JP3614997B2 - 乳酸菌検出用抗体及びそれを用いた乳酸菌検出方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビール中で増殖可能であり、混濁を引き起こす性質を有する有害な乳酸菌の検出に使用しうる抗体及びそれを用いる有害な乳酸菌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビール製造工程中に混入したビール汚染微生物のうち、ある種のものは製品ビール中で増殖可能であり、ビールを混濁させるなどの有害な作用を示し、ビールの品質を低下させる危険性があった。これらビール汚染菌の中でも、ラクトバチルス属等に属する有害な乳酸菌が最も問題になっており、これら有害な乳酸菌を迅速かつ高感度に検出する必要が指摘されていた。乳酸菌類は、大腸菌等に比べて、検査培地中での増殖速度が遅いことから、迅速、高感度かつ特異的に検出する方法が従来より種々提案されている。
【０００３】
例えば、抗原抗体反応を利用してビール中の有害な乳酸菌を検出する方法は、特開平６−４６８８１号公報に記載されている。この方法では、ラクトバチルス属第３群に属するラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・コリノイデス、ラクトバチルス・スエビカスを抗原としてモノクローナル抗体を作成し、これらモノクローナル抗体を用いてビール中のラクトバチルス属第３群に属する乳酸菌を迅速、高感度かつ特異的に検出することができるとしている。
【０００４】
しかし、ビールの汚染に関与する乳酸菌であっても、製品ビール中で増殖可能であり、増殖によりビールの混濁を引き起こす性質（以下「ビール混濁能」という）を有する有害菌は、ラクトバチルス属第３群に属する乳酸菌の内の一部の菌であり、上記モノクローナル抗体を用いる方法では、ラクトバチルス属第３群に属する乳酸菌は検出できても、その中にはビール混濁能をもたない乳酸菌も多数存在し、ビール混濁能を有する乳酸菌を特異的に検出することはできなかった。
【０００５】
一方、本発明者らの知見によると、後述するように、ビール混濁能を有する菌は、ラクトバチルス属第３群に属する乳酸菌ばかりではなく、その他にも存在することから、ビール混濁能を有する乳酸菌をすべて特異的に検出したい場合、上記方法では多数の抗体を併用する必要があり、十分対応することができなかった。
【０００６】
また、ビール中の有害な乳酸菌を検出する別法として、特定の乳酸菌検出用プライマーを用いたＰＣＲ法を利用する方法（例えば、ＡＳＢＣ Ｊｏｕｒｎａｌ、５１，６３（１９９３）、特開平７−２８９２９５号公報）も提案されているが、この方法も特定の菌株を検出する方法であって、ビール混濁能を有する乳酸菌を特異的に検出することができない上に、菌種毎に多数のプライマーを調製する必要があった。
【０００７】
【発明が解決する課題】
ビール製造工程中に混入したビール汚染微生物のうち、製品ビール中で増殖可能であり、増殖によりビールの混濁を引き起こす、ビール混濁能を有する乳酸菌が、ビール汚染菌として実際上問題となっている。
【０００８】
このようなビール混濁能を有する乳酸菌には、ラクトバチルス属に属するものとして、ラクトバチルス・ブレビス種に属する菌とラクトバチルス・リンドネリ種（正式分類名称は未報告。Ｂａｃｋ，Ｗ（１９８１）Ｍｏｎａｔｓｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｂｒａｕｅｒｅｉ，３４，２６７，Ｂａｃｋ，Ｗ．（１９８２）Ｂｒａｕｗｅｌｔ ４５，１５６２ ａｎｄ ２０９０）があり、またペディオコッカス属に属するものとして、ペディオコッカス・ダムノサス種に属する菌が知られている。また、ラクトバチルス・ブレビス及びペディオコッカス・ダムノサスについては、その種に属するすべての菌がビール混濁能を有するわけではなく、それらの一部がビール混濁能を有するにすぎないことも知られている。
【０００９】
そして、前記のモノクローナル抗体やＰＣＲ法を利用する検出方法、その他従来の乳酸菌の検出方法では、乳酸菌を分類学上の種（スピーシーズ）のレベル毎に判別することは可能であっても、製品ビールにおいて実際上問題になっているビール混濁能の有無というレベルでの判別は不可能であった。
【００１０】
本発明の課題は、ビール混濁能を有する乳酸菌類を特異的に、精度よくかつ迅速・簡便に検出できる方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、製品ビールにおいて実際上問題になっているビール混濁能を有する乳酸菌のみを選択的に検出しうる抗体を見いだすべく鋭意研究し、ビールから見いだされた数多くの乳酸菌について、その乳酸菌を抗原として免疫して得られた抗体について種々検討する過程において、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビス菌の中でも、嫌気条件下でグルコース資化能をもたない菌株を抗原として免疫を行なって得られた抗体が、偶然にも上記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビス菌を抗原として用いて得られる乳酸菌検出用抗体に関する。
【００１３】
また、本発明は、ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビス菌、例えばラクトバチルス・ブレビスＬ５０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６８３）を抗原として用いて得られる、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビス又はペディオコッカス・ダムノサスに属する乳酸菌と特異的に反応する乳酸菌検出用の抗血清又はその精製物からなる抗体に関する。
【００１４】
そしてまた、本発明は、ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビス菌を抗原として用いて得られる抗体を使用することを特徴とするビール混濁能を有する乳酸菌の検出方法に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビス菌、例えばラクトバチルス・ブレビスＬ５０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６８３）を抗原として用いて得られる、ビール混濁能を有する乳酸菌と特異的に反応する抗血清又はその精製物からなる抗体を使用して、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビス又はペディオコッカス・ダムノサスに属する乳酸菌を検出する方法に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明において、「ビール混濁能」とは、前述したように、ビール中で増殖可能であり、増殖によりビールの混濁を引き起こす性質をいい、本発明におけるビール混濁能を有する菌とはビール中、特に最終製品ビール中で増殖し、混濁を生じさせる菌をいう。ここで「混濁」とは、目視により微生物に由来する濁りが認められることをいう。
【００１７】
本発明において、「検出」とは、検査して見つけ出すことという通常の意味の他、「識別」及び「同定」をも意味する。
【００１８】
ビール混濁能を有する乳酸菌として、前記のように、ラクトバチルス・ブレビス種に属する菌を挙げることができ、このラクトバチルス・ブレビスはビール有害菌としてもっとも有名な菌の一つではあるが、ラクトバチルス・ブレビス種に属するすべての菌がこのようなビール混濁能を有するわけではない。
【００１９】
本発明において、抗原として用いる「ラクトバチルス・ブレビス菌」は、ビール混濁能を有していることが必要条件であるが、さらに、このラクトバチルス・ブレビス菌は嫌気条件下でグルコースが資化できない、すなわち嫌気条件下でグルコース資化能をもたないことも必要条件である。
【００２０】
乳酸菌は通性嫌気性細菌であり、酸素の存在下でも生育しうるが、酸素の非存在下、すなわち嫌気条件下でも生育しうる。かかる嫌気条件下でグルコース資化能をもたないということは、嫌気条件下でグルコースを唯一の炭素源としてその菌を培養した場合、生育が認められないことをいう。
【００２１】
これら２つの条件を合わせ有するラクトバチルス・ブレビス菌は、ビール工場などの汚染菌の中から、乳酸菌選択培地を用いて乳酸菌を生育させ、生育した乳酸菌の中からビール混濁能を有する菌株を選別し、その中から嫌気条件下でグルコース資化能がない菌株を選択することによって得ることができる。
【００２２】
ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能がないラクトバチルス・ブレビス菌株を抗原として抗体を得る方法としては、よく知られている公知の方法を用いることができる。
【００２３】
具体的には、上記菌株を処理することなく、あるいはアルカリ処理等の前処理（特開平４−７２５７０号公報参照）の後、菌体を、必要に応じて適当なアジュバンドと混合し、適当な哺乳類動物（例えばウサギ）に免疫を行い、その後、必要に応じて複数回追加免疫を行って、目的とする抗体を含む抗血清が得られる。
【００２４】
得られた抗血清を通常知られている吸収操作やカラムクロマトグラフィーなどの方法により精製して、より純度の高い抗体を得ることももちろん可能であるが、実用上は抗血清の状態で使用しても効果の点ではなんら問題はなく、この抗血清の状態で使用しうる簡便さは本発明の抗体の一つの特徴である。
【００２５】
本発明の抗体は、また、再現性良く調製できることも特徴の一つである。すなわち、特定のラクトバチルス・ブレビス菌株を抗原として用いれば、製造ロットが変わったとしても、常に目的の効果を有する抗体が安定的に得られる。
【００２６】
本発明の抗体としては、上記のような抗血清又はその精製物の他、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビスの菌体で免疫したマウスの脾臓からの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを常法により細胞融合し、得られるハイブリドーマから得られる、ビール混濁能を有する乳酸菌に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を挙げることができる。
【００２７】
さらに、本発明の抗体は、ビール混濁能を有する乳酸菌のうち、免疫源として用いたラクトバチルス・ブレビス種のみならず、上記ペディオコッカス属のダムノサス種とも反応し、他方、ビール混濁能を有さないラクトバチルス・ブレビス種やペディオコッカス・ダムノサス種の菌やその他の乳酸菌とは反応しないという大きな特徴を有している。
【００２８】
したがって、ビール混濁能を有する乳酸菌の別の一種である、上記のラクトバチルス・リンドネリを検出することができる抗体と組み合わせて使用すれば、前述したビール混濁能を有する３種の乳酸菌すべての検出が可能になる。そして、かかるラクトバチルス・リンドネリに対する抗体も、ラクトバチルス・リンドネリで同様に免疫すれば得られることが確認されている。
【００２９】
本発明を用いたビール混濁能を有する乳酸菌の検出は、対象となるビール汚染菌に対して、本発明の抗体を反応させ、凝集反応が見られるか否かで判別するだけでよく、ビール工場等実際の現場で、迅速かつ高感度でビール混濁能を有する乳酸菌を検出する場合には、対象となる製品ビールをメンブレンフィルターで濾過して、フィルター上に存在する菌を乳酸菌選択増殖培地（例えば、ｍ−ＮＢＢ培地；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ｏｆ Ｍａｓｔｅｒ Ｂｒｅｗｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｓ，２２，６１（１９８５））で培養した後、上記抗血清からあらかじめ精製して得られたＩｇＧ抗体とのイムノブロットを、例えば「免疫化学実験法」（Ａ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｔｈｏｒｐｅ著 西村書店）に記載されているような常法にしたがって行えばよい。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
実施例１（Ｌ５０株による抗体の作成）
ビールから分離した、ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビスＬ５０株をｍ−ＮＢＢ培地で培養後、集菌した菌体を０．１Ｎの水酸化ナトリウムに懸濁し、室温で１０分間処理する。この処理菌体を再度集菌し、生理食塩水にて洗浄した菌体を抗原とした。この抗原をウサギに対し静脈注射により免疫した。５日の間隔で６回追加免疫を行い、血中の抗体価が上昇し平衡に達したときに全採血を実施し抗血清を得た。このラクトバチルス・ブレビスＬ５０株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓＬ５０）は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８年９月３０日、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６８３として寄託されている。
【００３２】
この抗血清中には、ビール混濁能の有無にかかわらず、ラクトバチルス・ブレビスに属する菌株すべてに反応しうる非特異的抗体が混入している可能性がある。かかる非特異的抗体を抗血清から除去するため、ビール混濁能がないラクトバチルス・ブレビスＪＣＭ１１７０株（理化学研究所より入手可能）のアルカリ処理菌体を得られた抗血清中に混合し、室温で１時間撹拌して、上記非特異的抗体をＪＣＭ１１７０株に吸着せしめた。この吸着処理後、遠心分離により、ＪＣＭ１１７０株の菌体から上清を分離し、ビール混濁能を有する菌に対して特異的に反応する抗血清を取得した（以下、この抗血清を「Ｌ５０抗体」という。）。
【００３３】
上記吸収処理によって、この抗血清のＬ５０株への反応力価の低下は認められなかった。また、Ｌ５０株を抗原として４羽のウサギに対して免疫を行い、そのすべてから同等の抗体が得られることを確認し、本発明の抗体が再現性よく調製しうることがわかった。
【００３４】
実施例２（Ｌ５３株による抗体の作成）
Ｌ５０株と同様に、ビールから分離した、ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビスＬ５３株を使用する以外は、実施例１と同様に抗血清を取得し、ビール混濁能を有する菌に対して特異的に反応する抗血清を取得した（以下、この抗血清を「Ｌ５３抗体」という。）。また、Ｌ５３株を抗原として４羽のウサギに対して免疫を行い、そのすべてから同等の抗体が得られることを確認し、本発明の抗体が再現性よく調製しうることがわかった。
【００３５】
比較例１（ビール混濁能をもたない菌株による抗体の作成）
ビール混濁能をもたないラクトバチルス・ブレビスとして、上記ＪＣＭ１１７０株を抗原として、実施例１と同様な免疫操作で全採血を実施し抗血清を取得した（以下、この抗血清を「ＪＣＭ１１７０抗体」という。）。得られた抗血清は、ビール混濁能の有無にかかわらず、ラクトバチルス・ブレビスに属するすべての菌株に反応し、ビール混濁能のない菌による前記のような吸収処理を実施することはできなかった。
【００３６】
比較例２（嫌気条件下でグルコース資化能を有する菌株による抗体の作成）
ビール混濁能を有するが、嫌気条件下でグルコース資化能をも有するラクトバチルス・ブレビスＬ６３株を使用する以外は、実施例１と同様に抗血清を取得した（以下、この抗血清を「Ｌ６３抗体」という。）。得られた抗血清はＬ５０抗体に比べて、混濁能を有する乳酸菌の識別力が劣っていた。また、このＬ６３株菌を抗原として複数のウサギに免疫し、得られた抗血清について調べたところ、それぞれの個体によって抗血清の性能にバラツキがあり、Ｌ６３株を用いた場合は再現性が得られないことが判明した。
【００３７】
実施例３（本発明の抗体の特異的反応性）
ビール工場から分離されるラクトバチルス・ブレビスとペディオコッカス・ダムノサスとには、ビール混濁能を有する株とビール混濁能をもたない株が混在している。そこで、ビール工場から分離された、ラクトバチルス・ブレビスに属するビール混濁能を有する３４株とビール混濁能をもたない２０株を、またペディオコッカス・ダムノサスに属するビール混濁能を有する２０株とビール混濁能をもたない２０株のそれぞれを供試菌とし、実施例１、実施例２、比較例１及び比較例２で得られた抗体の、これら供試菌に対する特異性を凝集反応により確かめた。
【００３８】
凝集反応は次のようにして実施した。回転凝集板のウェルに１０２４倍又は６４倍に希釈した抗血清を１００μｌずつ入れ、そこに約０．２ｇ／ｍｌの濃度となるように生理食塩水で懸濁されたアルカリ処理済の菌体を４０μｌずつ添加した。凝集板をローテーターの上でゆるやかに７分間回転させ、菌体の凝集反応が見られるか否かを確認した。
【００３９】
上記４種類の抗体と上記ビール混濁能を有する供試菌及びビール混濁能をもたない供試菌との凝集反応の結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】

【００４１】
表１中、分母の数値は供試菌株数を表し、分子の数値は凝集反応陽性数を表している。表１から明らかなように、Ｌ５０抗体は、１０２４倍の希釈倍率の抗体でラクトバチルス・ブレビスを完全に識別し、他方、ビール混濁能をもたないラクトバチルス・ブレビスをも完全に識別した。また、Ｌ５３抗体は、１０２４倍の希釈倍率の抗体で、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビスを９７％という極めて高い確率で識別し、他方、ビール混濁能をもたないラクトバチルス・ブレビスの誤認率は５％という極めて低いものであった。
【００４２】
また、これらＬ５０抗体とＬ５３抗体は、６４倍の希釈倍率の抗体で、ビール混濁能を有するペディオコッカス・ダムノサスを完全に識別し、他方、ビール混濁能をもたないペディオコッカス・ダムノサスをも完全に識別した。
【００４３】
このような高い識別能力を有する、Ｌ５０抗体とＬ５３抗体とは、ビール工場の現場におけるビール混濁能を有する乳酸菌の検出において、充分実用に供しうるものである。
【００４４】
これに対し、比較例１のＪＣＭ１１７０抗体は、１０２４倍の希釈倍率の抗体で、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビスとビール混濁能をもたないラクトバチルス・ブレビスとを全く識別できなかった。
【００４５】
また、Ｌ６３抗体は、１０２４倍の希釈倍率の抗体で、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビスを７６％の確率で識別し、他方、ビール混濁能をもたないラクトバチルス・ブレビスの誤認率は１５％であり、この程度の識別能力の抗体は実用に供することができるものとはいえない。
【００４６】
実施例４（本発明の抗体の交差反応性）
上記Ｌ５０抗体とＬ５３抗体の２つの抗体について、ラクトバチルス・ブレビス及びペディオコッカス・ダムノサス以外の、ビール混濁能をもたない他の乳酸菌群との交差反応性についても調べた。抗体の希釈倍率については、ラクトバチルス属に対しては１０２４倍、それ以外に対しては６４倍で行った。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】

【００４８】
表２の「反応性」の項中、凝集反応が認められたものを「＋」、認められなかったものを「−」でそれぞれ示す。表２からもわかるように、これらＬ５０抗体とＬ５３抗体は、ビール混濁能を有するラクトバチルス・ブレビスＬ５０株とペディオコッカス・ダムノサスＢ２０株とのみ反応し、他のビール混濁能をもたない、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属及びロイコノストック属に属する乳酸菌とは反応しない。
【００４９】
実施例５（標識抗体を使用したビール混濁乳酸菌の特異検出法）
Ｌ５０株を抗原として得られた抗血清から、例えば「免疫化学実験法」（Ａ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｔｈｏｒｐｅ著 西村書店）に記載されているような常法にしたがってイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）を精製し、西洋ワサビペルオキシダーゼによって標識した。
【００５０】
一方、各種ラクトバチルス・ブレビス及びペディオコッカス・ダムノサスのそれぞれをビール中に懸濁し、ポリカーボネート製メンブレンフィルター（４７ｍｍ径、ポアサイズ、０．６μｍ、ニュークリポア社製）上に、１０個程度のコロニーが出現するように濾過し、ｍ−ＮＢＢ培地のプレート上で培養を行った。マイクロコロニーが出現した段階でフィルターを剥がし、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで１０分間処理した後、生理食塩水で洗浄した。このフィルターを免疫実験用ブロッキング剤「ブロックエース」（雪印乳業株式会社製）の原液１ｍｌで３０分間処理した。
【００５１】
このブロッキング処理済みのフィルターを、上記酵素標識されたＩｇＧの１０００倍希釈液（抗体濃度としては、約４μｇ／ｍｌ）１ｍｌで３０分間抗原抗体反応を行った。ＩｇＧの希釈には、生理食塩水で１０倍希釈したブロックエースを用いた。
【００５２】
この抗原抗体反応後のフィルターを、Ｔｗｅｅｎ２０の０．２％含有の１０倍希釈ブロックエースで洗浄後乾燥し、次いで、０．１％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ｐＨ７．２、Ｔｒｉｓバッファーで作製）と０．０２％Ｈ_２Ｏ_２との１：１混合液１ｍｌと反応させた。その結果、ビール混濁能を有する株のみ着色が認められた。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によると、製品ビール中で増殖し、ビールの混濁を引き起こし、ビールの品質を低下させる、ビール汚染菌の中で問題となっているビール混濁能を有する乳酸菌を、迅速・簡便かつ高精度で検出することができる。

Claims (10)

1. ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビス菌を抗原として用いて得られる乳酸菌検出用抗体。
2. 抗体が、抗血清又はその精製物である請求項１記載の乳酸菌検出用抗体。
3. 抗体が、ビール混濁能を有する乳酸菌と特異的に反応するものである請求項１又は２記載の乳酸菌検出用抗体。
4. ビール混濁能を有する乳酸菌が、ラクトバチルス・ブレビス又はペディオコッカス・ダムノサスに属する乳酸菌である請求項３記載の乳酸菌検出用抗体。
5. ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビス菌が、ラクトバチルス・ブレビスＬ５０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６８３）である請求項１〜４のいずれか記載の乳酸菌検出用抗体。
6. ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビス菌を抗原として用いて得られる抗体を使用することを特徴とするビール混濁能を有する乳酸菌の検出方法。
7. 抗体が、抗血清又はその精製物である請求項６記載の乳酸菌の検出方法。
8. 抗体が、ビール混濁能を有する乳酸菌と特異的に反応するものである請求項６又は７記載の乳酸菌の検出方法。
9. ビール混濁能を有する乳酸菌が、ラクトバチルス・ブレビス又はペディオコッカス・ダムノサスに属する乳酸菌である請求項８記載の乳酸菌の検出方法。
10. ビール混濁能を有し、かつ嫌気条件下でグルコース資化能をもたないラクトバチルス・ブレビス菌が、ラクトバチルス・ブレビスＬ５０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６８３）である請求項６〜９のいずれか記載の乳酸菌の検出方法。