JP3877226B2

JP3877226B2 - ケラチノサイト成長因子の精製法

Info

Publication number: JP3877226B2
Application number: JP51337696A
Authority: JP
Inventors: シユー，エリク・ダブリユ; ケニー，ウイリアム・シー; トレツセル，テイム
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2007-02-07
Anticipated expiration: 2015-10-12
Also published as: DE122006000019I1; CA2201762C; ATE239038T1; AU3830695A; CN1169734A; EP0785949A1; WO1996011952A1; LU91235I2; IL147575A0; EP1334981B1; ES2197926T3; JPH10507452A; IL115605A0; EP1334981A2; NL300229I1; SK43097A3; DK0785949T3; SI0785949T1; HU220584B1; IL115605A

Description

発明の分野
本発明は、タンパク質精製の分野に関する。特に、本発明は、ケラチノサイト成長因子の精製の分野に関する。
発明の背景
ポリペプチド成長因子は、細胞間の連絡の重用な媒介物である（ルビン（Ｒｕｂｉｎ）ら，（１９８９年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６巻：８０２〜８０６頁）。これらの分子は通常一つの細胞型から放出され、他の細胞型の増殖に影響を与えるように作用する。
生長因子の一つのファミリーは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である。現在のところ一次構造間に関係を有する８つのＦＧＦファミリーメンバーが知られている：塩基性線維芽細胞成長因子、ｂＦＧＦ（アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら，（１９８６年）、ＥＭＢＯＪ．，５巻：２５２３〜２５２８頁）；酸性線維芽細胞成長因子、ａＦＧＦ（ジェイエ（Ｊａｙｅ）ら，（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２３３巻：５４１〜５４５頁）；ｉｎｔ−２遺伝子産物、ｉｎｔ−２（ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ）およびピーター（Ｐｅｔｅｒｓ），（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ，３２６巻：８３３頁）；ｈｓｔ／ｋＦＧＦ（デリ−ボビ（Ｄｅｌｌｉ−Ｂｏｖｉ）ら，（１９８７年），Ｃｅｌｌ，５０巻：７２９〜７３７頁およびヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）ら，（１９８７年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４巻：７３０５〜７３０９頁）；ＦＧＦ−５（ツァン（Ｚｈａｎ）ら，（１９８８年），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８巻：３４８７〜３４９５頁）；ＦＧＦ−６（マリクス（Ｍａｒｉｃｓ）ら，（１９８９年），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．，４巻：３３５〜３４０頁）；ケラチノサイト成長因子（フィンチ（Ｆｉｎｃｈ）ら，（１９８９年），Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２４巻：７５２〜７５５頁）；ルビン（Ｒｕｂｉｎ）ら，（１９８９年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６巻：８０２〜８０６頁；ロン（Ｒｏｎ）ら，（１９９３年），ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ），２６８（４）巻：２９８４〜２９８８頁：およびヤン（Ｙａｎ）ら，（１９９１年），ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２７Ａ巻：４３７〜４３８頁；およびヒサクトフィリン（ハバッツェトゥル（Ｈａｂａｚｚｅｔｔｌ）ら，（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９巻：855〜858頁）。
タンパク質のＦＧＦファミリー中、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）は、間葉組織から誘導される非線維芽細胞上皮（特に、ケラチノサイト）細胞増殖の独自のエフェクターである。
「天然ＫＧＦ」という用語は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列により示される天然ヒト（ｈＫＧＦ）または組み換え（ｒＫＧＦ）ポリペプチド（シグナル配列を有するまたは有さない）あるいはその対立遺伝子変異体を意味する。［特記しない限り、本明細書に記載の分子のアミノ酸番号は、配列番号：２のアミノ酸３２〜１９４により示される天然分子の成熟型（すなわち、シグナル配列がない）について示されるものに対応する。］
天然ＫＧＦは、天然源から単離することができる。例えば、ｈＫＧＦを胚性肺線維芽細胞系によるならし培地から単離することができる（ルビン（Ｒｕｂｉｎ）ら，（１９８９年），前記）。精製されたｈＫＧＦ製剤を得るために、三つのクロマトグラフィー工程、すなわちヘパリン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TM）（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣゲル濾過、および逆相ＨＰＬＣが用いられた。ならし培地１０リッターからｈＫＧＦ約６ｍｇが得られ、これらのクロマトグラフィー工程によって、有糸分裂活性アッセイを基に０．８％の全ｈＫＧＦしか回収されなかった。さらなる例は、バクテリア中で生成されたｒＫＧＦを単離するためにヘパリン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TM）アフィニティおよびモノ−エス（Ｍｏｎｏ−Ｓ^TM）イオン交換クロマトグラフィー（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）を用いる別のクロマトグラフィー工程を用いることを教示している。（ロン（Ｒｏｎ）ら，（１９９３年），ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ），２６８巻：２９８４〜２９８８頁）。
ケラチノサイト成長因子の特性は、上皮細胞成長の特異的刺激を促進するための薬剤としてのその可能な用途を示している。従って、包括的インビトロおよびインビボ生物学的評価および可能性のある治療用途に充分な量の材料を提供するために、均質のケラチノサイト成長因子を比較的高レベルで得るための方法を開発することが望ましい。
本発明の目的はケラチノサイト成長因子を精製するための新規方法を提供することにある。
発明の概要
本発明は、
（ａ）ＫＧＦを含む溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の溶液からのＫＧＦをカチオン交換樹脂に結合させる工程、
（ｃ）カチオン交換樹脂からＫＧＦを溶離溶液中に溶離する工程、
（ｄ）工程（ｃ）からの溶離溶液を分子量排除マトリックスを通過させる工程、および
（ｅ）分子量排除マトリックスからＫＧＦを回収する工程
を含んでなる、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を精製するための第１の方法に関する。
本発明は、さらに、
（ａ）ＫＧＦを含む溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の溶液からのＫＧＦをカチオン交換樹脂に結合させる工程、
（ｃ）カチオン交換樹脂からＫＧＦを溶離溶液中に溶離する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の溶離溶液に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う工程、および
（ｅ）工程（ｄ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー段階からＫＧＦを回収する工程
を含んでなる、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を精製するための第２の方法に関する。
通常、第１および第２の方法のカチオン交換クロマトグラフィー段階は、適当な緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝塩水、酢酸ナトリウムまたはｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を用いて好ましくは６．８〜７．５のｐＨで行うことができる。この段階で用いるための適当なカラムは、カルボキシメシルセルロース、カルボキシメチルアガロースおよび硫酸アガロースおよびセルロースカラムを含む（例えば、ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社製エス−セファロース・ファースト・フロー（Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ^TM）樹脂、モノ−エス（Ｍｏｎｏ−Ｓ^TM）樹脂およびシーエム−セルロース（ＣＭ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ^TM）樹脂）。流速はカラム寸法に依存して変化し得る。
第１の方法のゲル濾過段階は、任意の好適な緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝塩水）中において好ましくは約７．０〜７．５のｐＨで行うことができる。この段階で用いるための適当なカラムは、アガロース系、アクリルアミド系、シリカ系またはポリマー系のサイズ排除カラムを含む（例えば、ファーマシア社製セファデックスジー７５（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５^TM）樹脂およびスーパーデックス−７５（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５^TM）樹脂）。
第２の方法の特に好ましい態様において、以下に記述するように疎水性相互作用段階の前に遊離スルフヒドリル基を酸化することができる。任意の酸化方法を用いることができる。例えば、タンパク質を大気の酸素に適当な期間晒してもよい。また、種々の酸化手順を用いてもよい。一つのそのような手順は、１以上のシステイン残基が、天然のＫＧＦ分子と比較して除去または置換されているケラチノサイト成長因子に特に好適である。この手順において、酸化剤（例えば、シスタミンジヒドロクロライドまたは別の適当な酸化剤、例えばシスチン、酸化型グルタチオンまたは２価銅）を最終濃度まで添加することができ、ｐＨが好ましくは約７〜９．５に調節され、シスタミンジヒドロクロライドを用いる場合９．０±０．３のｐＨがより好ましく、温度は好ましくは約１０〜３０℃に適当な期間保持される。第２の手順は、天然ＫＧＦ、およびシステイン残基の同等のパターンを有する他のケラチノサイト成長因子を酸化するために用いることができる。この手順において、酸化は、適当な量のイオン強度調整剤（例えば（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）を添加することにより達成することができ、ｐＨが好ましくは約７．５〜９．５に調節され、温度が好ましくは約２３±５℃に適当な期間保持される。
第２の方法の疎水性相互作用段階は、任意の適当な緩衝液（例えばリン酸ナトリウム）を好ましくは約６．０〜８．０、より好ましくは約７．０のｐＨで用い、および２〜０Ｍの範囲の減少濃度の直線的（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄グラジエントで溶離することにより行うことができる。この段階で用いるための好適なカラムは、アルキルまたはフェニル置換樹脂を含む（例えば、ペンシルバニア州モントゴメリービル在トーソハース社（Ｔｏｓｏｈａcｓ，Ｉｎｃ．）から市販されているブチル−６５０Ｍトヨパール（Ｂｕｔｙｌ−６５０ＭＴｏｙｏｐｅａｒｌ^TM）樹脂のカラム、およびファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から市販されているフェニルセファロース（ｐｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ^TM）樹脂およびフェニルスーパーローズ（ｐｈｅｎｙｌＳｕｐｅｒｏｓｅ^TM）樹脂のカラム）を含む。
本発明の方法は、ＫＧＦの精製に用いることができる。すなわち、この明細書で用いられる「ケラチノサイト成長因子」および「ＫＧＦ」という用語は、天然ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列により、および天然ＫＧＦの生物学的活性の全てまたは一部、特に非線維芽細胞上皮細胞増殖（例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞よりも少なくとも約５００倍大きいＢＡＬＢ／ＭＫケラチノサイト細胞の刺激、およびＢＳ／５８９上皮細胞またはＣＣ１２０８上皮細胞に対するより少なくとも約５００倍大きいＢＡＬＢ／ＭＫケラチノサイト細胞の刺激（Ｈ−チミジンの組み込みにより決められる。）を示す。）を保持することにより特徴付けられるＫＧＦ類似タンパク質（または「ムテイン」）と天然ＫＧＦとを、特記しない限り交換可能に含むまたは意味するものと解すべきである。「天然ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列により特徴付けられる」という表現は、好ましくはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下に、配列番号：１のヌクレオチド２０１〜６８４にハイブリダイズすることのできるＤＮＡ配列によりコードされるペプチド配列を意味する。
二つのアミノ酸配列間の対応するアミノ酸の位置は、アミノおよび／またはカルボキシル末端の移動、必用に応じてのギャップの導入および／または候補物質中に挿入体として存在する残基の欠失を含む残基を最大にマッチさせるように二つの配列を整列させることにより決定される。データベース検索、配列解析および処理は、一つのよく知られた日常的に用いられる配列相同性／同一性走査アルゴリズムプログラムを用いて行われる（例えば、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５巻：２４４４〜２４４８頁；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，（１９９０年），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５巻：４０３〜４１０；リップマン（Ｌｉｐｍａｎ）およびピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ），（１９８５年），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２巻：１４３５頁またはデベロークス（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら，（１９８４年），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１２巻：３８７〜３９５）。
ハイブリダイゼーションに関するストリンジェント条件は、塩、温度、有機溶媒、およびハイブリダイゼーション化反応において典型的に制御される他のパラメーターの組み合わされたストリンジェント条件である。例示としてのストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６２〜６７℃で４ × ＳＳＣでのハイブリダイゼーション化、およびその後の約１時間６２〜６７℃で０．１ × ＳＳＣでの洗浄である。または、例示としてのストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、４５〜５５％のホルムアミド中、４０〜４５℃での４ × ＳＳＣでのハイブリダイゼーションである。［マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら，モレキュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）（実験室マニュアル）；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年），３８７〜３８９頁］。
すなわち、タンパク質は、対立遺伝子の変異、または、天然型ＫＧＦのフラグメント、キメラもしくはハイブリッド分子を含むアミノ酸の欠失、置換または挿入を含む。ＫＧＦの一つの例は、親分子と比較して向上した安定性を有する分子が得られるように、Ｃｙｓ¹およびＣｙｓ¹⁵が置換又は欠失された対応する残基を有するタンパク質を含む（１９９５年７月７日に出願された同一所有者の米国特許出願第０８／４８７，８２５号に教示）。ＫＧＦのもう一つの例は、天然型ＫＧＦのアミノ酸残基４１〜１５４（好ましくは、Ａｒｇ⁴¹、Ｇｌｎ⁴³、Ｌｙｓ⁵⁵，Ｌｙｓ⁹⁵、Ｌｙｓ¹²⁸、Ａｓｎ¹³⁷、Ｇｌｎ¹³⁸、Ｌｙｓ¹³⁹、Ａｒｇ¹⁴⁴、Ｌｙｓ¹⁴⁷、Ｇｌｎ¹⁵²、Ｌｙｓ¹⁵³またはＴｈｒ¹⁵⁴）の一つ以上が、タンパク質の陽電荷を減少させるように選択された電気的に陰性の残基または中性の残基で置換されるかまたは欠失された、電荷を変化させたポリペプチドを含む（１９９４年１０月１３日に出願された同一所有者の米国特許出願第０８／３２３，３３７号に教示）。ＫＧＦのさらなる例は、天然型ＫＧＦのＡｓｎ¹¹⁵−Ｈｉｓ¹¹⁶−Ｔｙｒ¹¹⁷−Ａｓｎ¹¹⁸−Ｔｈｒ¹¹⁹のループ形成領域内の少なくとも一つのアミノ酸を、高いループ形成能を有する少なくとも一つのアミノ酸で置換することにより生じるタンパク質を含む（1994年10月13日に出願された同一所有者の米国特許出願第08/323,473に教示）。さらなる例は、天然型ＫＧＦの１２３〜１３３（配列番号：２のアミノ酸１５４〜１６４）の領域内における一つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するタンパク質を含み、これらのタンパク質は作働活動または拮抗活性を有する。
具体的に記載されたタンパク質は、以下のＫＧＦ分子を含む（配列番号：２に示される成熟型タンパク質（シグナル配列がない）中の位置に認められる残基、その後丸括弧内にアミノ酸の位置、その後に、置換された基かまたは欠失を示す「−」により示される）：Ｃ（１，１５）Ｓ、ΔＮ１５−ΔＮ２４、ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ３／Ｃ（１５）−、ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ８／Ｃ（１５）−、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５，４０）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ、ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｅ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ、ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ；Ｒ（１４４）ＱおよびＨ（１１６）Ｇ。
当業者が同様に考えるような、ＫＧＦタンパク質コード配列を発現するために種々の宿主ベクター系を利用することができる。これらは、限定されないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染される哺乳動物細胞系のような真核生物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染される昆虫細胞系；酵母含有酵母ベクターのような微生物；または、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換されたバクテリアのような原核生物細胞系を含む。これらのベクターの発現要素は、強度および特異性が変化する。利用される宿主ベクター系に依存して、多くの適当な転写および翻訳要素の任意の一つを用いることができる。
ＫＧＦ発現のタンパク質生成物を一旦単離し、精製し、ＫＧＦ活性を（当業者に知られている手順を用いて）アッセイすると、それは種々の医薬組成物に調製することができる。典型的に、そのような組成物は、適当な、通常化学的に規定された、治療薬のためのキャリアまたは賦形剤、および意図する投与形態により、他の成分も含む。組成物は、水性キャリアを含むことができる、またはコラーゲン、ヒアルロン酸および種々のポリマーのような非水性キャリア中にＫＧＦが組み込まれた固相製剤からなることができる。組成物は、注射、経口、局所的、鼻腔内および肺投与を含む種々の方法で投与されるように調製することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、天然型ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号：１）およびアミノ酸（配列番号：２）配列を示す（成熟型天然ＫＧＦをコードするヌクレオチドは配列番号：１の塩基２０１〜６８４により示され、成熟型ＫＧＦは配列番号：２のアミノ酸残基３２〜１９４により示される。）。
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、それぞれｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
図３は、構築物ＲＳＨ−ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号：３）およびアミノ酸（配列番号：４）配列を示す。
図４は、プラスミドＫＧＦに含まれる構築物のヌクレオチド（配列番号：５）およびアミノ酸（配列番号：６）配列を示す。
図５は、構築物を含有するプラスミドＫＧＦ中のＫｐｎＩ部位（配列番号：６のアミノ酸位置４６〜８５）をＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間のＤＮＡ配列で置換してプラスミドＫＧＦ（ｄｓｄ）中に構築物を形成するのに用いられる化学的に合成されたＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃６〜ＯＬＩＧＯ＃１１；それぞれ配列番号：１２〜１７）を示す。
図６は、ＫＧＦ（最適化コドン）を構築するのに用いられる化学的に合成されたＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃１２〜ＯＬＩＧＯ＃２４；それぞれ配列番号：１８〜３０）を示す。
図７は、Ｃ（１，１５）Ｓ、すなわち天然型ＫＧＦのアミノ酸位置１および１５のシステインがセリンに置換されたＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：３２）およびヌクレオチド配列（配列番号：３１）を示す。
図８は、Ｒ（１４４）Ｑ、すなわち天然型ＫＧＦのアミノ酸位置１４４のアルギニンがグルタミン酸に置換されたＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：３４）およびヌクレオチド配列（配列番号：３３）を示す。
図９は、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１１４）Ｑ、すなわち天然型ＫＧＦのアミノ酸位置１４４のアルギニンがグルタミンに置換され、アミノ酸位置１および１５のシステインがともにセリンに置換されたＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：３６）およびヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示す。
図１０は、ΔＮ１５、すなわち天然型ＫＧＦのＮ−末端の最初の１５アミノ酸が欠失したＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：３８）およびヌクレオチド配列（配列番号：３７）を示す。
図１１は、ΔＮ２３、すなわち天然型ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３アミノ酸が欠失したＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：４０）およびヌクレオチド配列（配列番号：３９）を示す。
図１２は、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、すなわち天然型ＫＧＦのアミノ酸位置１４４のアルギニンがグルタミンに置換され、Ｎ−末端の最初の２３アミノ酸が欠失したＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：４２）およびヌクレオチド配列（配列番号：４１）を示す。
特定態様の説明
以下の実施例に記載の多くの手順または適当な別の手順のための標準的方法が、例えば、モレキュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ），第２版，サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ），（１９８７年）およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），アウサベル（Ａｕｓａｂｅｌ）ら，グリーネ・パブリッシング・アソシエーツ（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ）／ウィリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨーク（１９９０年）のような分子生物学の広く認められているマニュアルに提供されている。
実施例１
ＫＧＦおよびＫＧＦ類似体をコードするＤＮＡの調製
全長ヒトＫＧＦ遺伝子（天然型ＫＧＦの配列をもつポリペプチドをコードする）のクローニングを、動物細胞からのＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および化学的に合成した（Ｅ．ｃｏｌｉ優先コドン）オリゴヌクレオチド（「ＯＬＩＧＯ」）のＰＣＲの両方により行った。これらの両方の手順を以下に記載する。
上記ポリペプチドを生成することが知られている細胞から単離したＲＮＡを用いてＰＣＲ増幅を行った。まず、ヒト線維芽細胞系ＡＧ１５２３Ａ（ニュージャージー州カムデン在ヒューマン・ジェネティック・ミュータント・セル・カルチャー・レポジトリー・インスティチュート・フォア・メディカル・リサーチ（ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃＭｕｔａｎｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅＦｏｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）から得られる）からの細胞をチオシアン酸グアニジンで分解し、次に抽出した（コミジンスキー（Ｃｈｏｍｙｚｉｎｓｋｉ）ら，（１９８７年版），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２巻：１５６頁）。全ＲＮＡ用標準的逆転写酵素プロトコールを用いて、ＫＧＦｃＤＮＡを生成させた。ＫＧＦ遺伝子の５’および３’の直のところのＤＮＡ配列をコードするプライマーＯＬＩＧＯ＃１およびＯＬＩＧＯ＃２ならびに鋳型としてのＫＧＦｃＤＮＡを用いて、ＫＧＦ遺伝子のＰＣＲ（ＰＣＲ＃１）増幅を行った［モデル９６００サーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（コネチカット州ノーウォーク在パーキンエルマー・セタス社（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）製；２８サイクル；各サイクルは変性のために９４℃で１分、アニーリングのために６０℃で２分、および伸長のために７２℃で３分からなる］。次に、アニーリング温度が５０℃である以外は前述と同じサイクル条件で第２のＫＧＦＰＣＲ（ＰＣＲ＃２）増幅のための鋳型として小量のＰＣＲ＃１産物を用いた。ＫＧＦ遺伝子の発現クローニングのために、ＫＧＦ遺伝子の両末端に都合のよい制限部位を形成するためにネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲプライマーを用いた。ＯＬＩＧＯ＃３およびＯＬＩＧＯ＃４を使用して、ＰＣＲ＃２からのＫＧＦＤＮＡ産物を改変して、遺伝子の５’および３’末端にそれぞれＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含ませた［ＰＣＲ＃３：３０サイクル；各サイクルは変性のために９４℃で１分、アニーリングのために６０℃で２分、および伸長のために７２℃で３分からなる］。次に、このＤＮＡをＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩで切断し、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。それを次に再懸濁させ、「ＲＳＨ」シグナル配列を含むｐＣＦＭ１１５６プラスミド（図２Ａ）内に（Ｔ４リガーゼを用いて）結合させて構築物ＲＳＨ−ＫＧＦをつくった（図３）。連結生成物をＥ．ｃｏｌｉ株ＦＭ５（ＡＴＣＣ：５３９１１）に（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）（１９８３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６巻：５５７頁の方法により）形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン上に２８℃でプレーティングした。幾つかの形質転換株を選択し、カナマイシン２０μｇ／ｍｌを含む少量の液状培地中で成長させた。各培養細胞からＲＳＨ−ＫＧＦプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定した。ＫＧＦ遺伝子中の内部ＮｄｅＩ部位のために、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの括弧内の制限部位を有する所望の発現ベクター内に天然型遺伝子配列を直接クローニングすることはできなかった。これは、３通り結合（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙｌｉｇａｔｉｏｎ）として達成された。ＢｓｍＩおよびＳｓｔＩの各単一の制限部位でプラスミドＲＳＨ−ＫＧＦを切断し、１％アガロースゲル電気泳動により〜３ｋｂｐＤＮＡフラグメント（ＫＧＦ遺伝子の３’末端を含む）を単離した。ＯＬＩＧＯ＃３をＯＬＩＧＯ＃５で置換する以外はＰＣＲ＃３について記載したようにＰＣＲ（ＰＣＲ＃４）を行った。次に、ＰＣＲＤＮＡ産物を、ＮｄｅＩおよびＢｓｍＩで切断し、４％アガロースゲル電気泳動により３１１ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。結合で使用した第３のフラグメントを、１％アガロースゲル電気泳動により単離したＮｄｅＩおよびＳｓｔＩで切断されたｐＣＦＭ１１５６の１．８ｋｂｐＤＮＡフラグメントであった。前述のような結合（Ｔ４リガーゼ）、形質転換、カナマイシン選択およびＤＮＡ配列の後に、図４の構築物を含みＫＧＦとして示されるプラスミドを含むクローンを得た。切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）産物を生成する内部リボソーム結合部位のために、単一のＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間のＫＧＦＤＮＡ配列を、化学的に合成されたＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃６〜ＯＬＩＧＯ＃１１）で置換して内部側開始部位の使用を最小化した（図５）。

ＯＬＩＧＯをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、次に熱変性した。次に、温度をゆっくりと室温まで低下させることにより１本鎖（ｓｓ）ＯＬＩＧＯから二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを形成した。次に、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで切断したＫＧＦプラスミドに、内部ＯＬＩＧＯ付着末端および全ｄｓＯＬＩＧＯフラグメントの両方をＴ４リガーゼを用いて共有結合させた。新規のプラスミドをＫＧＦ（ｄｓｄ）を称した。
化学的に合成したＯＬＩＧＯ＃１２〜２４のＰＣＲ増幅により完全にＥ．ｃｏｌｉコドンに最適化したＫＧＦ遺伝子を構築した。

天然型ＫＧＦをコードする全ＤＮＡ配列が「ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）」または「クリック（Ｃｒｉｃｋ）」ストランドからのＯＬＩＧＯにより表され、ＰＣＲ増幅時に所望の２本鎖ＤＮＡ配列を形成するようにＯＬＩＧＯ＃１２〜２４を設計した（図６）［ＰＣＲ＃５，モデル９６００サーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（パーキンエルマー・セタス社（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）製）；２１サイクル；各サイクルは変性のために９４℃で３１秒、アニーリングのために５０℃で３１秒、および伸長のために７３℃で３１秒からなり、２１サイクルの後、最終伸長段階を７分行ってＰＣＲを終了した。］。ＰＣＲ増幅後、ＤＮＡフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同じ酵素で切断した発現プラスミドｐＣＦＭ１１５６中に５２１ｂｐフラグメントを結合した。ＰＣＲ＃５は、結合のために、ＯＬＩＧＯ＃２０〜ＯＬＩＧＯ＃２４をバンド補助オリゴ（ｂａｎｄ−ａｉｄｏｌｇｏｓ）として用いる（ジャヤラマン（Ｊａｙａｒａｍａｎ）ら，（１９９２），バイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），１２巻：３９２頁）ＯＬＩＧＯ＃１４〜＃１９（ＯＬＩＧＯ＃１５〜＃１８はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化された）の（Ｔ４リガーゼによる）結合により誘導されるＫＧＦ鋳型１μｌ／１００μｌｒｘｎ、および外側プライマー（１００ｐｍｏｌｅｓ／１００μｌｒｘｎ）ＯＬＩＧＯｓ＃１２およびＯＬＩＧＯ＃１３を利用した。最終的構造物をＫＧＦ（最適化コドン）と呼ぶ。
本明細書に記載のＫＧＦ類似体の全てが、ＫＧＦ（ｄｓｄ）またはＫＧＦ（最適化コドン）中に見られるＤＮＡ配列から部分的になる、またはその二つの組み合わせからなる。前述のＤＮＡフラグメント合成技術の一つ以上を利用して製造された特定のＫＧＦ類似体アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を都合のよい制限部位に挿入することにより配列がさらに改変される。前述の技術のいずれかにより任意の類似体を全体として生成することができる。しかしながら、試験した任意の遺伝子の一部または全体におけるＥ．ｃｏｌｉ最適化コドンの存在は、細菌培養細胞から得ることのできたタンパク質の収率を有意に増加させなかったが、適切な場合には通常のＯＬＩＧＯ設計の一部として最適化Ｅ．ｃｏｌｉコドンを用いた。図７〜１２は、都合のよい実施例として特定のＫＧＦ類似体ヌクレオチドおよびアミノ酸配列構築物を示す：Ｃ（１，１５）Ｓ（図７）；Ｒ（１４４）Ｑ（図８）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ（図９）；ΔＮ１５（図１０）；ΔＮ２３（図１１）及びΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ（図１２）。本明細書に記載の全てのＫＧＦ類似体構築物は、そのＤＮＡ配列が確認された。
実施例２
Ｅ．ｃｏｌｉからの精製
ＫＧＦ類似体遺伝子のクローニングにおいて三つの異なる発現プラスミドを使用した。それらは、ｐＣＦＭ１１５６（ＡＴＣＣ６９７０２）、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ６９５７６）およびｐＣＦＭ３１０２（それぞれ、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）である。ＰＣＲ重複オリゴ変異誘発で一連の部位特異的塩基変換を行うことにより、プラスミドｐ３１０２をプラスミドｐＣＦＭ１６５６から誘導することができる。プラスミド複製プロモーターＰ_copBの５’の直のところのＢｇｌＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６プラスミドｂｐ＃１８０）から出発し、プラスミド複製遺伝子に向かって進んで、塩基対は次のように変化する。

前記内容からわかるように、ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２は互いに非常に類似しており、多くの同じ制限部位を含む。プラスミドは都合よく選択され、ベクターＤＮＡ成分は新しい構築物のために容易に交換することができる。全てのクローニングに用いた宿主はＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＦＭ５（ＡＴＣＣ：５３９１１）であり、形質転換は前記ハナハン（ｈａｎａｈａｎ）（１９８３）の方法によりまたはジーン・パルサー（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ^TM）トランスフェクション装置（カリフォルニア州ヘルキュール在バイオラッド・ラボラトリーズ社（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）を用い製造者のプロトコールに従って電気溶離することにより行った。
最初に、三つのｐＣＦＭベクターの一つに所望の構築物を有する所望の組み換えＥ．ｃｏｌｉクローンの小さい新しく培養した接種体を、適当な菌株の凍結グリセロールストック０．１ｍＬをルリアブロス（Ｌｕｒｉａｂｒｏｔｈ）５００ｍＬを含む２Ｌフラスコに移すことにより開始した。培養物を３０℃で１６時間振盪した。その後、培養物を、滅菌バッチ培地（ツァイ（Ｔｓａｉ）ら，（１９８７），Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２巻：１８１〜１８７頁）８Ｌを含む１５Ｌ発酵器に移した。
フィードバッチ発酵を、フィード＃１培地の供給により始める（前記ツァイ（Ｔｓａｉ）ら，（１９８７））。ＯＤ₆₀₀が３５に達すると、プラスミドを増幅させるように培養温度を３７℃に迅速に昇温させることにより所望のＫＧＦ類似体の発現を誘発した。３７℃で２時間後、ＣＩリプレッサーを変性させるために培養温度を迅速に４２℃に昇温し、フィード１の添加をフィード２のために停止し、その添加速度は３００ｍＬ／時から始めた。フィード２は、トリプチカーゼ−ペプトン１７５ｇ／Ｌ、酵母抽出物８７．５ｇ／Ｌおよびグルコース２６０ｇ／Ｌからなっていた。４２℃で１時間後、培養温度を３６℃に下げ、この温度をさらに６時間維持した。
次に発酵を停止し、１Ｌ遠心分離瓶内に配置されたプラスチックバッグ内に遠心分離により細胞を収集した。細胞を４００ｒｐｍで６０分間遠心分離によりペレット化し、その後、上澄み液を除去し、細胞ペーストを−９０℃で凍結した。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける種々のＫＧＦ類似体の発現に続いて、天然型ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ、Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ１５、ΔＮ２３、およびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑタンパク質を、以下の手順を用いて精製した。高細胞密度発酵からの細胞ペーストを、０．２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５中の１０〜２０％溶液（容量当たり重量）に４℃で適当な高剪断ミキサーを用いて懸濁させた。懸濁した細胞を、次に、溶液をホモジナイザー（マサチューセツ州エベレット在ガウリン社（ＡＰＶＧａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）製）に３回通すことにより溶解した。あふれ出る均一液を適当な熱交換機を用いて４〜８℃に冷却した。次に、ＪＳ４．２ローターを備えたＪ−６Ｂ^TM遠心分離器（カリフォルニア州ブリー在ベックマン・インストルーメンツ社（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）製）で４２００ｒｐｍにて４℃で３０〜６０分間遠心分離することにより細胞破片を除去した。次に、上澄み液を注意深く除去し、０．２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５により４℃で平衡化させたエス−セファロース・ファースト・フロー（Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ^TM）樹脂（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）カラムの予め調製した４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムにロードした。次に、５カラム体積（２２５０ｍＬ）の０．４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５により４℃でカラムを洗った。カラムを５Ｌの０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で洗うことにより所望のタンパク質を溶離した。再び、フラクション５０ｍＬを収集し、溶離液のＡ₂₈₀を連続的にモニターした。次に、溶離物質を含んでいるとＡ₂₈₀により確認されたフラクションを１４％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して所望のポリペプチドの存在を確認した。
次に、所望のタンパク質を含むこれらのフラクションを溜め、等量の蒸留水を添加した。希釈サンプルを、０．４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ６．８により４℃で平衡化させたエス−セファロース・ファースト・フロー（Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ^TM）樹脂の予め調製した４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムにロードした。カラムを、２２５０ｍＬの０．４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ６．８で洗い、０．４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ６．８から０．６ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ６．８の２０カラム体積の直線グラジエントを用いてタンパク質を溶離した。再度、流出液を定常的にＡ₂₈₀でモニターしつつフラクション５０ｍＬを収集した。タンパク質（１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決められる）を含むこれらのフラクションを溜め、３５０ｃｃ攪拌セル（マサチューセッツ州メイベリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．））中、ＹＭ−１０膜（分子量１００００カットオフ）を通して３０〜４０ｍＬの容量まで濃縮した。
次に、濃縮液を、１×ＰＢＳ（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸塩緩衝塩水、「Ｄ−ＰＢＳ」、カルシウムおよびマグネシウム非含有）または０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０を含むカラム緩衝液中で平衡化させたスーパーデックス−７５（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５^TM）樹脂（ファーマシア社製）の予め調製した１３００ｍＬ（４．４ｃｍ×８５ｃｍ）カラムにロードした。サンプルをカラム内を通した後、タンパク質をゲル濾過マトリックスからカラム緩衝液を用いて溶離した。その後、フラクション１０ｍＬを回収し、類似体（１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決められる）を含む液を溜めた。典型的に、得られる貯溜液中のタンパク質濃度は約５〜１０ｍｇ／ｍＬであった。前記全ての手順は、特記しない限り４〜８℃で行った。
天然型ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）ＳおよびΔＮ２３を精製するために別の精製手順を用いた。手順は以下の段階を含み、特記しない限り、全ての手順、溶液および材料は２３±５℃で処理した。
細菌発酵の製造工程の終了時に、培養細胞を４〜８℃に冷却し、遠心分離または同様のプロセスにより細胞を収集した。細胞ペーストの単位重量当たりのタンパク質の予想される収量および必用とされる精製タンパク質の量を基準として、適当な重量の細胞ペーストを、２０ｍＭＮａＰＯ₄、０．２ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含みかつ懸濁すべき細胞ペーストの約５倍の重量の穏和な緩衝溶液中に懸濁させた。細胞を、高剪断ミキサーを用いて均一溶液中に分散した。細胞ペースト分散液の温度は均一化中、４〜８℃に維持した。
細胞を圧力により、例えば適当な寸法の細胞ホモジナイザーに細胞ペースト分散液を２回通すことにより溶解した。均一液を５±３℃で冷却維持した。細胞溶解液を清澄化するために、適当な容量の０．２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で平衡化した、適当な大きさのフィルター表面積を有するフィルターを備えている予め調製されたデプスフィルターハウジング（コネチカット州メリデンのクノ社（Ｃｕｎｏ，Ｉｎｃ．））を用いた。平衡化および遠心分離は５±３℃で行った。清澄化の前に、適量の好適なフィルター助剤を使用してフィルターを予備被覆し、細胞溶解物と充分に混合し、その後、溶液をフィルター装置を通過させることにより溶解液を清澄化した。フィルターを０．２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で洗った。濾液およびいかなるその後の洗浄液も、適当な容積の冷却容器に収集し、１０℃未満の温度に維持した。
清澄化に続いて、次に溶解液を、細胞ペースト２ｇ当たり少なくとも１ｍＬの樹脂を含む予め調製しておいたＳＰ−セファロース・ファースト・フローのカラムを通過させた。ＳＰ−セファロース・ファースト・フローのカラムを、冷たい（５±３℃）、０．２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で平衡化させた。カラムの温度を１０℃未満に維持した。次に、清澄化溶解液（５±３℃）を２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）における溶離液の吸収率を連続的にモニターしながらイオン交換カラムにロードした。サンプルをロードした後、カラムを、冷たい０．２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で洗い、２３±５℃で０．３ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で洗った。
所望のタンパク質を溶離するために、０．２〜１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５の直線グラジエントを用いた。溶離液のＡ₂₈₀を基準にした幾つかのフラクションとして生成物のバルクを収集した。溶離に続いて、これらのフラクションを溜め、容量を記録した。
遊離スルフヒドリル基を酸化するために、酸化段階を実施した。天然型ＫＧＦと比較して、変化したシステインパターンを有するタンパク質については、酸化剤（例えば、シスタミンジヒドロクロライドまたは他の適当な酸化剤、例えば、シスチン、酸化型グルタチオン、または２価の銅）を最終濃度が１〜２０ｍＭになるように添加しおよびｐＨを７〜９．５に調節し、シスタミンジヒドロクロライドを用いる場合はｐＨを９．０±０．３に調節する。酸化は、１０〜３０℃の温度で適当な期間行った。天然型ＫＧＦタンパク質の場合、酸化は、１〜２Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄のような適量の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を添加し、ｐＨを７．５〜９．５に調節し、温度を２３±５℃に適当な時間保持する事により行った。
酸化後、溶液のｐＨを６．５〜９．５に調節した。必用な場合、固体の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を最終濃度が２Ｍになるように溶液に添加した。粒子を除去するために、溶液を、適当な清澄化フィルターを通過させた。
次に、濾過され酸化した生成物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に掛けた。ＨＩＣマトリックスは、ブチル−６５０Ｍトヨパール（Ｂｕｔｙｌ−６５０ＭＴｏｙｏｐｅａｒｌ^TM）樹脂（ペンシルバニア州モントゴメリー在トーソハース社（Ｔｏｓｏｈａａｓ）製）であった。タンパク質含有溶液を、２Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０により予め平衡化させておいたカラムにロードした。サンプルをロードした後、カラムを、２Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０で洗った。次に、所望のタンパク質を、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０中に２〜０Ｍの濃度で展開した減少濃度の直線的（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄グラジエントを用いて溶離した。溶離液のＡ₂₈₀の増加により示される所望のタンパク質の溶離が開始すると、フラクションを収集した。各フラクションのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。所望のタンパク質を含むこれらのフラクションを溜め、充分に混合し、貯溜液の容量を、そこのタンパク質濃度とともに決定した。
次に、溜めたＨＩＣタンパク質含有溶離液を濃縮し、溶離緩衝液を交換した。典型的に、タンパク質を５．０〜１０．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。適当な寸法のカットオフ膜を有するペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ^TM）カセットシステム（マサチューセッツ州ベッドフォード在ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）製）が備えられた限外濾過システムを用いて限外濾過を行った。
濃縮後、サンプルを適当な緩衝液に対して透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。濃縮段階からの残留物を、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０溶液の導電率の５％以内に残留物の導電率が入るまで、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０に対して透析濾過した。
さらに、存在し得る沈殿物およびバクテリアのエンドトキシンを除去するために、濃縮・透析濾過したタンパク質含有サンプルを０．１μｍポジダイン（Ｐｏｓｉｄｙｎｅ^TM）フィルター（ニューヨーク州コートランド在ポール社（Ｐａｌｌ，Ｉｎｃ．）製）を通過させた。溶液のタンパク質濃度を決めた後、最終のバルク生成物の所望の濃度を基準として溶液を、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０で所望の最終濃度に希釈した。最終のバルク生成物を、さらなる組成物調製のために貯蔵（約５℃で）のための発熱物質を含まない容器に移すときに、最終的な０．２２μｍフィルターを通す滅菌濾過を実施した。
実施例３
哺乳動物細胞培養物からの精製
この実施例は、哺乳動物発現系において生成された二つの生物学的に活性な組み換えＫＧＦ（ｒＫＧＦ）の発現、単離、および特性付けを記載する。
ヒトＫＧＦ遺伝子を、正常なヒト皮膚線維芽細胞から製造されるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により単離した（カリフォルニア州パロ・アルト在クロネテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃ，Ｉｎｃ．））。逆転写酵素によるｃＤＮＡの製造後に、ＫＧＦ遺伝子の増幅のためにＰＣＲを使用した。図１に示されるように、ｃＤＮＡから遺伝子を増幅するためにＯＬＩＧＯ＃２５およびＯＬＩＧＯ＃２６を使用し、第２のＰＣＲ増幅によりフラグメント末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｌＩＩ制限部位を入れるためにＯＬＩＧＯ＃２７およびＯＬＩＧＯ＃２８を用いた。

クローニングおよびＤＮＡ配列の確認に続いて、ＫＧＦ遺伝子ＤＮＡを使用した。二つのプライマーを用いて増幅を行った。

センスプライマーＯＬＩＧＯ＃２９は、開始コドンＡＴＧの上流のコンセンサスＫｏｚａｋ翻訳配列（５’−ＣＣＡＣＣ−３’）およびＸｂａＩ部位を含んでいた。アンチセンスプライマーＯＬＩＧＯ＃３０は、ＳａｌＩクローニング部位および追加の停止コドンを含んでいた。１８サイクルのＰＣＲ増幅（９４℃での変性３０秒、５５℃でのアニーリング４０秒、および７２℃での伸長４０秒間）後、生成物をＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、同様に消化したｐＤＳＲα２ＤＮＡと結合させた（バードレル（Ｂｏｕｒｄｒｅｌ）ら，（１９９３），ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐ．＆Ｐｕｒｉｆ．，４巻：１３０〜１４０頁およびルー（Ｌｕ）ら，（１９９２），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２９８巻：１５０〜１５８頁の方法による）。これにより、ＳＶ４０初期プロモーターとα−ＦＳＨポリアデニル化配列との間にヒトＫＧＦ遺伝子が組み込まれたプラスミドＫＧＦ／ｐＤＳＲα２を得た。二つのクローンを取り出し、ＤＮＡ配列分析により所望のベクターの構築を確認した。
次に、ＫＧＦ／ｐＤＳＲα２ＤＮＡ２μｇをＰｖｕＩで直線化した。前日に０．８×１０⁶細胞／６０ｍｍ培養皿で接種したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、標準的リン酸カルシウム沈降法（前記バードレルら）を用いて、処理したＤＮＡでトランスフェクションした。２週間後、個々のコロニーを取り出し、２４ウエルプレートに移した。細胞が集密状態に達し、そのアリコートをＥ．ｃｏｌｉ発現ヒトＫＧＦに対して反応性のポリクローナルウサギ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析したとき、ならし培地は血清を含まないと考えられた。
ウエスタンブロッティングは、サンプルを１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、続いて半乾燥トランスファー装置（カリフォルニア州サンフランシスコ在ヘーファー・サイエンティフィック・インスツルーメンツ（ＨｏｅｆｅｒＳｃｉｅｎｔｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いてニトロセルロース膜上で４００ｍＡで１時間エレクトロブロッティングすることにより実施した。２０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭグリシン、２０％メタノールをトランスファー緩衝液として使用した。ニトロセルロースシートを、ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清と一緒にインキュベートすることによりブロックした。Ｅ．ｃｏｌｉ誘導ＫＧＦに対するウサギ抗血清を第一抗体として用いた。使用のために、それを、ＰＢＳ中１％正常ヤギ血清中に１／１００００に希釈し、ブロックされたニトロセルロースシートと一緒に室温で１２時間インキュベートし、その後、過剰の抗体を、ＰＢＳ中で３０分間の洗浄を３回行って除去した。次に、ニトロセルロース膜を、ベクタスタイン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ^TM）ビオチニル化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（第二抗体；カリフォルニア州バーリンガム在ベクター・ラブス社（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）製）を含むＰＢＳ中１％正常ヤギ血清１００ｍＬ中で室温にて３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中での１０分間の洗浄を３回行った後、製造者（ベクター・ラブス社）の指示に従って調製したビオチニル化ペルオキシダーゼおよびストレプトアビジンを含む１％正常ヤギ血清の１００ｍＬ溶液中で、３０分間、室温でのインキュベーションを行った。ＰＢＳ中での３回の洗浄に続いて、ＰＢＳ１００ｍＬ中３０％（ｗ／ｖ）Ｈ₂Ｏ₂６０μＬとメタノール２０ｍＬ中４−クロロナフトール５０ｍｇとの混合物中でインキュベートすることによりＫＧＦ交差反応性物質を視覚化した。１０分後に水中で濯ぐことにより反応を停止した。
ブロットの分析により、ＫＧＦ特異抗体が三つの異なるタンパク質バンド、すなわち、１６３アミノ酸の成熟型タンパク質の約１８．８ｋＤａの予想される分子量と比較して、その二つが約２５〜２９ｋＤａの分子量に密接に係わり、また一つが約１７ｋＤａの推定分子量に係わる前記三つのバンドと結合することがわかった。さらに、ウエスタン分析により判断される１リッター当たり２．０ｍｇを越えるｒＫＧＦを分泌する幾つかの高発現クローンを選択し、（前記ルーらの方法により）ローラー瓶中に増殖させて、後述するゲル濾過およびカチオン交換クロマトグラフィーによるＫＧＦの精製のために大量の無血清ならし培地を生成した。
無血清ならし培地３ＬからのＫＧＦを、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で予め平衡化されたＳＰ−セファロース・ファースト・フロー（ファーマシア社製）の４５０ｍＬのスルホエチル樹脂を詰めたカチオン交換カラム（５×２４ｃｍ）に直接培地をロードすることにより精製した。５倍カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄した後、２０ｍＭリン酸ナトリウム中０．２〜１．０ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５の２０倍カラム体積の直線グラジエントを用いてｒＫＧＦを溶離した。連続的にＡ₂₈₀をモニターしながらフラクション５０ｍＬを収集した。各フラクションのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することによりＫＧＦタンパク質を検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、予め流延した１４％Ｔｒｉｓ−グリシン予備流延ゲルを用いる電気泳動システム（カリフォルニア州サンジエゴ在ノヴェックス社（Ｎｏｖｅｘ）製）で行った（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）（１９７０），Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻：６８０〜６８５頁）。サンプルを、ローディング前に加熱することなく非還元性ＳＤＳサンプル緩衝液と混合した。タンパク質を、クマシーブルーまたは銀染色で検出した。二つの後期溶離ピークが、ウエスタンブロットにより検出される１７ｋＤａバンドおよび２５〜２９ｋＤａに相当するタンパク質バンドを含むことがわかった。これらのピークの各々を含むフラクションを別々に１．０ｍＬ未満の体積に濃縮し、ゲル濾過した。
ゲル濾過は、ＰＢＳで予め平衡化されたスーパーデックス−７５（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５^TM）樹脂（ＨＲ１０／３０，ファーマシア社製）のカラムであって、以下の既知の分子量標準により検量されたカラム（カリフォルニア州サンフランシスコ在バアイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ）製）を用いた：チログロブリン（６７０ｋＤａ）、ガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、オボアルブミン（４４ｋＤａ）、ミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ−１２（１．４ｋＤａ）。これらの精製段階により、銀染色により推定されるように特に１７ｋＤａおよび３０ｋＤａの物質を含むｒＫＧＤが約２０００倍精製された。
より高分子量の物質の場合、ｒＫＧＦは主要の対称ピークとして溶離され、それはＫＧＦ−ａと呼ばれた。この物質のより少量（３μｇ／レーン対６μ／レーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、分子量の差が１〜２ｋＤａである二つのバンドに分離した。ＫＧＦ−ｂと呼ぶ低分子量物質の場合、ゲル濾過により予想された移動度を有するタンパク質調製物が得られた。ＫＧＦ−ａとＫＧＦ−ｂの両方について、精製後の全収率は約３０〜４０％であった。
ＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂのアミノ酸配列も分析した。これらの分析は、モデル１２０ＡオンラインＰＴＨ−アミノ酸分析器およびモデル９００Ａデータ収集システムが備えられた自動シーケンサー（カリフォルニア州フォスターシティー在アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）製のモデル４４７Ａ又は４７０Ａ）で行った（ルー（Ｌｕ）ら，（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６巻：８１０２〜８１０７頁の方法による）。ＫＧＦ−ａのエドマン（Ｅｄｍａｎ）配列分析は、主にＮ−末端配列Ｘ₁−Ｎ−Ｄ−Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｑ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｎ−Ｖ−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｓ−（配列番号：５１）を示した。３番目のＮ−末端アミノ酸であるアスパラギン酸から始まるマイナーな配列も、全配列決定可能タンパク質の１．６％の量で存在していた。Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃は、配列分析中、フェニルチオヒダントイニル（ＰＴＨ）アミノ酸シグナルの不在のために帰属できなかった。
興味深いことに、ＫＧＦ−ｂのＮ−末端配列分析は、Ｎ−末端アミノ酸肺配列Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｇ−Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−（配列番号：５２）を示し、それは、Ａｒｇ²³−Ｓｅｒ²⁴ペプチド結合でタンパク質分解されたＫＧＦのＮ−末端切頭型であることを示している。
精製されたＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂをさらに特性付けるために、既知の技術（ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら，（１９８７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２巻：１２０５９〜１２０７６頁；タケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ）ら，（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３巻：３６５７〜３６６３頁；ツェボ（Ｚｓｅｂｏ）ら，（１９９０），Ｃｅｌｌ，６３巻：１９５〜２０１頁）を用いてタンパク質をグリコシダーゼ（ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、および／またはＮ−グリカナーゼ）処理に付した。これらのデータは、ＫＧＦ−ａのより低分子量型のものは、おそらくＮ−結合糖のみを含むが、ＫＧＦ−ａはＮ−およびＯ−結合炭水化物を含むことを示している。グリコシダーゼ処理は、ＫＧＦ−ｂについて分子量低下を引き起こさず、それは分子がグリコシル化されていないことを示している。
実施例４
生物学的活性
各ＫＧＦ類似体を希釈し、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞の［³Ｈ］−チミジン取り込みを測定することにより生物学的活性を検定した（前記ルビンら（１９８９）の方法による）。まず、サンプルを、５０％カスタマーメイドＥａｇｌｅ′ｓＭＥＭ、５０％カスタマーメイドＦ１２、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、０．０００５％ＨＳＡおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０からなるバイオアッセイ培地中に希釈する。次に、ＫＧＦサンプルを、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞を接種したファルコン・プリメリア（ＦａｌｃｏｎＰｒｉｍｅｒｉａ）９６−ウエルプレートに添加した。ＤＮＡ合成中における［³Ｈ］−チミジンの組み込みを測定し、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較することにより、組み込まれた天然型ＫＧＦ濃度に変換された。試験した各類似体は、有糸分裂活性を示した。
Ｂａｌｂ／ＭＫマウス上皮ケラチノサイトから調製した単離ＫＧＦレセプター膜調製物を用いてＫＧＦレセプターとの相互作用を試験した（マッサージュ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）（１９８３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８巻：１３６１４〜１３６２０頁に記載の手順による）。特に、５０μＬ当たり０．８ｎｇ〜１００ｎｇの濃度範囲になるように０．２％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で種々の形態のＫＧＦを希釈した。それらは、個々に、前記膜調製物（７５ｎｇ／ｍＬ）および¹²⁵Ｉ−標識化Ｅ．ｃｏｌｉ誘導ＫＧＦ（１．５ｎｇ）と一緒にインキュベートした。レセプター結合および競合実験を４℃で１６時間行い、その後、サンプルを取り出し、遠心分離し、前記希釈緩衝液で２回洗って非結合および非特異的結合の標識化ＫＧＦを除去した。次に、サンプルの残留放射能を計数した。各ＫＧＦサンプルの濃度に対して非競合％をプロットすることにより、ＫＧＦサンプルと標識化ＫＧＦとの間のレセプター結合の競合曲線をつくった。放射性レセプターアッセイ非競合実験は、Ｅ−ｃｏｌｉ誘導ＫＧＦ、ＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂが類似するレセプター結合活性を有することを示した。
本発明を、一般的におよび好ましい実施態様について記載したが、前記記載に照らして当業者は他の変更および変形を行い得るものと解すべきである。
配列表
配列番号１
配列の長さ：８６２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２
配列の長さ：１９４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号３
配列の長さ：５９５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号４
配列の長さ：１８６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号５
配列の長さ：４９９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号６
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号７
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号８
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号９
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１０
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１１
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１２
配列の長さ：３７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１３
配列の長さ：４４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１４
配列の長さ：３７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１５
配列の長さ：４５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１６
配列の長さ：４５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１７
配列の長さ：３６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１８
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号１９
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２０
配列の長さ：９１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２１
配列の長さ：９０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２２
配列の長さ：９０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２３
配列の長さ：９０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２４
配列の長さ：９０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２５
配列の長さ：８８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２６
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２７
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２８
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号２９
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号３０
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号３１
配列の長さ：４９５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号３２
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号３３
配列の長さ：４９５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号３４
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号３５
配列の長さ：４９５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号３６
配列の長さ：１６４アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号３７
配列の長さ：４５０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号３８
配列の長さ：１４９アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号３９
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号４０
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号４１
配列の長さ：４２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号４２
配列の長さ：１４１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号４３
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号４４
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：−
存在位置：相補鎖（１．．２４）
配列

配列番号４５
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号４６
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号４７
配列の長さ：２９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号４８
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号４９
配列特性
配列の長さ：３８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号５０
配列の長さ：３３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号５１
配列の長さ：１６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号５２
配列の長さ：１２アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列

Claims

（ａ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の溶液をカチオン交換樹脂にロードする工程、
（ｃ）カチオン交換樹脂からの溶離溶液中にＫＧＦを溶離する工程、
（ｄ）工程（ｃ）からの溶離溶液を（ｉ）分子量排除マトリックスを通過させる工程、または（ii）疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを通過させる工程、および
（ｅ）ＫＧＦを回収する工程を含んでなり、
但し、ヘパリン・アフィニティクロマトグラフィー工程を含まない、ＫＧＦの精製方法。
カチオン交換樹脂がカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルアガロース、硫酸アガロースまたはセルロースカラムから選択されたものである請求項１に記載の方法。
工程（ｃ）からの溶離溶液を、分子量排除マトリックスを通過させる請求項１又は２に記載の方法。
分子量排除マトリックスが、アガロース系、アクリルアミド系、シリカ系またはポリマー系サイズ排除カラムから選択されたものである請求項３に記載の方法。
工程（ｃ）からの溶離溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを通過させる請求項１又は２に記載の方法。
溶離溶液中のＫＧＦを、溶離溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを通過させる前に酸化する請求項５に記載の方法。
ＫＧＦを酸化剤と接触させることにより酸化する請求項６に記載の方法。
酸化剤がシスタミンジヒドロクロリド、シスチン、酸化型グルタチオンまたは２価銅から選択される請求項７に記載の方法。
疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスがアルキルまたはフェニル置換樹脂を有するカラムから選択される請求項１、２及び５から８のいずれか１項に記載された方法。
該ＫＧＦが天然ケラチノサイト成長因子（配列番号２のアミノ酸残基３２〜１９４で表され、シグナル配列を含むか或いは含まない）のアミノ酸配列またはそのムテインを含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
天然ケラチノサイト成長因子のムテインが、
（ａ）天然ケラチノサイト成長因子のＣｙｓ¹およびＣｙｓ¹⁵（配列番号２のアミノ酸位置３２のシステインおよび配列番号２のアミノ酸位置４６のシステイン）が置換または欠失された対応する残基を有するポリペプチド、
（ｂ）天然ケラチノサイト成長因子のアミノ酸残基４１〜１５４（配列番号２のアミノ酸残基７２〜１８５）の一つ以上が、タンパク質の陽電荷を減少させるように選択された電気的に陰性の残基または中性の残基で置換されるかまたは欠失された、荷電を変化させたポリペプチド、
（ｃ）天然ケラチノサイト成長因子のＡｓｎ¹¹⁵−Ｈｉｓ¹¹⁶−Ｔｙｒ¹¹⁷−Ａｓｎ¹¹⁸−Ｔｈｒ¹¹⁹のループ形成領域内（配列番号２のアミノ酸残基１４６〜１５０）の少なくとも一つのアミノ酸を、より高いループ形成能を有する少なくとも一つのアミノ酸で置換することにより生じるポリペプチド、または
（ｄ）天然ケラチノサイト増殖因子の１２３〜１３３（配列番号２のアミノ酸残基１５４〜１６４）の領域内における一つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するポリペプチド
のいずれかから選ばれる請求項１０に記載の方法。
該ムテインがＣ（１、１５）Ｓ、ΔＮ１５、ΔＮ１６，ΔＮ１７、ΔＮ１８、ΔＮ１９、ΔＮ２０、ΔＮ２１、ΔＮ２２、ΔＮ２３、ΔＮ２４、ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ３／Ｃ（１５）−、ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ，ΔＮ８／Ｃ（１５）−、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５，４０）Ｓ，Ｃ（１、１５、１０２）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ，ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ，ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｅ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ、ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ、Ｒ（１４４）ＱまたはＨ（１１６）Ｇのいずれかから選択されたものであり、配列番号２のアミノ酸残基３２〜１９４により表される、天然ケラチノサイト成長因子の当該位置に見出せる残基に関して設計されたものである請求項１１に記載の方法。
該ＫＧＦが最初のメチオニン残基を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
ＫＧＦが原核細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞内で生成される請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
ＫＧＦが哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞内で生成される請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）最初のメチオニンが存在するかまたは存在しないΔＮ２３を含む溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の溶液をカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルアガロース、硫酸アガロースまたはセルロースカラムから選択されるカチオン交換樹脂へロードする工程、
（ｃ）該カチオン交換樹脂からの溶離溶液中にＫＧＦを溶離する工程、
（ｄ）該溶離溶液をシスタミンジヒドロクロリド、シスチン、酸化グルタチオンまたは２価銅である酸化剤と接触させる工程、
（ｅ）アルキルまたはフェニル置換樹脂から選択された疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに工程（ｄ）の溶離溶液を通過させる工程、および
（ｆ）該疎水性相互作用クロマトグラフィーからΔＮ２３を回収する工程を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
（ａ）最初のメチオニンが存在するかまたは存在しないΔＮ１６を含む溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の溶液から得た溶液をカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルアガロース、硫酸アガロースまたはセルロースカラムから選択されるカチオン交換樹脂へロードする工程、
（ｃ）該カチオン交換樹脂からの溶離溶液を溶離する工程、
（ｄ）該溶離溶液をシスタミンジヒドロクロリド、シスチン、酸化グルタチオンまたは２価銅である酸化剤と接触させる工程、
（ｅ）アルキルまたはフェニル置換樹脂から選択された疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに工程（ｄ）の溶離溶液を通過させる工程、および
（ｆ）疎水性相互作用クロマトグラフィーからΔＮ１６を回収する工程を含んでなる、請求項１４に記載の方法。