TW202136295A - 單株抗體、細菌的檢測方法、細菌的檢測試劑盒及融合瘤 - Google Patents
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Abstract
本發明可提供一種與具有16S rRNA基因的細菌反應的單株抗體及由受託編號為NITE BP-03165、NITE BP-03166、NITE BP-03167或NITE BP-03168的融合瘤產生的單株抗體,所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列。
Description
本發明是有關於一種單株抗體(monoclonal antibody)、細菌的檢測方法、細菌的檢測試劑盒及融合瘤(Hybridoma)。
當藉由活性污泥法來進行污水淨化時,所去除的有機物成為包含微生物(細菌)的絮狀物(floc),產生被稱為剩餘污泥的污泥。自廢水處理設備排出的剩餘污泥於產業廢棄物中佔據20%以上的比例。通常,剩餘污泥是於脫水、乾燥後被焚燒處理(非專利文獻1:2018年度事業、產業廢棄物排出/處理狀況調查報告書、2016年度實績(概要版);非專利文獻2:山本昌幸、「關於污水的燃燒技術」、日本燃料學會誌、一般社團法人日本燃燒學會、2011年、第53卷、164號、p91-96)。
[現有技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]「2018年度事業、產業廢棄物排出/處理狀況調查報告書、2016年度實績(概要版)」[online(線上)]、2019年3月、環境省環境再生/資源循環局廢棄物管制科[2020年3月17日檢索]、互聯網<URL:https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download?statInfId=000031887949&fileKind=2>
[非專利文獻2]山本昌幸、「關於污水的燃燒技術」、日本燃料學會誌、一般社團法人日本燃燒學會、2011年、第53卷、164號、p91-96
[發明所欲解決之課題]
然而,若焚燒處理剩餘污泥,則產生溫室氣體,因此就對於環境的考慮而言,要求將剩餘污泥減容化。作為將剩餘污泥減容化的方法,提出將構成剩餘污泥的微生物分解的方法。作為可分解構成剩餘污泥的微生物的細菌,本發明者們發現具有包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列的16S rRNA基因。
本發明的目的在於提供一種特異性檢測所述細菌的新穎的抗體、使用所述抗體的細菌的檢測方法及檢測試劑盒。
[解決課題之手段]
本發明是有關於以下所例示的[1]~[8]。
[1] 一種單株抗體,其與具有16S rRNA基因的細菌反應,所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列。
[2] 一種單株抗體,其與膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus sp.)NITE BP-02779反應。
[3] 一種單株抗體,其由受託編號為NITE BP-03165、NITE BP-03166、NITE BP-03167或NITE BP-03168的融合瘤產生。
[4] 一種細菌的檢測方法,其中,使用如[1]至[3]中任一項所述的單株抗體,所述細菌具有包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列的16S rRNA基因。
[5] 如[4]所述的檢測方法,其中,所述細菌為膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus sp.)NITE BP-02779。
[6] 一種細菌的檢測試劑盒,包含如[1]至[3]中任一項所述的單株抗體,所述細菌具有包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列的16S rRNA基因。
[7] 如[6]所述的檢測試劑盒,其中,所述細菌為膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus sp.)NITE BP-02779。
[8] 一種融合瘤,其受託編號為NITE BP-03165、NITE BP-03166、NITE BP-03167或NITE BP-03168。
[發明的效果]
根據本發明,可提供一種能特異性檢測具有16S rRNA基因的細菌的新穎的抗體、使用所述抗體的細菌的檢測方法及檢測試劑盒,所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列。
以下,對用以實施本發明的形態進行詳細說明。再者,本發明並不限定於以下的實施形態。
[抗體]
本發明的抗體的一實施形態是與具有16S rRNA基因的細菌(以下,有時記為「細菌a」)反應的單株抗體,所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列。作為細菌a,可列舉膨脹芽孢桿菌(Tumebacillus)屬細菌。細菌a較佳為具有靶微生物分解能力。細菌a可為細菌a的整體,亦可為一部分。
細菌a亦可具有如下16S rRNA基因,所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而同一性為98.5%以上、98.8%以上、99.0%以上、99.3%以上、99.5%以上或99.8%以上的鹼基序列。細菌a亦可為後述的膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus sp.)NITE BP-02779。
細菌a亦可具有如下16S rRNA基因,所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而產生了1個鹼基或數個鹼基的取代、缺失或附加的鹼基序列。1個鹼基或數個鹼基例如可設為1個鹼基~25個鹼基、較佳為1個鹼基~10個鹼基、更佳為1個鹼基~5個鹼基。所述變異為16S rRNA的表達及功能並不喪失的變異。
細菌a亦可具有如下16S rRNA基因,所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列中所含的、約15個鹼基以上、較佳為約18個鹼基~約500個鹼基、更佳為約18個鹼基~約200個鹼基、進而佳為約18個鹼基~約50個鹼基連續的序列或其互補序列於嚴格條件下進行雜交的鹼基序列。所謂嚴格條件,是指不形成非特異性雜種的條件,例如可列舉於60℃、1×SSC、0.1%十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)、較佳為68℃、0.1×SSC、0.1% SDS中清洗1次以上的條件等。
16S rRNA基因的鹼基序列的解析例如可利用以下方法來進行。首先,使用公知的方法,自對象微生物中萃取基因組(genome)去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),使16S rRNA基因增幅。作為使16S rRNA基因增幅的方法,並無特別限制,可列舉本領域技術人員通常使用的使用通用引物的聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)法等。視需要,將藉由PCR法而獲得的增幅產物精製,並供於DNA測序儀等,從而可確定鹼基序列。進行所獲得的鹼基序列與序列編號1中記載的鹼基序列的比較。
細菌a是否具有微生物分解能力可藉由本領域技術人員通常使用的方法來確認。作為此種確認方法,例如可列舉使細菌a與靶微生物於適當的培養基或緩衝液中反應一定時間,然後檢測培養基或緩衝液中的靶微生物的分解的方法。檢測靶微生物的分解的方法並無特別限定,例如可列舉:測定靶微生物的濁度的方法;利用SLP(Silkworm Larvae Plasma,家蠶幼蟲血漿)試劑來檢測靶微生物的方法;利用PCR來檢測靶微生物的DNA的方法;測定靶微生物的乾燥菌體重量的方法;使用高效液相層析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、質量分析法(Mass Spectrometry,MS)、薄層層析(Thin-Layer Chromatography,TLC)、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)、氣相層析(Gas Chromatography,GC)等來檢測源自靶微生物的分解物的方法等。
於根據濁度來調查靶微生物的分解的情況下,所謂具有靶微生物分解能力,是指反應後的濁度較反應前的濁度非偶然地降低,例如,反應後的濁度為反應前的濁度的80%以下,較佳為50%以下,更佳為30%以下。於根據乾燥菌體重量來調查靶微生物的分解的情況下,所謂具有靶微生物分解能力,例如是指反應後的乾燥菌體重量較反應前非偶然地降低,例如,反應後的乾燥菌體重量為反應前的95%以下,較佳為90%以下。
本發明的抗體的一實施形態是與膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus sp.)NITE BP-02779(以下,有時記為「NITE BP-02779」)反應的單株抗體。
NITE BP-02779是於2018年9月11日國際寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心(〒292-0818 日本千葉縣木更津市上總鐮足(Kazusa-kamatari)2丁目5番地8 122號房間)並於2018年9月26日發行了與原寄存相關的受託證及與生存有關的證明書的細菌。認為NITE BP-02779是膨脹芽孢桿菌(Tumebacillus)屬細菌的新的種類。NITE BP-02779可分解芽孢桿菌(Bacillus)、微球菌(Micrococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)等各種靶微生物及剩餘污泥,因此對於剩餘污泥處理而言有用。關於NITE BP-02779的菌學性質,示於後述的實施例的表1~表4中。NITE BP-02779為具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因的細菌。
與抗體反應的細菌a可為活菌,亦可為死菌。活菌可藉由將細菌a於適當的培養基中培養來獲得。作為培養基,可使用適宜包含微生物的培養中通常使用的碳源、氮源、有機鹽或無機鹽等的各種培養基。具體而言,可列舉ATCC802培養基、R2A培養基等。亦可使用適當的緩衝液或排水來代替培養基。死菌例如可藉由對活菌進行變性處理來獲得。作為變性處理,可列舉:利用SDS等變性劑的處理、物理破碎處理、熱處理等。於包含細菌a的試樣中亦可混合細菌a的活菌與死菌。
「與抗體反應」可為抗體與抗原藉由抗原抗體反應而結合或抗體識別抗原。「抗體與細菌反應」可為細菌與抗體結合或抗體識別細菌。作為調查細菌與抗體是否反應的方法,例如可列舉:酶聯免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、流式細胞儀(Flow Cytometer)、免疫染色、免疫印漬術(Western Blotting)等。「與細菌反應的抗體」亦可稱為「對於細菌的抗體」。
例如於藉由ELISA來調查抗體與細菌的反應的情況下,所謂與細菌反應,是指添加了抗體時的細菌的檢測值(吸光度)非偶然地高於陰性對照的檢測值(吸光度),例如陽性抗原與陰性抗原的ABS450值的差為0.05以上,且陰性抗原的ABS450值為0.05以下。
「抗體」是與某抗原特異性結合的免疫球蛋白,「單株抗體」是由源自單一抗體產生細胞的克隆獲得的抗體。單株抗體例如可藉由培養經克隆化的融合瘤(以下,有時簡記為「克隆」)而於培養液中以分泌物的形式獲得。「經克隆化的融合瘤」例如可藉由製作使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞(myeloma cell)進行細胞融合而成的融合瘤,並對產生具有目標抗原特異性的抗體的融合瘤進行篩選、克隆化來獲得。
本發明的抗體可藉由包括將細菌a對動物進行免疫的步驟的方法來獲得。將細菌a對動物進行免疫的步驟可利用公知的單株抗體的生產方法中的對動物進行免疫的步驟。作為單株抗體的生產方法,例如可列舉:小鼠脾臟法、小鼠髂骨淋巴結法(參照日本專利特開2007-020547號公報)等。就可獲得特異性高的抗體的觀點而言,較佳為小鼠髂骨淋巴結法。
所免疫的動物並無特別限定,只要匹合單株抗體的生產方法而自非人動物中適宜選擇即可。具體而言,於使用小鼠髂骨淋巴結法作為單株抗體的生產方法的情況下,只要依據所述文獻記載的方法來對動物進行免疫即可。
於對動物進行了免疫後,依據公知的方法來進行融合瘤的製作、篩選等,可獲得本發明的抗體。於篩選融合瘤時,可利用細菌a、例如NITE BP-02779作為陽性抗原,可利用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、艾氏菌(Escherichia)、百脈根根瘤菌(Rhizobium loti)、黃單胞菌(Xanthomonas)、鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas)、短桿菌(Brevibacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、新鞘脂菌(Novosphingobium)等作為陰性抗原。
關於融合瘤的篩選基準,例如若為使用ELISA的情況,關於所產生的單株抗體,陽性抗原與陰性抗原的ABS450值的差為0.05以上,且陰性抗原的ABS450值為0.05以下。
本發明的抗體的同種型並無特別限定。本發明的抗體可為免疫球蛋白分子,亦可為具有與抗原的結合活性的抗體的部分片段、例如F(ab')2、Fab'、Fab、CDR等。
本發明的抗體可為人工合成的抗體。本發明的抗體較佳為經分離或精製的抗體,例如為由經免疫的動物的血清、腹水等或所述融合瘤的培養上清液精製的抗體。抗體的精製只要藉由公知的方法來進行即可,例如可列舉:硫酸銨分餾、離子交換層析、疏水層析、對於蛋白質A或蛋白質G等的親和層析、凝膠過濾層析、等電沈澱。該些方法可單獨使用一種,亦可適宜組合使用兩種或兩種以上。抗體的精製可進行至所期望的程度。
本發明的抗體可經鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase,HRP)等酶、生物素、螢光物質、發光物質、放射性同位素等標記物質標記。
本發明的抗體較佳為與細菌a以外的微生物實質上不反應。本發明的抗體較佳為與選自(I)群組中的任意一種以上的細菌實質上不反應,更佳為與選自(II)群組中的任意一種以上的細菌實質上不反應,進而佳為與選自(III)群組中的任意一種以上的細菌實質上不反應。
(I)群組:細菌a除外的膨脹芽孢桿菌(Tumebacillus)、艾氏菌(Escherichia)、根瘤菌(Rhizobium)、黃單胞菌(Xanthomonas)、鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas)、短桿菌(Brevibacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、新鞘脂菌(Novosphingobium)及鞘脂菌(Sphingobium)
(II)群組:細菌a除外的膨脹芽孢桿菌(Tumebacillus)、艾氏菌(Escherichia)、根瘤菌(Rhizobium)、黃單胞菌(Xanthomonas)、短桿菌(Brevibacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、新鞘脂菌(Novosphingobium)及鞘脂菌(Sphingobium)
(III)群組:艾氏菌(Escherichia)、黃單胞菌(Xanthomonas)、假單胞菌(Pseudomonas)、新鞘脂菌(Novosphingobium)及鞘脂菌(Sphingobium)
此處,所謂「實質上不反應」,是指與藉由抗原抗體反應而相對於細菌a結合的抗體數相比,相對於對象細菌結合的抗體數少。所謂「實質上不反應」,例如是指於利用固相化ELISA進行評價的情況下,以細菌a為抗原時的吸光度相對於以對象細菌為抗原時的吸光度的比例(%)為0%以上且50%以下,較佳為0%以上且40%以下,更佳為0%以上且30%以下,特佳為0%以上且20%以下。
作為本發明的抗體的一實施形態,可列舉由後述的實施例中記載的經克隆化的融合瘤即3A5-1H1、4G4-1A9、6D9-2G6或7D4-1G9產生的單株抗體。該些單株抗體對細菌a、特別是NITE BP-02779顯示出高反應性,並且與細菌a除外的膨脹芽孢桿菌(Tumebacillus)、艾氏菌(Escherichia)、根瘤菌(Rhizobium)、黃單胞菌(Xanthomonas)、鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas)、短桿菌(Brevibacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、新鞘脂菌(Novosphingobium)及鞘脂菌(Sphingobium)實質上不反應。
3A5-1H1作為受託編號NITE BP-03165(受託日:2020年3月3日)、4G4-1A9作為受託編號NITE BP-03166(受託日:2020年3月3日)、6D9-2G6作為受託編號NITE BP-03167(受託日:2020年3月3日)及7D4-1G9作為受託編號NITE BP-03168(受託日:2020年3月3日)分別基於布達佩斯(Budapest)條約而國際寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心(NPMD、地址:〒292-0818 千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號房間)。
本發明的抗體為對於細菌a的特異性高的抗體,例如對於可包含多種微生物的試樣中的細菌a的檢測而言有用。作為可包含多種微生物的試樣,例如可列舉:活性污泥、剩餘污泥、土壤、排水、水等。具有靶微生物分解能力的細菌a、例如NITE BP-02779可將構成剩餘污泥的微生物分解,因此於包含剩餘污泥的環境中,確認存在細菌a這一情況對於剩餘污泥的減容化而言有用。
[細菌的檢測方法]
本發明的檢測方法是使用本發明的抗體來檢測細菌a。根據本發明的檢測方法,可特異性檢測試樣中的細菌a,例如即便於在試樣中存在多種微生物的情況下,亦可檢測細菌a。於本發明的檢測方法中,所檢測的細菌例如為NITE BP-02779。本發明的一態樣是用以檢測細菌a的所述抗體的使用。
作為檢測細菌a的方法,可利用公知的免疫學測定方法。作為免疫學測定方法,例如可列舉:固相化ELISA、競爭ELISA、夾心ELISA、免疫複合體轉移測定方法、免疫比濁法、免疫層析法、乳膠凝聚法等。作為細菌的檢測方法的一例,以下對藉由固相化ELISA來檢測試樣中的細菌a的情況進行說明。
首先,形成包含本發明的抗體與細菌a的複合體。複合體可藉由混合本發明的抗體與包含細菌a的試樣來形成。其次,藉由使包含複合體的溶液與可捕捉細菌a的固相接觸而將複合體固定於固相上。作為固相,可使用預先固定了包含細菌a的試樣的固相。即,藉由使固定於固相上的試樣與本發明的抗體接觸,可使所述複合體形成於固相上。試樣於檢測細菌a之前可進行離心分離、變性處理、清洗等預處理,亦可不進行。
使試樣固定於固相上的態樣並無特別限定,例如可使試樣與固相直接結合,亦可使捕捉用抗體與固相經由其他物質來間接結合。作為直接結合的方法,例如可列舉物理吸附等。
固相的原材料並無特別限定,例如可自有機高分子化合物、無機化合物、生物體高分子等中選擇。作為有機高分子化合物,可列舉:乳膠、聚苯乙烯、聚丙烯等。作為無機化合物,可列舉:磁性體(氧化鐵、氧化鉻及鐵氧體等)、二氧化矽、氧化鋁、玻璃等。作為生物體高分子,可列舉:不溶性瓊脂糖、不溶性葡聚糖、明膠、纖維素等。亦可組合使用該些中的兩種以上。固相的形狀並無特別限定,例如可列舉:粒子、膜、微板、微管、試驗管等。
向固定了複合體的固相中添加本發明的抗體並加以清洗。於清洗後,利用於該技術領域中公知的方法來檢測與固相結合的抗體,藉此可判定試樣中有無細菌a及測定其量(菌數)。例如於使用經標記物質標記的抗體作為本發明的抗體的情況下,可藉由檢測由所述標記物質產生的訊號來測定試樣中有無細菌a及其量。於使用未標記的抗體作為本發明的抗體的情況下,向固相中添加對於本發明的抗體的標記二次抗體,並檢測由所述標記物質產生的訊號,藉此可測定試樣中有無細菌a及其量。
「檢測訊號」包括定性檢測訊號的有無、定量訊號強度及半定量性檢測訊號的強度。所謂半定量性檢測,是指將訊號的強度階段性表示為「不產生訊號」、「弱」、「中」、「強」等。於本實施形態中,較佳為定量性或半定量性檢測訊號的強度。
標記物質只要產生可檢測的訊號,則並無特別限定。例如,可為其自身產生訊號的物質(以下,亦稱為「訊號產生物質」),亦可為催化其他物質的反應而產生訊號的物質。作為訊號產生物質,例如可列舉螢光物質、放射性同位素等。作為螢光物質,可列舉:螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate,FITC)、若丹明、阿萊克薩螢光(Alexa Fluor)(註冊商標)等螢光色素、綠色螢光蛋白(Green Fluorescent Proteins,GFP)等螢光蛋白質等。作為放射性同位素,可列舉125I、14C、32P等。作為催化其他物質的反應而產生訊號的物質,例如可列舉酶。作為酶,可列舉:ALP、HRP、β-半乳糖苷酶、螢光素酶等。作為標記物質,較佳為酶,特佳為ALP或HRP。
檢測訊號的方法自身於該技術中是公知的,只要適宜選擇與源自標記物質的訊號的種類相應的檢測方法即可。例如於標記物質為酶的情況下,只要使用分光光度計等公知的裝置來檢測藉由使對於該酶的基質反應而產生的光、色等訊號即可。
酶的基質可根據酶的種類而自公知的基質中適宜選擇。例如於使用ALP作為酶的情況下,作為基質,可列舉:CDP-Star(註冊商標)(4-氯3-(甲氧基螺[1,2-二氧雜環丁烷-3,2'-(5'-氯)三環[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二鈉)、CSPD(註冊商標)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧雜環丁烷-3,2-(5'-氯)三環[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二鈉)等化學發光基質;5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate,BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸二鈉、p-硝基苯基磷酸等顯色基質。於使用HRP作為酶的情況下,作為基質,可列舉:發光胺及其衍生物等化學發光基質;2,2'-連氮基雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸銨)(2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium),ABTS)、1,2-苯二胺(1,2-phenylenediamine,OPD)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)等顯色基質。
於標記物質為放射性同位素的情況下,可使用閃爍計數器等公知的裝置來測定作為訊號的放射線。於標記物質為螢光物質的情況下,可使用螢光酶標儀(microplate reader)等公知的裝置來測定作為訊號的螢光。激發波長及螢光波長可根據所使用的螢光物質的種類來適宜確定。
[細菌的檢測試劑盒]
本發明的抗體可用於檢測細菌a的試劑盒中。本發明的試劑盒包含本發明的抗體,此外,還可包含展開用溶媒、緩衝液、清洗液、封閉用試劑、酶的基質、顯色試劑、固相(包含乳膠粒子)、細菌a的標準試樣等試劑及/或容器、反應裝置、螢光儀等裝置或器具。試劑盒亦可為包含本發明的抗體的固相化ELISA試劑盒、夾心ELISA試劑盒、乳膠凝聚法試劑盒、免疫層析試劑盒等。就可於現場測定的方面而言,試劑盒較佳為乳膠凝聚法試劑盒。藉由本發明的檢測試劑盒而檢測的細菌a例如為NITE BP-02779。試劑盒亦可為所述檢測方法中所使用的試劑盒。本發明的一態樣是用以製造細菌a的檢測試劑盒的所述抗體的使用。
以下,以乳膠凝聚法試劑盒為例,對本試劑盒進行更詳細說明。乳膠凝聚法試劑盒中所使用的乳膠粒子的比重較佳為0.8 mg/ml~1.2 mg/ml,更佳為1.05 mg/ml左右。乳膠粒子的平均粒子徑例如為約0.1 μm~4.0 μm,較佳為0.5 μm~1.5 μm左右,更佳為平均1.0 μm左右。作為乳膠粒子,可較佳地使用經著色的乳膠粒子。作為此種乳膠粒子,例如可例示:巴克特乳膠(Bacto latex)0.81(狄飛科(DIFCO)公司製造、平均粒徑0.81 μm、比重1.0 g/ml)、聚珠(Polybeads)#15713(聚科學(Polysciences)公司製造、平均粒徑1.0 μm、比重1.05 g/ml)等市售製品。作為乳膠粒子,並不限於該些,只要是具有與該些相同效果的乳膠粒子,不論其種類如何,均可使用。
乳膠粒子較佳為吸附本發明的抗體。所述吸附特異性抗體的載體的乳膠粒子及致敏乳膠粒子的製造方法等並無特別限定,例如可依據國際公開第2017/138608號來製備。作為使抗體致敏乳膠粒子的方法,可較佳地使用物理吸附法與化學結合法的任一者。
進行致敏的抗體較佳為選自(A)群組中的任意一種以上的融合瘤所產生的單株抗體,更佳為選自(B)群組中的任意一種以上的融合瘤所產生的單株抗體,進而佳為選自(C)群組中的任意一種以上的融合瘤所產生的單株抗體。該些單株抗體可使一種單株抗體單獨致敏乳膠粒子(乳膠珠),亦可混合數種單株抗體來致敏乳膠粒子。另外,亦可混合使用經不同的單株抗體致敏的乳膠粒子。
(A)群組:受託編號為NITE BP-03165、NITE BP-03166、NITE BP-03167及NITE BP-03168
(B)群組:受託編號為NITE BP-03166、NITE BP-03167及NITE BP-03168
(C)群組:受託編號為NITE BP-03166及NITE BP-03168
使抗體致敏乳膠粒子的步驟較佳為於緩衝液中進行。具體而言,將稀釋為適當的濃度的乳膠粒子的懸浮液與抗體的溶液混合,放置一會後進行清洗而製造致敏乳膠粒子。作為稀釋中所使用的緩衝液,通常可選擇具有不阻礙與所擔載的抗體的測定對象物質即抗原的反應的離子強度、pH值的緩衝液。緩衝液例如可利用TBS、PBS、GBS、磷酸緩衝液及硼酸緩衝液。其中,就致敏乳膠粒子的凝聚性、自凝聚的不易產生性的方面而言,可較佳地使用磷酸緩衝液、硼酸緩衝液及GBS作為緩衝液。緩衝液通常可於pH值5~10的範圍內選擇,特別是可選擇pH值6~9的範圍作為較佳者。
致敏時的乳膠粒子的濃度適當為0.01(w/v)%~0.5(w/v)%,特別是於0.05(w/v)%~0.25(w/v)%左右下可獲得良好的致敏乳膠粒子。另外,使抗體致敏時的抗體溶液的抗體蛋白質濃度適當為1.0 μg~1000 μg,若為所述以外,則因感度降低或致敏乳膠粒子的自凝聚而難以判斷陽性/陰性。關於致敏反應時的溫度,於0℃~60℃的範圍內進行,但當於室溫或稍稍高於室溫的溫度(~40℃)下進行反應時,可獲得感度良好的乳膠粒子。
於使用該些致敏乳膠粒子來進行細菌a的檢測、菌數的測定時,較佳為逆向被動乳膠凝聚法。逆向被動乳膠凝聚法是將包含免疫學凝聚反應粒子的液狀試劑與包含被檢測物質的試樣混合來進行被檢測物質的檢測或定量的方法,所述免疫學凝聚反應粒子是使具有與被檢測物質特異性結合的性質的物質(抗體等)和乳膠粒子結合而成。更詳細而言,將稀釋為適當的階段的試樣與包含抗體致敏乳膠粒子的試劑混合,並確認可觀察到凝聚像的稀釋度。另一方面,只要進行將包含已知數的細菌的標準試樣與包含抗體致敏乳膠粒子的試劑混合的試驗,並根據與所得結果的比較來算出菌數即可。
更詳細而言,向U型微量滴定板中添加用緩衝液進行了階段性稀釋的包含抗原的試樣或標準試樣。向各孔中分注包含等量的抗體致敏乳膠粒子的試劑,然後於室溫下靜置4小時~15小時。然後,使用肉眼或10倍左右的放大鏡來觀察凝聚像,並進行有無抗原的判定及濃度(菌數)的測定。將僅緩衝液時的凝聚像設為陰性,判定各孔的凝聚像,根據顯示陽性的凝聚像的被檢測孔的稀釋倍率與使用標準抗原的凝聚試驗的結果而可計算菌數。
作為乳膠凝聚法試劑盒,除所述以外,還可為如下試劑盒:將乳膠粒子與被檢測試樣於載玻片上混合,使用光學顯微鏡性判斷凝聚像的成否的方法(顯微鏡乳膠法)、免疫層析法等利用免疫學凝聚反應粒子的各種定性/定量方法的試劑盒。
根據本發明的試劑盒,可簡便地檢測試樣中所含的細菌a。本發明的試劑盒亦可用於自剩餘污泥、土壤、排水等試樣中檢測細菌a。
[實施例]
以下,列舉實施例來更詳細說明本發明,但本發明並不限定於該些實施例。
[實驗1.微生物分解菌的分離]
(方法)
使用以微球菌(Micrococcus)屬細菌為碳源的培養基來培養環境(水)中所存在的微生物群,藉此對分解微球菌(Micrococcus)屬細菌的微生物進行富集培養。其次,自經富集培養的微生物群中分離出增殖良好的數個菌株。
(結果)
對於經分離的菌株的每一個調查微球菌屬細菌分解能力,結果於一個菌株中確認到微球菌屬細菌分解能力。以下,有時將確認到微球菌屬細菌分解能力的菌株記為「菌株A」。
[實驗2.菌株A的鑑定]
(材料)
·克隆用正向引物(27F:序列編號2)
·克隆用反向引物(1492R:序列編號3)
·序列解析用引物(339F:序列編號4、536R:序列編號5、907F:序列編號6)
(方法)
菌株A的鑑定是藉由16S rRNA基因解析、形態觀察及生理/生化性狀試驗來進行。
16S rRNA基因解析是按照以下順序來進行。自菌株A中萃取基因組DNA,將所獲得的基因組DNA作為模板,使用克隆用正向引物(27F)及克隆用反向引物(1492R)來進行16S rRNA基因的PCR增幅。PCR增幅是使用KOD FX(東洋紡公司製造)來進行,並對PCR後的增幅產物進行精製。
使用經精製的PCR後的增幅產物來進行循環測序反應。循環測序反應是使用比格戴終結者v3.1循環測序試劑盒(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit)來進行。對所獲得的反應液進行精製,並將精製液供於DNA測序解析(3730xl DNA分析儀(3730xl DNA Analyzer)),確定自菌株A中萃取的模板DNA的16S rRNA基因的鹼基序列。
形態觀察及生理/生化性狀試驗是藉由利用光學顯微鏡的形態觀察、巴羅(BARROW)等人的方法(「考恩與斯蒂爾醫學細菌鑑定手冊」(第三版,1993年),劍橋大學出版社(Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria 3rd Edition 1993、Cambridge University Press.))及API50CHB(生物梅里埃(bioMerieux)公司製造、里昂(Lyon)、法國(France))來進行。
(結果)
對於所獲得的16S rRNA基因的鹼基序列(序列編號1),相對於國際鹼基序列資料庫(DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)進行同源解析。於基準株中,相對於永久冰凍膨脹芽孢桿菌Eurl_9.5(Tumebacillus permanentifrigoris Eurl_9.5)的16S rRNA基因的鹼基序列,顯示出同一性98.1%。但是,具有與所獲得的鹼基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物並不存在。另外,菌株A於10℃下並不繁育,但於16S rRNA基因的相同性最高的永久冰凍膨脹芽孢桿菌Eurl_9.5(Tumebacillus permanentifrigoris Eurl_9.5)中並未發現此種特徵。因此,暗示:菌株A是與現有的膨脹芽孢桿菌(Tumebacillus)不同的新的種類。將菌株A作為膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus sp.)NITE BP-02779進行國際寄存。
將NITE BP-02779的形態觀察及生理/生化性狀試驗結果示於表1~表4中。
[表1]
+:陽性、-:陰性、+w:反應弱
試驗項目 | 結果 | |
培養溫度(℃) | 25 | |
細胞形態 | 桿菌(0.8-0.9×3.0-5.0 μm) | |
革蘭氏染色性 | + | |
有無孢子 | + | |
運動性 | - | |
菌落(colony)形態 | 培養基:R2A瓊脂 | |
培養時間:48 hr | ||
直徑:1 mm-2 mm | ||
色調:黃色 | ||
形狀:圓形 | ||
隆起狀態:透鏡狀(中央隆起) | ||
周緣:波狀 | ||
表面的形狀等:平滑 | ||
透明度:不透明 | ||
黏稠度:黃油狀 | ||
繁育溫度試驗 (℃) | 37 | + |
45 | - | |
過氧化氫酶(catalase)反應 | +w | |
氧化酶(oxidase)反應 | - | |
產生來自葡萄糖的酸/氣體 (酸產生/氣體產生) | -/- | |
O/f測驗(氧化/發酵) | -/- |
[表2]
+:陽性、-:陰性
試驗項目 (發酵性試驗) | 試驗 結果 | 試驗項目 (發酵性試驗) | 試驗 結果 | 基質成分 (發酵性試驗) | 試驗 結果 |
控制(control) | - | α-甲基-D-葡萄糖苷 | - | D-塔格糖(D-tagatose) | - |
丙三醇 | - | N-乙醯葡萄糖胺 | - | D-岩藻糖(D-fucose) | - |
赤藻糖醇(erythritol) | - | 苦杏仁苷(amygdalin) | - | L-岩藻糖 | - |
D-阿拉伯糖(D-arabinose) | - | 熊果苷(arbutin) | - | D-阿拉伯糖醇 (D-arabitol) | - |
L-阿拉伯糖 | - | 七葉苷(Aesculin) | - | L-阿拉伯糖醇 | - |
核糖(ribose) | - | 水楊苷(salicin) | - | 葡萄糖酸鹽(gluconate) | - |
D-木糖(D-xylose) | - | 纖維雙糖(cellobiose) | - | 2-酮基葡萄糖酸鹽 (2-ketogluconate) | - |
L-木糖 | - | 麥芽糖(maltose) | - | 5-酮基葡萄糖酸鹽 | - |
核糖醇(adonitol) | - | 乳糖(lactose) | - | ||
β-甲基-D-木糖 | - | 蜜二糖(melibiose) | - | ||
半乳糖(galactose) | - | 蔗糖(saccharose) | - | ||
葡萄糖 | - | 海藻糖(trehalose) | - | ||
果糖(fructose) | - | 菊糖(inulin) | - | ||
甘露糖(mannose) | - | 松三糖(melicitose) | - | ||
山梨糖(sorbose) | - | 棉子糖(raffinose) | - | ||
鼠李糖(rhamnose) | - | 澱粉 | - | ||
甜醇(dulcitol) | - | 肝醣(glycogen) | - | ||
肌醇(inositol) | - | 木糖醇 | - | ||
甘露醇(mannitol) | - | 龍膽二糖(gentiobiose) | - | ||
山梨糖醇 | - | D-松二糖(D-turanose) | - | ||
α-甲基-D-甘露糖苷 (α-methyl-D-mannoside) | - | D-來蘇糖(D-lyxose) | - |
[表3]
+:陽性、-:陰性
基質成分 (生化試驗) | 試驗結果 |
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase) | - |
精胺酸二水解酶(arginine dihydrolase) | - |
離胺酸脫羧酶(lysine decarboxylase) | - |
鳥胺酸脫羧酶 | - |
檸檬酸的利用性 | - |
產生H2 S | - |
尿素酶(urease) | - |
色胺酸脫胺酶(tryptophan deaminase) | - |
產生吲哚 | - |
產生乙偶姻(acetoin)(VP) | - |
明膠酶(gelatinase) | - |
硝酸鹽還原 | - |
[表4]
+:陽性、-:陰性
試驗項目 | 試驗結果 |
10℃下的繁育 | - |
pH值9.0下的繁育 | + |
澱粉的水解 | + |
[實驗3.NITE BP-02779對於剩餘污泥(死菌)的分解能力評價-1]
(材料)
·R2A培養基:相對於1000 mL的超純水而以3.2 g的比例溶解R2A培養液(R2A Broth)、大高(DAIGO)(日本製藥股份有限公司製造)並進行高壓蒸氣滅菌而成的培養基
·含有剩餘污泥(死菌)的無機培養基:將986 mL基質溶液、3.0 mL A液、3.0 mL B液、3.0 mL C液、3.0 mL D液及1.8 mL 1%磷酸混合而成的培養基
作為基質溶液及A液~D液,使用以下溶液。
基質溶液:對剩餘污泥進行清洗,然後對於超純水986 mL,以成為濁度(OD660)0.2的方式混合,並進行高壓蒸氣滅菌而成的溶液
A液:將4.35 g磷酸氫二鉀、1.70 g磷酸二氫一鉀、8.92 g磷酸氫二鈉十二水合物、0.34 g氯化銨溶解於超純水中後,製備成200 mL,並進行高壓蒸氣滅菌而成的溶液
B液:將4.50 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水中後,製備成200 mL,並進行高壓蒸氣滅菌而成的溶液
C液:將5.50 g氯化鈣無水物溶解於超純水中後,製備成200 mL,並進行高壓蒸氣滅菌而成的溶液
D液:將0.05 g氯化鐵六水合物溶解於超純水中後,製備成200 mL,並利用0.2 μm的針筒過濾器(syringe filter)進行過濾滅菌而成的溶液
(方法)
將NITE BP-02779播種於R2A培養基中,於25℃下培養24小時~48小時。於培養結束後,向試驗管中添加NITE BP-02779培養液50 μL與含有剩餘污泥(死菌)的無機培養基5.0 mL,於25℃下以200 rpm進行反應,經時性利用簡易濁度計(簡易OD監視器 迷你伏特(miniphoto)518R、泰太科(TAITEC)公司製造)對試驗管的濁度(OD660)進行測定。算出含有剩餘污泥(死菌)的無機培養基的濁度(OD660)顯示出陰性對照的濁度(OD660)的50%的經過天數。陰性對照是使用未添加NITE BP-02779的含有靶細菌(死菌)的無機培養基的濁度(OD660)。
(結果)
藉由添加NITE BP-02779而確認到剩餘污泥(死菌)的濁度的降低,於3.2天成為陰性對照的濁度的50%。因此,NITE BP-02779可分解剩餘污泥(死菌)。
[實驗4.NITE BP-02779對於剩餘污泥(死菌)的分解能力評價-2]
(材料)
使用與實驗3相同的材料。
(方法)
利用與實驗3相同的方法進行反應。反應是以5連進行,且於反應開始後第4天全量回收試驗管中殘存的剩餘污泥。將所回收的剩餘污泥乾燥後,測定重量,並利用陰性對照群組與添加有NITE BP-02779的群組進行有意差檢定(t檢定、單側)。
(結果)
將結果示於圖1中。與陰性對照群組相比較,於添加有NITE BP-02779的群組中,確認到剩餘污泥的乾燥重量的非偶然的降低(p<0.01)。因此,藉由添加NITE BP-02779而可削減剩餘污泥。
[實驗5.融合瘤的建立]
(材料)
·抗原:對NITE BP-02779進行熱處理,將處理後的菌體與弗氏不完全佐劑(富士軟片和光純藥公司製造)混合而成者
·免疫動物:小鼠(B6D2F1/Slc)8週齡、雌性、5只
·骨髓瘤細胞:SP2
(方法)
依據圖2的融合瘤的製作順序及評價順序來製作融合瘤。首先,將抗原(菌體數約1.0×109
cells/只)對小鼠尾根部進行免疫。於17天後利用相同量的抗原進行追加免疫,於21天後自免疫了抗原的小鼠的髂骨淋巴結回收淋巴球。使淋巴球與骨髓瘤細胞進行細胞融合而形成融合瘤,播種於約800井中進行培養。自各井中回收融合瘤培養上清液。
[實驗6.融合瘤的篩選]
(材料)
·802培養基:將10 g聚蛋白腖(polypeptone)、2 g酵母萃取物、1 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水中並將pH值調節為7.0,然後製備成1000 mL,並進行高壓蒸氣滅菌而成的培養基
·1%BSA-PBS:相對於1×PBS 25 mL而溶解250 mgBSA(富士軟片和光純藥公司製造)而成的溶液
·一次抗體液:將融合瘤培養上清液稀釋為1/10而成的溶液
·二次抗體液:將以下的抗體稀釋為1/20000並加以混合而成的溶液
HRP標記Donkey抗Mouse IgG(H+L)(傑克遜免疫研究(Jackson ImmunoResearch)公司製造)
HRP標記Goat抗Mouse IgG(Light Chain Specific)(傑克遜免疫研究(Jackson ImmunoResearch)公司製造)
·顯色基質:TMBZ(賽默科技(ThermoScientific)公司製造)
(方法)
依據以下順序來進行固相化ELISA,並對融合瘤培養上清液中的抗體的抗原識別能力進行評價。
將NITE BP-02779於802培養基中培養,然後集菌,利用PBS進行清洗,然後製備成規定的濃度。將菌體液以50 μL/井播種於免疫板(能肯-免疫板I(Nunc-Immuno PlateI)、能肯(Nunc)公司製造),於37℃下靜置1小時。利用PBS進行清洗,然後以100 μL/井加入1%BSA-PBS,於室溫下進行30分鐘封閉。於封閉結束後,以50 μL/井加入一次抗體液,於室溫下反應1小時。於反應後,利用PBS清洗3次,以50 μL/井加入二次抗體液,於室溫下反應30分鐘。於反應後,利用PBS清洗3次,以100 μL/井加入顯色基質溶液,於室溫下反應數分鐘。以100 μL/井為單位加入1 M硫酸,停止反應。利用酶標儀(分子器件(Molecular Device)公司製造)來測定450 nm的吸光度。基於固相化ELISA的結果來選擇表5所示的5種(3A5、4G4、7D4、4D9及6D9)的融合瘤。
[表5]
3A5 | 4G4 | 7D4 | 4D9 | 6D9 | |
陽性抗原(NITE BP-02779) | 0.601 | 0.371 | 0.486 | 0.601 | 0.428 |
陰性抗原(BSA) | 0.035 | 0.014 | 0.016 | 0.003 | 0.026 |
[實驗7.融合瘤的克隆]
(方法)
藉由極限稀釋法來分別稀釋所述所選擇的5種融合瘤,以每1種200井重新播種並進行培養。藉由顯微鏡觀察而確認到是單菌落。自各井中獲得克隆培養上清液。
[實驗8.克隆的篩選]
(方法)
利用與實驗6相同的方法來評價克隆培養上清液中的抗體的抗原識別能力。固相化ELISA的結果,選擇表6所示的4種(3A5-1H1、4G4-1A9、6D9-2G6及7D4-1G9)的克隆。所獲得的克隆如表7般國際寄託於寄託機構。
[表6]
3A5-1H1 | 4G4-1A9 | 6D9-2G6 | 7D4-1G9 | |
陽性抗原(NITE BP-02779) | 0.161 | 0.387 | 0.265 | 0.502 |
陰性抗原(BSA) | 0.007 | 0.004 | 0.009 | 0.007 |
[表7]
克隆 | 受託編號 |
3A5-1H1 | NITE BP-03165 |
4G4-1A9 | NITE BP-03166 |
6D9-2G6 | NITE BP-03167 |
7D4-1G9 | NITE BP-03168 |
[實驗9.對於浮游菌體的克隆培養上清液的評價]
(材料)
除使用實驗8中所獲得的克隆培養上清液(1/10稀釋)作為一次抗體液以外,使用與實驗6相同的材料。
(方法)
依據以下順序來進行競爭ELISA,並評價克隆培養上清液中的抗體的抗原識別能力。
將製備成規定的濃度的NITE BP-02779的菌體液與一次抗體液混合,於室溫下靜置1小時。將所述混合液以50 μL/井加入至已NITE BP-02779固相化及封閉完的免疫板中,於室溫下反應1小時。於反應後,利用PBS清洗3次,以50 μL/井加入二次抗體液,於室溫下反應30分鐘。於反應後,利用PBS清洗3次,以100 μL/井加入顯色基質溶液,於室溫下反應5分鐘。以100 μL/井為單位加入1 M硫酸,停止反應。利用酶標儀(分子器件(Molecular Device)公司製造)來測定450 nm的吸光度。
將競爭菌體濃度為0時的ABS450 nm設為100%,算出ABS450 nm顯示50%時的競爭菌體濃度,並按照以下基準來評價克隆。
A:未滿1.25×108
cells/mL
B:1.25×108
cells/mL以上且未滿2.5×108
cells/mL
C:2.5×108
cells/mL以上
(結果)
將結果示於表8中。任一克隆培養上清液對NITE BP-02779(浮游菌體)均顯示出反應。
[表8]
克隆培養上清液 | 結果 |
3A5-1H1 | B |
4G4-1A9 | A |
6D9-2G6 | B |
7D4-1G9 | A |
[實驗10.對於固相化菌體的克隆培養上清液的評價]
(材料)
除使用實驗8中所獲得的克隆培養上清液(1/10稀釋)作為一次抗體液以外,使用與實驗6相同的材料。
(方法)
利用與實驗6相同的方法來評價克隆培養上清液中的抗體的抗原識別能力。
將固相化菌體濃度為5.0×108
cells/mL時的ABS450 nm設為100%,算出ABS450 nm顯示50%時的固相化菌體濃度,並按照以下基準來評價克隆。
A:未滿1.0×108
cells/mL
B:1.0×108
cells/mL以上且未滿1.5×108
cells/mL
C:1.5×108
cells/mL以上且未滿2.0×108
cells/mL
D:2.0×108
cells/mL以上
(結果)
將固相化ELISA的結果示於表9中。任一克隆培養上清液對NITE BP-02779(固相化菌體)均顯示出反應。
[表9]
克隆培養上清液 | 結果 |
3A5-1H1 | C |
4G4-1A9 | A |
6D9-2G6 | A |
7D4-1G9 | B |
[實驗11.克隆培養上清液的交叉性的評價]
(材料)
除使用實驗8中所獲得的克隆培養上清液(1/10稀釋)作為一次抗體液及使用表10中記載的細菌作為固相化菌體以外,使用與實驗6相同的材料。
(方法)
利用與實驗6相同的方法來評價克隆培養上清液中的抗體的抗原交叉性。
將使用NITE BP-02779作為固相化菌體時的ABS450 nm設為100%,算出對於表10中記載的菌體的交叉性(%),採用交叉性(%)最高的菌體的值,並按照以下基準來評價克隆。
A:0%以上且未滿20%
B:20%以上且未滿30%
C:30%以上且未滿40%
D:40%以上
(結果)
關於4種克隆,將對於表10中記載的菌體的交叉性(%)示於圖3~圖6中。將交叉性的評價示於表11中。關於任一克隆培養上清液,對於NITE BP-02779的反應性均高,但對於其以外的抗原的反應性均低。得知:4種克隆均產生具有高抗原特異性的抗體。
[表10]
1 | 膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus sp.)NITE BP-02779 |
2 | 藻渣膨脹芽孢桿菌(Tumebacillus algifaecis)NBRC108765 |
3 | 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α |
4 | 百脈根根瘤菌(Rhizobium loti)IFO 14779t |
5 | 嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonas maltophilia)JCM 1975t |
6 | 副少動鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas parapaucimobilis)JCM 7510t |
7 | 表皮短桿菌(Brevibacterium epidermidis)JCM 2593t |
8 | 核黃素假單胞菌(Pseudomonas riboflavina)IFO 13584t |
9 | 玫瑰紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)JCM 3202t |
10 | 食萘新鞘脂菌(Novosphingobium naphthalenivorans)NBRC 102051 |
11 | 陰溝鞘脂菌(Sphingobium cloacae)NBRC 102517 |
[表11]
克隆培養上清液 | 結果 |
3A5-1H1 | B |
4G4-1A9 | C |
6D9-2G6 | B |
7D4-1G9 | A |
[實驗12.單株抗體的精製]
(材料)
·克隆:4G4-1A9、6D9-2G6或7D4-1G9
·培養基:向無血清培養基融合瘤(Hybridoma)-SFM(GIBCO公司製造)中以成為1 ng/mL的方式添加休曼(Human)IL-6(R&D系統(Systems)公司製造)而成的培養基
·陽離子交換層析的結合緩衝液:15.7 mM磷酸鈉緩衝液
·陽離子交換層析的溶出緩衝液:1×PBS
(方法)
將克隆於100 mL的培養基中培養,藉由硫酸銨沈澱來將培養上清液濃縮。藉由陽離子交換層析(管柱:HiTrap SP HP)來分餾濃縮液,藉此精製單株抗體。
[實驗13.抗體對於乳膠珠的致敏]
(材料)
·單株抗體:於實驗12中由克隆(4G4-1A9、6D9-2G6或7D4-1G9)的培養上清液精製而得的單株抗體(以下,分別記為4G4-1A9 mAb、6D9-2G6 mAb及7D4-1G9 mAb)
·乳膠珠:#15713(聚科學(Polysciences)公司製造、粒形1.0 μm)
·硼酸緩衝液:將6.18 g硼酸溶解於超純水中,將pH值調節為8.5,然後製備成1000 mL而成的緩衝液
·1%BSA-硼酸緩衝液:相對於硼酸緩衝液25 mL而溶解250 mg BSA而成的溶液
·保存液:相對於100 mM磷酸緩衝液100 mL而溶解1 g BSA、0.83 g氯化鈉及5 g丙三醇而成的溶液
(方法)
向乳膠珠0.5 mL中添加硼酸緩衝液1 mL來進行清洗,將所述操作反覆進行3次。向經清洗的乳膠珠1 mL中添加1 mg/mL的單株抗體溶液0.3 mL,於室溫下倒轉混合一晚。於倒轉混合後,藉由離心分離來去除上清液,利用1%BSA-硼酸緩衝液封閉30分鐘。藉由離心分離來去除封閉液,然後添加1%BSA-硼酸緩衝液來進行封閉,將所述操作反覆進行2次,添加保存液1 mL而製成抗體致敏乳膠珠並加以冷藏保存。單株抗體對於乳膠珠的結合是藉由測定致敏前後的抗體溶液的吸光度(A280 nm)來確認。
(結果)
將抗體致敏前後的抗體溶液的吸光度(A280 nm)示於表12中。任一抗體溶液於致敏前後吸光度均減少,因此可確認到抗體對於乳膠珠的致敏。
[表12]
單株抗體溶液 | 吸光度 | |
致敏前 | 致敏後 | |
4G4-1A9 mAb | 0.38 | 0.21 |
6D9-2G6 mAb | 0.35 | 0.19 |
7D4-1G9 mAb | 0.42 | 0.22 |
[實驗14.乳膠凝聚試驗]
(材料)
·實驗13中製作的抗體致敏乳膠珠
·其他材料使用與實驗11~實驗13相同的材料。
(方法)
相對於抗體致敏乳膠珠0.1 mL添加0.5 mL硼酸緩衝液來進行清洗,將所述操作反覆進行2次,最終懸浮於4 mL硼酸緩衝液中。其次,利用硼酸緩衝液將於802培養基中培養的NITE BP-02779階段稀釋為規定的濃度。將階段稀釋的菌體溶液與懸浮於硼酸緩衝液中的抗體致敏乳膠珠分別以50 μL/井(合計100 μL/井)添加於U字板中,於室溫下靜置一晚。
將僅緩衝液時的凝聚像設為陰性,判定各孔的凝聚像,基於顯示陽性的凝聚像的被檢測孔的細菌濃度而分類為以下的A~D。
A:未滿2.0×106
cells/mL
B:2.0×106
cells/mL以上且未滿2.0×107
cells/mL
C:2.0×107
cells/mL以上且未滿2.0×108
cells/mL
D:2.0×108
cells/mL以上
(結果)
將結果示於表13中。任一抗體致敏乳膠珠均與NITE BP-02779(浮游菌體)反應而可確認到凝聚像。
[表13]
抗體致敏乳膠珠 | 結果 |
4G4-1A9 mAb致敏乳膠珠 | A |
6D9-2G6 mAb致敏乳膠珠 | B |
7D4-1G9 mAb致敏乳膠珠 | A |
無
圖1是表示於實驗4中添加膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus sp.)NITE BP-02779後的剩餘污泥的乾燥重量的圖。
圖2是示意性表示實驗5中的單株抗體的製造方法的圖。
圖3是實驗11中的3A5-1H1(受託編號NITE BP-03165)的培養上清液的交叉性評價結果。
圖4是實驗11中的4G4-1A9(受託編號NITE BP-03166)的培養上清液的交叉性評價結果。
圖5是實驗11中的6D9-2G6(受託編號NITE BP-03167)的培養上清液的交叉性評價結果。
圖6是實驗11中的7D4-1G9(受託編號NITE BP-03168)的培養上清液的交叉性評價結果。
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
1.日本,獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心,2018/09/11,NITE BP-02779
2.日本,獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心,2020/03/03,NITE BP-03165
3.日本,獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心,2020/03/03,NITE BP-03166
4.日本,獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心,2020/03/03,NITE BP-03167
5.日本,獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心,2020/03/03,NITE BP-03168
Claims (8)
- 一種單株抗體,其與具有16S rRNA基因的細菌反應,所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列。
- 一種單株抗體,其與膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779反應。
- 一種單株抗體,其由受託編號為NITE BP-03165、NITE BP-03166、NITE BP-03167或NITE BP-03168的融合瘤產生。
- 一種細菌的檢測方法,其中,使用如請求項1至請求項3中任一項所述的單株抗體,所述細菌具有包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列的16S rRNA基因。
- 如請求項4所述的檢測方法,其中,所述細菌為膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779。
- 一種細菌的檢測試劑盒,包含如請求項1至請求項3中任一項所述的單株抗體,所述細菌具有包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有98.2%以上的同一性的鹼基序列的16S rRNA基因。
- 如請求項6所述的檢測試劑盒,其中,所述細菌為膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779。
- 一種融合瘤,其受託編號為NITE BP-03165、NITE BP-03166、NITE BP-03167或NITE BP-03168。
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