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JP3509859B2 - 供与体−供与体エネルギー転移系を創製するための発色団および蛍光団でコンジュゲート化されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション - Google Patents

供与体−供与体エネルギー転移系を創製するための発色団および蛍光団でコンジュゲート化されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション

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JP3509859B2
JP3509859B2 JP50879393A JP50879393A JP3509859B2 JP 3509859 B2 JP3509859 B2 JP 3509859B2 JP 50879393 A JP50879393 A JP 50879393A JP 50879393 A JP50879393 A JP 50879393A JP 3509859 B2 JP3509859 B2 JP 3509859B2
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nucleic acid
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ヘラー，マイケル・ジェイ
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ナノトロニクス，インコーポレイテッド
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、直接導入された電子／光子転移の性質を有
する修飾化合成核酸ポリマー／オリゴマーの設計および
合成に関する。特に、本発明は拡張（延長）された指向
性の非放射性エネルギー転移（移動）の性質に関係す
る。これらの独特の成分を、さらに大きくさらに複雑な
構造に自己組立ておよび組織化するようにプログラムす
ることができる。これらの直接導入された電子／光子の
機能的性質は、これら組織化された構造内に関連および
新規な機序が形成されることを可能にする。これら性質
の組合せは、最終的に、有用な光子および光電装置、DN
Aバイオセンサー、ならびにDNA診断検定系の創製を可能
にする。
発明の背景 分子電子工学／光子工学およびナノテクノロジーの分
野、未来に対して大きな技術的有望性を与える。ナノテ
クノロジーは、対象を複雑かつ極めて小さな仕様に組み
立てる総合的能力に基づく計画された技術と定義される
［Drexler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5275−5278（19
81）］。ナノテクノロジーは、複雑な構造のあらゆる部
分を顕微鏡レベルに組織化および組立てるための、原子
による原子または分子による分子の制御を意味する。ナ
ノテクノロジーは、半導体や集積回路工業において使用
されている現在のリソグラフ技術のようなトップ−ダウ
ン方式とは対照的なボトム−アップ方式である。ナノテ
クノロジーの成功は、プログラムが可能な自己組立て分
子単位および分子レベルの機械的手段（いわゆる組立て
機であり、広範囲の分子構造および装置の構築を可能に
するものである）の開発にかかっていよう［Drexler,
「創造のエンジン」,Doubleday Publishing Co.,New Yo
rk,NY（1986）］。即ち、ナノテクノロジーにおける第
１のそして最も重要な目標の１つは、プログラムが可能
な自己組立て分子構築単位の開発である。
現在の分子の電子／光子技術には、様々の分野の科学
者および技術者の極めて多くの努力が含まれる［Carter
編，「分子性の電子装置II」中,Marcel Dekker,Inc.,Ne
w York,NY（1987）］。これらの分野には、有機ポリマ
ーに基づく整流器［Metzgerら，「分子性の電子装置I
I」中,Carter編,Marcel Dekker,New York,NY,pp.5−25
（1987）］、導電コンジュゲート化ポリマー［MacDiarm
iら,Synthetic Metals,18:285（1987）］、有機薄膜ま
たはLangmuir−Blogett膜の電子的性質［Watanabeら,Sy
nthetic Metals,28:C473（1989）］、電子移動に基づく
分子シフトレジスター［Hopfieldら,Science,241:817
（1988）］、および合成によって修飾された脂質（種々
に異なる「管状」微小構造を形成する）に基づく自己組
立て系［Singhら，「応用生物活性ポリマー物質」中,Pl
enum Press,New York,NY,pp.239−249（1988）］が含ま
れる。また、コンジュゲート化有機ポリマー［Bakerら,
Synthetic Metals,28:D639（1989）］および非直線性有
機材料［Potemberら,Proc.Annual Conf.IEEE in Medici
ne and Biology,Part 4/6:1302−1303（1989）］に基づ
く分子性の光学または光子装置も記載されている。
しかし、これら引用した文献のどれも、精巧なあるい
はプログラムが可能なレベルの自己組織化または自己組
立てを記載していない。通常、電子性および／または光
子性の機序を実施すること実際の分子成分は、天然の生
物学的タンパク質または他の分子である［Akaikeら,Pro
c.Annual Conf.IEEE in Medicine and Biology,Part 4/
6:1337−1338（1989）］。現在のところ、効率的な電子
性または光子性の構造、機序または装置を生み出す全合
成によるプログラム可能な自己組立て分子の例は存在し
ない。
生物学的な系における自己組立ての理解の進展がナノ
テクノロジーに関係している［Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,78:5275−5278（1981）;Drexler,「創造のエンジン
中,Doubleday Publishing Co.,New York,NY（198
6）］。大きく進展した分野には、光を採取する光合成
系、エネルギーを変換する電子輸送系、視覚過程、神経
伝達の機構、ならびにこれらの系を構成するタンパク質
成分の構造および機能が含まれる。いわゆるバイオチッ
プは、分子性の電子装置を構築するために、合成または
生物学的に改変したタンパク質を使用すると記載されて
いる［Haddonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1874−187
8（1985）;McAlearら，「分子性の電子装置II」中,Cart
er編,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.623−633（1
987）］。伝導性のネットワークを開発する目的で合成
タンパク質（ポリペプチド）に関するいくつかの研究が
行なわれている［McAlearら，「分子性の電子装置」中,
Carter編,Marcel Dekker,New York,NY,pp.175−180（19
82）］。他の研修者らは、核酸に基づくバイオチップが
さらに有望であろうと考えている「Robinsonら，「バイ
オチップの設計：自己組立て型の分子スケールの記憶装
置」,Protein Engineering,1:295−300（1987）］。
また、すべての生存生物における遺伝情報の担体であ
る核酸、デオキシリボ核酸またはDNAの構造および機能
の理解に多くの研究が為されている［Watsonら，「遺伝
子の分子生物学」中,Vol.1,Benjamin Publishing Co.,M
enlo Park,CA（1987）］。DNAにおいては、直線配列の
ヌクレオチド中の塩基単位アデニン、グアニン、シトシ
ンおよびチミジン（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ）によって情報
がコードされている。一本鎖のDNA（または、ポリヌク
レオチド）は、ハイブリダイゼーションによってその相
補性配列を認識して結合し、二本鎖の核酸二重構造を形
成する独特の性質を有している。これは、核酸の固有の
塩基対合の性質の故に可能となっている（ＡはＴを認識
し、ＧはＣを認識する）。ある任意のポリヌクレオチド
配列はその厳密な相補性配列にだけハイブリダイズする
ので、この性質は極めて高度な特異性を導く。
核酸の分子生物学に加えて、核酸の化学合成の分野で
も大きな進展が為された（16）。この技術が発展したの
で、現在では自動装置により、長さが100ヌクレオチド
を越える配列を15ヌクレオチド／時間の合成速度で効率
的に合成することができる。さらに、核酸を官能基（蛍
光団、発色団、親和性ラベル、金属キレート、化学的反
応性基および酵素を含む）で修飾するための多くの技術
が開発されている［Smithら,Nature,321:674−679（198
6）;Agarawalら,Nucleic Acids Research,14:6227−624
5（1986）;Chuら,Nucleic Acids Research,16:3671−36
91（1988）］。
核酸の合成および修飾の両方の進展の勢いは、臨床診
断検定において、DNAプローブ診断とも呼ばれる分野に
おいてこれらを利用する可能性を開いた。DNAプローブ
診断検定系に感度の高い蛍光検出の性質を付与するため
の検討において、単純な光子機序が修飾化オリゴヌクレ
オチド中に導入されている。この方法には、Ｆrster
（フェルスター）の非放射性エネルギー移動を行なう蛍
光団および化学発光ラベルされたオリゴヌクレオチドが
包含される［Hellerら，「感染性物質の迅速な検出およ
び同定」中,Kingsburyら編,Academic Press,New York,N
Y,pp.345−356（1985）］。Ｆrsterの非放射性エネル
ギー移動は、ある波長に励起された蛍光供与（Ｄ）基が
その吸収したエネルギーを共鳴双極子カップリング過程
によって適当な蛍光受容（Ａ）基に移動させる過程であ
る。適当な供与基と受容基の間のエネルギー移動の効率
は、1/r6の距離依存性を有している［Lakowiczら，「蛍
光分光学の原理」中,Plenum Press,New York,NY,第10
章,pp.305−337（1983）を参照］。
Hellerら（上記）の研究において、相補性標的核酸鎖
の隣接位置に結合またはハイブリダイズし、次いで受容
体による再放射の見地から効率的な蛍光エネルギー移動
を生じるように、２つの蛍光団ラベルしたオリゴヌクレ
オチドを設計している。第１のオリゴヌクレオチドは3'
末端位置が適当な供与基でラベルされており、第２のオ
リゴヌクレオチドは5'末端位置が適当な受容基でラベル
されている。相補性配列への結合またはハイブリダイゼ
ーションにより、蛍光供与基と蛍光受容基が最も効率的
なＦrsterの非放射性エネルギー移動のための最適距
離（理論的に）となるようにこれらを配置する。しか
し、受容体による再放射の見地からの観察されたエネル
ギー移動効率は、この特定配列に対しては、比較的低い
ものであった（-20％）。
その後の研究［Hellerら、欧州特許出願No.EPO 02299
43（1987）；およびHellerら、US特許4,996,143（1991
年２月26日）］において、合成化学の進歩が、リンカー
アームで修飾されたヌクレオチドを用いてオリゴヌクレ
オチド配列内のあらゆる位置に蛍光団を結合させる方法
を与えた。また、この合成結合法を用いて、同じオリゴ
ヌクレオチド内に供与および受容の両方の蛍光団を導入
することが可能になった。特定のリンカーアームを用い
て、最も効率的なエネルギー移動（受容体による再放射
の見地から）は、供与体と受容体が５個の介在ヌクレオ
チド単位を隔ててまたは約1.7ナノメーター（nm）離れ
て位置しているときに生じることがわかった。さらに、
Hellerら（US特許4,996,143）は、ヌクレオチドの間隔
が４から０単位（1.4nmから0nm）に減少するにつれてエ
ネルギー移動効率も減少し、これがＦrsterの理論に
従わないものであることを示した。また、ヌクレオチド
間隔が６から12単位（2nmから4.1nm）に増加するにつれ
てエネルギー移動効率が減少し、これはＦrster理論
に従うことがわかった。その当時、何故さらに近く配置
された供与体と受容体の配列がエネルギー移動効率の減
少を示し、Ｆrster理論に従わないのかについては、
説明も理解もされなかった。特に、Hellerらの教示は、
＞5nmのＦrster距離を越える供与体からの拡張された
エネルギー移動および複数の供与体共鳴に向けられたも
のではなかった。
蛍光エネルギー移動は、免疫診断および液体クロマト
グラフィー分析を含む他の分野において利用されている
［Morrisonら,Anal.Biochem.,174:101−120（1988）；
およびGarnerら,Anal.Chem.,62:2193−2198（199
0）］。また、核酸における単純な蛍光供与／受容エネ
ルギー移動の最初の証明の一部は、他の研究者によって
後に確認された［Cardulloら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
85:8790−8794（1988）；およびMorrisionら,Anal.Bioc
hem.,183:231−244（1989）］。Cardulloらの研究にお
いて、２つの短い（12マー）オリゴヌクレオチド配列
（それぞれはローダミン受容体で末端ラベルされ、相補
性の29マー配列にハイブリダイズされている）をいくつ
かの挿入供与体（アクリジンオレンジ）と結合させた配
列を研究している。Cardulloによって記載された配列
は、追加の供与体によるある程度の追加のエネルギー移
動を示す。しかし、このエネルギー移動効率の増加は、
供与体のどれも効率的な移動のために必要なＦrster
距離を越えて機能するとは記載されていないので、直接
の供与体から受容体への移動に完全に一致している。現
在まで、複数の供与体からのそして通常のＦrster距
離を越えた受容体への拡張（延長）されたエネルギー移
動が可能な組織化された構造に関する記載は全く存在し
ていない。
発明の要約 本発明は、機能的な電子／光子の性質が直接導入され
た修飾化合成核酸ポリマー／オリゴマーの設計および合
成に関する。特に、本発明は、拡張された非放射性エネ
ルギー移動過程の性質を合成核酸の配列中に導入するこ
とに関する。
ここに、通常のＦrster距離を越えて（＞5nm）配置
された複数の発色団供与基を配列させて末端の受容基に
光子エネルギーを吸収および移動させることができ、こ
れによりそれが光アンテナまたは光子伝導体として作用
することを発見した。この性質は、配列させた供与基が
ある波長（hv1）の光子エネルギーを吸収し、結合した
共鳴過程によってそれを受容基に指向的に移動させ、次
いでそれがさらに長い波長（hv2）の光子エネルギーと
して再放射されうることに関係している。特別の供与発
色団基（非蛍光発色団を含む）を適切な受容蛍光団と共
に選択および相対配置させることにより、独特の性質を
有する効率的な拡張されたエネルギー移動過程が導かれ
る。さらに、１次供与基を受容基に極めて近接して設置
することを可能にするオリゴヌクレオチドおよびポリヌ
クレオチドの適切な設計が見い出された。
機能的な分子成分（発色団）の相対位置をヌクレオチ
ド配列上でのそれらの配置によってプログラムすること
ができるので、発色団を含有する核酸をさらに大きくさ
らに複雑な規定された構造に自己組立ておよび組織化す
るように設計することができる。これら分子成分のプロ
グラム可能性および機能的な電子／光子の性質は、連
結、増幅機序、およびアンテナ配列が核酸構造内に形成
されることを可能にする。これら性質の組合せは、最終
的に、光子装置、光電装置、バイオセンサー、ならびに
均一および不均一DNA診断検定の創製を導く。
従って、本発明は、リンカーアームによってポリヌク
レオチドに機能的に結合させた少なくとも２つ（複数）
の供与発色団を有するポリヌクレオチドであって、これ
ら発色団が供与体−供与体移動距離（エネルギー移動が
２つの供与体分子間で起こり得る距離）でポリヌクレオ
チドの長さに沿って結合により配置されているポリヌク
レオチドを記述するものである。通常、供与発色団は非
蛍光性の発色団である。
このポリヌクレオチドは、リンカーアームによって該
ポリヌクレオチドに機能的に結合させた蛍光性の受容発
色団であって、複数の供与体が励起光を集め、それを受
容体に移動させ、次いで受容体が集めた光を再放射する
ことができるように供与発色団からの供与体−受容体移
動距離（エネルギー移動が供与体と受容体分子間で起こ
り得る距離）で結合により配置されている蛍光性の受容
発色団をさらに含有することができる。
別の態様においては、ハイブリダイゼーションしたと
きに受容蛍光性発色団が少なくとも１つの供与発色団に
対して供与体−受容体移動距離になるように、１を越え
るポリヌクレオチド上に供与発色団と受容発色団を表出
させることができる。即ち、ポリヌクレオチドの組合せ
は、予め選択した配列ならびに必要な供与および受容発
色団（本明細書に記載した様々な用途に適合させること
ができる）を含むことが意図されている。
例えば、上記のような供与体−供与体移動が可能なポ
リヌクレオチドを含有する診断検定系が記載されてい
る。この系は、別のポリヌクレオチド上に存在する受容
発色団を利用することができるし、また、この受容発色
団は供与発色団と同じポリヌクレオチド上に存在するこ
とができる。
ポリヌクレオチドの配列を相補性ハイブリダイゼーシ
ョンのために選択し、供与体−供与体移動および最終的
な供与体−受容体移動が可能なさらに大きな構造の組立
てを容易にすることができる。また、ポリヌクレオチド
の配列を標的核酸配列に相補性であるように選択して、
これらポリヌクレオチドを診断に用いて試料中の標的配
列を検出するようにすることができる。
他の態様においては、本発明は、通常の相補性ヌクレ
オチド塩基ハイブリダイゼーションによって共にハイブ
リダイズした少なくとも２つのポリヌクレオチドからな
る核酸二本鎖の形態の構造を記述する。複数のポリヌク
レオチドをハイブリダイズさせて図３に示すような二本
鎖を形成させることができる。これらポリヌクレオチド
は機能的に結合した供与および受容発色団を含有してお
り、開示した供与体−供与体および供与体−受容体エネ
ルギー移動が起こりうるさらに大きな構造を与える。こ
れら発色団は二本鎖構造の１本の鎖にそって配列させる
ことができるが、エネルギー移動が二本鎖の鎖の間を交
互に変わるように配置するのが好ましい。
さらに、リンカーアームによってポリヌクレオチドに
機能的に結合させた少なくとも２つの供与発色団を有す
る本発明のポリヌクレオチド（ここで、これら発色団は
供与体−供与体移動距離でポリヌクレオチドの長さに沿
って結合により配置されている）および光子エネルギー
感知装置からなるバイオセンサー装置が意図されてい
る。このバイオセンサーは、リンカーアームによってポ
リヌクレオチドに機能的に結合させた少なくとも１つの
蛍光性受容発色団であって、供与発色団の少なくとも１
つからの供与体−受容体移動距離で結合により配置され
ている蛍光性受容発色団を有している。さらに、供与発
色団の励起により受容発色団から放射される光子エネル
ギーを感知手段が検出できるように、上記ポリヌクレオ
チドを感知手段に隣接して検出可能に配置する。
別の態様において、本発明は、核酸を含有する試料中
の予め選択した核酸配列の存在を検出するための方法で
あって、本発明の１またはそれ以上のポリヌクレオチド
をプローブとして使用することからなり、ハイブリダイ
ゼーション現象を示すための検出可能な蛍光受容体放射
を生じさせるために本明細書中に記載のエネルギー移動
系に基づく方法を意図するものである。
他の態様は本明細書中の開示に基づいて明らかとなる
であろう。
図面の簡単な説明 本開示の一部を構成する図面において、図１は、相補
性の標的核酸鎖（標的配列：配列番号３）上の隣接位置
に結合またはハイブリダイズさせるために、どのように
２つの発色団ラベルしたオリゴヌクレオチド（供与オリ
ゴマー：配列番号１、および受容オリゴマー：配列番号
２）を設計するかを示すものである。標的配列への結合
またはハイブリダイゼーションは蛍光供与基と蛍光受容
基を予め選択した供与体−受容体移動距離に接近させ、
これにより、この系をhv1の光子エネルギーで照射した
ときに供与基がこのエネルギーを吸収し、これを非放射
性エネルギー移動（）によって受容基に移動させ、こ
の受容基がhv2でそれを再放射する。照射および放射光
子は波線の矢印で示す。正確なヌクレオチド配列ならび
に供与基および受容基の位置は、この図の上部の未ハイ
ブリダイズ（または、解離）の系で示す。ハイブリダイ
ズした図（または、会合した系）は、この図の下部に平
易にするために図示している。
図2Aは、鋳型DNAオリゴマーにハイブリダイズまたは
会合した１本のDNAポリヌクレオチド鎖に導入されてい
る複数の供与基（Ｄ）と１個の受容基（Ａ）を図示する
ものである。図2Bは、鋳型DNAポリマー上の組織化され
た構造中に組立てられた複数の供与DNAポリマーと受容D
NAポリマーを示す。
図３の上部は、４つのオリゴヌクレオチド:16マーの
受容体単位（AU）、30マーの中間供与体１単位（ID
1）、29マーの中間供与体２単位（ID2）、および末端供
与体単位（TD）から組立てられ組織化された実施例１に
記載した例示の14nm光子アンテナ構造を図示するもので
ある。この図の下部は、この組立てた構造を495nmの光
で照射したときの延長されたエネルギー移動を示す。波
線は照射または放射光子を示し、点線の矢印（）は延
長されたエネルギー移動過程の方向を示す。
図４は、実施例３に記載した延長されたエネルギー移
動に基づく均一DNAハイブリダイゼーション検定法を示
す。示したポリヌクレオチドには、複数の供与体を含有
するオリゴマー（MDO）、受容体オリゴマー（AO）、ク
エンチャー（消光）オリゴマー（QO）、および標的DNA
が含まれる。図4Aは、標的DNAを変性する前の均一系を
示す。受容体基はクエンチャー基の基部にあり、従って
受容体からの放射が消光されることに注意すべきであ
る。図4Bは、標的DNAを変性した後の均一系を示すもの
であり、これにより、複数の供与体および受容体オリゴ
マーが標的DNAの特定のプログラムされた相補性部位に
ハイブリダイズして、延長されたエネルギー移動が可能
な構造を生成する。
発明の詳細な説明 A.発色団含有ポリヌクレオチド 本発明は、機能的な電子／光子の性質を直接組み込ん
だ修飾合成核酸ポリマー／オリゴマーの設計および合成
に関する。固有の認識特性（すなわち、相補的ハイブリ
ダイゼーション）を有する合成核酸は、電子的および光
子的構造ならびに装置へと自己組織化し得る分子成分を
構築するための理想的な物質である。
１つの態様において、本発明は、受容体発色団基およ
び１またはそれ以上の第一の供供与体発色団をＦrste
r距離内（＜5nm）に有し、少なくとも２つの供与体発色
団または好ましくは複数の発色団が通常のＦrster距
離を越えて（＞5nm）位置するポリヌクレオチドを意図
している。受容体および供与体発色団をリンカーアーム
によりポリヌクレオチドに機能的に結合させ、この発色
団がポリヌクレオチドの全長に沿って本発明の開示によ
り説明される共鳴エネルギー転移のために有効な供与体
−供与体転移距離（1.4nm〜6.1nm）に位置するようにす
る。
本明細書中で説明するポリヌクレオチドを形式化して
種々の配置において用いることができる。供与体発色団
を１個のポリヌクレオチド上に存在させることができ、
受容体発色団を予め選択されたハイブリダイゼーション
現象によってのみ供与体−受容体転移距離中にもたらさ
れる別個のポリヌクレオチド上に存在させることができ
る。または、受容体発色団を同じポリヌクレオチド上に
１またはそれ以上の供与体発色団と共に存在させること
ができる。
１つの態様において、ポリヌクレオチドはリンカーア
ームにより該ポリヌクレオチドに機能的に結合された少
なくとも２つの供与体発色団を有し、該供与体発色団は
ポリヌクレオチドの全長に沿った結合により本明細書中
に定義される供与体−供与体転移距離に位置する。好ま
しい供与体−供与体転移距離は約1.4〜約6.1ナノメータ
ーである。
このポリヌクレオチドは他の核酸配列に相補的になる
よう選択された予め決定された配列を有し、これにより
ポリヌクレオチドを含有している発色団を（１）ハイブ
リダイゼーション工程により互いに自己組み立てして、
組織化された光子または電子的構造を固体支持体または
薄いフィルム例えばガラス、シリコン、ゲルマニウム、
ヒ化ガリウム、ポリマー、防腐剤、ラングミュア・ブロ
ジェット液などの上に形成させるかまたは（２）溶液中
もしくは固体支持体もしくは薄いフィルム物質に結合し
た予め選択された標的核酸配列に結合させることをプロ
グラムすることができる。
１つの態様において、末端または中心のポリヌクレオ
チドはリンカーアームにより該ポリヌクレオチドに機能
的に結合された少なくとも１個の蛍光性受容体発色団を
さらに含有し、該蛍光性受容体発色団は結合により少な
くとも１個の第一のまたは主要な結合供与体発色団から
約0.1nm〜約1.7nmの供与体−受容体転移距離に位置す
る。これらの配置は、本発明により説明される拡張され
た非放射性エネルギー転移をし得る組織化構造をもたら
す。
本発明の目的のために、別のように記述しない限りは
「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」または「ポリ
ヌクレオチド」の用語は、通常、DNA、RNAまたは全体と
して合成工程により製造される修飾配列を包含する一本
鎖核酸ポリマーの形態の核酸を意味するであろう。技術
的に、長さが２〜50ヌクレオチドの比較的短い配列はオ
リゴヌクレオチドまたはオリゴマーと称し、比較的長い
配列（＞50ヌクレオチド）はポリヌクレオチドと称す
る。しかし、該用語は両方とも核酸ポリマーを示すか
ら、本発明のためにこれら用語をその範囲において若干
交換可能に用いる。
転移構造における複数の供与体および受容体を方向付
ける配列を供給するための支持体構造としての合成DNA
の重要な利点は：（１）２〜150ヌクレオチド単位（0.7
nm〜50nm）の長さの、自動装置による迅速な合成；
（２）それらのヌクレオチド配列による高い特異性を有
するプログラム可能な認識；（３）蛍光団、発色団、親
和性ラベル、金属キレートおよび酵素による容易な修
飾；（４）それらの配列におけるあらゆる位置および塩
基単位内のいくつかの場所での修飾可能性；（５）異な
る性質を生み出す（例えば、通常は負に荷電されたDNA
を中性の形態に作成することができる）ための修飾可能
な背骨構造；（６）固体表面：ガラス、金属、シリコ
ン、有機ポリマーおよびバイオ−ポリマーへの共有的お
よび非共有的両方の結合可能性；（７）可逆的な組織化
特性；（８）３次元および分岐構造を形成する能力およ
び（９）良く理解され容易にモデル化される構造的およ
び組織化特性である。
1.拡張されたエネルギー転移 本発明に関する特に機能的な電子的／光子的性質は非
放射性（Ｆrster）エネルギー転移工程である。基本
的なＦrsterエネルギー転移工程は、１波長（hv1）で
光子エネルギーを吸収し、それを非放射性双極子結合工
程を通じて比較的長い波長（hv2）で光子エネルギーを
再放射する受容基に転移する供与基の能力に関与する。
エネルギー転移効率は以下の式において与えられるパラ
メーターに依存する： Ｅ＝R0 6/（R0 6＋r6） （１） R0＝9.8×103（k2n-4OdJ）（Ａ中） （２） ［式中、Ｅ＝転移効率、ｒ＝供与体と受容体の間の距
離、ｋは双極子配向因子、ｎは媒体の屈折率、Odは供与
体の量子収量、そしてＪは供与体放射と受容体吸収の間
の重なりの程度を表す重なり全体］。他の全てのパラメ
ーターが最適であるなら、高い効率のエネルギー転移が
起こるために1/r6依存は供与体から受容体への距離が2n
m（20Å）以下であることを必要とする。表１は供与体
（Ｄ）から受容体（Ａ）への距離範囲が０〜4.5nmであ
る場合の通常のＦrsterエネルギー転移（ET）による
理論的エネルギー転移効率を示す。
図１は、２つの蛍光団−ラベル化オリゴヌクレオチド
（供与体および受容体）を相補的標的核酸鎖の隣接位置
に結合またはハイブリダイズさせ次いで効率的な蛍光エ
ネルギー転移を生じさせるよういかに設計するかを示し
ている。エネルギー転移工程についての相対的な効率
を、２つの非常に単純化された方法で表すことができ
る。第一の方法は転移されるエネルギーと供与体により
吸収されるエネルギーの比によるものであり；これは受
容体の存在下で発生する供与体の蛍光消光の相対的な量
を測定することにより決定される。第二の方法は受容体
により再放射されるエネルギーと供与体により吸収され
るエネルギーの比による相対的な効率を表すものであ
り；これは供与基による受容体蛍光の相対的な増加を測
定することにより決定される。両法はエネルギー転移効
率の相対的な測定であると見なされる一方で、供与体か
ら受容体へのエネルギーの効率的な転移（供与体消光と
して見られる）は必ずしも受容体による再放射に対して
同じ効率を導かない。これは第二の工程（受容体消光）
が受容体にそのエネルギーを再放射による以外に放散さ
せる場合に起こる。
拡張されたエネルギー転移は、１の波長（hv1）で複
数の供与基が光子エネルギーを吸収する工程であり、エ
ネルギーを受容基に指向的に転移させることのできる結
合された共鳴構造を形成する。次いで、共鳴エネルギー
を波長（hv2）で光子エネルギーとして再放射する。hv1
が非飽和である条件下で、光子エネルギーを供与基の配
列により集めて適当な受容体に指向的に転移させ、hv2
でその蛍光放射を大きく高めることができる。これは分
子アンテナまたは増幅器機構とみなすことができる。ま
たは、光子エネルギー（hv1）を構造の一端で供与基に
より集めて、供与体の直線配列により該構造の他方の端
の受容基に転移させ、そこでhv2として再放射すること
ができる。この型の分子光子転移機構は光子ワイヤーま
たは連結器の同等物とみなすことができる。さらにこれ
ら機構を用いて異なる分子構造を相互連結し、分子構造
を表面に連結し、表面（単層）間の分子連結を作成する
ことができる。
従って、供与体発色団間の距離を選択して供与体−供
与体転移距離を得るが、この距離は該転移が非放射性エ
ネルギー転移であることを示す。同様に、末端供与体発
色団と受容体発色団の間の距離を選択して供与体−受容
体転移距離を得るが、この距離は供与体による転移が非
放射性であることを示し、蛍光受容体発色団の励起およ
び続いて受容体からの放射スペクトルを与える。
2.発色団および蛍光団 本発明の新規な部分は、双極子結合によりエネルギー
を転移し得る適当な供与体と受容体の対を形成するため
の特別な発色団および蛍光団基の選択および配置に関す
る。
発色団とは、有利な吸収特性を有する、すなわち任意
の種々の光子源による放射により励起し得る基を意味す
る。発色団は蛍光性であるかまたは非蛍光性であってよ
い。非蛍光発色団は通常、光子エネルギー（hv2）の形
態にあるエネルギーを放射しない。ゆえにこれらの発色
団は低い量子収量を有することを特徴とすることがで
き、この量子収量は放射光子エネルギーの吸収光子エネ
ルギーに対する比であって、通常0.01より小さい。蛍光
発色団は蛍光団と称し、通常は0.01〜１の中〜高量子収
量で光子エネルギーを放射する。
本発明にとって特に重要であるのは、非蛍光発色団、
例えば４−ジメチルアミノフェニル−アゾフェニル−4'
−イソチオシアネート（またはDABITC）が有効なエネル
ギー転移供与基として機能し得ることである。これら発
色団供与基が適当な受容基に非常に近い（0.1nm〜1.7n
m）場合には、これら供与基は受容体による有意な蛍光
再放射を生じさせる。適当な受容体発色団にエネルギー
を転移し得る発色団は本明細書中で供与発色団または供
与体と称する。
本発明の目的のための１つの受容体発色団は蛍光団で
あり、これは供与体発色団からのエネルギー転移を受容
して放射スペクトルを生じることができる。双極子結合
によるエネルギー転移は、供与体の放射スペクトルと受
容体の励起スペクトルに重なりがある場合に通常生ずる
ことができるから、「適当な」受容体は通常はその対応
する適当な供与体よりも比較的長い波長に励起スペクト
ルを有する。この点において、供与体放射と受容体励起
スペクトルを重ね合わせることに基づいてエネルギーを
転移させる能力のために供与体および受容体を対合させ
ることができる。ゆえに、２つの発色団が異なる放射ス
ペクトルを有し、エネルギー転移を遂行するための十分
重なり合う供与体放射および受容体励起スペクトルを有
している限り、潜在的にあらゆる発色団を別の発色団と
対合させて、受容体−供与体対を形成することができ
る。
受容基における蛍光再放射を生じる非蛍光供与体は非
常に価値のある特性である。本発明の組成物における非
蛍光供与体は、供与体による放射の程度が低いかまたは
欠如した特別の利点を提供し、そのため供与体−受容体
系におけるバックグラウンドまたは検出可能な放射光に
寄与しない。従って、非蛍光供与体は非常に低いバック
グラウンドを可能にするものであり、特に好ましい。
このような非蛍光発色団からなる複数の供与体系は、
固有の蛍光バックグラウンドをほとんど有さないであろ
う。この性質は、DNA診断アッセイ適用における蛍光エ
ネルギー転移の実際の使用を非常に制限していた主な限
界を克服する。さらにこれに、より有用な光子機構およ
び適用を創造する機会を開く。
受容体における独特の性質に関して、最も高い量子収
量を有するかまたは特異的な受容体放射と供与体に帰属
されるバックグラウンド（非特異的）放射の間のシグナ
ル対ノイズ比を増大させる別の性質を有する受容体が最
も好ましい。シグナル対ノイズ比を減少させるアプロー
チの例には、比較的低い放射を有する供与体、好ましく
は非蛍光供与体の使用、供与体と受容体の放射スペクト
ルの間のスペクトル距離が最大化される受容体−供与体
対の選択（好ましくは重なり合わないよう選択される）
などの本明細書中でさらに説明するアプローチが含まれ
る。
表２は、本発明において開示される新規な拡張エネル
ギー転移機構および適用のための供与体、受容体および
消光物質として用いることのできる可能性のある発色団
および蛍光団の一部を列挙するものである。このリスト
は排他的であることを意図しておらず、これら独特で望
ましい性質を与え得る供与体、受容体および消光物質の
ある種の具体的な型またはクラスを確認するものであ
る。
特に好ましい供与体発色団は、4,4'−ジイソチオシア
ナトジヒドロ−スチルベン−2,2'−ジスルホン酸、４−
アセトアミド−4'−イソチオシアナト−スチルベン−2,
2'−ジスルホン酸、4,4'−ジイソチオシアナトスチルベ
ン−2,2'−ジスルホン酸、スクシンイミジルピレンブチ
レート、アクリジンイソチオシアネート、４−ジメチル
アミノフェニルアゾフェニル−4'−イソチオシアネート
（DABITC）、ルシフェルイエロー（Lucifer Yellow）ビ
ニルスルホン、フルオレセインイソチオシアネート、リ
アクティブレッド４（Reactive Red4）（Cibacron Bril
liant Red 3B−Ａ）、ローダミンＸイソチオシアネー
ト、テキサスレッド（Texas Red）（スルホローダミン1
01、塩化スルホニル）、マラカイトグリーンイソチオシ
アネートおよびIR1446からなる群から選択される。例示
的な供与体発色団を実施例で説明する。
特に好ましい蛍光受容体発色団は、ピレン、ルシフェ
ルイエロー、アクリジン、リボフラビン、フルオレセイ
ン、ローダミン、スルホローダミン101、テキサスレッ
ドおよびIR144からなる群から選択される。例示的な蛍
光受容体発色団を実施例で説明する。
また、本発明のための有用な供与体または受容体発色
団として意図されるものには、励起された電子などの電
子シグナルが供与体−供与体転移系に入り、次いで共鳴
エネルギーとして受容体へと転移されて電子シグナルと
して系を出るのを可能にするであろう発色団、誘導体ま
たはそれらの組み合わせが含まれる。換言すれば、本発
明の供与体−供与体−受容体転移系に入りそしてそこか
ら出る、またはその両方のための機構は、電子エネルギ
ーを転移系の共鳴エネルギーに変換（そして再び戻す）
して転移系が電子回路に伝達するために適応される発色
団を必要とする。この方法において、本発明の拡張され
たエネルギー転移系は電子コネクターまたはシグナル導
管として機能することができる。電子エネルギーと共鳴
エネルギーの間の可能な変換器には発光化合物、例えば
ルテニウム複合体、光電池などが含まれるが、これらに
限定はされない。
3.供与体および受容体対配置 表２に列挙した発色団および蛍光団から、効率的な拡
張されたエネルギー転移過程および新規な光子機構を生
じるであろう多くの供与体／受容体配置または配列を作
成することができる。表２に示すこれらの配列には次の
ものが含まれる： （１）エネルギー１個または比較的少数の受容基に転移
させる複数の供与基（蛍光および非蛍光）の配列。通常
は、複数の供与体が１個の受容基に転移させるが、ある
種の条件下および特定の光子機構については１以上の受
容基を用いることもある。好ましい配列は非蛍光供与体
を含むものであり、これは低バックグラウンドの拡張さ
れたエネルギー転移工程という重要な利点を提供する。
他の好ましい配列には可視領域において励起される複数
の蛍光供与体が含まれ、これは赤外線領域において再放
射する受容体に転移させる。これは、可視領域において
生じる蛍光バックグラウンドにはるかに非感受性である
光電子工学装置により赤外線放射を検出することができ
るから、有用な機構である。
（２）複数の供与基（蛍光および非蛍光）がhv1で光を
吸収して中間の供与体−受容体に転移させ、これが次い
で最終の受容基へと転移させ、この供与基がhv2で再放
射する配列。これら配列は、系の励起波長（hv1）と放
射波長（hv2）の間の大きなストークス・シフトを生じ
るという利点を有している。これは、励起と放射の分離
が大きいほど系に対する蛍光バックグラウンドが低くな
るので重要である。例示的な配置を表３に示し、表中３
つの発色団を連続して示す。好ましい配列は、非蛍光ま
たは蛍光供与体から赤外線領域中に再放射する受容体へ
と転移させる配列である。好ましい態様においては、IR
144（Kodak Laer Dye）、可視領域において励起される
供与体からの励起エネルギーを受容し次いで赤外線領域
において再放射する発色団の使用を意図している。
（３）受容基による蛍光放射を防ぐために強い消光特性
を有するある種の発色団基を用いる特別配列。この態様
において、本発明は消光物質発色団（または消光物質）
の使用を意図しており、これは双極子結合によるエネル
ギーの転移を受容する受容体のような能力を有するが有
意な放射を有さない。性質が非蛍光供与体と似ている
が、消光物質の用語は、励起された受容体からエネルギ
ーポテンシャルを引き離して、受容体が放射しない、す
なわち受容体が消光されるように形成された非蛍光発色
団を意味している。本発明の複数の供与体オリゴヌクレ
オチドとの組み合わせにおいて消光物質発色団を用いる
例示的な配置を実施例３および図４に説明する。
消光発色団へのエネルギー転移のための機構は供与体
−供与体または供与体−受容体転移、すなわち双極子結
合のための機構と同じであり、このため転移距離および
最適な対合配置に関して本明細書中に説明するものと同
じ必要条件に従う。消光に適した例示的な非蛍光発色団
はリアクティブレッド４またはマラカイトグリーンであ
るが、これはこれら物質が検出可能な放射を有さず、ス
ペクトルの「赤」端に位置していることを理由としてお
り、ゆえに受容体が放射する前にエネルギーを受容体か
ら受容する（消光する）ために種々の受容体発色団に比
べてこれらを選択することができる。好ましい配列は非
蛍光発色団についてはリアクティブレッド４またはマラ
カイトであり、これらはテキサスレッド受容基における
蛍光を消光する。
上で説明した供与体、受容体および消光基の様々な配
列および配置は、それらを１個のDNAポリマー内に組み
込むか、またはDNA鋳型を用いて複数の供与体DNAポリマ
ー、受容体DNAポリマーおよび消光DNAポリマーの様々な
組み合わせを組み立てることによりなし遂げることがで
きることを示すことは重要である。両方の型の配置を図
２に図式的に示す。
第一の「供与体から受容体」対の最適な配置または間
隔、これによる供与体−受容体転移距離の形成に関し
て、Ｆrster転移に対する基本的な1/r6距離依存性
は、効率的な（80〜100％）エネルギー転移が起こるた
めに基の間に０〜5nmの間隔、好ましくは約0.1nm〜約1.
7nmの間隔を必要とする。１本および二本鎖DNAポリマー
におけるヌクレオチド間隔に関しては、この最適転移距
離は０〜５ヌクレオチド単位におよそ相当する。比較的
短い分離距離で効率は理論的に100％に近づくことがで
きる。＞4.0nmまたは12ヌクレオチド単位の距離で、エ
ネルギー転移効率は20％より低い。第一の供与体の受容
体への結合については、近接した間隔設定（０、１また
は２塩基対）を実行することができるが、最適なエネル
ギー転移へと基を配向させていかなる第二の消光機構ま
たは励起捕捉も排除する特別のリンカーアーム作用を必
要とする。
複数の供与体配列における「供与体から供与体」対の
最適な配置または間隔、これによる供与体−供与体転移
距離の形成について、近すぎる間隔での複数の供与体の
組み込みは、高い特異性でハイブリダイズするDNAの能
力に干渉し得る。さらに、供与体−供与体対の近接した
間隔は、エネルギー転移効率を大きく減少させ得る第二
の消光機構または励起捕捉をいずれ導入する可能性があ
る。現在、ポリヌクレオチド配列を内部および末端位置
で修飾するための最も利用可能な化学的物質は、約４〜
約18ヌクレオチド単位（1.4nmから6.1nm）の供与体−供
与体間隔設定を適度に長い距離にわたってなし遂げるの
を可能にする。これは50ヌクレオチドの１個のオリゴヌ
クレオチド配列中に約10供与体が組み込まれ得ることを
意味するであろう。相補的な複数の供与体ポリヌクレオ
チドのハイブリダイゼーションが、ここで４〜９ヌクレ
オチド単位の間隔をとる供与体を有する交互になってい
る二本鎖構造を生じる場合には、８〜18ヌクレオチド単
位の比較的長い間隔の間隔設定を用いることができる。
これらの交互になっている供与体型の構造は合理的な転
移効率を維持し、第二の供与体−供与体消光を減少さ
せ、ハイブリダイゼーションおよび組織化された構造の
安定性への干渉が比較的少ない。
消光が望ましい性質である場合においては、消光基と
受容基の間を０〜５ヌクレオチド単位（0.1nm〜1.7nm）
の間隔にすることができる。消光体−受容体、供与体−
受容体、ならびに供与体−供与体対を二本鎖DNA構造の
交互の側に位置した基の間に形成することができること
を留意すべきである。
4.オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成お
よびラベル化 オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列の合
成は、ポリヌクレオチドの新たな化学合成を含む任意の
種々の方法を用いて、例えば現在利用可能な自動DNA合
成装置および通常のホスホロアミダイト化学により、ま
たはゲノム、プラスミドもしくは他のベクター中に遺伝
子もしくは遺伝子の一部として存在する天然の核酸配列
からの核酸フラグメントの誘導化、例えば比較的大きな
二本鎖核酸の制限エンドヌクレアーゼ消化および鎖分離
により、または核酸鋳型を用いる酵素的合成により行う
ことができる。
ポリヌクレオチドの新たな化学合成は任意の適当な方
法、例えばホスホトリエステルまたはホスホジエステル
法を用いて行うことができる。Narangら［Meth.Enzymo
l.,68:90（1979）］；米国特許番号4,356,270;Itakura
ら［Ann.Rev.Biochem.,53:323−56（1989）］およびBro
wnら［Meth.Enzymol.,68:109（1979）］を参照。
核酸からのポリヌクレオチドの導出には、クローニン
グベクターによる適当な宿主への核酸のクローニング、
ベクターの複製およびこれによるクローン化された核酸
の量の増大、次いでクローン化された核酸のサブフラグ
メントの単離が含まれる。
核酸フラグメントのサブクローニングの説明について
は、Maniatisら［「分子クローニング：実験室マニュア
ル」,Cold Spring Harbor Laboratory,pp390−401（198
2）］および米国特許番号4,416,988および4,403,036を
参照。
好ましい態様において、Applied Biosystems Model
＃381 DNA合成装置および市販品として入手可能（Appli
ed Biosystems）な5'−ジメトキシトリチルヌクレオシ
ドｂ−シアノエチルホスホロアミダイト試薬および制御
された孔ガラス合成カラムを用いた自動合成を、本特許
出願において説明する研究のために行った。「通常のホ
スホロアミダイト化学」に加えて、RNA、リン酸水素お
よびホスホチオエートを含む他の化学作用を用いてもよ
い。
後のラベル化のための内部または末端官能基を有する
修飾されたオリゴヌクレオチドは多くの方法で得られ
る。官能基を導入するためのいくつかの特に有用な方法
を以下に説明する［合成方法に関するこの特定部分にお
いては、「官能基の導入」は、蛍光団または発色団との
後の結合のための化学的反応性基（第一アミン、スルフ
ヒドリル基、アルデヒドなど）を意味する；これを本発
明の主要部分における電子的／光子的性質に関する「機
能的性質の導入」と混同すべきではない］。
配列内の選択された位置ならびに3'および5'末端位置
に、適当に保護されたリンカーアームヌクレオシド（5'
−ジメトキシトリチル−５［Ｎ−（７−トリフルオロア
セチルアミノヘプチル）−2'−デオキシウリジン3'−Ｏ
−ホスホロアミダイト］）として内部官能第一アミン基
を導入することができる。このリンカーアームヌクレオ
シド（Glen Researchにより供給される）を自動合成工
程中、容易に導入することができる。これは、様々な活
性化蛍光団および発色団との後の結合反応のための第一
アミン基（実際のリンカーアームの長さは1.5nmであ
る）を提供する。
また、Aminolink 2を用いて第一アミン官能基を5'−
末端位置に導入することができる。Aminolink 2は６個
の炭素鎖アーム（0.9nm）および保護されたアミン基を
有するホスホロアミダイト分子（Applied Biosystemsに
より供給される）である。この適当に保護されたリンカ
ー基を自動合成工程の終わりに5'−末端位置に導入する
ことができ、これは様々な活性化蛍光団および発色団と
の後の結合反応のための第一アミン基を提供する。
デオキシリボヌクレオシドの代わりにリボヌクレオシ
ドを用いた合成工程を開始させることにより、異なる型
の官能基を末端位置に導入することができる。これはオ
リゴマーの3'末端位置にリボヌクレオチドを提供し、次
いでこれを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して種々の蛍光
団および発色団と結合し得る反応性アルデヒド基を形成
することができる。
オリゴヌクレオチドを機能化するこれらの工程は排他
的であることを意図しておらず、他の工程は、利用可能
であるかまたは本発明の新規な概念をさらに可能にする
ために開発することができる。
各合成の終点で、完成したオリゴヌクレオチド（修飾
または未修飾）を、濃縮水酸化アンモニウムによる55℃
で12時間の処理により除去される支持およびブロック基
から遊離させる。精製において助力となるようジメトキ
シトリチル基をオリゴヌクレオチド上に残すことができ
る。5'−トリチルオリゴヌクレオチドを逆層高圧液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）により精製することができ
る。各オリゴヌクレオチド産物の純度を分析的ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により測定することができる。
この時点で、未修飾のオリゴヌクレオチドは実験的使用
への準備ができている。反応性リンカーアームを有する
オリゴヌクレオチドを適当な活性化蛍光団と反応させる
ことができる。
イソチオシアネート、塩化スルホニル、スクシンイミ
ジルエステルまたはトリアジンを含有する蛍光団および
発色団誘導体を、第一アミン官能基を含有するオリゴヌ
クレオチドに容易に結合させることができる。3'−末端
アルデヒド（過ヨウ素酸塩により酸化されたリボヌクレ
オチド由来）を含有しているオリゴヌクレオチドを第一
アミンまたはヒドラジド基を有する蛍光団および発色団
と反応させることができる。異なる蛍光団および発色団
を機能化されたオリゴヌクレオチドに導入するための多
種多様な試薬および方法が存在する［Bioconjugate Che
mistry,Vol 1,＃3,pp.165−187（1990）;Symon,R.H.,
「核酸プローブ」,CRC Press,Inc.（1989）；およびKel
lerら，「DNAプローブ」,Stockton Press,（1989）を参
照］。さらに、オリゴヌクレオチド（内部および末端）
の直接的蛍光ラベル化は、蛍光（フルオレセインおよび
アクリジン）ホスホロアミダイト（Clontech）を用いて
行うことができる。この方法を用いて、完全なヌクレオ
チドを蛍光ホスホロアミダイト誘導体と置き換える。こ
れらの誘導体を通常の自動DNA合成法の中で導入する。
5.機構、装置および系 機能的分子成分のプログラム可能性により、それらの
ヌクレオチド配列を通してそれらがさらに大きくそして
さらに複雑に規定される構造へと自己−組み立てして組
織化するのが可能になることを強調するのは重要であ
る。これらの分子成分のこのプログラム可能性および機
能的電子／光子的性質は、光子的連結、増幅機構および
アンテナ配列が該構造内で組織化するのを可能にする。
性質の組み合わせは、最終的には光子装置、光起電装
置、バイオセンサーおよび均一ならびに不均一DNA診断
アッセイの創製を導く。
各々が多くの供与基を含有する多数のDNAポリマーを
共に組織化することができるから、比較的大きなアンテ
ナまたは増幅器ネットワークを構築するかまたは長い光
子転移および連結を作成することが可能である。増幅ま
たはアンテナ機能のための拡張されたエネルギー転移に
関して、ある分子構造または系における受容体に対する
供与体の数はいくつかの因子に依存する。これらには、
（１）最終の系に影響を与える光束（強度）；（２）供
与体配列についての全体のエネルギー転移効率；（３）
供与体および受容体の量子収量（QY）および（４）供与
体および受容体励起状態の寿命（tau）が含まれる。ア
ンテナまたは光子増幅への適用のために、低〜中程度の
光で、供与体の受容体に対する数は２対１および好まし
くは10対１の下限から106対１の上限までの範囲であろ
う。不均一DNA診断およびバイオセンサーへの応用のた
めに、供与体の受容体に対する数は２対１および好まし
くは５対１の下限から105対１の上限までの範囲であろ
う。蛍光分析のための通常の分光蛍光計または他の計器
において見られる通常の水銀またはキセノン光源を用い
る均一DNA診断への応用のために、供与体の受容体に対
する数は２対１の下限から104対１の上限までの範囲で
あろう。さらに、ある種の光子機構および特定の装置へ
の応用のために、複数の供与体DNAポリマーが１以上の
受容基を有する受容体DNAポリマーに転移させてもよ
い。上で与えられた供与体の受容体に対する基本的な比
と同じものが、１以上の受容基を有する受容体DNAポリ
マーを有する分子構造または系に対して適用される。
本発明の装置を二本鎖核酸構造により説明することが
でき、これは通常の相補性によりハイブリダイズして通
常の二本鎖を形成する２またはそれ以上のポリヌクレオ
チドであるが、二本鎖の「鎖」は図３に示すような２ま
たはそれ以上の隣接したポリヌクレオチドからなること
もある。
従って、本発明の二本鎖核酸構造は、少なくとも２つ
のハイブリダイズされたポリヌクレオチドからなる。こ
の構造は、（１）該構造のポリヌクレオチドに結合され
たリンカーアームにより該構造に機能的に結合した少な
くとも２つの供与体発色団を有し、該供与体発色団は該
構造の全長に沿った結合により供与体−供与体転移距離
に配置される。またこの構造は、（２）該構造のポリヌ
クレオチドに結合されたリンカーアームにより該構造に
機能的に結合した少なくとも１の蛍光発色団を有し、蛍
光発色団は少なくとも１の供与体発色団からの供与体−
受容体転移距離に結合により配置される。
図３に示す配置により示唆されるように、１つの態様
は１またはそれ以上の交互の発色団の使用に関与し得
る。すなわち、該構造はこの構造上に交互に配置される
供与体発色団を含有し、該供与体−供与体転移距離は二
本鎖のポリヌクレオチドの間で交差する（交互になる）
ことができる。交互の配置は、一部の供与体−供与体転
移が同じポリヌクレオチド上の隣接した供与体間にあっ
て一部が向かい側の二本鎖上の供与体間にある（すなわ
ち、交互）か、または全ての転移が交互であることがで
きる。交互の転移距離は、本明細書中で説明するように
供与体−供与体転移距離により表すかまたはヌクレオチ
ド塩基間隔により表すことができる。従って、例えば交
互の供与体発色団を有する構造は少なくとも３つの供与
体発色団を含むことが意図されており、ここで供与体発
色団は１個のポリヌクレオチド上で４〜18ヌクレオチド
塩基単位離れて位置する。
別の態様は、光子エネルギー転移系または回路として
複数の供与体にわたって拡張される光子エネルギー転移
の能力の使用である。光子エネルギー転移系は本明細書
中で説明する１またはそれ以上のポリヌクレオチド成分
を有することができる。ゆえに光子エネルギー転移系
は、上で説明した少なくとも２つの供与体発色団を有す
るポリヌクレオチドを含む。さらにこのポリヌクレオチ
ドは受容体発色団を含んでいてよい。この系は、本明細
書中で説明する様々な配置において１またはそれ以上の
別のポリヌクレオチドを含むこともある。
本発明が説明する拡張された光子エネルギー転移のた
めの構造および系の範囲で、１つの態様は、説明する構
造、ポリヌクレオチド、複数のポリヌクレオチド二本
鎖、光子エネルギー転移系などの、固体状態での使用を
意図していることは理解されるであろう。すなわち、こ
の系のポリヌクレオチドを固体支持体に機能的に結合
（接着）させて拡張されたエネルギー転移装置の使用を
容易にすることができる。固体支持体系は特に電子装
置、例えば光子エネルギーコレクター、光増幅器、エネ
ルギー転移導管などに適している。
固体支持体へのポリヌクレオチドの結合は任意の種々
の方法により行うことができ、限定されるものと解釈す
べきではない。例示的な結合方法は本明細書中の他の部
分で説明し、ポリヌクレオチド技術分野における当業者
に通常周知のものである。
１つの態様において、固体支持体とは受動的な支持体
を表すことができ、すなわち支持体は固体相におけるエ
ネルギー転移ポリヌクレオチドをただ保持するために受
動的に作用する。別の態様において、固体支持体は反応
性であってよく、すなわちこの支持体は、エネルギーを
転移系に与え、または受容体から第二の回路に放射光子
エネルギーを検出、受容、変換、翻訳または伝達するた
めの能力を有するなどの相補的な機能を提供する。例示
的な第二回路は固相媒体における感光装置、光起電など
の装置である。
B.診断系と診断法 1.診断系 本発明のキットの形態にある診断系は、少なくとも１
回の検定に足る量の本発明の発色団含有ポリヌクレオチ
ドを、個別に梱包された試薬として含む。典型的にはこ
の梱包された試薬の使用説明書も含まれる。
典型的な場合、「使用説明書」は、試薬濃度、あるい
は試薬と混合すべき試料の相対量、試薬／試料混合物の
維持期間、温度、緩衝液条件などの少なくとも１つの検
定法パラメーターを記述する具体的な表現を含む。
１つの態様として、本発明は、少なくとも１回の検定
に足る量の、リンカーアームによってポリヌクレオチド
に機能的に連結された少なくとも２つの供与発色団を有
するポリヌクレオチド（ここにその供与発色団は該ポリ
ヌクレオチドの長さに沿う結合によって供与体−供与体
移動距離に配置される）からなる、予め選択されたヌク
レオチド配列の光子検出のための診断系を包含する。こ
のポリヌクレオチドは予め選択されたヌクレオチド配列
（すなわち標的核酸配列）にハイブリッド形成するよう
に設計されるので、これは標的核酸配列に相補的なヌク
レオチド配列を含有する。標的核酸配列の相補性は試薬
ポリヌクレオチド（すなわちプローブ）に適用されるの
で核酸診断技術の分野ではよく知られており、したがっ
てここで詳述する必要はない。
もう１つの態様では、診断系のポリヌクレオチドが、
蛍光性発色団が結合によって供与発色団の少なくとも１
つから供与体−受容体移動距離に配置されるように、リ
ンカーアームによってポリヌクレオチドに機能的に連結
された少なくとも１つの蛍光性発色団をさらに含有す
る。この態様では、受容発色団と複数の供与発色団の両
方が１つのポリヌクレオチド上に存在する。図２（ａ）
に示す構造はその具体例である。
もう１つの態様では、診断系が、リンカーアームによ
って第２のポリヌクレオチドに機能的に連結された少な
くとも１つの蛍光性発色団を含有する第２のポリヌクレ
オチドを含む。図２（ｂ）に示す構造はその具体例であ
る。
さらなる態様では、診断系が、典型的には別個の容器
に入った、本発明の消光ポリヌクレオチドをも含有す
る。包含される消光ポリヌクレオチドは受容体ポリヌク
レオチドの少なくとも一部に相補的であり、好ましくは
受容体ポリヌクレオチドに完全に相補的である。標的配
列がハイブリッド形成混合物中に存在するとすれば、受
容体がそれに優先的にハイブリッド形成することを確実
にするために、消光ポリヌクレオチドは受容体ポリヌク
レオチドより長さが短くなくてはならず、典型的には少
なくとも10％短く、より好ましくは少なくとも50％短
い。
本明細書に記述するあらゆる診断系の試薬種、すなわ
ち本発明の発色団含有ポリヌクレオチドを、液体分散液
として、あるいは実質上乾燥した粉末（例：凍結乾燥
型）として提供することができる。また反応容器として
の固体支持体および１またはそれ以上の緩衝剤を個別に
梱包された要素としてこの診断検定系に含ませることも
できる。
診断系に関して本明細書で議論する梱包は診断系で通
例的に使用されているものである。「梱包」という用語
は、固定された限界内で本発明の診断試薬を保持するこ
とができるガラス、プラスチック、紙、金属箔などの固
体基盤または材料を意味する。したがって例えば梱包と
は、意図する診断試薬を含有するために使用されるガラ
スバイアルであり得る。
2.診断法 また本発明は、本発明の発色団含有構造によって生成
する放射された光子エネルギーの検出をもたらすあらゆ
る診断法を包含する。放射が励起とそれに続く励起した
供与発色団から受容発色団へのエネルギー移動の結果で
ある限り、本法は少なくとも２つの段階からなる： （１）供与発色団が支持体の長さに沿って供与体−供与
体移動距離に配置されるように、リンカーアームによっ
て支持構造に機能的に連結され少なくとも２つの供与発
色団を含有し、かつ、供与発色団の少なくとも１つから
供与体−受容体移動距離を与える構造上の位置にリンカ
ーアームによって支持構造に機能的に連結された少なく
とも１つの蛍光性受容発色団をも含有する本発明の組織
化された構造の励起。この励起は、「収集」事象として
の供与発色団間の非放射性エネルギー移動を誘発するに
足り、かつ、受容体自体が十分に励起されて光子エネル
ギーの放射をもたらすように供与発色団と受容発色団の
間の非放射性エネルギー移動を誘発するに足る光子エネ
ルギー量である。
（２）様々な光子センサーのいずれかの利用による結果
的に放射された光子エネルギーの検出。
上述のように発色団を含有する組織化された構造は本
明細書に記述する様々な配置のいずれであってもよい。
特定の励起手段と検知手段は、手元にある系の必要に応
じて広範囲に変化し得るし、また、要求される感度、組
み込んだ供与発色団および受容発色団の励起および放射
特性ならびに構造の適用に依存する。
とりわけ好ましい診断方法として、本発明は、核酸を
含有する試料中の標的配列を検出するためのハイブリッ
ド形成プローブとして本発明の発色団含有ポリヌクレオ
チドを用いる予め選択された核酸配列の光子検出の方法
を包含する。
したがって、核酸含有試料中の予め選択された核酸配
列の存在を検出するための診断法は、次の段階からなる
と考えられる： （ａ）（ｉ）（１）発色団がポリヌクレオチドの長さに
沿う結合によって供与体−供与体移動距離に配置される
ように、リンカーアームによってポリヌクレオチドに機
能的に連結された少なくとも２つの供与発色団と、
（２）蛍光性受容発色団が結合によって供与発色団の少
なくとも１つから供与体−受容体移動距離に配置される
ように、リンカーアームによってポリヌクレオチドに機
能的に連結された少なくとも１つの蛍光性受容発色団、
とを有するポリヌクレオチド（ここにポリヌクレオチド
は予め選択された「標的」核酸配列に対して相補的にな
るように予め選択されたヌクレオチド配列を有する）
を、（ii）予め選択された核酸塩基（「標的」）配列を
含有する核酸含有試料、と混合してハイブリッド形成反
応混合物を形成させ、 （ｂ）そのハイブリッド形成反応混合物を、ポリヌクレ
オチドが標的配列にハイブリッド形成し、供与発色団を
含有する−ならびに受容発色団を含有する−ハイブリッ
ド形成した核酸二本鎖を形成するに足る期間、ハイブリ
ッド条件に付し、 （ｃ）受容発色団からの光子エネルギーの放射を誘発す
るに足る光子エネルギーに供与発色団をさらすことによ
って、段階（ｂ）で形成した核酸二本鎖中の供与発色団
を励起し、 （ｄ）励起した受容発色団から放射される光子エネルギ
ーの存在を検出することによって、試料中の予め選択し
た核酸配列の存在を検出する。
関連する態様では、複数の受容体と少なくとも１つの
受容発色団との両方を含有する１つのポリヌクレオチド
の代わりに、受容発色団を含有するポリヌクレオチドと
は別個の１またはそれ以上のポリヌクレオチド上に供与
体が存在する点で、段階（ａ）の混合が相違する。
図２（ｂ）と図３に例示するこの態様では、供与体と
受容体の配置が、予め選択した核酸標的配列にハイブリ
ッド形成した時のこれらの発色団の近接性と、それぞれ
のポリヌクレオチド上のそれらの結合位置の両方によっ
て制御される。
もう１つの態様として、標的核酸配列を含有するポリ
ヌクレオチドとのハイブリッド形成に関して標的配列と
競争するように設計された核酸配列を有する、本明細書
に記載の消光ポリペプチドをハイブリッド形成混合物が
含有してもよい。この態様を実施例３と図４に示す。
ハイブリッド形成反応混合物は、本発明のポリヌクレ
オチドプローブ（単数または複数）の有効量、標的核酸
およびハイブリッド形成反応混合物に適合し得る他の成
分を混合することによって調製される。
本法でハイブリッド形成されるべき標的核酸配列は、
その試料が純度と濃度に関して核酸ハイブリッド形成反
応に適合し得る形態にある限り、あらゆる核酸含有試料
中に存在することができる。ハイブリッド形成に適する
程度に核酸を単離することは一般に知られており、様々
な手段で達成することができる。例えば皮膚、筋肉、毛
髪などの身体組織や、血液、血漿、尿、羊膜液、大脳脊
髄液などの体液を含む様々な核酸含有試料から核酸を単
離することができる。例えば、Maniatisら［Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory（1982）］およびAusubelら［Current Protocol
s in Molecules Biology,John Wiley and Sons（198
7）］を参照のこと。
ポリヌクレオチドプローブが試料中に存在する相補的
な核酸配列にハイブリッド形成してハイブリッド形成産
物（すなわち本発明の発色団含有ポリヌクレオチドプロ
ーブ（単数または複数）と標的核酸とを含有する錯体）
を形成するに足る期間、ハイブリッド形成反応混合物を
ハイブリッド形成条件下の意図する方法で維持する。
「ハイブリッド形成条件」という表現とその文法的に
等価な表現は、維持期間と共に用いられる場合、ハイブ
リッド形成反応混合物を、その混合物中の反応物と付随
する試薬の濃度との関連で、ポリヌクレオチドプローブ
が標的配列とアニールして、典型的には核酸二本鎖を形
成すること、を可能にするに足る時間、温度およびpH条
件に付すことを示す。ハイブリッド形成の達成に必要な
そのような時間、温度およびpH条件は、当該技術分野で
はよく知られているように、ハイブリッド形成されるべ
きポリヌクレオチドプローブの長さ、ポリヌクレオチド
プローブと標的の間の相補性の程度、ポリヌクレオチド
のグアニンおよびシトシン含量、所望のハイブリッド形
成の厳密度、ハイブリッド形成の速度論に影響を与え得
るハイブリッド形成反応混合物中の塩または付加的試薬
の存在に依存する。与えられたハイブリッド形成反応混
合物についてハイブリッド形成条件を最適化する方法は
当該技術分野ではよく知られている。
典型的なハイブリッド形成条件には４〜９のpH値に緩
衝化された溶液の使用が含まれ、典型的なハイブリッド
形成条件は18℃〜75℃（好ましくは約37℃〜約65℃、よ
り好ましくは約54℃）の温度で、0.5秒〜24時間（好ま
しくは２分）の期間、行われる。
ハイブリッド形成はよく知られているように均一形式
でも不均一形式でも行うことができる。均一ハイブリッ
ド形成反応は完全に溶液中で起こり、ポリヌクレオチド
プローブとハイブリッド形成されるべき（標的）核酸配
列の両方が溶液中に可溶型で存在する。不均一反応では
反応媒質に不溶性の基盤が使用され、その基盤にポリヌ
クレオチドプローブまたは標的核酸を結合させる。例え
ば検定すべき身体試料を固体基盤に付着させて、それを
原位置ハイブリッド形成に付すことができる。
原位置ハイブリッド形成は典型的には通常約１ミクロ
ン〜約100ミクロン（好ましくは約１ミクロン〜約25ミ
クロン、より好ましくは約１ミクロン〜約10ミクロン）
の厚さを有する組織の切片または区分の形態にある身体
試料上で行われる。このような試料は市販の冷却保持装
置を用いて調製することができる。
別法として、広く使用されている不均一形式はサザン
ブロット法であり、この場合、ゲノムDNAを制限酵素消
化の後で電気泳動し、電気泳動したDNA断片をまず変性
させた後、それを不溶性の基盤に移す。このブロット法
では、次いでポリヌクレオチドプローブを、相補的な核
酸（標的）配列を含有する固定化されたゲノム核酸にハ
イブリッド形成させる。
さらに、もう１つの広く使用されている不均一形式は
ライブラリースクリーニング法であり、この場合、多数
のコロニー（典型的にはプラスミド含有細菌またはラム
ダバクテリオファージ含有細菌）をプレートに接種し、
培養し、ブロットすることによって、不溶性の基盤上に
クローン化された核酸のライブラリーを形成させる。次
にブロットしたライブラリーをポリヌクレオチドプロー
ブとハイブリッド形成させることによって、目的の核酸
断片を含有する細菌コロニーを同定する。
典型的な不均一ハイブリッド形成反応には、標的含有
核酸断片を付着させる固体基盤としてガラススライド、
ニトロセルロースシートなどの使用が含まれる。
また、cDNAを形成させるための単離mRNAの逆転写、ジ
デオキシ配列決定およびポリヌクレオチドのハイブリッ
ド形成が第１段階となるプライマー伸長反応を用いる他
の手法のために行われるような均一ハイブリッド形成反
応も好ましい。特定の核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）によって増幅する均一ハイブリッド形成反応は
とりわけ好ましい。
標的配列を含有する核酸が二本鎖（ds）型である場合
には、ハイブリッド形成反応を行う前にまず、そのdsDN
Aを加熱やアルキル処理などによって変性させることが
好ましい。dsDNAの変性はハイブリッド形成させるべき
ポリヌクレオチドとの混合に先立って行うことができる
し、また、dsDNAをポリヌクレオチドと混合した後に行
うこともできる。ポリヌクレオチド自体が二本鎖分子と
して提供される場合にも、ハイブリッド形成反応混合物
中での混合に先立ってそれを変性させることができる
し、また、それと同時に標的含有dsDNAを変性させるこ
ともできる。
ハイブリッド形成反応混合物に混合するポリヌクレオ
チドの量は広範囲にわたることができ、その応用に依存
するが、その応用もまた標的配列を検出するために必要
とされる感度に依存する。均一ハイブリッド形成混合物
については、発色団含有ポリヌクレオチドが１ミリリッ
トル（ml）あたり約１〜1000ナノグラム（ng）の濃度
（約20ヌクレオチド長のポリヌクレオチドの場合は好ま
しくは約10〜100μg/ml）で存在することができる。
主ポリヌクレオチド上に存在する受容発色団の量に関
して、均一液体ハイブリッド形成混合物中では、１ポリ
ヌクレオチドあたり１受容発色団のための検出のレベル
は、100マイクロリットル（μｌ）あたり少なくとも約1
04〜105受容発色団分子である。
標的核酸が固相中に存在する場合のような不均一ハイ
ブリッド形成混合物については、検出すべき核酸バンド
１つもしくは標的核酸の２ミリメートル（mm）ドットブ
ロットあたり少なくとも約106〜107分子の受容発色団量
で、発色団含有ポリヌクレオチドをハイブリッド混合物
に加える。代表的な応用は、サザンブロットまたはDNA
配列決定用ゲル上に存在する核酸断片を、例えば蛍光的
に標識されたプローブを検出するABI配列読み取り機を
用いて検出することである。
C.光子装置 本発明は、長距離にわたって拡張されるという複数供
与体移動構造の能力ゆえに、光コレクターや光子伝導体
などの光子装置に対応する。したがってその構造を光子
エネルギーの線形伝導体として設計することができる
し、あるいは光感受性光子スイッチ（すなわちバイオセ
ンサー）として配列させることもできる。
したがって１つの態様として、本発明は、リンカーア
ームによってそのポリヌクレオチドに機能的に連結され
た少なくとも２つの供与発色団を有する本発明のポリヌ
クレオチド（ここに該発色団は該ポリヌクレオチドの長
さに沿う該結合によって供与体−供供与体移動距離に配
置されている）からなるバイオセンサーを包含する。こ
のポリヌクレオチドはリンカーアームによって該ポリヌ
クレオチドに機能的に連結した少なくとも１つの蛍光性
受容発色団をも有する（ここに該蛍光性受容発色団は該
結合によって該供与体発色団の少なくとも１つから供与
体−受容体移動距離に配置されている）。
したがってこのバイオセンサーは、様々な長さであり
得て、集められ転送された光子エネルギーを受容発色団
に送達する光子コレクターを含有する。好ましくは、バ
イオセンサーが、集合してより明るい光子出力を与える
複数の受容発色団を含有する。
受容体または受容体の集合に隣接して位置するのは、
放射された光子エネルギーの存在を検出するための光子
検知手段である。この検知手段は、光電子増倍管チュー
ブ、放射された光を光感受性光電子増倍管に送達する繊
維光学系といった検知手段など、様々な光検出装置のい
ずれであってもよい。
実施例 下記の実施例は本発明の例示を意図するものであっ
て、限定を意図するものではない。
1.自己組織性の拡張されたエネルギー移動系の設計と合
成 拡張されたエネルギー移動系の実験的な実証のため
に、５つの異なる特定配列蛍光オリゴヌクレオチドと、
同じ配列の非機能化型とを設計し、合成した。これらは
次のものを含む： （１）受容体16マー・オリゴヌクレオチド単位,5.4nm
長，スルホローダミン（Sulforhodamine）101によって
標識されている（AU）。
（２）第１中間供与体30マー・オリゴヌクレオチド単
位,10.2nm長,6ヌクレオチドもしくは2.4nmの間隔で隔て
られた２つのフルオレセインで標識されている（ID
1）。
（３）第２中間供与体29マー・オリゴヌクレオチド単
位,9.9nm長,6ヌクレオチドもしくは2.4nmの間隔で隔て
られた２つのフルオレセインで標識されている（ID
2）。
（４）リピーター中間供与体30マー・オリゴヌクレオチ
ド単位,10.2nm長,7ヌクレオチドもしくは2.7nmの間隔で
隔てられた２つのフルオレセインで標識されている（R
D）。このリピーター単位はその構造を拡張し得るよう
に設計されている。
（５）末端供与体15マー・オリゴヌクレオチド単位,5.1
nm長,1つのフルオレセインで標識されている（TD）。
上記のオリゴヌクレオチドすべての非修飾型をも合成
した。すべてのオリゴヌクレオチドは、それらのコード
化された配列によって互いに相補的部分に結合して直線
状の二本鎖構造を形成するように設計されている。５つ
の修飾されたオリゴヌクレオチド配列中の特定の配列と
蛍光標識［Ａ＝スルホローダミン101（テキサス・レッ
ド）,D＝フルオレセイン］の位置を下に示し、それぞれ
を配列番号４〜８と識別する。
上に示したオリゴヌクレオチド配列とその非機能化型
はすべて、制御された多孔ガラス支持体上で標準的なホ
スホルアミダイト化学を用いるアプライド・バイオシス
テムズ自動DNA合成機モデル＃381で合成した。機能化さ
れたオリゴヌクレオチドの場合には、保護されたリンカ
ーアームヌクレオシド（5'−ジメトキシトリチル−５−
トリフルオロアミノアルキル・デオキシウリジン）を上
記の選択した位置に組み込んだ。このリンカーアームヌ
クレオシドは、活性化された発蛍光団［すなわちスルホ
ローダミン101塩化スルホニル（テキサス・レッド）と
フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）］との反
応のために１級アミン基を提供する。
各合成の最後に、完成したオリゴヌクレオチドを支持
体から切り離し、濃水酸化アンモニウムによる55℃で12
時間の処理によって遮断基を除去した。ジメトキシトリ
チル基は精製を助けるためにオリゴヌクレオチド上に残
した。5'−トリチルオリゴヌクレオチドを逆相高圧液体
クロマトグラフィー（HPLC）で精製した。各オリゴヌク
レオチド生成物の純度を分析用ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で決定した。
HPLCで精製した非修飾型のオリゴヌクレオチドは実験
で使用する準備ができていた。次に活性なリンカーアー
ム（単数または複数）を含有するオリゴヌクレオチドを
適当な活性化発蛍光団と反応させた。蛍光標識化は、活
性なリンカーアームを含有するオリゴヌクレオチド500n
gをスルホローダミン101塩化スルホニル（テキサス・レ
ッド）もしくはフルオレセイン・イソチオシアネート
（共にモレキュラー・プローブから入手できる）1mgと
0.1M重炭酸ナトリウム（pH8.5）100μｌ中で20℃で２時
間反応させることによって行った。反応が完了した後、
その溶液をセファデックスＧ−25ゲル濾過カラムに通す
ことによって、過剰の発蛍光団試薬を除去した。蛍光標
識したオリゴヌクレオチドの非標識物質からの最終的な
精製は調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
行った。
精製した蛍光オリゴヌクレオチドと非修飾型オリゴヌ
クレオチドのすべてについてUV/可視スペクトル（240nm
〜600nm）を得た（ヒューレット・パッカード・8451A・
ダイオード・アレイ・スペクトロフォトメーター）。そ
のスペクトルデータから、濃度と蛍光標識化の程度を決
定した。受容体単位（AU）はスルホローダミン101（テ
キサス・レッド）による標識化に関して＞95％純粋であ
ることが決定された。中間供与体（ID1）は二重フルオ
レセイン標識化成分に関して約40％純粋であることが決
定され、残りは単一標識化成分の混合物であった。中間
供与体２（ID2）は二重フルオレセイン標識化成分に関
して約30％純粋であることが決定され、残りは単一標識
化成分の混合物であった。反復供与体（RD）単位は二重
フルオレセイン標識化成分に関して約25％純粋であるこ
とが決定され、残りは単一標識化成分の混合物であっ
た。末端供与体（TD）はフルオレセインによる標識化に
関して＞95％純粋であることが決定された。中間供与体
はフルオレセインで完全には二重に標識されなかった
が、それでも自己組織性系中での拡張されたエネルギー
移動機構を立証するには適している。
ここで拡張されたエネルギー移動を示すために設計し
た実際の実験には、４オリゴヌクレオチド単位（すなわ
ち受容体単位（AU）、中間供与体１単位（ID1）、中間
供与体２単位（ID2）および１つの末端供与体単位（T
D））のハイブリッド形成による14nm長の光子アンテナ
構造の組織化が含まれる。組織化された構造と拡張され
たエネルギー移動に関する経路を図３に示す。
20℃の水性緩衝液（0.1M塩化ナトリウム/0.02Mリン酸
ナトリウム,pH7.8）500μｌ中で濃度0.5ナノモル／μｌ
の上記オリゴヌクレオチドを混合することによって、14
nmアンテナ構造の会合した構造を形成させた。これらの
条件は上記オリゴヌクレオチド単位がそれらの相補的配
列に迅速にハイブリッド形成（１分）し、16nm直線状二
本鎖構造を自己組織化（会合）するには最適である。
いくつかの実験対照構造をも同じ塩基配置で会合させ
たが、その供与体単位の１またはそれ以上を非標識（N
L）型とした。適度に効率のよいフェルター・エネルギ
ー移動に関する潜在能力ゆえに、フルオレセインおよび
スルホローダミン101を蛍光供与基および蛍光受容基と
して選んだ。組織化された14nmアンテナ構造は、受容体
単位（AU）中のスルホローダミン基と中間供与体１単位
（ID1）中の第１フルオレセイン基との間に６塩基対
（2.4nm）の間隙（受容体−供与体移動距離）を有し、
かつ、この配列の残りの部分にあるフルオレセイン供与
体のそれぞれの間に６塩基対の間隙（供与体−供与体移
動距離）を有するように設計されている。
フルオレセインは495nm波長にその吸収（励起）極大
（EX495）を持ち、520nm波長に放射極大（EM520）を持
ち、吸光係数は-72000である。スルホローダミン101
（テキサス・レッド）は595nm波長に吸収（励起）極大
（EX595）を持ち、615nm波長に放射極大（EM615）を持
ち、吸光係数は-85000である。フルオレセインの幅広い
放射バンドは500nmから600nmまでに及び、520nmから600
nmに及ぶスルホローダミンの幅広い吸収バンドとよく重
複している。放射バンドと吸収バンドのこの重複とそれ
ぞれの発蛍光団の高い量子収率ゆえに、これらはエネル
ギー移動にとって良好な一対となる。
会合した光子アンテナ構造における拡張されたエネル
ギー移動の立証は、495nmでの放射でフルオレセイン供
与体単位を励起し、スルホローダミン101受容体単位に
よる615nmでの放射の再放出を測定することによって行
った。595nmで励起することによって615nmにおける基礎
テキサス・レッド蛍光放射を決定した（アミコ−ボウマ
ン・スペクトロフォトフルオロメーターを用いてこれら
の実験を行った）。相対エネルギー移動効率（ET eff）
とは、この系を495nmで励起した場合の615nm放射の、49
5nmで励起した場合の615nm放射に対する比率を100倍し
たものであり、次式で表すことができる： ET eff＝EM615（EX495）/EM615（EX595）×100（３） 16ナノメーター光子アンテナ構造の自己組織化の可逆
性の立証は、まず20℃で組織化した構造を会合させ、次
いでそれを90℃に１分間加熱し、次にその系を20℃に冷
却し直す（１分間）ことによって行った。会合（最
初）、加熱（加熱）および冷却（冷却）の工程の後に、
各条件について上述のように励起と放射の測定を行っ
た。様々な配置における拡張されたエネルギー移動の実
験的立証と可逆性自己会合に関する結果を表４に示す。
表４には、組織化された（AU/ID1/ID2/TD）アンテナ
構造中で拡張されたエネルギー移動が起こり、全ての供
与体単位が存在する場合に受容体単位（AU）に対して約
76％のエネルギー移動効率をもたらすことが示されてい
る。まさにID1単位のみが蛍光性である場合、つまりAU/
ID1/ID2（NL）/TD（NL）系では、エネルギー移動は46％
である。これは移動したエネルギーの30％がID2単位
（これは受容基から20塩基対もしくは6.8nmに位置する
第１供与基を有する）に由来していたことを示してい
る。これは何らかの有意なエネルギー移動レベルを説明
するのに必要なフェルスター距離を充分に越えている。
ID2単位とTD単位のみが蛍光性である場合、即ち［AU/ID
1（NL）/ID2/TD］系では、エネルギー移動が約８％に低
下する。これはID2単位とTD単位がID1単位を通してAU単
位に移動していたことを示す他の結果の確証となるか
ら、重要な結果である。AU/ID1（NL）/ID2（NL）/TD（N
L）系の495nm励起での結果は単にAUに関するテキサス・
レッド背景（バックグラウンド）蛍光のレベルを示すも
のであり、595nm励起での結果はAUに関するテキサス・
レッド蛍光の正常な、または基礎のレベルを与える。
会合、加熱および冷却実験は、この系が完全に崩壊す
る90℃におけるエネルギー移動の完全な喪失と、系を冷
却した場合のエネルギー移動能力の回復を示すことによ
って、この系の可逆性組織化特性を明確に立証してい
る。
2.有意な再放射を伴う非蛍光性供与体から蛍光性受容体
へのエネルギー移動の立証 テキサス・レッドへエネルギー移動するいくつかの非
蛍光性供与基が有意な再放射を導き得ることを立証する
ために、いくつかのオリゴヌクレオチドを設計し、合成
した。「合成と標識化」の項と実施例１に記述したもの
と同じ基本的手法を用いて、２つの相補的18マー配列を
合成し、標識した。下記オリゴヌクレオチド（Ａ）を、
その3'−末端位置から第６ヌクレオチド上の１級アミノ
基で機能化（誘導体化）した。下記オリゴヌクレオチド
（Ｂ）をアミノリンク２化学を用いて5'−末端アミノ基
で機能化した。次にオリゴヌクレオチド（Ａ）をフルオ
レセイン、DABITC（モレキュラー・プローブス）、リア
クティブ・レッド（シグマ・ケミカル）またはマラカイ
ト・グリーン（モレキュラー・プローブス）で標識し
た。DABITC、リアクティブ・レッド４およびマラカイト
・グリーンは非蛍光性の発色団基である。オリゴヌクレ
オチド（Ｂ）をテキサス・レッドで標識した。これらの
オリゴヌクレオチド配列を次に示し、それぞれを配列番
号９〜10と識別する： ［ここにＤ＝フルオレセイン、DABITC、リアクティブ・
レッド４またはマラカイト・グリーンであり、Ａ＝テキ
サス・レッドである］ オリゴヌクレオチド（Ａ）と（Ｂ）とをハイブリッド
形成させると、受容基と供与基との間に５塩基対の間隙
（2.0nm）が生まれる。テキサス・レッド（Ａ）オリゴ
マーとフルオレセイン（Ｂ）オリゴマーに関してハイブ
リッド形成した配置を次に示し、それぞれを配列番号９
〜10と識別する。
オリゴヌクレオチド（Ａ）に対応するが、フルオレセ
イン、DABITC、リアクティブ・レッド４またはマラカイ
ト・グリーンの１つを有するオリゴヌクレオチドを個別
に試験することによって、それぞれのオリゴヌクレオチ
ド（Ｂ）上のテキサス・レッド受容基へのエネルギー移
動能力を決定した。20℃の水性緩衝液（0.1M塩化ナトリ
ウム/0.02Mリン酸ナトリウム,pH7.8）500μｌ中で濃度
0.5ナノモル／μｌの上記オリゴヌクレオチド（Ａ）お
よび（Ｂ）を混合することによって、上記の構造を形成
させた。これらの条件は上記オリゴヌクレオチド単位が
それらの相補的配列に迅速にハイブリッド形成（１分）
するのに最適である。実施例１で記述した装置と手法を
用いて蛍光分析実験を行った。
下記の結果が得られた： （ｉ）フルオレセインで標識したオリゴ（Ａ）は、テキ
サス・レッドで標識した（Ｂ）にハイブリッド形成した
時に、その配置を495nm（フルオレセインの励起極大）
で励起すると、615nmにおける再放射として約55％のエ
ネルギー移動をもたらした。これはこの系については適
度に良好な効率である。しかし供与基からの有意な背景
蛍光がまだ存在する。つまりフルオレセインからの蛍光
放射（-500nm〜-600nm）の45％がまだ存在する。
（ii）DABITCで標識したオリゴ（Ａ）は、テキサス・レ
ッドで標識したオリゴ（Ｂ）にハイブリッド形成した時
に、その配置を430nm（DABITCの励起極大）で励起する
と、615nmにおける再放射として約５％〜10％のエネル
ギー移動をもたらした。しかし-440nmにおけるDABITCの
励起をちょうど越えたところから-600nmにおけるテキサ
ス・レッドの蛍光放射の始まりまで検出し得る蛍光放射
型はなかった。これと同じ配置において、595nm（テキ
サス・レッドの励起極大）でこの配置を励起した場合、
DABITCはテキサス・レッドの蛍光放射（615nm）の消光
をほとんどもたらさないか、もしくは全くもたらさない
ものと思われる。
（iii）リアクティブ・レッド４で標識したオリゴ
（Ａ）は、テキサス・レッドで標識したオリゴ（Ｂ）に
ハイブリッド形成した時に、その配置を535nm（リアク
ティブ・レッド４の励起極大）で励起すると、610nmに
おける再放射として陽性のエネルギー移動をもたらさな
かった。リアクティブ・レッド４は、その配置を595nm
（テキサス・レッドの励起極大）で励起した場合に、テ
キサス・レッドの蛍光放射（615nm）の80％以上の消光
をもたらした。
（iv）マラカイト・グリーンで標識したオリゴ（Ａ）
は、テキサス・レッドで標識したオリゴ（Ｂ）とハイブ
リッド形成した時に、その配置を595nm（テキサス・レ
ッドの励起極大）で励起すると、テキサス・レッドの蛍
光放射（615nm）の60％以上の消光をもたらした。マラ
カイト・グリーンの励起極大は629nmにある。
上記（ｉ）と（ii）に記述した結果は、５塩基対の間
隔（2.0nm）にある非蛍光性発色団基DABITCがテキサス
・レッド受容体における有意な蛍光再放射をもたらし得
ることを明確に示している。またDABITCはフルオレセイ
ンが有意な背景（45％）をもたらす領域と同じ領域で検
出し得る背景蛍光をもたらさない。複数供与体系に関し
て、このことは、DABITCからの移動によってもたらされ
る再放射（５％〜10％）がフルオレセインからのもの
（55％）よい低いという事実よりはるかに重要である。
複数供与体系では、蛍光性供与体からの背景蛍光の相加
的効果がその性能と有用性を極めて迅速に制約し得る。
したがって複数供与体系での使用にはDABITCのような発
色団がより理想的である。
上記（iii）および（iv）に記述した結果は、５塩基
対（2.0nm）の間隔にある他の非蛍光性発色団基（リア
クティブ・レッドとマラカイト・グリーン）がテキサス
・レッド受容体の蛍光放射を有意に消光し得るというこ
とを立証している。これらの強力な消光基は、増幅され
た光子放射をスイッチ・オンおよびスイッチ・オフする
ことを可能にする機構を工夫する際に有用であり得る。
したがって、これらはより新規で有用な光子機構または
装置を作成する助けになる。背景を減じるために消光基
を使用する有用な系の例を実施例４に記述し、図４に示
す。
3.拡張されたエネルギー移動に基づく均一DNAハイブリ
ッド形成検定法 次に低蛍光背景の拡張されたエネルギー移動過程を使
用する均一DNAハイブリッド形成検定法について記述す
る。この系には複数供与体、受容体および消光オリゴヌ
クレオチドが含まれる。
20〜100ヌクレオチド長の複数供与体オリゴヌクレオ
チド（MDO）をDABITC（非蛍光性）供与基を用いて３〜
６塩基対の間隔で標識する。この複数供与体系は実施例
１で議論した配置に類似するいくつかの複数供与体プロ
ーブの配置であってもよい。複数供与体オリゴマーの少
なくとも10〜50ヌクレオチド部分は標的DNA配列の特定
の部分に相補的である。
15〜50ヌクレオチド長の受容体オリゴヌクレオチド
（AO）を、その5'−末端位置か、もしくはその近傍でテ
キサス・レッドを用いて標識する。この受容体オリゴヌ
クレオチドは、複数供与体オリゴマーに特異的な標的配
列と連続するDNA標的配列の部分に対して相補的であ
る。
10〜45ヌクレオチド長の消光オリゴヌクレオチド（Q
O）を、その3'−末端位置か、もしくはその近傍でリア
クティブ・レッド４を用いて標識する。この消光オリゴ
マーを受容体オリゴマーに対して相補的にするが、消光
オリゴマーは５〜10塩基分短い。消光オリゴマーは、そ
れが受容体オリゴマーにハイブリッド形成した時に、リ
アクティブ・レッド４基がテキサス・レッド基の１〜５
塩基内にあって、テキサス・レッド蛍光の完全な消光を
もたらすように構築する。
図４はこの均一検定法を示している。この手法はハイ
ブリッド形成の分野で一般的な水性緩衝液を用いて行う
ことができる。最初に複数供与体オリゴマーをハイブリ
ッド形成していない（一本鎖）オリゴマーとしてこの均
一系に供し、受容体オリゴマーにハイブリッド形成した
系に消光オリゴマーを供する。標的DNAはこの検定系中
に既存させるか、もしくはこの時点で検定系に加える。
次にこの系を、標的DNAの変性を引き起こす温度に加熱
する。次にその系を冷却することによって、新しい特異
的なハイブリッド形成を起こさせる。次いで供与体オリ
ゴマーが標的DNA上の相補的配列にハイブリッド形成
し、受容体オリゴマーも複数供与体の隣で標的DNAにハ
イブリッド形成する。両オリゴマーは予め選択された標
的配列に対して、計画した会合（ハイブリッド形成）時
に末端供与基が受容基の３〜６塩基対内に位置するよう
に構築される。消光オリゴマーは受容体よりも長さが短
くなるように設計され、それゆえに受容体オリゴマーを
結合した標的へのハイブリッド形成に関して標的配列と
効果的に競争することができない。ハイブリッドしてい
ないあらゆる受容体オリゴマーは消光オリゴマーと再ハ
イブリッド形成する。この時点で標的DNAは、テキサス
・レッド基への効率のよい拡張されたエネルギー移動の
ために、供与体オリゴマーと受容体オリゴマーを組織化
している。蛍光分析によって標的DNAを定量的に決定す
ることができる。
次に上記の会合系を430nmで励起し、615nmにおける蛍
光放射を決定する。この均一系は、複数受容体基のいず
れか、ならびに、非標的ハイブリッド形成した受容体オ
リゴマーのいずれかからの蛍光背景がないという特有の
利点を有する。この特定の手法は、新しい拡張されたエ
ネルギー移動機構に基づいて開発することができるいく
つかの考え得る均一および不均一DNA検定系のほんの１
つを表すにすぎない。
4.緊密に接近した供与体−受容体配置における効率のよ
いエネルギー移動の立証 次に、末端受容体（テキサス・レッド）がその一次供
与体（フルオレセイン）から１ヌクレオチド単位（0.34
nm）によって分離されているオリゴヌクレオチドにおけ
る効率のよいエネルギー移動の立証について記述する。
このヌクレオチド配列におけるフルオレセイン供与体と
テキサス・レッド受容体の配置を次に示す（配列番号1
1）： 上記の蛍光修飾オリゴヌクレオチドを既に記述した技術
を用いて合成的に作成した。ただし上記オリゴヌクレオ
チドの5'−末端から２番目のヌクレオチドをフルオレセ
イン（Ｆ）ホスホルアミダイト（クローンテック）に置
き換えた。この第２ヌクレオチド位置を標準的なC6リン
カーアミン（アミノリンク２）で官能化し、次いでそれ
をテキサス・レッドと反応させた。得られたオリゴヌク
レオチド誘導体をポリアクリルアミドゲル（15％）電気
泳動で精製した。
この蛍光ホスホルアミダイト誘導体オリゴヌクレオチ
ドに関する蛍光エネルギー移動を、まずその誘導体を相
補的なオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成ささせた
後に行った。両オリゴヌクレオチドの濃度は25μg/mlで
あり、ハイブリッド形成は１×SSC（pH7.0）中室温で行
った。490nmで励起すると、この誘導体はテキサス・レ
ッド受容体による610nm再放射に関して、＞50％のエネ
ルギー移動をもたらした。このことは、２次的な消光機
構が減じらたいる密接な間隔の供与体−受容体配置と、
受容体再放射に関してより高いエネルギー移動が観測さ
れることを明確に立証している。
上の記述は本発明の例示を意図するものであって、制
約を意図するものではない。本発明の真の思想と範囲か
ら逸脱することなく数多くの改変や修飾を施すことがで
きる。
配 列 表 （１） 一般的情報 （ｉ） 特許出願人：ヘラー，マイケル・ジェイ （ii） 発明の名称：発色団および蛍光団を含有する
ポリヌクレオチドに基づく自己組織化の分子性光子構造
ならびにその使用方法 （iii） 配列の数:11 （iv） 連絡先： （Ａ） 名宛人：トーマス・フィッティング （Ｂ） 通り：スイート300、ハイ・ブラフ・ドラ
イブ12526番 （Ｃ） 市：サン・ディエゴ （Ｄ） 州：カリフォルニア （Ｅ） 国：アメリカ合衆国 （Ｆ） ZIP:92130 （ｖ） コンピューター解読書式： （Ａ） 媒体型：フロッピー・ディスク （Ｂ） コンピューター:IBM PC適合 （Ｃ） オペレーティング・システム:PC−DOS/MS
−DOS （Ｄ） ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0、V
ersion ＃1.25 （vi） 本出願のデータ： （Ａ） 出願番号:PCT/US92 （Ｂ） 出願日:1992年11月６日 （Ｃ） 分類：未 定 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号:US 07/790,262 （Ｂ） 出願日:1992年11月７日 （viii） 弁理士／代理人情報： （Ａ） 氏名：フィッティング，トーマス （Ｂ） 登録番号:34,163 （Ｃ） 参照／整理番号:HEL0005P （ix） 電話連絡先情報： （Ａ） 電話番号:619−792−3680 （Ｂ） ファックス番号:619−792−8477 （２） 配列番号１の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:10塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:10 （Ｄ） 他の情報:/注−「3'のＴヌクレオチドのと
ころに供与発色団」 （xi） 配列：配列番号1: （２） 配列番号２の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:10塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:1 （Ｄ） 他の情報:/注−「5'のＴヌクレオチドのと
ころに受容発色団」 （xi） 配列：配列番号2: （２） 配列番号３の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:20塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列：配列番号3: （２） 配列番号４の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:16塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:6 （Ｄ） 他の情報:/注−「スルホローダミン101（T
exas Red）でラベルされたＴヌクレオチド」 （xi） 配列：配列番号4: （２） 配列番号５の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:30塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:11 （Ｄ） 他の情報:/注−「フルオレセインでラベル
されたＴヌクレオチド」 （ix） 配列の特徴 （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:18 （Ｄ） 他の情報:/注−「フルオレセインでラベル
されたＴヌクレオチド」 （xi） 配列：配列番号5: （２） 配列番号６の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:29塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:11 （Ｄ） 他の情報:/注−「フルオレセインでラベル
されたＴヌクレオチド」 （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:18 （Ｄ） 他の情報:/注−「フルオレセインでラベル
されたＴヌクレオチド」 （xi） 配列：配列番号6: （２） 配列番号７の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:29塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:11 （Ｄ） 他の情報:/注−「フルオレセインでラベル
されたＴヌクレオチド」 （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:19 （Ｄ） 他の情報:/注−「フルオレセインでラベル
されたＴヌクレオチド」 （xi） 配列：配列番号7: （２） 配列番号８の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:15塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:5 （Ｄ） 他の情報:/注−「フルオレセインでラベル
されたＴヌクレオチド」 （xi） 配列：配列番号8: （２） 配列番号９の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:13 （Ｄ） 他の情報:/注−「フルオレセインでラベル
されたＴヌクレオチド」 （xi） 配列：配列番号9: （２） 配列番号10の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:1 （Ｄ） 他の情報:/注−「Texas Redでラベルされ
たＧヌクレオチド」 （xi） 配列：配列番号10: （２） 配列番号11の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:24塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:DNA（genomic） （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （ix） 配列の特徴： （Ａ） 特徴を表す記号:misc feature （Ｂ） 存在位置:1 （Ｄ） 他の情報:/注−「5'のＧヌクレオチドがそ
の１次供与体フルオレセイン（Ｆ）から末端Texas Red
（TR）受容体を隔てる」 （xi） 配列：配列番号11:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−157570（ＪＰ，Ａ) 米国特許4822746（ＵＳ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ 1988, Ｖｏｌ．85，Ｎｏ．23，ｐｐ．8790− 8794 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/00 - 21/04 C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (45)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】末端供与発色団、少なくとも１つの中間供
    与−受容発色団、および少なくとも１つの受容発色団を
    有するポリヌクレオチドであって、すべての該発色団は
    リンカーアームによって該ポリヌクレオチドに結合して
    おり、該末端供与発色団と１つの該受容発色団の間の距
    離は5nmを越え、該距離以内に少なくとも１つの該中間
    供与発色団が存在するポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】少なくとも１つの受容発色団が光を再放射
    する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】少なくとも１つの該供与発色団から運ばれ
    た光が受容体再発光の増加をもたらす請求項２に記載の
    ポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】供与発色団が4,4'−ジイソチオシアナトジ
    ヒドロスチルベン−2,2'−ジスルホン酸、４−アセトア
    ミド−4'−イソチオシアナトスチルベン−2,2'−ジスル
    ホン酸、4,4'−ジイソチオシアナトスチルベン−2,2'−
    ジスルホン酸、スクシンイミジルピレンブチレート、ア
    クリジンイソチオシアネート、４−ジメチルアミノフェ
    ニルアゾフェニル−4'−イソチオシアネート（DABIT
    C）、ルシファーイエロービニルスルホン、フルオレセ
    インイソチオシアネート、リアクティブレッド４（チバ
    クロンブリリアントレッド3B−Ａ）、ローダミンＸイソ
    チオシアネート、スルホローダミン101酸クロライド、
    マラカイトグリーンイソチオシアネートおよびIR144か
    らなる群から選ばれる請求項１に記載のポリヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項５】該末端供与発色団および該少なくとも１つ
    の中間供与発色団が非蛍光性発色団である請求項２に記
    載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】該末端供与発色団および該少なくとも１つ
    の中間供与発色団が２〜100の発色団を含む請求項２に
    記載のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】受容発色団が蛍光性受容発色団である請求
    項２に記載のポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】蛍光性の受容発色団がピレン、ルシファー
    イエロービニルスルホン、アクリジンイソチオシアネー
    ト、リボフラビン、フルオレセインイソチオシアネー
    ト、ローダミンイソチオシアネート、スルホローダミン
    101酸クロライドおよびIR144からなる群から選ばれる請
    求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】電子回路とコミュニケートできる拡張され
    た光子エネルギー移動システムであって、該移動システ
    ムは、リンカーアームによってポリヌクレオチドに結合
    した末端供与発色団、少なくとも１つの中間供与発色
    団、および少なくとも１つの受容発色団を有するポリヌ
    クレオチドを含み； 該末端供与発色団と１つの該受容発色団の間の距離は5n
    mを越え、少なくとも１つの該中間供与発色団が存在
    し；そして 少なくとも１つの発色団は電気エネルギーを光子エネル
    ギーに転換するエネルギー移動システム。
  10. 【請求項１０】電気エネルギーを光子エネルギーに転換
    するために適応させる発色団が、ルミネセンス化合物、
    ルテニウム複合体，および光ボルタ電池よりなる群から
    選択される請求項９に記載の移動システム
  11. 【請求項１１】電子回路とコミュニケートできる拡張さ
    れた光子エネルギー移動システムであって、該移動シス
    テムは、リンカーアームによってポリヌクレオチドに結
    合した末端供与発色団、少なくとも１つの中間供与発色
    団、および少なくとも１つの受容発色団を有するポリヌ
    クレオチドを含み；該末端供与発色団と１つの該受容発
    色団の間の距離は5nmを越え、少なくとも１つの該中間
    供与発色団が存在し；そして少なくとも１つの該発色団
    は光子エネルギーを電気エネルギーに転換するエネルギ
    ー移動システム。
  12. 【請求項１２】光子エネルギーを電気エネルギーに転換
    するために適応させる発色団が、ルミネセンス化合物、
    ルテニウム複合体，および光ボルタ電池よりなる群から
    選択される請求項11に記載の移動システム
  13. 【請求項１３】予め選択したヌクレオチド配列の光子検
    出のための診断検定システムであって、末端供与発色
    団、少なくとも１つの中間供与−受容発色団を有するポ
    リヌクレオチドを少なくとも１つの検定に十分な量で含
    有し、すべての発色団はリンカーアームによってポリヌ
    クレオチドに結合しており、該末端供与発色団と１つの
    該受容発色団の間の距離は5nmを越え、該距離以内に少
    なくとも１つの該中間供与発色団が存在する 診断検定システム。
  14. 【請求項１４】末端供与発色団、該少なくとも１つの中
    間供与発色団、および該少なくとも１つの受容発色団の
    少なくとも１つがリンカーにより該ポリヌクレオチドに
    作動可能に結合した蛍光性の受容発色団であって、蛍光
    性発色団は該非蛍光性発色団の少なくとも１つから供与
    体−受容体移動距離で該結合により配置されている請求
    項13に記載の診断システム。
  15. 【請求項１５】リンカーアームにより第２のポリヌクレ
    オチドに結合した少なくとも１つの蛍光性の受容発色団
    を含む第２のポリヌクレオチドをさらに含む請求項13に
    記載の診断システム。
  16. 【請求項１６】拡張された光子エネルギー移動ができる
    二本鎖核酸構造体であって、該構造体は、 第１のポリヌクレオチド； 第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズした第２のポ
    リヌクレオチド； 該第１のヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチド
    の一つにリンカーアームにより結合した末端供与発色
    団； 該第１のヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチド
    の一つにリンカーアームにより結合した少なくとも１つ
    の中間供与発色団；および 該第１のポリヌクレオチドと該第２の１つにリンカーア
    ームにより結合した少なくとも１つの受容発色団； を含んでなり、 該末端供与発色団と１つの該受容発色団の間の距離は5n
    mを越え、供与体−供与体移動該距離だけ該末端供与発
    色団から間隔を置いて配置した少なくとも１つの該中間
    供与発色団が存在し、 該供与発色団と受容発色団は第１のポリヌクレオチドと
    第２のポリヌクレオチド上で交互に配置され、その結果
    光子エネルギー移動は、該２本鎖の該第１および第２ポ
    リヌクレオチドの間で交叉する、 二本鎖核酸構造体。
  17. 【請求項１７】供与体−供与体移動距離が約1.4〜約6.1
    ナノメーターである請求項16に記載の構造体。
  18. 【請求項１８】供与発色団が4,4'−ジイソチオシアナト
    ジヒドロスチルベン−2,2'−ジスルホン酸、４−アセト
    アミド−4'−イソチオシアナトスチルベン−2,2'−ジス
    ルホン酸、4,4'−ジイソチオシアナトスチルベン−2,2'
    −ジスルホン酸、スクシンイミジルピレンブチレート、
    アクリジンイソチオシアネート、４−ジメチルアミノフ
    ェニルアゾフェニル−4'−イソチオシアネート（DABIT
    C）、ルシフェールイエロービニルスルホン、フルオレ
    セインイソチオシアネート、リアクティブレッド４（チ
    バクロン.RTM.ブリリアントレッド−Ａ）、ローダミン
    Ｘイソチオシアネート、スルホローダミン101、マラカ
    イトグリーン イソチオシアネートおよびIR1446からな
    る群から選ばれる請求項16に記載の構造体。
  19. 【請求項１９】該末端供与発色団が非蛍光性発色団であ
    る請求項16に記載の構造体。
  20. 【請求項２０】該少なくとも１つの中間供与発色団が１
    〜99の発色団を含む請求項16に記載の構造体。
  21. 【請求項２１】該第１のポリヌクレオチドおよび該第２
    のポリヌクレオチドの１つにリンカーアームにより機能
    的に結合した少なくとも１つの蛍光性受容発色団をさら
    に含む請求項16に記載の構造体であって、該少なくとも
    １つの蛍光性受容性発色団は該供与発色団の少なくとも
    １つから供与体−受容体移動距離で該リンカーアームに
    より位置づけられている構造体。
  22. 【請求項２２】該供与体−受容体移動距離が0.1〜1.7nm
    である請求項21に記載の構造体。
  23. 【請求項２３】該蛍光性受容発色団が、ピレン、ルシフ
    ァーイエロー、アクリジン、リボフラビン、フルオレセ
    イン、ローダミン、スルフォローダミン、101、およびI
    R144よりなる群から選択される請求項21に記載の構造
    体。
  24. 【請求項２４】該第１のポリヌクレオチドおよび第２の
    ポリヌクレオチドの少なくとも１つが固体支持体に結合
    している請求項16に記載の構造体。
  25. 【請求項２５】固体支持体がガラス、金属、シリコン、
    有機高分子、膜、およびバイオポリマーよりなる群から
    選択される請求項24に記載の構造体。
  26. 【請求項２６】溶液中の分析物の存在を検出するバイオ
    センサーであって、該分析物は標的DNA配列を含み、該
    バイオセンサーは、 放射する光子エネルギーを運搬するための励起源； リンカーアームによってポリヌクレオチドに結合させた
    末端供与発色団および少なくとも１つの中間供与発色団
    を有する第１のポリヌクレオチドを含む供与配列（該第
    １のポリヌクレオチドは該標的DNA配列の第１領域に相
    補的である）； リンカーアームによって第２のポリヌクレオチドに結合
    させた少なくとも１つの受容発色団を有する第２のポリ
    ヌクレオチドを含む受容配列（該第２のポリヌクレオチ
    ドは該標的DNA配列の第２領域に相補的であり;1の供与
    発色団と１の受容発色団間の距離はそれらがエネルギー
    移動関係にあるようなものである）；そして 該受容体から放射された光子エネルギーを検出するため
    の光子感知手段 を含むバイオセンサー。
  27. 【請求項２７】ハイブリダイゼーションした時、該分析
    物が該光子感知手段による検知を可能にするに十分近い
    請求項26に記載のバイオセンサー。
  28. 【請求項２８】該第１のポリヌクレオチド、該第２のポ
    リヌクレオチドおよび該標的DNA配列の少なくとも１つ
    が分析物溶液に不溶性の固体支持体またはマトリックス
    に結合している請求項26に記載のバイオセンサー。
  29. 【請求項２９】固体支持体またはマトリックスがガラ
    ス、金属、シリコン、有機高分子、膜、およびバイオポ
    リマーよりなる群から選択される請求項28に記載のバイ
    オセンサー。
  30. 【請求項３０】該関連光子センサー手段が光ダイオー
    ド、光ダイオードアレイ、光電子増倍管、繊維光検出シ
    ステムである請求項26に記載のバイオセンサー。
  31. 【請求項３１】溶液中の分析物の存在を検知するための
    バイオセンサーであって、該分析物は標的DNA配列を含
    み、該バイオセンサーは、 放射する光子エネルギーを運搬するための励起源； リンカーアームにより第１のポリヌクレオチドに結合し
    ている末端供与発色団および少なくとも１つの中間供与
    発色団を有する第１のポリヌクレオチドを含む供与体配
    列（該第１のポリヌクレオチドは該標的DNA配列の第１
    の領域に相補的である）； リンカーアームにより第２のポリヌクレオチドに結合し
    ている少なくとも１つの受容発色団を有する第２のポリ
    ヌクレオチドを含む供与体配列（該第２のポリヌクレオ
    チドは該標的DNA配列の第２の領域に相補的である）； 該受容体から放射される光子エネルギーを検出するため
    の関連光子感知手段 を含んでなり、 該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオ
    チドは該標的DNA配列とハイブリダイズして複合体を形
    成することができ、該末端供与発色団および１つの該受
    容発色団間の距離が5nmを超え、少なくとも１つの該中
    間供与発色団が存在するバイオセンサー。
  32. 【請求項３２】該分析物がハイブリダイゼーションする
    と該光子感知手段に接近して関連している請求項31に記
    載のバイオセンサー。
  33. 【請求項３３】該第１のポリヌクレオチド、該第２のポ
    リヌクレオチドおよび該標的DNA配列の少なくとも１つ
    が分析物溶液に不溶性の固体の支持体またはマトリック
    スに結合している請求項31に記載のバイオセンサー。
  34. 【請求項３４】固体支持体またはマトリックスがガラ
    ス、金属、シリコン、有機高分子、膜、およびバイオポ
    リマーよりなる群から選択される請求項33に記載のバイ
    オセンサー。
  35. 【請求項３５】該関連光子センサー手段が光ダイオー
    ド、光ダイオードアレイ、光電子増倍管、繊維光検出シ
    ステムよりなる群から選択される請求項31に記載のバイ
    オセンサー。
  36. 【請求項３６】核酸を含有する試料中の予め選択した核
    酸標的配列の存在を検出する方法であって、 （ａ）（ｉ）末端受容発色団、少なくとも１つの中間供
    与体−受容発色団、及び少なくとも１つの受容発色団は
    を有するポリヌクレオチドであって、該発色団はリンカ
    ーアームにより該ポリヌクレオチドに結合しており、該
    末端受容発色団、および１つの該受容発色団間の距離は
    5nmより大きく、該距離内に該中間供与発色団が存在す
    るポリヌクレオチド、および （ii）ハイブリダイゼーション反応混合物を形成する該
    核酸を含有する試料であって、該ポリヌクレオチドは該
    標的配列にハイブリダイズするよう適応させた予め選択
    した核酸塩基配列を有する可能性のある該核酸含有試
    料、 を混合し、 （ｂ）該ポリヌクレオチドが該予め選択した核酸塩基配
    列にハイブリダイズし、供与発色団を含み、受容発色団
    を含むハイブリダイズした核酸２本鎖を形成するに十分
    な時間該ハイブリダイゼーション反応混合物をハイブリ
    ダイゼーション条件に付し； （ｃ）該受容配色団から光子エネルギーの放射を誘導す
    る十分な光子エネルギーに該供与発色団をさらすことに
    よって、工程（ｂ）で形成した該核酸２本鎖において該
    供与発色団を励起させ；そして （ｄ）光子感知手段を用いて該受容発色団から再放射さ
    れた光子エネルギーの存在を検出し、それによって該試
    料中の該予め選択した核酸標的配列の存在を検出する； 工程を含む方法。
  37. 【請求項３７】該末端供与発色団および該少なくとも１
    つの中間供与発色団が供与体の最大励起に対応する波長
    の光子エネルギーにより励起される請求項36に記載の方
    法であって、該受容体から再放射された光子エネルギー
    がその放射波長で検出される方法。
  38. 【請求項３８】ポリヌクレオチドの１つおよび核酸標的
    配列の少なくともを固体支持体またはマトリックスに結
    合する請求項36に記載の方法。
  39. 【請求項３９】固体支持体またはマトリックスがガラ
    ス、金属、シリコン、有機高分子、膜、およびバイオポ
    リマーから選択される請求項38に記載の方法。
  40. 【請求項４０】光子感知手段が固体支持体またはマトリ
    ックスに接近して関連づけられている請求項38に記載の
    方法。
  41. 【請求項４１】核酸を含有する試料中の予め選択した核
    酸標的配列の存在を検出する方法であって、 （ａ）（ｉ）末端供与発色団、および少なくとも１つの
    中間供与−受容発色団を有する第１のポリヌクレオチド
    であって、該供与発色団および供与−受容発色団はリン
    カーアームにより該第１のポリヌクレオチドに結合して
    いるポリヌクレオチド、および （ii）リンカーアームにより該第２のポリヌクレオチド
    に結合している少なくとも１つの受容発色団を有する第
    ２のポリヌクレオチド； （iii）ハイブリダイゼーション反応混合物を形成する
    該核酸を含有する試料であって、該第１および第２のポ
    リヌクレオチドは該標的配列にハイブリダイズし、それ
    により該第１のポリヌクレオチド上に該末端供与体を、
    そして該第２のポリヌクレオチド上に１つの該受容発色
    団を5nmより大きい距離で配置するよう適応させた予め
    選択した核酸標的配列を有し、該距離内に少なくとも１
    つの該中間受容発色団が存在する試料； を混合し； （ｂ）該ポリヌクレオチドが該予め選択した核酸塩基配
    列にハイブリダイズし、供与発色団を含み、受容発色団
    を含むハイブリダイズした核酸２本鎖を形成するに十分
    な時間該ハイブリダイゼーション反応混合物をハイブリ
    ダイゼーション条件に付し； （ｃ）該受容発色団からの光子エネルギーの放射を誘導
    する十分な光子エネルギーに該供与発色団をさらすこと
    によって、工程（ｂ）で形成した該核酸２本鎖の該供与
    発色団を励起し、再放射される光子エネルギーの存在を
    検出し；そして （ｄ）光子感知手段を用いて該受容発色団から再放射さ
    れた光子エネルギーの存在を検出し、それによって該試
    料中の該予め選択した核酸標的配列の存在を検出する； 工程を含む方法。
  42. 【請求項４２】該供与発色団を供与体の最大励起に対応
    する波長の光子エネルギーにより励起し、該受容体から
    再放射される光子エネルギーはその放射波長で検出され
    る請求項41に記載の方法。
  43. 【請求項４３】第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌ
    クレオチド、および核酸標的配列の少なくとも１つを固
    体支持体またはマトリックスに結合する請求項41に記載
    の方法。
  44. 【請求項４４】固体支持体またはマトリックスがガラ
    ス、金属、シリコン、有機高分子、膜およびバイオポリ
    マーから選択される請求項43に記載の方法。
  45. 【請求項４５】光子感知手段が固体支持体またはマトリ
    ックスに密接に関連づけられている請求項43に記載の方
    法。
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