JP3614779B2 - ビール有害乳酸菌検出用抗体とその診断的用途 - Google Patents

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、ビール中で増殖可能なビール有害乳酸菌を認識する抗体、それを用いた有害乳酸菌の検出方法、及びそれを用いた有害乳酸菌の同定キットに関する。
【０００２】
背景技術
ビール製造工程中にある種の乳酸菌が混入すると、濁りや酸敗などによって製造されたビールの品質を損なわれる危険性があることが知られている。例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属するある種の乳酸菌、特にラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）とラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）に属するある種の乳酸菌、及びペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属するある種の乳酸菌が代表的なビール有害菌として挙げられる。そのため、これらの有害乳酸菌を、迅速且つ高感度に検出する方法の開発が試みられている。
【０００３】
例えば、検定対象であるビールをメンブレンフィルターで濾過後、適当な培地で培養し、生育するコロニーを観察する方法がある。しかしながら、ビール中に存在する有害菌は微量でありまた培地中での有害菌の生育は遅いため、検出感度及び検出に時間がかかるという問題があった。
【０００４】
また、抗原抗体反応を利用したビール中の有害乳酸菌の検出方法が開発されている。例えば、乳酸菌に対するポリクローナル抗体（抗血清）が作成されている。（Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ｇｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２，１０７（１９５５），Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２０，５０９（１９７０），Ｋｎｏｘ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２４，１２（１９７９），Ｓｈｉｍｏｂａｓｈｉ，Ｈ．＆ Ｍｕｔａｉ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０３，３３７（１９７７），特開平４−７２５７０号公報）。現時点では種々の条件を調整することにより、特異性及び感度ともある程度実用に耐えうる品質の抗血清が作成可能となっている。しかしながら、抗血清はロット毎に抗体価や特異性が変動することは避けられない点、ある種の乳酸菌に対する抗血清は非有害菌も陽性となる点、又は抗血清によってはＮａＯＨ処理を必要とする点など、さらなる改善が望まれている。
【０００５】
そこでモノクローナル抗体を用いた検出方法が提案されている（特開平６−４６８８１号公報、特開平６−１０５６９８号公報）。特開平６−４６８８１号公報に記載されている方法では、培地中で培養したラクトバチルス属第３群に属するラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・コリノイデス、ラクトバチルス・スエビカズを抗原としてモノクローナル抗体を作成し、これらのモノクローナル抗体を用いてビール中のラクトバチルス属第３群を検出する方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら、ビール製造において有害となる乳酸菌はラクトバチルス属第３群に属する乳酸菌の内の一部の菌であるため、特開平６−４６８８１号公報に記載の方法では、他の非有害乳酸菌をも検出するという問題がある。
【０００７】
特開平６−１０５６９８号公報に記載の方法では、培地中で培養したラクトバチルス属に属するラクトバチルス・プランタラムを抗原としてモノクローナル抗体を作成し、これらのモノクローナル抗体を用いてビール中のラクトバチルス及びラクトバチルス・コリフォルミスを検出する方法が開示されている。しかしながら、この開示された抗体も、非有害乳酸菌をも検出するという同様の問題を有する。
【０００８】
そこで、増殖によりビールの混濁を引き起こす性質（以下、「ビール混濁能」という）を有する有害菌にのみを検出する方法が提案されている（特開平１０−１０４２３８号公報）。特開平１０−１０４２３８号公報に記載の方法では、培地中で培養した嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビスを抗原としてウサギを用いて抗血清を作成し、その抗血清を用いてビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビスを検出するというものである。作成された抗血清は、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビス及びペディオコッカス・ダムノサスに特異的に反応するとされている。
【０００９】
しかしながら、特開平１０−１０４２３８号公報に記載の方法では、ラクトバチルス・ブレビスに反応する非特異的抗体、すなわち非有害乳酸菌に反応する非特異的抗体を抗血清から除去するために、ビール混濁能がないラクトバチルス・ブレビスのアルカリ処理菌体を用いて非特異的抗体を吸着除去しなければならない。また、抗原として用いるラクトバチルス・ブレビスによっては、得られる抗血清が誤認を生じるという問題がある。さらに、抗血清を用いる以上、ロット毎に抗体価や特異性が変動することは避けられない。
【００１０】
また、代表的なビール有害乳酸菌として、ラクトバチルス・リンドネリがあるが、特開平１０−１０４２３８号公報においては、かかる菌に対する抗血清の有効性が確認されていない。
【００１１】
以上より、ビール有害菌を検出する改良された方法が醗酵工業において必要とされている。
【００１２】
発明の開示
本発明の目的は、ビールの品質に対して有害な乳酸菌を検出可能な試薬を提供することである。
【００１３】
本発明の目的は、ビール製造工程中に混入し、製造ビール中で増殖し、ビールの品質を低下させるビール有害乳酸菌を、特異的に、そして迅速・簡便かつ再現性よく検出する方法を提供することである。また、代表的なビール有害乳酸菌である、ラクトバチルス・ブレビス属、ラクトバチルス・リンドネリ属及びペディオコッカス・ダムノサスに属するビール有害乳酸菌を効率よくかつ漏れなく検出する方法を提供することである。さらに、従来の培地による培養法で出現した乳酸菌のビール有害性を正確にかつ簡便に予測するための同定キットを提供することである。
【００１４】
より詳しくは、本発明の目的は、ビール混濁能を持つ乳酸菌をビール中で培養し、哺乳動物に免疫して得られるビール有害乳酸菌検出用抗体を提供することである。
【００１５】
また、本発明の目的は、ビール混濁能を持つ乳酸菌をビール中で培養し、哺乳動物に免疫して得られる、ビール有害性を示す乳酸菌と反応性を示し、かつビール非有害性の乳酸菌とは反応性を示さないモノクローナル抗体を提供することである。
【００１６】
さらに、本発明の目的は、前記ビール混濁能を有する乳酸菌が、嫌気条件下でグルコース資化能を有する乳酸菌である前記有害乳酸菌検出用抗体又はモノクローナル抗体を提供することである。
【００１７】
また、本発明の目的は、前記ビール混濁能を有する乳酸菌が、ビール有害ラクトバチルス・ブレビス、ビール有害ラクトバチルス・リンドネリ及びビール有害ペディオコッカス・ダムノサスからなる群より選ばれる乳酸菌である前記ビール有害乳酸菌検出用抗体又はモノクローナル抗体を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、前記抗体を用いたビール混濁能を持つビール有害乳酸菌、例えば、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・リンドネリ及びペディオコッカス・ダムノサスの検出法を提供することである。
【００１９】
さらに、本発明の目的は、ビール有害乳酸菌と特異的に反応する前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインＢＬｂ２Ｆ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４４）、ＢＧ３Ａ５ｂ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４５）又はＰＱ３Ｈ８ａ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４６）を提供することである。
【００２０】
また、本発明の目的は、前記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を組み合わせて用いることを特徴とする、ビール混濁能を持つビール有害乳酸菌、例えば、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・リンドネリ及びペディオコッカス・ダムノサスの検出法を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、ビール有害乳酸菌を同定するキットであって、少なくとも（１）細菌を捕捉するためのフィルター付き遠心チューブと、（２）前記本発明にかかるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と、（３）前記モノクローナル抗体に対する酵素で標識された二次抗体もしくは抗体様物質と、（４）前記二次抗体もしくは抗体様物質の標識酵素と反応させて発色させる基質以下の成分を有することを特徴とするキットを提供することである。
【００２２】
本発明の目的は、前記抗体及びハイブリドーマを製造する方法を提供することである。
【００２３】
発明を実施するための最良の形態
（ビール有害乳酸菌）
本発明において、「ビール有害乳酸菌」とは、ビール中で増殖可能であり、増殖によりビールに混濁や沈殿を生じる菌のことを言う。
【００２４】
本発明において用いられる反応、反応性、結合等の用語は、本発明の抗体と乳酸菌との間の相互関係を示すものであり、例えば、抗原−抗体反応のような、抗体と細菌の複合体の形成を言う。
【００２５】
ビール有害乳酸菌として代表的なものは、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・リンドネリ又はペディオコッカス・ダムノサスに属する菌を挙げることができる（Ｂｌａｃｋ，Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒａｕｗｌｔ，３１／３２，１３５８（１９８８）、この記載は参照することにより本明細書に援用される）が、これらに属する全ての菌がビール有害性を有するわけではない。
【００２６】
本発明において抗原として用いる乳酸菌は、ビール有害性を有する乳酸菌、例えば、ラクトバチルス・ブレビスに属する乳酸菌、ラクトバチルス・リンドネリに属する乳酸菌及びペディオコッカス・ダムノサス属に属する乳酸菌である。
【００２７】
これらのビール有害乳酸菌は、環境中より得られたサンプルを、乳酸菌選択培地を用いて乳酸菌を生育させてから、あるいは直接ビールに添加して混濁を生じるものを選択することにより得ることができる。
【００２８】
ビール有害性乳酸菌の継代培養及び保存は、ビール中で培養し、４℃に保存して数ヶ月毎に植え継ぐか、あるいは、終濃度が２０％になるようにグリセロールを添加し、−７０℃で保存する。
【００２９】
ビール有害性の確認は、市販の麦芽１００％、ｐＨ約４．４、苦味価約２８のビールの入った小ビン（３３４ｍｌ）に約１０^７個の菌体を添加し、打栓し、２５℃にて２ヶ月保存後、ビールに混濁が生じるか否かを目視にて判定することにより行った。
【００３０】
（モノクローナル抗体）
上記の如くして選択したビール有害乳酸菌を、マウスに免疫を行い、その後、ハイブリドーマを作成し、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを樹立した。モノクローナル抗体及びハイブリドーマの製造方法はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１−３， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， Ｊｏｈ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９８，に記載されており、この記載は本明細書に援用する。
【００３１】
１．抗原の調製と免疫
具体的には、ビール中で増殖させたビール有害乳酸菌を集菌し、生理食塩水にて洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、マウスに免疫する。適当な間隔で数回追加免疫を行い、血中の抗体価が上昇したら最終免疫を行う。
【００３２】
２．細胞融合
最終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞を適当な細胞融合剤の存在下でミエローマ細胞と融合する。９６穴マイクロプレートに融合細胞を播き、適当な選択培地、例えばＨＡＴ培地中にて培養を行う。
【００３３】
３．スクリーニング及びクローニング
ＥＬＩＳＡ等の方法を用いて、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、スクリーニングを行う。
【００３４】
目的の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈等の方法を用いてクローニングを行い、ハイブリドーマクローンを樹立する。
【００３５】
４．モノクローナル抗体の大量調製
抗体を産生するハイブリドーマクローンを培地中で培養した後、細胞を回収し、次いで、マウス腹腔中に植える。腹腔中より抗体を含んだ腹水を採取し、その後、腹水より、硫安沈殿やマフィニティカラム、例えばプロテインＡ又はプロテインＧカラムを用いてモノクローナル抗体を精製する。或いは、ハイブリドーマクローンを培地中で大量培養した後、培養液より硫安沈殿、イオン交換カラムを用いた方法等によりモノクローナル抗体を精製する。
【００３６】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、ビール有害性を示す乳酸菌と反応性を示し、かつビール非有害性の乳酸菌とは反応性を示さないという性質を有する。
【００３７】
５．ビール有害乳酸菌の検出
ビール有害乳酸菌の検出方法としては、ＥＬＩＳＡ法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，２０３９（１９９５）、参考文献として援用する）や、メンブラン上に捕捉した菌について抗原抗体反応を用いる方法（特開平６−４６８８１号公報、参考文献として援用する）等を挙げることができる。
【００３８】
例えば、製造されたビールをメンブランフィルターで濾過し、ビール中の菌を捕獲し、次いで、メンブランを適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、上記で得られたモノクローナル抗体を反応させ、メンブランをＰＢＳで洗浄する。その後、ペルオキシダーゼが連結された抗マウス抗体を用いてメンブラン上に残っているモノクローナル抗体を検出することにより、ビール有害乳酸菌の検出が可能となる。
【００３９】
また、本発明で得られたモノクローナル抗体を直接、例えば、酵素、蛍光色素、ラジオアイソトープで標識することにより、二次抗体を必要とせずに直接ビール有害乳酸菌の検出が可能となり、さらには、検出感度を高めることも可能である。
【００４０】
６．簡易な同定方法およびキット
本発明にかかる高い特異性を有しかつ簡易な同定を可能とする方法は少なくとも以下の成分を有する。すなわち、（１）細菌を捕捉するためのフィルター付き遠心チューブと、（２）本発明により得られたビール有害乳酸菌に対する３種類のモノクローナル抗体と、（３）前記モノクローナル抗体に対する酵素で標識された二次抗体もしくは抗体様物質と、（４）前記二次抗体もしくは抗体様物質の標識酵素と反応させて発色させる基質である。さらに、好ましくはポジティブコントロールとして用いる有害乳酸菌を含むものである。
【００４１】
以下、本発明にかかる簡易同定法検出方法および簡易同定キットにつき詳細に説明する。
【００４２】
本発明にかかるビール有害乳酸菌の簡易な同定キットは、フィルター付き遠心チューブによる菌の捕捉および未反応の抗体の除去、酵素免疫測定法との組合せから、被験菌のビール有害性の予測を色調の強さで判定するものである。本方法では、菌懸濁液、酵素標識抗体（モノクローナル抗体と酵素標識２次抗体、またはモノクローナル抗体を直接酵素標識したものなど）をフィルター付き遠心チューブに添加、遠心することにより抗体が被験菌と反応する場合はフィルター上に標識酵素と共に残り、反応しない場合は標識酵素はフィルター下に濾液と共に除去されることから、酵素基質液を添加すると抗体が被験菌と反応する場合のみ発色が起こることで簡易に被験菌のビール有害性の予測を行うことができる。また、直接蛍光抗体法と基本原理は同じなので特異性は高い。
【００４３】
フィルター付き遠心チューブに使用するフィルターは、測定対象となる乳酸菌を捕捉するのに充分で、かつ未反応の抗体が除去できる孔径を持つものが必要であるが、これは当業者が容易に選択できるものである。具体的には、０．２〜０．４５μｍ程度の孔径で、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）など、蛋白質の吸着ができるだけ少ない材質のものを用い、これをカゼインや牛血清アルブミンなどでブロッキングを行った上で使用することが好ましい。
【００４４】
被験菌を生理食塩水や抗原抗体反応に適した緩衝液に懸濁した後、モノクローナル抗体と酵素標識２次抗体、またはモノクローナル抗体を直接酵素標識したものなどを添加し、被験菌と反応させた後、遠心により未反応のモノクローナル抗体と酵素標識２次抗体、または、モノクローナル抗体を直接酵素標識したものなどを除去する。
【００４５】
さらに、抗体に反応を阻害しないような性質と濃度の洗浄液、例えば０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加した後、遠心により洗浄と洗浄液の除去を行う。本発明においては、フィルター付き遠心チューブ（フィルターユニット）を用い、遠心によって洗浄と洗浄液の除去を同時に行うことができ、しかも被験菌が流れ落ちたりすることなく洗浄を効率良く完全に行うことが可能になる。
【００４６】
発色基質は、吸収極大波長を可視領域に持ち、高感度で、判別しやすく、経時的安定性の高いものが好ましい。その条件を満たすためにはペルオキシダーゼ系の発色基質が好ましく、例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）等が使用可能である。
【００４７】
本発明にかかるキットを用いた有害ビール乳酸菌の同定を行う場合の具体的な一連の手順の例を以下に示す。すなわち、（１）生理食塩水１００μｌとポジティブコントロールとして用いる有害乳酸菌懸濁液（生理食塩水に懸濁、熱処理殺菌し、６６０ｎｍの濁度を０．３に調整したもの）１００μｌをそれぞれ凝集皿に載せる。（２）その生理食塩水に試験菌体一白金耳を懸濁する（有害乳酸菌懸濁液とほぼ同じ濃度になるように調整）。（３）それぞれの菌懸濁液２５μｌずつを３つのフィルターユニットに添加（１つの菌について３つのフィルターユニットを使用。Ｉ〜ＩＩＩの番号を付ける）。（４）抗体溶液（モノクローナル抗体と酵素標識２次抗体、またはモノクローナル抗体を直接酵素標識したものなどを適当な濃度になるようにＰＢＳにて希釈したもの）５０μｌをそれぞれフィルターユニットに添加（Ｉにはモノクローナル抗体としてＢＬｂ２Ｆ３７を使用したもの、ＩＩにはＢＧ３Ａ５ｂ４を使用したもの、ＩＩＩにはＰＱ８Ｈ８ａ９を使用したものを添加）。（５）撹拌後、室温で１５分間放置する。（６）２０００ｒｐｍで５分間遠心する。（７）洗浄後３５０μｌを添加。（８）２０００ｒｐｍで１０分間遠心する。（９）発色液５０μｌを添加する。（１０）撹拌した後、室温で５分間放置する。（１１）反応停止液５０μｌを添加する。（１２）撹拌後、まず、ポジティブコントローラを添加したフィルターユニットが適切に発色していることを確認する。（１３）次に試験菌体を添加した３つのフィルターユニットの発色の仕方を以下の表と比較し判定を行う。
（判定表）
（＋は強い発色、−は発色なしまたは弱い発色）
【表１】

【００４８】
本判定法は、ビール有害乳酸菌を３つのモノクローナル抗体とそれぞれ反応させた場合、いかなるビール有害乳酸菌においてもいずれか１つないし２つのモノクローナル抗体と反応すると同時に少なくとも１つのモノクローナル抗体とは反応しないこと、かつ非有害菌は３つのモノクローナル抗体のいずれとも反応しないことを利用する（実施例の抗体の特異性検定の項参照）。すなわち、最初に用意する菌懸濁液の濃度がよほど薄かったり、濃かったりしない限りは、等量を３つの抗体と反応させた場合、有害菌であれば少なくとも１つあるいは２つのフィルターユニットで、残るフィルターユニットに比べ顕著に強い発色が起こり、非有害菌であれば、３つとも発色しないかあるいは３つとも同じような弱い発色が起こる。従って、この方法では、被験菌体の量が厳密である必要はなく、しかも有害菌と判断された場合、どのフィルターユニットが発色したかにより菌種の同定も可能となる。さらに、ポジティブコントロールとして有害乳酸菌懸濁液を同時に処理し、比較することで、抗体が失活していないかや操作手順が間違っていないかを確認できると同時に、より正確な判断が可能となる。
【００４９】
また、有害菌によってはビールから分離した後にあまりに何回も培地での植え継ぎを繰り返すと、抗体との反応性が低下する場合がある。かかる場合は、例えばまず始めに０．１％程度のＮａＯＨ溶液に菌を懸濁し、室温にて１０分間放置後フィルターユニットに添加、遠心にてＮａＯＨ溶液を除去した後に抗体溶液を添加することで十分な発色を得ることが可能となる。
【００５０】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定するものではない。
【００５１】
実施例
（実施例１） 抗ビール有害乳酸菌モノクローナル抗体の作成
（１）抗原の調製
ビールから単離したビール有害乳酸菌である、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・リンドネリ及びペディオコッカス・ダムノサスを抗原として用いた。これらの株は、ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの記載の分類法に基づいて同定され、この記載は参考文献として本明細書に援用される。特に、使用したラクトバチルス・ブレビスについては、上記分類法にも記載の通り、嫌気条件下でグルコース資化性を有する。４℃のビール中にて保存のこれらの菌株を新しいビールに植菌し、ビールが混濁してくるまで２５℃にて培養し、菌体を遠心により集菌した。その際、菌液の一部を新しいビールに植え継ぎ、免疫の度に新しい菌体を使用した。
【００５２】
遠心集菌した菌体を生理食塩水にて洗浄した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、６６０ｎｍでの吸光度が０．５となるように調製し、抗原菌液として用いた。
【００５３】
（２）マウスへの免疫
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの雌を日本エスエルシーより購入し、１０日間予備飼育した後、免疫した。
【００５４】
免疫には、上記で調製した各抗原菌液をそれぞれ別のマウスの腹腔に注射し免疫した。注射の間隔は週１回とし、注射液量は、開始時から、０．１、０．５、１．０、１．０、１．０、１．０の計６回、合計４．６ｍｌ注射した。
【００５５】
（３）細胞融合
最終免疫の３日後に「単クローン抗体実験マニュアル」（富川朔二・安東民衛編、講談社）をもとにマウスより脾臓を摘出し、牛胎児血清（ＦＣＳ）を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬株式会社）中で脾細胞を分離した。次いで、ポリエチレングリコール（ベーリンガーマンハイム社製、細胞融合用）存在下で、ミエローマ細胞（大日本製薬、ＳＰ２／０・Ａｇ１４）と細胞融合を行った。その後、ハイブリドーマを、１５％ＦＣＳ及びＨＡＴ（シグマ社製、Ｈ−０２６２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製、１６７００８）中に分注し、ＣＯ_２インキュベータで３７℃で培養し、以後適当な間隔で同培地を交換した。ハイブリドーマが増殖したら上清の抗体価を以下のＥＬＩＳＡで測定し、抗体陽性細胞をスクリーニングした。
【００５６】
（４）抗体のスクリーニング
９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製、１６８０５５）の各ウェルに２．５％グルタルアルデヒド溶液を５０μｌずつ添加し、室温で３時間放置後、溶液を廃棄した。ビール中で植え継いだ上記３種のビール有害乳酸菌及びＭＲＳ培地で植え継いだビール非有害乳酸菌であるラクトバチルス・カゼイ ＡＨＵ１０５７株（ＡＨＵ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＯＦ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ，ＦＡＣＵＬＴＹ ＯＦ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ，ＨＯＫＫＡＩＤＯ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ，ＳＡＰＰＯＲＯ，ＪＡＰＡＮ）（対照）を、それぞれ、６６０ｎｍでの吸光度が０．３になるように調製し、それぞれを各ウェルに５０μずつ添加し、２，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心後、４℃にて翌日まで静置した。その後、上清を廃棄し、１％ゼラチンを含むＰＢＳを各ウェルに１００μｌづつ添加し、室温にて２時間放置した後、上清を廃棄し、菌が固定された検定プレートを作成した。
【００５７】
細胞融合の培養上清を、上記で調製した検定プレートの各ウェルに５０μｌずつ添加し、さらに市販のペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ＋Ｍ抗体（和光純薬）を０．１％ゼラチンを含むＰＢＳで２５０倍に希釈したものを各ウェルに２５μｌずつ添加し、室温にて１時間放置後、上清を廃棄した。その後、各ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）１００μｌを用いて２回洗浄した後、基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ 二塩酸ｏ−フェニレンジアミン含有０．２５Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２））を各ウェルに５０μｌずつ添加した。室温に５分間放置後、反応停止液（１０ｍＭ ＮａＮ_３）を各ウェルに５０μｌずつ添加し反応を停止した。ＯＤ４９２−ＯＤ６３０（４９２ｎｍにおける吸光度から６３０ｎｍにおける吸光度を引いた値）を測定した。有害乳酸菌を固定したウェルの吸光度が対照であるラクトバチルス・カゼイを固定したウェルの吸光度より高いものを陽性とした。
【００５８】
（５）クローニング
陽性を示したハイブリドーマを限界希釈法により、クローニングを行った。このようにして、ラクトバチルス・ブレビスを抗原として用いたハイブリドーマから４つのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得した。そのうちの１株をＢＬｂ２Ｆ３７と名づけ、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年７月８日寄託した（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６８８４）。本株はさらに、国際寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本、〒３０５−８５６６、茨城県つくば市東１−１−３）に平成１１年６月４日国際寄託した（国際寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４４）。また、ラクトバチルス・リンドネリを抗原として用いたハイブリドーマから２つのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得し、そのうちの１株をＢＧ３Ａ５ｂ４と名づけ、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年７月８日寄託した（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６８８５）。本株はさらに、国際寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本、〒３０５−８５６６、茨城県つくば市東１−１−３）に平成１１年６月４日国際寄託した（国際寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４５）。加えて、ペディオコッカス・ダムノサスを抗原として用いたハイブリドーマから２つのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得し、そのうちの１株をＰＱ３Ｈ８ａ９と名づけ、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年７月８日寄託した（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６８８６）。本株はさらに、国際寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本、〒３０５−８５６６、茨城県つくば市東１−１−３）に平成１１年６月４日国際寄託した（国際寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４６）。
【００５９】
（６）モノクローナル抗体の調製
ハイブリドーマを全細胞の約８０％が萎縮し、黒味がかって見えるまで培養した後、遠心して細胞を除去する。培養上清と等量の飽和硫安を４℃にてゆっくりと添加し、遠心し、上清を捨てた。沈殿をＰＢＳに再び溶解させた後、溶解液をＰＢＳ中にて４℃で一晩透析し、モノクローナル抗体を調製した。
【００６０】
（７）抗体の特異性検定
ビール醸造場及び研究所から分離した、ラクトバチルス・ブレビスに属するビール有害性を示す４４株とビール有害性を示さない１８株、ラクトバチルス・リンドネリに属するビール有害性を示す７株、ペディオコッカスに属するビール有害性を示す３株と有害性を示さない１株、その他のビール有害性を示さない乳酸菌（ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パルパス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・フラクチボランス、ラクトバチルス・コリニフォルミス、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・コリノイデス、ラクトバチルス・ヒルガルディ、ラクトバチルス・カンドレリ、ラクトバチルス・ケソイア、ペディオコッカス・ベントサセウス、ペディオコッカス・テキストリニカスを含む）４７株について、上記で得たモノクローナル抗体（ＢＬｂ２Ｆ３７抗体、ＢＧ３Ａ５ｂ４抗体、ＰＱ３Ｈ８ａ９抗体）の特異性を検討した。
【００６１】
上記のそれぞれの菌株を培養し、集菌したものを用い、上記（４）に記載の方法と同様にして、各菌株に対する反応性を検定した。但し、ビール有害菌株はビール中で培養し、ビール非有害菌株はＭＲＳ培地にて培養した。対照として、ビール有害性を示さないラクトバチルス・カゼイ ＡＨＵ１０５７株を用い、ＡＨＵ１０５７を用いた場合の吸光度をブランクとして、値が０．０８以上を示したものを反応性ありと判定した。結果を表２に示す。
【表２】

【００６２】
表２より明らかなように、ＢＬｂ２Ｆ３７抗体は、全てのビール有害ラクトバチルス・ブレビス及び多くのビール有害ペディオコッカス・ダムノサスと反応性を示すが、ビール非有害ラクトバチルス・ブレビス及びペディオコッカス・ダムノサスを含む非有害乳酸菌とは反応性を示さなかった。また、ＢＧ３Ａ５ｂ４抗体は、全てのビール有害ラクトバチルス・リンドネリと反応性を示すが、非有害菌とは反応性を示さなかった。また、ＰＱ３Ｈ８ａ９抗体は、全てのビール有害ペディオコッカス・ダムノサス、及び多くのビール有害ラクトバチルス・ブレビスと反応性を示すが、１株のビール非有害ペディオコッカス・ダムノサスを除いてビール非有害乳酸菌とは反応性を示さなかった。
【００６３】
これらのことより、上記の抗体を用いて、ビール有害乳酸菌を特異的に、すなわち、ビール非有害乳酸菌と反応することなしに、検出できることが判った。さらに、上記の３種の抗体を組み合わせて用いることにより、全てのビール有害性乳酸菌を特異的に検出可能であることが示された。
【００６４】
（実施例２）得られたモノクローナル抗体のクラス検定
実施例１において得られた３つのモノクローナル抗体のクラス、サブクラス及びＬ鎖のタイプを市販のキット（アマシャム社製、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット）を用いて調べた。結果を表３に示す。
【表３】

【００６５】
（実施例３）簡易同定法および同定キット
使用したビール有害乳酸菌を認識する３種類のモノクローナル抗体は上で説明した方法で取得した。
【００６６】
（１）ブロッキング済みフィルター付き遠心チューブの作成：
宝酒造社製フィルター付き遠心チューブ（ＳＵＰＲＥＣ^ＴＭ−０１）に１００μｌの１％カゼイン（ＰＢＳ中）を添加し、室温にて１時間放置した後、半径１６．５ｃｍのスイング型遠心機２０００ｒｐｍにて５分間遠心した。次に洗浄液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）２００μｌを添加し、２０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、これをブロッキング済フィルター付き遠心チューブとして４℃にて保存した。
【００６７】
（２）抗体溶液：
抗体溶液Ｉには抗体ＢＬｂ２Ｆ３７を、抗体溶液ＩＩには抗体ＢＧ３Ａ５ｂ４を、抗体溶液ＩＩＩには抗体ＰＱ３Ｈ８ａ９を、それぞれ同じ程度のバックグラウンドを生じるように希釈したものを５容量と、抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭヤギＩｇＧペルオキシダーゼ結合（和光純薬社製）を５０倍希釈したものを５容量と、１％カゼイン（ＰＢＳ中）を７容量と、ＰＢＳを３３容量とを結合したものを小分けして−２０℃にて保存した。それぞれの溶液を抗体溶液Ｉ〜ＩＩＩとする。
【００６８】
これら溶液はフィルター付き遠心チューブ１つあたり５０μｌを使用した。
【００６９】
（３）洗浄液：
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）をフィルターユニット当たり３５０μｌ使用した。
【００７０】
（４）発色および停止液：
ペルオキシダーゼ用発色キット（ＯＰＤ）（住友ベークライト社製）を使用した。基質液５ｍｌに発色剤１錠を溶かしたものを、フィルター付き遠心チューブ１つあたり５０μｌ使用した。停止液も同量使用した。
【００７１】
（５）ビールにて増殖させた後ＮＢＢスラントにて保存していた有害菌および、ＮＢＢスラント保存非有害菌の一白金耳を１００μｌの生理食塩水に懸濁し、２５μｌずつ３つのフィルターユニットに添加、それぞれを抗体溶液Ｉ〜ＩＩＩと反応させ、洗浄、発色させた。その結果、非有害菌では３つのフィルターユニットともほぼ同じように弱い発色が観察され、有害菌の場合、菌種に応じて１つあるいは２つのフィルターユニットで、残るフィルターユニットに比べ顕著に強い発色が観察された（図１）。
【００７２】
得られた結果から、本方法であれば試験菌体の量が厳密である必要はなく、有害菌と判定された場合、どのチューブ（抗体）が発色したかによって菌種の同定が可能となることを示された。
【００７３】
また、図示されないが、表１に示した全ての乳酸菌についてかかる簡易な同定法を適用した結果、表１に示した抗体反応性と矛盾しない結果を得た。
【００７４】
さらに、本簡易同定法は、一白金耳程度の菌量で十分判定が可能であることが明らかとなった。
【００７５】
産業上の利用可能性
本発明は、広い利用可能性を有する。本発明の抗体は、ビール有害乳酸菌と反応性を示しかつビール非有害菌とは反応性を示さないので、ビール有害乳酸菌を迅速・簡便かつ高精度で検出するのに有用である。また、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるので、再現性よく調製が可能であるので、ビール有害菌の検出試薬として有用である。また、本発明の抗体を組み合わせることにより、問題とされている全ての種類のビール有害乳酸菌を検出することが可能である。さらに、本発明にかかる簡易な同定方法およびそのためのキットは、市販のフィルター付き遠心チューブと、本発明の３つの抗体の持つ特異性を利用することで、従来の培地による培養法によって出現した乳酸菌のビール有害性を簡便かつ正確に判定することが可能である。
【００７６】
上記の教示に鑑みて、明らかに、本発明の多数の修正及び改変が可能である。従って、付記の特許請求項の範囲内で、本発明を具体的に本明細書に記載された以外でも、本発明は実施し得ることを理解すべきである。
【００７７】
この特許出願は１９９８年７月２２日付の日本国特許出願特願平１０−２０６４８４号及び１９９９年１月１１日付の日本国特許出願特願平１１−４０９６号に基づくものであり、その全体を参考文献として本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
添付の図面と共に以下の詳細な説明を参照することにより、本発明のより完全な理解とそれに付随する多くの利点が容易に得られる。
【図１】実施例３（３種類の抗体を用いた簡易同定）で得られた結果を示す写真である。

Claims (16)

1. ビール混濁能を持つ乳酸菌をビール中で培養し、該培養乳酸菌をヒト以外の哺乳動物に免疫して得られるビール有害乳酸菌検出用抗体。
2. 抗体が、抗血清又はその精製物である請求項１に記載のビール有害乳酸菌検出用抗体。
3. ビール混濁能を持つ乳酸菌が、嫌気条件下でグルコース資化能を有する乳酸菌である請求項１又は２に記載のビール有害乳酸菌検出用抗体。
4. ビール混濁能を持つ乳酸菌が、ビール有害ラクトバチルス・ブレビス、ビール有害ラクトバチルス・リンドネリ及びビール有害ペディオコッカス・ダムノサスからなる群より選ばれる乳酸菌である請求項１〜３のいずれか一項に記載のビール有害乳酸菌検出用抗体。
5. 抗体が、ビール混濁能を持つビール有害乳酸菌と反応性を示し、かつビール混濁能を持たないビール非有害菌とは反応性を示さないモノクローナル抗体である請求項１、３又は４に記載のビール有害乳酸菌検出用抗体。
6. 請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマセルライン。
7. ＢＬｂ２Ｆ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４４）である請求項６に記載のハイブリドーマセルライン。
8. ＢＧ３Ａ５ｂ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４５）である請求項６に記載のハイブリドーマセルライン。
9. ＰＱ３Ｈ８ａ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４６）である請求項６に記載のハイブリドーマセルライン。
10. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のビール有害乳酸菌検出用抗体と被検体を接触させ、該抗体と該乳酸菌の複合体を形成させる工程からなるビール有害乳酸菌の検出方法において、該複合体の存在が該被検体中のビール有害乳酸菌の存在を示し、該複合体の不在が該被検体中のビール有害乳酸菌の不在を示すことを特徴とする、ビール有害乳酸菌検出方法。
11. 前記ビール有害乳酸菌検出用抗体が、ＢＬｂ２Ｆ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４４）、ＢＧ３Ａ５ｂ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４５）、ＰＱ３Ｈ８ａ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４６）からなる群より選ばれるいずれか一つのハイブリドーマセルラインによって産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載のビール有害乳酸菌検出方法。
12. 前記ビール有害乳酸菌検出用抗体が、ハイブリドーマセルラインＢＬｂ２Ｆ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４４）、ＢＧ３Ａ５ｂ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４５）、ＰＱ３Ｈ８ａ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４６）により産生されるモノクローナル抗体の組み合わせであることを特徴とする、請求項１０に記載のビール有害乳酸菌検出方法。
13. ビール有害乳酸菌が、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・リンドネリ及びペディオコッカス・ダムノサスから選ばれる少なくとも１種の乳酸菌であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のビール有害乳酸菌検出方法。
14. ビール混濁能を持つ乳酸菌をビール中で培養し、該培養乳酸菌をヒト以外の哺乳動物に免疫して得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のビール有害乳酸菌検出用抗体の製造方法。
15. ビール中でビール混濁能を有する乳酸菌を、ヒト以外で且つ脾臓を有する哺乳動物に免疫し、該哺乳動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させることを特徴とする、請求項６に記載のハイブリドーマの製造方法。
16. 抗体との複合体形成によるビール有害乳酸菌の検出を迅速・簡便かつ高精度化する方法であって、
    前記抗体として、請求項１〜５のいずれか一項に記載のビール有害乳酸菌検出用抗体を用いることを特徴とする方法。

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