JP2777678B2

JP2777678B2 - 組換ヒト肝実質細胞増殖因子及びその製造方法

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Publication number: JP2777678B2
Application number: JP3163485A
Authority: JP
Inventors: 敏一中村; 道雄萩屋; 達也関; 学下西; 伸清水; 泉猪原; 磨理子坂口; 修浅見
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1991-06-06
Publication date: 1998-07-23
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: JPH05111383A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は肝実質細胞増殖活性を有
するポリペプチド、さらに詳しくは、生体外（in vitr
o）で肝実質細胞の維持、増殖を可能にする生理活性を
有するポリペプチドをコードする塩基配列を発現し得る
組換発現ベクター、形質転換体、および該ポリペプチド
の製造法に関するものである。本発明により製造された
ポリペプチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生促進剤、肝
機能の基礎的研究、肝実質細胞に対する各種ホルモンや
薬剤の作用の研究、肝癌の発癌研究用、さらに該ポリペ
プチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬、肝疾患治療
薬などへの利用が期待できる。

【０００２】

【従来技術】従来、細胞増殖活性を有するポリペプチド
として、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、血小板
由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｅ
ＣＧＦ）などが知られている。これらの増殖因子の他
に、生体外において肝実質細胞増殖活性を有するポリペ
プチドが１９８４年に中村らによって再生肝ラット血清
より部分精製され、肝実質細胞増殖因子（以下ＨＧＦと
略す）と命名された。

【０００３】このＨＧＦの発見まで肝実質細胞は各種の
株化細胞が活発に増殖する哺乳動物血清存在下でも該細
胞の増殖が全く認められず、通常約１週間で培養容器壁
からの脱落が起こり、生体外での長期培養は不可能であ
った。ところがこのＨＧＦの存在下において肝細胞は極
めて良好に増殖し、該細胞の培養が可能となった（Bioc
hem, Biophys. Res. Commun.,122, 1450, 1984)。他の
研究者によってもこのＨＧＦ活性は、肝部分切除手術後
の血中、劇症肝炎患者の血中にも存在することが確認さ
れた。

【０００４】このような状況の下で、本発明者らは、先
にラット血小板からＨＧＦを分離精製して研究を重ね、
このラット血小板由来のＨＧＦが２種のサブユニットか
らなることを見出し、かつＨＧＦに含有される一部のア
ミノ酸配列２７残基の同定に成功した（特願昭６３−３
１１８６６号明細書）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】生体内ＨＧＦは、肝組
織あるいは血小板などから極微量分泌されるポリペプチ
ドであるため、原材料組織の入手の困難さにより、安定
供給することはほとんど不可能に近い。特に、ヒトＨＧ
Ｆにおいては現在までに唯一活性が確認されているのは
劇症肝炎患者血清中のみである。このヒトＨＧＦを肝実
質細胞の培養や肝細胞の研究用、ひいては肝疾患治療薬
として利用するためには、ヒトＨＧＦと同様な活性を有
するポリペプチドを遺伝子組換技術を応用して大量に供
給することが望まれる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ラット血小板由来Ｈ
ＧＦのアミノ配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチ
ドをプローブとしてラット肝臓ｍＲＮＡより調製したｃ
ＤＮＡライブラリーよりラットＨＧＦポリペプチドをコ
ードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを
見出した。さらにラット由来の該ｃＤＮＡをプローブと
してヒト肝臓ｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡライブラ
リーよりヒトＨＧＦポリペプチドをコードする塩基配列
を含有するｃＤＮＡが得られることを見出した。(Natur
e, 342, 440, 1989 ）。

【０００７】さらにヒト肝臓由来の該ｃＤＮＡの一部ま
たは全部をプローブとして肝臓を除いた種々のヒト組織
由来のｍＲＮＡとのノザーンハイブリダイゼイションを
行ったところ、胎盤及び白血球ｍＲＮＡにもＨＧＦ様転
写産物の存在が認められることを見出した。本発明者ら
は、このうち白血球由来のｍＲＮＡから作製したｃＤＮ
Ａライブラリーより、ヒトＨＧＦをコードする塩基配列
を含有するｃＤＮＡを単離しその塩基配列を明らかに
し、さらに該ｃＤＮＡを含有する組換発現ベクターを作
製し、該組換発現ベクターによって形質転換された形質
転換体を得、該形質転換体を培養してヒト白血球由来Ｈ
ＧＦ遺伝子が発現することを見出し本発明を完成させる
に至った。

【０００８】即ち、本発明はヒト白血球由来肝実質細胞
増殖因子をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを発現
しうる組換発現ベクター、該組換発現ベクターで形質転
換された形質転換体、該形質転換体を培養し、該培養物
から組換ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子を採取、製
造する方法及び組換ヒト白血球由来肝実質細胞増殖因子
に関するものである。

【０００９】本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコード
するＤＮＡ組換発現ベクター、及び形質転換体は例えば
次のようにして調製される。即ち、（１）ヒトの白血球
よりｍＲＮＡを単離し、常法に従ってｃＤＮＡライブラ
リーを作製し、（２）すでに単離されているヒト肝臓由
来ＨＧＦｃＤＮＡの全部または一部をプローブとして上
記ヒト白血球由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グを行い、単離されたクローンより目的とするｃＤＮＡ
を抽出する。（３）このヒト白血球由来ＨＧＦのｃＤＮ
ＡよりヒトＨＧＦをコードするｃＤＮＡ断片を制限酵素
を用いて切り出し発現用ベクターに組み込み、（４）得
られた組換発現ベクターにより宿主細胞を形質転換して
形質転換体を得、（５）この形質転換体を培養して、そ
の培養上清からヒト白血球ＨＧＦを採取、製造すること
ができる。

【００１０】以下、本発明の各工程について詳細に説明
する。１）ｍＲＮＡの単離とノーザンハイブリダイゼーションヒト白血球のｍＲＮＡは常法に従って得ることができ
る。例えば、Biochemistry, 18, 5294 (1979) に記載さ
れているJ.M. Chirgvin らの方法によって、ヒトの白血
球のグアニジンチオシアン酸溶液から得たＲＮＡをさら
にオリゴｄＴセルロースカラムを用いる液体クロマトグ
ラフィーに、またはオリゴｄＴラテックスに付すことに
よって該ｍＲＮＡを調製することが可能である。また、
ヒト白血球ｍＲＮＡは市販品としてクロンテック社など
から購入して利用することもできる。このようにして得
られたｍＲＮＡとヒト肝臓由来のＨＧＦをコードするｃ
ＤＮＡとのノーザンハイブリダイゼイションは、例えば
Molecular cloning : ALaboratory Manual, Cold Sprin
g Harbor Laboratory, New York, 202 (1982)に記載さ
れているManiatisらの方法によって行うことができる。
プローブとしてはヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡの全部又
は一部を³²Ｐ標識して使用することができる。

【００１１】２）ｃＤＮＡの調製上記によりＨＧＦ転写産物の存在が確認されたヒト白血
球ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例えば
H. Okayama らの方法（Mol. Cell.Biol.,2, 161, 1982
及びMol. Cell. Biol., 3, 280, 1983) あるいはU.Gub
ler らの方法（Gene, 25, 263, 1983)に従ってｃＤＮＡ
を合成し、このｃＤＮＡをプラスミドやファージに組み
込むことによりｃＤＮＡライブラリーを調製することが
できる。ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクターとして
は、大腸菌由来のｐＢＲ３２２（東洋紡績）、ｐＵＣ１
８及びｐＵＣ１９（東洋紡績）、枯草菌由来のｐＵＢ１
１０（シグマ社）などがある。これらのベクターは、宿
主細胞内に保存されていて複製、増幅されるものであれ
ば、ここに例示したものに限定されるものではない。ｍ
ＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡをプラスミドま
たはファージに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを調製
する方法として、T. Maniatis らの方法(Molecular Clo
ning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo
ratory, NewYork, 239, 1982)またはT.V. Hyunhらの方
法（DNA Cloning:A Practical Approach, 1, 49, 1985)
を各々例示することができる。また、ｍＲＮＡと同様に
ヒト白血球のｃＤＮＡライブラリーを市販品としてクロ
ンテック社などから購入して使うことも可能である。

【００１２】３）ｃＤＮＡライブラリースクリーニングｃＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやファ
ージなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な
宿主細胞に保持される。宿主となりうる大腸菌として
は、例えばEscherichia coli NM514, C600( ストラタジ
ーン社）、NM522,JM101（ファルマシア社）などを例示
することができる。ｃＤＮＡのベクターがプラスミドの
場合、塩化カルシウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジ
ウム法などを用いて、またｃＤＮＡのベクターがファー
ジの場合、インビトロパッケージング法などを用いてあ
らかじめ増殖させた宿主細胞に保持させることができる
（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborator
y,New York, 249, 1982)。このようにして得られた形質
転換体から、ヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡを³²Ｐ標識し
たプローブを使用してコロニーハイブリダイゼーション
法(Gene,10, 63,1980) 、プラークハイブリダイゼーシ
ョン法(Science, 196, 180, 1977) などによってｃＤＮ
Ａクローンを釣り上げることができる。また、目的とす
るポリペプチドに対する抗体を用いて、標識抗体法(DNA
Cloning : A Practical Approach,1, 49, 1985)によっ
て、ｃＤＮＡをクローニングすることも可能である。

【００１３】次に該形質転換体から常法(Molecular Clo
ning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Labor
atory, New York, 1982) に従ってプラスミドやファー
ジなどの組換ＤＮＡを単離し、そのままあるいは制限酵
素で消化してからｃＤＮＡ塩基配列が決定される。塩基
配列はマクサムとギルバートの化学法(Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA., 74, 560, 1977)やサンガーのジデオキシ
法(Proc. Natl. Acad.Sci. USA., 74, 5463,1977) など
によって決定される。記述のｍＲＮＡと塩基配列の決定
されたｃＤＮＡの一部あるいはｃＤＮＡの一部の合成Ｄ
ＮＡをプライマーにして、プライマーエクステンション
法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,76, 731, 1979 ）に
よって新たにｃＤＮＡを合成し、上記と同様にしてｃＤ
ＮＡライブラリーから第１のｃＤＮＡに連絡した第２の
ｃＤＮＡを含有するプラスミドやファージなどの組換Ｄ
ＮＡをクローニングすることが可能である。このプライ
マーエクステンションとクローニングの工程は、必要に
より複数回繰り返される。

【００１４】４）ヒトＨＧＦ組換発現ベクターの構築クローン化されたヒト白血球ＨＧＦのアミノ酸配列の全
部あるいはその一部をコードするｃＤＮＡを含有する数
種のプラスミドやファージなどの組換ベクターから制限
酵素によってｃＤＮＡを切り出し、ヒト白血球由来ＨＧ
Ｆの発現に適したベクターのプロモーターの下流に制限
酵素とＤＮＡリガーゼを用いて再結合して組換発現ベク
ターを作製することができる。より詳しくは、ヒト白血
球由来ＨＧＦを効率良く発現させるために組換発現ベク
ターは転写の下流方向に順番に必要により (1)プロモー
ター、 (2)リボゾーム結合部位、 (3)開始コドン、 (4)
ヒト白血球由来ＨＧＦをコードする塩基配列を含有する
ＤＮＡ、(5) 終止コドン、(6) ターミネーターを含むよ
うに構築される。本発明で用いることができるＤＮＡの
ベクターとして大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２、
ｐＵＣ１８（東洋紡績）、枯草菌由来のプラスミドｐＵ
Ｂ１１０（シグマ社）、酵母由来のプラスミドｐＲＢ１
５（ATCC 37062) 、バクテリオファージλｇｔ１０、λ
ｇｔ１１（ストラタジーン社）、ウィルスＳＶ４０（Ｂ
ＲＬ社）、ＢＰＶ（ATCC VR-703)、レトロウィルスの遺
伝子由来のベクターなどが列挙出来るが、宿主内で複
製、増幅可能なベクターであれば特に限定はない。特
に、ヒト白血球由来ＨＧＦを簡便に発現させるには、Ｓ
Ｖ４０のようなウィルスの遺伝子由来のベクターを用い
るのが好ましい。例えば、前述のクローン化されたヒト
白血球由来ＨＧＦをコードするＤＮＡをＳＶ４０ベクタ
ーの後期領域に結合した組換発現ベクターは、ＣＯＳ細
胞（Cell, 23, 175, 1981)と呼ばれるサル細胞株に導入
して発現させることが可能である。プロモーター及びタ
ーミネーターに関しても、目的とするヒト白血球由来Ｈ
ＧＦをコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対
応したものであれば特に限定はない。例えば、プロモー
ターとして宿主が大腸菌である場合、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーターなどを、宿主が枯草菌である場
合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなど
を、宿主が酵母である場合、ＧＡＰプロモーター、ＰＧ
Ｋプロモーターなどを、宿主がマウス線維芽細胞やチャ
イニーズハムスター卵巣細胞のような動物細胞の場合、
ウィルス由来のＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ１ＴＫプ
ロモーターなどを例示することができる。また、ターミ
ネーターとしては、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐターミ
ネーター、ｌｐｐターミネーターなどを、宿主が枯草菌
の場合amy F ターミネーターなどを、宿主が酵母の場合
ＣＹＣ１ターミネーターなどを、宿主が動物細胞の場
合、ＳＶ４０ターミネーター、ＨＳＶ１ＴＫターミネー
ターなどを例示することができる。これらのプロモータ
ーとターミネーターは用いる宿主に応じて適切に組み合
わされる。本発明においてヒト白血球由来ＨＧＦをコー
ドする塩基配列を含有するＤＮＡは、そのＤＮＡが発現
されるポリペプチドが、肝実質細胞増殖活性を有するな
らば特に制限はなく、例えば後述する配列表・配列番号
１に示した塩基配列が例示され、さらには上記塩基配列
の一部が置換、欠損、挿入、あるいはこれらが組み合わ
された塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。ヒト白
血球由来ＨＧＦをコードする塩基配列を含有する該ＤＮ
Ａの翻訳開始コドンとしてＡＴＧ、翻訳終止コドンとし
てＴＡＡ、ＴＧＡ、あるいはＴＡＧを有してもよい。ま
た、必要に応じて開始コドン、あるいは終止コドンを１
つ以上組み合わせたり、他のコドンと組み合わせて配列
してもよく、これらに特に限定はない。さらにこの組換
発現ベクターで形質転換した宿主の選択マーカーとなり
得るアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝
子、ＤＨＦＲ遺伝子など１種または２種以上が該ベクタ
ーの適切な位置に含有されていることが好ましい。

【００１５】５）宿主細胞の形質転換とその培養このようにして構築されたヒトＨＧＦ白血球組換発現ベ
クターは、コンピテント細胞法（J. Mol. Biol., 53, 1
54, 1970）、プロトプラスト法（Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA, 75, 1929, 1978) リン酸カルシウム法（Scienc
e, 221, 551, 1983)ＤＥＡＥデキストラン法（Science,
215, 166, 1983)、電気パルス法（Proc. Natl. Acad.
USA, 81, 7161,1984) 、インビトロパッケージング法
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975) 、ウ
イルスベクター法（Cell, 37, 1053, 1984) 、またはマ
イクロインジェクション法（Exp. Cell. Res., 153, 34
7, 1984)などによって宿主に導入され、形質転換体が作
製される。このとき、宿主として既述の大腸菌の他に枯
草菌、酵母、動物細胞などが用いられる。特にマウス線
維芽細胞Ｃ１２７（J. Virol.,26, 291, 1978) やチャ
イニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 77, 1929, 1978) などの哺乳動物由来の
宿主細胞を用いるのが好適である。得られた形質転換体
は、目的とする組換ヒト白血球ＨＧＦを産生させるため
にその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培地中
には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機
物、ビタミン、血清および薬剤などが含有される。培地
の１例としては、形質転換体の宿主が大腸菌の場合、Ｌ
Ｂ培地（日水製薬）Ｍ９培地(J. Exp. Mol. Genet., Co
ld Spring Harbor Laboratory, New York, 1972, p.43
1) などを、宿主が酵母の場合、ＹＥＰＤ培地（Genetic
Engineering,vol. 1, Plenum Press, New York, 1979,
p.117) などを、宿主が動物細胞の場合、２０％以下の
ウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）などを挙げることがで
きる。形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、pHは
５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行わ
れる。また、宿主が接着性の動物細胞などの場合は、ガ
ラスビーズ、コラーゲンビーズ、あるいはアセチルセル
ロースフォローファイバーなどの担体が用いられる。こ
れら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体
が生育すれば実施でき、これらに限定されるものではな
い。

【００１６】６）ヒトＨＧＦの精製このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換
体中に生成した組換ヒト白血球ＨＧＦは、公知の塩析
法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動
法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換ク
ロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティ
クロマトグラフィなどを組み合わせて分離精製すること
ができる。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−
セファロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファ
ロースアフィニテイクロマトグラフィおよびフェニルセ
ファロース逆相クロマトグラフィの組み合わせ、あるい
は硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイ
オンクロマトグラフィ、および抗ＨＧＦ抗体セファロー
スアフィニティクロマトクラフィの組み合わせなどが好
ましく有効な精製法である。以上に述べた方法によって
得られた組換ヒト白血球由来ＨＧＦは、ラット肝、ラッ
ト血小板及び組換ヒト肝由来ＨＧＦと同様にラット肝実
質細胞の増殖を顕著に促進する活性を示した。

【００１７】７）ＨＧＦ活性の測定ＨＧＦ活性は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7229
(1983) に記載の方法に準じて次のように測定した。ウ
イスター系ラットからコラーゲナーゼ還流法によって肝
実質細胞を分離精製した。得られたラット肝実質細胞を
５％ウシ血清、２×１０^-9Ｍインスリンおよび２×１０
^-9Ｍデキサメサゾンを添加したウイリアムスＥ培地（フ
ローラボラトリー社）に懸濁し、２４ウエルマルチプレ
ートに1.２５×１０⁵個／ウエルの濃度で播いた。５％
ＣＯ₂および３０％Ｏ₂および６５％Ｎ₂の存在下、３
７℃で２０時間培養後、０．１μｇ／mlのアプロチニン
を添加したウイリアムスＥ培地に交換すると同時に所定
量の被験試料を添加した。１５時間後、１５μＣｉ／ml
の¹²⁵Ｉデオキシウリジン１０μｌ／ウエルを添加し
た。コントロール群には、¹²⁵Ｉデオキシウリジン添加
の１５分前に５μｇ／mlのアフィディコリンを添加し
た。さらに４時間培養して¹²⁵Ｉでラベルした。細胞を
pH７．４のＰＢＳで２回洗浄後、冷１０％トリクロロ酢
酸水溶液（ＴＣＡ）で固定した。細胞を１ウエル当たり
０．５mlの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し、そ
の放射能をガンマカウンターにより測定した。また放射
能測定後の試料の１部をとってローリー法（J. Biol. C
hem., 193, 265, 1951) に従い蛋白量を測定した。被験
試料を添加したとき肝実質細胞に取り込まれた¹²⁵Ｉの
量をコントロールとのカウントの差として求め、これを
ラット肝実質細胞蛋白質１mg当たりに換算して、ＤＮＡ
合成活性（ｄｐｍ／ｍｇ蛋白質）とした。被験試料のＨ
ＧＦ活性は同一試験において上皮細胞成長因子（ＥＧ
Ｆ）１０ｎｇ／mlを用いた時の肝実質細胞のＤＮＡ合成
活性の５０％に相当する活性を１単位と定義して表示し
た。

【００１８】

【発明の効果】本発明により肝実質細胞の生体外での増
殖を可能とする新規な生理活性ペプチドの大量供給が可
能となる。本発明により供給される組換ヒト白血球由来
ＨＧＦは、臨床診断試薬や肝疾患治療薬として有用であ
る。さらに、本発明によりつくられる組換ヒト白血球由
来ＨＧＦの作用により増殖維持される肝実質細胞は、例
えば肝機能の基礎的研究用肝実質細胞に対する各種ホル
モンや薬剤の作用の研究用、肝癌の発癌研究用あるいは
肝炎ウィルスの生体外培養のための宿主細胞として極め
て有用である。

【００１９】

【実施例】以下本発明を実施例によりさらに詳しく説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００２０】実施例１１）ヒト組織ｍＲＮＡとヒト肝由来ＨＧＦｃＤＮＡのノ
ーザンハイブリダイゼーションヒト脳、胎盤、白血球、肺、及び肝臓ｍＲＮＡ（クロン
テック社）それぞれ２μｇを Maniatis らの方法（Mole
cular Cloning : A Laboratory Manual, ColdSpring Ha
rbor Laboratory, New York, 202, 1982)に準じて０．
６６Ｍホルムアルデヒド含有アガロース電気泳動に供し
た後、ナイロンフィルター・ジーンスクリーンプラス
（デュポン社）上に固定した。ヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤ
ＮＡのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ２．２ｋｂ断片をアガロ
ース電気泳動により分離、精製し、マルチプライムＤＮ
Ａ標識システム（アマシャム社）を用いて〔α³²Ｐ〕ｄ
ＣＴＰで標識することにより調製したプローブ、５×Ｓ
ＳＰＥ緩衝液（１×ＳＳＰＥ：１８０ｍＭＮａＣｌ
１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
６．８）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫
酸、４０％ホルムアルデヒド、０．１％ＳＤＳ、０．１
mg／ml大腸菌ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶
液に上記ナイロンフィルターを浸し、４２℃で１６時間
ハイブリダイゼーション反応した。反応後、ナイロンフ
ィルターは６０℃で０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ緩
衝液によって３回洗浄してから風乾した。このナイロン
フィルターを増感スクリーン・ライトニングプラス（デ
ュポン社）とＸ線フィルム、ＲＸ（富士写真フィルム）
に密着させ、−８０℃で１６時間露光した。現像の結
果、肝臓ｍＲＮＡと同様に胎盤及び白血球ｍＲＮＡにも
ＨＧＦ様転写産物の存在が認められた。

【００２１】２）ヒト白血球由来のｃＤＮＡライブラリ
ーの作製ヒト白血球ｍＲＮＡ３μｇを鋳型にし、ヒト肝臓由来Ｈ
ＧＦｃＤＮＡの３’非翻訳領域に含有する^5'ＡＣＡＴＴ
ＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴ^3'の塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｃＤＮＡ合成
システムプラス（アマシャム社）を用いてGublerらの方
法（Gene, 25, 263, 1983)に準じてｃＤＮＡを合成し
た。ｃＤＮＡはフェノール／クロロホルム（１：１、Ｖ
／Ｖ）抽出とエタノール沈澱によって精製した後、０．
５ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ＳＴＥ緩衝液と略す）に溶解し、０．
７μｇ／２０μｌとした。このｃＤＮＡをｃＤＮＡクロ
ーニングシステムλｇｔ１０（アマシャム社）を用いて
Huynh らの方法（ＤＮＡ Cloning I, APractical Appro
ach, 1, 49, 1982) に準じ、次のようにλｇｔ１０の
ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いてｃＤＮＡの両末端にＥｃｏＲＩアダプターを
付加した。ＳＴＥ緩衝液で平衡化したｃＤＮＡ精製用ゲ
ル濾過カラムに反応液をアプライし、同緩衝液で溶出し
てｃＤＮＡ画分５００μｌを集めた。常法によってエタ
ノール沈澱を２回繰り返した後、減圧乾燥してリンカー
付加ｃＤＮＡを得た。再びＳＴＥ緩衝液に５０ｎｇ／μ
ｌの濃度で溶解したのち、あらかじめ準備されたλｇｔ
１０アーム１μｇにアダプター付加ｃＤＮＡ０．１μｇ
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。この反応液は
冷エタノール処理した後、軽く乾燥して得られた組換Ｄ
ＮＡの全量を５μｌの１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５（ＴＥ緩衝液と略す）に溶
解した。この組換ＤＮＡをインビトロパッケージング反
応に供し、λｇｔ１０組換ファージを得た。ファージプ
レーティング用大腸菌を用いたタイトレーションにより
測定したｃＤＮＡ１μｇから得られた組換ファージ数は
５．０×１０⁶個であった。このようにして作製したｃ
ＤＮＡライブラリーは使用するまで少量のクロロホルム
を加えたＳＥ緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ, １０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄,０．０１％ゼラチン含有２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液、ｐＨ７．５）中、４℃で保存した。

【００２２】３）ヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子ｃＤＮＡ
の単離と塩基配列の決定マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を
用いて〔α³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したヒト肝臓由来ＨＧ
ＦｃＤＮＡの一部であるＨＡＣ６９の０．２ｋｂＥｃ
ｏＲＩ断片をプローブとし、上記ｃＤＮＡライブラリー
からヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子のクローニングを行っ
た。ハイブリダイゼーション反応温度及び洗浄温度を６
０℃、洗浄液は０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液
とし、スクリーニングを行い、陽性クローンＨＬＣ２及
びＨＬＣ３を得た。それぞれのファージから常法により
単離、精製したＨＬＣ２及びＨＬＣ３ｃＤＮＡを塩基配
列解析及び制限酵素切断解析に供した。図１にＨＬＣ３
の制限酵素地図、配列表・配列番号１に塩基配列の一部
及び演繹されるアミノ酸配列を示す。ヒト白血球由来Ｈ
ＧＦクローン、ＨＬＣ３は以前に決定されたヒト肝臓由
来ＨＧＦ（Nature, 342, 440, 1989) と同様の特徴を有
しているが、コード領域内の塩基配列に３８ヶ所差異が
あり、その結果演繹されるアミノ酸配列に１４ヶ所の差
異を生じた。また、ＨＬＣ２ｃＤＮＡはＨＬＣ３ｃＤＮ
Ａとほぼ同一の塩基配列を有しているが、ＨＬＣ３ｃＤ
ＮＡの４８４番目から４９８番目までの塩基が欠失して
いた（配列表・配列番号２）。

【００２３】４）サルＣＯＳ細胞用ヒト白血球由来ＨＧ
Ｆ発現ベクターの構築サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターＣＤＭ〔ｄＬ
ｅＨＧＦ〕およびＣＤＭ〔ＬｅＨＧＦ〕の構築図を図２
に示す。上記３）で得られたＨＬＣ２及びＨＬＣ３ファ
ージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化し、
２．２ｋｂのＤＮＡ断片を分離、精製した。ＨＬＣ２及
びＨＬＣ３のＫｐｎＩ切断部位、その３’側に含有する
配列及びＨｐａＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ切断部位から成
るオリゴヌクレオチド^5'ＣＡＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧ
ＴＴＡＡＣＣＣＧＧＧ^3'、^5'ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴ
ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＡＣ^3'を合成
し、ＫｐｎＩ−ＳａｌＩアダプターとした。上記ＨＬＣ
２及びＨＬＣ３のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片、
ＫｐｎＩ−ＳａｌＩアダプター及びあらかじめ制限酵素
ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したブルースクリプトＫＳ
Ｍ１３＋（ストラタジーン社）を混合し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで結合して２種類のプラスミドｐＢＳ〔ｄＬｅＨ
ＧＦ〕及びｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕を得た。得られたｐＢ
Ｓ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕を制限酵
素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼで平滑末端とした後、あらかじめ制限酵素ＢｓｔＸＩ
で消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端としたＣＯ
Ｓ細胞用発現ベクターＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 19
87) と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してヒト白血
球由来ＨＧＦ発現ベクターＣＤＭ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及び
ＣＤＭ〔ＬｅＨＧＦ〕を得た。

【００２４】５）サルＣＯＳ細胞の形質転換とヒト白血
球由来ＨＧＦ遺伝子の発現得られたＣＤＭ〔ｄＬｅＨＧＦ〕及びＣＤＭ〔ＬｅＨＧ
Ｆ〕プラスミドをエタノール沈澱した後、１０ｍＭＰＢ
Ｓ緩衝液に溶解し、２μｇ／mlに調製した。次に１０％
ウシ胎児血清（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（日水製
薬）中で飽和細胞密度まで増殖させたＣＯＳ−１細胞
（ATCC CRL-1650)を１０ｍＭＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し
た後、トリプシン処理した。同緩衝液で３回洗浄後、細
胞密度２×１０⁷個／mlになるように再び同緩衝液に浮
遊化した。先に調製したプラスミド溶液２５０μｌと細
胞浮遊液２５０μｌを混合し、氷冷下で10分間放置し
た。この氷冷したプラスミド細胞混液高電圧パルス遺伝
子導入装置ＺＡ−1200（ＰＤＳ社）を用いて、印加電圧
４ＫＶ／1cm パルス時間２０ミリ秒の条件下で高電圧パ
ルスをかけた。得られた細胞を上記の培地で希釈し、３
７℃５％ＣＯ₂存在下にて３日間培養した。培養３日目
の培養上清中のＨＧＦ活性を測定したところ、それぞれ
２０単位／ml及び５単位／mlであった。一方、ＨＧＦｃ
ＤＮＡを挿入していない発現ベクターＣＤＭ８を同じ方
法によりＣＯＳ−１細胞に導入して培養したが、その培
養上清中にはＨＧＦ活性を認めなかった。

【００２５】実施例２１）マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベ
クターの構築マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクタ
ーｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７
号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２
８９８号）の構築を図３に示す。実施例１で得られたプ
ラスミドｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕及びｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧ
Ｆ〕をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで消化し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、あらかじ
め制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したＣ１２７細胞用発現ベ
クターｐＢＰＭＴと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合
してヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕
（微工研条寄第２８９７号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨ
ＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号）を得た。得られたヒ
ト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターは、ＭＴ−１プロモー
ターとＳＶ４０初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの
間にヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子を有し、この発現ベク
ターによるマウスＣ１２７細胞の形質転換はウシパピロ
ーマウィルス（ＢＰＶ）により行われる。また、形質転
換された細胞の選択は、トランスポゾンＴｎ５のneo 遺
伝子（Gene, 19,329, 1982)にヘルペスシンプレックス
ウィルスタイプ１のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１Ｔ
Ｋ）遺伝子由来のプロモーターとポリ（Ａ）付加シグナ
ルを連結したneo キメラ遺伝子によって可能となる。

【００２６】２）マウスＣ１２７細胞の形質転換とヒト
ＨＧＦ遺伝子の発現ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨ
ＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号）及びｐＢＰＭＴ〔ｄ
ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号）はWiglerらの
方法(Cell,11, 223, 1977) によりマウスＣ１２７細胞
へ導入した。上記(1) で得られた２９μｇのｐＢＰＭＴ
〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９７号）プラスミド
およびｐＢＰＭＴ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８
９８号）をそれぞれ２４０μｌの０．５Ｍ塩化カルシウ
ムに溶解し、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，２８０ｍＭＮａ
Ｃｌ及び１．５ｍＭリン酸ナトリウムからなる２×ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（pH7.１）、２４０μｌを攪拌しながら加
えた。室温で３０分攪拌を続け、プラスミドとリン酸カ
ルシウムの共沈澱を形成させた。あらかじめ、１０％ウ
シ胎児血清（ギブコ社）及び１０ｍＭグルタミンを添加
したＤＭＥＭ培地（日水製薬）を用いて５×１０⁵個の
Ｃ１２７細胞を５％ＣＯ₂の存在下で３７℃、２４時間
培養した。培地交換した後、プラスミドとリン酸カルシ
ウム共沈澱を加え、室温で２０分間放置した。さらに３
７℃で４時間インキュベートした後、培地を除去し、１
５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加
え、室温で５分間放置した。培地で細胞を洗浄した後、
培地交換し、さらに37℃で２日間インキュベートした。
細胞を１０倍に希釈して１mg／mlのＧ４１８（シグマ
社）を含む同培地を用いて５％ＣＯ₂の存在下で３７
℃、７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞
株から培養上清中のＨＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法
でスクリーニングし、ヒト白血球由来ＨＧＦ高生産株Ｂ
ＰＩ−１４株（ｐＢＰＭＴ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄
第２８９７号））及びＢＰＤ−２７株（ｐＢＰＭＴ〔ｄ
ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９８号））を得た。こ
れらの細胞の培養上清中のＨＧＦ生産能はそれぞれ１２
万単位／ｌ／日、１５万単位／ｌ／日であった。

【００２７】実施例３１）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血球由
来ＨＧＦ発現ベクターの構築チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血球由来Ｈ
ＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研
条寄第２８９９号）及びｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅＨＧＦ〕
（微工研条寄第２９００号）の構築図を図４に示す。実
施例１で得られたプラスミドｐＢＳ〔ＬｅＨＧＦ〕及び
ｐＢＳ〔ｄＬｅＨＧＦ〕をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩと
ＳａｌＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端
とした後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したＣ
ＨＯ細胞用発現ベクターｐＥＶＳＳＶと混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合してヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベク
ターｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９
９号）及びｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄
第２９００号）を得た。得られたヒト白血球由来ＨＧＦ
発現ベクターはＳＶ４０初期プロモーターとポリ（Ａ）
付加シグナルの間にヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子を有す
る。また、形質転換された細胞の選択は、マウスジヒド
ロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子にＳＶ４０初期プロ
モーターとポリ（Ａ）付加シグナルで連結したＤＨＦＲ
キメラ遺伝子により可能となる。

【００２８】２）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の
形質転換とヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子の発現ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ〔Ｌｅ
ＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９９号）及びｐＥＶＳＳＶ
〔ｄＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２９００号）は実施例
２と同様にしてチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のＤ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯＤＵＫＸ細胞に導入した。得られた細
胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを
含まず、透析した１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と１
％グルタミンと５０ｎＭメソトレキセートを含むα−Ｍ
ＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて、培養上清
中のＨＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスクリーニン
グした。発生したコロニーは、安定なヒト白血球由来Ｈ
ＧＦ高生産株を得るために、同培地において９世代まで
増殖させた。この細胞株は１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５
００ｎＭ、 750ｎＭ、及び１０００ｎＭとメソトレキセ
ートの濃度を順次増加させながら同培地で生育させ、さ
らに安定なヒト白血球由来ＨＧＦ高産生株ＥＶＩ−６５
株（ｐＥＶＳＳＶ〔ＬｅＨＧＦ〕（微工研条寄第２８９
９号））及びＥＶＤ−１０４株（ｐＥＶＳＳＶ〔ｄＬｅ
ＨＧＦ〕（微工研条寄第２９００号））を得た。これら
の細胞のヒト白血球由来ＨＧＦ産生能はそれぞれ９万単
位／ｌ／日、１３万単位／ｌ／日であった。

【００２９】実施例４形質転換Ｃ１２７細胞培養上清からの組換ヒト白血球由
来ＨＧＦの精製実施例２で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ産生マウスＣ
１２７組換細胞株ＢＰＤ−２７（１５塩基欠失型ＨＧＦ
産生株）の培養上清液より、組換ヒト白血球由来ＨＧＦ
を精製した。１）陽イオン交換クロマトグラフィーＢＰＤ−２７株の培養液５００mlに終濃度０．０１％と
なるようにＴｗｅｅｎ８０を添加し、ステリベクスＨＶ
フィルター（日本ミリポア・リミテッド）により濾過し
た。この濾液に１／２０容の１Ｍ Tris・HCl （ｐＨ8.
５）緩衝液を加え、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Tris ・HCl,１
０ｍＭ Hepes、２ｍＭ CaCl₂、１５０ｍＭ NaCl 、
０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．５）で平衡化した
Ｓ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製、カラムサイ
ズ内径１．６cm、高さ５cm）に添加した。緩衝液Ａで未
吸着物質を洗浄後、０．１５Ｍから１．０ＭのNaClによ
る直線濃度勾配（全量１００ml）で吸着物を溶出した。
クロマトパターンを図５に示す。ＨＧＦ活性をもつ画分
を集め、Ｓ−セファロース溶出液とした。

【００３０】２）アフィニティークロマトグラフィーＳ−セファロース溶出液を１Ｎ酢酸でｐＨ７．５に調整
後、２倍容の０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水で
希釈し、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Tris ・HCl 、0.３Ｍ NaC
l 、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．５）で平衡化
した。ヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシ
ア社製、カラムサイズ内径１cm、高さ３cm）に添加し
た。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、０．３Ｍから２．０Ｍ
のNaClによる直線濃度勾配（全量３０ml）により溶出し
た。そのクロマトパターンを図６に示す。ＨＧＦ活性を
もつ画分を集め、ヘパリン溶出液とした。

【００３１】３）逆相ＨＰＬＣ０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、ｖ／ｖ％）を含む
蒸留水で平衡化したフェニル５ＰＷＲＰカラム（トー
ソー社製、内径０．７５cm、高さ７．５cm）にヘパリン
溶出液を添加し、０．１％ＴＦＡを含む０％から９０％
へのアセトニトリルの濃度勾配により溶出を行った。組
換ヒト白血球由来ＨＧＦは約４０％のアセトニトリル濃
度にて溶出された。そのクロマトグラムを図７に示す。
精製された組換ヒトＨＧＦの収量は約２０μｇであり、
培養上清液からの活性回収率は１８％であった。

【００３２】４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動前記３段のクロマトグラフィーで精製された15塩基欠失
型ヒト組換白血球由来ＨＧＦを２−メルカプトエタノー
ル還元下及び非還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動にかけた。結果を図８に示す。精製組換ＨＧＦは
非還元条件（２−ＭＥ（−））では分子量７万〜９万の
単一バンドを示し、還元条件下（２−ＭＥ（＋））で
は、分子量６万〜７．５万のα鎖と分子量３万〜４万の
β鎖に分かれた。即ち組換ＨＧＦはα鎖とβ鎖からなる
ヘテロダイマーであることが示された。

【００３３】５）組換ヒト白血球由来ＨＧＦ（１５塩基
欠失型）の肝細胞増殖活性ラット初代培養肝実質細胞は、現在知られているin vit
roの系の中では最もinvivo に近い肝機能を持つ系であ
る。「ＨＧＦ活性の測定法」に記述した方法に従って得
たラット肝実質細胞に対し、精製した１５塩基欠失型組
換ヒト白血球由来ＨＧＦを添加したところ、１〜２０ｎ
ｇ／mlの濃度で強い細胞増殖を誘起した。この培養系に
増殖活性を示す因子としては他にもインスリンやＥＧＦ
があるが、該組換ＨＧＦは単独で両者よりも強い活性を
有し、かつこれら３者の共存下では相加的な作用を示し
た。

【００３４】実施例５ヒト白血球由来ＨＧＦ遺伝子によるチャイニーズハムス
ターＣＨＯ細胞の形質転換とその発現ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＳＶ（ｄＬ
ｅＨＧＦ）（微工研条寄第２９００号）はWiglerらの方
法（Cell, 11, 233,1977)によりチャイニーズハムスタ
ーＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ欠損細胞に導入した。約３０μ
ｇのｐＥＶＳＳＶ（ｄＬｅＨＧＦ）プラスミドをそれぞ
れ２４０μｌの０．５Ｍ塩化カルシウムに溶解し、２０
ｍＭＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ塩化ナトリウムおよび
１．５ｍＭリン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．１）、２４０μｌを攪拌しながら加え
た。室温で３０分攪拌を続けプラスミドとリン酸カルシ
ウムの共沈殿を形成させた。続いて、１０％ウシ胎児血
清（ギブコ社）と１％グルタミンとを含むα−ＭＥＭ培
地（フローラボラトリー社）を用いて５×１０⁵個のＣ
ＨＯ細胞を５％ＣＯ₂存在下で３７℃、２４時間培養し
た。培地交換した後プラスミドとリン酸カルシウム共沈
殿を加え室温で２０分間放置した。さらに３７℃で４時
間インキュベートしたのち、培地を除去し、１５％グリ
セリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５
分間放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地交換しさ
らに３７℃で７日間培養して形質転換細胞を得た。得ら
れた細胞株はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シドを含まず、透析した１０％ウシ胎児血清（ギブコ
社）、２％グルタミンを含むα−ＭＥＭ培地（フローラ
ボラトリー社）を用いて安定なＨＧＦ高生産株を得るた
めに１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎ
Ｍ、１μＭ、２μＭとメソトレキセート濃度を順次増加
させながら同培地で継代培養を繰り返した。得られたヒ
ト白血球由来ＨＧＦ産生組換細胞をクローン選別を行
い、安定なヒト白血球由来ＨＧＦ産生株５１５Ｃを得
た。これらの細胞のＨＧＦ産生能は約８０万単位／ｌ／
日であった。

【００３５】実施例６形質転換ＣＨＯ細胞培養上清からの組換ヒト白血球由来
ＨＧＦの精製実施例５で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ産生チャイニ
ーズハムスターＣＨＯ組換細胞株５１５Ｃ（１５塩基欠
失型ＨＧＦ産生株）をリボヌクレオシドとデオキシリボ
ヌクレオシドを含まず、１０％ウシ胎児血清（ギブコ
社）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセートを含む
α−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）で培養し、そ
の培養上清液より、組換ヒト白血球由来ＨＧＦを精製し
た。１）陽イオン交換クロマトグラフィー５１５Ｃ株の培養液５００mlに最終濃度０．０１％とな
るようにTween 80を添加し、ステリベックスＨＶフィル
ター（日本ミリポア・リミテッドにより濾過した。この
濾液に１／２０容の１ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．
５）緩衝液を加え、１５０ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液
Ｃ（５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、０．０１％Tween 8
0、ｐＨ８．５）で平衡化したＳ−セファロースＦＦ
（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１．６cm、高さ
５cm）に添加した。緩衝液Ｃカラムを１５０ｍＭＮａ
Ｃｌを含む緩衝液Ｃおよび４００ｍＭＮａＣｌを含む
緩衝液Ｃ（図９で矢印Ａで印した）で洗浄後１ＭＮａ
Ｃｌを含む緩衝液Ｃ（図９で矢印Ｂで印した）で溶出し
た。クロマトパターンを図９に示す。１ＭＮａＣｌを
含む緩衝液Ｃで溶出したピーク部分（図９で←→と印し
た）を集め、Ｓ−セファロース溶出液とした。

【００３６】２）アフィニティークロマトグラフィーＳ−セファロース溶出液を１Ｎ塩酸でｐＨ７．５に調製
後、２倍容の０．０１％Tween 80を含む蒸留水で希釈
し、緩衝液Ｂ（１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、０．３Ｍ
塩化ナトリウム、０．０１％Tween 80、ｐＨ７．５）で
平衡化した、ヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファ
ルマシア社製、カラムサイズ内径１cm、高さ５cm）に添
加した。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、０．３Ｍから２．
０Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配（全量４０m
l）により吸着物を溶出した。そのクロマトパターンを
図１０に示す。ＨＧＦ活性を持つ画分を集め、ヘパリン
溶出液とした。

【００３７】３）疎水性クロマトグラフィー４ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したフェニル５ＰＷカラム（トーソー製、
内径０．７５cm、高さ７．５cm）にヘパリン溶出液を添
加し、溶媒Ａ：４Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）から溶媒Ｂ：５０％エチレング
リコールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）へ
の濃度勾配により溶出を行った。ＨＧＦ活性は２ＭＮ
ａＣｌ、２５％エチレングリコール濃度で溶出された。
そのクロマトグラムを図１１に示す。精製された組換ヒ
ト白血球由来ＨＧＦの収量は約５００μｇであり、培養
上清液からの活性回収率は２５％であった。

【００３８】４）精製組換ヒト白血球由来ＨＧＦの特性３）項で得られた組換ヒト白血球由来ＨＧＦの生物学
的、化学的および物理化学的特性について測定した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動組換ＨＧＦを２−メルカプトエタノール還元下および非
還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行っ
た。泳動後ゲルは銀染色法により染色したその結果を図
１２に示す。組換ＨＧＦは非還元下で分子量７万〜９万
ダルトン、還元下では分子量６万〜７．５万のα鎖と分
子量３万〜４万のβ鎖に分かれた。またβ鎖は２本のバ
ンドに分かれたが、これはβ鎖における結合糖鎖本数の
差異を示している。

【００３９】糖組成、分析（中性糖およびアミノ糖）精製組換ＨＧＦを蒸発乾固後、２．５Ｎのトリフロロ酢
酸存在下で１１０℃、６時間加水分解した。加水分解物
を蒸発乾固後、水に再溶解し、試料とした。試料をアニ
オン交換樹脂を用いるＨＰＬＣにより糖組成、分析を実
施した。その結果フコース、ガラクトース、マンノー
ス、Ｎ−アセチルグルコサミンが検出され、組換ＨＧＦ
が糖タンパクであることが確認された。

【００４０】生物活性精製組換ＨＧＦの肝細胞増殖活性を「ＨＧＦ活性の測
定」の項に記載の方法に従って活性を測定した。その結
果、精製組換ＨＧＦの比活性は２０〜５０万unit／mgと
測定された。

【００４１】実施例７一本鎖型組換ヒト白血球由来ＨＧＦの製造実施例５で得られたヒト白血球由来ＨＧＦ（１５塩基欠
失型ＨＧＦ）産生ＣＨＯ５１５Ｃ株を１０％ウシ胎児血
清（ギブコ社）と１％グルタミンと２μＭメソトレキセ
ートを添加した。リボヌクレオシドとデオキシヌクレオ
シドを含有しないα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー
社）で、３７℃、５％ＣＯ₂下培養し、細胞をコンフル
エントになるまで培養した。培養後、培養液を抜き取
り、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。次で１％グルタミン
と５００μＭメソトレキセートとプロテアーゼ阻害剤で
ある４００unit／mlアプロチニンを加えたα−ＭＥＭ培
地（リボヌクレオシドとデオキシヌクレオシド不含）を
加え、３７℃、５％ＣＯ₂下培養した。約１日培養後、
培養上清液を採取し、実施例６に示す方法とほぼ同様の
クロマト操作により組換ＨＧＦを精製した。培養上清液
からの活性回収率は約１５％であった。

【００４２】精製した１５塩基欠失型組換ヒト白血球由
来ＨＧＦをＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動にかけた。
その結果を図１３に示す。精製された組換ＨＧＦは非還
元条件下で分子量７万〜９万ダルトンのバンドを示し、
更にメルカプトエタノール還元条件下でも、分子量８万
〜９万５千ダルトンの単一バンドを示した。

【００４３】この結果、得られた組換ＨＧＦは一本鎖型
のものであることが示された。更に精製されたこの一本
鎖型組換ＨＧＦの生物活性を測定した。即ち「ＨＧＦ活
性の測定」の項に記載の初代培養ラット肝細胞に対する
増殖活性を測定した。その結果一本鎖型組換ＨＧＦは肝
細胞増殖活性を示し、その比活性は実施例６の４）の項
で得られた活性とほぼ等しく、２０〜５０万unit／mgで
あると測定された。

【００４４】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：２２１４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ヒト配列の特徴特徴を示す記号：ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１−９３特徴を決定した方法：Ｅ特徴を示す記号：ＣＤＳ存在位置：１−２１８４特徴を決定した方法：Ｅ配列 GGATCCG CCAGCCCGTC CAGCAGCACC -1 ATG TGG GTG ACC AAA CTC CTG CCA GCC CTG CTG CTG CAG CAT GTC CTC 48 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 CTG CAT CTC CTC CTG CTC CCC ATC GCC ATC CCC TAT GCA GAG GGA CAA 96 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 AGG AAA AGA AGA AAT ACA ATT CAT GAA TTC AAA AAA TCA GCA AAG ACT 144 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 ACC CTA ATC AAA ATA GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC AAA AAA GTG 192 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 AAT ACT GCA GAC CAA TGT GCT AAT AGA TGT ACT AGG AAT AAA GGA CTT 240 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 CCA TTC ACT TGC AAG GCT TTT GTT TTT GAT AAA GCA AGA AAA CAA TGC 288 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 CTC TGG TTC CCC TTC AAT AGC ATG TCA AGT GGA GTG AAA AAA GAA TTT 336 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 GGC CAT GAA TTT GAC CTC TAT GAA AAC AAA GAC TAC ATT AGA AAC TGC 384 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 ATC ATT GGT AAA GGA CGC AGC TAC AAG GGA ACA GTA TCT ATC ACT AAG 432 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 AGT GGC ATC AAA TGT CAG CCC TGG AGT TCC ATG ATA CCA CAC GAA CAC 480 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 AGC TTT TTG CCT TCG AGC TAT CGG GGT AAA GAC CTA CAG GAA AAC TAC 528 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 TGT CGA AAT CCT CGA GGG GAA GAA GGG GGA CCC TGG TGT TTC ACA AGC 576 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 AAT CCA GAG GTA CGC TAC GAA GTC TGT GAC ATT CCT CAG TGT TCA GAA 624 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 GTT GAA TGC ATG ACC TGC AAT GGG GAG AGT TAT CGA GGT CTC ATG GAT 672 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 CAT ACA GAA TCA GGC AAG ATT TGT CAG CGC TGG GAT CAT CAG ACA CCA 720 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 CAC CGG CAC AAA TTC TTG CCT GAA AGA TAT CCC GAC AAG GGC TTT GAT 768 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 GAT AAT TAT TGC CGC AAT CCC GAT GGC CAG CCG AGG CCA TGG TGC TAT 816 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 ACT CTT GAC CCT CAC ACC CGC TGG GAG TAC TGT GCA ATT AAA ACA TGC 864 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 GCT GAC AAT ACT ATG AAT GAC ACT GAT GTT CCT TTG GAA ACA ACT GAA 912 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 TGC ATC CAA GGT CAA GGA GAA GGC TAC AGG GGC ACT GTC AAT ACC ATT 960 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 TGG AAT GGA ATT CCA TGT CAG CGT TGG GAT TCT CAG TAT CCT CAC GAG 1008 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 CAT GAC ATG ACT CCT GAA AAT TTC AAG TGC AAG GAC CTA CGA GAA AAT 1056 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 TAC TGC CGA AAT CCA GAT GGG TCT GAA TCA CCC TGG TGT TTT ACC ACT 1104 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 GAT CCA AAC ATC CGA GTT GGC TAC TGC TCC CAA ATT CCA AAC TGT GAT 1152 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 ATG TCA CAT GGA CAA GAT TGT TAT CGT GGG AAT GGC AAA AAT TAT ATG 1200 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 GGC AAC TTA TCC CAA ACA AGA TCT GGA CTA ACA TGT TCA ATG TGG GAC 1248 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 AAG AAC ATG GAA GAC TTA CAT CGT CAT ATC TTC TGG GAA CCA GAT GCA 1296 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 AGT AAG CTG AAT GAG AAT TAC TGC CGA AAT CCA GAT GAT GAT GCT CAT 1344 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 GGA CCC TGG TGC TAC ACG GGA AAT CCA CTC ATT CCT TGG GAT TAT TGC 1392 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 CCT ATT TCT CGT TGT GAA GGT GAT ACC ACA CCT ACA ATA GTC AAT TTA 1440 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 GAC CAT CCC GTA ATA TCT TGT GCC AAA ACG AAA CAA TTG CGA GTT GTA 1488 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 AAT GGG ATT CCA ACA CGA ACA AAC ATA GGA TGG ATG GTT AGT TTG AGA 1536 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 TAC AGA AAT AAA CAT ATC TGC GGA GGA TCA TTG ATA AAG GAG AGT TGG 1584 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 GTT CTT ACT GCA CGA CAG TGT TTC CCT TCT CGA GAC TTG AAA GAT TAT 1632 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 GAA GCT TGG CTT GGA ATT CAT GAT GTC CAC GGA AGA GGA GAT GAG AAA 1680 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 TGC AAA CAG GTT CTC AAT GTT TCC CAG CTG GTA TAT GGC CCT GAA GGA 1728 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 TCA GAT CTG GTT TTA ATG AAG CTT GCC AGG CCT GCT GTC CTG GAT GAT 1776 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 TTT GTT AGT ACG ATT GAT TTA CCT AAT TAT GGA TGC ACA ATT CCT GAA 1824 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 AAG ACC AGT TGC AGT GTT TAT GGC TGG GGC TAC ACT GGA TTG ATC AAC 1872 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 TAT GAT GGC CTA TTA CGA GTG GCA CAT CTC TAT ATA ATG GGA AAT GAG 1920 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 AAA TGC AGC CAG CAT CAT CGA GGG AAG GTG ACT CTG AAT GAG TCT GAA 1968 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 ATA TGT GCT GGG GCT GAA AAG ATT GGA TCA GGA CCA TGT GAG GGG GAT 2016 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 TAT GGT GGC CCA CTT GTT TGT GAG CAA CAT AAA ATG AGA ATG GTT CTT 2064 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 GGT GTC ATT GTT CCT GGT CGT GGA TGT GCC ATT CCA AAT CGT CCT GGT 2112 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 ATT TTT GTC CGA GTA GCA TAT TAT GCA AAA TGG ATA CAC AAA ATT ATT 2160 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 TTA ACA TAT AAG GTA CCA CAG TCA TAG 2187 Lys Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725

【００４５】

【配列表】配列番号：２配列の長さ：２１９９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：c ＤＮＡ起源生物名：ヒト配列の特徴特徴を示す記号：ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１−９３特徴を決定した方法：Ｅ特徴を示す記号：ＣＤＳ存在位置：１−２１６９特徴を決定した方法：Ｅ配列 GGATCCG CCAGCCCGTC CAGCAGCACC -1 ATG TGG GTG ACC AAA CTC CTG CCA GCC CTG CTG CTG CAG CAT GTC CTC 48 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 5 10 15 CTG CAT CTC CTC CTG CTC CCC ATC GCC ATC CCC TAT GCA GAG GGA CAA 96 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 AGG AAA AGA AGA AAT ACA ATT CAT GAA TTC AAA AAA TCA GCA AAG ACT 144 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 ACC CTA ATC AAA ATA GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC AAA AAA GTG 192 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 AAT ACT GCA GAC CAA TGT GCT AAT AGA TGT ACT AGG AAT AAA GGA CTT 240 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 CCA TTC ACT TGC AAG GCT TTT GTT TTT GAT AAA GCA AGA AAA CAA TGC 288 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 CTC TGG TTC CCC TTC AAT AGC ATG TCA AGT GGA GTG AAA AAA GAA TTT 336 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 GGC CAT GAA TTT GAC CTC TAT GAA AAC AAA GAC TAC ATT AGA AAC TGC 384 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 ATC ATT GGT AAA GGA CGC AGC TAC AAG GGA ACA GTA TCT ATC ACT AAG 432 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 AGT GGC ATC AAA TGT CAG CCC TGG AGT TCC ATG ATA CCA CAC GAA CAC 480 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 AGC TAT CGG GGT AAA GAC CTA CAG GAA AAC TAC TGT CGA AAT CCT CGA 528 Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg 165 170 175 GGG GAA GAA GGG GGA CCC TGG TGT TTC ACA AGC AAT CCA GAG GTA CGC 576 Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg 180 185 190 TAC GAA GTC TGT GAC ATT CCT CAG TGT TCA GAA GTT GAA TGC ATG ACC 624 Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr 195 200 205 TGC AAT GGG GAG AGT TAT CGA GGT CTC ATG GAT CAT ACA GAA TCA GGC 672 Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly 210 215 220 AAG ATT TGT CAG CGC TGG GAT CAT CAG ACA CCA CAC CGG CAC AAA TTC 720 Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe 225 230 235 240 TTG CCT GAA AGA TAT CCC GAC AAG GGC TTT GAT GAT AAT TAT TGC CGC 768 Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg 245 250 255 AAT CCC GAT GGC CAG CCG AGG CCA TGG TGC TAT ACT CTT GAC CCT CAC 816 Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His 260 265 270 ACC CGC TGG GAG TAC TGT GCA ATT AAA ACA TGC GCT GAC AAT ACT ATG 864 Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met 275 280 285 AAT GAC ACT GAT GTT CCT TTG GAA ACA ACT GAA TGC ATC CAA GGT CAA 912 Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln 290 295 300 GGA GAA GGC TAC AGG GGC ACT GTC AAT ACC ATT TGG AAT GGA ATT CCA 960 Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro 305 310 315 320 TGT CAG CGT TGG GAT TCT CAG TAT CCT CAC GAG CAT GAC ATG ACT CCT 1008 Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro 325 330 335 GAA AAT TTC AAG TGC AAG GAC CTA CGA GAA AAT TAC TGC CGA AAT CCA 1056 Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 340 345 350 GAT GGG TCT GAA TCA CCC TGG TGT TTT ACC ACT GAT CCA AAC ATC CGA 1104 Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg 355 360 365 GTT GGC TAC TGC TCC CAA ATT CCA AAC TGT GAT ATG TCA CAT GGA CAA 1152 Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln 370 375 380 GAT TGT TAT CGT GGG AAT GGC AAA AAT TAT ATG GGC AAC TTA TCC CAA 1200 Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln 385 390 395 400 ACA AGA TCT GGA CTA ACA TGT TCA ATG TGG GAC AAG AAC ATG GAA GAC 1248 Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp 405 410 415 TTA CAT CGT CAT ATC TTC TGG GAA CCA GAT GCA AGT AAG CTG AAT GAG 1296 Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu 420 425 430 AAT TAC TGC CGA AAT CCA GAT GAT GAT GCT CAT GGA CCC TGG TGC TAC 1344 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr 435 440 445 ACG GGA AAT CCA CTC ATT CCT TGG GAT TAT TGC CCT ATT TCT CGT TGT 1392 Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys 450 455 460 GAA GGT GAT ACC ACA CCT ACA ATA GTC AAT TTA GAC CAT CCC GTA ATA 1440 Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile 465 470 475 480 TCT TGT GCC AAA ACG AAA CAA TTG CGA GTT GTA AAT GGG ATT CCA ACA 1488 Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr 485 490 495 CGA ACA AAC ATA GGA TGG ATG GTT AGT TTG AGA TAC AGA AAT AAA CAT 1536 Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His 500 505 510 ATC TGC GGA GGA TCA TTG ATA AAG GAG AGT TGG GTT CTT ACT GCA CGA 1584 Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg 515 520 525 CAG TGT TTC CCT TCT CGA GAC TTG AAA GAT TAT GAA GCT TGG CTT GGA 1632 Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly 530 535 540 ATT CAT GAT GTC CAC GGA AGA GGA GAT GAG AAA TGC AAA CAG GTT CTC 1680 Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu 545 550 555 560 AAT GTT TCC CAG CTG GTA TAT GGC CCT GAA GGA TCA GAT CTG GTT TTA 1728 Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu 565 570 575 ATG AAG CTT GCC AGG CCT GCT GTC CTG GAT GAT TTT GTT AGT ACG ATT 1776 Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile 580 585 590 GAT TTA CCT AAT TAT GGA TGC ACA ATT CCT GAA AAG ACC AGT TGC AGT 1824 Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser 595 600 605 GTT TAT GGC TGG GGC TAC ACT GGA TTG ATC AAC TAT GAT GGC CTA TTA 1872 Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu 610 615 620 CGA GTG GCA CAT CTC TAT ATA ATG GGA AAT GAG AAA TGC AGC CAG CAT 1920 Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His 625 630 635 640 CAT CGA GGG AAG GTG ACT CTG AAT GAG TCT GAA ATA TGT GCT GGG GCT 1968 His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala 645 650 655 GAA AAG ATT GGA TCA GGA CCA TGT GAG GGG GAT TAT GGT GGC CCA CTT 2016 Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu 660 665 670 GTT TGT GAG CAA CAT AAA ATG AGA ATG GTT CTT GGT GTC ATT GTT CCT 2064 Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro 675 680 685 GGT CGT GGA TGT GCC ATT CCA AAT CGT CCT GGT ATT TTT GTC CGA GTA 2112 Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val 690 695 700 GCA TAT TAT GCA AAA TGG ATA CAC AAA ATT ATT TTA ACA TAT AAG GTA 2160 Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val 705 710 715 720 CCA CAG TCA TAG 2172 Pro Gln Ser

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＬＣ３の制限酵素地図である。

【図２】ＣＯＳ細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発現ベクタ
ーの構築図である。

【図３】マウスＣ１２７細胞用ヒト白血球由来ＨＧＦ発
現ベクターの構築図である。

【図４】チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒト白血
球由来ＨＧＦ発現ベクターの構築図である。

【図５】Ｓ−セファロース溶出液のフラクションと溶出
成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を
示す線図である。

【図６】ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の吸
光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図
である。

【図７】逆相ＨＰＬＣにおいて、通液したアセトニトリ
ル濃度と、溶出した成分の吸光度との関係を示す線図で
ある。

【図８】精製組換ヒトＨＧＦの還元下および非還元下で
のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示
す。

【図９】Ｓ−セファロース溶出液のクロマトパターンを
示す線図である。

【図１０】ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の
吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線
図である。

【図１１】フェニル５ＰＷカラムクロマトグラフィーに
おける溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度および
それらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。

【図１２】精製組換ヒトＨＧＦの還元下および非還元下
でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示
す。

【図１３】精製一本鎖型組換ヒトＨＧＦの還元下および
非還元下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パタ
ーンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者下西学滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者清水伸滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者猪原泉滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者坂口磨理子滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者浅見修愛知県江南市東野塔後８番１号 (56)参考文献ＮＡＴＵＲＥ，1989年，第342巻，Ｐ. 440−443 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程からなる肝実質細胞増殖因
子（ＨＧＦ）の製造方法。（１）配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子と
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を有する組換
発現ベクターで動物細胞を形質転換し、（２）メソトレキセートの濃度を上昇させながら上記形
質転換体を培養して、ＨＧＦ高生産株を選別し、（３）このＨＧＦ産生株を培養し、産生されたＨＧＦを
回収し精製する。
【請求項２】請求項１記載の動物細胞として、ＣＨ
Ｏ細胞を使用することを特徴とするＨＧＦの製造方法。
【請求項３】請求項１記載のＨＧＦ産生株の培養条
件として、プロテアーゼ阻害剤の存在下で培養すること
を特徴とする１本鎖ＨＧＦの製造方法。