JPS63503357A

JPS63503357A - 新規な凝固活性タンパク質

Info

Publication number: JPS63503357A
Application number: JP62503481A
Authority: JP
Inventors: カウフマン，ランダル・ジェイ; ピットマン，デブラ・ディー; トゥール，ジョン・ジェイ，ジュニアー
Original assignee: ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド
Priority date: 1986-05-29
Filing date: 1987-05-29
Publication date: 1988-12-08
Also published as: EP0270618A1; DK42588A; KR880701105A; AU7486887A; CA1341229C; AU609043B2; US5451521A; DK42588D0; WO1987007144A1; EP0270618A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規な凝固活性タンパク質本発明の研究のある面は、中小企業技術革新研究（Ｓｍａ　’１ＩＢｕｓｉｎｅｓｓ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　；　５ＢＩＲ）認可、ＤＨ３ＳＧｒａｎｔ　Ａ　Ｉ　Ｒ４３ＨＬ　３５９４６−０１のもとに米国保健奉仕省（Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ；ＤＨＨ３）から一部資金の提供を受けた。米国政府はこの発明に対して一定の権利を有する。

本発明は凝固活性を有する物質に関する。より詳細には、本発明は゛遺伝子組み換え”凝固活性タンパク質、遺伝子工学的に操作された細胞から前記タンパク質を得る方法、および凝固剤として使用するための前記タンパク質を含有する治療用組成物に関する。

血漿由来のヒト■因子の特性決定は、その凝固活性が約ｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ〜約２１０．０００ダルトンの分子量をもつ多数のポリハプチド鎖と関連していることを示している。トロンビンを添加すると、■因子凝固活性を初めに活性化しその後不活化するタンパク質加水分解の特定のノミターンが生ずる。■因子の活性化および不活化に必要なタンパク質分解を知ることは、〜■■子活性の構造的必要条件を理解するために必要である。１つの研究方法はトロンビン消化の前および後の特定切断産物のアミノ酸配列を決定する方法であった〔イートン（Ｅａｔｏｎ）ら。

この方法は〜■■因子分子に沿ってこのプロテアーゼの切断部位をマツピングする上で多少なりとも有用であった。

今や、我々は哨乳動物宿主細胞系から誘導されたヒト組み換え■因子を分析し、そして血漿由来の■因子から得られたものと同じ切断部位を解明した。我々のデータは、組み換えタンパク質と天然タンパク質が同様に折りたたまれ且つプロセッシングされることを示唆しており、この結果は確信をもって推定できなかつただろう。我々のデータは、■因子を産生ずるように遺伝子工学的に操作されだ哺乳動物細胞株からの調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎθａｍθｄ１ｕｍ）より精製された組み換え■因子を使用して得られた。こうして得られた組み換えタンツク質は約２００Ｋｄのポリはプチドと約７６Ｋａのポリにプチドとの複合体として固定された。トロンビンで消化すると、２００ＫｄＪすにプチドはｇ□Ｋａの物質を生じ、最終的に５０Ｋｄと４０Ｋａの物質を生成する。７６　Ｋａ　＃？リー！：プチドはトロンビン消化の際に６９Ｋｄの物質に切断される。７６Ｋａと６ｇＫａの物質はほかのところでは“８０Ｋｄ”および７３Ｋａ”の物質と呼ばれている。

しかしながら、正確な切断部位の存在の知識はこれまで、活性化およびその後の不活化に対してどんな切断が必要とされるのかについて決定的に確立してはいなかった。

本発明の研究の別の面では、■因子ＤＮＡの変異型の発現と組み合わせた部位特異的突然変異誘発方法を使用して、■因子の活性化および不活化にとってどの部位が必要かつ十分であるかを明らかにした。特定の切断部位の不活化をもたらす特定のアミノ酸を変えるために、特定のＤＮＡ配列が変更された。■因子の修飾型は、クローニングされた修飾〜■因因子コード化化ＤＮＡを使用して、高レベル発現の可能な哨乳動物宿主細胞系において産生された〔カラ７７７　（Ｋａｕｆｍａｎ）　、　ＰＮＡＳ　、　８２　：　６８９（１９８５）を参照されたい〕。こうして産生された■因子の修飾型をその後分析した。我々の結果は、ｇ　 □　Ｋａまたは７６　Ｋａ切断部位で切断されないタンパク質をもたらす突然変異が凝固活性またはトロンビンによる活性化を低下させないことを明らかにした。７６Ｋｄ切断部位の突然変異からの調整培地中で生産された主な物質は、少な（とも以後に述べる欠失変異型の場合には、５ＤＳ−ｙｆ＃ｌＪアクリルアミドゲル電気泳動で追跡したとき単一のポリはプチド鎖である。５０Ｋｄと４０Ｋｄの物質を生じるトロンビン切断部位の突然変異は＼■因子を不活性にする。アミン末端における提案された活性化プロティンｃ　（ＡＰＣ）切断部位の突然変異は、比活性が増大しまた恐らくはタンパク質分解による不活化に対して感受性が減少した■因子をもたらす。実、験的証拠は、Ａｒｇ　−３３６のすぐ下流（すなわちＡｒｇ−３３６とＭｅ　ｔ　−３３７の間）および、その部位での切断が以下で述べるように遮断される場合は、恐も＜　Ｌｙｅ　−３２５、Ｌｙｓ　− ３３８およびＡｒｇ　−３５９の１つまたはそれ以上のすぐ下流でのタンパク質切断がＡＰＣにより触媒されることを示唆している。

本発明は、天然ヒト＼・■：ｃ因子の１つ以上の切断部位で特定プロテアーゼにより触媒される切断に対して不安定性が減少するが、凝固活性およびトロンビンによる活性化が保持された天然ヒト■：Ｃ因子に関して修飾を含む１群の■：Ｃ因子型タンパク質を提供する。これらの部位は以後単に゛切断部位”と呼ばれ、Ａｒｇ−２２６とＡｈａ　−２２７の間の切断部位、Ａｒｇ−３３６とＭｅｔ− ３３７の間の切断部位および／または先の段落で述べたその他の提案された”ＡＰＣ”切断部位を含む”ＡＰＣ”切断部位、Ａｒｇ−５６２とＧ’１ｙ−５６３の間の切断部位、Ａｚｇ−７４０とＳｅｒ　−７４１の間の″９０Ｋｄ切断部位 ”、Ａｒｇ−７７６とＴｈｒ−７７７の間の″ｃ＋ｓＫａ切断部位”、Ａｒｇ− １３１３とＡｌａ　（３１４の間の″１１５Ｋｄ切断部位”、Ａｒｇ−１６４８とＧｌｕ−１６４９の間の゛７６Ｋｄ切断部位”、およびＡｒｇ−１７２１とＡｈａ−１７２２＋７）間の″′Ｘａ因子切断部位”を包含する。

本明細書全体を通して、アミノ酸のナンバリングは表ＩＫ示した〜■：Ｃ因子のアミノ酸配列（ここで成熟タンパク質のアミン末端はＡｌａ−１である）に基づいている。

゛■：Ｃ因子型タンパク質”（以後゛変異型”とも呼ばれる）とは、天然ヒト■ ：Ｃ因子のアミノ酸配列または凝固活性を保持するＳｅｔ　−３７３からＡｒｇ −１６８９までの１〜１３１７個のアミノ酸の欠失を含むその類似体（以後“欠失類似体”と呼ぶ）のアミノ酸配列と、１個所またはそれ以上の切断部位を除いて、同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列により特徴づけられる〜■因子型凝固活性を示すタンパク質を意味する。１個所またはそれ以上の切断部位を除いて天然ヒト〜■：ｃ因子と”実質的に同じ”アミノ酸配列とは、（１）１個所またはそれ以上の切断部位でのアミノ酸修飾；および（ｉｉａ）天然ヒト■：Ｃ因子をコードするｃ　ＤＮＡと緊縮条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｃｏｎａｉｔｉｏｎｓ）下でハイブリダイズし得るｃＤＮＡによりコードされること；または（ｆｉｂ）表Ｉに示した最初の４０アミノ酸と同じか又は実質的に同じ成熟Ｎ末端はプチド配列、および最後の５０アミノ酸と同じか又は実質的に同じＣ末端ペプチド配列を持つこと；により特徴づけられる全ての■因子型タンパク質を包含する。

従って、＼■因子型タンパク質はそのタンパク質が凝固活性タンパク質であり、且つ（１）天然ヒト■：Ｃ因子をコードするｃＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし得るｃ　ＤＮＡによりコードされるが、あるいは（１１）表Ｉに示したものと同じが又は実質的に同じ４ｏアミノ酸成熟Ｎ末端および５０アミノ酸Ｃ末端を有する限り、更なる修飾を含んでいてもよい１つ以上の切断部位修飾を有する全長および欠失類似体を包含する。本発明に含まれる更なる修飾の例には、”硫酸化変異体（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ）”、すなわち１個所またはそれ以上の硫酸化可能な部位（例えば３４６．３９５．４０７．１．６６４．１６８０および１７０９位）でのチロシンのアミノ酸置換または欠失により特徴づけられる〜■：ｃ因子型タンパク質、により具体化される修飾が含まれるが、これに限定されない。

本発明の修飾型■因子は血清由来の＼■因子または組み換え〜■因子よりも均一なかつ／また安定した形で生産することができ、しかもｉｎ　ＶｉＶＯ投与の際に単一鎖分子の活性増加、プロティンＣ不活化による不活化の減少、半減期または比活性の増加、もしくは薬物速度論的プロフィールの改善によりもたらされる有益な作用を有する。従って、これらのタンパク質は非修飾入組：Ｃ因子と比べて投与量の低下および／または投与経路の変更を可能にする。

本発明の１つの面は、１個所またはそれ以上のＸａ因子、ＡＰＣおよびトロンビン切断部位を修飾して、この種の切断部位が特定のタンパク質加水分解に対してより安定になった変異型、例えばその切断部位を規定するアミノ酸の一方または両方（好ましくは少なくともアルギニン残基）が欠失されるか、または目下のところ好適であるように別のアミノ酸で置換された変異型に関する。その置換は保存的変化（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｃｈａｎｇｅ）であり、例えばタンパク質の二次構造の変化が起こる機会を最小限に抑えるＡｒｇのＬｙｓによる置換でありうる。また、その変化は非保存的変化であり、例えばタンパク質の加水分解に対する抵抗性を保証するＡｒｇの非塩基性アミノ酸（例えば１１ｅ）による置換であり得る。さらに、切断部位のアミノ酸の置換は２個以上のアミノ酸による置換であり得る。例えば、Ａｒｇは１個のアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチド（１１ｅ、　ｌ１ｅ−ＬｅｕｌＬｅｕ−１１ｅ、　ｌ１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙなど）テ背換することカテきる。

従って、本発明のこの面の化合物には２２０．２２６．２５０．２７９．２８２．３３６．３５９．５６２．７４０（および／または５ｅｒ−７４１）、７７６．１３１３．１６４８．１７１９および１７２１位のうち１個所以上のＡｒｇが欠失されるか、あるいはりシンまたは非塩基性アミノ酸（例えばインロイシン）から独立に選ばれる１個以上のアミノ酸で置換された変異型が包含される。本発明はさらに６ｇＫａ切断部位でのＡｒｇ−１６８９のＬｙｅによる置換を単独で、またはここに記載の他の修飾との組み合わせで含む■：Ｃ因子型タンパク質を包含する。さらに、Ｌｙｅ　−３２５およびＬｙｅ　−３３８の一方または両方が欠失されても、あるいは例えば非塩基性アミノ酸で置換されてもよい。

表■　：ヒト〜■：ｃ因子の全長タンパク質配列（胱き　→）（表Ｉの続き）本発明の他の面は、（α）１個所以上の切断部位にわたるトリペプチド配列および／または（ｂ）本発明に従って修飾され得る前記アミノ酸のいずれか１個以上が共通のアスパラギン−結合グリコシル化部位で置換された変異型に関する。共通のＮ−結合グリコシル化部位は式：アスパラギンーＸ−）レオニンマタはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここでＸは通常アミノ酸のいずれかであるが、恐らくプロリンを除く）のトリペプチド配列から成る。本発明のこの面の化合物の例には、Ｘａ因子切断部位にわたる配夕じＮＲＡ”が“ＮＲ３”または“ＮＲＴ”で置換された変異型が含まれる。１個所以上の切断部位に遺伝子工学的に処理されたＮ−結合グリコシル化部位を含む本発明のこの面の化合物は、１個所以上の他の切断部位でのアルギニンおよび／またはりシンの欠失もしくは置換、および／または１個所以上の硫酸化部位でのチロシンの欠失もしくは置換のような前記修飾をさらに含むことができる。この種の化合物は例えば７６Ｋａ切断部位（１６４８位）でのＡｒｇの工１θによる置換、およびＸａ因子切断部位（１７２０〜１７２２位）でのＮＲＡのＮＲ８またはＮＲＴによる置換を含む。

現在特に興味ある変異型の１つのグループは、７６Ｋａ切断部位に修飾を含むものである。従って、これらの変異型はＡｒｇ−１６４８での点欠失（ｐｏｉｎｔ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ）または好ましくはアミノ酸置換、もしくはＡｒｇ−１６４８の代わりにまたは７６Ｋａ切断部位にわたる３種のトリペプチド配列ＱＲＥまたは好ましくはＨＱＲもしくはＲＥＩＯ代わりに使用された配列−ＮＸＴ　−または−ＮＸＳ−（ここでＸはアミノ酸であるが、好ましくはプロリンでない）から成る共通のＮ−結合グリコシル化部位を含む。

このグループには７６Ｋａ部位でのみ修飾された変異型、および本発明の範囲内の１．２．３．４．５．６個所またはそれ以上の他の切断部位でさらに修飾されまた場合により１６８９位のＡｒｇ。

代わりにＬｙｓを含む変異型が含まれる。例えば、このグループはＡＴｇ−１６４８が欠失されるが又は他のアミノ酸で置換され、またＧｌ−ｕ−１６４９が欠失されるか又はＡｓｎで置換された変異型を含み、この変異型はさらにＡｒｇ− １３１３の代わりに置換用アミノ酸を含む。このグループはまた提案されたＡＰＣ１９０Ｋｃｌ、　９５Ｋａ１１１５　Ｋａ、　７６　Ｋａ、　６９　Ｋｄ（リシン置換のみ）およびＸａ因子切断部位の１個所以上で修飾された変異型を包含する。

また、現在特に興味あるグループは提案されたＡＰＣ切断部位とＸａ切断部位の両方に修飾を含む変異型である。このグループはまた１個所以上の他の切断部位（好ましくは７６Ｋｌ１１部位を含む）で修飾された変異型を包含する。現在特に興味ある変異型の例を以下の表に示す。表中°Ｘ”で表される位置は、アミノ酸の欠失位置または独立に選ばれた置換用アミノ酸によるその置換位置を示している。”独立に選ばれた”とは、２個所以上のアミノ酸位置（下記の表におけるＸ”）が修飾される場合、それぞれの位置に対する置換用アミノ酸は同じであっても互いに異なっていてもよく、また１個所以上の部位が欠失により修飾され、一方１個所以上の他の部位がアミノ酸置換により修飾され得ることを意味している。こうして、下記の表の化合物１９では、例えばＡｒｇ−７４０が■１ｅで置換され、そしてＡｒｇ−１６４８がＬｅｕ″′ｃ置換され得る。また、もちろんＡｒｇ−７４０が欠失されてＡｒｇ−１６４８が■１θで置換されてもよい。

本発明変異型の例以下により特徴づけられる■：Ｃ因子タンパク質７：Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｒおよび／またはＲ１７ＸＸＸＸＸ２７ｘｘｘｘｘ（続ぎ一一−〉）（表の続き）Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｒおよび／またはＲ３１Ｘ　ＸＸＸ３２ｘｘｘ　ｘｘ３３ＸＸＸＸＸ３４Ｘ　ＸＸＸＸ３５ＸＸＸＸＸＸ４２ｘｘ　ｘ’　ｘ４３Ｘ　ＸＸ　ｘ４４ＸＸＸＸ　Ｘ４Ｂ　ｘ　ｘ　ｘ　ｘ４９Ｘ　ＸＸ　ｘ５ＱＸＸＸ　Ｘ　Ｘ５１　ＸＸ　ＸＸ　ｘ５２Ｘ　ＸＸＸ、　ｘ５３ＸＸＸＸＸ　Ｘ５４　Ｘ　Ｘ５５　Ｘ　Ｘ　Ｘ５Ｂ　ｘ　ｘ　ｘ　ｘ５ｇ　ｘ　ｘ　ｘ　ｘ６０ｘｘｘ　Ｘ　Ｘ６１ｘｘ　ｘ　ｘ　ｘ６２Ｘ　ＸＸ　Ｘ　Ｘ６３ＸＸＸＸ　Ｘ　Ｘ（続き一一一〉）（表の続き）Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｒおよび／またはＲ６４Ｘ　ＸＸ　ｘ５５ＸＸ　ＸＸ　ｘ６６Ｘ　Ｘ　ＸＸ　ｘ６７Ｘ　ＸＸＸ　ｘ６８ＸＸＸ　ＸＸ　Ｘ５９ＸＸ　ＸＸＸ　ｘ７ｏ　χ　ｘ　ｘ　ｘｘ　ｘ７１　ＸＸＸＸＸＸ　ｘ ※＼■：ｃ因子型タンパク質は全長＼■因子および以下のような欠失類似体を含む： α、Ａ−９８２からＬ−１５６２までが欠失されたもの（”ＤＧＲ”）ｄ、　Ｓ −３７３からＦｌ−１６４８までが欠失されたもの（５０−７６Ｋｄ）ｅ、Ｔ− ７６０からＰ−１６４０までが欠失されたもの（”ＬＡ”）？二徐表示したアミノ酸は欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換される。

例えばＲ→■またはに；に→工本発明による変異型はまた対立遺伝子変異（すなわち、互いに区別される天然変異性によるＤＮＡ塩基配列の変異）をもっタン・々り質、または〜■：ｃ因子型凝固活性をまだ保持する他のアミノ酸置換もしくは欠失をもつタンパク質を包含する。

本発明の全ての変異型は、当分野で知られるように、所望の変異型をコードする組み換えＤＮＡ配列を宿主細胞（好ましくは哨乳動物宿主細胞）中で発現させることにより生産される。変異型をコードするＤＮＡ配列は、ヒト＼■：ｃ因子またはその欠失類似体をコードするＤＮＡ配列の特定部位突然変異誘発により作ることができる。

ヒト〜■：Ｃ因子をコードするＤＮＡ配列はすでにクローニングされている。表Ｉの全長ヒトタン・ξり質をコードするＤＮＡ配列、およびその欠失類似体をコードする配列ｍ１）ＧＲ−２はメリーランビ州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＡＴＣＣ５３１００として寄託された。

全長ヒト＼■：Ｃ因子ｃＤＮＡの調製およびヌクレオチド配列は米国特許出願第５４６６５０号（１９８３年１０月２８日付）および同第６４４０８６号（１９８４年８月２４日付）、ならびに国際特許出願筒ＰＣＴ／ＵＳ　８４　／　０１６”４１号（１９８５年５月９日に公開番号ＷＯ３５１０１９６１として発明の詳細な説明されている。

表１に示したヌクレオチド配列を含むｐＳＰ６４組み換えクローン（ｐＳＰ６４ −＼・■と名づげた）はＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ３９８１２として寄託されている。

％Ｔ［：ｃ因子の欠失類似体をコードするｃ　ＤＮＡを調製するために、制限エンドヌクレアーゼを使用して全長ヒト〜■：Ｃ因子ｃＤＮＡをそのヌクレオチド配列の適当な部位で切断した。制限エンドヌクレアーゼは一般にそれらの商業上の供給者により推薦される条件および方法のもとで利用される。制限エンド１ヌクレアーゼは切除することを望む〜■：ｃ因子の部分をコードする塩基配列を実質上特異的に切断するものが選ばれる。ＢａｍＨＩおよび５ａｃＩは特に有用なエンドヌクレアーゼである。しかしながら、当業者は通常の選択方法により選ばれた他の制限エンドヌクレアーゼも利用できるであろう。欠失されるヌクレオチドの数は変化しうるが、最終的なｃ　ＤＮＡ配列の読み枠に影響を及ぼさないように注意すべきである。

欠失類似体をコードするＤＮＡ配列は、他の方法に加えて、例えばモリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ、Ｙ、　）ら、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ７＋　２　：６３６〜６３９　（１９８４）に記載されるようなオリゴヌクレオチド９媒介欠失突然変異誘発〔しばしば”ループアラ）　（１ｏｏｐｏｕｔ）”突然変異誘発と呼ばれる〕の適用により全長ヒト＼■：ｃ因子ＤＮＡ配列から誘導することができる。

ｇＯＫａ切断部位と６９Ｋ（１切断部位の間の１〜９５１個のアミノ酸の欠失を含む欠失類似体およびそれらの製法は、米国特許出願第７２５３５０号（１９８５年４月１２日付）およびそれに基づく国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７７４号（ＷＯ８６１０６１０１として１９８６年１０月２３日に発行）に詳細に記載されている。

５８１個のアミノ酸が欠失された欠失類似体をコードするｃＤＮＡを含むプラスミ）”　ｐＤＧＲ−２はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ５３１００として寄託された。Ａｒｇ　−３７２（５０／４０切断部位）およびＳｅｒ　−１６９０（６９Ｋａ切断部位）の間の１〜１３１７個のアミノ酸の欠失を含む類似の欠失変異型は、上記のＰＣＴ／ＵＳ　８６１００７７４に記載の一般方法を用いて作ることができる。より詳細には、このような欠失類似体をコードするＤＮＡ分子は、当分野で通常の知識を有する者には容易に理解されるように、適当なオリゴヌクレオチドを使用するループアウト突然変異誘発または適当な制限酵素により、全長〜■因子もしくはｐＤＧＲ−２のような欠失類似体をコードするＤＮＡ分子から容易に作製しうる。

これらの手段により、アミノ酸配列ニ −Ｘ−Ｂにより特徴づけられ且つ＼■：Ｃ因子型凝固活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡが容易に作製される。式Ａ−Ｘ−Ｂにおいて、Ａは＼■：Ｃ因子の全長配列（例えば実質的に表■に示すもの）のＡｌａ　−１からＡｒｇ−３７２までの４１Ｊペプチド配列から成るタンパク質領域を表す。Ｂは■：Ｃ因子の全長配列（例えば表■に示すもの）の５ｅｒ−１６９０からＴｙｒ　−２３３２まテノホＩＪｓプチト９配列から成るタンパク質領域を表す。Ｘは■：Ｃ因子の全長配列（例えば表１に示すもの）のＡｒｇ−３７２から５ｅｒ−１６９０までの配列中に含まれるアミノ酸配列と実質的に同じ０〜１３１６個のアミノ酸から成るタンパク質領域を表す。Ｘのアミン末端はペプチド結合を介してＡのカルボキシ末端に共有結合され、そしてＸのカルボキシ末端はＢのアミン末端に同様に結合されることを理解すべきである。しかしながら、Ｘが０個のアミノ酸を表す場合は、Ａのアミン末端がペプチド結合によりＢのカルボキシ末端に直接共有結合されてＡｒｇ−３７２：Ｓｅｒ−１６９０縮合体を形成することをさらに理解すべきである。

本発明のタンパク質には、とりわげＸが■：Ｃ因子の全長配列（例えば表１に示すもの）のＡｒｇ−３７２からＡｒｇ−７４０までの配列中に含まれるアミノ酸配列と実質的に同じ０〜３６７個のアミノ酸のはプチド配列から成る場合の式Ａ −Ｘ−Ｂのタンパク質が含まれる。

上述したように、本発明のそれぞれの変異型をコードするＤＮＡ配列は、ヒト■ ：Ｃ因子またはその欠失類似体をコードするＤＮＡ配列の慣用的な特定部位突然変異誘発により作製される。

このような突然変異誘発法にはシーラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０　：　６４８７〜６５００（１ｇＢ２）　；　Ｍｅｔｈｏａｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１００　：　４６８〜５００（１９８３）　；およびＤＮＡ且：４７９〜４８８（１９８４）に記載される一本鎖ＤＮＡを使用するＭ１３系、およびモリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　、　６３６〜６３９　（１９８４年７月）に記載されるヘテロ二本鎖ＤＮＡを使用する方法が含まれる。例えば、アルギニンコドンをイソロイシンコドンに変検するために、上記方法に従って使用されるオリゴヌクレオチドの例を表■に示す。もちろん、本発明のそれぞれのタンパク質をコードするＤＮＡは、適切に選択したオリゴヌクレオチドを使用する特定部位突然変異誘発により同様に作製し得ることを理解すべきである。

本発明の変異型をコードする新しいＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞内での発現のために適当なベクターに導入される。一時的にトランスフェクションされた、または安定して形質転換された宿主細胞により生産された凝固活性は、血漿試料用の標準検定法を使用して測定しうる。

表■：オリゴヌクレオチドの例２、ＣＡＴ　ＣＡＡ　ＡＴＡ　Ｃ，ＡＡ　ＡＴＡ　※（１）３、ＣＧＣＣＡＴ　ＣＡＡ　ＣＧＧ　ＡＡＣＡＴＡ　Ｒ１５４９−−→ＮＡＣＴ　ＣＧＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ４、ＣＡＡ　Ｃ（Ａ　ＡＡＣＡＴＡ　ＡＣ※（３）５、ＧＣＣＡＴＴ　ＧＡＡ　ｃｃＡＡ’ｒｃ　ＡＧＣＲ７４０−−−−＋　ＩＴＴＣ：　ＴＣＣＣＡＧ　− ６、ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＡＴＣＡＧＣＴＴＣ※（５）７、Ｇ　ＴＴＴ　Ａ、ＴＣＣＡＡ　ＡＴＴ　ＡＴＣＲ３７２−−−→■ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＧＣＣＡＡＧ□ ８、ＣＡＡ　ＡＴＴ　ＡＴＣＴＣＡ　ＧＴＴ　※（７）１０、ＧｋＡ　ＣＴＡ　ＡＡＧ　ＡＴＣＡ、ＡＡ　※（９）１１、ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＣＡＧ　ＡＧＯＧＣＧ　ＡＡＡ　Ｒ１６３ｇ　−−−＋　ＫＡＧＣＴＴＴ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣｌ　２、ＡＧＣＣＣＣＡＡＡ　ＡＧＣＴＴＴ　※συ１３、ＣＡＡ　ＣＧＴ　ＡＧＴ　ＡＡＧ　Ａ’ｌ旦ＧＣＴ　Ｒ１３１３−−→ＩＴＴＣＡＡＡ　ＣＡＡ　ＴＴＣ ※　カッコ内に示したオリゴヌクレオチドにより生じた突然変異誘発現象なスクリーニングするために使用した。置換用アミノ酸のコドンには下線が施されている。当業者が認めるように、オリゴヌクレオチドは１個以上のアミノ酸を欠失させるために、あるいは所望の位置に異なる（置換用）アミノ酸を挿入するために、それぞれオリゴヌクレオチド中の１個以上のコト９ンを欠失させることにより、あるいは所望アミノ酸のコドンを代わりに使用することにより容易に構築できる。他の突然変異誘発用オリゴヌクレオチドは、所望部位にわたる約２０〜５０ヌクレオチド配列に基づいて、変俟を希望するもとのゴドンの置換または欠失により考案することができる。

ここに記載の真核細胞発現ベクターは、当業者によく知られた手法を用いて合成される。細菌レプリコン、選択遺伝子、エン、ハンサー、プロモーターのようなベクターの諸成分は天然源から得られるか、または既知方法により合成しうる。

カラツマ７　（Ｋａｕｆｍａｎ　）ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｘ、　、　１５９　：　６０１〜６２１（１９８２）：カウ７？ン、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ、ｄ、、Ｓｃｉ、　８２　：　６８９〜６９３（１９８５）を参照されたい。本発明の変異型を生産するのに有用な真核細胞発現ベクターはまた誘導プロモーターを含むことができ、また当分野で知られるような誘導発現系でありうる。

宿主としては形質転換細胞株を含む確立された細胞株が適している。通常の二倍体細胞、−次組織ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養がら誘導される細胞株、ならびに−次移植片（造血幹細胞のような比較的未分化の細胞を含む）も適している。細胞は選択遺伝子が優先的に作用する限り、その選択遺伝子に遺伝子型欠陥が存在する必要はない。

宿主細胞は好ましくは確立された哺乳動物細胞株であるだろう。慣用方法によるベクターＤＮＡの染色体ＤＮＡへの安定した組み込みのために、そして組み込まれたベクターＤＮＡのその後の増嘔のために、ＣＨＯ（チャイニーズ　ハムスター卵巣）細胞が目下のところ好適である。また、ベクターＤＮＡがウシ乳頭腫ウィルスゲノム〔ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）ら、Ｃｅ１ｌ、３６　：　３９］〜４０１（１９８４）を参照〕の全部または一部を含む場合は、安定したエビソーム因子としてＣ１２７マウス細胞のような細胞株に保有させることができる。その他の使用可能な哺乳動物細胞株にはＨｅＬａ、　ＣＯ３−１サル細胞、Ｂｏｗｅｓ細胞のような黒色腫細胞株、マウスＬ　−９２９細胞、５ｗ１ｓｓ、　Ｂａ１ｂ −ｃまたはＮ工Ｈマウスカら誘導される３Ｔ３細胞株、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株などが含まれる。

その後、安定な形質転換細胞は標準的な免疫検定または活性検定により凝固活性産物の発現についてスクリーニングされる。

凝固活性タンノξり質をコードするＤＮＡの存在は、サザンブロッティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）のような標準方法により検出できる。発現ベクターＤＮＡを適当な宿主細胞（例えばＣ０８−１サル細胞）中へ導入した後の数日間にわたる凝固剤遺伝子の一時的発現は、選択することなく培地中のタンパク質の活性検定または免疫検定により測定される。

慣用手段によるＤＮＡの発現後、生産された変異型は既知方法により回収・精製され、かつ／また物理化学的、生化学的および／または臨床的ノミラメ−ターに関して同定される。

哺乳動物宿主細胞により生産された野生型全長■：Ｃ因子は、〜９０ＫＤ１〜７６ＫＤオヨび〜６９ＫＤフラグメントと共に〜２ｏｏＫＤのＮ末端重鎖および〜８０ＫＤのＣ末端軽鎖により特徴づけられる。トロンビンで処理すると、次のもの：すなわち〜１８０ＫＤ（汚れ）、〜６９　ＫＤ　、　〜６５　ＫＤ　（Ｘａ因子で消化後）、〜５ｏＫＤ、〜４５ＫＤおよび〜４３ＫＤ　フラグメントを含むポリＲプチト９フラグメントがＳＤＳ　−ＰＡＣ，Ｅにより観察された。活性物質は〜５０ＫＤと〜９ＱＫＤポリペプチドの複合体であると考えられ、恐らく〜４３ＫＤポリはプテドとさらに会合していると思われる。９ＱＫＤ部位と７５ＫＤ部位の間で欠失された欠失類似体の場合は、一本領ボリはプチドが約〜１８０ＫＤまでの重鎖および〜７６ＫＤの軽鎖と共に〜２００ＫＤまでの分子量として観察される。トロンビン消化後、末端切断Ｂ−ドメインは〜６９ＫＤ、〜６５ＫＤ　（Ｘａ消化後）、〜５ＱＫＤ、〜４．５ＫＤおよび〜４３ＫＤのポリペプチドと共に〜９２ＫＤまでの分子量として観察される。本発明に従ってタンパク質の１個所以上の切断部位での特定加水分解を部分的にまたは完全に排除するよう突然変異誘発させた＼■：ｃ因子型コード化ＤＮＡ配列な哺乳動物宿主細胞中で発現させることにより、本発明は以下の特徴を有するホリ投プチドから成る活性＼■：ｃ因子型凝固剤組成物を初めて提供する：（ａ）　−’プチド配列が７５ＫＤ部位で切断されないように修飾された態様における、トロンビン消化前および消化後の〜７６ＫＤｒｆ　＋）ペプチドの実質的不在；（１！’）　−’プチド配列がＸａ部位（Ａｒｇ−１７２１）で切断されないように修飾された態様における、χａ因子処理前および処理後の〜５５ＫＤフラグメントの実質的不在；（Ｃ）″！プチド配列カ９０ＫＤ部位（Ａｒｇ−７４０）で切断されないように修飾された態様における、トロンビン処理前および処理後の〜９ＱＫＤフラグメントの実質的不在；（ｄ）　ペプチド配列がＡＰＣ部位（Ａｒｇ−３３６）で切断されないように修飾された態様における、トロンビン処理前および処理後の〜４ＱＫ、Ｄフラグメントの実質的不在；および（＋り２個所以上の切断部位での特定加水分解が妨げられた態様における、上記（α）〜（ｃｔ）の組合せ。

本発明のタンパク質はヒト＼■：ｃ因子に対するモノクローナル抗体と結合することが分かり、こうしてこの種の抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、および／または慣用のタンパク質精製法により回収・精製された。さらに、これらの化合物は〜■：ｃ因子様凝固活性を保有する。

本発明化合物は当分野で知られた方法により非経口的に許容されるビヒクルおよび／または１種以上の希釈剤を用いて薬学的に許容される製剤に処方される。

非経口投与に適する本発明の薬学的製剤は、有利には、受容者の血液と等張付の液剤を生ずるように滅菌溶液の添加により用時調製しうる滅菌凍結乾燥タン・ξ り質製剤から成る。この製剤は単位用量容器または多重用量容器（例えば密閉アンプルやバイアル）で提供される。それらの使用法は効力が適切に調節されたヒＩＩＩ因子のそれと類似しているだろう。

本発明は以下の実験実施例および方法によりさらに理解されるだろう。しかしながら、これらの実施例および方法は単に例示するためのものであって、請求の範囲に記載される本発明の真の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。

プラスミドの作製ｔｍ因子ｃ　ＤＮＡの突然変異誘発は、異なるベクター間で塩基配列を様々に変える労力を最小限にするため、発現ベクター中で直接行った。一般に、突然変異誘発のために採用された方法はモリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）の方法を改変したものであった。この方法は＼■因子発現プラスミド中に有利な唯一の制限部位をもつプラスミドを作製することにより促進される。以下は唯一のＥＣ０ＲＶ、Ｈｐａ工、Ｃ１ａＩおよびＸｂａＩ制限部位をもっ〜■因子発現プラスミドの作製を示す。プラスミ）”ｐＭＴ２はＩ）ＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ　消化により得られ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＡＴＣＣ６７１２２として寄託されたＥｃｏＲＩ消化はｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入物を切除して線状のｐＭＴ２をもたらし、この線状ｐＭＴ２は連結して大腸菌ＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へ形質転換するために使用できる。プラスミ）ｌ”　ｐＭＴ２　ＤＮＡは慣用方法により作製しうる。ｐＭＴ２■はその後ｐＭＴ２をＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化し、消化ＤＮＡをＤＮＡ　＄リメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、そしてＣ１ａリンカ−（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ社製、　ＣＡＴ（Ｘ；ＡＴＧ）を連結することにより作製された。これはｐＭＴ　２のｓｖ４　Ｑ複製起点およびエンハンサ−配列に近℃・Ｈｌｎａ　ＩＩＩ部位から始まる塩基２１７１〜２４２１を除去する（１１）ＭＴ２の０１ａＩ誘導体）。■因子ｃＤＮＡはｐｓＰｓ４〜■から５ａＩＩで切り取り、’ｒ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端となし、ＥｃｏＲＩ　７ダプター（ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴ）を付加した。

ＥｃｏＲＩアダプターを付加した＼■因子ｃＤＮＡはその後ｐＭＴ　２の０１ａＩ誘導体のＥｃ　ｏＲＩ部位に連結した。得られたプラスミドはｐＭＴ２−〜・ ■と名づけだ。

全長■因子発現プラスミドをＣＯ８−１細胞に導入すると、低レベルの〜■因子が得られる。＼■■子コート９領域の中間領域を欠失させることにより（上記の米国特許出願第７２５３５０号および関連ＰＣＴ出願を参照）、トロンビン活性化を含めた天然型）■因子と非常に類似した特性を有する〜■因子が比較的高レベルで得られた。従って、〜■■子切断部位における突然変異の分析は、より効率的に発現されるこれらの欠失肪導体の突然変異を研究することにより促進された。こうして、■因子発現プラスミド１）ＭＴ２＼徂の欠失体が、ｐＤＧＲ−２からＫｐｎＩ部位（〜■因子ｃＤＮＡの１９６１位）〜Ｘｂａ工部位（〜■因子ｃＤＮＡの７０９６位）を取り出し、それをｐＭＴ２■のＫｐｎＩ　−ＸｂａＩフラグメントに連結することにより作製された。この最終誘導体はｐＭＴ２−　ＤＧＲである。

突然変異誘発＼■因因子発現プラスミド圧おける特定部位の突然変異誘発は以下の工程を包含する：ｌ）　プラスミドｐＭＴ２−　ＤＧＲはＣ１ａＩで線状化し、ウシｐ５ホス７プターゼで処理し、そして０．８　％低融解温度トリスー酢酸アガロースゲル上で分離した。その後、その線状化バンドを二酸化ケイ素に吸着させることにより抽出し、トリス−ＥＤＴＡで溶出した。

２）　ｐＭＴ　２−　ＤＧＨの第２０ツトは以下で述べるようにＫｐｎＩおよびＸｈｏＩまたはＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、０．８％低融解温度アガロースゲル上で分離し、そして上記の如く抽出した。

３）　これらのプラスミド又れぞれ１〜ずつを混合し、容量を１８μｌに調整して２Ｎ　ＮａＯＨ２，０μｌを加えた。

４）　この混合物を室温で１０分間変性させ、その後０．０２ＮＨＣｌおよび０．１Ｍ）リス−Ｈ（Ｊ　（ｐＨｇ、ｏ　）から成る溶液１８０μｇで中和した。

５）　このヘテロ二本鎖混合物４０μｌに突然変異誘発性のリン酸化オリゴヌクレオチド２０ピコモルを加えた。

６）　この混合物を６８℃の加熱ブロック中に９０分間入れた。

インキュイージョン後、この混合物を室温へ徐々に冷却させた。

７）　それぞれの突然変異誘発反応に対して、ペテロ二本鎖オリゴヌクレオチド混合物を４０μｌ使用した。この反応は２Ｄ１ＭＭ９０１２．１　ｍＭβ−メルカプトエタノール、４００μＭＡＴＰ、１００／４デオキシヌクレオチド三リン酸、３〜４単位／μｇの大腸菌ＤＮＡ　ｌリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗフラグメント、および４００単位／μｌの’ｒ４　ＤＮＡリガーゼ中で行った。

８）　この反応は室温で１０分間、次に１６℃で一晩インキーイーションした。

９）　この反応はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により終結させ、得られた沈殿物を７０％エタノールで洗って、滅菌８２０１０μで中に再懸濁した。

１０）その後ＤＮＡを使用してコンピテ：／　）　ＨＢ　１０１またはＤＨ−５細菌を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーは５　ｘ　ＳＳＣ。

０．１％ＳＤＳ、　５ｘＤｅｎｈａｒａｔ試薬および１００μ９／ｍ＃性サケ精子ＤＮＡ中でＩ　Ｘ　１０６ｃｐｍ／ｍｌの３２ｐ−標識スクリーニングオリゴヌクレオチド９を用いてスクリーニングした。

１１）フィルターはオリゴヌクレオチドプローブの計算した融解温度より５℃低い温度で５ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにより洗浄した。

１２）　ＤＮＡはポジティブにハイブリダイズするクローンから調製し、初めに異なる制限酵素での消化およびアガロースゲル電気泳動により分析した。ＤＮＡをニトロセルロースに移行させ、フィルターを調製し、そして突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが正しいフラグメントに導入されたことを確かめるためにスクリーニングプローブとハイブリダイズさせた。

１３）その後ＤＮＡを太陽菌に形質転換させ、アンピシリン耐性コロニーはスクリーニングオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。

１４）最終突然変異はＤＮＡ塩基配列決定により確かめた〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　：５４６３〜５４６７（１９７７）を参照〕。

実施例　１７６ＫＤ切断部位の変更：特定切断部位の変更は、切断部位のアミン末端側の塩基性アミノ酸を変えることにより達成される。アミノ酸置換の選択はタンパク質の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）および／または機能に影響を及ぼしうるので、この点に関しての最良の選択は保存的変更である。若干のプロテアーゼ（例えばトロンビン）はアルギニンに対して非常に特異的である。従って、アルギニンのりシンへの変更は有意に切断を阻害する。より劇的な修飾（例えばインロイシンへの変更）はタンパク質加水分解に対する抵抗性を保証するであろう。７６Ｋａの切断に関与するプロテアーゼは知られていないので、１６４８位のアルギニンからインロイシンへの変更を行った。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは表Ｈの３９−　ｍａｒ、　Ａ６１であった。スクリーニングヌクレオチビは表Ｈの１５−ｍａｒ　、Ａ６２であった。突然変異誘発はｐＭ’ｒ　２−　ＤＧＲノＫｐｎＩ　−ＸｂａＩ　７ラグメントおよびｐＭＴ２−　ＤＧＲのＣｄａＩ消化線状体を用いて上記のように実施した。得られた変異体はＤＮＡ塩基配列決定（サンガーらの上記文献参照）により正しいことを証明した。ＤＮＡ（ｐｃｓＭ　１６４８）は塩化セシウム中でバンド化して調製し、前述の如＜ｃｏｓ−１サル細胞をトランスフェクションするために使用した（カウフマン、ＰＮＡＳ、照：　６８９．１９８５を参照）。

トランスフェクションの６０時間後、調整培地の試料を採取して、カビコアテスト発色検定法（Ｋａｂｉ社）により＼狙因子活性について、またはトロンビン活性化の前および後に＼・■因子欠損血漿を凝血させる能力（活性化部分トロンボプラスチン時間；　ＡＰＴＴと略す）につ（・て調べた。活性検定から得られた結果を表ＩＩＩに示す。７６Ｋａ切断部位の突然変異は調整培地中に生産された＼■因子の活性を低下させなかった。さらに、トロンビン活性化係数に全く変化がなかった。この突然変異が実際に７６Ｋａ切断部位を破壊したことを立証するために、トランスフェクションした細胞を３５３−メチオニンで６時間標識し、その後調整培地と細胞抽出物を免疫沈降および５ＤＳ−４１Ｊアクリルアミドゲル電気泳動による分析のために調製した。これらの結果は、Ａｒｇの工ｌｅへの変更が細胞からの＼■因子変異型の合成または分泌に影響を与えないことを証明した。トロンビン消化後の放射性標識タンパク質の分析は６ｇＫａ、および５０と４０Ｋａフラグメントの通常の出現を示した。しかしながら、生産された主なＳＩ因子物質は７６Ｋｄ部位での切断に対する抵抗性の結果として一本鎖分子であった。この結果は、一本領■因子が天然分子と同様に活性であることを示した。一本領＼■：Ｃ因子変異型は、それらがより均質な形で生産され且つ天然ヒトまたは他の組み換え〜■：Ｃ因子タンパク質に比べて改善された薬物反応速度論的プロフィールを有するという点で優れている。

実施例　２７６Ｋａ切断部位でのＡｒｇ→ＩＪｅ変更に代わるべき手段は、切断を遮断するためにＡｒｇに隣接してアスパラギンのＮ−結合グリコシル化部位を導入することであった。この変更の利点は、得られるタンパク質が炭水化物成分を有するために修飾アミノ酸が免疫反応を起こすのを阻止しうるということである。こうして、表Ｈの突然変異誘発性オリゴヌクレオチド腐３が合成された。この突然変異誘発現象はＧＪｎ　−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−１１ｅ　−Ｔｂｒ配列をＧｌｎ　−Ａｒｇ−Ａｓｎ　−Ｉ’ｌｅ　−Ｔｈｒ配列に変換した。突然変異のスクリーニングのために使用したオリゴヌクレオチドは表■の１４−ｍθｒ、　／％４であった。この突然変異のために、突然変異誘発は一本鎖ファージＭ１３ばフタ−にクローニングされた天然の非欠失〜■因子ｃＤＮＡを用いて実施した。全＼■因子ｃＤＮＡを含む５ａＩＩフラグメントはＭ１３起点ばフタ−ｐｃｃ２のＸｈｏＩ部位へ挿入した。ｐｃｃ　２はアンピシリン耐性、大腸菌複製起点、Ｍ１３複製起点およびＸｈｏＩ部位含有ポＩＪ　リンカ−を含むプラスミドである。その他の同様の市販プラスミドももちろん使用できる。リン酸化（２０ピコモル）突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは１μｇの鋳型と共に２０ｍＭ）リス−ＨＣ１，１０ｒｒＭ　Ｍ９Ｃ１ｌ　２．５０　＋ｎＭ　ＮａＧ４１　ｍＭジチオトレイトールを含む１０μｌ中で６５℃にて１０分間アニーリングさせた。この反応を徐々に冷却させ、１０μｇの溶液Ｂ（２０ｍＭ）リス−Ｈｃｌ　（ｐＨ７，ｓ　）、１０ｍＭＭ９Ｃ１２、ｔｏｍＭジチ第１・Ｉ／イトール、１　ｍＭずツノヌクレオチ）、′ニリン酸（ａ、ＡＴＰ、ａｃＴＰ、ａｃＴＰおよびａＴＴＰ　）、１０　ｍＭ　ＡＴＰ。

４００単位／ｍｌリガーゼ、および３〜４単位／μｌのＤＮＡポリメラーゼエのＫｌｅｎｏｗフラグメント〕、２３℃で５分インキュベーションし、次いで１６ ℃で一晩インキユイーションした。この反応はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により終結させた。ＤＮＡは１０１１１の１０ｍＭ）リス− Ｈｃｇ　（７’８７．５）およびＩ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再懸濁し、１μｌを採取して大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。

ＤＮＡ、（Ｃ：ＳＭ　−１６４，９）は調製して上記のようにＣＯ３−１細胞にトランスフェクションした。ｃｏｓ　−１＜ｍ胞のトランスフェクション後、前のように調整培地を検定し、この培地はｐ、Ｍ’ｒ２中の野生型＼■：Ｃ因子ｃＤＮＡにより生産されたものと類似した活性を比較的低レベルで含有することが分かった。上記のような３５３−メチオニン標識タンパク質の分析は、Ｎ−結合糖の存在が切断を一部阻止することを示した。この特定タイプの突然変異の、切断を阻止して分泌を可能にする能力は、恐らくタンパク質の構造に依存して個々のタンパク質配列により変化するで９０Ｋｄ切断部位の突然変異ニ７４０位でのアルギニンのインロイシンへの突然変異は表■のオリゴヌクレオチド屑５を用いて行った。正しい突然変異は表■の１５−　ｍａｒＡ　６を用いてスクリーニングした。突然変異誘発はｐＭＴ　２−　ＤＧＲのＫｐｎニー　ＸｂａＩ　７ラグメントおよびｐＭＴ２−ＤＧＲのＣＪａ工消化線状体を用いて実施した。得られたＤＮＡ（Ｏ３１，４−７４０）は上記のように調製してトランスフェクションを行った。試料を上記のように検定し、Ｃ３Ｍ−７４０はｐＭ’ｒ２−ＤＧＲよりも低い活性を生ずることが分かった。３５３−メチオニン標識細胞抽出物および調整培地の免疫沈降ならびにゲル電気泳動による分析は、〜■因子の合成、分泌、活性およびトロンビン活性化がこの切断部位の変更により劇的に改変されなかったことを示した。精密な検査によりＣ３Ｍ−７４０の分泌レベルはあまり効率的でないことが見出された。こうして、ｇＯＫａ切断部位の切断は＼■因子活性にとって不可欠であるという訳ではない。

実施例　４３７２位でのトロンビン切断部位の突然変異：Ａ、３７２位でアルギニンをインロイシンに変換するための突然変異誘発性オリゴヌクレオチド９は表Ｈのオリゴヌクレオチド屑７であった。正しい突然変異を同定するのに使用したオリゴヌクレオチドは表■の腐８であった。突然変異誘発はｐＭＴ２−　ＤＧＲのＫｐｎＩ −ＸｈｏＩ　７ラグメントおよびｐＭＴ２−　ＤＧＲのＣ１ａＩ消化線状体を用いて実施した。得られたプラスミドＤＮＡ（Ｃ８Ｍ−３７２）は上記のように調製してＣＯ３−１細胞にトランスフェクションした。試料を上記の如く検定した。結果は、３７２切断部位の破壊が＼■因子活性を９０％以上低下させることを証明した。その上、トロンビン処理は活性を回復させない。別の分析は〜■因子ノ修飾型が適切に合成されて分泌されたことを示した。

Ｂ、に−３７２変異型を作るために、表■のオリゴヌクレオチド９／１６７および腐８の類似体（ＩｃｅコドンＥ匹の代わりにＬｙｓコドン例えばＡＡＡを含む）を用いて実施例４Ａを繰り返した。

実施例　５Ｒ−３３６位でのトロンビン切断部位（提案された活性化プロティンＣ切断部位）の突然変異：Ａ、３３６位でアルギニンをリシンに変換するための突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは表■のオリゴヌクレオチド／ＶＬ９であった。突然変異をスクリーニングするために使用したオリゴヌクレオチドは腐１０であった。この突然変異誘発はｐＭＴ′２−ＤＧＦｉのＫｐｎＩ　−ＸｈｏＩ　７ラグメントおよびｐＭ’ ｒ２−　ＤＧＲのＣ１ａＩ消化線状体を用いて実施した。得られたＤＮＡ　（Ｃ３Ｍ−３３６）は上記のように調製してトランスフェクションを行い、得られた試料を検定した。その結果は活性の増加および通常のトロンビン活性化を示した。この修飾＼■因子はその合成または分泌に影響を及ぼさなかった。活性が増加した原因はｃｏｂａｓ検定において提案されたＸａ切断の結果としての不活化が低下したためであると考えられる。従って、この変更は■因子のより安定した形を提供すると思われる。

Ｂ、ｌ−３３６変異型を作るために、表■のオリゴヌクレオチド腐９および／％１０の類似体（Ｌｙｓコドン匹の代わりにＩＩｓ　コドン例えばＡＴＣを含む）を使用して実施例５Ａを繰り返した。

こうして作られたニー　３３６変異型はに一３３６変異型と類似した生物学的性質をもっていた。さらに、全長１−３３６およびに−３３６変異型が作られ、これらは対応する欠失変異型と同様の生物学的性質を有することが分かった。

実施例　６６ｇＫａ切断部位の突然変異：Ａ、アルギニンをリシンに突然変異誘発させるためのオリゴヌクレオチドは表■ のＡｌｌであった。スクリーニングオリゴヌクレオチビは表■の１５−ｍｅｒＪ６１２であった。突然変異誘発はｐＭ’ｒ２−　ＤＣ，ＲのＫｐｎＩ　−ＸｂａＩフラ／メントおよびｐＭＴ２−　ＤＧＲの０１ａ　Ｉ消化線状体を用いて実施した。正しい突然変異をもつＤＮＡ　（Ｃ８Ｍ−１５８９）を調製してＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。細胞は上記の如く分析した。結果は６ｇ　Ｋａ切断部位の突然変異がｐＭＴ２−　ＤＧＲから生成したものと同様の活性をもたらすことを示した。従って、我々の６ｇＫａ切断部位におけるアルギニンに代わるリシンの突然変異は〜■：Ｃ因子活性を破壊しない。

Ｂ、ｌ−１６８９変異型を作るために、表■のオリゴヌクレオチド９Ａｌｌおよび４１２の類似体（ＬｙｅコドンＡＡＡの代わりに１１ｅコビン例えばＡＴＣを含む）を使用して実施例６Ａを繰り返した。

驚いたことに、こうして生産されたＩ　−１６８９変異型はｐＭＴ２−ＤＧ〜２労１られた■：Ｃ因子活性の９０チ以下の活性を保有することが分かった。我々の結果は、６９Ｋｄ部位での切断がこの分子を活性化させるのに重要であり且つＡｒｇ　−１６８９のＬｙｅによる置換がこのような切断を排除しないことを示唆して℃・る。

さらに、Ｋ−１６８９変異型は恐ら＜ｔｌ［Ｉ：Ｃ因子活性が遅れて開始され、治療上有用であるだろう。

これらの突然変異の大部分は〜■因子の欠失体（ＤＧＲ）において構築され且つ分析されたものであるが、変更は全長”１１１［因子をコードするＤＮＡを用いて直接行うこともでき、また突然変異を起こした欠失変異型ＤＮＡおよび野生型＼ｌ［ｃ因子コード化ＤＮＡを適当な酵素で消化し、適当なフラグメントな連結させて所望のプラスミドを作製することにより、突然変異を起こした欠失変異型ＤＮＡから全長＼■因子ｃＤＮＡ中に再導入することもできる。

さらに、同様の方法を使用して、■因子ｃＤＮＡ中に複数の突然変異を導入することができる。試験したすべての場合に、我々は突然変異を起こした欠失変異型により得られた結果が対応する全長変異型を用いた場合にも得られ、そして多数のアミノ酸置換を作る結果が個々のアミノ酸修飾について別々に観察された結果に関して加法的であることを見出した。提案されたＡＰＣ切断部位（例えばＲ− ３３６）およびＸａ切断部位（Ｒ−１７２１）の両方の部位にアミノ酸修飾を含む変異型は、不活化に対して抵抗性の特に安定した変異型であるだろう。

表■ 実験１実験２Ｃ８Ｍ−１６４９Ｅ−＋Ｎ　１９６　１０倍ＰＭＴ２＼−■　１８５　１０倍実験３Ｃ３Ｍ　−１６８９Ｒ−＋Ｋ　８８　Ｎ、Ｔ。

ｐＭＴ２−ＤＧＲ１０３Ｎ、Ｔ。

Ｎ、Ｔ、　：試、噛しなかった国際調査報告ｌｎｍｎａむ０Ｃ１１＾ｏが−ｃａＩＩｏｎＮｏ：ＰＣＴＩ−二ｉｓａ１ｒ０１２９９

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトＶＩＩＩ：ｃ因子型凝固活性およびヒトＶＩＩＩ：ｃ因子と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質またはＡｒｇ−３７２とＳｅｒ−１６９０との間で１〜１３１７個のアミノ酸が欠失されたその欠失類似体であって、（ｉ）アルギニン−１６８９がリシンで置換されており、そして／または（ｉｉ）次の群：（ａ）２２０、２２６、２５０、２７９、２８２、３３６、３５９、５６２、７４０、７７６、１３１３、１６４８、１７１９および１７２１位のうち１個所以上のアルギニン；（ｂ）３２５位および３３８位の一方または両方のリシン；（ｃ）３４６、３９５、４０７、１３６４および１３８０位の１個以上のチロシン；および（ｄ）７４１位のセリンから選ばれた１個以上のアミノ酸が欠失されているか、あるいは独立に選ばれた置換用アミノ酸で置換されていることを特徴とする上記タンパク質。
２．２２０、２２６、２５０、２７９、２８２、３２５、３３６、３３８、３５９、５６２、７４０、７４１、７７６、１３１３、１６４８、１７１９または１７２１位のうち１個所以上を包含するトリペプチド配列がＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ（ここでＸはアミノ酸である）から成るトリペプチド配列で置換されている、請求の範囲第１項記載のタンパク質。
３．ＸはＡｒｇでない、請求の範囲第２項記載のタンパク質。
４．請求の範囲第１〜３項記載のタンパク質をコードするｃＤＮＡ。
５．発現調節配列に操作可能な状態で連結された請求の範囲第４項記載のｃＤＮＡを含み、そのｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現しうる宿主細胞。
６．ヒトＶＩＩＩ：ｃ因子型凝固活性およびヒトＶＩＩＩ：ｃ因子と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質またはＡｒｒ−３７２とＳｅｒ−１６９０の間で１〜１３１７個のアミノ酸が欠失されたその欠失類似体であり、アルギニン −１６８９がリシンで置換されており、そして／または次の群：（ａ）２２０、２２６、２５０、２７９、２８２、３３６、３５９、５６２、７４０、７７６、１３１３、１６４８、１７１９および１７２１位のうち１個所以上のアルギニン；（ｂ）３２５および３３８位の一方または両方のリシン；（ｃ）３４６、３９５、４０７、１３６４および１３８０位の１個以上のチロシン；および（ｂ）７４１位のセリンから選ばれた１個以上のアミノ酸が欠失されているか、あるいは独立に選ばれた置換用アミノ酸で置換されていることを特徴とする上記タンパク質を生産する方法であって、請求の範囲第５項記載の指主細胞を、上記タンパク質を生産させる条件下で培養することから成る方法。
７．請求の範囲第６項記載の方法により生産されたタンパク質。
８．有効量の請求の範囲第１項記載のタンパク質を非経口的に許容されるビヒクルまたは希釈剤と共に含有してなる血友病Ａを治療または予防するための薬剤組成物。
９．有効量の請求の範囲第７項記載のタンパク質を非経口的に許容されるビヒクルまたは希釈剤と共に含有してなる血友病Ａを治療または予防するための薬剤組成物。
１０．アミノ酸配列：Ａ−Ｘ−Ｂ（ここで領域Ａは実質的に表Ｉに示したＡｌａ−１からＡｒｇ−３７２までのポリペプチド配列を表し；領域Ｂは実質的に表Ｉに示したＳｅｒ−１６９０からＴｙｒ−２３３２までのポリペプチド配列を表し；そして領域Ｘは表ＩのＡｒｇ− ３７２からＡｒｇ−７４０までの配列内に含まれるアミノ酸配列と実質的に同じ０〜３６７個のアミノ酸から成るペプチド配列を表し；その際Ｘのアミノ末端はＡのカルボキシ末端にペプチド結合を介して共有結合され、そしてＸのカルボキシ末端はＢのアミノ末端に同様に結合される）により特徴づけられるＶＩＩＩ：ｃ因子型凝固活性を有するタンパク質。
１１．請求の範囲第１０項記載のタンパク質をコードするｃＤＮＡ。
１２．発現調節配列に操作可能な状態で連結された請求の範囲第１１項記載のｃＤＮＡを含み、そのｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現しうる宿主細胞。
１３．アミノ酸配列：Ａ−Ｘ−Ｂ（ここで領域Ａは実質的に表Ｉに示したＡｌａ−１からＡｒｇ−３７２までのポリペプチド配列を表し；領域Ｂは実質的に表Ｉに示したＳｅｒ−１６９０からＴｙｒ−２３３２までのポリペプチド配列を表し；そして領域Ｘは表ＩのＡｒｇ− ３７２からＡｒｇ−７４０までの配列内に含まれるアミノ酸配列と実質的に同じ０〜３６７個のアミノ酸から成るペプチド配列を表し；その際Ｘのアミノ末端はＡのカルボキシ末端にペプチド結合を介して共有結合され、そしてＸのカルボキシ末端はＢのアミノ末端に同様に結合される）により特徴づけられるＶＩＩＩ：ｃ因子型凝固活性を有するタンパク質の生産方法であって、請求の範囲第１２項記載の宿主細胞を、上記タンパク質を生産させる条件下で培養することから成る方法。
１４．有効量の請求の範囲第１０項記載のタンパク質を非経口的に許容されるビヒクルまたは希釈剤と共に含有してなる血友病Ａを治療または予防するための薬剤組成物。