JP2634323B2

JP2634323B2 - Ｔｃｆ‐▲ｉｉ▼のアミノ酸配列をコードするｄｎａを含むプラスミド，形質転換細胞及びこれを用いて生理活性物質を生産する方法

Info

Publication number: JP2634323B2
Application number: JP3511690A
Authority: JP
Inventors: 伸行島; 侃二東尾; 雅哉永尾; 文子大垣; 博昭高岡; 英資津田
Original assignee: YUKIJIRUSHI NYUGYO KK
Current assignee: YUKIJIRUSHI NYUGYO KK
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-15
Publication date: 1997-07-23
Anticipated expiration: 2012-07-23
Also published as: EP0539590B1; ATE178354T1; KR920702417A; EP0539590A1; US5328836A; DE69131069T2; CA2066618C; CA2066618A1; KR0153009B1; ES2132087T3; DE69131069D1; DK0539590T3; EP0539590A4; WO1992001053A1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、ヒト線維芽細胞由来の新規な糖蛋白質（以
下、TCF−IIという）のアミノ酸配列をコードするDNAを
含むプラスミド、このプラスミドで形質転換した細胞及
びこの形質転換体を用いて生理活性物質を生産する方法
に関する。

本発明のTCF−IIは、肝細胞増殖因子、腫瘍細胞障害
活性因子等として医薬あるいは生化学的もしくは薬理作
用の試薬等の分野で有用である。

背景技術ヒト由来の線維芽細胞が産生する生理活性物質、例え
ば腫瘍細胞障害因子としてはβ−インターフェロンが代
表的な物質である。これは線維芽細胞を培養後、細胞を
ハーベストしついでポリＩ−ポリＣやセンダイウイルス
で刺激すると細胞外に分泌される糖蛋白質であり、抗ウ
イルス、抗腫瘍効果の他に、種々の生理活性を示すこと
が明らかになっている。特開昭58−146293号公報には、
CBFと呼ばれる線維芽細胞由来の腫瘍細胞障害性糖蛋白
質が開示されている。特開昭61−33120号公報にはヒト
組織由来の線維芽細胞培養液より抽出される分子量35,0
00〜45,000の腫瘍増殖阻害因子（INF）が開示されてい
る。又、特開昭61−56131号公報には線維芽細胞より抽
出される腫瘍壊死因子様物質が、特開昭61−1872号公報
には、線維芽細胞由来壊死因子FNFが、特開昭62−10302
1号公報には、動物線維芽細胞から産生される分子量40,
000〜60,000、等電点5.0±0.5の細胞障害作用を有する
生理活性物質がそれぞれ開示されている。さらに、特開
昭64−10998号公報には、ヒト由来の線維芽細胞の培養
上清から得られる分子量36,000±1,000、等電点10.5以
上の腫瘍細胞障害因子の全アミノ酸配列およびこれをコ
ードするcDNA配列が開示されている。

発明の開示本発明者らは、ヒト由来の線維芽細胞の培養上清に含
まれる生理活性物質について検索を進めた結果、従来報
告されている物質とは分子量、等電点等において異なる
種々の生理活性を有する糖蛋白質を見出して特許出願し
た（RCT/JP90/00314）（国際公開番号WO90/10651国際公
開日1990年９月20日）。

このヒト線維芽細胞由来の新規な糖蛋白質（TCF−I
I）は下記に示す物理化学的特性により特定される糖蛋
白質である。

a.分子量;SDS電気泳動法による分子量測定で、非還元で
は78,000±2,000又は74,000±2,000の分子量であり、還
元した場合、52,000±2,000の共通バンドＡと、30,000
±2,000のバンドＢ及び26,000±2,000のバンドＣの２本
のバンドを示す。

b.等電点;7.4〜8.6 c.熱安定性;60℃、10分間の加熱によっても安定 d.pH安定性;pH6〜９の範囲で安定 e.糖鎖；コンカナバリンＡ（ConA）セファロースに吸着
性を示す。

f.生理活性;KB細胞、HeLa細胞、Ｌ−929細胞の増殖を抑
制し、IMR−90細胞の増殖を抑制しない。

g.抗体との反応性；抗TNF抗体、抗リンホトキシン抗
体、抗インターフェロンβ抗体によって障害活性が中和
されない。

さらに、本発明のTCF−IIは、下記のＮ末端アミノ酸
配列及びアミノ酸組成を有するものが好ましい。

h.N末端アミノ酸配列；上記Ｂ及びＣがバンドＡのサブ
チェーンとなっており、又バンドＡはＮ末端アミノ酸が
ブロックされている。サブチェーンＢ及びＣは共に以下
のＮ末端アミノ酸配列をもつ； Val−Val−Asn−Gly−Ile−Pro−Thr− または Val−Val−Asn−Gly−Ile−Pro−Thr−Ｘ−Thr−Asn−I
le−Gly−Ｘ−Met−Val−Ser−Leu− ただしＸは未同定を意味する。

i.アミノ酸組成；塩酸で加水分解すると次のアミノ酸組
成を示す。

A.A nmol mol％ Asp 10.375 12.97 Glu 7.750 9.69 Ser 5.000 6.25 Gly 7.250 9.06 His 3.000 3.75 Arg 5.375 6.72 Thr 5.125 6.41 Ala 2.625 3.28 Pro 2.625 7.03 Tyr 3.875 4.84 Val 4.125 5.16 Met 1.875 2.34 Cys ND − Ile 5.000 6.25 Leu 4.875 6.09 Phe 2.250 2.81 Trp ND − 合計 80.000 100（99.99）さらに、本発明者らはTCF−IIのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を決定し、上記特許出願明細書中に記載
した。すなわち、本発明者らは、下記に示す手順に従っ
て、ヒト胎児肺由来線維芽細胞（IMR−90）から、TCF−
IIをコードしたmRNAを精製した後、その遺伝子をクロー
ニングして塩基配列を決定し、その塩基配列からアミノ
酸配列を推定した。

（１）IMR−90細胞からのポリ（Ａ）⁺RNAの抽出５％のNew born calf serum（NBCS）を添加したダル
ベッコ改変イーグル（DME）培地を用いて培養したIMR−
90細胞２×10⁸個から、グアニジンチオシアネート−塩
化セシウム法（Biochemistry18 5294−5299（1979））
によりトータルRNAを調製した。IMR−90細胞に6Mグアニ
ジンチオシアネート、5mMクエン酸ナトリウム、0.5％ザ
ルコシール、0.1Mβ−メルカプトエタノール溶液28mlを
添加し、ホモジィナイズした。4mlの5.7M塩化セシウ
ム、0.1M EDTA溶液をポリアロマ−遠心管に入れ、その
上にホモジィナイズ溶液7mlをのせ、ベックマン超遠心
機40Tiローターで35,000rpm,20℃、16時間超遠心分離を
行った。遠心後、沈澱を95％エタノールで２回洗浄し、
200μｌの10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）,1mM EDTA溶
液で65℃、５分間加熱することにより溶解し、トータル
RNA溶液とした。トータルRNAから、オリゴ（dT）セルロ
ースカラムクロマト法により、ポリ（Ａ）⁺RNAを精製し
た。オリゴ（dT）セルロースカラムを10mMトリス塩酸緩
衝液（pH7.4）,1mM EDTA,0.5M塩化ナトリウム、0.05％S
DSで平衡化し、トータルRNAを通し、吸着画分を10mMト
リス塩酸緩衝液（pH7.4）,1mM EDTA,0.05％SDSで溶出
し、ポリ（Ａ）⁺RNA溶液とした。

（２）cDNAの合成（１）で得たpoly（Ａ）⁺RNAを鋳型として、cDNA合成
キット（ファルマシア社）により二本鎖cDNAを作成し、
EcoR Iアダプターを付加した。作成方法は同社のプロト
コールに従ったが、一本鎖cDNAの合成の際、トリ骨髄芽
球症ウイルス由来の逆転写酵素（AMV RTase）を添加す
る改良を加えた（40units/反応系、ライフサイエンス
社）。

（３）cDNAライブラリーの作成（２）で得たcDNAをファージベクターλgt10のEcoR I
arm（プロメガ社）に組み込んだ。3.3μｇのポリ
（Ａ）⁺RNAから合成したcDNAを150μｌの66mMトリス塩
酸緩衝液（pH7.6）、1mMスペルミジン、10mM塩化マグネ
シウム、15mMジオスレイトール、0.2mg/mlウシ血清アル
ブミン溶液（カラム緩衝液）に溶解し、このうちの5.2
μｌを１μｇのλgt10のEcoR armと混合後、エタノール
で沈澱させた。この沈澱を９μｌのカラム緩衝液に再溶
解し、１μｌの10mMアデノシン三リン酸、１μｌのT4DN
Aリガーゼ（350units/μｌ）を加え、16℃で一晩反応
し、λgt10とcDNAの組換えファージDNAを作成した。

（４）cDNAライブラリーのスクリーニング（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブの作成 TCF−IIβ鎖のＮ末端の１番目から６番目のアミノ酸
配列に相当する17merの相補鎖オリゴヌクレオチド混合
物（384種mix）を合成し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造社製）〔γ−³²p〕ATP（アマシャム社）を用い
て５′未満を標識してプローブとして用いた。このプロ
ーブは下記で示される。プロープとして用いる相補鎖
（384種mix）：（ii）組換えファージのスクリーニング（３）で作成した組換えファージDNA溶液をGigapack
Gold（ストラタジーン社）を用いてin vitroでpackagin
gし、大腸菌C600hflに感染させ、約50万個のファージの
プラークを得た。プラークをHybond−Ｎフィルター（ア
マシャム社）に吸着させた後、フィルターをアルカリ変
性、中和後、80℃２時間bakingした。ハイブリダイゼー
ションは、Bellら（Nature310 775−777（1984）の方法
に従い、（ｉ）で作成したプローブで一次スクリーニン
グした。一次スクリーニングで陽性であったプラークの
なかにTCF−II cDNA断片を含むと思われるクローンが１
つ得られた。

（５）アミノ酸に翻訳される全領域を含むTCF−II cDNA
のクローニング TCF−IIのβ鎖Ｎ末端アミノ酸配列およびα鎖および
β鎖のリシルエンドペプチダーゼ処理により得られたそ
れぞれ一部内部アミノ酸配列（α）（１文字表示）NYMG
NLSQTRSGLおよび（β）TSXSVYGWGYTGLINYDGLL（Ｘは未
同定を示す）が、ヒト肝細胞増殖因子（hHGF）のアミノ
酸配列とよく一致しているため、TCF−IIはhHGFの遺伝
子ファミリーの一種と考えられた。hHGFについては、宮
沢ら（Biochemical and Biophysical Research Communi
cation163967−973（1989）），中村（Nature342 440−
443（1989））によってそのcDNAの塩基配列が報告され
ているが、両者でアミノ酸配列が14箇所異なり、hHGF遺
伝子ファミリーの存在が示唆されていた。そこで両者で
一致している、ポリヌクレオチド鎖コード領域周辺の
５′−および３′−非翻訳領域のDNAの塩基配列を基に
プライマーとなるオリゴヌクレオチドを合成し、Polyme
rase Chain Reaction（PCR）法によるTCF−II cDNAの検
索を行った。まず、DNA合成機（アプライド社）により
制限酵素Sal Iの認識配列を有するSal−77プライマー
と、制限酵素Sph Iの認識配列を有するSph2203プライマ
ーを合成した。これらプライマーを下記に示す。

PCR法によるクローニングは以下の手順で行った。

（ｉ）PCR （２）で合成したcDNA（150μｌのカラム緩衝液に溶
解）１ μｌ 20μＭ Sal−77プライマー 2.5μｌ 20μＭ Sph2203プライマー 2.5μｌ 10xPCR反応液（500mM塩化カリウム、100mMトリス塩酸緩
衝液（pH8.3）、15mM塩化マグネシウム、0.1％（w/v）
ゼラチン 10 μｌ 1.25mM dGTP,dATP,dTTP,dCTP混合液 16 μｌ Ampli Taq（5units/μｌ宝酒造） 0.5μｌ蒸留水 67.5μｌ上記の溶液を0.5ml用の微量遠心チューブ中で混合
後、ミネラルオイル（シグマ社）約100μｌで液面をお
おった後、Quick Thermo System（日本ジェネティクス
社）によりPCRを行った。反応条件は次に示した。94℃
で７分前処理後、55℃ ３分（アニーリング反応）、72
℃ ４分（ポリメラーゼ反応）、94℃ ２分（変性）の
三段階の反応を35回繰り返した後、後処理として55℃
３分、72℃ 11分処理し、室温に戻した（（注）それぞ
れの時間は温度が変化する時間も含む。）反応液のうち
の一部をアガロースゲル電気泳動にかけたところ約2.3
キロベース（Kb）のDNA断片が得られ、これが目的のTCF
−II cDNAと考えられた。そこで反応液４本分から得たD
NAをエタノールで沈澱させた後、制限酵素Sal IとSph I
で消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、DE81ペーパ
ー（ワットマン社製）で約2.3KbのDNA断片を回収した。

（ii）サブクローニング（ｉ）で得られた制限酵素Sal IとSph Iで消化された
約2.3KbのcDNA断片を、プラスミドベクターpUC18（日本
ジーン社製）を制限酵素Sal IとSph Iで消化したベクタ
ー断片にライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて
挿入し、大腸菌DH5α（BRL社製）の形質転換を行った
（BRL社添付のプロトコールに従った）。結果として、2
0個以上のサブクローンを得ることが出来た。

（iii）塩基配列決定得られたサブクローンについてダイデオキシ法（Sequ
enase Ver.2.0東洋紡製）により塩基配列を決定した。A
mpi Taq（宝酒造社製）のヌクレオチド取り込みのミス
を複数個のサブクローンの塩基配列を解析することによ
り補正した。上述のようにして得られたTCF−II cDNAの
塩基配列と、その配列から予想されるアミノ酸配列を第
１図に示した。翻訳開始信号ATGから停止信号TAGまで21
72塩基対（bp）であり、アミノ酸に翻訳すると723個の
アミノ酸配列からなり、１番目のメチオニン残基から29
番目のアラニン残基までがシグナル配列と予想された。
TCF−IIは、α鎖、β鎖の二本のポリペプチド鎖がジス
ルフイド結合しているが、第１図に示すように最初は１
本のポリペプチド鎖として合成されることがわかった。
TCF−IIのα鎖のＮ末端はブロックされているために不
明であるが、β鎖のＮ末端およびα鎖，β鎖の一部内部
アミノ酸配列が前述のごとく決定しており、第１図中に
示した。得られたTCF−II cDNAの塩基配列は宮沢ら（Bi
ochemical and Biophysical Research Communication16
3 967−973（1989））の発見したhHGFと極めてよく一致
するが宮沢らのhHGFのアミノ酸配列でいうと、162番目
のフェニルアラニンから166番目のセリンまでの５残基
（Ｆ−Ｌ−Ｐ−Ｓ−Ｓ）が、今回のTCF−II cDNAでは欠
失している点が異なり、TCF−II cDNAは新しいHGF遺伝
子ファミリーの遺伝子の１つであることがわかった。

本発明は、このようにして得られたTCF−IIのcDNAに
関する知見を基に、このcDNAを発現ベクター中に組み込
み、TCF−IIを遺伝子工学的手法によって製造しようと
するものである（以下、遺伝子工学的手法によって得ら
れたTCF−IIをrTCF−IIという）。

従って、本発明の課題は、TCF−IIのアミノ酸配列を
コードするDNAを含む発現ベクターの構築とこのTCF−II
発現ベクターで形質転換された形質転換細胞及びこれを
用いてrTCF−IIあるいは肝細胞増殖因子を製造する方法
を提供することにある。

本発明は、このような課題を解決するためになされた
ものであって、まず、TCF−IIのアミノ酸配列をコード
したDNAを含む発現プラスミドに関する。

発現ベクターとしてはpc DNA I（インビトロージェン
社）pMNSM（Tsuchiya他.Biochemical and Biophysical
Research Communication158 576−583（1989））などが
あげられる。

本発明のプラスミドは、一般に次の方法で作製され
る。すなわち、第２図に示すように、まず前記したよう
にpUC18プラスミドベクター（日本ジーン社製）にサブ
クローニングされているTCF−II cDNAを制限酵素を用い
て切り出し、一方例えば発現ベクターpcDNA I（インビ
トロージェン社製）から制限酵素を用いてプラスミド断
片を切り出す。そして両断片をリガーゼを用いてライゲ
ーションし、TCF−II cDNA断片をpcDNA I断片中に挿入
してTCF−II発現プラスミドを構築する。

このTCF−II発現ベクターには第２図に示されるよう
にプラスミドpucDNA Iに由来するサイトメガロウィルス
T7プロモーター（CTV/T7プロモーター）が含まれてい
る。

TCF−II cDNA、プラスミド断片等の切出しは従来知ら
れている種々の制限酵素が用いられるが、特にBamH I、
Sph I等を用いることが好ましく、またリガーゼとして
はT4リガーゼを用いることが好ましい。プラスミド断片
の切り出し、あるいはライゲーションの方法は従来知ら
れている通常の手段によって行うことができる。

また、本発明では、次の第４図に示す方法によってrT
CF−IIを大量に発現させることのできるTCF−II大量発
現プラスミドpCDTCFdhを構築することができる。

マウスDHFR遺伝子発現プラスミドpAdD26SVpA（３）
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,689−693（1985））をEc
oR IとBamH I、およびBamH IとPst Iとでそれぞれ別に
消化し、１％アガロースゲル（宝酒造社製）電気泳動に
より、それぞれ1.8Kb、0.5KbのDNA断片をあらかじめEco
R I、Pst Iで消化したブルースクリプトSK＋（ストラタ
ジーン製）と混合し、T4 DNAリガーゼでライゲーション
を行い、マウスDHFR遺伝子発現プラスミドpBAdDSVを得
た。

プラスミドpBAdDSVをEcoR Iとspeで消化した後、クレ
ノウフラグメントで平滑末端とした後、１％MEアガロー
ス電気泳動により、2.4KbのDNA断片をあらかじめNaelで
消化したTCF−II発現プラスミド（第２図6.3Kb）にT4 D
NAリガーゼにより挿入し、TCF−II大量発現プラスミドp
CDTCFdhを得た。このようにして得られたプラスミドpCD
TCFdhは、サイトメガロウイルスプロモーター（CTV/T7
プロモーターとSV40初期遺伝子関連のスプライスシグナ
ルおよびポリ（Ａ）付加シグナルの間にTCF−II遺伝子
を有するTCF−II発現単位と、アデノイウイルス主要後
期プロモータとSV40初期遺伝子関連のポリ（Ａ）付加シ
グナルの間にマウスDHFR遺伝子を有するマウスDHFR発現
単位の双方を含むプラスミドである。

このようにして得られたTCF−II発現プラスミドを大
腸菌を用いて増幅し精製を行う。大腸菌としては、市販
されているMC1061/P3等種々のものが用いられる。プラ
スミドを組み込んだ大腸菌を、アンピシリン等を含む培
地中で培養して増幅するとともに選択を行い、さらにプ
ラスミドを取り出して精製する。本発明の発現プラスミ
ド第２図を大腸菌MC1061/P3に組み込んだ形質転換体は
微工研に寄託している〔受託番号微工研条寄第3479号
（FERM BP−3479）〕。

本発明は、また、このようにして得られたTCF−II発
現プラスミドを細胞中に組み込み、得られる形質転換さ
れた細胞に関する。細胞としては、ナマルワ（Namalw
a）細胞が用いられる。その形質転換法は、従来用いら
れているリン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、
リポフェクチン法、エレクトロポレーション法等の通常
の方法が用いられる。

さらに、本発明は、このようにして得られた形質転換
体を培養し、その培養液からrTCF−IIを採取する方法に
関する。培養に当っては、WO90/10651に記載される方法
で培養するとよい。すなわち、動物細胞を血清培地もし
くは無血清培地中で増殖させる。代表的な培地の例とし
てはダルベッコ−モデファイドイーグル培地（DMEM）に
子牛血清を５％添加した培地が挙げられる。この他に必
要に応じ、アミノ酸、トランスフェリン、脂肪酸、イン
シュリンなどのホルモンを添加してもよい。

この培地中で細胞を培養するが、培養に当っては、Ｔ
フラスコ等を使用した静置培養、マイクロキャリアーを
使用した浮遊培養、ホローファイバーやセラミック担体
を症した連続培養の方法が採用し得る。培養条件は、５
％CO₂、95％空気雰囲気下で、20〜37℃の温度、培地は
２〜３日ごとに交換することが好ましい。このようにし
て所望の細胞密度に到達した後は、７〜10日ごとに培地
を交換し、培養液を回収する。回収した培養液より目的
物質である糖蛋白質を抽出精製する。

回収した培養液は分子量6,000以下をカットするUF膜
処理により約10倍に濃縮し、その後、陽イオン交換体に
吸着させた後、NaCl濃度0.3M〜0.6Mの緩衝液で溶出す
る。イオン交換体としてはCMセファデックス（ファルマ
シア社製）等が例示できる。このようにして溶出される
活性画分のうちでラット肝実質細胞の増殖活性、もしく
はマウスL929細胞に対する細胞障害活性を指標として最
も強い活性を示す画分を集め、さらに糖アフィニティー
クロマトグラフィーを行う。糖アフィニティークロマト
グラフィーとしてはConA−セファロースが適している。
糖アフィニティークロマトカラムは0.5M NaClを含むpH
7.0の0.05Mトリス塩酸緩衝液で平衡化した後、上記回収
画分を負荷し、さらにカラムを洗浄する。その後糖アフ
ィニティーの結合糖鎖に応じた溶出液で溶出する。上述
したConAセファロースを使用した場合は、α−メチル−
Ｄ−マンノピラノサイドを含む緩衝液で溶出される。溶
出された活性画分は、水に対して透析を行い、凍結乾燥
する。その後pH6.0〜7.0の0.05Mトリス塩酸緩衝液に溶
解し、強陽イオン交換樹脂を充填剤としたHPLCによりさ
らに分離精製を行う。強陽イオン交換樹脂充填カラムと
してはMonoS（ファルマシア社製）が特に適する。MonoS
カラムからの溶出は、0M→1.0MのNaClのグラジエント溶
出を行い、活性画分を集める。

rTCF−IIは、0.6M〜0.9Mの塩強度部分に溶出される。
このようにして得られた活性画分をさらにヘパリン−セ
ファロース（ファルマシア社製）を使用したアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより精製する。ヘパリン−セ
ロファロースカラムからの溶出は0.3M→2.0MのNaClグラ
ジエントで行い、目的物質は1.0〜1.5Mの塩強度部分に
溶出される。次に、rTCF−IIの肝細胞増殖活性の測定に
ついて記述する。

セグレンの方法（Method in cell biology.vol 13.p2
9.Academic Press.New York.（1976））に従い、ウィス
ター系雄ラットより肝実質細胞を単離した。この肝実質
細胞を8.8×10⁴個/0.5ml/ウェルの濃度で24ウェルのプ
ラスチックプレート（ファルコン社製）に播き、５％の
CO₂存在下、37℃で培養した。培地は、10％牛新生児血
清（ハイクロン）、10μＭデキサメタゾン、100U/mlペ
ニシリン、100ug/mlストレプトマイシンを含むウイリア
ムズＥ培地（フローラボラトリーズ社製）を使用した
（以下、基礎培地という）。24時間培養後、被験試料を
含む基礎培地に交換し更に24時間培養の後、³H−チミジ
ン（アマシャム社製）を４μCi/ml（86Ci/mmol）を含む
基礎培地に交換し２時間培養した後、DNA合成を測定し
た。上記培養によるラベル後、細胞を冷PBS、10％過塩
素酸及び95％エタノールで、それぞれ２回洗浄したのち
風乾し、10mM塩化マグネシウムを含む10％SDSの0.8mlで
可溶化し、液体シンチレーションカウンターにて測定し
た。

純化したrTCF−IIに対する肝細胞増殖活性の例を第１
表に示す。

肝細胞増殖のポジティブコントロールとしてhEGF（湧
永製薬）を用いた。表より、rTCF−IIの肝細胞増殖活性
は、hEGFのよれより強いことが判る。

本発明のrTCF−IIは、肝実質細胞の増殖因子となるほ
か、腫瘍細胞障害因子、白血病株分化誘導因子、細胞免
疫活性因子、血管内皮細胞増殖因子となる。

図面の簡単な説明第１図ａ及び第１図ｂは、TCF−IIのアミノ酸配列及
びそれをコードする塩基配列を示す。

第２図は、本発明のTCF−II発現プラスミドの作製方
法の概略図を示す。

第３図は、TCF−IIの発現の状況を示す。

図中、−○−はrTCF−II遺伝子を保有しない細胞のHG
F活性を示し、−●−はTCF−II遺伝子を保有する細胞の
HGF活性を示す。

第４図は、本発明のTCF−II大量発現プラスミドの作
製方法の概略図を示す。

第５図は、形質転換ナマルワ（Namalwa）細胞培養液
（５％CS含有）のCMセファデックスＣ−50カラムクロマ
トグラフィーを示す。

図中、（１）は0.3M NaClおよび0.01％ツイーン20を
含む0.05Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8〜7.0）、（２）
は0.6M NaClおよび0.01％ツイーン20を含む0.05Mトリス
−塩酸緩衝液（pH7.0）によるカラムクロマトグラフィ
ーを示す。−○−は吸光度（OD.280nm）、−●−はL929
−C18株に対する細胞障害活性を示す。

第６図は、CMセファデックスＣ−50クロマトグラフィ
ーからのrTCF−II溶出液（0.6M NaCl溶出画分）のCon A
セファロースCL−6Bアフィニティクロマトグラフィーを
示す。

図中（１）は0.5M NaCl含有0.05Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.0）、（２）は0.5M NaCl、0.01％ツイーン20およ
び0.3M α−メチル−Ｄ−マンノピラノサイド含有0.05M
トリス−塩酸緩衝液（pH7.0）によるカラムクロマトグ
ラフィーを示す。−○−は吸光度（OD.280nm）、−●−
はL929−C18株に対する細胞障害活性を示す。

第７図は、Con AセファロースCL−6Bアフィニティク
ロマトグラフィーからの、rTCF−II溶出画分のMono S−
HPLCを示す。

図中、−は吸光度（OD.280nm）、−●−はL929−18に
対する細胞障害性、……はNaCl濃度勾配をそれぞれ示
す。

第８図は、Mono S−HPLCからのrTCF−II溶出画分のヘ
パリン−HPLCを示す。

図中、−は吸光度（OD.280nm）、−●−はL929−C18
株に対する細胞障害活性、……はNaCl濃度勾配をそれぞ
れ示す。

第９図は、rTCF−II（非還元及び還元）のSDS電気泳
動を示す。

第10図は、rTCF−IIの各種腫瘍細胞株に対する細胞障
害活性を示す。

図中、−▲−はSarcoma 180、−●−はMeth Asarcom
a、−△−はKB、−○−はIMR−90に対する細胞障害活性
をそれぞれ示す。

第11図はrTCF−IIの肝細胞増殖活性を示す。

発明を実施するための最良の形態以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例１（１）TCF−II発現プラスミドの構築第２図に示すようにpUC18プラスミドベクター（日本
ジーン社）にサブクローニングされたTCF−II cDNA（第
１図）およびpcDNA I発現ベクター（インビトロージェ
ン社）を以下の制限酵素処理により切り出しそれらのDN
A断片を得た。

rTCF−II cDNAが挿入されたpUC18プラスミド１μｇお
よび、pcDNA Iプラスミド１μｇをそれぞれ別々に20mM
Tris−HCl,pH8.5,10mM MgCl₂,1mM Dithiothreitol,100m
M KClを含むバッファー10μに溶解させ、制限酵素Bam
H I,Sph Iそれぞれ１ユニットずつを加え37℃で１時間
反応させた後、１％MEアガロースゲル（宝酒造製）電気
泳動にかけ、DE81ペーパー（ワットマン社製）で約2.3K
bのTCF−II cDNA断片および約4.0KbのpcDNA I断片を回
収した。

次にTCF−II cDNA断片を、pcDNA I断片に以下の反応
により挿入した。

TCF−II cDNA断片100ngおよびpcDNA I断片50ngを60mM
Tris−HCl,pH7.6,1mMATP,1mMスペルミジン,10mM MgC
l₂,15mM DTTを含むバッファー10μに溶解させ、300ユ
ニットのT4リガーゼを加え、15℃で一晩ライゲーション
を行った。

次に、上記反応液を用い常法に従い大腸菌MC1061/P3
の形質転換を行い、TCF−II発現プラスミドを保有する
形質転換菌を得た。

この形質転換体は微工研に受託番号微工研条寄第34
79号（FERM BP−3479）として寄託されている。第２図
に、構築したTCF−II発現プラスミドを示す。

（２） TCF発現プラスミドの調製と精製上記の形質転換大腸菌を25μg/mlのアンピシリンを含
む１のＬ培地で培養し、0D600が0.8を示した時点で、
終濃度が170μg/mlになるようにクロラムフェニコール
を加え一晩培養した。Maniatisら（Molecular cloning
2nd edition）の方法に従いアルカリ法およびポリエチ
レングリコール法で処理し、塩化セシウム密度勾配遠心
法により、TCF−II発現プラスミドを精製した。

（３） TCF−II発現プラスミドの動物細胞への導入 Parkerら（J.Virology 31 360−369,1979）の方法に
従い、リン酸カルシウム法により、COS−Ｉ細胞にTCF−
II発現プラスミドを導入した。ネガティヴコントロール
としてpcDNA Iベクターのみを同様にしてCOS−Ｉ細胞に
導入した。

（４）rTCF−II発現の確認プラスミド導入後、72時間目のCOS−１培養上清中に
おける、rTCF−IIの発現の有無を、ラット肝実質細胞の
増殖活性を指標として検討した。Gohdaら（J.Clin Inve
st.81 414−419,（1988））の方法に従い、ラットの肝
実質細胞のDNA合成能を³Hサイミジンの取込み量で測定
した。その結果を第３図に示す。

第３図に示されるようにTCF−II発現プラスミドを導
入して72時間目のCOS−Ｉ細胞上清中にラット肝実質細
胞増殖活性が認められ、rTCF−IIが発現していることが
確認された。pcDNA Iベクターのみを導入したCOS−Ｉ細
胞中には、増殖活性は認められなかった。

実施例２（１）TCF−II大量発現プラスミドの構築第４図に示すように、マウスDHFR遺伝子発現プラスミ
ドpAD26SVpA（３）（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82 ,689
−693,（1985））をEcoR IとBamH I、およびBamH IとPs
t Iとでそれぞれ別に消化し、１％MEアガロースゲル
（宝酒造社製）電気泳動により、それぞれ1.8Kb、0.5Kb
のDNA断片をあらかじめEcoR I、Pst Iで消化したブルー
スクリプトSK＋（ストラタジーン社製）と混合し、実施
例１に示した方法に従い、T4 DNAリガーゼでライゲーシ
ョンを行い、マウスDHFR遺伝子発現プラスミドpBAdDSV
を得た。

プラスミドpBAdDSVをEcoR IとSpe Iで消化した後、ク
レノウフラグメントで平滑末端とした後、１％MEアガロ
ース電気泳動により、2.4KbのDNA断片をあらかじめNae
lで消化したTCF−II発現プラスミド（第２図6.3Kb）にT
4 DNAリガーゼにより挿入し、TCF−II大量発現プラミド
pCDTCFdhを得た。このようにして得られたプラスミドpC
DTCFdhは、サイトメガロウイルスプロモーターとSV40初
期遺伝子関連のスプライスシグナルおよびポリ（Ａ）付
加シグナルの間にTCF−II遺伝子を有するTCF−II発現単
位と、アデノウイルス主要後期プロモータとSV40初期遺
伝子関連のポリ（Ａ）付加シグナルの間にマウスDHFR遺
伝子を有するマウスDHFR発現単位の双方を含むプラスミ
ドである。

（２）TCF−II大量発現プラスミドのヒトナマルワ細胞
への導入およびTCF−II遺伝子の発現 TCF−II大量発現プラスミドpCDTCFdhを、ヒトナマル
ワ細胞TACC CRL1432に下記に示すリポフェクチン法（Fo
cus11（２）,37（1989））により導入した。

pCDTCFdhプラスミド10μｇとpMCIneoプラスミド１μ
ｇ（フナコシ社製）を10μのTEバッファー（10mM Tri
s,1mM DETA,pH7.5）に溶解し、これに1.5mlのOPTI−MEM
（ギブコ社製）を加えたDNA溶液を調製した。ポリフェ
クチン溶液は、BRLのプロトコールに従い、1.4mlのOPTI
−MEMに0.1mlのリポフェクチン（１μg/ml,BRL）を加え
たものを調製した。ナマルワ細胞は、１×10⁷cellsを0.
3mlのOPTI−MEMに懸濁した。上記DNA溶液1.5mlに1.5ml
のリポフェクチン溶液、0.3mlのナマルワ細胞懸濁液を
加え、軽くピペッティングをして攪拌した後、25cm²の
Ｔフラスコ（住友ベークライト社製）に移し、CO₂イン
キュベーター中で４時間培養した後、7mlの増殖培地（1
0％FCSを含むRPMI−1640培地）を加え、一晩培養した。
その後増殖培地を交換して３日間培養した後、500μg/m
lの濃度のG418（シグマ社製）を含む増殖培地に交換し
てさらに２週間培養した。得られたG418耐性細胞を、50
nMメソトレキセート（MTX）、10％の透析FCSを含むα−
MEM.（ギブコ社製）培地に懸濁し、5000cells/wellの濃
度で96ウェルマイクロプレートにまき、約２週間培養し
た。得られたMTX耐性細胞株から培養上清中のTCF−II濃
度の高い細胞株をELISA法でスクリーニングした。得ら
れたTCF−II高生産株を10％FCS、10％ハイブリド−マク
ローニングファクター（オリジェン社製）を含むRPMI−
1640培地で限界希釈法により、細胞のクローニングを行
ない、得られたクローンについてELISA法でスクリーニ
ングしTCF−II高生産クローンG₂H₃C₂を得た。この細胞
の培養上清中のTCF−II生産能は約1mg/であった。こ
のG₂H₃C₂細胞は工業技術院微生物工業研究所に受託番号
微工研条寄第3480号（FERM BP−3480）として寄託し
た。

（３）rTCF−IIの精製１）形質転換ナマルワ（Namalwa）細胞（G₂H₃C₂）の培
養 RPMI 1640に牛血清（CS）を５％添加した培地2.5に
形質転換ナマルワ細胞を４×10⁵cells/mlとなるように
接種し、37℃、２日間培養毎に同培地を2.5添加する
流加培養法により20の培養液を採取した。

２）rTCF−IIの活性測定法マウスL929（ATCC CCL 1）をサブクローニングし、TC
F−IIに最も感受性の高いサブクローンL929−C18株を得
た。L929−C18株を10％FCSを含むダルベッコ改変イーグ
ル培地（DMEM）でコンフルエントになるまで培養し、そ
の後トリプシン処理により細胞を剥離採取し、10％FCS
および１μg/mlのアクチノマイシンＤを含むDMEMに６×
10⁵cells/mlの細胞密度になるように懸濁させる。96穴
マイクロプレート（ファルコン社製、3072）の各ウエル
に細胞懸濁液と同様に調製したDMEMを50μ加え、本発
明のrTCF−IIを含む試料も同様に調製したDMEMで溶解ま
たは希釈し、希釈列の第１穴に50μを添加し、混合
後、その50μを第２穴に添加混合する。この操作を繰
り返しながら希釈列を作成する。

試料の希釈列に各ウエル当たり、細胞懸濁液を50μ
づつ添加し、CO₂インキュベーター内で、37℃、２日間
培養する。培養後、上清を静かに捨て、整理食塩水で２
回洗浄後、各ウエルに接着した生存細胞をメタノール：
水＝1:4の混合液に溶解した0.5％クリスタルバイオレッ
ト溶液を50μづつ添加し、染色固定する。蒸留水で各
ウエルを洗浄し、染色プレートを風乾し、色素をセレン
ソン緩衝液（6.1ml、0.1Mクエン酸ナトリウム3.9ml、0.
1N塩酸、10mlエタノールを混合）で溶出し、マイクロタ
イター分光光度計で570nmの吸光度を測定する。

50％の細胞死滅率を示す希釈率をTCF−IIの単位数（u
/ml）と規定する。

３）rTCF−IIの精製１）で得た培養液20をHClでpH6.2〜7.0に調製し、
これに予めpH7.0の0.05Mトリス塩酸緩衝液で平衡化した
CMセファデックスＣ−50を湿重量として1.5kg加え、pH
6.5〜7.0下でゆるやかに攪拌しながら４℃で24時間吸着
させた。吸着後、樹脂をブッフナー漏斗上、ワットマン
No.2濾紙で濾過し、回収した樹脂は、pH7.0の0.05Mトリ
ス塩酸緩衝液で洗浄した。約1500gの洗浄後の樹脂を径7
cm×40cmのカラムに充填し、0.01％ツイーン20および0.
3M NaCl含有0.05Mトリス塩酸緩衝液、pH7.0で溶出し
た。280nmの吸収をモニターし、蛋白質がほぼ溶出し終
えたところで更に塩濃度を0.6M食塩に上げて溶出を行っ
た。各フラクションについて細胞障害活性を測定した。
このようにして得た溶出パターンを第５図に示した。0.
6MのNaCl濃度で溶出される画分に強い細胞障害活性が認
められた。この画分を集めてrTCF−II画分とした。次い
で、Con AセファロースCL−6B（ファルマシア社製）を
0.5M NaCl、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂含有のpH7.0、0.05M
トリス塩酸緩衝液で平衡化し、径2.5cm×8cmのカラムに
充填した。このカラムを同じ緩衝液でよく洗浄し、CMセ
ファデックスＣ−50カラムクロマトグラフィーで溶出さ
れたrTCF−II画分（pH7.0）を負荷した。その後再度カ
ラム容量の10倍量の0.5MのNaCl含有pH7.0、005Mトリス
塩酸緩衝液でカラムを洗浄した後、0.5M NaCl、0.01％
ツイーン20および0.3Mα−メチル−Ｄ−マンノピラノサ
イド含有pH7.0、0.05Mトリス塩酸緩衝液で１時間当たり
70mlの流速で溶出した。各溶出画分は細胞障害活性を測
定すると共に280nmの蛋白吸収をモニターした。第６図
に溶出パターンを示した。

最初に溶出される画分を回収し、NaCl濃度が0.3M以下
となるように、0.01Mリン酸緩衝液、pH7.0で希釈した。
希釈液のpHを再度6.5〜7.0となるように調整した後、0.
01％ツイーン20含有pH7.0のリン酸緩衝液で平衡化したH
PLC用Mono Sカラム（ファルマシア社製）に負荷した。
負荷後、0.01％ツイーン20含有pH7.0の0.01Mリン酸緩衝
液で20分間、0.5ml/分の流速で洗浄した後、0.5ml/分の
流速で60分間で最終塩濃度が1M NaClとなるような濃度
勾配で溶出を行った。溶出ターンは第７図に示した。活
性画分は0.76M NaClを頂点として溶出された。精製度を
上げるため活性画分を回収し、再度Mono Sカラムに負荷
し、同じ緩衝液で、NaCl濃度1Mまでの濃度勾配で再度溶
出した。

活性画分を回収し、NaCl濃度が0.3Mとなるように0.01
％ツイーン20含有pH7.5、10mMトリス塩酸緩衝液で希釈
後、0.3M NaClおよび0.01％ツイーン20含有pH7.5、10mM
トリス塩酸緩衝液で平衡化したHPLC用ヘパリンカラム
（東ソー社製）に負荷した。負荷後、0.3M NaCl、0.01
％ツイーン20含有pH7.5、10mMトリス塩酸緩衝液で、流
速0.5ml/分で20分間洗浄した。更に同じpHの緩衝液を用
い、流速0.5ml/分で60分間でNaCl濃度が0.3Mから2.0Mに
なるような塩濃度勾配で溶出した。溶出パターンを第８
図に示した。このようにして、rTCF−IIの精製標品を得
た。20の培養液から11.6mgの活性な蛋白質を得ること
が出来た。細胞障害活性で測定したこの精製蛋白質の比
活性は約530万単位であった。

（４）rTCF−IIの物理化学的諸性質上記のようにして得られたrTCF−IIの物理化学的性質
を測定した結果を以下に示す。

SDS電気泳動法による分子量測定 0.1％SDSを含むポリアクリルアミドゲルを用いて電気
泳動による分子量測定を行った。SDS電気泳動パターン
を図９に示した。rTCF−IIは非還元状態で78,000±2,00
0及び74,000±2,000の近接したバンドを示した。また２
−メルカプトエタノールによる還元処理した電気泳動で
は、分子量52,000±2,000の共通バンドＡと30,000±2,0
00のバンドＢおよび26,000±2,000のバンドＣからなる
３つのポリペプチド鎖に分かれる。

等電点 LKB社製等電点電気泳動装置を用いPhast Gel IEF3−
９による等電点を測定したところ、7.4〜8.6の等電点を
示した。

熱安定性 pH7.5に調整した0.01％ツイーン20を含む0.1Mトリス
塩酸緩衝液に600u/mlとなるようにrTCF−IIを溶解し、
この活性を有する液を25、35、50、60、70、80、90、95
℃の各温度で10分間処理し、25℃の活性に対する相対活
性を求めた。60℃までは安定であった。

pH安定性第２表に示す組成の各緩衝液（いずれも0.01％ツイー
ン20を含有）を調製し、各pHの緩衝液に600u/mlとなる
ようにrTCF−IIを溶解し、37℃で、１時間放置後の活性
を測定した。

pH8、室温で１時間放置した場合の活性を100％とし、
それぞれのpHでの活性を相対活性で求めた。その結果、
pH6〜９の範囲で安定であった。

Ｎ末アミノ酸配列 100μｇのrTCF−IIを還元し、エレクトロブロット法
により、分子量52,000のＡ、32,000のＢ、26,000のＣの
３つのポリペプチドに分離し、各ポリペプチド鎖につい
てアプライド社製477A型プロテインシークエンサにより
Ｎ末アミノ酸配列を分析した。ＡはＮ末がブロックされ
ているためか分析できなかったが、Ｂ、Ｃは共に下記に
示す共通のＮ末アミノ酸配列を示した。

ＢおよびＣのＮ末アミノ酸配列が全く同一であること
からrTCF−IIは分子量52,000のＡ鎖と分子量32,000のＢ
鎖あるいは分子量26,000のＣ鎖がＳ−Ｓ結合したヘテロ
ダイマー構造を有していることが認められた。

（５）rTCF−IIの生物活性１）腫瘍細胞障害活性供試腫瘍株としてヒト腫瘍細胞株、KB及びマウス腫瘍
細胞株、Sarcoma 180およびMeth A sarcomaを用いた。
また、正常細胞としてヒト胎児肺由来正常２倍体線維芽
細胞、IMR−90を用いた。

腫瘍細胞株であるKB、Sarcoma 180は10％FCS含有DMEM
に、またMeth A sarcomaは10％FCS含有RPMI 1640に１×
10⁴cells/mlの細胞密度になるように調製した。また、
正常細胞であるIMR−90については10％FCS含有に１×10
⁵cells/mlの細胞密度になるように調製した。96穴平底
マイクロプレート（ファルコン社製、3072）の各ウエル
に各細胞懸濁液を50μ１づつ添加した。rTCF−IIはKB、
Sarcoma 180およびIMR−90用には10％FCS含有DMEMに、M
eth A sarcoma用には10％FCS含有PRMI 1640に溶解、希
釈し、rTCF−II溶液を調製した。それぞれの細胞懸濁液
を加えた各ウエルにrTCF−II溶液を50μづつ添加し、
rTCF−IIの最終濃度が０、２、４、８、16、31、62、12
5、250、500、1000ng/mlになるように調製した。混合
後、CO₂インキュベーター中、37℃、４日間培養した。
各細胞については各ウエル中の生細胞数のみを血球計算
盤を用いて計数し、２回の実験値の平均値を求めた。各
細胞についてrTCF−II無添加群を対照として、細胞障害
活性（％）を以下の計算式により計算し、rTCF−II濃度
との関係を求めた。

この結果、得られたrTCF−IIの供試細胞株に対する細
胞障害活性を第10図に示した。

rTCF−IIはSarcoma 180やMeth A sarcomaに対して強
い細胞障害活性を、またKB細胞に対しても細胞障害活性
を有していた。しかしながら、ヒト正常細胞であるIMR
−90に対しては、全く細胞障害活性を示さなかった。

２）rTCF−IIの肝細胞増殖活性セグレンの方法（Method in cell biology Vol.13,p2
9 Academic Press,New York）に従い、ウイスター系ラ
ット200gより肝実質細胞を単離した。この肝実質細胞を
8.8×10⁴個/0.5ml/wellの濃度で、24ウエルプレート
（ファルコン社製）に播き、37℃で培養した。培地は10
％牛胎児血清（FCS）、10μＭデキサメタゾンを含むウ
イリアムズＥ（フローラボラトリー社製）培地を使用し
た（以下基礎培地と略す）。24時間培養後、rTCF−IIを
含む基礎培地に交換し、更に24時間の培養後³H−チミジ
ン（アマシャム社製）を最終濃度４μCi/mlになるよう
に添加し、次いで２時間培養した。その後、細胞を冷PB
S、５％過塩素酸および95％エタノールでそれぞれ２回
洗浄した後、風乾し、10mM塩化マグネシウムを含む10％
SDSで可溶化し、液体シンチレーションカウンターでDNA
合成量を測定した。rTCF−IIの肝細胞増殖効果を第11図
に示した。

産業上の利用可能性本発明は、TCF−IIのアミノ酸配列をコードするDNAを
含むTCF−II発現ベクターを創製し、これを用いて遺伝
子工学的手法によってrTCF−IIを製造するので、TCF−I
Iを大量にしかも経済的に製造することができる。そし
て、得られるrTCF−IIは、肝細胞増殖因子等として、医
薬の分野で利用することができる。また、生化学的ある
いは薬理学用の試薬としても用いられる。

微生物への言及 1.pcTCF（Ｓ）/MC1061/P3 寄託機関名称：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号寄託日：平成２年（1990年）７月13日受託番号:FERM BP−3479〔ズタペスト条約に基づいた
寄託：日本国内寄託（受託番号:FERM P−11605）より移
管〕 2.TCdG₂H₃C₂ 寄託機関名称：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号寄託日：平成３年（1999年）７月10日受託番号:FERM BP−3480

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者高岡博昭栃木県下都賀郡石橋町大字石橋241―１ (72)発明者津田英資栃木県下都賀郡石橋町大字石橋622 マロニエハイツ201号 (56)参考文献特開昭62−171696（ＪＰ，Ａ) 特開平５−111383（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／10651（ＷＯ，Ａ１) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ，172, Ｎｏ．１（1990．Ｏｃｔ．15）Ｐ．321 −327 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ，82（1985）Ｐ. 689−693

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】図1a及びｂで示され、TCF−IIのアミノ酸
配列をコードするDNAを含むTCF−II発現プラスミド。
【請求項２】ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）cDNAを含ま
ず、サイトメガロウイルスプロモーターならびに図1a及
びｂで示され、TCF−IIのアミノ酸配列をコードするDNA
を含むTCF−II発現プラスミド。
【請求項３】請求項１または２記載のTCF−II発現プラ
スミドで形質転換された大腸菌。
【請求項４】微工研条菌寄第3479号（FERM BP−3479）
である請求項３記載の大腸菌。
【請求項５】ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）cDNA、サイ
トメガロウイルスプロモーターならびに図1a及びｂで示
され、TCF−IIのアミノ酸配列をコードするDNAを含むTC
F−II発現プラスミド。
【請求項６】請求項５記載のTCF−II発現プラスミドで
形質転換されたTCF−IIを産生するナマルワ細胞。
【請求項７】微工研条菌寄第3480号（FERM BP−3480）
である請求項６記載のナマルワ細胞。
【請求項８】請求項６または７に記載の形質転換された
ナマルワ細胞を培養し、TCF−IIを産生せしめ、これを
採取することを特徴とするTCF−IIの製造方法。
【請求項９】請求項６または７に記載の形質転換された
細胞を培養し、肝細胞増殖因子を産生せしめ、これを採
取することを特徴とする肝細胞増殖因子の製造方法。