CN109402130A

CN109402130A - 一种重组人角质细胞生长因子-1及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN109402130A
Application number: CN201811408920.1A
Authority: CN
Inventors: 高坪; 张培海
Original assignee: Second Affiliated Hospital Army Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital Army Medical University
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明涉及一种重组人角质细胞生长因子‑1(KGF‑1)生产方法。还公开了含重组人角质细胞生长因子‑1的基因的重组质粒，该质粒电转染到中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)中后人角质细胞生长因子的表达方法及纯化步骤。本发明人角质细胞生长因子‑1能显著促进4MBr‑5细胞增殖，适合用于治疗因皮肤及黏膜组织损伤相关的疾病、肺部损伤相关疾病以及治疗膀胱或尿道上皮损伤相关的疾病。

Description

一种重组人角质细胞生长因子-1及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及重组人角质细胞生长因子-1(rhKGF-1)及其制备方法和用途。

背景技术

人角质细胞生长因子-1(KGF-1或KGF)，也称为成纤维细胞生长因子-7(FGF-7)，是人肺泡II型上皮细胞增殖、迁移和分化的一种重要的旁分泌辅助因子，通过结合上皮细胞受体KGFR发挥重要功能。在体外培养的支气管上皮细胞中，KGF可加速上皮细胞愈合，增强气道上皮细胞的修复和循环上皮细胞的动员和迁移。KGF促进气道上皮细胞增殖并对活性氧的解毒具有重要意义。在动物模型中，KGF可降低大鼠肺泡损伤和死亡率，也可减少急性肺损伤对气体交换区域的影响。此外，在原代泌尿上皮细胞缺乏KGF培养时细胞分裂将终止；在KGF敲出小鼠中，输尿管芽发生，而且肾集合系统显著小于对照的野生型小鼠；KGF敲出小鼠的膀胱或尿道上皮厚度也比野生型小鼠显著更薄。在环磷酰胺诱导的大鼠溃疡性膀胱炎模型，用重组KGF治疗几乎能完全改善溃疡性症状。这些均提示KGF在治疗肺部损伤相关疾病，以及治疗膀胱或尿道上皮损伤相关的疾病。

重组人KGF(rhKGF)是一种由N末端缺失的KGF突变体或类似物，N末端的缺失已被证明具有增强蛋白质稳定性的作用，在2004年作为治疗性重组蛋白被FDA批准上市(中文名：帕利夫明)，用于治疗因高剂量放化疗所致的严重口腔溃疡。已批准上市的rhKGF是由大肠杆菌表达体系生产制备，该体系流程简单，成本低廉，但从大肠杆菌中提取KGF通常需要经过复性等复杂过程才能得到有活性的可溶性蛋白。而且，大肠杆菌表达体系也存在潜在的安全问题。中国专利申请(201210032424.7和201610458957.X)先后公开了利用昆虫细胞和毕赤酵母作为宿主，重组表达KGF。相对于大肠杆菌，昆虫细胞和毕赤酵母表达体系的优势在于翻译后修饰和无需蛋白复性的产物纯化。但无论是昆虫细胞或是毕赤酵母，经纯化的KGF与天然蛋白间仍然存在活性差异。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组人角质细胞生长因子-1(rhKGF-1)。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。优选地，所述的重组载体是重组pCMV质粒。

还提供了一种重组细胞，它包含前述的重组载体。优选地，所述的重组细胞为重组中国仓鼠卵巢CHO细胞。

本发明提供的重组人角质细胞生长因子-1(rhKGF-1)，它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种制备前述重组人角质细胞生长因子-1(rhKGF-1)的方法，包含如下步骤：

(1)取前述的重组细胞，接种于商业用无血清添加培养基Acti Pro中悬浮培养，期间流加补料Cell Boost 7a powder supplement两次，培养温度37℃，加料时间为第3天和第5天，第7天于4℃条件下收集培养液，离心，过滤，得上清；

(2)取上清液，用离子交换层析技术分离纯化：先用阴离子交换层析再阳离子交换层析；

阴离子层析时流动相A作为平衡缓冲液，用于冲洗层析系统流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm；用流动相B对其目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱样品，所述梯度洗脱的方式为：100-50％A、0-50％B，洗脱20min；

阳离子层析时流动相A为：20mM柠檬酸，pH6.0；流动相B为：20mM柠檬酸，含1M氯化钠，pH6.0；流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm；用流动相B对其目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱样品，即得；所述梯度洗脱的方式为：100-70％A、0-30％B，洗脱20min；

所述流动相A为20mM的Tris-HCl溶液；所述流动相B为1M氯化钠的20mM的Tris-HCl溶液。

本发明还提供了前述rhKGF-1在制备皮肤损伤、黏膜组织损伤、肺部损伤、膀胱上皮损伤或尿道上皮损伤的药物中的用途。

本发明还提供了一种药物，它是以rhKGF-1为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明通过基因工程的方式制备得到了纯品rhKGF-1，其生物活性好，且制备方法简单，可实现大工业生产，具有良好的市场应用前景。

不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1质粒pCMV示意图。

图2重组质粒pCMV-KGF-1示意图。

图3 DNA凝胶电泳分析。1-9泳道为挑选的pCMV-KGF-1单克隆重组菌株PCR产物，其中，2和9泳道为含KGF-1序列的重组克隆菌株。

图4SDS—PAGE分析。1泳道为发酵液，M泳道为Marker，2泳道为穿透液，3-5泳道为洗脱液。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1本发明重组蛋白的制备

1、重组质粒的构建

(1)人角质细胞生长因子-1(KGF-1)基因的合成

基因序列分析

进行KGF-1编码区基因序列(GenBank:)的优化，得到KGF-1基因序列(SEQ ID NO：1)和KGF-1基因表达后的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。由上海生工生物工程有限公司合成，合成的基因序列重组至质粒载体pUC57中，获得包含目的基因的质粒为pUC57-KGF-1。

KGF-1基因序列(SEQ ID NO：1)：

AGCTATGACTACATGGAAGGAGGCGATATCAGAGTGAGAAGACTGTTCTGTCGGACACAGTGGTACCTGAGGATCGACAAGAGAGGCAAGGTGAAGGGCACCCAGGAGATGAAGAATAACTACAACATCATGGAAATCAGGACAGTGGCCGTCGGAATCGTGGCCATCAAAGGAGTGGAAAGTGAATTCTATCTCGCCATGAACAAGGAAGGAAAGCTCTATGCTAAGAAGGAGTGCAATGAAGATTGTAACTTCAAGGAACTCATTCTGGAAAACCATTACAACACATATGCCTCTGCTAAGTGGACACACAACGGAGGCGAAATGTTCGTCGCCTTGAATCAGAAGGGCATTCCTGTCAGAGGAAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAGACAGCCCACTTTCTGCCTATGGCTATCACTTAA

KGF-1基因表达后的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)

SYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNNYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEFYLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHNGGEMFVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

生工生物合成含KGF-1基因序列的质粒部分序列片段(SEQ ID NO：3):

GCAGATCTCCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTAGCTATGACTACATGGAAGGAGGCGATATCAGAGTGAGAAGACTGTTCTGTCGGACACAGTGGTACCTGAGGATCGACAAGAGAGGCAAGGTGAAGGGCACCCAGGAGATGAAGAATAACTACAACATCATGGAAATCAGGACAGTGGCCGTCGGAATCGTGGCCATCAAAGGAGTGGAAAGTGAATTCTATCTCGCCATGAACAAGGAAGGAAAGCTCTATGCTAAGAAGGAGTGCAATGAAGATTGTAACTTCAAGGAACTCATTCTGGAAAACCATTACAACACATATGCCTCTGCTAAGTGGACACACAACGGAGGCGAAATGTTCGTCGCCTTGAATCAGAAGGGCATTCCTGTCAGAGGAAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAGACAGCCCACTTTCTGCCTATGGCTATCACTTGATTAATTAAGCG

(2)重组表达载体的构建

对pCMV质粒(如图1所示)和pUC57-KGF-1质粒进行双酶切，酶切体系在1.5ml离心管中建立如下成分：上述质粒40μl、Cutsmart 10μl、AvrⅡ和Pac I(A/P)各5μl、灭菌水50μl，混匀后37℃反应过夜，利用QIAGEN产物纯化试剂盒回收，回收获得载体线性化质粒pCMV(A/P)和目的基因片段KGF-1(A/P)。

在T4连接酶的作用下，将上述已酶切回收获得的质粒pCMV(A/P)与KGF-1(A/P)基因片段连接，形成重组质粒pCMV-KGF-1(如图2所示)。连接反应在1.5mlEP管中建立如下体系：pCMV(A/P)1μl、KGF-1(A/P)基因片段7μl、10×T4Buffer 1μl、T4DNAligase 1μl，混匀后于室温(20℃左右)下反应4h以上，连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞中，涂于2YT(AMP)平板培养基上，37℃恒温培养箱静止孵育过夜，平板编号分别为pCMV-KGF-1。

从上述菌落中挑取数个重组单菌落经过培养，进行重组菌的质粒提取，然后进行酶切，酶切体系是在1.5ml EP管中加入如下成分：质粒7μl、Cutsmart 1μl、AvrⅡ和Pac I(A/P)各0.2μl、补灭菌水至10μl，混匀后于37℃下反应4h。琼脂糖凝胶电泳分析结果(如图3)。经酶切鉴定正确后，采用QIAGEN Plasmid Midi Kit大量提取表达质粒，并保存备用。

2、重组表达

将重组质粒pCMV-KGF-1(如图2)经电转法转染至CHO DG44细胞中，将电转后细胞混合液转移至含SFM4培养基的6孔板中，置于37℃孵箱中培养，48h后加入MTX(10nM)进行加压筛选，待细胞活率恢复至90％以上，MTX增加至100nM；细胞加入MTX至500nM，待活率恢复至90％以上后，将细胞转入摇瓶并在商业用无血清添加培养基Acti Pro中悬浮培养。于培养第3和第5天分别流加补料Cell Boost 7a powder supplement继续培养，第7天收获培养液在4℃条件下，以5000rpm离心15min，收集上清经0.45μm滤膜过滤后进行纯化。

3、分离纯化：

采用离子交换层析技术对上述表达细胞的上清进行纯化，具体操作如下：

阴离子交换层析：将1mL HiTrapTM Q HP预装柱与AKTA purifier层析系统相连。流动相A为：20mM Tris-HCl，pH 8.0；流动相B为：20mM Tris-HCl，含1M氯化钠，pH 8.0；流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm。先用流动相A平衡层析柱5-10CV，对已收集处理的细胞上清液进行上样，目的蛋白结合于介质上，部分杂质穿透。上样结束后，采用流动相A清洗层析柱3-5CV，最后用流动相B对其目的蛋白进行梯度洗脱(100-50％A、0-50％B，20min)，收集洗脱样品并将缓冲液置换至20mM柠檬酸(pH6.0)中。层析柱用3-5CV的1M氯化钠再生，并用0.1M氢氧化钠进行清洗。

阳离子交换层析：将1ml HitrapTM SP HP预装柱与AKTA purifier层析系统相连。流动相A为：20mM柠檬酸，pH6.0；流动相B为：20mM柠檬酸，含1M氯化钠，pH6.0；流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm。先用流动相A平衡层析柱5-10CV，将阴离子层析透析样品上样，目的蛋白结合于介质上，部分杂质穿透。上样结束后，采用流动相A进行冲洗层析柱3-5CV，线性梯度洗脱100-70％A、0-30％B，20min。

采用离子交换层析技术获得纯化的重组人KGF-1(rhKGF-1)，根据SDS-PAGE电泳检测，本发明的rhKGF-1分子量大约在19-20KD，结果符合预期(图4)。

实施例2本发明重组人KGF-1(rhKGF-1)的生物活性检测

取实施例1制备的重组人KGF-1以及市售的KGF-1，比较它们的生物活性：

采用F-12培养基培养4MBr-5恒河猴肺支气管上皮细胞，然后转移至96孔培养板继续培养，24小时加入预先稀释的rhKGF-1，使其终浓度在1-100ng/mL范围，总体积为100μL，在37℃恒温培养箱继续培养48小时。培养结束后加入CCK8溶液，37℃孵育1.5h，置多功能检测仪于450nm测定吸光度，绘制曲线图并计算EC50(刺激细胞增殖的半数有效浓度)。

检测结果见下表所示，本发明在1-100ng/mL浓度范围具有明显促4MBr-5细胞增殖的作用，其作用呈现浓度依赖性。根据3次重复实验的结果计算本发明的rhKGF-1促进4MBr-5细胞增殖的半数有效浓度EC50大约为2.87±0.32ng/mL，低于对照品KGF-1(R&D公司，活性单位为1.3×10⁶IU/mg)的EC50(3.29±0.28ng/mL)，表明采用CHO细胞表达的rhKGF生物学活性高，有良好的市场应用前景。

本发明的rhKGF-1与对照品rhKGF-1的生物活性比较

实验结果说明，本发明制备得到的重组人KGF-1，其促进上皮细胞生长的活性优良，明显优于市售的KGF-1。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都中医药大学附属医院

<120> 一种重组人角质细胞生长因子-1及其制备方法和用途

<130> GY025-18P1711

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 423

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KGF-1基因

<400> 1

agctatgact acatggaagg aggcgatatc agagtgagaa gactgttctg tcggacacag 60

tggtacctga ggatcgacaa gagaggcaag gtgaagggca cccaggagat gaagaataac 120

tacaacatca tggaaatcag gacagtggcc gtcggaatcg tggccatcaa aggagtggaa 180

agtgaattct atctcgccat gaacaaggaa ggaaagctct atgctaagaa ggagtgcaat 240

gaagattgta acttcaagga actcattctg gaaaaccatt acaacacata tgcctctgct 300

aagtggacac acaacggagg cgaaatgttc gtcgccttga atcagaaggg cattcctgtc 360

agaggaaaga aaaccaagaa agaacagaag acagcccact ttctgcctat ggctatcact 420

taa 423

<210> 2

<211> 140

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KGF-1基因表达后的氨基酸序列

<400> 2

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe

1 5 10 15

Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys

20 25 30

Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr

35 40 45

Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr

50 55 60

Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn

65 70 75 80

Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr

85 90 95

Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala

100 105 110

Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu

115 120 125

Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

130 135 140

<210> 3

<211> 511

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 生工生物合成含KGF-1基因序列的质粒部分序列片段

<400> 3

gcagatctcc tagggccacc atggcctgga tgatgcttct cctcggactc cttgcttatg 60

gatcaggagt cgactctagc tatgactaca tggaaggagg cgatatcaga gtgagaagac 120

tgttctgtcg gacacagtgg tacctgagga tcgacaagag aggcaaggtg aagggcaccc 180

aggagatgaa gaataactac aacatcatgg aaatcaggac agtggccgtc ggaatcgtgg 240

ccatcaaagg agtggaaagt gaattctatc tcgccatgaa caaggaagga aagctctatg 300

ctaagaagga gtgcaatgaa gattgtaact tcaaggaact cattctggaa aaccattaca 360

acacatatgc ctctgctaag tggacacaca acggaggcga aatgttcgtc gccttgaatc 420

agaagggcat tcctgtcaga ggaaagaaaa ccaagaaaga acagaagaca gcccactttc 480

tgcctatggc tatcacttga ttaattaagc g 511

Claims

1.一种重组人KGF-1的基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是pCMV质粒。

4.一种重组质粒，其特征在于：它包含权利要求2和3所述的核苷酸序列和质粒载体，其特征是：所述重组质粒是表达质粒pCMV-KGF-1。

5.一种表达重组人KGF-1基因的重组细胞，其特征在于包含权利要求2和3所述的重组质粒。

6.根据权利4要求所述表达细胞，其特征在于：所述的重组细胞为含重组质粒的中国仓鼠卵巢CHO细胞。

7.一种重组人KGF-1，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

8.一种制备权利要求1或7所述重组人KGF-1的方法，其特征在于：包含如下步骤：

(1)取权利要求5或6所述的重组细胞，接种于商业用无血清添加培养基Acti Pro中悬浮培养，期间流加补料Cell Boost 7a powder supplement两次，培养温度37℃，加料时间为第3天和第5天，第7天于4℃条件下收集培养液，离心，过滤，得上清；

9.权利要求7或8所述重组人KGF-1在制备治疗皮肤损伤、黏膜组织损伤、肺部损伤、膀胱上皮损伤或尿道上皮损伤的药物中的用途。

10.一种药物，其特征在于：它是以权利要求7或8所述重组人KGF-1为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。