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DE69231853T2 - Hybridisierung von mit chromophoren und fluorophoren konjugierten polynukleotiden zur erzeugung eines donor-zu-donor energietransfersystems - Google Patents

Hybridisierung von mit chromophoren und fluorophoren konjugierten polynukleotiden zur erzeugung eines donor-zu-donor energietransfersystems

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DE69231853T2
DE69231853T2 DE69231853T DE69231853T DE69231853T2 DE 69231853 T2 DE69231853 T2 DE 69231853T2 DE 69231853 T DE69231853 T DE 69231853T DE 69231853 T DE69231853 T DE 69231853T DE 69231853 T2 DE69231853 T2 DE 69231853T2
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DE
Germany
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donor
chromophore
acceptor
polynucleotide
chromophores
Prior art date
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DE69231853T
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J. Heller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanotronics Imaging Inc
Original Assignee
Nanotronics Inc
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Publication date
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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Konstruktion und die Synthese modifizierter synthetischer Nukleinsäure-Polymere/-Oligomere mit direkt inkorporierten lektronen/Photonentransfer-Eigenschaften. Insbesondere betrifft sie die Eigenschaft der erweiterten gerichteten strahlungslosen Energieübertragung. Diese einzigartigen Komponenten können auf eine Selbstzusammenzusetzung und -organisation zu größeren, komplexeren Strukturen hin programmiert werden. Die direkt inkorporierten funktionellen Elektronen/Photonen-Eigenschaften ermöglichen den Erhalt von Verbindungen und neuartigen Mechanismen innerhalb der organisierten Strukturen, wobei die Kombination aus den Eigenschaften schließlich die Schaffung nützlicher Photo- und Sperrschichtphotoelemente, DNA-Biosensoren und diagnostischer DNA- Assay-Systeme ermöglicht.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Die Bereiche der Molekularelektronik/Photonik und der Nanotechnologie bieten ein immenses technologisches Potential für die Zukunft. Die Nanotechnologie kann als eine geplante Technologie auf der Grundlage einer generalisierten Fähigkeit zum Konstrukieren von Objekten nach komplexen atomaren Spezifikationen definiert werden. Drexler, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 78: 5275-5278, (1981). Nanotechnologie bedeutet, die Organisation und den Aufbau komplexer Strukturen von Atom zu Atom oder Molekül zu Molekül bis hin zur makroskopischen Ebene zu kontrollieren. Die Nanotechnologie stellt einen von unten nach oben aufbauenden Ansatz dar, im Gegensatz zur von oben nach unten vorgehenden Strategie bei den aktuellen lithographischen Methoden, die in den industriellen Bereichen der Halbleiter und integrierten Schaltkreise eingesetzt werden. Der Erfolg der Nanotechnologie basiert auf der Entwicklung programmierbarer selbstzusammensetzender molekularer Elemente und Werkzeugmaschinen auf molekularem Niveau, sogenannten "Assemblern", die die Konstruktion eines breiten Bereichs molekularer Strukturen und Bauelemente ermöglichen werden. Drexler, in "Engines of Creation", Doubleday Publishing Co., New York, NY (1986). Daher besteht eines der zuvordersten und wichtigsten Ziele der Nanotechnologie in der Entwicklung programmierbarer selbstzusammensetzender molekularer Bauelemente.
  • Die Technologie der Molekularelektronik/Photonik bezieht gegenwärtig zahlreiche Anstrengungen von Wissenschaftlern und Ingenieuren aus den unterschiedlichsten Fachbereichen mit ein. Carter, Hrg. in "Molecular Electronic Devices II", Marcel Dekker, Inc. New York, NY (1987). Diese Fachbereiche umfassen organische Gleichrichter auf Polymerbasis, Metzger et al., in "Molecular Electronic Devices 11", Carter, Hrg., Marcel Dekker, New York, NY, S. 5-25 (1987), leitende konjugierte Polymere, MacDiarmid et al., Svnthetic Metals, 18: 285, (1987), elektronische Eigenschaften organischer Dünnschichten oder Langmuir-Blogett-Filme, Watanabe et al., S nthetic Metals, 28: C473, (1989), molekulare Schieberegister auf der Basis des Elektronentransfers, Hopfield et al., Science, 241: 817, (1988), und ein selbstzusammensetzendes System auf der Basis synthetisch modifizierter Lipide, die eine Vielzahl unterschiedlicher "röhrenförmiger" Mikrostrukturen bilden. Singh et al., in "Applied Bioactive Polymeric Materials, Plenum Press, New York, NY, S. 239-249. (1988), molekulare optische oder Photoelemente auf der Basis konjugierter organischer Polymere, Baker et al., Synthetic Metals, 28: D639, (1989), wobei auch nicht-lineare organische Materialen beschrieben wurden; Potember et al., Proc. Annual Conf. IEEE in Medicine and Bioloay, Teil 4/6 : 1302-1303, (1989).
  • Allerdings ist in keiner der zitierten Literaturstellen ein weitentwickeltes oder programmierbares Niveau der Selbstorganisation oder Selbstzusammensetzung beschrieben. Typischerweise besteht das molekulare Bauelement, das den Elektronen- und/oder Photonenmechanismus bewirkt, in einem natürlichen biologischen Protein oder einem anderen Molekül. Akaike et al., Proc. Annual Conf. IEEE in Medicine and Biolociv, Teil 4/6: 1337-1338, (1989). Derzeit liegen keine Beispiele eines völlig synthetischen, programmierbaren, selbstzusammensetzenden Moleküls vor, das eine leistungsfähige Elektronen- oder Photonenstruktur, -mechanismus oder -element erzeugt.
  • Ein tiefergehendes Verständnis der Selbstorganisation in biologischen Systemen ist für die Nanotechnologie relevant. Drexler, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 78: 5275-5278, (1981). Drexler, in "Engines of Creation", Doubleday Publishing Co., New York, NY (1986). Zu Bereichen, in denen ein wesentlicher Fortschritt erzielt wurde, zählen die Organisation der lichtgewinnenden photosynthetischen Systeme, die energieumwandelnden Elektronentransportsysteme, der Sehprozess, die Nervenleitung und die Struktur und Funktion der Proteinkomponenten, aus denen diese Systeme bestehen. Mit den sogenannten Biochips wurde die Verwendung synthetisch oder biologisch modifizierter Proteine zur Konstruktion molekularelektronischer Elemente beschrieben. Haddon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 1874-1878 (1985). (McAlear et al., in "Molecular Electronic Devices II", Carter Hrg., Marcel Dekker, Inc., New York NY, S. 623-633, (1987). Es wurden einige Untersuchungen zu synthetischen Proteinen (Polypeptiden) mit dem Ziel der Entwicklung leitfähiger Netzwerke durchgeführt. McAlear et al., in "Molecular Electronic Devices", Carter Hrg., Marcel Dekker, New York, NY, S. 175-180, (1982). Weitere Forscher vermuteten, dass Biochips auf Nukleinsäure-Basis vielversprechender sein könnten. Robinson et al., "The Design of a Biochip: a Self- Assembling Molecular-Scale Memory Device", Protein Engineering, 1: 295-300, (1987).
  • Große Fortschritte bezüglich unseres Verständnisses von Struktur und Funktion der Nukleinsäuren, von Disoxyribonukleinsäure oder DNA, wurden ebenfalls gemacht, Watson, et al., in "Molecular Biology of the Gene", Bd. 1, Benjamin Publishing Co., Menlo Park, CA, (1987), die der Träger der genetischen Information in allen lebenden Organismen ist. In der DNA ist die Information in der linearen Sequenz der Nukleotide durch ihre Baseneinheiten Adenin, Guanin, Cytosin und Thymidin (A, G, C und T) kodiert. Die einzelnen Stränge der DNA (oder Polynukleotide) weisen die einzigartige Eigenschaft auf, ihre komplementäre Sequenz zu erkennen und an sie durch Hybridisierung zu binden, wodurch eine doppelsträngige Nukleinsäure- Duplexstruktur erhalten wird. Dies ist durch die den Nukleinsäuren zueigenen basenpaarenden Eigenschaften möglich; A erkennt T und G erkennt C. Diese Eigenschaft ergibt einen sehr hohen Grad der Spezifität, da jede gegebene Polynukleotid-Sequenz ausschließlich an ihre exakt komplementäre Sequenz hybridisiert.
  • Über die Molekularbiologie der Nukleinsäuren hinaus wurde auch ein großer Fortschritt im Bereich der chemischen Synthese der Nukleinsäuren (16) erzielt. Mittels dieser Technologie wurden automatisierte Instrumente entwickelt, so dass nun in effizienter Weise Sequenzen von über 100 Nukleotiden Länge bei Syntheseraten von 15 Nukleotiden pro Stunde synthetisiert werden können. Ebenso wurden viele Methoden zur Modifikation der Nukleinsäuren durch funktionelle Gruppen einschließlich Fluorophoren, Chromophoren, Affinitätsmarkern, Metallchelaten, chemisch reaktiven Gruppen und Enzymen entwickelt. Smith et al., Nature, 321: 674-679, (1986); Agarawal et al., Nucleic Acids Research, 14: 6227- 6245, (1986); Chu et al., Nucleic Acids Research, 16: 3671-3691, (1988).
  • Ein Impuls zur Entwicklung sowohl der Synthese als auch der Modifikation der Nukleinsäuren stellte die Möglichkeit dar, diese in klinischen diagnostischen Assays zu verwenden, einem Bereich, der auch als DNA-Sondendiagnostik bezeichnet wird. Einfache Photonenmechanismen wurden in modifizierte Oligonukleotide in einer Bemühung aufgenommen, den diagnostischen DNA-Sonden-Assay-Systemen empfindliche Fluoreszenznachweis-Eigenschaften zu verleihen. Dieser Ansatz umfasste Fluorophor- und Chemielumineszenz-markierte Oligonukleotide, die den strahlungslosen Förster-Energietransfer ausführen. Heller et al., in "Rapid Detection and Identification of Infectious Agents", Kingsbury et al., Hrg., Academic Press, New York, NY S. 345-356, (1985). Beim strahlungslosen Förster-Energietransfer handelt es sich um einen Vorgang, bei dem eine bei einer Wellenlänge angeregte Fluoreszenz-Donor-(D)-Gruppe ihre absorbierte Energie mittels eines resonanten Dipol-Kopplungsprozesses an eine geeignete Fluoreszenz-Akzeptor-(A)-Gruppe überträgt. Die Leistungsfähigkeit der Energieübertragung zwischen einer geeigneten Donor- und einer Akzeptor-Gruppe zeigt eine Abhängigkeit des Abstands von 1/r&sup6; (siehe Lakowicz et al., in "Principles of Fluorescent Spectroscopy", Plenum Press, New York, NY, Kap. 10, S. 305-337, (1983)).
  • In der Arbeit von Heller et al., supra, sind zwei Fluorophor-markierte Oligonukleotide so gestaltet, dass sie an benachbarte Abschnitte eines komplementären Ziel- Nukleinsäurestrangs binden oder hybridisieren und dann eine effiziente Fluoreszenz- Energieübertragung bezüglich der Sekundäremission durch den Akzeptor erzeugen. Das erste Oligonukleotid ist an der 3'-terminalen Position mit einer geeigneten Donor-Gruppe markiert, und das zweite ist an der 5-terminalen Position mit einer geeigneten Akzeptor-Gruppe markiert. Die Bindung oder Hybridisierung an die komplementäre Sequenz positioniert die Fluoreszenz-Donor-Gruppe und die Fluoreszenz-Akzeptor-Gruppe so, dass sie in optimalem Abstand (theoretisch) für die effizienteste strahlungslose Förster-Energieübertragung zueinander stehen. Allerdings war die beobachtete Leistung der Energieübertragung bezüglich der Sekundäremission durch den Akzeptor bei dieser speziellen Anordnung relativ gering (~20%).
  • In einer späteren Arbeit (Heller et al., Europäische Patentanmeldung Nr. EPO 0229943, 1987; und Heller et al., US-Patentschrift Nr. 4.996.143, 26. Februar 1991) boten die Fortschritte in der synthetischen Chemie Methoden zur Bindung von Fluorophoren an einer beliebigen Position innerhalb einer Oligonukleotid-Sequenz unter Verwendung eines Linkerarm-modifizierten Nukleotids. Ebenso war es mit dieser synthetischen Verknüpfungsmethode möglich, sowohl ein Donor- als auch ein Akzeptor-Fluorophor in das gleiche Oligonukleotid aufzunehmen. Unter Verwendung des speziellen Linkerarms wurde festgestellt, dass die wirksamste Energieübertragung (bezogen auf die Sekundäremission durch den Akzeptor) dann stattfindet, wenn der Donor und der Akzeptor durch fünf dazwischenliegende Nukleotid-Einheiten, oder etwa 1,7 Nanometer (nm), voneinander beabstandet waren. Heller et al., US-Patentschrift Nr. 4.996.143 zeigte außerdem, dass dann, wenn der Nukleotidabstand von 4 auf 0 Einheiten (1,4 nm bis 0 nm) abnimmt, die energieübertragende Leistung ebenfalls abnimmt, was nicht mit der Förster-Theorie übereinstimmt. Wurde der Nukleotid-Abstand von 6 auf 12 Einheiten (2 nm bis 4,1 nm) erhöht, so wurde die energieübertragende Leistung ebenfalls als abnehmend befunden, was der Förster-Theorie entspricht. Zu diesem Zeitpunkt war weder erklärt noch verstanden, warum die enger beabstandete Anordnung von Donor und Akzeptor die energieübertragende Leistung vermindert hatte und nicht mit der Förster-Theorie übereinstimmte. Insbesondere richteten sich die Lehren von Heller et al. nicht auf die multiple Donor-Resonanz und die erweiterte Energieübertragung von Donoren über Förster-Abstände von > 5 nm.
  • Die Fluoreszenz-Energieübertragung wird auch in weiteren Bereichen angewandt, zu denen die Immundiagnostik und die Flüssigchromatographie-Analyse zählen.
  • Morrison et al., Anal. Biochem., 174: 101-120, (1988); und Garner et al., Anal. Chem., 62: 2193-2198, (1990). Auch wurden einige der anfänglichen Nachweise der einfachen Fluoreszenz-Donor/Akzeptor-Energieübertragung in Nukleinsäuren später durch andere Forscher bestätigt. Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790-8794, (1988); und Morrison et al., Anal. Biochem., 183: 231-244 (1989). In der Arbeit von Cardullo et al. wurde eine Anordnung untersucht, bei der zwei kurze (12-mer) Oligonukleotid-Sequenzen, die beide mit Rhodamin-Akzeptoren terminal markiert und an eine komplementäre 29-mer-Sequenz hybridisiert wurden, mit mehreren interkalierenden Donoren (Acridinorange) verbunden sind. Die von Cardullo beschriebenen Anordnungen ergeben aufgrund der zusätzlichen Donoren eine gewisse zusätzliche Energieübertragung. Dieser Anstieg der energieübertragenden Leistungsfähigkeit ist jedoch gänzlich einer direkten Donor-zu- Akzeptor-Übertragung zuzuordnen, da keiner der Donoren als funktionsfähig jenseits des für die Energieübertragung erforderlichen Förster-Abstands beschrieben wurde. Bis heute liegen keine Beschreibungen einer organisierten Struktur vor, die zur erweiterten Energieübertragung von multiplen Donoren und zu einem Akzeptor jenseits der normalen Förster-Abstände fähig wäre.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft den Entwurf und die Synthese modifizierter synthetischer Nukleinsäure-Polymere/-Oligomere, in die funktionelle Elektronen/Photonen- Eigenschaften direkt inkorporiert sind. Insbesondere betrifft sie die Inkroporation der Eigenschaft eines erweiterten strahlungslosen energieübertragenden Prozesses in Anordnungen von synthetischen Nukleinsäuren.
  • Es wurde nun entdeckt, dass multiple Chromophor-Donor-Gruppen, die jenseits des normalen Förster-Abstands (> 5 nm) lokalisiert sind, so angeordnet werden können, dass sie Photonenenergie absorbieren und auf eine endständige Akzeptor-Gruppe übertragen, wobei sie als eine Lichtantenne oder ein Photonenleiter wirken. Diese Eigenschaft umfasst die Fähigkeit einer Anordnung von Donor-Gruppen, Photonenenergie bei einer Wellenlänge (hv&sub1;) zu absorbieren und sie über einen gekoppelten Resonanzprozess auf eine Akzeptor-Gruppe zu übertragen, wo sie dann als Photonenenergie einer längeren Wellenlänge (hv&sub2;) sekundäremittiert wird. Die Auswahl und relative Positionierung der speziellen Donor-Chromophor-Gruppen, umfassend nicht-fluoreszierende Chromophoren, zu geeigneten Akzeptor- Fluorophoren führt zu einem wirksamen erweiterten energieübertragenden Prozess mit einzigartigen Eigenschaften. Außerdem wurden geeignete Gestaltungen für Oligonukleotide und Polynukleotide gefunden, die es ermöglichen, eine primäre Donor-Gruppe dicht an einer Akzeptor-Gruppe zu plazieren.
  • Da die relativen Positionen der funktionellen Molekülkomponenten (Chromophoren) über ihre Plazierung an den Nukleotidsequenzen programmiert werden können, kann die Chromophoren enthaltende Nukleinsäure so gestaltet werden, dass sie sich selbst anordnet und zu größeren und komplexer definierten Strukturen organisiert. Die Programmierbarkeit und die funktionellen Elektronen/Photonen-Eigenschaften der Molekülkomponenten ermöglichen die Herstellung von Verbindungen, Amplifikationsmechanismen und Array-Antennen innerhalb der Nukleinsäure- Strukturen. Die Kombination der Eigenschaften schließlich erlaubt die Erzeugung von Photoelementen, Sperrschichtphotoelementen, Biosensoren und homogenen und heterogenen diagnostischen DNA-Assays.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Polynukleotid mit einem endständigen Donor-Chromophor, mindestens einem intermediären Donor-Akzeptor-Chromophor, das vom endständigen Donor-Chromophor in einer Donor-Donor- Übertragungsdistanz beabstandet ist, und mindestens einem Akzeptor-Chromophor, das vom Donor-Akzeptor-Chromophor in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist, bereit, wobei all diese Chromophoren an das Polynukleotid mittels Linkerarmen geknüpft sind, wobei die Distanz zwischen dem endständigen Donor- Chromophor und dem Akzeptor-Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solches intermediäres Donor-Chromophor innerhalb der Distanz liegt.
  • Die Erfindung stellt auch ein diagnostisches Assay-System ebenso wie ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, einen Biosensor, einen Nukleinsäure-Duplexstruktur, ein elektronisches Bauelement und ein erweitertes Photonenenergie-Übertragungssystem bereit, wobei das oben genannte Polynukleotid der Erfindung Anwendung findet.
  • Die Chromophoren sind daher durch die Verknüpfung entlang der Länge des Polynukleotids in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz positioniert. Typischerweise handelt es sich bei den Donor-Chromophoren um nichtfluoreszierende Chromophoren.
  • Das Polynukleotid kann außerdem ein fluoreszierendes Akzeptor-Chromophor enthalten, das an das Polynukleotid mittels eines Linkerarms funktionsfähig geknüpft ist, wobei das fluoreszierende Akzeptor-Chromophor durch die Verknüpfung in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz von den Donor-Chromophoren positioniert ist, so dass die multiplen Donoren Anregungslicht auffangen und auf den Akzeptor übertragen können, der dann das aufgefangene Licht wiederausstrahlt.
  • Bei einer anderen Ausführungsform können die Donor-Chromophoren und Akzeptor- Chromophoren auf mehr als einem Polynukleotid dargestellt werden, so dass bei ihrer Hybridisierung das fluoreszierende Akzeptor-Chromophor in eine Donor- Akzeptor-Übertragungsdistanz zu mindestens einem der Donor-Chromophoren gebracht wird. Daher werden Kombinationen der Polynukleotide erwogen, die zuvor ausgewählte Sequenzen und die erforderlichen Donor- und Akzeptor-Chromophoren enthalten, was auf vielfältige Anwendungen angepasst werden kann, wie hierin beschrieben.
  • Zum Beispiel wird ein diagnostisches Assay-System beschrieben, das ein zur Donor- Donor-Übertragung fähiges Polynukleotid enthält, wie oben beschrieben. Das System kann ein Akzeptor-Chromophor nutzen, das auf einem separaten Polynukleotid vorhanden ist, oder alternativ kann das Akzeptor-Chromophor auf demselben Polynukleotid wie die Donor-Chromophoren vorhanden sein.
  • Die Sequenzen der Polynukleotide können für die Zwecke der komplementären Hybridisierung ausgewählt werden, um dadurch die Zusammensetzung größerer, zur Donor-Donor-Übertragung und schließlichen zur Donor-Akzeptor-Übertragung fähigen Strukturen zu erleichtern. Alternativ dazu können die Sequenzen der Polynukleotide komplementär zu den Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen gewählt werden, um die Polynukleotide durch den Nachweis der Zielsequenzen in Proben diagnostisch anzuwenden.
  • Bei einer anderen Ausführungsform werden durch die Erfindung Strukturen in Form eines Nukleinsäure-Duplex beschrieben, die sich aus mindestens zwei Polynukleotiden zusammensetzen, die mittels herkömmlicher komplementärer Nukleotidbasen-Hybridisierung aneinander hybridisiert wurden. Multiple Polynukleotide können zum Erhalt des in Abb. 3 dargestellten Duplex hybridisiert werden. Die Polynukleotide enthalten funktionsfähig verknüpfte Donor- und Akzeptor-Chromophoren zum Erhalt einer größeren Struktur, bei der die beschriebenen Donor-Donor- und Donor-Akzeptor-Energieübertragungen stattfinden können. Die Chromophoren können entlang eines einzelnen Strangs der Duplexstruktur angeordnet sein, doch werden vorzugsweise so positioniert, dass die Energieübertragung zwischen den Strängen des Duplex alterniert.
  • Außerdem wird ein Biosensor-Element erwogen, umfassend einen Photonenenergie- Messfühler und ein Polynukleotid dieser Erfindung, das mindestens zwei mittels Linkerarmen funktionsfähig an das Polynukleotid geknüpfte Donor-Chromophoren aufweist, wobei die Chromophoren mittels der Verknüpfung entlang der Länge des Polynukleotids in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz positioniert sind. Der Biosensor weist mindestens ein fluoreszierendes Akzeptor-Chromophor auf, das mittels eines Linkerarms funktionsfähig so an das Polynukleotid geknüpft ist, dass das fluoreszierende Akzeptor-Chromophor durch die Verknüpfung in einer Donor- Akzeptor-Übertragungsdistanz von mindestens einem der Donor-Chromophoren positioniert ist. Darüber hinaus wird das Polynukleotid nachweisbar so angrenzend am Messfühler positioniert, dass der Messfühler die vom Akzeptor-Chromophor auf Anregung der Donor-Chromophoren hin emittierte Photonenenergie nachweisen kann.
  • Bei einer anderen Ausführungsform betrachtet die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer zuvor ausgewählten Nukleinsäure-Sequenz in einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe, das die Verwendung eines oder mehrerer Polynukleotide dieser Erfindung als einer Sonde umfasst und das auf den hierin beschriebenen Energieübertragungs-Systemen zur Erzeugung einer nachweisbaren fluoreszierenden Akzeptor-Emission zum Anzeigen eines Hybridisations-Ereignisses beruht.
  • Weitere Ausführungsformen werden aus den hierin wiedergegebenen Beschreibungen ersichtlich werden.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • In den Zeichnungen, die einen Teil dieser Beschreibung darstellen, zeigt:
  • Abb. 1 das Design zweier Chromophor-markierter Oligonukleotide (Donor- Oligomer SEQ. ID. Nr. 1 und Akzeptor-Oligomer SEQ. ID. Nr. 2) zur Bindung oder Hybridisierung an benachbarte Abschnitte auf einem komplementären Ziel- Nukleinsäure-Strang (Zielsequenz SEQ. ID. Nr. 3). Die Bindung oder Hybridisierung an die Zielsequenz nähert die fluoreszierende Donor-Gruppe und die fluoreszierende Akzeptor-Gruppe einander bei einer zuvor gewählten Donor-Akzeptor- Übertragungsdistanz so an, dass dann, wenn das System durch Photonenenergie bei hv&sub1; bestrahlt wird, die Donor-Gruppe die Energie absorbiert und sie mittels strahlungsloser Energieübertragung (-----> ) auf die Akzeptor-Gruppe überträgt, die sie bei hv&sub2; rückstrahlt. Die Bestrahlung und Aussendung von Photonen ist durch die wellenlinigen Pfeile angezeigt. Die exakte Nukleotidsequenz und die Position der Donor- und Akzeptor-Gruppen ist für das unhybridisierte (oder unverbundene System) im oberen Abschnitt der Abbildung gezeigt. Die hybridisierte Abbildung (oder das verbundene System) ist zum Zwecke der Einfachheit im unteren Abschnitt der Abbildung schematisch dargestellt.
  • Abb. 2 in Tafel (a) eine schematische Darstellung der multiplen Donor- Gruppen (D) und einer einzelnen Akzeptor-Gruppe (A), die in einen einzelnen DNA- Polynukleotid-Strang inkorporiert sind, der an ein Template-DNA-Oligomer hybridisiert oder gebunden ist. In Tafel (b) sind ein multiples Donor-DNA-Polymer und ein Akzeptor-DNA-Polymer veranschaulicht, die in einer organisierten Struktur auf einem Template-DNA-Polymer angeordnet sind.
  • Abb. 3 im oberen Abschnitt schematisch die in Abb. 1 als Beispiel beschriebene Photonenantennen-Struktur von 14 nm, die aus vier Oligonukleotiden zusammengesetzt und organisiert ist: der 16-mer-Akzeptor-Einheit (AU), der intermediären 30-mer-Donor-1-Einheit (ID1), der intermediären 29-mer-Donor-2- Einheit (ID2) und der endständigen Donor-Einheit (TD). Der untere Abschnitt der Abbildung veranschaulicht die erweiterte Energieübertragung, wenn die zusammengesetzte Struktur mit Licht bei 495 nm bestrahlt wird. Die Wellenlinien zeigen anstrahlende oder ausstrahlende Photonen an, und der gestrichelte Pfeil (-----> ) zeigt die Richtung des erweiterten energieübertragenden Prozesses an.
  • Abb. 4 ein homogenes DNA-Hybridisations-Assayverfahren auf der Grundlage der erweiterten Energieübertragung, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die gezeigten Polynukleotide umfassen das multiple Donor-enthaltende Oligomer (MDO), das Akzeptor-Oligomer (AO), das Quencher-Oligomer (QO) und eine Ziel- DNA. Tafel (a) zeigt das homogene System vor Denaturierung der Ziel-DNA. Zu beachten ist, dass die Akzeptor-Gruppe proximal zur Quencher-Gruppe situiert ist und daher die Emission aus dem Akzeptor gelöscht ist. Tafel (b) zeigt das homogene System nach Denaturierung der Ziel-DNA, auf die hin die multiplen Donor- und Akzeptor-Oligomere an die Ziel-DNA an spezifischen, programmierten, komplementären Stellen zur Erzeugung einer zur erweiterten Energieübertragung fähigen Struktur hybridisiert haben.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung A. Chromophor-enthaltende Polynukleotide
  • Die Erfindung betrifft die Konstruktion und die Synthese modifizierter synthetischer Nukleinsäure-Polymere/Oligomere, in die funktionelle Elektronen/Photonen- Eigenschaften direkt inkorporiert werden. Synthetische Nukleinsäuren mit den ihnen zueigenen Erkennungs-Eigenschaften (d. h. komplementäre Hybridisierung) sind ideale Ausgangsstoffe zur Konstruierung molekularer Komponenten, die sich selbst zu Elektronen- und Photonenstrukturen und -elementen organisieren können.
  • Bei einer Ausführungsform erwägt die Erfindung ein oder mehrere Polynukleotide mit einer Akzeptor-Chromophor-Gruppe und ein oder mehreren primären Donor- Chromophoren innerhalb der Förster-Distanz (< 5 nm) und mindestens zwei Donor- Chromophoren, oder vorzugsweise multiplen Chromophoren, die jenseits der normalen Förster-Distanz (> 5 nm) lokalisiert sind. Funktionsfähige Akzeptor- und Donor-Chromophoren sind an das/die Polynukleotid/e mittels Linkerarmen geknüpft, so dass die Chromophoren entlang der Länge des Polynukleotids in einer Donor- Donor-Übertragungsdistanz (1,4 nm bis 6,1 nm) positioniert sind, die für die resonante Energieübertragung wirksam ist, wie durch die vorliegenden Entdeckungen beschrieben.
  • Die hierin beschriebenen Polynukleotide können formatiert und in vielfältigen Anordnungen verwendet werden. Die Donor-Chromophoren können auf einem einzelnen Polynukleotid vorhanden sein, und das Akzeptor-Chromophor kann auf einem separaten Polynukleotid vorhanden sein, das in eine Donor-Akzeptor- Übertragungsdistanz lediglich durch einen zuvor gewählten Hybridisierungsvorgang gebracht wird. Alternativ dazu können Akzeptor-Chromophoren auf dem selben Polynukleotid zusammen mit einem oder mehreren der Donor-Chromophoren vorhanden sein.
  • Bei einer Ausführungsform weist das Polynukleotid mindestens zwei Donor- Chromophoren auf, die an das Polynukleotid mittels Linkerarmen funktionsfähig geknüpft sind, so dass die Donor-Chromophoren mittels der Verknüpfung entlang der Länge des Polynukleotids in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz positioniert sind, wie hierin definiert. Eine bevorzugte Donor-Donor-Übertragungsdistanz beträgt etwa 1,4 bis etwa 1,6 nm.
  • Das/die Polynukleotid/e mit einer zuvor bestimmten Sequenz, das als komplementär zu anderen Nukleinsäure-Sequenzen gewählt ist, so dass die Chromophorenthaltenden Polynukleotide programmiert werden können, um (1) sich durch den Hybridisierungs-Prozess selbst miteinander zusammenzusetzen, wobei sie organisierte Photonen- oder Elektronenstrukturen auf festen Trägern oder Dünnschichten wie Glas, Silizium, Germanium, Galliumarsonid, Polymeren, Resists, Langmuir-Blodgett-Flüssigkeiten und ähnlichem bilden, oder (2) an zuvor gewählte Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen in Lösung oder in Bindung an feste Träger oder Dünnschichtmaterialien zu binden.
  • Bei einer Ausführungsform enthält ein endständiges oder zentrales Polynukleotid außerdem mindestens ein fluoreszierendes Akzeptor-Chromophor, das an das Polynukleotid mittels eines Linkerarms funktionsfähig geknüpft ist, so dass das fluoreszierende Akzeptor-Chromophor durch die Verknüpfung in einer Donor- Akzeptor-Übertragungsdistanz von etwa 0,1 nm bis etwa 1,7 nm von mindestens einem primären oder hauptsächlich koppelnden Donor-Chromophor positioniert ist. Diese Anordnungen stellen die organisierten Strukturen bereit, die zur durch die vorliegende Erfindung beschriebenen erweiterten strahlungslosen Energieübertragung fähig sind.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung und sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Begriffe "Oligonukleotid", "Oligomer" oder "Polynukleotid" allgemein auf Nukleinsäuren in Form einzelsträngiger Nukleinsäure-Polymere, die sich aus DNA, RNA oder modifizierten Sequenzen zusammensetzen und vollständig durch synthetische Verfahrensweisen erzeugt sind. Genau genommen werden die kürzeren Sequenzen mit 2 bis 50 Nukleotiden Länge als Oligonukleotide oder Oligomere und die längeren Sequenzen (> 50 Nukleotide) als Polynukleotide bezeichnet. Bei dieser Erfindung werden diese Begriffe jedoch in gewissem Grade insofern austauschbar verwendet, als sie beide für Nukleinsäure-Polymere stehen.
  • Wichtige Vorteile der synthetischen DNA als der Trägerstruktur zur Bereitstellung der Anordnung, in der multiple Donoren und Akzeptoren in einer Übertragungsstruktur ausgerichtet sind, bestehen in folgendem: (1) schnelle Synthese mit automatisierten Instrumenten, in Längen von 2 bis 150 Nukleotid-Einheiten (0,7 nm bis 50 nm); (2) programmierbare Erkennung bei hoher Spezifität über ihre Nukleotid-Sequenz; (3) einfache Modifikation mit Fluorophoren, Chromophoren, Affinitätsmarkern, Metallchelaten und Enzymen; (4) Modifizierbarkeit an jeglicher Position in ihrer Sequenz und an verschiedenen Plätzen innerhalb der Baseneinheit; (5) modifizierbare Rückgradstruktur zur Erzeugung verschiedener Eigenschaften (z. B. kann normalerweise negativ geladene DNA zu einer neutralen Form verändert werden); (6) sowohl kovalent als auch nicht-kovalent an feste Oberflächen wie Glas, Metalle, Silizium, organische Polymere und Biopolymere knüpfbar; (7) umkehrbare Organisations-Eigenschaften; (8) Erzeugbarkeit dreidimensionaler und verzweigter Strukturen; und (9) wohlbekannte und leicht modellierbare strukturelle und organisatorische Eigenschaften.
    • 1. Erweiterte Energieübertragung
  • Die besondere funktionelle Elektronen/Photonen-Eigenschaft, die diese Erfindung beschäftigt, besteht in einem erweiterten strahlungslosen (Förster) energieübertragenden Prozess. Der zugrundeliegende Förster-Energieübertragungs- Prozess bezieht die Fähigkeit einer Donor-Gruppe zum Absorbieren von Photonenenergie bei einer Wellenlänge (hv&sub1;) und deren Übertragung, über einen strahlungslosen Dipol-Kopplungsprozess, auf eine Akzeptor-Gruppe ein, die die Photonenenergie bei einer längeren Wellenlänge (hv&sub2;) wiederausstrahlt. Die Leistungsfähigkeit der Energieübertragung hängt von den in den nachstehenden Gleichungen angegebenen Parametern ab:
  • Ro = 9,8 · 10³ (k² n&supmin;&sup4; Od J) (in A) (2)
  • worin E = die Übertragungsleistung, r = der Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor, k ein Dipol-Orientierungsfaktor, n der Brechungsindex des Mediums, Od die Quantenausbeute des Donors und J das Überlappungsintegral, das den Grad der Überlappung zwischen der Donor-Emission und der Akzeptor-Absorption ausdrückt. Sind alle anderen Parameter optimal, so erfordert die Abhängigkeit von 1/r&sup6; eine Donor-zu-Akzeptor-Distanz von weniger als 2 nm (20 Å), damit eine hochleistungsfähige Energieübertragung stattfinden kann. In Tabelle 1 sind die theoretischen Energieübertragungs-Leistungen mittels der herkömmlichen Förster- Energieübertragung (ET) gezeigt, wenn der Donor-(D)-zu-Akzeptor-(A)- Distanzbereich 0 bis 4,5 nm beträgt.
    • TABELLE 1
  • D/A-Distanz (nm) Theoretische ET-Leistung (%)
  • 0 100
  • 0,5 100
  • 1,0 99
  • 1,5 98
  • 2,0 97
  • 2,5 86
  • 3,0 67
  • 3,5 50
  • 4,0 28
  • 4,5 < 10
  • Abb. 1 zeigt das Design zweier Fluorophor-markierter Oligonukleotide (einen Donor und einen Akzeptor) zur Bindung oder Hybridisierung an benachbarte Positionen eines komplementären Ziel-Nukleinsäurestrangs und anschließenden Erzeugung einer leistungsfähigen Fluoreszenz-Energieübertragung. Die relativen Leistungen des energieübertragenden Prozesses können auf zwei stark vereinfachende Weisen ausgedrückt werden. Die erste ist dargestellt durch das Verhältnis von übertragener Energie zur durch den Donor absorbierten Energie; dies wird durch Messen der relativen Menge an gelöschter Donor-Fluoreszenz bestimmt, die in Gegenwart des Akzeptoren eintritt. Die zweite drückt die relative Leistung bezüglich des Verhältnisses der durch den Akzeptor wiederausgestrahlten Energie zur durch den Donor absorbierten Energie aus; dies wird durch Messen des relativen Anstiegs der Akzeptor-Fluoreszenz aufgrund der Donor-Gruppe bestimmt. Zwar werden beide Methoden als relatives Maß der Leistung der Energieübertragung erachtet, doch führt die effiziente Übertragung von Energie vom Donor zum Akzeptor (als Donor-Löschung betrachtet) nicht notwendigerweise zur selben Leistung bei der Wiederausstrahlung durch den Akzeptor. Dies tritt dann ein, wenn Sekundärprozesse (Akzeptor-Löschung) den Akzeptor veranlassen, seine Energie auf andere Weise als durch Wiederausstrahlung abzugeben.
  • Bei der erweiterten Energieübertragung handelt es sich um jenen Prozess, durch den multiple Donor-Gruppen Photonenenergie bei einer Wellenlänge (hv&sub1;) absorbieren und dabei eine gekoppelte Resonanzstruktur bilden, die Energie gerichtet auf eine Akzeptor-Gruppe übertragen kann. Die Resonanzenergie wird dann als Photonenenergie bei Wellenlänge (hv&sub2;) wiederausgestrahlt. Unter Bedingungen, bei denen hv&sub1; nicht gesättigt ist, kann die Photonenenergie durch Anordnungen der Donor-Gruppen aufgenommen und auf einen geeigneten Akzeptor gerichtet übertragen werden, was seine Fluoreszenz-Emission bei hv&sub2; stark erhöht. Dies kann man sich als eine Molekülantenne oder einen Verstärkermechanismus vorstellen. Alternativ dazu kann Photonenenergie (hv&sub1;) an einem Ende einer Struktur mittels einer Donor-Gruppe aufgenommen und durch eine lineare Anordnung der Donoren auf eine Akzeptor-Gruppe am anderen Ende der Struktur übertragen werden, wo sie als hv&sub2; wiederausgestrahlt wird. Diese Art von molekularem Photonentransfer-Mechanismus kann man sich entsprechend einem Photonenkabel oder -anschluss vorstellen. Diese Mechanismen können auch zum Zwischenverbinden verschiedener Molekularstrukturen, zum Verbinden von Molekularstrukturen mit Oberflächen und zum Herstellen molekularer Bindungen zwischen Oberflächen (Monoschichten) verwendet werden.
  • Auf diese Weise werden die Abstände zwischen den Donor-Chromophoren so gewählt, dass eine Donor-Donor-Übertragungsdistanz vorliegt, die dafür steht, dass die Übertragung eine strahlungslose Energieübertragung ist. Ähnliche Distanzen zwischen einem endständigen Donor-Chromophor und dem Akzeptor-Chromophor werden so gewählt, dass eine Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz vorliegt, was dafür steht, dass die Übertragung durch den Donor eine strahlungslose ist und zur Anregung eines fluoreszierenden Akzeptor-Chromophors und daraufhin einem Emissionsspektrum aus dem Akzeptor führt.
    • 2. Chromophore und Fluorophore
  • Eine Neuartigkeit dieser Erfindung besteht in der Auswahl und Positionierung spezieller Chromophor- und Fluorophor-Gruppen zum Erhalt geeigneter Donor- und Akzeptor-Paare, die zur Energieübertragung durch Dipol-Kopplung fähig sind. Das Chromophor betrifft jene Gruppen, die günstige Absorptions-Eigenschaften aufweisen, d. h. durch Bestrahlung mittels einer Vielfalt von Photonenquellen anregbar sind. Ein Chromophor kann von fluoreszierender oder nichtfluoreszierender Art sein. Nicht-fluoreszierende Chromophore strahlen normalerweise keine Energie in Form von Photonenenergie (hv&sub2;) aus. Sie sind daher gekennzeichnet durch eine geringe Quantenausbeute, welche das Verhältnis von emittierter Photonenenergie zu absorbierter Photonenenergie darstellt und typischerweise weniger als 0,01 beträgt. Ein fluoreszierendes Chromophor wird als ein Fluorophor bezeichnet und emittiert typischerweise Photonenenergie bei mittleren bis hohen Quantenausbeuten von 0,01 bis 1.
  • Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist der Nachweis, dass nicht-fluoreszierende Chromophore, wie etwa 4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'- isothiocyanat (oder DABITC), als leistungsfähige energieübertragende Donor- Gruppen fungieren können. Werden diese Chromophor-Donor-Gruppen dicht an eine geeignete Akzeptor-Gruppe herangebracht (0,1 nm bis 1,7 nm), so erzeugen sie eine beträchtliche Fluoreszenz-Sekundäremission durch den Akzeptor. Zur Energieübertragung auf ein geeignetes Akzeptor-Chromophor fähige Chromophoren werden hierin als Donor-Chromophoren oder Donoren bezeichnet.
  • Bei einem Akzeptor-Chromophor für die Zwecke der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Fluorophor, das zur Annahme der Energieübertragung von einem Donor-Chromophor und Erzeugung eines Emissionsspektrums fähig ist. Da die Energieübertragung durch Dipol-Kopplung typischerweise dann eintreten kann, wenn eine Überlappung im Emissionsspektrum des Donoren und dem Anregungsspektrum des Akzeptoren vorliegt, weist ein "geeigneter" Akzeptor typischenrveise ein Anregungsspektrum im längeren Wellenlängenbereich als sein entsprechender geeigneter Donor auf. Aufgrund dessen können Donoren und Akzeptoren gepaart werden, um eine energieübertragende Kapazität auf der Grundlage einer Überlappung von Donoremission und Akzeptor-Anregungsspektrum zu erzielen. Daher kann potentiell jedes Chromophor mit einem anderen Chromophor zum Erhalt eines Akzeptor-Donor-Paars gepaart werden, so lange die beiden Chromophoren unterschiedliche Emissionsspektren und eine ausreichende Überlappung der Donor- Emission und der Akzeptor-Anregungsspektren aufweisen, um die Energieübertragung zu bewirken.
  • Eine nicht-fluoreszierende Donor-produzierende Fluoreszenz-Reemission in der Akzeptor-Gruppe stellt eine extrem wertvolle Eigenschaft dar. Der nichtfluoreszierende Donor in einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bietet den besonderen Vorteil, sehr wenig oder gar nicht abzustrahlen und daher nicht zum Hintergrund oder dem nachweisbaren emittierten Licht in einem Donor-Akzeptor- System beizutragen. So erzeugen nicht-fluoreszierende Donoren sehr wenig Hintergrund und sind besonders bevorzugt.
  • Ein aus diesen nicht-fluoreszierenden Chromophoren zusammengesetztes multiples Donor-System weist einen sehr geringen ihm zueigenen Fluoreszenz-Hintergrund auf. Durch diese Eigenschaft kann eine der wichtigsten Einschränkungen überwunden werden, die die praktischen Anwendungen der Fluoreszenz- Energieübertragung bei diagnostischen DNA-Assay-Anwendungen stark beeinträchtigt hat. Sie eröffnet auch die Möglichkeit, nützlichere Photonenmechanismen und -anwendungen zu schaffen.
  • Bezüglich der einzigartigen Eigenschaften von Akzeptoren sind jene Akzeptoren mit den höchsten Quantenausbeuten oder mit anderen Eigenschaften am bevorzugtesten, die das Signalrauschverhältnis zwischen den spezifischen Akzeptor- Emissionen und den dem Donor zuzuschreibenden Hintergrund-(nicht-spezifischen)- Emissionen erhöhen. Zu Beispielen für die Ansätze zur Reduzierung des Signalrauschverhältnisses zählen die Verwendung von Donoren mit geringerer Emission, vorzugsweise nicht-fluoreszierende Donoren, die Auswahl von Akzeptor- Donor-Paaren, bei denen der Spektralabstand zwischen dem Emissionsspektrum des Donoren und dem Akzeptor maximiert und vorzugsweise so gewählt ist, dass er nicht-überlappend ist, und ähnliche hierin ausführlicher beschriebene Ansätze. In Tabelle 2 sind einige der potentiellen Chromophoren und Fluorophoren aufgelistet, die als Donoren, Akzeptoren und Quencher für die neuartigen erweiterten energieübertragenden Mechanismen und bei den in dieser Erfindung beschriebenen Anwendungen verwendet werden können. Die Liste ist nicht als ausschließlich zu verstehen, indem sie einige spezifische Arten oder Klassen von Donoren, Akzeptoren und Quenchern identifiziert, die zur Erzeugung dieser einzigartigen und erwünschten Eigenschaften fähig sind. TABELLE 2 CHROMOPHOR-DERIVATE, DIE ALS DONOREN, AKZEPTOREN UND QUENCHER FÜR DEN ERWEITERTEN ENERGIEÜBERTRAGENDEN PROZESS UND VERWANDTE PHOTONENMECHANISMEN NÜTZLICH SIND
  • IDie oben aufgelisteten Fluorophoren und Chromophoren sind in derivatisierter Form gezeigt, die sich zur direkten Kopplung an die in das DNA-Polymer aufgenommene primäre Aminogruppe eignet. In vielen Fällen stehen andere Arten von Derivaten (Succinimidylester und Haloacetyl) zur Kopplung an Amine zur Verfügung. Auch stehen Derivate zur Verfügung, die zur Kopplung an funktionelle Sulfhydryl- und Aldehyd-Gruppen spezifisch sind.
  • ²Bei EX handelt es sich um das Absorptionsmaximum in Nanometern (nm).
  • ³Bei EM handelt sich um das Emissionsmaxium in Nanometern (nm).
  • &sup4;Die angenäherten Bereiche der Quantenausbeuten (QY) sind: "Gering", 0,01-0,1; "Mittel", 0,1-0,3 und "Hoch", 0,3-1,0.
  • &sup5;Hierbei handelt es sich im wesentlichen um nicht-fluoreszierende (QY < 0,01) organische Verbindungen mit mittlerem bis hohem molaren Absorptionsvermögen. Sie werden geeigneter als Chromophoren bezeichnet.
  • &sup6;IR144 (Kodak Laser Dye) ist underivatisiert und erfordert vor Kopplung an ein DNA-Polymer eine Modifikation.
  • Besonders bevorzugte Donor-Chromophoren werden gewählt aus der Gruppe, bestehend aus 4,4'- Diisothiocyanatdihydrostilben-2,2'-disulfonsäure, 4-Acetamido- 4'-isothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure, 4,4'-Diisothiocyanatstilben-2,2'- disulfonsäure, Succinimidylpyrenbutyrat, Acridinisothiocyanat, 4- Dimethylaminophenylazophenyl-4'-isothiocyanat (DABITC), Luzifergelb-Vinylsulfon, Fluoresceinisothiocyanat, Reaktivrot 4 (Cibacron Brilliantrot 3B-A), Rhodamin-X- isothiocyanat, Texasrot (Sulforhodamin-101, Sulfonylchlorid, Malachitgrün- Isothiocyanat und IR1446. Beispiele der Donor-Chromophoren sind in den Beispielen beschrieben.
  • Besonders bevorzugte fluoreszierende Akzeptor-Chromophoren werden gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pyren, Luzifergelb, Acridin, Riboflavin, Fluorescein, Rhodamin, Sulforhodamin 101, Texasrot und IR 144. Beispiele der fluoreszierenden Akzeptor-Chromophoren sind in den Beispielen beschrieben.
  • Ebenfalls für die Erfindung als nützlich erachtete Donor- oder Akzeptor- Chromophoren umfassen jene Chromophoren, deren Derivate oder Kombinationen, die es zulassen, dass elektronische Signale wie z. B. angeregte Elektronen in das Donor-Donor-Übertragungssystem eindringen und dann als Resonanzenergie auf den Akzeptor übertragen werden und das System als ein elektronisches Signal verlassen. In anderen Worten kann der Mechanismus des Eintritts, Austritts oder beides in und aus dem Donor-Donor-Akzeptor-Übertragungssystem dieser Erfindung ein oder mehrere Chromophoren einbeziehen, die auf die Umwandlung von Elektronenenergie zu Resonanzenergie des Übertragungssystems (und wieder zurück) in einer Weise angepasst sind, dass das Übertragungssystem auf einen elektronischen Schaltkreis überträgt. In dieser Weise kann das erweiterte Energieübertragungssystem der vorliegenden Erfindung als ein elektronischer Schalter oder Signalleiter fungieren. Mögliche Umwandler von Elektronenenergie zu Resonanzenergie sind, ohne darauf beschränkt zu sein, lumineszierende Verbindungen, wie zum Beispiel Ruthenium-Komplexe, photovoltaische Zellen und ähnliches.
    • 3. Donor- und Akzeptor-Paar-Konfigurationen
  • Aus den in Tabelle 2 aufgelisteten Chromophoren und Fluorophoren kann eine Anzahl von Donor/Akzeptor-Konfigurationen oder Anordnungen erhalten werden, die zu leistungsfähigen erweiterten energieübertragenden Prozessen und neuartigen Photonenmechanismen führen. Diese Anordnungen sind in Tabelle 2 gezeigt und umfassen:
  • (1) Anordnungen multipler Donor-Gruppen (fluoreszierend und nicht-fluoreszierend), die Energie auf eine einzelne oder kleinere Zahl von Akzeptor-Gruppen übertragen. Allgemein übertragen multiple Donoren auf eine einzelne Akzeptor-Gruppe, doch unter bestimmten Bedingungen und für bestimmte Photonenmechanismen kann mehr als eine Akzeptor-Gruppe verwendet werden. Die bevorzugten Anordnungen sind die unter Einbeziehung der nicht-fluoreszierenden Donoren, die den wichtigen Vorteil eines erweiterten energieübertragenden Prozesses mit geringem Hintergrund bieten. Weitere bevorzugte Anordnungen umfassen multiple fluoreszierende Donoren, die in der sichtbaren Region angeregt werden und die auf einen oder mehrere Akzeptoren übertragen, die im Infrarotbereich wiederausstrahlen. Hierbei handelt es sich um einen nützlichen Mechanismus, da die Infrarot-Emission mittels optoelektronischer Elemente nachweisbar ist, die viel unempfindlicher gegenüber der im sichtbaren Bereich erzeugten Hintergrund-Fluoreszenz sind.
  • (2) Anordnungen, bei denen multiple Donor-Gruppen (fluoreszierend und nichtfluoreszierend) Licht bei hv&sub1; absorbieren und auf einen intermediären Donor- Akzeptor übertragen, der dann zu einer abschließenden Akzeptor-Gruppe überträgt, die bei hv&sub2; wiederausstrahlt. Diese Anordnungen weisen den Vorteil auf, dass sie große Stokes-Verschiebungen zwischen der Anregungswellenlänge (hv&sub1;) und der Emissionswellenlänge (hv&sub2;) des Systems erzeugen. Dies ist wichtig, denn je größer die Trennung zwischen Anregung und Emission, um so geringer die Hintergrund- Fluoreszenz des Systems. Beispiele der Konfigurationen sind in Tabelle 3 gezeigt, wobei drei Chromophoren in Serie gezeigt sind. Die bevorzugten Anordnungen sind jene, die von nicht-fluoreszierenden oder fluoreszierenden Donoren auf einen oder mehrere Akzeptoren übertragen, die im Infrarotbereich wiederausstrahlen. Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht die Verwendung von IR144 (Kodak Laser Dye) ein, einem Chromophor, das Anregungsenergie von Donoren annimmt, die im sichtbaren Bereich angeregt werden, und dann im Infrarotbereich wiederausstrahlt.
  • (3) Spezielle Anordnungen, bei denen bestimmte Chromophor-Gruppen mit stark löschenden Eigenschaften zur Verhinderung der Fluoreszenz-Emission durch die Akzeptor-Gruppe verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform verwendet die vorliegende Erfindung ein Quencher-Chromophor (oder Quencher), der, wie ein Akzeptor, zum Annehmen der Energieübertragung durch Dipol-Kopplung fähig ist, doch keine wesentliche Emission besitzt. Obschon in den Eigenschaften einem nicht-fluoreszierenden Donor ähnlich, bezieht sich der Begriff Quencher auf ein nicht-fluoreszierendes Chromophor, das daraufhin angeordnet ist, das Energiepotential von einem angeregten Akzeptor so wegzuziehen, dass der Akzeptor nicht emittiert, d. h. der Akzeptor gelöscht wird. Ein Beispiel dieser Konfiguration unter Verwendung eines Quencher-Chromophors in Kombination mit einem multiplen Donor-Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung ist in Beispiel 3 und in Abb. 4 beschrieben.
  • Der Mechanismus der Energieübertragung auf ein Quencher-Chromophor ist derselbe wie bei der Donor-Donor- oder Donor-Akzeptor-Übertragung, nämlich eine Dipol-Kopplung, und unterliegt daher denselben Anforderungen wie hierin bezüglich der Übertragungsdistanzen und optimalen Paarkonfigurationen beschrieben.
  • Beispiele der zum Löschen geeigneten nicht-fluoreszierenden Chromophore sind Reaktivrot 4 oder Malachitgrün, da diese keine nachweisbare Emission aufweisen und am "roten" Ende des Spektrums lokalisiert sind und daher bezüglich einer Vielzahl von Akzeptor-Chromophoren zum Annehmen (Löschen) von Energie vom Akzeptor, bevor dieser emittiert, ausgewählt werden können. Die bevorzugten Anordnungen bestehen aus dem nicht-fluoreszierenden Chromophor Reaktivrot 4 oder Malachitgrün zur Löschung der Fluoreszenz in der texasroten Akzeptor-Gruppe. TABELLE 3 MULTIPLER DONOR/AKZEPTOR, MULTIPLER DONOR 1/AKZEPTOR DONOR 2/AKZEPTOR, UND SPEZIELLE LÖSCH-ANORDNUNGEN (* BEVORZUGT *)
  • Der ---> weist auf eine energieübertragende Wirkung hin, die zu beträchtlicher Sekundäremission durch die Akzeptor-Gruppe führt. Der::::> weist auf eine energieübertragende Wirkung hin, die die Fluoreszenz der Akzeptor-Gruppe beträchtlich löscht.
  • Wichtig ist herauszustreichen, dass die verschiedenen, oben beschriebenen Anordnungen und Konfigurationen der Donor-, Akzeptor- und Quencher-Gruppen entweder durch ihre Inkorporation in ein einzelnes DNA-Polymer erhalten werden können; oder durch Verwendung einer DNA-Template zum Zusammensetzen verschiedener Kombinationen multipler Donor-DNA-Polymere, Akzeptor-DNA- Polymere und Quencher-DNA-Polymere. Beide Arten von Anordnungen sind in Abb. 2 schematisch gezeigt.
  • Bezüglich der optimalen Positionierung oder Beabstandung des primären "Donor-zu- Akzeptor"-Paars, wodurch die Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz entsteht, erfordert die zugrundeliegende Distanzabhängigkeit von 1/r&sup6; für die Förster- Übertragung einen Abstand von 0 bis 5 nm, und bevorzugt einen Abstand von etwa 0,1 nm bis etwa 1,7 nm zwischen den Gruppen für das Eintreten einer effizienten (80-100%) Energieübertragung. Bezüglich des Nukleotid-Abstands bei einzel- und doppelsträngigen DNA-Polymeren ist diese optimale Übertragungsdistanz etwa gleich 0 bis 5 Nukleotid-Einheiten. Bei den kürzeren trennenden Abständen kann sich die Leistung theoretisch 100% annähern. Bei einer Distanz > 4,0 nm oder 12 Nukleotid-Einheiten beträgt die energieübertragende Leistung weniger als 20%. Für die primäre Donor-zu-Akzeptor-Kopplung kann ein enger Abstand (0,1 oder 2 Basenpaare) gewählt werden, doch erfordert dies eine spezielle Linkerarm-Chemie, durch die Gruppen für eine optimale Energieübertragung orientiert und jegliche Sekundär-Löschmechanismen oder Anregungsfallen ausgeschaltet werden.
  • Hinsichtlich der optimalen Positionierung oder Beabstandung der "Donor-zu-Donor"- Paare in multiplen Donor-Anordnungen, wodurch die Donor-Donor- Übertragungsdistanz entsteht, kann die Inkorporation der multiplen Donoren bei zu dichten Abständen die Fähigkeit der DANN zur Hybridisierung bei hoher Spezifität beeinträchtigen. Ebenso kann ein dichter Abstand der Donor-Donor-Paare manchmal zu Sekundär-Löschmechanismen oder Anregungsfallen führen, was die Leistungsfähigkeit der Energieübertragung stark vermindern kann. Derzeit ermöglicht die beste verfügbare Chemie zur Modifikation einer Polynukleotid-Sequenz an internen und endständigen Positionen die Erzielung von Donor-Donor-Abständen von etwa 4 bis etwa 18 Nukleotid-Einheiten (1,4 nm bis 6,1 nm), also eine angemessen lange Distanz. Dies würde bedeuten, dass etwa 10 Donoren in eine einzige Oligonukleotid-Sequenz von 50 Nukleotiden inkorporiert werden könnten. Abstände bei den längeren Intervallen von 8 bis 18 Nukleotid-Einheiten können angewandt werden, wenn die Hybridisierung eines komplementären multiplen Donor- Polynukleotids eine doppelsträngige Struktur mit alternierenden Donoren erzeugt, die nun im Abstand von 4 bis 9 Nukleotid-Einheiten vorliegen. Diese alternierenden Donor-Struktur-Typen behalten eine zweckmäßige Übertragungsleistung bei, vermindern die Sekundär-Donor-Donor-Löschung und beeinträchtigen die Hybridisierung und die Stabilität der organisierten Strukturen weniger.
  • In den Fällen, in denen die Löschung eine erwünschte Eigenschaft ist, kann ein Abstand von 0 bis 5 Nukleotid-Einheiten (0,1 nm bis 1,7 nm) zwischen der/den Quencher-Gruppe/n und der Akzeptor-Gruppe gewählt werden. Es sollte nicht vergessen werden, dass Quencher-Akzeptor-, Donor-Akzeptor- als auch Donor- Donor-Paare auch zwischen Gruppen gebildet werden können, die auf alternierenden Seiten der doppelsträngigen DNA-Strukturen lokalisiert sind.
    • 4. Synthese und Markierung von Oligonukleotiden und Polynukleotiden
  • Die Synthese der Oligonukleotid- und Polynukleotid-Sequenzen kann unter Anwendung einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden, einschließlich der chemischen de novo-Synthese von Polynukleotiden, z. B. mittels derzeit verfügbarer automatisierter DNA-Synthesegeräte und einer standardmäßigen Phosphoramidit- Chemie, oder durch Herleitung von Nukleinsäure-Fragmenten von nativen Nukleinsäure-Sequenzen, die als Gene oder Teile von Genen in einem Genom, Plasmid oder anderen Vektoren vorliegen, z. B. mittels Restriktionsendonuklease- Verdau größerer doppelsträngiger Nukleinsäuren und Strangtrennung oder mittels enzymatischer Synthese unter Verwendung einer Nukleinsäure-Template.
  • Die chemische de novo-Synthese eines Polynukleotids kann unter Anwendung jeglicher geeigneten Methode durchgeführt werden, wie z. B. den Phosphotriester- oder Phosphodiester-Methoden. Siehe Narang et al., Meth. Enzymol., 68: 90, (1979); US-Patentschrift Nr. 4.356.270; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem., 53: 323-56 (1989); und Brown et al., Meth. Enzymol., 68: 109, (1979).
  • Die Herleitung eines Polynukleotids aus Nukleinsäuren umfasst das Klonieren einer Nukleinsäure in einen geeigneten Wirt mittels eines Kloniervektors, die Replikation des Vektors und dadurch die Multiplikation der Menge der klonierten Nukleinsäure, und dann die Isolation der Subfragmente der klonierten Nukleinsäuren. Für eine Beschreibung des Subklonierens von Nukleinsäure-Fragmenten, siehe Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 390- 401 (1982); und siehe US-Patentschriften Nr. 4.416.988 und Nr. 4.403.036.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen wurden automatisierte Synthesen unter Verwendung eines DNA-Synthesegerät Modell #381 von Applied Biosystems und im Handel verfügbare (Applied Biosystems) 5'-Dimethoxytritylnukleosid-b- cyanoethylphosphoramidit-Reagenzien und Synthese-Glassäulen mit kontrollierten Poren für die in dieser Patentanmeldung beschriebene Untersuchung durchgeführt. Über die "standardmäßige Phosphoramidit-Chemie" hinaus können auch andere Methoden, einschließlich der RNA-, Hydrogenphosphonat- und Phosphothioat- Chemie, angewandt werden.
  • Modifizierte Oligonukleotide mit internen oder endständigen funktionellen Gruppen können für die anschließende Markierung in zahlreichen Weisen erhalten werden. Verschiedene besonders nützliche Methoden zur Inkorporation der funktionellen Gruppen sind nachfolgend beschrieben. [Bei diesem speziellen Abschnitt zu den synthetischen Verfahrensweisen bedeutet "Inkorporation der funktionellen Gruppen" chemisch reaktive Gruppen (primäre Amine, Sulfhydrylgruppen, Aldehyde etc.) für die anschließende Kopplung mit Fluorophoren oder Chromophoren. Dies sollte nicht mit "Inkorporation der funktionellen Eigenschaften" verwechselt werden, das im Hauptteil dieser Erfindung die Elektronen/Photonen-Eigenschaften betrifft.] Interne funktionelle primäre Amingruppen können an ausgewählten Positionen innerhalb der Sequenz und an den 3'- und 5'-Endpositionen als geeignet geschützte Linkerarm-Nukleoside inkorporiert werden (5'-Dimethoxytrityl-5[N-(7- trifluoracetylaminoheptyl)-2'-desoxyuridin-3'-O-phosphoramidit). Dieses Linkerarm- Nukleosid (bezogen von Glen Research) kann während des automatisierten Syntheseverfahrens leicht inkorporiert werden. Es stellt eine primäre Amingruppe für anschließende Kopplungsreaktionen mit verschiedenen aktivierten Fluorophoren und Chromophoren bereit (die tatsächliche Länge des Linkerarms beträgt 1,5 nm).
  • Die Funktionalität des primären Amins kann auch an der 5'-Endposition unter Verwendung des Aminolinks 2 inkorporiert werden. Bei Aminolink 2 handelt es sich um ein Phosphoramidit-Molekül mit einem Kettenarm aus sechs Kohlenstoffen (0,9 nm) und einer geschützten Amingruppe (bezogen von Applied Biosystems). Diese geeignet geschützte Linkergruppe kann in die 5'-Endposition am Ende des automatisierten Syntheseverfahrens inkorporiert werden, wodurch eine primäre Amingruppe für anschließende Kopplungsreaktionen mit verschiedenen aktivierten Fluorophoren und Chromophoren bereitgestellt wird.
  • Eine unterschiedliche Art von Funktionalität kann an der Endposition durch Einleiten des Syntheseverfahrens unter Verwendung eines Ribonukleosids anstelle eines Desoxyribonukleosids inkorporiert werden. Dies stellt ein Ribonukleotid an der 3'- Endposition des Oligomers bereit, das anschließend mit Natriumperiodat zum Erhalt reaktiver Aldehydgruppen oxidiert werden kann, die mit einer Vielzahl von Fluorophoren und Chromophoren gekoppelt werden können.
  • Diese Verfahrensweisen zur Funktionalisierung der Oligonukleotide schließen andere, zur Verfügung stehende oder zur Weiterführung der neuartigen Konzepte dieser Erfindung entwickelbare nicht aus.
  • Am Ende jedes Syntheseverfahrens wird das fertiggestellte Oligonukleotid (modifiziert oder unmodifiziert) vom Träger getrennt und werden die Blockierungsgruppen durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid über 12 Stunden hinweg bei 55ºC entfernt. Die Dimethoxytritylgruppe kann zur Förderung der Reinigung am Oligonukleotid verbleiben. Das 5-Trityl-Oligonukleotid kann mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) gereinigt werden. Die Reinheit jedes Oligonukleotid-Produkts kann mittels analytischer Polyacrylamid- Gelelektrophorese bestimmt werden. Zu diesem Zeitpunkt sind die unmodifizierten Oligonukleotide für die experimentelle Anwendung bereit. Die Oligonukleotide mit einem oder mehreren reaktiven Linkerarmen können mit dem entsprechenden aktivierten Fluorophor umgesetzt werden.
  • Jene Fluorophor- und Chromophor-Derivate, die Isothiocyanat, Sulfonylchlorid, Succinimidylester oder Triazin enthalten, sind leicht an die Oligonukleotide koppelbar, die primäre funktionelle Amingruppen besitzen. Oligonukleotide, die 3'- terminale Aldehyde enthalten (von mit Periodat oxidiertem Ribonukleotid), können mit Fluorophoren und Chromophoren mit primären Amino- oder Hydrazidgruppen umgesetzt werden. Eine breite Vielfalt von Reagenzien und Verfahrensweisen zur Inkorporation verschiedener Fluorophore und Chromophore in funktionalisierte Oligonukleotide steht zur Verfügung [siehe: Bioconjugate Chemistry, Bd. 1, #3, S. 165-187 (1990); Symons, R. H., Nucleic Acid Probes, CRC Press, Inc. (1989); und Keller et al., DNA Probes, Stockton Press, (1989)]. Auch kann eine direkte Fluoreszenz-Markierung der Oligonukleotide (intern und terminal) unter Verwendung von fluoreszierenden (Fluorescein und Acridin) Phosphoramiditen (Clontech) durchgeführt werden. Mit dieser Verfahrensweise wird ein vollständiges Nukleotid durch das Fluoreszenz-Phosphoramidit-Derivat ersetzt. Diese Derivate werden während des normalen automatisierten DNA-Syntheseverfahrens inkorporiert.
    • 5. Mechanismen. Elemente und Systeme
  • Es ist wichtig zu betonen, dass die Programmierbarkeit der funktionellen Molekülkomponenten ihnen über ihre Nukleotidsequenz ermöglicht, sich selbst zusammenzusetzen und zu größeren und komplexer definierten Strukturen zu organisieren. Diese Programmierbarkeit und die funktionellen Elektronen/Photonen- Eigenschaften dieser Molekülkomponenten ermöglichen die Organisation von Photonenverbindungen, Amplifikationsmechanismen und Antennenanordnungen innerhalb der Strukturen. Die Kombination der Eigenschaften führt schließlich zur Schaffung von Photoelementen, Sperrschichtphotoelementen, Biosensoren und diagnostischen homogenen und heterogenen DNA-Assays.
  • Da eine große Zahl von DNA-Polymeren, die jeweils eine Anzahl von Donor- Gruppen enthalten, miteinander organisiert werden können, ist die Herstellung relativ großer Antennen- oder Verstärker-Netzwerke oder langer Photonenübertragungswege und -Verbindungen möglich. Bezüglich der erweiterten Energieübertragung für Amplifikations- oder Antennenfunktionen hängt die Verhältniszahl von Donoren zu einem Akzeptor in einer gegebenen Molekülstruktur oder -system von mehreren Faktoren ab. Zu diesen zählen: (1) der Lichtstrom (Stärke), der auf das Endsystem auftrifft; (2) die Gesamtleistung der Energieübertragung für die Donor-Anordnungen, (3) die Quantenausbeute (QY) der Donoren und des Akzeptoren, und (4) die Lebensdauer (tau) der Donor- und Akzeptor-Anregungszustände. Für Antennen-Anwendungen oder Photonenamplifikationen könnte, bei niederen bis mittleren Lichtmengen, die Zahl der Donoren zum Akzeptor vom unteren Bereich von 2 zu 1, und vorzugsweise 10 zu 1, bis zum oberen Bereich von 10&sup6; bis 1 rangieren. Für heterogene diagnostische DNA- und Biosensor-Anwendungen könnte die Zahl der Donoren zu einem Akzeptor vom unteren Bereich von 2 zu 1, und bevorzugt 5 zu 1, bis zum oberen Bereich von 105 bis 1 rangieren. Für diagnostische homogene DNA-Anwendungen unter Einsatz typischer, bei standardmäßigen Spektrofluorometern oder anderen Instrumenten für die Fluoreszenz-Analyse verwendeten Quecksilber- oder Xenon-Lichtquellen könnte die Zahl der Donoren zu einem Akzeptor vom unteren Bereich von 2 zu 1 bis zum oberen Bereich von 104 zu 1 rangieren. Auch können bei einigen Photonenmechanismen und bestimmten Element-Anwendungen ein oder mehrere multiple Donor-DNA-Polymere auf ein Akzeptor-DNA-Polymer übertragen werden, das mehr als eine Akzeptor-Gruppe aufweist. Dieselben grundlegenden Verhältnisse von Donoren zu Akzeptor, wie oben angegeben, gelten für jene Molekülstrukturen oder -systeme, die ein Akzeptor-DNA-Polymer mit mehr als einer Akzeptor-Gruppe aufweisen.
  • Ein Element dieser Erfindung lässt sich bezüglich einer Nukleinsäure-Duplexstruktur beschreiben, die aus zwei oder mehr Polynukleotiden besteht, die durch herkömmliche Komplementarität zum Erhalt des typischen doppelsträngigen Duplex miteinander hybridisieren, außer dass ein "Strang" des Duplex sich aus zwei oder mehreren benachbarten Polynukleotiden zusammensetzt, wie in Abb. 3 gezeigt.
  • Eine Nukleinsäure-Duplexstruktur dieser Erfindung setzt sich daher aus mindestens zwei hybridisierten Polynukleotiden zusammen. Die Struktur weist (1) mindestens zwei Donor-Chromophoren auf, die funktionsfähig an die Struktur mittels an ein Polynukleotid der Struktur gebundenen Linkerarmen geknüpft sind, so dass die Donor-Chromophoren durch die Verknüpfung entlang der Länge der Struktur in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz positioniert sind. Die Struktur weist außerdem (2) mindestens ein fluoreszierendes Chromophor auf, das funktionsfähig an die Struktur mittels eines an das Polynukleotid der Struktur gebundenen Linkerarms geknüpft ist, so dass das fluoreszierende Chromophor durch die Verknüpfung in einer Donor- Akzeptor-Übertragungsdistanz von mindestens einem der Donor-Chromophoren positioniert ist.
  • Wie durch die in Abb. 3 gezeigte Konfiguration vorgeschlagen, kann eine Ausführungsform die Verwendung eines oder mehrerer alternierender Chromophoren umfassen. Das heißt, die Struktur enthält Donor-Chromophoren, die an der Struktur alternierend so positioniert sind, dass die Donor-Donor- Übertragungsdistanz zwischen den Polynukleotiden des Duplex kreuzen (alternieren) kann. Die alternierende Konfiguration kann eine derartige sein, dass einige Donor- Donor-Übertragungen zwischen benachbarten Donoren auf demselben Polynukleotid und einige andere zwischen Donoren auf gegenüberliegenden Duplex- Strängen stattfinden (d. h. alternierend), oder eine derartige, dass alle Übertragungen alternieren. Die alternierende Übertragungsdistanz lässt sich bezüglich einer Donor- Donor-Übertragungsdistanz ausgedrücken, wie hierin beschrieben, oder lässt sich bezüglich des Nukleotid-Basenabstands ausgedrücken. So wird z. B. eine Struktur mit alternierenden Donor-Chromophoren erwogen, die mindestens drei Donor- Chromophoren umfasst, wobei die Donor-Chromophoren 4 bis 18 Nukleotid- Baseneinheiten voneinander entfernt auf einem einzelnen Polynukleotid positioniert sind.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Einsetzbarkeit der erweiterten Photonenenergieübertragung über multiple Donoren hinweg als einem Photonenenergie-Übertragungssystem oder Schaltkreis ausgenutzt. Das Photonenenergie-Übertragungssystem kann eine oder mehrere der hierin beschriebenen Polynukleotid-Komponenten enthalten. So umfasst ein Photonenenergie-Übertragungssystem ein Polynukleotid mit mindestens zwei Donor- Chromophoren, wie zuvor beschrieben. Das Polynukleotid kann auch ein Akzeptor- Chromophor enthalten. Das System kann ein oder mehrere zusätzliche Polynukleotide in den verschiedenen hierin beschriebenen Konfigurationen umfassen.
  • Insofern, als die vorliegende Erfindung Strukturen und Systeme für die erweiterte Photonenenergieübertragung beschreibt, sollte verstanden sein, dass bei einer Ausführungsform die Verwendung der beschriebenen Strukturen, Polynukleotide, Multi-Polynukleotid-Duplexe, Photonenenergie-Übertragungssysteme und ähnliches in einem Festzustand erwogen wird. Das heißt, dass ein oder mehrere Polynukleotide des Systems funktionsfähig an einen festen Träger geknüpft (gebunden) werden können, um die Anwendung der erweiterten energieübertragenden Elemente zu erleichtern. Feste Trägersysteme sind für elektronische Bauelemente, wie z. B. Photonenenergiekollektor, Lichtverstärker, Energieübertragungsleitungen und ähnliches, besonders geeignet.
  • Die Bindung eines Polynukleotids an ein festen Träger kann mittels einer beliebigen von vielfältigen Methoden vorgenommen werden und unterliegt keiner Beschränkung. Beispiele für die Bindungsmethoden sind hierin an anderer Stelle beschrieben und sind den Fachleuten des Bereichs der Polynukleotide allgemein wohlbekannt.
  • Bei einer Ausführungsform kann ein fester Träger in einem passiven Träger bestehen, was heißt, dass der Träger eine passive Funktion besitzt und das energieübertragende Polynukleotid lediglich in der festen Phase hält. Bei einer anderen Ausführungsform kann ein fester Träger eine aktive Funktion besitzen, was heißt, dass der Träger eine ergänzende Funktion ausübt, um dem Übertragungssystem Energie zu spenden, oder dass er die Fähigkeit zum Nachweisen, Empfangen, Umwandeln, Übersetzen oder Übertragen der emittierten Photonenenergie aus dem Akzeptor an einen zweiten Schaltkreis besitzt. Ein Beispiel für einen zweiten Schaltkreis ist dargestellt durch einen Photosensor, ein photovoltaisches und ähnliches Element im Festphasenmedium.
    • B. Diagnostische Systeme und Methoden 1. Diagnostische Systeme
  • Ein diagnostisches Systems in Form eines Kits der vorliegenden Erfindung umfasst, in ausreichender Menge für mindestens einen Assay, ein Chromophor-enthaltendes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung als ein separat gepacktes Reagenz. Gewöhnlich sind auch Gebrauchsanweisungen für das abgepackte Reagenz enthalten.
  • In den "Gebrauchsanweisungen" findet sich üblicherweise eine Erklärung der Materie, die die Reagenzkonzentration oder mindestens einen Parameter der Assay- Methode beschreibt, wie etwa die relativen Mengen an zu vermengendem Reagenz und Probe, die Aufrechterhaltungsdauer des Reagenz-Probengemischs, die Temperatur, die Puffer-Bedingungen und ähnliches.
  • Bei einer Ausführungsform erwägt die Erfindung ein diagnostisches System für den Photonennachweis einer zuvor gewählten Nukleotidsequenz, umfassend in ausreichender Menge für mindestens einen Assay ein Polynukleotid mit mindestens zwei Donor-Chromophoren, die mittels Linkerarmen funktionsfähig an das Polynukleotid geknüpft sind, worin die Donor-Chromophoren mittels der Verknüpfung entlang der Länge des Polynukleotids in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz positioniert sind. Das Polynukleotid ist so entworfen, dass es an die zuvor gewählte Nukleotidsequenz (d. h. die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz) hybridisiert, und enthält daher eine zur Ziel-Nukleinsäure-Sequenz komplementäre Nukleotid-Sequenz.
  • Zielnukleinsäuren-Sequenzkomplementarität ist im Fachbereich der Nukleinsäure- Diagnostik wohlbekannt, da dies auf ein Polynukleotid-Reagenz (d. h. Sonde) zutrifft und braucht daher nicht ausführlich beschrieben zu werden.
  • Bei einer anderen Ausführungsform enthält das Polynukleotid eines diagnostischen Systems außerdem mindestens ein fluoreszierendes Chromophor, das mittels eines Linkerarms funktionsfähig an das Polynukleotid geknüpft ist, so dass das fluoreszierende Chromophor mittels der Verknüpfung in einer Donor-Akzeptor- Übertragungsdistanz von mindestens einem der Donor-Chromophoren positioniert ist. Bei dieser Ausführungsform sind sowohl die Akzeptor- als auch multiplen Donor- Chromophoren auf einem einzigen Polynukleotid vorhanden. Die in Abb. 2 (a) gezeigte Struktur stellt ein Beispiel dar.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst ein diagnostisches System ein zweites Polynukleotid, enthaltend mindestens ein fluoreszierendes Chromophor, das an das zweite Polynukleotid mittels eines Linkerarms funktionsfähig geknüpft ist. Die in Abb. 2 (b) gezeigte Struktur stellt ein Beispiel dar.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform enthält ein diagnostisches System, typischerweise in einem separaten Behälter, außerdem ein Quencher-Polynukleotid der vorliegenden Erfindung. Das aufgenommene Quencher-Polynukleotid ist komplementär zu mindestens einem Abschnitt des Akzeptor-Polynukleotids, und ist vorzugsweise vollständig komplementär zum Akzeptor-Polynukleotid. Ein Quencher- Polynukleotid muss von kürzerer Länge als ein Akzeptor-Polynukleotid sein, und zwar typischerweise um mindestens 10% kürzer und bevorzugter um mindestens 50% kürzer, um sicherzugehen, dass der Akzeptor bevorzugt an eine Ziel-Sequenz hybridisiert, sofern diese im Hybridisationsgemisch vorhanden ist.
  • Die Reagenz-Spezies, d. h. das Chromophor-enthaltende Polynukleotid der Erfindung, kann in jedem hierin beschriebenen diagnostischen Systeme in Lösung, als eine Flüssigkeitsdispersion oder als ein im wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form, bereitgestellt werden. Ein fester Träger als ein Reaktionsgefäß und ein oder mehrere Puffer können ebenfalls in diesem diagnostischen Assay- System als separat gepackte Elemente vorhanden sein.
  • Bei den hierin bezüglich der diagnostischen Systeme genannten Packungen handelt es sich um solche, wie sie üblicherweise in diagnostischen Systemen verwendet werden. Der Begriff "Packung" bezieht sich auf eine feste Matrix oder ein Material wie Glas, Kunststoff, Papier, Folie und ähnliches, das innerhalb fixierter Begrenzungen für ein diagnostisches Reagenz der vorliegenden Erfindung aufnahmefähig ist. So kann eine Packung z. B. eine Glasphiole sein, die zur Aufnahme eines erwogenen diagnostischen Reagenz verwendet wird.
    • 2. Diagnostische Methoden
  • Für die vorliegende Erfindung wird auch jegliche diagnostische Methode erwogen, die zum Nachweis emittierter Photonenenergie führt, wie durch eine Chromophorenthaltende Struktur der vorliegenden Erfindung erzeugt. Da die Emission eine Folge der Anregung und anschließenden Energieübertragung von den angeregten Donor- Chromophoren zum Akzeptor-Chromophor darstellt, umfasst die vorliegende Erfindung mindestens die folgenden beiden Schritte:
  • (1) Anregen einer organisierten Struktur dieser Erfindung, die mindestens zwei Donor-Chromophoren enthält, die mittels Linkerarmen funktionsfähig an eine Trägerstruktur geknüpft sind, so dass die Donor-Chromophoren entlang der Länge des Trägers in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz positioniert sind, und auch mindestens ein fluoreszierendes Akzeptor-Chromophor enthält, das mittels eines Linkerarms funktionsfähig an die Trägerstruktur an einer Position auf der Struktur geknüpft ist, die eine Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz von mindestens einem der Donor-Chromophoren schafft. Die Anregung besteht in einer Menge an Photonenenergie, die ausreicht, um eine strahlungslose Energieübertragung zwischen den Donor-Chromophoren als einem "aufnehmenden" Ereignis herbeizuführen und die strahlungslose Energieübertragung zwischen dem Donor- Chromophor und dem Akzeptor-Chromophor so auszulösen, dass der Akzeptor selbst ausreichend angeregt wird, um eine Emission von Photonenenergie zu erbringen.
  • (2) Nachweisen der resultierenden emittierten Photonenenergie durch Verwendung eines aus einer Vielfalt von Photosensoren.
  • Die oben beschriebene organisierte Struktur, die die Chromophoren enthält, kann in einer beliebigen der hierin beschriebenen verschiedenartigen Konfigurationen bestehen. Die spezielle Anregungs- und Messfühlmethode kann in Abhängigkeit von den Anforderungen des vorliegenden Systems breit variieren und hängt von der erforderlichen Empfindlichkeit, den Anregungs- und Emissions-Charakteristika der inkorporierten Donor- und Akzeptor-Chromophoren und der Anwendung der Struktur ab.
  • Bei einer besonders bevorzugten diagnostischen Methode wird für die vorliegende Erfindung eine Photonennachweis-Methode von zuvor gewählten Nukleinsäure- Sequenzen erwogen, wobei Chromophor-enthaltende Polynukleotide der vorliegenden Erfindung als Hybridisierungs-Sonden für den Nachweis einer Ziel- Sequenz in einer Probe verwendet werden, die Nukleinsäuren enthält.
  • Daher wird eine diagnostische Methode zum Nachweis des Vorhandenseins einer zuvor gewählten Nukleinsäure-Sequenz in einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe erwogen, umfassend die folgenden Schritte:
  • (a) Vermengen:
  • (i) eines Polynukleotids mit (1) mindestens zwei Donor-Chromophoren, die mittels Linkerarmen funktionsfähig an ein Polynukleotid geknüpft sind, so dass die Chromophoren mittels Verknüpfung entlang der Länge des Polynukleotids in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz positioniert sind, und (2) mindestens ein fluoreszierendes Akzeptor-Chromophor, das an das Polynukleotid mittels eines Linkerarms funktionsfähig geknüpft ist, so dass das fluoreszierende Akzeptor- Chromophor durch die Verknüpfung in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz von mindestens einem der Donor-Chromophoren positioniert ist, wobei das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz aufweist, die zuvor als komplementär zur zuvor gewählten "Ziel"-Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt wurde; mit
  • (ii) einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe, umfassend die zuvor gewählte Nukleinsäure-Basen-("Ziel")-Sequenz zum Erhalt eines Hybridisations- Reaktionsgemischs;
  • (b) Unterziehen des Hybridisations-Reaktionsgemischs den Hybridisations- Bedingungen über einen ausreichend langen Zeitraum zum Hybridisieren des Polynukleotids an die Zielsequenz und Bilden eines Donor-Chromophorenthaltenden und Akzeptor-Chromophor-enthaltenden hybridisierten Nukleinsäure- Duplex;
  • (c) Anregen des Donor-Chromophors im in Schritt (b) gebildeten Nukleinsäure- Duplex durch Aussetzen des Donor-Chromophors einer ausreichenden Photonenenergie zur Herbeiführung der Emission von Photonenenergie aus dem Akzeptor-Chromophor; und
  • (d) Nachweisen des Vorhandenseins der aus dem angeregten Akzeptor- Chromophor emittierten Photonenenergie, dabei Nachweisen des Vorhandenseins der zuvor gewählten Nukleinsäure-Sequenz in der Probe.
  • Bei einer verwandten Ausführungsform unterscheidet sich das Gemisch aus Schritt (a) darin, dass anstelle eines einzelnen Polynukleotids, das sowohl die multiplen Donoren als auch mindestens ein Akzeptor-Chromophor enthält, die Donoren auf einem oder mehreren anderen Polynukleotiden als dem das Akzeptor-Chromophor enthaltenden Polynukleotid vorhanden sind.
  • Bei dieser Ausführungsform, wie in Abb. 2(b) und in Abb. 3 veranschaulicht, wird die Positionierung der Donoren und des Akzeptoren sowohl durch ihre Verknüpfungsposition auf ihren jeweiligen Polynukleotiden als auch die Annäherung dieser Chromophoren bei der Hybridisierung an eine zuvor gewählte Nukleinsäure-Zielsequenz kontrolliert.
  • Bei einer anderen Ausführungsform kann das Hybridisationsgemisch ein wie hierin beschriebenes Quencher-Polynukleotid mit einer Nukleinsäure-Sequenz enthalten, die auf die Konkurrenz mit der Zielsequenz um die Hybridisierung mit dem Polynukleotid, das die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz enthält, hin entworfen ist. Die Ausführungsform ist in Beispiel 3 und Abb. 4 gezeigt.
  • Ein Hybridisations-Reaktionsgemisch wird durch Vermengen wirksamer Mengen einer Polynukleotid-Sonde oder -Sonden dieser Erfindung, einer Ziel-Nukleinsäure und weiteren, mit einem Hybridisations-Reaktionsgemisch verträglichen Komponenten zubereitet.
  • Die bei den vorliegenden Verfahren zu hybridisierenden Ziel-Nukleinsäure- Sequenzen können in einer beliebigen Nukleinsäure-enthaltenden Probe vorliegen, solange die Probe bezüglich Reinheit und Konzentration in einer Form vorliegt, die mit einer Nukleinsäure-Hybridisationsreaktion verträglich ist. Die Isolierung von Nukleinsäuren bis zu einem für die Hybridisierung geeigneten Grad ist allgemein bekannt und kann mittels vielfältiger Methoden erreicht werden. Beispielsweise können Nukleinsäuren aus einer Vielfalt von Nukleinsäure-enthaltenden Proben isoliert werden, einschließlich Körpergeweben, wie etwa Haut, Muskel, Haar und ähnlichem, und Körperflüssigkeiten, wie etwa Blut, Plasma, Urin, amniotische Flüssigkeiten, zerebrospinale Flüssigkeiten und ähnlichem. Siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); und Ausubel et al., Current Protocols in Molecules Biology, John Wiley and Sons (1987).
  • Das Hybridisations-Reaktionsgemisch wird bei der erwogenen Methode unter Hybridisations-Bedingungen über einen ausreichenden Zeitraum hinweg gehalten, damit die Polynukleotid-Sonde an komplementäre, in der Probe vorhandene Nukleinsäure-Sequenzen hybridisieren kann, um dadurch ein Hybridisations-Produkt, d. h. einen die Chromophor-enthaltenden Polynukleotid-Sonde(n) dieser Erfindung und Ziel-Nukleinsäure-enthaltenden Komplex, zu bilden.
  • Der Ausdruck "Hybridisations-Bedingungen" und seine grammatikalischen Entsprechungen weist, wenn bezüglich einer Aufrechterhaltungsdauer verwendet, darauf hin, dass Hybridisations-Reaktionsgemisch bezüglich der Konzentrationen der Reaktionspartner und begleitenden Reagenzien im Gemisch, ausreichenden Zeit-, Temperatur- und pH-Bedingungen unterzogen werden muss, um die Verschmelzung der Polynukleotid-Sonde mit der Ziel-Sequenz typischerweise zum Erhalt eines Nukleinsäure-Duplex zu ermöglichen. Diese zur Erzielung der Hybridisierung erforderlichen Zeit-, Temperatur- und pH-Bedingungen hängen, wie im Fachbereich wohlbekannt, von der Länge der zu hybridisierenden Polynukleotid-Sonde, dem Grad der Komplementarität zwischen der Polynukleotid-Sonde und dem Ziel, dem Guanidin- und Cytosin-Gehalt des Polynukleotids, der Stringenz der gewünschten Hybridisierung und dem Vorhandensein von Salzen oder zusätzlichen Reagenzien im Hybridisations-Reaktionsgemisch ab, da all diese die Kinetik der Hybridisierung beeinflussen kann. Verfahren zur Optimierung der Hybridisations-Bedingungen für ein gegebenes Hybridisations-Reaktionsgemisch sind im Fachbereich wohlbekannt.
  • Typische Hybridisations-Bedingungen umfassen die Verwendung von auf pH-Werte zwischen 4 und 9 gepufferten Lösungen und werden bei Temperaturen von 18ºC bis 75ºC, bevorzugt etwa 37ºC bis etwa 65ºC, noch bevorzugter etwa 54ºC, und über Zeiträume von 0,5 Sekunden bis 24 Stunden, bevorzugt 2 Minuten, hinweg vorgenommen.
  • Die Hybridisierung kann in einem homogenen oder heterogenen Format vorgenommen werden, wie wohlbekannt. Die homogene Hybridisations-Reaktion wird vollständig in Lösung vollzogen, wobei sowohl die Polynukleotid-Sonde als auch die zu hybridisierenden Nukleinsäure-Sequenzen (Ziel) in löslichen Formen in Lösung vorliegen. Eine heterogene Reaktion umfasst die Verwendung einer Matrix, die im Reaktionsmedium, an das entweder die Polynukleotid-Sonde oder die Ziel- Nukleinsäure gebunden sind, unlöslich ist. So kann z. B. die zu untersuchende Körperprobe an einer festen Matrix fixiert und einer in sito-Hybridisierung unterzogen werden.
  • Die in situ-Hybridisierung wird typischerweise an einer Körperprobe in Form eines Scheiben- oder eines Schnittpräparats des Gewebes mit einer Dicke im Bereich von etwa 1 um bis etwa 100 um, bevorzugt etwa 1 um bis etwa 25 um, und noch bevorzugter etwa 1 um bis etwa 10 um vorgenommen. Eine solche Probe kann unter Verwendung eines handelsüblichen Kältereglers präpariert werden.
  • Alternativ dazu ist ein breit eingesetztes heterogenes Format das Southern-Blot- Verfahren, bei dem genomische DNA nach Restriktonsenzym-Verdau elektrophoretisch behandelt wird und dann die elektrophoretisch behandelten DNA- Fragmente zunächst denaturiert und dann auf eine unlösliche Matrix übertragen werden. Beim Blot-Verfahren wird dann eine Polynukleotid-Sonde an die immobilisierten genomischen Nukleinsäuren, die die komplementären Nukleinsäure- (Ziel)-Sequenzen enthalten, hybridisiert.
  • Darüber hinaus handelt es sich bei einem breit eingesetzten heterogenen Format um ein Banken-Screeningverfahren, bei dem eine Vielzahl von Kolonien, nämlich typischerweise Plasmid-enthaltende Bakterien oder Lambda-Bakteriophagenenthaltende Bakterien, ausplattiert, gezüchtet und aufgetupft werden, um eine Bank klonierter Nukleinsäuren auf einer unlöslichen Matrix zu erhalten. Die aufgetupfte Bank wird dann mit einer Polynukleotid-Sonde zur Identifizierung der die Nukleinsäure-Fragmente von Interesse enthaltenden Bakterienkolonie hybridisiert.
  • Typische heterogene Hybridisations-Reaktionen umfassen die Verwendung von Glasscheiben, Nitrocelluloseplatten und ähnlichem als der festen Matrix, an der die Ziel-enthaltenden Nukleinsäure-Fragmente fixiert werden.
  • Ebenfalls bevorzugt sind die homogenen Hybridisations-Reaktionen, wie sie etwa für eine reverse Transkription isolierter mRNA zum Erhalt von cDNA, die Didesoxy- Sequenzierung und weitere Verfahrensweisen unter Anwendung von Primerextensions-Reaktionen, bei denen die Polynukleotid-Hybridisierung einen ersten Schritt darstellt. Besonders bevorzugt ist die homogene Hybridisations- Reaktion, bei der eine spezifische Nukleinsäuresequenz über eine Polymerase- Kettenreaktion (polymerase chain reaction - PCR) amplifiziert wird.
  • Liegt die eine Ziel-Sequenz enthaltende Nukleinsäure in einer doppelsträngigen (ds) Form vor, so ist es bevorzugt, zunächst die dsDNA z. B. durch Erhitzung oder Alkali- Behandlung zu denaturieren und dann erst die Hybridisations-Reaktion durchzuführen: Die Denaturierung der dsDNA kann vor Vermengen mit einem zu hybridisierenden Polynukleotid oder nach Vermengung der dsDNA mit dem Polynukleotid vorgenommen werden. Wird das Polynukleotid selbst als ein doppelsträngiges Molekül bereitgestellt, so kann auch dieses vor Beimengung zu einem Hybridisations-Reaktionsgemisch hybridisiert werden, oder kann gleichzeitig mit der Ziel-enthaltenden dsDNA denaturiert werden.
  • Die Mengen an einem Hybridisations-Reaktonsgemisch beigemengtem Polynukleotid können breit variieren und hängen von der Anwendung ab, die wiederum von der zum Nachweis der Ziel-Sequenz erforderlichen Empfindlichkeit abhängt. Für homogene Hybridisationsgemische können die Chromophorenthaltenden Polynukleotide in Konzentrationen von etwa 1 bis 1000 Nanogramm (ng) pro Milliliter (ml), und vorzugsweise etwa 10 bis 100 ng/ml bei einem Polynukleotid von etwa 20 Nukleotiden Länge vorhanden sein.
  • Bezüglich der Menge an Akzeptor-Chromophor, die auf einem Polynukleotid in homogenen Hybridisations-Flüssigkeitsgemischen vorhanden ist, beträgt die Nachweismenge für ein einzelnes Akzeptor-Chromophor pro Polynukleotid mindestens etwa 10&sup4; bis 10&sup5; Akzeptor-Chromophor-Moleküle pro 100 Mikrolitern (ul).
  • Für heterogene Hybridisationsgemische, wie etwa solche, bei denen die Ziel- Nukleinsäure in der festen Phase vorliegt, werden die Chromophor-enthaltenderi Polynukleotide dem Hybridisationsgemisch in Mengen von mindestens etwa 106 bis 10&sup7; Akzeptor-Chromophor-Molekülen pro Bande der nachzweisenden Nukleinsäure oder pro 2 Millimeter (mm) Dot-Blot der Ziel-Nukleinsäure zugegeben. Ein Beispiel einer Anwendung stellt der Nachweis von auf einem Southern-Blot oder einem DNA- Sequenziergel vorhandenen Nukleinsäure-Segmenten unter Verwendung beispielsweise eines ABI-Sequenz-Lesegeräts dar, das fluorometrisch markierte Sonden nachweist.
    • C. Photoelemente
  • Die vorliegende Erfindung stellt Photoelemente wie Lichtkollektoren und Photoleiter dank der Erweiterbarkeit der multiplen Donor-Übertragungsstruktur über lange Distanzen bereit. Daher kann die Struktur als ein linearer Leiter von Photonenenergie gestaltet oder kann als ein lichtempfindlicher Photonenschalter, d. h. ein Biosensor, konfiguriert werden.
  • Daher wird bei einer Ausführungsform für die vorliegende Erfindung ein Biosensor erwogen, umfassend ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung mit mindestens zwei Donor-Chromophoren, die mittels Linkerarmen funktionsfähig an das Polynukleotid geknüpft sind, wobei die Chromophoren durch die Verknüpfung entlang der Länge des Polynukleotids in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz positioniert sind. Das Polynukleotid weist auch mindestens ein fluoreszierendes Akzeptor-Chromophor auf, das an das Polynukleotid mittels eines Linkerarms funktionsfähig geknüpft ist, wobei das fluoreszierende Akzeptor-Chromophor durch die Verknüpfung in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz von mindestens einem der Donor-Chromophoren positioniert ist.
  • Daher enthält der Biosensor einen Photonenkollektor, der eine Vielfalt von Längen aufweisen kann und die aufgenommene und übertragene Photonenenergie an das Akzeptor-Chromophor weiterleitet. Vorzugsweise enthält ein Biosensor multiple, zusammengeballte Akzeptor-Chromophoren, um eine hellere Photonenleistung bereitzustellen.
  • Benachbart zum Akzeptor oder zur Zusammenballung der Akzeptoren positioniert befindet sich ein Photosensor zum Nachweis des Vorhandenseins emittierter Photonenenergie. Der Messfühler kann in einer Vielzahl von Licht-nachweisenden Vorrichtungen bestehen, wie z. B. einer Photovervielfacherröhre, einem faseroptischen System, das das emittierte Licht an einen lichtempfindlichen Photovervielfacher weiterleitet und ähnliche Messfühlvorrichtungen.
    • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sollen der Veranschaulichung, doch nicht der Beschränkung der vorliegenden Erfindung dienen.
    • 1. Entwurf und Synthese eines selbstorganisierenden erweiterten Energieübertragungssystems
  • Fünf Oligonukleotide mit unterschiedlicher spezifischer Sequenz-Fluoreszenz und nicht-funktionalisierte Versionen derselben Sequenzen wurden entworfen und für den experimentellen Nachweis eines erweiterten Energieübertragungssystems synthetisiert. Zu diesen zählen die folgenden:
  • (1) Eine Akzeptor-16 mer-Oligonukleotid-Einheit, 5,4 nm lang und markiert mit Sulforhodamin 101 (AU).
  • (2) Eine erste intermediäre 30 mer-Donor-Oligonukleotid-Einheit, 10,2 nm lang und markiert mit zwei Fluoresceinen, die durch einen Abstand von 6 Nukleotiden oder 2,4 nm voneinander getrennt sind (ID1).
  • (3) Eine zweite intermediäre 29 mer-Donor-Oligonukleotid-Einheit, 9,9 nm lang und markiert mit zwei Fluoresceinen, die durch einen Abstand von 6 Nukleotiden oder 2,4 nm voneinander getrennt sind (ID2).
  • (4) Eine wiederholte intermediäre 30-mer-Donor-Oligonukleotid-Einheit, 10,2 nm lang und markiert mit zwei Fluoresceinen, die durch einen Abstand von 7 Nukleotiden oder 2,7 nm getrennt sind (RD). Die Wiederholungs-Einheit ist so entworfen, dass die Struktur verlängert werden kann.
  • (5) Eine endständige 15-mer-Donor-Oligonukleotid-Einheit, 5,1 nm lang und markiert mit einem einzelnen Fluorescein (TD).
  • Die unmodifizierten Versionen aller obigen Oligonukleotide wurden ebenfalls synthetisiert. Alle Oligonukleotide sind durch ihre kodierte Sequenz so gestaltet, dass sie an komplementäre Abschnitte voneinander zur Bildung linearer doppelsträngiger Strukturen binden. Die spezifische Sequenz und Position des/der fluoreszierenden Marker [A = Sulforhodamin 101 (Texasrot), D = Fluorescein] in den fünf modifizierten Oligonukleotid-Sequenzen sind unten gezeigt und jeweils als SEQ. ID. Nrn. 4-8 markiert:
  • Die oben gezeigten Oligonukleotid-Sequenzen und die nicht-funktionalisierten Versionen wurden alle auf einem automatisierten DNA-Synthesegerät, Modell #381, von Applied Biosystems unter Anwendung einer standardmäßigen Phosphoramidit- Chemie auf einem Glasträger mit kontrollierten Poren synthetisiert. Im Falle der funktionalisierten Oligonukleotide wurde das geschützte Linkerarm-Nukleosid (5'- Dimethoxytrityl-5-trifluoraminoalkyldesoxyuridin) an der/den oben angegebenen ausgewählten Position/en inkorporiert. Dieses Linkerarm-Nukleosid stellt die primäre Amingruppe für die Reaktion mit den aktivierten Fluorophoren, Sulforhodamin-101, Sulfonylchlorid (Texasrot) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) bereit.
  • Am Ende jeder Synthese wurde das fertiggestellte Oligonukleotid vom Träger getrennt und die Blockierungsgruppen durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid über 12 Stunden hinweg bei 55ºC entfernt. Die Dimethoxytrityl- Gruppe wurde am Oligonukleotid zur Unterstützung der Reinigung belassen. Das 5'- Trityl-Oligonukleotid wurde mittels Umkehrphasen-Hochdruck- Flüssigchromatographie (HPLC) gereinigt. Die Reinheit jedes Oligonukleotid- Produkts wurde mittels analytischer Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt. Die HPLC-gereinigten und unmodifizierten Oligonukleotide waren so für die experimentelle Anwendung bereit. Die den/die reaktiven Linkerarm/e enthaltenden Oligonukleotide wurden dann mit dem entsprechenden aktivierten Fluorophor umgesetzt. Die Fluoreszenz-Markierung wurde durch Umsetzen von 500 ng des den reaktiven Linkerarm enthaltenden Oligonukleotids mit 1 mg entweder von Sulforhodamin 101, Sulfonylchlorid (Texasrot) oder Fluoresceinisothiocyanat (beide beziehbar von Molecular Probes) in 100 ul an 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,5) über 2 Stunden hinweg bei 20ºC vorgenommen. Nach Reaktionsstop wurde das überschüssige Fluorophor-Reagenz entfernt, indem die Lösung durch eine Sephadex-G-25-Gel-Filtrationssäule geleitet wurde. Die abschließende Reinigung der Fluoreszenz-markierten Oligonukleotide von unmarkiertem Material wurde mittels präparativer Polyacrylamidgel-Elektrophorese vorgenommen.
  • Die UV/sichtbaren Spektren (240 nm bis 600 nm) wurden für alle gereinigten fluoreszierenden und unmodifizierten Oligonukleotide genommen (Hewlett Packard 8451A Diode Array Spectrophotometer). Aus den Spektraldaten wurden die Konzentrationen und der Grad der Fluoreszenz-Markierung bestimmt. Die Akzeptor- Einheit (AU) wurde als > 95% rein bezüglich der Sulforhodamin-101-(Texasrot)- Markierung bestimmt. Der intermediäre Donor 1 (ID1) wurde als zu etwa 40% rein bezüglich der doppelt Fluorescein-markierten Komponente bestimmt; beim Rest handelte es sich um ein Gemisch aus einzelmarkierten Komponenten. Der intermediäre Donor 2 (ID2) wurde als zu etwa 30% rein bezüglich der doppelt Fuorescein-markierten Komponente bestimmt; der Rest bestand in einem Gemisch aus einzelmarkierten Komponenten. Die Wiederholungs-Donor-(RD)-Einheit wurde als zu etwa 25% rein bezüglich der doppelt Fluorescein-markierten Komponente bestimmt; der Rest bestand in einem Gemisch aus einzelmarkierten Komponenten. Der endständige Donor (TD) wurde als zu > 95% rein bezüglich der Fluorescein- Markierung bestimmt. Obschon die intermediären Donoren nicht alle mit Fluorescein doppelmarkiert waren, eigneten sie sich doch nach wie vor zum Demonstrieren des Mechanismus der erweiterten Energieübertragung in einem selbstorganisierenden System.
  • Die eigentlichen Experimente, die zur Demonstration der erweiterten Energieübertragung hierin entworfen wurden, beinhalten die Organisation einer 14 nm langen Photonenantennen-Struktur, über die Hybridisierung, der vier Oligonukleotid-Einheiten: der Akzeptor-Einheit (AU), der intermediären Donor-1- Einheit (ID1), der intermediären Donor-2-Einheit (ID2) und einer endständigen Donor-Einheit (TD). Die organisierte Struktur und der Weg für die erweiterte Energieübertragung sind in Abb. 3 gezeigt.
  • Die zusammengesetzte Antennenstruktur von 14 nm wurde durch Kombinieren der obigen Oligonukleotide bei einer Konzentration von 0,5 Nanomol/pl in 500 ul wässrigem Puffer (0,1 M Natriumchlorid/0,02 M Natriumphosphat, pH 7,8) bei 20ºC gebildet. Diese Bedingungen sind für eine schnelle Hybridisation (eine Minute) der Oligonukleotid-Einheiten an ihre komplementären Sequenzen und die Selbstorganisation (Zusammenfügung) der linearen doppelsträngigen Strukturen von 16 nm optimal.
  • Auch eine Reihe der experimentellen Kontrollstrukturen wurde bei derselben Grundanordnung zusammengefügt, abgesehen davon, dass eine oder mehrere der verwendeten Donor-Einheiten in unmarkierter Form (NL) vorlag. Als die Fluoreszenz- Donor- und Akzeptor-Gruppen wurden Fluorescein und Sulforhodamin 101 aufgrund ihres Potentials für eine zweckmäßig effiziente Förster-Energieübertragung ausgewählt. Die organisierte Antennenstruktur von 14 nm ist auf einen Abstand von 6 Basenpaaren (2,4 nm) (Akzeptor-Donor-Übertragungsdistanz) zwischen der Sulforhodamin-Gruppe in der Akzeptor-Einheit (AU) und der ersten Fluorescein- Gruppe in der intermediären Donor-1-Einheit (ID1) und einen Abstand von 6 Basenpaaren (Donor-Donor-Übertragungsdistanz) zwischen den jeweiligen Fluorescein-Donoren im Rest der Anordnung hin entworfen.
  • Fluorescein besitzt sein Absorptions-(Anregungs)-Maximum bei einer Wellenlänge von 495 nm (EX&sub4;&sub9;&sub5;), sein Emissions-Maximum bei Wellenlänge 520 nm (EM&sub5;&sub2;&sub0;) und einen Extinktionskoeffizienten von 72.000. Sulforhodamin 101 (Texasrot) besitzt sein Absorptions-(Anregungs)-Maximum bei Wellenlänge 595 nm (EX&sub5;&sub9;&sub5;), sein Emissions-Maximum bei einer Wellenlänge von 615 nm (EM&sub6;&sub1;&sub5;) und einen Extinktionskoeffizienten von 85.000. Die breite Emissionsbande von Fluorescein erstreckt sich von 500 nm bis 600 nm und zeigt eine gute Überlappung mit der breiten Absorptionsbande von Sulforhodamin, die sich von 520 nm bis 600 nm erstreckt. Diese Überlappung der Emissions- und Absorptionsbanden und die hohe Quantenausbeute bei jedem der Fluorophore macht sie zu guten Partnern für die Energieübertragung.
  • Die Demonstration der erweiterten Energieübertragung in der zusammengesetzten Photonenantennen-Struktur wurde durch Anregen der Fluorescein-Donor-Einheiten mit einer Bestrahlung bei 495 nm und Messen der Sekundäremission dieser Strahlung bei 615 nm durch die Sulforhodamin-101-Akzeptor-Einheit vorgenommen. Die Texasrot-Fluoreszenz-Basisemission bei 615 nm wurde durch Anregung bei 595 nm bestimmt (zur Durchführung dieser Experimente wurde ein Aminco-Bowmen- Spectrophotofluorometer verwendet). Die relative energieübertragende Leistung (ET eff.) wird ausgedrückt als das Verhältnis der Emission bei 615 nm, wenn das System bei 495 nm angeregt wird, zur Emission bei 615 nm bei einer Anregung bei 595 nm, multipliziert mit 100, und kann durch die folgende Formel dargestellt werden:
  • ET eff. = EM&sub6;&sub1;&sub5; (EX&sub4;&sub9;&sub5;)/EM&sub6;&sub1;&sub5; (EX&sub5;&sub9;&sub5;) · 100 (3)
  • Es wurde die Umkehrbarkeit der Selbstorganisation der Photonenantennen-Struktur von 16 nm demonstriert, indem zunächst die organisierte Struktur bei 20ºC zusammengesetzt, dann auf 90ºC über eine Minute hinweg erhitzt und das System anschließend auf 20ºC rückgekühlt (eine Minute) wurde. Die Messungen von Anregung und Emission wurden wie zuvor für jede Bedingung nach den Prozessen des Zusammensetzens (eingeleitet), Erhitzens (erhitzt) und Abkühlens (abgekühlt) vorgenommen. Die Ergebnisse der experimentellen Nachweise der erweiterten Energieübertragung in den verschiedenen Anordnungen und für die umkehrbare Selbstzusammensetzung sind in Tabelle 4 wiedergegeben. TABELLE 4 ERGEBNISSE DER EXPERIMENTE FÜR DIE ERWEITERTE ENERGIEÜBERTRAGUNG
  • ¹ AU= Akzeptor-Einheit mit Sulforhodamin 101; ID1 = der intermediäre Donor 1 mit zwei Fluoresceinen; ID2 = der intermediäre Donor 2 mit zwei Fluoresceinen; TD = der endständige Donor mit einem Fluorescein; NL bedeutet, dass das Oligomer nicht markiert war (keine Fluoresecein-Donor-Gruppen).
  • ² Experimente zur Demonstration der umkehrbaren Selbstzusammensetzung bei Einleitung bei 20ºC, Erhitzung auf 90ºC und Rückkühlung auf 20ºC.
  • Die erweiterte Energieübertragung ist in Tabelle 4 anhand der organisierten (AU/ID1/ID2/TD) Antennenstruktur gezeigt, wobei eine energieübertragende Leistung von etwa 76% zur Akzeptor-Einheit (AU) erzeugt wird, wenn alle Donor-Einheiten anwesend sind. Ist nur die ID1-Einheit im AU/ID1/ID2(NL)/TD(NL)-System fluoreszierend, so beträgt die Energieübertragung 46%. Dies zeigt an, dass 30% der übertragenen Energie von der ID2-Einheit kamen; die ihre erste Donor-Gruppe 20 Basenpaare oder 6,&beta; nm von der Akzeptor-Gruppe entfernt lokalisiert aufweist. Dies liegt deutlich jenseits der Förster-Distanz, die für jedes signifikante Maß an Energieübertragung erforderlich ist. Sind lediglich die ID2- und TD-Einheiten im (AU/iDI (NL)/ID2/TD)-System fluoreszierend, so fällt die Energieübertragung auf etwa 8%. Dies stellt ein wichtiges Ergebnis dar, da es die anderen Ergebnisse erhärtet, die zeigen, dass die Übertragung von den ID2- und TD-Einheiten durch die ID1-Einheit auf die AU-Einheit stattfand. Das Ergebnis aus dem AU/ID1(NL)/ID2(NL)/TD(NL)-System bei einer Anregung bei 495 nm zeigt lediglich die Menge an Texasrot-Hintergrund-Fluoreszenz für AU; und das Ergebnis bei einer Anregung bei 595 nm gibt die normale oder Grundmenge der Texasrot-Fluoreszenz für AU wieder.
  • Das Zusammensetzungs-, Erhitzungs- und Abkühlungs-Experiment demonstriert eindeutig die Eigenschaften der umkehrbaren Organisation des Systems, indem es einen völligen Verlust der Energieübertragung bei 90ºC ergibt, wenn das System komplett zerlegt ist, und eine rückkehrende Befähigung zur Energieübertragung, wenn das System abgekühlt ist.
    • 2. Nachweis der Energieübertragung vom nicht-fluoreszierenden Donor zum fluoreszierenden Akzeptor bei beträchtlicher Reemission
  • Mehrere Oligonukleotide wurden entworfen und synthetisiert, um zu zeigen, dass bestimmte nicht-fluoreszierende Donor-Gruppen, die Energie auf Texasrot übertragen, eine beträchtliche Wiederausstrahlung ergeben können. Dieselben grundsätzlichen Vorgehensweisen, wie im Synthese- und Markierungs-Abschnitt und in Beispiel 1 beschrieben, wurden zur Synthese und Markierung zweier komplementärer 18-mer-Sequenzen angewendet. Unten stehendes Oligonukleotid (A) wurde mit einer primären Aminogruppe am sechsten Nukleotid von seiner 3'- terminalen Position aus funktionalisiert (derivatisiert). Unten stehendes Oligonukleotid (B) wurde mit einer 5'-terminalen Aminogruppe unter Anwendung der Aminolink-2-Chemie funktionalisiert. Oligonukleotid (A) wurde dann mit Fluorescein, DABITC (Molecular Probes), Reaktivrot (Sigma Chemical) oder Malachitgrün (Molecular Probes) markiert. DABITC, Reaktivrot 4 und Malachitgrün sind nichtfluoreszierende Chromophor-Gruppen. Oligonukleotid (B) wurde mit Texasrot markiert. Die Oligonukleotid-Sequenzen sind unten gezeigt und mit SEQ. ID. Nr. 9 bzw. 10 bezeichnet:
  • wobei D = Fluorescein, DABITC, Reaktivrot 4 oder Malachitgrün, und A = Texasrot. Wenn miteinander hybridisiert, ergeben Oligonukleotide (A) und (B) einen Abstand von 5 Basenpaaren (2,0 nm) zwischen den Donor- und Akzeptor-Gruppen. Die hybridisierte Anordnung für Texasrot-(A)- und Fluorescein-(B)-OÜgomere ist nachfolgend gezeigt und mit SEQ. ID. Nr. 9 bzw. 10 bezeichnet:
  • Oligonukleotide entsprechend dem Oligonukleotid (A), jedoch eines von Fluorescein, DABITC, Reaktivrot 4 oder Malachitgrün wurden unabhängig voneinander getestet, um ihre jeweilige Befähigung zur Energieübertragung auf die Texasrot-Akzeptor- Gruppe auf Oligonukleotid (B) zu bestimmen. Die Strukturen wurden durch Kombinieren der obigen Oligonukleotide (A) und (B) bei einer Konzentration von 0,5 Nanomol/pl in 500 ul wässrigem Puffer (0,1 M Natriumchlorid/0,02 M Natriumphosphat, pH 7,8) bei 20ºC gebildet. Diese Bedingungen sind für die Oligonukleotid-Einheiten zur schnellen Hybridisierung (1 Minute) an ihre komplementären Sequenzen optimal. Die Experimente für die Fluoreszenzanalyse wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Ausrüstung und Verfahrensweisen durchgeführt.
  • Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
  • (i) Fluorescein-markiertes Oligo-(A) erzeugte, wenn an Texasrot-markiertes (B) hybridisiert, eine Energieübertragung von etwa 55% als Reemission bei 615 nm, wenn die Anordnung bei 495 nm (dem Fluorescein-Anregungsmaximum) angeregt wurde. Dies stellt eine dem Zweck entsprechend gute Leistung für dieses System dar. Allerdings liegt nach wie vor eine beträchtliche Hintergrund-Fluoreszenz von der Donor-Gruppe vor. Das heißt, es sind nach wie vor 45% der fluoreszierenden Emission (-500 nm bis 600 nm) von Fluorescein vorhanden.
  • (ii) DABITC-markiertes Oligo-(A) erzeugte, wenn an Texasrot-markiertes Oligo-(B) hybridisiert, eine Energieübertragung von etwa 5% bis 10% als Reemission bei 615 nm, wenn die Anordnung bei 430 nm (dem DABITC-Anregungsmaximum) angeregt wurde. Allerdings war keine Fluoreszenz-Emision unmittelbar jenseits der Anregung von DABITC bei 440 nm bis zum Beginn der Texasrot-Fluoreszenz-Emission bei 600 nm nachweisbar. Bei dieser gleichen Anordnung scheint DABITC wenig oder keine Löschung der Texasrot-Fluoreszenz-Emission (615 nm) zu bewirken, wenn die Anordnung bei 595 nm (dem Anregungsmaximum von Texasrot) angeregt wurde.
  • (iii) Reaktivrot-4-markiertes Oligo-(A) erzeugte, wenn an Texasrot-markiertes Oligo- (B) hybridisiert, keine positive Energieübertragung als Reemmision bei 61 D nm, wenn die Anordnung bei 535 nm (dem Reaktivrot-4-Anregungsmaximum) angeregt wurde. Reaktivrot 4 erzeugte eine Löschung der Texasrot-Fluoreszenz-Emission (615 nm) über 80%, wenn die Anordnung bei 595 nm (dem Texasrot- Anregungsmaximum) angeregt wurde.
  • (iv) Malachitgrün-markiertes Oligo-(A) erzeugte, wenn an Texasrot-markiertes Oligo- (B) hybridisiert, eine Löschung der Texasrot-Fluoreszenz-Emission (615 nm) von über 60%, wenn die Anordnung bei 595 nm (dem Texasrot-Anregungsmaximum) angeregt wurde. Das Anregungsmaximum von Malachitgrün liegt bei 629 nm.
  • Die oben bei (i) und (ii) beschriebenen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass DABITC, eine nicht-fluoreszierende Chromophor-Gruppe, bei einem Abstand von 5 Basenpaaren (2,0 nm) eine signifikante Fluoreszenz-Reemission bei einem Texasrot-Akzeptor erzeugen kann. Auch erzeugt DABITC keine nachweisbare Hintergrund-Fluoreszenz in demselben Bereich, in dem Fluorescein einen beträchtlichen Hintergrund (45%) erzeugt. Bezüglich der multiplen Donor-Systeme ist dies viel wichtiger als die Tatsache, dass die durch Übertragung von DABITC (5% bis 10%) erzeugte Reemission geringer ist als von Fluorescein (55%). In einem multiplen Donor-System kann sich die additive Wirkung der Hintergrund-Fluoreszenz von den fluoreszierenden Donoren sehr schnell nachteilig auf seine Leistung und Nützlichkeit auswirken. Daher sind DABITC und ähnliche Chromophoren zur Verwendung in multiplen Donor-Systemen besser geeignet.
  • Das oben bei (iii) und (iv) beschriebene Ergebnis zeigt, dass andere nichtfluoreszierende Chromophor-Gruppen (Reaktivrot und Malachitgrün) die Fluoreszenz-Emission eines Texasrot-Akzeptoren bei einem Abstand von 5 Basenpaaren (2,0 nm) beträchtlich löschen können. Diese starken Quencher- Gruppen können für die Gestaltung von Mechanismen nützlich sein, die das An- und Abschalten amplifizierter Photonenemissionen ermöglichen würden. Daher sind sie bei der Erzeugung eines neueren und nützlicheren Photonenmechanismus oder -elements hilfreich. Ein Beispiel eines nützlichen Systems, bei dem eine Quencher- Gruppe zur Verminderung des Hintergrunds eingesetzt wird, ist in Beispiel 4 beschrieben und in Abb. 4 gezeigt.
    • 3. Methode für einen homogenen DNA-Hybridisations-Assay auf der Grundlage der erweiterten Energieübertragung
  • Im folgenden ist eine Methode für einen homogenen DNA-Hybridisations-Assay beschrieben, die einen erweiterten energieübertragenden Prozess bei geringem Fluoreszenz-Hintergrund ausnützt. Das System umfasst ein multiples Donor-, ein Akzeptor- und ein Quencher-Oligonukleotid.
  • Ein multiples Donor-Oligonukleotid (MDO) von 20 bis 100 Nukleotiden Länge wird mit DABITC-(nicht-fluoreszierenden)-Donor-Gruppen bei Abständen von 3 bis 6 Basenpaaren markiert. Das multiple Donor-System könnte auch in einer Anordnung aus einer Reihe multipler Donor-Sonden ähnlich der in Beispiel 1 erörterten Anordnung bestehen. Ein Abschnitt von mindestens 10 bis 50 Nukleotiden des multiplen Donor-Oligomers ist komplementär zu einem spezifischen Abschnitt einer Ziel-DNA-Sequenz.
  • Ein Akzeptor-Oligonukleotid (AO) von 15 bis 50 Nukleotiden Länge wird mit Texasrot an oder nahe seiner 5'-Endposition markiert und ist zu jenem Abschnitt der DNA- Ziel-Sequenz komplementär, die mit der für das multiple Donor-Oligomer spezifischen Ziel-Sequenz zusammenhängt.
  • Ein Quencher-Oligonukleotid (QO) von 10 bis 45 Nukleotiden Länge wird mit Reaktivrot 4 nahe seiner 3'-Endposition markiert. Das Quencher-Oligomer wird komplementär zum Akzeptor-Oligomer, jedoch 5 bis 10 Basen kürzer, hergestellt. Das Quencher-Oligomer ist so konstruiert, dass sich bei Hybridisierung an das Akzeptor-Oligomer die Reaktivrot-4-Gruppe innerhalb von 1 bis 5 Basen von der Texasrot-Gruppe entfernt befindet, was zur völligen Löschung der Texasrot- Fluoreszenz führt.
  • In Abb. 4 ist das homogene Assay-Verfahren gezeigt. Dieses Verfahren kann unter Verwendung der im Fachbereich der Hybridisierung üblichen wässrigen Puffer durchgeführt werden. Anfänglich wird das multiple Donor-Oligomer als ein unhybridisiertes (einzelsträngiges) Oligomer in das homogene System eingeführt und das Quencher-Oligomer dem System hybridisiert an das Akzeptor-Oligomer dem System zugeführt. Die Ziel-DNA ist entweder bereits vorhanden oder wird nun dem Assay-System zugegeben. Das System wird dann auf eine Temperatur erhitzt, die zur Denaturierung der Ziel-DNA führt. Das System wird dann abgekühlt, damit die neuen spezifischen Hybridisierungen stattfinden können. Das Donor-Oligomer hybridisiert dann an seine komplementäre Sequenz auf der Ziel-DANN, und ebenso hybridisiert das Akzeptor-Oligomer an die Ziel-DNA in Nachbarschaft zum multiplen Donor. Beide Oligomere sind relativ zu einer zuvor gewählten Ziel-Sequenz konstruiert, so dass bei der programmierten Zusammensetzung (Hybridisierung) die endständige Donor-Gruppe innerhalb von 3 bis 6 Basenpaaren zur Akzeptor-Gruppe lokalisiert ist. Das Quencher-Oligomer ist von kürzerer Länge als der Akzeptor gewählt und kann daher nicht wirksam mit den Ziel-Sequenzen um die Hybridisierung an das Ziel-gebundene Akzeptor-Oligomer konkurrieren. Jegliches unhybridisierte Akzeptor-Oligomer rehybridisiert mit dem Quencher-Oligomer. Die Ziel-DNA hat nun das Donor-Oligomer und das Akzeptor-Oligomer für eine wirksame erweiterte Energieübertragung zur Texasrot-Gruppe organisiert. Die Ziel-DNA kann mittels Fluoreszenz-Analyse quantitativ bestimmt werden.
  • Das obige zusammengesetzte System wird dann bei 430 nm angeregt und die Fluoreszenz-Emission bei 615 nm bestimmt. Dieses homogene System zeigt den einzigartigen Vorteil, keinen Fluoreszenz-Hintergrund durch eine der multiplen Donor-Gruppen als auch durch ein nicht an das Ziel hybridisiertes Akzeptor-Oligomer aufzuweisen. Dieses spezielle Verfahren stellt lediglich eines aus einer Anzahl möglicher homogener und heterogener DNA-Assay-Systeme dar, die auf der Basis der neuartigen erweiterten energieübertragenden Mechanismen entwickelt werden können.
    • 4. Nachweis einer wirksamen Energieübertragung in einer stark einander genäherten Donor-Akzeptor-Anordnung
  • Im folgenden ist der Nachweis einer wirksamen Energieübertragung in einem Oligonukleotid beschrieben, bei dem der endständige Akzeptor (Texasrot) durch eine Nukleotid-Einheit (0,34 nm) von seinem primären Donor (Fluorescein) beabstandet ist. Die Anordnung des Fluorescein-Donoren und Texasrot-Akzeptoren in der Nukleotidsequenz ist nachstehend gezeigt (SEQ. ID. Nr. 11):
  • 5'-(TR)-G-(F)-GAGACTCATGAGCAGGGGCTAGC-3'
  • Das obige Fluoreszenz-modifizierte Oligonukleotid wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden synthetisch hergestellt, mit der Ausnahme, dass ein Fluorescein-(F)-Phosphoramidit (Clontech) das zweite Nukleotid vom 5'-Terminus des Oligonukleotids aus ersetzte. Diese zweite Nukleotid-Position wurde mit standardmäßigem C&sub6;-Linker-Amin (Aminolink 2) funktionalisiert, das anschließend mit Texasrot umgesetzt wurde. Das resultierende Oligonukleotid-Derivat wurde mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese (15%) gereinigt.
  • Die Fluoreszenz-Energieübertragung für dieses Oligonukleotid mit fluoreszierendem Phosphoramidit-Derivat wurde vorgenommen, nachdem zuvor das Derivat an ein komplementäres Oligonukleotid hybridisiert worden war. Die Konzentration bei beiden Oligonukleotiden betrug 25 ug/ml; die Hybridisierung wurde bei Raumtemperatur in 1X SSC (pH 7,0) vorgenommen. Bei Anregung bei 490 nm erbrachte dieses Derivat eine Energieübertragung von > 50%, bezogen auf eine Reemission bei 610 nm durch den Texasrot-Akzeptor. Dies weist eindeutig eine dicht beabstandete Donor-Akzeptor-Anordnung nach, bei der sekundäre Löschmechanismen reduziert und eine höhere Energieübertragung, bezogen auf die Reemission durch den Akzeptor, beobachtet wird.
  • Die vorangegangene Beschreibung soll der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung der vorliegenden Erfindung dienen. Zahlreiche Abwandlungen und Abweichungen können vorgenommen werden, ohne den Rahmen der Erfindung zu überschreiten.
    • SEQUENZLISTE
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (i) ANMELDER: HELLER, Michael J.
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: SELBSTORGANISIERENDE MOLEKULARE PHOTONENSTRUKTUREN AUF DER BASIS CHROMOPHOR- UND FLUOROPHOR-ENTHALTENDER POLYNUKLEOTIDE UND VERFAHREN FÜR DEREN ANWENDUNG
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 11
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) ADRESSAT: Thomas Fitting
  • (B) STRAßE: 12526 High Bluff Drive, Suite 300
  • (C) STADT: San Diego
  • (D) STAAT: Kalifornien
  • (E) LAND: USA
  • (F) PLZ (ZIP): 92130
  • (v) COMPUTER-LESBARE FORM:
  • (A) MEDIUM-TYP: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIN Release #1.0, Version #1,25
  • (vi) DERZEITIGE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) ANMELDUNGSNUMMER: PCT/US92
  • (B) ABLAGEDATUM: 06. Nov. 1992
  • (C) KLASSIFIKATION:
  • (vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) ANMELDUNGSNUMMER: US 071790.262
  • (B) EINREICHUNGSDATUM: 07. NOV. 1992
  • (viii) ANWALT/AGENT-INFORMATION:
  • (A) NAME: Fitting, Thomas
  • (B) REGISTRATIONSNUMMER: 34.163
  • (C) REFERENZ/REGISTERNUMMER: HEL0005P
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION:
  • (A) TELEFON: 619-792-3680
  • (B) TELEFAX: 619-792-8477
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 10 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 10
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anmerk.- "Donor-Chromophor am 3'-T-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
  • ATGCATACGT 10
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 10 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 1
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:.- "Akzeptor-Chromophor am 5'-T-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
  • TCAGTACGAT 10
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 3:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
  • ATCGTACTGA ACGTATGCAT 20
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 4:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 16 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 6
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm.- "Sulforhodamin-101-(Texasrot)-markiertes T-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
  • ATGTCTGACT GCAGCT 16
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 11
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:- "Fluorescein-markiertes T-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
  • ACGACCATAG TGCGAGCTGC AGTCAGACAT 30
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 6:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 11
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:- "Fluorescein-markiertes T-Nukleotid"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 18
  • (D) WEITERE INFORMATiON: /Anm:- "Fluorescein-markiertes T-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
  • CGCACTATGG TCGTGAGTGT TGAGAGGCT 29
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 7:
  • (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 11
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:- "Fluorescein-markiertes T-Nukleotid"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 19
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:- "Fluorescein-markiertes T-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
  • ACGACCATAG TGCGAGCCTC TGAACACTC 29
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 8:
  • (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 15 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 5
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:- "Fluorescein-markiertes T-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
  • AGCCTCTGAA CACTC 15
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 9:
  • (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 13
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:- "Fluorescein-markiertes T-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
  • CCTGCTCATG AGTCTCTC 18
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 10:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 1
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:- "Texasrot-markiertes G-Nukleotid"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
  • GAGAGACTCA TGAGCAGG 18
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 11:
  • (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLART: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
  • (iv) ANTI-SENSE: NEIN
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) LOKATION: 1
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Anm:- "Das 5'-G-Nukleotid trennt den endständigen Texasrot-(TR)-Akzeptor von seinem Primärdonor, Fluorescein (F)"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
  • GGAGACTCAT GAGCAGGGGC TAGC 24

Claims (54)

1. Polynukleotid mit einem endständigen Donor-Chromophor, mindestens einem intermediären Donor-Akzeptor-Chromophor, der vom endständigen Donor- Chromophor in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz beabstandet ist, und mindestens einem Akzeptor-Chromophor, der vom Donor-Akzeptor-Chromophor in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist, wobei alle diese Chromophoren an das Polynukleotid durch Linkerarme geknüpft sind und wobei die Distanz zwischen dem endständigen Donor-Chromophor und einem Akzeptor-Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor innerhalb dieser Distanz liegt.
2. Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei mindestens ein solcher Akzeptor- Chromophor zum Wiederausstrahlen von Licht ohne Löschen fähig ist.
3. Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei Licht, das von mindestens einem solchen Donor-Chromophor über 5 nm hinaus übertragen wird, einen Anstieg der Akzeptor-Reemission erzeugt.
4. Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei die Donor-Chromophoren gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 4,4'-Diisothiocyanatdihydrostilben-2,2'- disulfonsäure, 4-Acetamid-4'-isothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure, 4,4'- Diisothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure, Succinimidylpyrenbutyrat, Acridinisothiocyanat, 4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-isothiocyanat, Lucifergelb-Vinylsulfon, Fluoresceinisothiocyanat, Cibacron Brilliantrot 3B-A, Rhodamin-X-Isothiocyanat, Sulforhodamin-101-Säurechlorid, Malachitgrün-Isothiocyanat und IR1446.
5. Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei der endständige Donor-Chromophor und der mindestens eine intermediäre Donor-Chromophor nicht-fluoreszierende Chromophoren sind.
6. Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei der endständige Donor-Chromophor und der mindestens eine intermediäre Donor-Chromophor 2 bis 100 Chromophoren umfassen.
7. Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei der Akzeptor-Chromophor ein fluoreszierender Akzeptor-Chromophor ist, der vom Donor-Akzeptor-Chromophor in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist.
8. Polynukleotid nach Anspruch 7, wobei der fluoreszierende Chromophor gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pyren, Lucifergelb-Vinylsulfon, Acridinisothiocyanat, Riboflavin, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin-XIsothiocyanat, Sulforhodamin-101-Säurechlorid und IR 144.
9. Diagnostisches Assay-System für den Photonen-Nachweis einer zuvor gewählten Nukleotidsequenz, umfassend, in einer ausreichenden Menge für zumindest einen Assay, ein Polynukleotid mit einem endständigen Donor- Chromophor, mindestens einem intermediären Donor-Akzeptor-Chromophor und mindestens einem Akzeptor-Chromophor, wobei alle diese Chromophoren an das Polynukleotid durch Linkerarme geknüpft sind und wobei die Distanz zwischen dem endständigen Donor-Chromophor und einem Akzeptor- Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor innerhalb dieser Distanz liegt.
10. Diagnostisches System nach Anspruch 9, wobei mindestens einer von dem endständigen Donor-Chromophor, dem intermediären Donor-Chromophor und dem Akzeptor-Chromophor ein fluoreszierender Chromophor ist, der funktionsfähig an das Polynukleotid durch einen Linkerarm geknüpft ist, wobei der fluoreszierende Chromophor durch die Verknüpfung in einer Donor-Akzeptor- Übertragungsdistanz zu mindestens einem der nicht-fluoreszierenden Chromophoren positioniert ist.
11. Diagnostisches System nach Anspruch 9, außerdem umfassend ein zweites Polynukleotid, und dabei mindestens ein fluoreszierendes Polynukleotid, das an das zweite Polynukleotid mittels eines Linkerarms geknüpft ist.
12. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins einer zuvor gewählten Nukleinsäure-Zielsequenz in einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Vermischen
(i) eines Polynukleotids mit einem endständigen Donor-Chromophor, mindestens einem intermediären Donor-Akzeptor-Chromophor, der vom endständigen Donor-Chromophor in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz beabstandet ist, und mindestens einem Akzeptor-Chromophor, der vom Donor-Akzeptor-Chromophor in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist, wobei alle diese Chromophoren an das Polynukleotid durch Linkerarme geknüpft sind und wobei die Distanz zwischen dem endständigen Donor-Chromophor und dem Akzeptor-Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor innerhalb dieser Distanz liegt, und
(ii) der Nukleinsäure-enthaltenden Probe zum Erhalt eines Hybridisierungs- Reaktionsgemischs, wobei das Polynukleotid mit einer zuvor gewählten Nukleinsäuresequenz zum Hybridisieren an die Zielsequenz angepasst ist;
(b) Unterziehen des Hybridisierungs-Reaktionsgemischs den Hybridisierungsbedingungen über einen ausreichenden Zeitraum hinweg, damit das Polynukleotid an die zuvor gewählte Nukleinsäure-Basensequenz hybridisieren und einen Donor-Chromophor-enthaltenden und Akzeptor- Chromophor-enthaltenden hybridisierten Nukleinsäure-Duplex bilden kann;
(c) Anregen der Donor-Chromophoren im in Schritt (b) gebildeten Nukleinsäure- Duplex durch Aussetzen der Donor-ChromophOren einer ausreichenden Photonenenergie, um eine Emission von Photonenenergie aus dem Akzeptor- Chromophor zu hervorzurufen; und
(d) Nachweisen des Vorhandenseins der aus dem Akzeptor-Chromophor wiederausgestrahlten Photonenenergie unter Verwendung einer Photonen- Messvorrichtung, und dabei Nachweisen des Vorhandenseins der zuvor gewählten Nukleinsäure-Zielsequenz in der Probe.
13. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins einer zuvor gewählten Nukleinsäure-Zielsequenz in einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Vermischen
(i) eines ersten Polynukleotids mit einem endständigen Donor-Chromophor und mindestens einem intermediären Donor-Chromophor, der vom endständigen Donor-Chromophor in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz beabstandet ist und an das erste Polynukleotid durch Linkerarme geknüpft sind; und
(ii) eines zweiten Polynukleotids mit mindestens einem Akzeptor- Chromophor, der an das zweite Polynukleotid durch einen Linkerarm geknüpft ist, und
(iii) der Nukleinsäure-enthaltenden Probe zum Erhalt eines Hybridisierungs- Reaktionsgemischs, wobei die ersten und zweiten Polynukleotide mit den zuvor gewählten Nukleinsäure-Sequenzen zum Hybridisieren an die Zielsequenz angepasst sind und dabei das endständige Donor-Chromophor auf dem ersten Polynukleotid und ein Akzeptor-Chromophor auf dem zweiten Polynukleotid in einer Distanz zu positionieren, die größer als 5 nm ist, wobei mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor vorhanden ist und wobei der Akzeptor-Chromophor vom intermediären Donor-Chromophor in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist;
(b) Unterziehen des Hybridisierungs-Reaktionsgemischs den Hybridisierungsbedingungen über einen ausreichenden Zeitraum hinweg, damit das Polynukleotid an die zuvor gewählte Nukleinsäure-Basensequenz hybridisieren und einen Donor-Chromophor-enthaltenden und Akzeptor- Chromophor-enthaltenden hybridisierten Nukleinsäure-Duplex bilden kann;
(c) Anregen der Donor-Chromophoren im in Schritt (b) gebildeten Nukleinsäure- Duplex durch Aussetzen der Donor-Chromophoren einer ausreichenden Photonenenergie, um eine Emission von Photonenenergie aus dem Akzeptor- Chromophor hervorzurufen; und
(d) Nachweisen des Vorhandenseins der aus dem Akzeptor-Chromophor wiederausgestrahlten Photonenenergie unter Verwendung einer Photonen- Messvorrichtung, und dabei Nachweisen des Vorhandenseins der zuvor gewählten Nukleinsäure-Zielsequenz in der Probe.
14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der endständige Donor-Chromophor und der mindestens eine intermediäre Donor-Chromophor durch Photonenenergie bei einer Wellenlänge entsprechend dem Anregungsmaximum des Donors angeregt werden, und wobei die aus dem Akzeptor wiederausgestrahlte Photonenenergie bei ihrer Emissionswellenlänge nachgewiesen wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Donor-Chromophoren durch Photonenenergie bei einer Wellenlänge entsprechend dem Anregungsmaximum des Donors angeregt werden, und wobei die aus dem Akzeptor wiederausgestrahlte Photonenenergie bei ihrer Emissionswellenlänge nachgewiesen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 12, wobei mindestens eines von dem Polynukleotid und der Nukleinsäure-Zielsequenz an einen festen Träger oder eine Matrix gebunden ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der feste Träger oder die Matrix gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glas, Metallen, Silicium, organischen Polymeren, Membranen und Biopolymeren.
18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Photonen-Messvorrichtung eng mit dem festen Träger oder der Matrix verbunden ist.
19. Verfahren nach Anspruch 13, wobei mindestens eines von dem ersten Polynukleotid, dem zweiten Polynukleotid und der Nukleinsäure-Zielsequenz an einen festen Träger oder eine Matrix gebunden ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der feste Träger oder die Matrix gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glas, Metallen, Silicium, organischen Polymeren, Membranen und Biopolymeren.
21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Photonen-Messvorrichtung eng mit dem festen Träger oder der Matrix verbunden ist.
22. Biosensor zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Analyts in Lösung, welches Analyt eine Ziel-DNA-Sequenz umfasst, und wobei der Biosensor umfasst:
(i) eine Anregungsquelle zum Abgeben emittierender Photonenenergie;
(ii) eine Donor-Sequenz, umfassend ein erstes Polynukleotid mit einem endständigen Donor-Chromophor und mindestens einem intermediären Donor- Chromophor, der vom endständigen Donor-Chromophor in einer Donor-Donor- Übertragungsdistanz beabstandet ist, die an das erste Polynukleotid mittels Linkerarme geknüpft sind, wobei das erste Polynukleotid komplementär zu einer ersten Region der Ziel-DNA-Sequenz ist;
(iii) eine Akzeptor-Sequenz, umfassend ein zweites Polynukleotid mit mindestens einem Akzeptor-Chromophor, der an das zweite Polynukleotid durch Linkerarme geknüpft ist, wobei das zweite Polynukleotid komplementär zu einer zweiten Region der Ziel-DNA-Sequenz ist; und
(iv) eine damit verbundene Photonen-Messvorrichtung zum Nachweisen der vom Akzeptor ausgestrahlten Photonenenergie; wobei das erste Polynukleotid und das zweite Polynukleotid zum Hybridisieren mit der Ziel-DNA-Sequenz zum Erhalt eines Komplexes fähig sind, bei dem die Distanz zwischen dem endständigen Donor-Chromophor und dem zweiten Akzeptor-Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor vorliegt, und wobei der Akzeptor-Chromophor vom intermediären Donor- Chromophor durch eine Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist.
23. Biosensor nach Anspruch 22, wobei das Analyt, auf die Hybridisierung hin, eng mit der Photonen-Messvorrichtung verbunden ist.
24. Biosensor nach Anspruch 22, wobei mindestens eines von dem ersten Polynukleotid, dem zweiten Polynukleotid und der Ziel-DNA-Sequenz an einen festen Träger oder eine Matrix gebunden ist, der/die in der Analyt-Lösung unlöslich ist.
25. Biosensor nach Anspruch 24, wobei der feste Träger oder die Matrix gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glas, Metallen, Silicium, organischen Polymeren, Membranen und Biopolymeren.
26. Biosensor nach Anspruch 22, wobei die assoziierte Photonen-Messvorrichtung gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Photodiode, Photodioden- Anordnung, einem Photomultiplier und einem faseroptischen Nachweissystem.
27. Duplex-Nukleinsäure-Struktur, die zur erweiterten Photonenenergie-Übertragung fähig ist, welche Struktur umfasst:
(i) ein erstes Polynukleotid;
(ii) ein zweites Polynukleotid, das an das erste Polynukleotid hybridisiert ist;
(iii) einen endständigen Donor-Chromophor, der durch Linkerarme an eines von dem ersten Polynukleotid und dem zweiten Polynukleotid geknüpft ist;
(iv) mindestens einen intermediären Donor-Chromophor, der vom endständigen Donor-Chromophor in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz beabstandet ist und der durch Linkerarme an eines von dem ersten Polynukleotid und dem zweiten Polynukleotid geknüpft ist; und
(v) mindestens ein Akzeptor-Chromophor, der vom Donor-Akzeptor-Chromophor in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist und der durch Linkerarme an eines von dem ersten Polynukleotid und dem zweiten Polynukleotid geknüpft ist;
wobei die Distanz zwischen dem endständigen Donor-Chromophor und einem Akzeptor-Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor vorhanden ist, der vom endständigen Donor- Chromophor durch eine Donor-Donor-Übertragungsdistanz beabstandet ist; und wobei die Donor- und die Akzeptor-Chromophoren abwechselnd so am ersten Polynukleotid und am zweiten Polynukleotid positioniert sind, dass die Photonenenergie-Übertragung zwischen dem ersten und dem zweiten Polynukleotid des Duplex kreuzt.
28. Struktur nach Anspruch 27, wobei die Donor-Donor-Übertragungsdistanz 1, 4 bis 6,1 nm beträgt.
29. Struktur nach Anspruch 27, wobei die Donor-Chromophoren gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 4,4'-Diisothiocyanatdihydrostilben-2,2'-disulfonsäure, 4- Acetamido-4'-isothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure, Succinimidylpyrenbutyrat, Acridinisothiocyanat, 4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-isothiocyanat (DABITC), Lucifergelb-Vinylsulfon, Fluoresceinisothiocyanat, Reaktives Rot 4 (Cibacron-Brilliantrot 3B-A), Rhodamin-X-isothiocyanat, Sulforhodamin 101- Säurechlorid, Malachitgrün-Isothiocyanat und IR1446.
30. Struktur nach Anspruch 27, wobei die Donor-Chromophoren nichtfluoreszierende Chromophoren sind.
31. Struktur nach Anspruch 27, wobei der mindestens eine intermediäre Donor- Chromophor 1 bis 99 Chromophoren umfasst.
32. Struktur nach Anspruch 27, außerdem umfassend mindestens einen fluoreszierenden Akzeptor-Chromophor, die durch Linkerarme an eines vom ersten Polynukleotid und vom zweiten Polynukleotid funktionsfähig geknüpft ist, wobei das mindestens eine fluoreszierende Akzeptor-Chromophor durch die Linkerarme in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz von mindestens einem der Donor-Chromophoren positioniert ist.
33. Struktur nach Anspruch 32, wobei die Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz 0,1 bis 1,7 nm beträgt.
34. Struktur nach Anspruch 32, wobei der fluoreszierende Akzeptor-Chromophor gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pyren, Lucifergelb, Acridin, Riboflavin, Fluorescein, Rhodamin, Sulforhodamin 101 und IR 144.
35. Struktur nach Anspruch 27, wobei mindestens eines vom ersten Polynukleotid und vom zweiten Polynukleotid an einen festen Träger geknüpft ist.
36. Struktur nach Anspruch 35, wobei der feste Träger gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glas, Metallen, Silicium, organischen Polymeren, Membranen und Biopolymeren.
37. Elektronische Vorrichtung, umfassend: ein erweitertes Energie-Übertragungssystem, umfassend ein Polynukleotid mit einem endständigen Donor-Chromophor, mindestens einem intermediären Donor-Chromophor, der vom endständigen Donor-Chromophor in einer Donor- Donor-Übertragungsdistanz beabstandet ist, und mindestens einem Akzeptor- Chromophor, der vom intermediären Donor-Chromophor in einer Donor- Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist, und die an die Polynukleotid- Linkerarme geknüpft sind, wobei die Distanz zwischen der endständigen Donor- Chromophor und einem Akzeptor-Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor vorhanden ist; und wobei das Polynukleotid an einen festen Träger geknüpft ist.
38. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 37, wobei der feste Träger gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glas, Metallen, Silicium, organischen Polymeren, Membranen und Biopolymeren.
39. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 37, wobei die Vorrichtung ein Photonenenergiesammler ist.
40. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 37, wobei die Vorrichtung ein Lichtverstärker ist.
41. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 37, wobei die Vorrichtung eine Energieübertragungsleitung ist.
42. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 37, wobei der feste Träger zur Bereitstellung einer komplementären Funktion angepasst ist.
43. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Funktion im Spenden von Energie an das erweiterte Energieübertragungssystem besteht.
44. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Funktion im Nachweis ausgestrahlter Photonenenergie besteht.
45. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Funktion im Empfangen ausgestrahler Photonenenergie besteht.
46. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Funktion im Umwandeln ausgestrahler Photonenenergie besteht.
41, Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Funktion im Übertragen ausgestrahler Photonenenergie auf einen zweiten Schaltkreis besteht.
48. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Funktion im Übersetzen ausgestrahler Photonenenergie besteht.
49. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 47, wobei der zweite Schaltkreis ein Photosensor ist.
50. Elektronische Vorrichtung nach Anspruch 47, wobei der zweite Schaltkreis eine photovoltaische Zelle ist.
51. Erweitertes Photonenenergie-Übertragungssystem, das zur Kommunikation mit einem elektronischen Schaltkreis fähig ist, welches Übertragungssystem umfasst:
ein Polynukleotid mit einem endständigen Donor-Chromophor, mindestens einem intermediären Donor-Chromophor, der vom endständigen Donor- Chromophor in einer Donor-Donor-Übertragungsdistanz beabstandet ist, und mindestens einem Akzeptor-Chromophor, der vom intermediären Donor- Chromophor in einer Donor-Akzeptor-Übertragungsdistanz beabstandet ist und die an das Polynukleotid durch Linkerarme geknüpft sind;
wobei die Distanz zwischen dem endständigen Donor-Chromophor und einem Akzeptor-Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor vorhanden ist; und
wobei mindestens ein solcher Chromophor zur Umwandlung von Elektronenenergie zu Photonenenergie angepasst ist.
52. Übertragungssystem nach Anspruch 51, wobei der zur Umwandlung von Elektronenenergie zu Photonenenergie angepasste Chromophor gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus lumineszierenden Verbindungen, Ruthenium- Komplexen und photovoltaischen Zellen.
53. Erweitertes Photonenenergie-Übertragungssystem, das zur Kommunikation mit einem elektronischen Schaltkreis fähig ist, wobei das Übertragungssystem umfasst:
ein Polynukleotid mit einem endständigen Donor-Chromophor, mindestens einem intermediären Donor-Chromophor und mindestens einem Akzeptor- Chromophor, die an das Polynukleotid durch Linkerarme geknüpft sind;
wobei die Distanz zwischem dem endständigen Donor-Chromophor und dem Akzeptor-Chromophor größer als 5 nm ist und mindestens ein solcher intermediärer Donor-Chromophor vorhanden ist; und
wobei mindestens ein solcher Chromophor zur Umwandlung von Photonenenergie zu Elektronenenergie angepasst ist.
54. Übertragungssystem nach Anspruch 53, wobei der zur Umwandlung von Photonenenergie zu Elektronenenergie angepasste Chromophor gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus lumineszierenden Verbindungen, Ruthenium- Komplexen und photovoltaischen Zellen.
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