。
レーン１および２は、ＢＹ２およびＧＴ６からの総タンパク質抽出物をそれぞれ
示し、レーン３は、ＲＣＡ₁₂₀アフィニティークロマトグラフィー後のＧＴ６か
らの糖タンパク質を示す。分子量はＫＤａの単位である。

【図９】カナマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を有するバイナリ
ーベクターであり、ＨＲＰｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＩＨｍ−ＨＲＰの
模式図である。

【図１０】トランスジェニック懸濁培養細胞におけるＨＲＰの産生を示す等電点電気泳動
およびウエスタンブロッティングの写真である。図１０（Ａ）は等電点電気泳動
の結果を示し、そして図１０（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す。
略語は以下の通りである：ＷＴ＝野生型；ＢＹ２−ＨＲＰ１、５、および７＝
ＨＲＰ遺伝子で形質転換したＢＹ２細胞のクローン番号；ならびにＧＴ６−ＨＲ
Ｐ４、５、および８＝ＨＲＰ遺伝子で形質転換したＧＴ６細胞のクローン番号
。

【図１１】０．０２％ＴＦＡ中でアセトニトリルの濃度を０〜１５％の直線状勾配で６０
分間かけて増加させ、１．２ｍｌ／分の流速で溶出したＰＡ糖鎖の逆相ＨＰＬＣ
パターンを示すグラフである。Ｉ〜ＸＩは、サイズ分画ＨＰＬＣにおいて溶出お
よび精製した個々の画分を示す。励起波長および放出波長は、それぞれ、３１０
ｎｍおよび３８０ｎｍであった。

【図１２】図１１におけるＰＡ鎖のサイズ分画ＨＰＬＣパターンを示すグラフである。Ｐ
Ａ糖鎖を、水−アセトニトリル混合物中で水の濃度を３０〜５０％に４０分間か
けて増加させ、０．８ｍｌ／分の流速で溶出させた。励起波長および放出波長は
、それぞれ、３１０ｎｍおよび３８０ｎｍであった。

【図１３】２つの標準品糖鎖ＡおよびＢと比較した、逆相ＨＰＬＣにおけるピーク−Ｋ２
の溶出位置を示すグラフである。溶出条件は、図１１と同様に０．０２％ＴＦＡ
中でアセトニトリルの濃度を０〜１５％の直線状勾配で６０分間かけて増加させ
、１．２ｍｌ／分の流速で溶出であった。

【図１４】エクソグリコシダーゼ消化後に得られたガラクトシル化ＰＡ糖鎖のＳＦ−ＨＰ
ＬＣプロフィールを示すグラフである。ＰＡ糖鎖を、水−アセトニトリル混合物
中の水含量を３０〜５０％で２５分間かけて増加させ、０．８ｍｌ／分の流速で
溶出させた。（Ａ）ＰＡ−糖鎖Ｋ−２；Ｉ．用いたガラクトシル化ＰＡ糖鎖の溶
出位置；ＩＩ．Ｉのβ−ガラクトシダーゼ消化物；ＩＩＩ．ＩＩのＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ消化物；ＩＶ．ＩＩＩのタチナタマメ α−マン
ノシダーゼ消化物。（Ｂ）ＰＡー糖鎖Ｌ；Ｉ．用いたガラクトシル化ＰＡ糖鎖の
溶出位置；ＩＩ．Ｉのβ−ガラクトシダーゼ消化物；ＩＩＩ．ＩＩのＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ消化物；ＩＶ．ＩＩＩのα１−２マンノシダー
ゼ消化物；Ｖ．ＩＩＩのタチナタマメ α−マンノシダーゼ消化物。

【図１５】形質転換細胞から得られたＮ結合型グリカンの推定構造を示す図である。括弧
内の数字は、モル比を示す。

【図１６】糖付加ＨＲＰの検出を示す、Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ１２０ａ
ｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＲＣＡ₁₂₀）アフィニティークロマトグラフィーの写真で
ある。図１６（Ａ）は銀染色、そして図１６（Ｂ）はレクチンＲＣＡ₁₂₀での染
色の結果である。レクチン染色のフィルターを細片に切断し、そして緩衝液単独
（ＩおよびＩＩ）または過剰なガラクトースを含有する緩衝液（ＩＩＩ）でプレ
インキュベートしたレクチンＲＣＡ₁₂₀でプローブした。（ＩＩ）では、ＨＲＰ
を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前にＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの
β−ガラクトシダーゼで処理した。レーン１はＢＹ２−ＨＲＰからの収集画分；
そしてレーン２はＧＴ６−ＨＲＰからの収集画分である。左側の数字は、タンパ
ク質の標準品の位置およびサイズ（ＫＤａ）を示す。

【図１７】ＲＣＡ₁₂₀アフィニティークロマトグラフィーの後に精製されたＨＲＰからの
ＰＡ糖鎖の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。

【図１８】植物特異的な複合型グリカンの免疫検出を示すウェスタンブロッティングの写
真である。精製されたＨＲＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースに
転写し、そしてウサギ抗ＨＲＰ（Ａ）または植物の複合型グリカンに特異的な抗
血清（Ｂ）でプローブした。レーン１＝ＢＹ２−ＨＲＰからの精製ＨＲＰ；レー
ン２＝ＲＣＡ₁₂₀アフィニティークロマトグラフィー後のＧＴ６−ＨＲＰからの
ガラクトシル化ＨＲＰ。分子のサイズマーカーの位置を、ＫＤａで左に示す。形
質転換体ＧＴ６−ＨＲＰ細胞由来のＨＲＰ上のガラクトシル化Ｎ−グリカンは、
植物Ｎ−グリカンの指標であるβ１，２キシロース残基と特異的に反応すること
が示された抗血清と反応しなかった。

【図１９】小胞体およびゴルジ体中の糖鎖修飾経路に関与するＮ−結合グリカンの構造お
よび酵素。白抜き菱形はグルコースを、白抜き四角はＧｌｃＮＡｃを、白抜き丸
はマンノースを、黒丸はガラクトースを、そして黒四角はシアル酸をそれぞれ示
す。

【図２０】ＧＴ６細胞株中のＮ−結合グリカン類の構造、および各Ｎ−結合グリカンの比
率を、同様に測定された野生型ＢＹ２細胞株それらとともに示す。白抜き四角は
ＧｌｃＮＡｃを、白抜き丸はマンノースを、黒丸はガラクトースを、そして黒四
角はシアル酸をそれぞれ示す。

【図２１】本発明の１つの実施態様を図示する。ＧＴ６細胞株において、アイソマー類Ｍ
ａｎ７−、Ｍａｎ６−およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が認められた。これらの高
マンノース型オリゴサッカライドは、いくつかのグリカンプロセッシング酵素に
よって、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）の基質であ
るように変換されるので、ＧｌｃＮＡｃＩ、ＭａｎＩおよびＭａｎＩＩ
ｃＤＮＡ類の導入は、オリゴサッカライドＭａｎ７−５ＧｌｃＮＡｃ２を、Ｇａ
ｌＴの基質であり得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により効率的に導き
得る。

【図２２】この図もまた、本発明の１つの実施態様を示す。１，４−ガラクトシルトラン
スフェラーゼ（ＧａｌＴ）は、ＵＤＰ−ガラクトースをドナー基質として用い
、そしてＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をアクセプター基質として用い
る。ＵＤＰ−ガラクトースの効率的な供給は、ＧａｌＴ酵素反応を増大し、そ
してより多くのガラクトシル化オリゴサッカライドを産生し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 4B024 BA10 BA80 CA04 DA01 DA05 GA11 HA12 4B064 AG01 CA11 CA19 CC24 CE12 DA01 4B065 AA88X AA89X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA29 CA44 4H045 AA10 AA20 BA53 CA40 DA89 EA21 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法であって、植物細胞に、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子および異種糖タンパク質
の遺伝子を導入することによって、形質転換植物細胞を得る工程、および得られた形質転換植物細胞を培養する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記グリコシルトランスフェラーゼが、非還元末端アセチル
グルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素である、請求
項１に記載の方法。
【請求項３】前記ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質が、コア糖鎖および外部
糖鎖を含み、該コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを含み
、そして該外部糖鎖が、非還元末端ガラクトースをもつ末端糖鎖部分を含む、請
求項１に記載の方法。
【請求項４】前記外部糖鎖が直鎖状構造をもつ、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記外部糖鎖が分岐状構造をもつ、請求項３に記載の方法。
【請求項６】前記分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造
をもつ、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記糖タンパク質がフコースまたはキシロースを含まない、
請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基
の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備え、該糖鎖付加機構が、コア糖鎖および
外部糖鎖を含む糖鎖であって、該コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグ
ルコサミンを含み、該外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを有する末端糖鎖部分
を含む糖鎖、を付加する、植物細胞。
【請求項９】前記植物細胞が、非還元末端アセチルグルコサミン残基への
ガラクトース残基の転移反応を行い得る第１の酵素の遺伝子、および該第１の酵
素を増大し得る第２の酵素の遺伝子で形質転換されている、請求項８に記載の植
物細胞。
【請求項１０】前記第２の酵素が、マンノシダーゼＩ、マンノシダーゼＩ
Ｉ、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびＮ−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃＩ）からなる群から選択
される、請求項９に記載の植物細胞。
【請求項１１】請求項８に記載の植物細胞から再生された植物。のいずれかに記載の方法によって得られたヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質。
【請求項１２】フコースまたはキシロースを含まない哺乳動物様糖タンパ
ク質を産生する、組換え植物、またはその一部分。
【請求項１３】請求項１から７のいずれかに記載の方法を用いて得られた
、ヒト型糖鎖をもつ、糖タンパク質。
【請求項１４】フコースまたはキシロースを含まない、植物が産生する糖
タンパク質。