JP2553425B2

JP2553425B2 - トロンビン結合性物質及びその製造法

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Publication number: JP2553425B2
Application number: JP3308976A
Authority: JP
Inventors: 武土肥; 昭夫岩崎; 佑之才野; 茂木村; 正夫大口
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1990-11-30
Filing date: 1991-11-25
Publication date: 1996-11-13
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: JPH06279497A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なトロンビン結合
性物質、該トロンビン結合性物質のアミノ酸配列をコー
ドするDNA断片、該DNA断片を含む組換えベクター、該組
換えベクターを保持する形質転換体細胞、該トロンビン
結合性物質を有効成分とする血小板凝集抑制作用を有す
る抗血液凝固剤及び該トロンビン結合性物質の製造法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】血液凝固系の中で、蛋白分解酵素として
のトロンビンの果す役割については種々の研究が行わ
れ、凝固系のメカニズムに関してはほぼ解明されてい
る。

【０００３】生体内において、線溶系及び抗凝固系に作
用するといわれているプロテインＣをトロンビンが活性
化すること、並びにその機構に補酵素的に働く因子がウ
サギ肺組織抽出物中に存在することが報告されており、
この因子はトロンボモジュリンと命名されている〔N.
L. Esmon et al., J. Biol. Chem., 257, (2), 859-864
(1982)〕。

【０００４】また、青木らは、ヒト胎盤より分離した同
様の性質を有する分子量約71,000(非還元状態)のヒト・
トロンボモジュリンを報告している〔Thromb. Res., 3
7, 353-364(1985)〕。

【０００５】また、I. Maruyamaらはヒト胎盤より分離
した分子量約75,000のヒト・トロンボモジュリンと、上
記ウサギ・トロンボモジュリンの活性を比較し、両者の
活性が等しいことを報告している〔J. Clin. Invest.,
75, 987-991(1985)〕。

【０００６】またH. Ishiiらはヒト血漿中及び尿中にト
ロンボモジュリンと同じ活性を有する物質が存在するこ
と、そして血漿中の当該物質の分子量が約63,000と約5
4,000であることを報告している〔J. Clin. Invest., 7
6, 2178-2181(1985)〕。

【０００７】更に、本発明者らは、ヒト尿中に上記物質
とは異なる、分子量の小さい２種のトロンビン結合性物
質（非還元状態の分子量約39,000及び約31,000）を見出
し、特許出願した（特開昭63-146898号公報）。

【０００８】更にまた、本発明者らはヒト尿中及びヒト
組織由来細胞の組織培養液中より上記物質とは異なる２
種のトロンビン結合性物質(A)及び(B)を分離し、先に特
許出願し（ヨーロッパ特許公開第４５５，６８１号）、
またこの尿から得られたトロンビン結合性物質を遺伝子
組換技術を用い、安定かつ大量に製造できる方法を開発
し、特許出願した（特願平３−５４４４６号，ここで得
られた物質をｒ−ＵＴＭという）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】一方、ウサギ肺トロン
ボモジュリンは、アンチトロンビンIIIの活性を増強す
ることが知られている〔K. T. Preissner et al., J. B
iol. Chem., 265, 4915-4922(1990)〕。しかしながら、
このような作用はウシ・トロンボモジュリンにはなく
〔H. V. Jakubowski et al., J. Biol. Chem., 261, 38
76(1986)〕、またヒト胎盤トロンボモジュリンはアンチ
トロンビンIIIの活性を阻害してしまう〔K.Hirahara et
al., Thromb. Res.,57, 117-126(1990)〕。

【００１０】また、遺伝子工学的手法によって生産され
た可溶性トロンボモジュリンは２種類あり、一方にはア
ンチトロンビンIII増強活性があり、他方にはないこと
が知られている〔K. Nawa et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 171, 729-737(1990)〕。しかしながら、
これらのトロンボモジュリンは、血液凝固系の中で重要
な役割をしている血小板に対して、トロンビン凝集を抑
制するが、ADP凝集を抑制しないことが知られている
〔N. L. Esmon, J. Biol. Chem., 258, 12238-12242(19
83)〕。

【００１１】従って、遺伝子工学的手法により、ヒト・
トロンボモジュリンその他のトロンビン結合性物質にア
ンチトロンビンIIIの活性を増強する作用及び血小板凝
集抑制作用を付加することが望まれていた。

【００１２】

【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結
果、ヒト尿由来トロンビン結合性物質をコードするDNA
断片の３′末端に特定のDNA断片を結合させ、得られたD
NA断片を組み込んだ組換えベクターを用いて宿主細胞を
形質転換し、当該DNAを発現させることにより、アンチ
トロンビンIIIの活性の増強作用及び血小板凝集抑制作
用を有するヒト尿由来トロンビン結合性物質を製造でき
ることを見出し、本発明を完成した。

【００１３】すなわち本発明は図１に示すアミノ酸配列
を有するトロンビン結合性物質、該アミノ酸配列をコー
ドし得る塩基配列を有するDNA断片、該DNA断片及び複製
可能なベクターからなる組換えベクター、該組換えベク
ターを保持する形質転換体細胞、上記トロンビン結合性
物質を有効成分とする血小板凝集抑制作用を有する抗血
液凝固剤、及び上記トロンビン結合性物質の製造法を提
供するものである。

【００１４】本発明のトロンビン結合性物質は、例えば
次の如くして製造される。まず、ヒト胎盤ゲノムDNAを
適当な制限酵素で切断し、これを鋳型DNAとする。次い
で既知のヒト・トロンボモジュリン遺伝子の塩基配列
〔Shirai, T. et al.,J. Biochem., 103, 281-285(198
8)〕を参考にして合成したDNAプライマーをプローブと
して、鋳型DNAをスクリーニングする。得られたDNAを適
当な制限酵素で切断し、生成したDNA断片をクローニン
グ用ベクターとライゲーションして、微生物を形質転換
する。得られた形質転換体よりプラスミドDNAを抽出
し、制限酵素処理をすれば、ヒト尿由来のトロンビン結
合性物質をコードする1404塩基を含むDNA断片が得られ
る。このDNA断片に、アミノ酸配列X₁X₂Y₁SerGlySerGlyY
₂をコードし得る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を挿入すれば、本発明DNA断片を含むDNA断片が得られ
る。本発明DNA断片の塩基配列の代表例としては、配列
番号３及び４に示すものが挙げられる。ただし、本発明
DNA断片の塩基配列は、本発明で目的とするトロンビン
結合性物質のペプチドを構成するアミノ酸配列〔図１
（好ましくは配列番号１又は２）〕をコードする能力を
有すれば、上記配列に限定されるものではない。

【００１５】本発明DNA断片を含有する組換えベクター
を構築するには、本発明DNA断片に複製可能な発現ベク
ターを接続すればよい。発現ベクターとしては、複製可
能であれば大腸菌をはじめとする原核生物由来、酵母由
来、昆虫ウィルス由来、脊椎動物ウィルス由来等いずれ
のベクターでもよい。

【００１６】しかし、トロンビン結合性物質を効率よく
生産するためには、転写の下流方向へ順に次の(1)〜(7)
の塩基配列、 (1)プロモーターとして作用する塩基配列 (2)リボソーム結合部位である塩基配列 (3)開始コドンである塩基配列 (4)シグナルペプチドをコードする塩基配列 (5)図１（好ましくは配列番号１又は２）に示すアミノ
酸配列をコードする塩基配列 (6)終止コドンである塩基配列 (7)ポリＡ付加シグナルとして作用する塩基配列を含む発現組換えベクターを構築するのが好ましい。

【００１７】ベクターとして利用するDNAはプラスミド
が好ましい。例えば大腸菌を宿主として増幅可能で、哺
乳動物細胞を形質転換することにより挿入遺伝子の発現
が可能なプラスミドが好ましい。このようなプラスミド
DNAは大腸菌細胞中にてプラスミドが増殖するために必
要な塩基配列、例えばColE1系プラスミドの複製起点の
塩基配列を有し、更に哺乳動物細胞中でプロモーターと
して働く塩基配列、形質転換大腸菌の選択マーカーとな
る遺伝子、形質転換哺乳動物細胞の選択マーカーとなる
遺伝子を含み、更に好ましくは哺乳動物細胞中で機能す
るSV40 ori、ポリオーマori、HSV oriなどの複製起点塩
基配列を含む。プロモーターとしては例えばサイトメガ
ロウィルス、SV40、ポリオーマウィルス、ウシパピロー
マウィルス、アデノウィルスなどのプロモーターやMMTV
などのレトロウィルスのLTR 、メタロチオネイン遺伝子
のプロモーターが挙げられる。大腸菌の選択マーカーと
しては例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐
性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子などが挙げられる。哺乳動物細胞の
選択マーカーとしては例えばネオマイシン耐性遺伝子、
ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝
子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、キサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げら
れ、これらの遺伝子の１種又は２種以上が用いられる。

【００１８】上記ベクターに本発明のDNA断片を組み込
むには、これを含むDNAを適当な制限酵素で切断し、必
要であれば適当なリンカーを付加した後、適当な制限酵
素で切断したベクターと結合させることにより行われ
る。用いられる制限酵素としては、例えばEcoRI、Sph
I、PstI、HindIII、BamHI、XhoI、XbaI、BanIII、Sma
I、NcoIなどが挙げられる。また、エキソヌクレアーゼI
II、Ba131、Slヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼVII、
ムングビーンヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼIなどの核
酸修飾酵素も利用できる。用いられるリンカーとして
は、EcoRIリンカー、SmaIリンカー、NcoIリンカー、Bam
HIリンカー、XhoIリンカー、HindIIIリンカー、PstIリ
ンカー、SphIリンカー、XbaIリンカーなどが利用でき
る。

【００１９】得られた発現用組換えベクターを、コンピ
テント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共
沈法、電気穿孔法、DEAEデキストラン法、リポフェクチ
ン法などを用いて宿主細胞に導入すれば、本発明組換え
ベクター及び／又はトロンビン結合性物質を効率的に生
産する能力を有する形質転換体細胞が得られる。このよ
うな形質転換体細胞を得るための宿主細胞としては、細
菌、酵母のごとき単細胞微生物あるいは培養昆虫細胞、
培養脊椎動物細胞などが好ましい。大腸菌を宿主とした
場合には、E. coli K12株の種々の変異株、例えばHB10
1、C600K、JM101、JM103、JM105、JM109、MV1034、MV11
84、MC1061/P3 などが利用できる。培養哺乳動物細胞を
宿主とした場合は、COS細胞、CHO細胞、L細胞、C127細
胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞などが利用できる。

【００２０】トロンビン結合性物質は、得られた形質転
換体細胞を培養し、該培養細胞及び／又は培養液から抽
出、分離することにより製造される。形質転換体細胞の
培養に際しては、種々の天然培地、合成培地が用いられ
る。培地は、糖類、アルコール類、有機酸塩などの炭素
源；蛋白質混合物、アミノ酸類、アンモニウム塩などの
窒素源；無機塩類を含んでいることが望ましい。更に、
ビタミン類、選択マーカー遺伝子に対応した抗生物質類
を添加することが望まれる。発現の制御が可能なベクタ
ーであれば、培養途中で遺伝子発現を誘導する操作を加
える必要がある。培養後、遠心処理を行い、培養液と培
養細胞とに分別する。トロンビン結合性物質が培養細胞
中に蓄積する様な場合は、例えば凍結融解、超音波処
理、フレンチプレス、酵素処理、ホモジナイザーなどを
用いて細胞を破壊した後に、例えばEDTA、界面活性剤、
尿素、塩酸グアニジンなどを用いてトロンビン結合性物
質を可溶化する必要がある。

【００２１】得られたトロンビン結合性物質を含む培養
液又は培養細胞抽出液を種々のカラムクロマトグラフィ
ーに付すことにより、精製されたトロンビン結合性物質
を得ることができる。カラムクロマトグラフィーとして
は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー（例えば特開昭64-45398号公報記載の
モノクローナル抗体を使用）、ゲルフィルトレーション
クロマトグラフィーなどを単独で又は組合せて用いるこ
とができる。

【００２２】かくして得られる本発明トロンビン結合性
物質のうち、配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する
物質は、次の性質を有する。 (1)アミノ酸配列本発明のDNA断片の塩基配列から、本発明トロンビン結
合性物質のアミノ酸配列は、配列番号１及び２の如くで
あると判断される。 (2)分子量 55,000〜100,000(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、非還元状態) (3)等電点（アンフォライトを用いる等電点電気泳動
法）pH３〜４ (4)糖分析分子量より、複数の糖類が付加しているものと考えられ
るが、そのうちの１つはアミノ酸配列よりSer(474)に酸
性多糖が付加しているものと推定される。 (5)作用イ．抗トロンビン作用を有する。ロ．アンチトロンビンIIIの活性を増強する。ハ．血小板凝集抑制作用を有する。

【００２３】本発明トロンビン結合性物質を抗血液凝固
剤の有効成分として使用する場合の剤型としては、例え
ば注射剤が挙げられる。注射剤としては、凍結乾燥粉末
を用時、注射用蒸留水、生理食塩水などに溶解して投与
する形態が好ましい。投与部位としては、静脈内が適当
である。

【００２４】投与量は疾患の重傷度、患者の体重などに
より異なるが、通常10μg〜10mg/kg/dayであることが好
ましい。尚、本発明トロンビン結合性物質は、上記投与
量の範囲内においては全く異常が認められず、安全であ
る。

【００２５】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに何ら制限されるものではない。

【００２６】実施例１トロンビン結合性物質遺伝子のクローニング：ヒト・ト
ロンボモジュリン遺伝子の塩基配列〔Shirai, T. et a
l., J. Biochem., 103, 281-285(1988)〕を参考としてD
NA合成装置(ABI model 381A)を用いて配列番号５に示す
プライマー#1及び配列番号６に示すプライマー#2を合成
した。続いてヒト胎盤ゲノムDNA(クローンテック社製)
をBamHI切断し、これを鋳型DNAとして以下の反応液によ
り遺伝子増幅を試みた。遺伝子増幅はQuick Thermo Sys
tem(MODEL QTS-10M,日本ジェネティクス社製)を用い、9
4℃で２分間、50℃で３分間、72℃で４分間を30サイク
ル繰り返すことにより行った。反応終了後、反応液の一
部を採り、アガロースゲル電気泳動により目的とするサ
イズのDNAバンドが増幅されていることを確認した。反応液蒸留水 71μl 緩衝液^*) 10μl dNTP混合液(2.5mM) 8μl プライマー#1(20μM) 5μl プライマー#2(20μM) 5μl 鋳型DNA(１μg/μl) 1μl AmpliTaq(5units/μl) 0.5μl *)：緩衝液 0.1M 塩化カリウム 0.1M トリス塩酸(pH8.3) 0.1％ゼラチン 15mM 塩化マグネシウム反応液からエタノール沈澱によりDNAを回収し、XhoIとK
pnIで切断し、アガロースゲル電気泳動により1.57kb Xh
oI-KpnI断片を調製した。これとは別にクローニング用
ベクターpUC118〔Vieira, J. and Messing, J., Method
s Enzymol., 153, 3-11(1987)〕をHindIIで切断し、Xho
Iリンカーを接続したのち更にXhoIとKpnIで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動によりベクター断片を調製した。
以上のベクター断片、1.57kb XhoI-KpnI断片をライゲー
ションした後、E. coli MV1304〔Vieira, J. and Messi
ng, J., Methods Enzymol., 153, 3-11(1987)〕を形質
転換した。得られた形質転換体よりプラスミドDNAを抽
出し、制限酵素切断を行った。結果として、目的とする
ヒト・トロンボモジュリン遺伝子由来1.57kb XhoI-KpnI
断片が挿入されたプラスミドを保持するクローンが６株
選択された。以上の６クローンの挿入断片の塩基配列を
決定したところ、いずれも１〜３箇所の変異を持つこと
が判明した。そこで変異の認められないクローン２の0.
31kb XhoI-SmaI断片、クローン１の0.65kb SmaI-MluI断
片、クローン４の0.62kb MluI-KpnI断片を上記ベクター
断片と接続し直し、正しいヒト・トロンボモジュリン遺
伝子配列を持つ挿入断片を含むプラスミドpUCTM/XHO-KP
N を構築した。

【００２７】実施例２トロンビン結合性物質発現用ベクターの構築：ヒト尿由
来のトロンビン結合性物質のアミノ酸分析より決定され
たＣ末端Aspに、新たにグリコサミノグリカン付加部位
を結合させて発現させるために、終止コドンを含む配列
番号７〜１２に示すリンカー$1〜$6を合成し、5'末端を
リン酸化した。pUCTM/XHO-KPNをXhoIとKpnIで切断し、
アガロースゲル電気泳動によりヒト・トロンボモジュリ
ン遺伝子由来1.57kb XhoI-KpnI断片を調製した。本1.57
kb断片をリンカー$1、$2、$3、$4と共にXhoI切断後脱リ
ン酸化した動物細胞発現ベクターCDM8(Invitrogen 社
製)とライゲーションした。また、この1.57kb断片をXho
Iで切断し、リンカー$1、$2、$5及び$6と共にXhoI切断
後脱リン酸化したベクターCDM8とライゲーションした。
これらのライゲーションしたDNAでE. coli MC1061/P3
〔Seed, B. and Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 84, 3365-3369(1987)〕をそれぞれ形質転換し
た。得られた形質転換体よりプラスミドDNAを抽出し、
制限酵素切断を行い、挿入方向と挿入断片の確認を行っ
た。正しい挿入方向と制限酵素地図を示したクローン８
株よりXhoI切断により本発明DNA断片を含む1.68kb断片
を切りだし、塩基配列の確認を行ったところ全てのクロ
ーンが配列番号１３又は１４に示した塩基配列を示し、
正しく本発明発現ベクターが構築されている事が確認さ
れた。以上のように構築された本発明発現ベクターをpC
DM-GAG-UTM1及びpCDM-GAG-UTM2（図２）、本発明ベクタ
ーを保持する形質転換体をそれぞれE. coli MC1061/P3
（pCDM-GAG-UTM1）及びE. coli MC1061/P3（pCDM-GAG-U
TM2）と名付けた。

【００２８】実施例３培養動物細胞によるトロンビン結合性物質の発現：pCDM
-GAG-UTM1 及びpCDM-GAG-UTM2を用いてDEAE-Dextran法
〔Seed, B. and Aruffo, A. Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA. 84, 3365-3369(1987)〕によりCOS7細胞にトランス
フェクションした。60mmのculture dishに５×10⁵個のC
OS7細胞を播き、翌日、培養液を吸引して10％のNu-seru
m(Collaborative Research Inc.)を含む２mlのダルベッ
コ改変最少必須培地(DMEM)に置き換えた。10mg／mlの濃
度でPBSに溶解したDEAE-Dextran(平均分子量５×10⁵；
ファルマシア社製)溶液100μlにpCDM-GAG-UTM1 又はpCD
M-GAG-UTM2 10μg(１μg/μl)を加え、これを10μlの20
mMクロロキンと共に細胞培養液に添加した。37℃で４時
間培養後、培養液を吸引し、10％DMSO(PBSに溶解）２ml
を加え、室温で２分間静置した。DMSO溶液を吸引除去
後、10％FCSを含むDMEM３mlを加えて37℃、24時間培養
した。培養液を血清を含まないDMEMに換え、更に48時間
培養した後、培養上清を集めた。得られた培養液を、モ
ノクローナル抗体A-73（特開昭64-45398号公報）を結合
したセファロース4B(２mgIgG/ml樹脂）１mlのカラムに
通した。カラムを(1)0.1M塩化ナトリウム加0.02Mトリス
−塩酸緩衝液(pH7.4)２ml、(2)1M塩化ナトリウム及び0.
05％Tween20加0.02Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)20ml、
(3)1M塩化ナトリウム加0.02Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.
4)５mlにて順次洗浄後2Mチオシアン酸ナトリウム及び5m
MのEDTAを含む1M塩化ナトリウム加0.02Mトリス−塩酸緩
衝液(pH7.4)５mlで溶出した。溶出液を0.1M塩化ナトリ
ウム加50mM酢酸緩衝液(pH4.5)に対して透析し、Mono Ｑ
カラムに付した。カラムを同じ緩衝液で洗浄してのち、
0.1〜２Mの塩化ナトリウムを含有する50mM酢酸緩衝液で
直線濃度勾配法により溶出して精製トロンビン結合性物
質（r-GAG-UTM1及びr-GAG-UTM2）を得た。

【００２９】実施例４培養動物細胞によるトロンビン結合性物質の発現：pCDM
-GAG-UTM1を用いてリン酸カルシウム沈殿法（Gorman,
C.,“DNA cloning", IRL Press, England, 1985, vol.
2, P.143-190）によりCHO・K1細胞(RCB285)にトランスフ
ェクションした。10cmのシャーレに５×10⁵個のCHO・K1
細胞を播き、翌日、培養液（10％FCS添加 Ham F12培
地；以下培地と称す）を交換し、その４時間後、DNAと
リン酸カルシウムの共沈殿物を加えた。共沈殿物の調製
は以下のようにして行った。20μgのpCDM-GAG-UTM1と10
0ngのネオマイシン耐性遺伝子を450μlの１mMトリス塩
酸(pH8.0)・0.1mM EDTAに溶解し、2.5M塩化カルシウム5
0μlを混和後、50mM HEPES(pH7.12)・280mM塩化ナトリ
ウム・1.5mMリン酸水素ナトリウム溶液500μlに滴下混和
した。室温に30分間放置後、上記細胞培養液に添加し、
24時間培養した。次いで、新鮮培地に換え、更に24時間
培養後、400μg/mlのG418を含む選択培地に交換した。
２週間後、生じたコロニーを24穴培養プレートに移して
更にコンフルエントになるまで培養した。培養上清を集
め、分泌されたトロンビン結合性物質(r-GAG-UTM1)量を
定量し、高産生クローンを選択した。選んだクローンに
ついて更に限界希釈法によるクローニング操作を行っ
た。得られた形質転換細胞株をCHO-GUTM 1-8と名付け、
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第3260号として寄託した。形質転換細胞株CHO-GUTM 1
-8を１％FCS添加UC202（日水製薬社製）培地を用いて22
5cm²フラスコにコンフルエントになるまで培養後、50ml
のFCSを含まないUC202培地に交換した。１週間後、培養
液を回収した後、新たに同量の無血清培地を添加し、更
に１週間培養して培養液を回収した。培養液中に本トロ
ンビン結合性物質は３〜４μg/ml分泌されていた。以
下、実施例３の後半と同様に処理して、精製トロンビン
結合性物質(r-GAG-UTM1)を得た。

【００３０】実施例５トロンビン結合性物質の物性：精製トロンビン結合性物
質をLaemmliの方法(Nature, 227, 680-685)に従いSDS-P
AGEを行った。ゲルをMatudairaの方法〔J. Biol. Che
m., 262 (21), 10035-10038〕に従い、PVDF膜に転写し
た。次いでPVDF膜を0.1％牛血清アルブミンを含有する
0.1M塩化ナトリウム加0.05Mトリス−塩酸緩衝液(TBS)
溶液中で室温にて２時間反応させた。溶液を捨て、0.05
％Tween20加TBSで充分洗浄した後、西洋ワサビペルオキ
シダーゼで標識したモノクローナル抗体A-60を含有する
0.05％Tween20加TBS中、室温で１時間反応させた。溶液
を捨て、0.05％Tween20加TBSで充分洗浄した後、3-アミ
ノ-9-エチルカルバゾール５mg及び30％過酸化水素水25
μlを含有する50mM酢酸緩衝液 (pH5.0)50mlに入れて発
色させたところ、グリコサミノグリカン付加体特有のブ
ロードなバンドが確認された。

【００３１】実施例６ r-UTM、本発明トロンビン結合性物質r-GAG-UTM1及びr-G
AG-UTM2(0.1μg/ml)を、それぞれ５μlのコンドロイチ
ナーゼABC(10mU；生化学工業社製）で37℃、40分間反応
させた後、実施例５と同様にしてイムノブロッティング
したところ本発明トロンビン結合性物質はコンドロイチ
ン硫酸タイプのグリコサミノグリカンが共有結合してい
ることが確認された。

【００３２】実施例７抗凝固活性：r-UTM、r-GAG-UTM1又はr-GAG-UTM2(2.5μg
/ml)、ヒト・フィブリノーゲン(2.5mg/ml)、ヒト・アン
チトロンビンIII(0又は250μg/ml)及び塩化カルシウム
(5mM)の溶液に、ウシ・トロンビン(0.5U/ml)を加え、凝
固時間を測定した。結果を表１に示す。

【００３３】

【表１】

【００３４】表１から明らかなように、本発明トロンビ
ン結合性物質はトロンビンと結合して血液凝固時間を延
長し、またこの抗血液凝固作用はアンチトロンビンIII
との共存により著しく増強される。

【００３５】実施例８抗凝固活性：r-UTM(9〜90nM)、本発明トロンビン結合性
物質r-GAG-UTM1又はr-GAG-UTM2(9〜90nM)及びウシ・フ
ィブリノーゲン（1mg/ml）の0.15M 塩化ナトリウム加20
mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)溶液に、ウシ・トロンビ
ン(18mM)を加え、凝固時間を測定した。予め各種濃度の
ウシ・トロンビンを用いて作成した検量線より、50％阻
害率(IC₅₀)を求めた。結果を表２に示す。

【００３６】

【表２】

【００３７】実施例９抗凝固活性：本発明物質(17nM)又はr-UTM(17nM)、ウシ
・フィブリノーゲン(1mg/ml)及びヒト−アンチトロンビ
ンIII(125μg/ml)の0.15M 塩化ナトリウム加20mMトリス
-塩酸緩衝液pH7.4溶液にウシ・トロンビン(18nM)を加
え、凝固時間を測定した。結果を表３に示す。

【００３８】

【表３】

【００３９】実施例10 血小板凝集抑制作用：ウサギ・耳動脈より採血した血液
を用いて作製したPRP（多血小板血漿）200μl、本発明
物質(10^-6〜10^-8M)８μlの溶液にADP（アデノシン二リ
ン酸）２μMを加え、血小板凝集を測定した。予め種々
の濃度のADPを用いて作成した検量線より求めたr-GAG-U
TM1及びr-GAG-UTM2のADP凝集に対する50％阻害濃度は、
それぞれ２×10^-7M及び2.1×10^-7Mであった。なお、r-U
TMは用いた濃度(10^-6〜10^-8M)で凝集阻害作用は見られ
なかった。

【００４０】実施例11 ラット（Wister系，雄）に、麻酔下、右大腿静脈内にカ
テーテルを挿入し、当該カテーテルより被験薬物（GAG-
UTM1又はr-UTM）を１mg/ml/kg宛急速投与した。薬物投
与前及び投与後１、３、６、10、20、30、60、120分に
0.1ml宛採血し、ヘパリンと混和後血漿とし、血中濃度
測定用に供した。血中濃度は抗トロンビン結合性物質モ
ノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにて
行った。その結果、いずれの薬物もone-compertment mo
delで解析可能であった。結果を表４に示す。

【００４１】

【表４】

【００４２】

【発明の効果】以上のように、本発明のトロンビン結合
性物質は、アンチトロンビンIII活性の増強作用及び血
小板凝集抑制作用を有し、かつそれ自身抗トロンビン作
用を有し、抗血液凝固剤の有効成分として有用である。
また本発明トロンビン結合性物質は、大量かつ安価に製
造することができる。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：476 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Glu Asp Tyr Ser Gly Ser Gly Glu 465 470 475

【００４４】配列番号：２配列の長さ：476 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Asp Glu Ala Ser Gly Ser Gly Asp 465 470 475

【００４5】配列番号：３配列の長さ：1428 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGTGACT CCGGCAAGGT GGACGAGGAC TATAGCGGCT CTGGCGAG 1428

【００４６】配列番号：４配列の長さ：1428 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGTGACT CCGGCAAGGT CGACGACGAG GCCAGCGGCT CTGGCGAC 1428

【００４７】配列番号：５配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGGGCCGGGC ACTTATAAAC T 21

【００４８】配列番号：６配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCCAGTGGTC CAGTGACGTC A 21

【００４９】配列番号：７配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTTCGAGTGC ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGTCCG 39

【００５０】配列番号：８配列の長さ：49 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATGTGGCGGA CAAGGGCCGA GTCGGGCCCG CAGATGCACT CGAAGGTAC 49

【００５１】配列番号：９配列の長さ：65 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCACATTGGC ACCGACTGTG ACTCCGGCAA GGTGGACGAG GACTATAGCG GCTCTGGCGA 60 GTGAC 65

【００５２】配列番号：10 配列の長さ：63 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCGAGTCACT CGCCAGAGCC GCTATAGTCC TCGTCCACCT TGCCGGAGTC ACAGTCGGTG 60 CCA 63

【００５３】配列番号：11 配列の長さ：65 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCACATTGGC ACCGACTGTG ACTCCGGCAA GGTCGACGAC GAGGCCAGCG GCTCTGGCGA 60 CTGAC 65

【００５４】配列番号：12 配列の長さ：63 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCGAGTCAGT CGCCAGAGCC GCTGGCCTCG TCGTCGACCT TGCCGGAGTC ACAGTCGGTG 60 CCA 63

【００５５】配列番号：13 配列の長さ：1680 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：190..243 特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：244..1671 特徴を決定した方法：Ｓ配列 CTCGAGCCCT GGCCGATCCG CATGTCAGAG GCTGCCTCGC AGGGGCTGCG CGCAGCGGCA 60 AGAAGTGTCT GGGCTGGGAC GGACAGGAGA GGCTGTCGCC ATCGGCGTCC TGTGCCCCTC 120 TGCTCCGGCA CGGCCCTGTC GCAGTGCCCG CGCTTTCCCC GGCGCCTGCA CGCGGCGCGC 180 CTGGGTAAC ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC 231 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly -18 -15 -10 -5 CTG GGG TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC 279 Leu Gly Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys 1 5 10 GTC GAG CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC 327 Val Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu 15 20 25 AAT GCC AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG 375 Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val 30 35 40 CGC TCC TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC 423 Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp 45 50 55 60 GGC GGC GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC 471 Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro 65 70 75 GGC TGC GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG 519 Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp 80 85 90 GTT ACG GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC 567 Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp 95 100 105 CTC AAT GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT 615 Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala 110 115 120 GCT GAG GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC 663 Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys 125 130 135 140 GAA GTG AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC 711 Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr 145 150 155 TGC AGG CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG 759 Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser 160 165 170 ATC ACC TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG 807 Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala 175 180 185 CTG CCG GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA 855 Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu 190 195 200 ATG TGC ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG 903 Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu 205 210 215 220 GCG CCG GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC 951 Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His 225 230 235 GCG TGC AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC 999 Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly 240 245 250 GCC GCC CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG 1047 Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln 255 260 265 TCC TGC AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG 1095 Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln 270 275 280 CCG GGC TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC 1143 Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala 285 290 295 300 GAC CAA CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT 1191 Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser 305 310 315 CCG TGT CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC 1239 Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His 320 325 330 TGC TAC CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG 1287 Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val 335 340 345 GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC 1335 Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn 350 355 360 CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC 1383 Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro 365 370 375 380 CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA 1431 His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro 385 390 395 GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC 1479 Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly 400 405 410 TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA 1527 Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu 415 420 425 AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC 1575 Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe 430 435 440 GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC 1623 Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr 445 450 455 460 GAC TGT GAC TCC GGC AAG GTG GAC GAG GAC TAT AGC GGC TCT GGC GAG 1671 Asp Cys Asp Ser Gly Lys Val Asp Glu Asp Tyr Ser Gly Ser Gly Glu 465 470 475 TGACTCGAG 1680

【００５６】配列番号：14 配列の長さ：1680 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：190..243 特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：244..1671 特徴を決定した方法：Ｓ配列 CTCGAGCCCT GGCCGATCCG CATGTCAGAG GCTGCCTCGC AGGGGCTGCG CGCAGCGGCA 60 AGAAGTGTCT GGGCTGGGAC GGACAGGAGA GGCTGTCGCC ATCGGCGTCC TGTGCCCCTC 120 TGCTCCGGCA CGGCCCTGTC GCAGTGCCCG CGCTTTCCCC GGCGCCTGCA CGCGGCGCGC 180 CTGGGTAAC ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC 231 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly -18 -15 -10 -5 CTG GGG TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC 279 Leu Gly Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys 1 5 10 GTC GAG CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC 327 Val Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu 15 20 25 AAT GCC AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG 375 Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val 30 35 40 CGC TCC TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC 423 Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp 45 50 55 60 GGC GGC GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC 471 Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro 65 70 75 GGC TGC GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG 519 Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp 80 85 90 GTT ACG GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC 567 Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp 95 100 105 CTC AAT GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT 615 Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala 110 115 120 GCT GAG GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC 663 Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys 125 130 135 140 GAA GTG AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC 711 Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr 145 150 155 TGC AGG CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG 759 Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser 160 165 170 ATC ACC TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG 807 Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala 175 180 185 CTG CCG GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA 855 Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu 190 195 200 ATG TGC ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG 903 Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu 205 210 215 220 GCG CCG GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC 951 Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His 225 230 235 GCG TGC AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC 999 Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly 240 245 250 GCC GCC CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG 1047 Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln 255 260 265 TCC TGC AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG 1095 Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln 270 275 280 CCG GGC TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC 1143 Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala 285 290 295 300 GAC CAA CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT 1191 Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser 305 310 315 CCG TGT CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC 1239 Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His 320 325 330 TGC TAC CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG 1287 Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val 335 340 345 GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC 1335 Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn 350 355 360 CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC 1383 Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro 365 370 375 380 CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA 1431 His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro 385 390 395 GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC 1479 Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly 400 405 410 TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA 1527 Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu 415 420 425 AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC 1575 Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe 430 435 440 GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC 1623 Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr 445 450 455 460 GAC TGT GAC TCC GGC AAG GTC GAC GAC GAG GCC AGC GGC TCT GGC GAC 1671 Asp Cys Asp Ser Gly Lys Val Asp Asp Glu Ala Ser Gly Ser Gly Asp 465 470 475 TGACTCGAG 1680

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のトロンビン結合性物質のアミノ酸配列
を示す図面である。

【図２】本発明発現用ベクターpCDM-GAG-UTM1及びpCDM-
GAG-UTM2の構造を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次に示すアミノ酸配列を有し、少なくと
もＮ末端側より４７４番目のＳｅｒにグリコサミノグリ
カンが付加してなるトロンビン結合性物質。（配列中、Ｘ１、Ｘ２は酸性アミノ酸を示し、Ｙ１、Ｙ
２は任意のアミノ酸を示す。）
【請求項２】アミノ酸配列中、（ａ）Ｘ１及びＹ２が
グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｘ２がアスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）、Ｙ１がチロシン（Ｔｙｒ）、又は（ｂ）Ｘ１及び
Ｙ２がアスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｘ２がグルタミン
酸、Ｙ１がアラニン（Ａｌａ）である請求項１記載のト
ロンビン結合性物質。
【請求項３】請求項１記載のアミノ酸配列をコードし
得る塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項４】請求項２記載のアミノ酸配列（ａ）又は
（ｂ）をコードし得る塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項５】塩基配列が次の（Ａ）又は（Ｂ）に示す
ものである請求項４記載のＤＮＡ断片。（Ａ）配列の長さ：１４２８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ（Ｂ）配列の長さ：１４２８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ
【請求項６】請求項１に示すアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を有するＤＮＡ断片及び複製可能なベクター
からなる組換えベクター。
【請求項７】転写の下流方向へ順に次の塩基配列
（１）〜（７）、（１）プロモーターとして作用する塩基配列（２）リボソーム結合部位である塩基配列（３）開始コドンである塩基配列（４）シグナルペプチドをコードする塩基配列（５）請求項１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配
列（６）終止コドンである塩基配列（７）ポリＡ付加シグナルとして作用する塩基配列を含有する組換えベクター。
【請求項８】請求項６又は７記載の組換えベクターを
保持する形質転換体細胞。
【請求項９】請求項１又は２記載のトロンビン結合性
物質を有効成分とする抗血液凝固剤。
【請求項１０】請求項１又は２記載のトロンビン結合
性物質を有効成分とする血小板凝集抑制剤。
【請求項１１】請求項８記載の形質転換体細胞を培養
し、該培養物から生産されたポリペプチドを採取するこ
とを特徴とする請求項１又は２記載のトロンビン結合性
物質の製造法。