JP2728166B2 - 導入抗原タンパク質を有する動物由来細胞 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、細胞の他の細胞に対する結合およびそれと
の融合を誘発する抗原タンパク質を膜中へ導入された動
物由来細胞に関する。より詳しくは本発明は、外膜がそ
の中に、修飾された細胞またはリポソームを種々の標的
細胞、殊にウイルス例えばヒト免疫不全ウイルス（以下
HIVとして示す）に感染した細胞に生体内および試験管
内で選択的に結合させる特異性タンパク質物質を取込ん
だ修飾された細胞およびリポソームに関する。

背景の情報 後天性免疫不全症候群（エイズ）は明示された年代学
的配列の症状および高い死亡率を特徴とするビルレント
疾患である〔カラン（Curran,J.W.）ほか、「エイズの
疫学」，サイエンス（Science），229,1352〜1357（198
5）〕。エイズは1981年に初めて記載され、そのときか
ら米国のみで約400,000例を有する流行割合および90％
以上の３年死亡率に達した。今日米国中に約100万のヒ
トがヒト免疫不全ウイルス（HIV）に感染されたと推定
される。HIVはコアタンパク質、ゲノムRNAおよび酵素逆
転写酵素を含むレトロウイルスとして分類されている。
HIVの若干の抗原に対する抗体が感染したヒトの血清中
に存在する。

エイズにおける免疫不全の特徴はT4ヘルパー／インデ
ューサーリンパ球の消耗である〔ゴットリーブ（Gottli
eb）ほか、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・
メデイシン（N.Eng J.Med.），305,1425〜1431（198
1）〕。この欠損は主にリンパ球のこの集団のHIVによる
選択的感染の結果である。ヘルパーリンパー球の表面上
に存在するT4分子（CD4抗原を示す）はT4リンパ球の表
面に対する特異的結合後に細胞内に入るHIVウイルスに
対する受容体として関連づけられた〔ダルグレイシュ
（Dalgleish）ほか、ネーチャー（Nature），312,763〜
767（1984）〕。ウイルスが入る機構は完全には示され
なかったが、しかし受容体仲介エンドサイトーシスまた
はHIVエンペロープと細胞膜との直接融合に類似するで
あろう〔ステイン（Stein）ほか、セル（Cell），49,65
9〜668（1987）〕。

フソーゲン（fusogen）タンパク質、gp120（分子量12
0,000ドルトンの糖タンパク質）と称される〔マクドウ
ガル（Mc Dougall）ほか、サイエンス（Science），23
1,382〜385（1986）〕、がHIV表面上に確認され、この
タンパク質がウイルスとリンパ球との間の融合を仲介す
る作用をすることができる。細胞の内部に入るとウイル
スRNAが逆転写酵素によりDNA中へ転写される。その後DN
Aが宿主ゲノム中へ組込まれる。しかし、HIV DNAの大
部分は組込まれないで細胞質中に保たれる。現在、感染
細胞が「活性化されるまでHIV複製がこの段階で制限さ
れることが知られている〔マクドウガル（Me Dougal）
ほか、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunolog
y），135,3151〜3162（1985）〕。HIV感染後の複製の潜
在的活性化因子にはウイルス例えばＢ型肝炎、ヒトサイ
トメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスが含まれ
ると思われている。活性化後、HIVが複製され、次いで
細胞表面上組立てられる。次いで成熟ビリオンがT4リン
パ球の表面膜からの出芽により形成される。HIV複製の
開始後T4リンパ球が殺されるであろう。

T4リンパ球に対するHIVウイルスの細胞変性効果は現
在知られていないけれども、HIV感染が起ると、ウイル
スのgp120抗原が感染T4リンパ球の表面上に発現される
ことが観察された。このタンパク質の通常存在するCD4
抗原に対する親和性のために他のT4リンパ球（未感染で
CD4抗原を有する）が感染リンパ球と融合することがで
きる。生じた細胞の結合および融合が、融合に含まれた
両方またはすべての細胞を殺すと思われる（ザグリ（Za
gury）ほか、サイエンス（Science），231,850〜853（1
986）〕。例えば、表面上にCD4抗原のない細胞系のT4リ
ンパ球並びに細胞と抗CD4抗体との反応により抗原がマ
スクされたT4細胞は通常状態下でHIV感染T4細胞との融
合を示さない〔マク ドウガル（Mc Dougall），前
掲〕。

この融合過程は若干のHIV感染および多数の非感染T4
細胞を包含することができ、大シンシチウムの形成を生
ずることができ、それが次いで細網内皮系の細胞により
循環から除去されるか、さもなければ溶解することがで
きる（例えば脳のような器官中）〔ショー（Shaw）ほ
か、サイエンス（Science），227,177〜181（1985）；
ガートナー（Gartner）ほか、サイエンス（Science），
233,215〜219（1986）〕。

T4リンパ球は免疫応答において中心的役割を演ずる。
それはマクロフアージ、細胞障害性Ｔ細胞、NK（ナチュ
ラルキラー）細胞およびＢリンパ球とともに均一に含ま
れる。従って、T4リンパ球集団の選択的消耗でも多くの
免疫欠損を生じ、エイズに特有の生命を脅かす日和見感
染を生ずる〔ボウエン（Bowen）ほか、アナルス・オブ
・インターナル・メデイシン（Ann.Intern.Med.），10
3,704〜709（1985）〕。さらに単球およびマクロフアー
ジの一定集団もまたCD4抗原を発現し、研究によりこれ
らの細胞もまたHIV感染されることができることが示さ
れた〔ホー（Ho）ほか、ジャーナル・オブ・クリニカル
・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.），77,171
2〜1715（1986）〕。単球のHIV感染は走化性における欠
損を生ずることができ、それはエイズで報告された。感
染マクロフアージはHIVウイルスを中枢神経系へ運ぶこ
とができ、この疾患に生ずる亜急性脳炎の発現を可能に
する〔ガブズダ（Gabuzda）ほか、アナルス・オブ・ノ
イロロジー（Ann.Neurology），20,289〜295（198
6）〕。HIV感染単球は腫瘍壊死因子を含む種々の因子を
生ずることができ、それがエイズの慢性熱およびまた悪
液質の関連状態（一般栄養不良）を説明できた。

さらに、新抗原に対する低い抗体応答と結合した高濃
度の免疫グロブリンによる多クローン性活性化からなる
Ｂリンパ球異常がエイズで普通であり、HIV感染の直接
的結果であることができる。エイズの一層進行した段階
における患者は通常無力性である（すなわち、普通の抗
原に対する減退した免疫応答を示す）。

エイズは治療が非常に困難なことが証明され、治癒す
るに任される。これまでに若干の異なる方法が試みられ
た。現在研究されている可能性のある処置は次のもので
ある： （ａ） 逆転写酵素の阻止因子 この型の治療は、標的酵素がヒト細胞中に見出されな
いので非常に選択的であることができる。この種の始原
型薬物はアジド−３′−デオキシチミジン（AZT）であ
る。この薬物はＩ、IIおよびIII期の研究に合格し、現
在エイズをもつ患者および以前にニューモシステイス
（pneu−mocystis）感染を有した患者の治療に承認され
ている。研究はこの薬物で処置した患者がヘルパーＴリ
ンパ球の高濃度を示しまた約1/3が陽性皮膚試験を示す
ことを示した（後者は以前に無力性であった）。さら
に、その疾患に特有の神経系欠損に対する改善がある
〔ヤーチェン（Yarchoan）ほか、ランセット（Lance
t）,575〜580頁（1986）参照〕。しかし、臨床および免
疫パラメーターにおける前記改善にもかかわらず、ウイ
ルスがリンパ球中に生き残ることが認められる。

（ｂ） 一般抗ウイルス剤 現在リバビリン（ribavirin）、ホスカーネット（Fos
carnet）（HPA−23）およびスラミン（Suramin）のよう
な化合物が研究中である。現在これらの物質の有効性に
ついて利用できるデータがない。

（ｃ） 免疫修飾物質 この型の処置にはエイズをもつ患者中の欠損免疫系を
高めまたは再構成する試みが包含される。そのような試
みは数年間行なわれた。試験された免疫修飾物質の１つ
はα−インターフェーロン、抗ウイルス免疫修飾および
抗増殖効果を有する白血球由来糖タンパク質である。こ
の物質はヒト患者に単に最少の有効性を示したが、許容
できない毒性水準を示した〔ゲルマン（Gelmann）ほ
か、アメリカン・ジャーナル・オブ・メデイシン（Am.
J.Med.），78,737〜741（1985）〕。エイズ患者に試験
された類似物質はインターロイキン−２である。後者は
Ｔリンパ球の全数を高め、リンパ球からのHIVの分離を
低下するが、しかし排除しないことが示された。それは
またカポジ肉腫、後者はエイズの一層進行した期に関連
する悪性腫瘍、の最少程度の進行に関連づけられた〔ブ
ロダー（Broder）ほか、ランセット（Lancet）,627〜63
0頁（1985）〕。

（ｄ） 移植 骨髄移植が若干のエイズ患者に試みられ、その目的は
患者の免疫反応性の再構成であった。そのような療法は
長期経続よりはむしろ一過性の状態の改善を生じたにす
ぎなかった。

リポソームと細胞または核エンベロープとを有効に溶
融させる方法が記載された〔アービンテ（Arvinte）ほ
か、バイオケミストリー（Biochemistry）、26,765〜77
2（1986）参照〕。多くの場合に、そのような融合は、
タンパク質、ペプチド、ポリエチレングリコール、ウイ
ルスエンベロープタンパク質などであることができるフ
ソーゲンといわれる誘発性物質を用いて行なわれた。若
干の場合に融合誘発性物質には媒質の改変状態が包含さ
れる。従って、低pHがリポソームと核エンベロープとの
融合の誘発に有利に使用された〔アービンテ（Arvint
e）ほか、バイオケミストリー（Biochemistry）、前
掲〕。

操作は以前には生体内の特定細胞に対する異なる分子
の標的送達のために開発された〔ニコラウ（Nicolau）
ほか、ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ（Biochi
m.Biophys.Acta），805,354〜367（1984）〕。そのよう
な標的性は二重層中に特定的に選択された糖脂質を含有
したリポソームの使用により実現された。そのような糖
脂質はそれらの上の、標的細胞の形質膜上の１またはそ
れ以上のレクチン（一定の型の炭水化物構造に特異的に
結合する植物細胞から誘導された物質）により認識され
た末端炭水化物の存在を基にして選択された〔ニコラウ
（Nicolau）ほか、プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.）、80,7128〜7132（1983）参照〕。そのよう
な方法が働くには、標的細胞がその膜内に他の細胞の膜
内に存在する分子に対し特異性でそれに結合する受容体
を含まねばならない。次に細胞の融合を誘発することが
必要であり、それはフソーゲン物質を用いて実験的に、
または自然にウイルス感染に由来するタンパク質のよう
な一定の融合剤により行なうことができる〔ガロ（Gall
o）ほか、サイエンス（Science），224,500〜503（198
3）〕。

発明の概要 本発明の目的は、種々の細胞毒素および溶菌物質、有
利にはタンパク質リシンを取込ませたCD4保持細胞、有
利には赤血球、あるいはリポソームを生成させることに
よりHIV感染細胞とCD4保持細胞との選択的融合を利用す
ることである。そのような方法はHIV感染細胞の選択的
な殺害を生ずる。そのような目的は形質膜または脂質二
重層（場合による）中にCD4抗原をもち、かつ細胞障害
物質例えばリシン、ゲロニンおよび（または）それらと
等価の物質を含有する一群のエンジニアド（engineere
d）赤血球またはリポソームの構築により実現される。

本発明の他の目的は抗原を細胞の形質膜中へ導入する
方法を提供することである。

本発明の目的はまた、毒性および細胞溶解物質を選定
リポソームおよび細胞中へ取込ませる方法を提供するこ
とである。

本発明の他の目的は、そのようなエンジニアド細胞ま
たはリポソームの最適量を罹患患者中へ導入し、ウイル
スが感染標的細胞内で複製するかまたは他の健全細胞に
対する細胞の結合を促進してウイルスを拡散しまたはそ
れらに対する身体の防禦を阻害することができる前に、
これらの細胞またはリポソームを生体内でウイルス感染
細胞に結合させ、それと融合して破壊させることにより
ウイルス疾患状態を軽減することである。

本発明の目的はまた、CD4タンパク質を膜中へ挿入す
ることにより修飾した異種的血球〔および（または）リ
ポソーム〕を投与し、その結果、これらの細胞〔および
（または）リポソーム〕をHIV感染細胞に選択的に結合
させ、付随して融合させてHIV感染細胞を循環から排除
させる方法を提供することである。

これらおよび他の目的、目標および利点は本発明によ
り実現される。

本発明は、細胞の他の細胞に対する結合およびそれと
の融合を誘発する抗原タンパク質を膜中へ導入された、
例えば人為的に取込ませた動物例えばヒト由来細胞に関
する。

本発明はまた、薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁
された前記動物由来細胞の、１種またはそれ以上の細胞
障害物質と協力した治療有効量を投与、例えば注射、す
ることを含むウイルス誘発疾患の治療に関する。

本発明はまた、薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁
された前記動物由来細胞の、１種またはそれ以上の細胞
障害物質と協力した治療有効量を含む組成物を指向す
る。

発明の詳細な説明 （ａ） 発明の性質 本発明は、ヒトCD4抗原を形質膜中へ取込み、エンジ
ニアド細胞と融合する細胞を破壊できる１種またはそれ
以上の細胞障害物質を細胞内に含有する型のエンジニア
ド赤血球を具体化する。これらのエンジニアド赤血球の
代りにリポソームを製造して同様に用いることができ
る。本発明はまたこれらの細胞を正常赤血球から製造す
る方法に関する。本発明はさらにこれらのエンジニアド
赤血球（またはリポソーム）をウイルス感染により起さ
れた疾患、殊に後天性免疫不全症候群（エイズ）の治療
に使用する方法を具体化する。もちろん、エンジニアド
赤血球が示されるとき常に本明細書に記載する修飾リポ
ソームもまた使用できることを留意すべきである。

提案した治療の主な特徴は次のとおりである。膜上に
CD4受容体をもつ赤血球はウイルスgp120表面糖タンパク
質を表現する循環HIV感染細胞に結合できる。そのよう
な凝集体は次いで脾臓マクロフアージおよび肝臓のクッ
パー（Kupffer）細胞により循環から除去される。

細胞凝集体の取込みによるこれらの食細胞の細胞の可
能な感染を防ぐために、一定の抗HIV薬例えばAZT−また
はDDC−三リン酸（AZTはアジド−３′−デオキシチミジ
ンであり、DDCはジデオキシシチジンである）が注射前
にCD4保持赤血球中に封入される。食作用は薬物の存在
なくHIV感染細胞の破壊を有効に生ずるけれども、赤血
球中のそのような抗HIV薬の取込みにより追加の保護が
生ずる。

HIV感染細胞が選択的に結合し、ついにはCD4抗原を有
する非感染細胞と融合する傾向があるので、我々はこの
抗原を形質膜上に有する細胞が、赤血球であっても、HI
V感染Ｔ細胞および（または）HIVウイルス自体と選択的
に結合し、おそらく融合することを仮定し、証明した。
HIV感染細胞が細胞溶解物質を含む他の細胞と融合する
と感染細胞が破壊される。

ウイルス感染細胞の破壊における作用物質として臨床
的に有効であるために、エンジニアド細胞は次の性質を
有さねばならない：（１）それらが長く持続する、すな
わち生体内で少くとも細胞、この場合赤血球、の正常寿
命に接近する寿命を有さねばならない；（２）それら
が、それらに含まれる細胞障害物質が身体の組織に無作
別に作用しないような低毒性でなければならない；
（３）それら自体が、それらの中に置かれた毒素により
不利に影響されてはならない（そうでないと、それらが
標的細胞を捜し出して選択的に融合できる前に毒される
であろう）；（４）それらはまた標的（すなわち感染し
た）細胞との融合にのみ選択的であって他の健全な細胞
とは結合も融合もしてはならない；（５）それらは、そ
れらがレシピエント中で不利な抗原反応を起し従って患
者のすでに負担のかかった免疫系にさらに負担をかける
ことのないように非免疫源でなければならない。本発明
に含まれる修飾赤血球（およびリポソーム）がそのよう
な役割に対する良好な候補であることが発見された。こ
れは、それらが他の細胞の生体繁殖装置を欠き、それら
の寿命の間実質的に血流中の酸素を運ぶ役目をするヘモ
グロビンの嚢にすぎないためである。従って、それら
は、それら自体その中の種々の細胞障害物質の存在によ
り不利に影響されない。赤血球は血流中の最も多い細胞
の１つであるので、抗原修飾毒素積載細胞によるその少
部の置換は生物体にとってほとんど重大でない。さら
に、毒素が修飾赤血球内に隔離されるので、単に注射さ
れた治療薬の場合のように生物体の組織と不規則に相互
作用することが自由でない。

（ｂ） リポソーム 水性媒質を囲む脂質二重層（２分子の厚さ）からな
る。

リポソームは一般に水性媒質中の脂質の音波処理によ
り、乾燥脂質層の緩衝液中の再懸濁により、または有機
溶媒中に溶解した脂質の選択緩衝液に対する透析により
形成することができる。

リン脂質はそれを水と混合すると一部は分子が両性で
ある：それらが疎水性（水不溶性）尾部および親水性
（水溶性）または「極性」頭部を有する、ので閉鎖流体
充填球体を形成する。２つの脂質酸鎖、それぞれ10〜24
個の炭素原子を含む、が多くの天然存在リン脂質分子の
疎水性尾部を構成する。若干の水溶性分子に結合したリ
ン酸が親水性頭部を構成する。十分高い濃度のリン脂質
を水と混合すると疎水性尾部が自然に一緒に並んで水を
排除し、親水性頭部が水を結合する。

その結果、脂肪酸尾部が膜の内部へ向き、極性頭部基
が外方へ向く二重層である。膜の１表面における極性基
はリポソームの内部へ向き、他の表面におけるものは外
部環境の方へ向く。研究者に薬剤のリポソーム中への装
入を可能にさせるのはリン脂質と水とのこの顕著な反応
性である。リポソームが形成されると、水に加えた水溶
性分子が球の内部中の水性空間中に取込まれ、小胞形成
中に溶媒に加えた脂質可溶性分子が脂質二重層中へ取込
まれる。

薬物送達に使用されるリポソームは典型的には直径が
250オングストローム単位〜数ミクロンの範囲内にあり
（対照として、赤血球の直径は約10ミクロンである）、
通常溶液中に懸濁される。それらは２つの標準形態：流
体により分離された若干の脂質二重層で構成される「タ
マネギ状皮膚」をもつ多重ラメラ小胞（MLV）および完
全に流体のコアを囲む単二重層からなる単ラメラ小胞、
を有する。単ラメラ小胞は典型的には小（SUV）または
大（LUV）である特徴を有する。

適当な環境下で、リポソームはほとんどの任意の細胞
型に吸着できる。それらが球を吸着するとリポソームは
若干の細胞により取込まれ、または飲み込まれることが
できる。吸着されたリポソームは細胞膜と脂質を交換す
ることができ、またときどき細胞と融合できる。融合が
起るとリポソーム膜は細胞膜中へ取込まれ、リポソーム
の水性分は細胞中の流体と併合する。

多くの型の細胞により吸着され、結合され、ついには
吸収され、そのときそれらの内容物を徐々に遊離するリ
ポソームの能力が、リポソームを時間放出薬物供給系に
対する優れた候補にする。薬物がリポソームからどのよ
うな速さで放出されるかはリポソームの組成、封入薬物
の型および細胞の性質を含む多くの因子による。

リポソームのエンドサイト−シスは限定種類の細胞、
すなわち異質粒子を摂取できるもの、の中で生ずる。食
細胞の細胞がリポソームを吸収すると、細胞は球をリソ
ソームとして知られる細胞下オルガネラ中へ移動させ、
そこでリポソームの膜が分解されると思われる。リポソ
ームの脂質成分はリソソームからおそらく外方へ移動し
て細胞膜の一部となり、リソソームの分解に耐性の他の
リポソーム成分（例えば一定の薬物）は細胞質内へ入る
ことができる。

脂質交換はリポソームからの形質膜中への個々の脂質
分子の移動（およびその逆）を含み；リポソームの水性
分は細胞内へ入らない。脂質交換が起るにはリポソーム
脂質が標的細胞に関連した特定の化学を有さねばならな
い。リポソーム脂質が細胞膜に接合した後、それが長時
間膜中に保持され、または種々の細胞内の膜へ再分配さ
れることができる。薬物がともかくそのような交換性脂
質に結合すれば、それは脂質交換中に潜在的に細胞中へ
入ることができる。

（ｃ） 疾患 本発明はヒトおよび動物の種々のウイルス、細菌、ア
レルゲンおよび寄生虫疾患との戦いに使用できる。

従って、本発明は次のウイルスとの戦いに使用でき
る:HIV、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ血球凝集素
（A/メンフイス/102/72株、A/Eng1878/69株、A/NT/60/6
8/29c株、およびA/Qu/7/70株、Ao/PR8/34、A1/CAM/46、
並びにA2/シンガポール/1/57;B型インフルエンザウイル
ス、例えばB/Lee40）、家禽ペストウイルス血球凝集
素、ワクシニア、ポリオ、風疹、サイトメガロウイル
ス、痘瘡、単純ヘルペス１および２型、黄熱、感染性エ
クトロメリアウイルス、牛痘ウイルス、ウシ伝染性鼻気
管炎ウイルス、ウマ鼻肺炎（ウマ流産）ウイルス、ウシ
の悪性カタルウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、イヌヘ
ルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス（伝染性
単核症およびバーキット・リンパ腫と関連）、マレーク
病ウイルス、ヒツジ肺リンパ節腫症（ヒツジ肺腺症）ウ
イルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス群、ヒ
ト乳頭腫ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ミン
ク腸炎ウイルス、サケ類（trout）の伝染性脾臓壊死ウ
イルス、魚類肉腫ウイルス（種々の系統）、ニワトリ白
血球ウイルス（内臓、赤芽球および骨髄芽球）、大理石
骨病ウイルス、ニユーカッスル病ウイルス、パラインフ
ルエンザウイルス１、２、３および４、ムンプスウイル
ス、トルコ（Turkey）ウイルス、カナダ/58、イスジス
テンパ−ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、例えば
インフルエンザＢ型ウイルス例えばB/Lee/40;狂犬病ウ
イルス；東部ウマ脳炎ウイルス；ベネズエラウマ脳炎ウ
イルス；西部ウマ脳炎ウイルス；黄熱ウイルス；デング
１型ウイルス（＝６型）、デング２型ウイルス（＝５
型）、デング３型ウイルス、デング４型ウイルス；日本
脳炎ウイルス；キャサナー森林病ウイルス；跳躍病ウイ
ルス；ミューリー谷脳炎ウイルス；オムスク出血熱ウイ
ルス（ＩおよびII型）；セントルイス脳炎ウイルス；ヒ
トライノウイルス；口蹄疫ウイルス；ポリオウイルス１
型；エンテロウイルスポリオ2;エンテロウイルスポリオ
3;ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス；ブタ伝染性胃腸炎
ウイルス；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス；ラッサウイ
ルス；マチュポウイルス；ピチンデ（Pichinde）ウイル
ス；タカリベウイルス；乳頭腫ウイルス；シンドビスウ
イルス；など。

本発明はまた細菌例えばらい病、結核、梅毒および淋
疾を起すものとの戦いに使用できる。

本発明はまた寄生虫、例えばマラリアを運ぶ生物体
（熱帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫など）、住血
吸虫症、回旋糸状虫および他のフィラリア寄生虫、トリ
パノソーマ、リーシュマニア、シャガス病、アメーバ
症、鉤虫などとの戦いに使用できる。

本発明は修飾細胞およびリポソームの特定細胞および
組織に対する標的性を可能にするので、それはまた癌増
殖との戦いに有効であることができる。

（ｅ） 純CD4の製造 HIVによる正常Ｔ細胞の破壊にはウイルスによる細胞
の感染とその後のウイルスによりコードされる特異糖タ
ンパク質の生成、並びに感染細胞の形質膜中へのこれら
の糖タンパク質の挿入が包含される。この糖タンパク質
は表面上にCD4抗原を含む他の細胞に対する親和性を有
する。ヒト白血球抗原、CD4、は血液バンクからの血液
の遠心分離後に得られたバフイーコートを含む種々の源
から、並びにＴ細胞リンパ腫細胞系〔アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（American Type Cultur
e Collection,Rockville,Maryland,USA）から得られるC
EM−細胞〕から分離することができる。CD4抗原はマド
ン（Maddon）ほか、セル（Cell）、42、93〜104（198
5）の操作により精製できる。

この操作に対する一般的図式は次に示される： 精製CD4はすぐに使用でき、また−20℃で２〜３月安
定である。上記図式中、緩衝液組成は次のとおりである
ことができた： 緩衝液Ａ＝0.02M ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド
（OGS） 0.15M NaCl 0.2M PMSF 0.01M トリス、最終pH＝8.0 緩衝液Ｂ＝0.1M β−マイノシドを含む緩衝液Ａ 緩衝液Ｃ＝１％（w/w）デオキシコール酸ナトリウム 1M 酢酸ナトリウム、最終pH＝4.0 緩衝液Ｄ＝0.1M 酢酸ナトリウム、最終pH＝4.7 上記緩衝液Ａ中のPMSF（フエニルメチルフルオロ硫
酸）は抽出および精製操作の間タンパク質分解の阻止に
使用される毒性物質である。しかし、それは後のクロマ
トグラフイー段階により完全に除去される。

OGS（オクチルガラクトシド）はCD4の抽出に使用され
る洗浄剤である。後に精製工程においてそれは天然存在
胆汁酸塩であり、毒性でないDOC（デオキシコール酸
塩）により置換される。

DOC（デオキシコール酸ナトリウム）は精製CD4中に0.
005％の濃度で存在し、本発明により治療したエイズ患
者の血液中に約0.000001％の濃度で存在する（それは全
く安全である）。

ヒトCD4タンパク質はまた種々の細胞中の組換えCD4分
子として得ることができる〔ウオルトン（Walton）ほ
か、セル（Cell）、1988、印刷中〕。

（ｆ） エンジニアド赤血球を形成する細胞融合 本発明によるエンジニアド赤血球を形成する一般的操
作が次に略示される： 上記図式中で生成された修飾RBC（赤血球）（未標
識）は約50,000分子のCD4毎細胞を含み、20℃で20日ま
で安定である。

クロム標識修飾RBCは毒性研究のみに用いたのでそれ
らの製造は任意であり、それらは通常治療目的に対する
本発明の実際の実施に使用されないがしかしそれらを使
用できる。そのような標識細胞は活性物質として本発明
を用いる試験管内診断法における使用が見出されよう。

赤血球膜中へCD4を挿入する他の方法は初めにタンパ
ク質をリポソーム膜中へ挿入し、次いでそれを赤血球と
融合させて膜中にCD4を含む細胞−リポソームハイブリ
ッドを生成させることである。さらにこの方法は後の融
合で細胞、有利には赤血球に対するリポソーム封入分子
（有利には細胞毒または治療物質）の送達を生ずる。

赤血球を連続溶解および再封する技術は再封赤血球
〔イーラー（Ihler）ほか、PNAS、70、2663〜2666（197
3）〕およびエンドサイトーシスによる装入細胞（イー
ラー（Ihler）ほか、ジャーナル・オブ・アプライド・
バイオケミストリー（J.App.Biochem）、４、418〜435
（1982）〕の既知概念を基にして開発された。これらの
方法は、種々の分子を細胞中へ封入し、その寿命を不変
に保つことを可能にする〔ニコラウ（Nicolau）ほか、E
P83 401364−１（1983）およびニコラウ（Nicolau）ほ
か、アナルス・オブ・ザ・ニユーヨーク・アカデミー・
オブ・サイエンス（Ann.N.Y.Acad.Sci）、445、304〜31
5（1985）〕。本発明には生体中のウイルス感染細胞と
の最終融合およびその破壊に対する「標的化弾丸」とし
て作用できる修飾赤血球（またはリポソーム）が含まれ
る。

リゾチームが酸性pHでリポソームと赤血球ゴーストと
の融合を誘発することが既に示された〔アービンテ（Ar
vinte）ほか、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Nat.Acad.
Sci.）,83巻、962〜966（1986）〕。その操作において
リゾチームは音波処理小胞（リポソーム）の外部膜に共
有結合させ、これらの小胞とヒト赤血球ゴーストとの融
合の誘発に作用させた。融合の強い誘発が最適リゾチー
ムpHで認められた（それはリゾチームを単に懸濁液に加
えたときに認められなかった）。この操作は、リゾチー
ムが電気的に中性のリポソーム相互の融合を誘発しない
ので有用であり、従って、リポソームと細胞との融合に
十分適する。

本発明には媒質中にリゾチームを全く存在させないで
融合を誘発させる方法が含まれる。これは大規模臨床使
用に対するエンジニアド赤血球の形成を非常に容易にす
る。

（ｇ） エンジニアド赤血球の毒性 エンジニアド赤血球（種々の捕捉物質例えばイノシト
ール六リン酸イソチオシアナート標識リシンを含む）の
寿命がほゞ正常値であることが示された〔リコラウ（Ni
colau）ほか、アナルス・オブ・ザ・ニユーヨーク・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Ann.N.Y.Acad.Sci.）、
前掲〕。さらに、これらの細胞の、子豚中の30日の期間
にわたる生体内毒性が追跡された。簡単に記載すると、
少量のエンジニアド細胞の注射（30〜40％薬物積載細
胞、すなわち細胞懸濁液のヘマトクリットが30〜40％で
ある、約0.1〜1mlを静脈内に注射した）後、動物血液、
例えば子豚の血液、の試料を30日の経過にわたってとき
どきとった。これをイオン（Ｋ、Na、Cl、Caなどを含
む）の濃度並びにタンパク質、尿素おらびグルコース濃
度について検定した。

ゲロニンを封入したマウスRBCの寿命測定値は正常マ
ウスRBCの寿命に比べて有意な変化を示さなかった（と
もにマウス中で約11日の半減期を有する）。

毒性試験の間、動物を30日の期間にわたって種々の時
間間隔で剖検し、肝臓クッパー細胞および脾臓マクロフ
アージの状態を調べた。遊離免疫毒素（リシンが毒素で
あった）の直接接種は細網内皮系中の組織損傷を示し
た。脾臓および肝臓中のマクロフアージは毒素を循環か
ら除去する〔ビテッタ（Vitetta）ほか、サイエンス（S
cience），219、644〜650（1983）〕。しかし、本発明
により用いた免疫毒素による腎臓細胞に対する損傷がな
く、毒素積載エンジニアド細胞が毒性でないことを示し
た。他のエンジニアド赤血球に対する含有毒素の主標的
は脾臓マクロフアージであろう。これらの細胞が幹細胞
により置換されることができるので、生ずる損傷は不可
逆性でないであろう。さらに実験証拠は、骨髄中の細胞
からのマクロフアージの置換のために細網内皮系を消耗
させることが不可能なことを示した〔フアン・フアース
・アンド・コーン（Van Furth and Cohn）、ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン（J.Exp.Me
d.）、128、415〜424（1968）〕。

（ｈ） 標的細胞との融合 適当な免疫系の機能化に必要なT4細胞がCD4抗原を有
するので、それらが感染細胞に選択的に結合し、ついに
は溶解される。溶解は培養細胞中への放射性成分例えば
Cr−51の取込みにより試験管内で測定できる。細胞上の
媒質中への同位元素の遊離（ウエル型カウンターを用い
てモニターした）は溶解の尺度である。そのような溶解
はシンシチウムの形成と（CD4含有細胞とHIV感染細胞と
の融合により発生するので）相関する。そのような融合
は後記の実施例５の操作によりモニターされ、結果は相
当する表１（後掲）に示される。

CD4抗原を挿入された赤血球はフリーズエッチング電
子顕微鏡検査並びに薄片電子顕微鏡検査により調べるこ
とができる。簡単に記載すると、CD4抗原を有する赤血
球をマウス単クローン性抗CD4とともにインキユベート
する。洗浄後、これらの細胞を、ヤギ抗マウスIgGでコ
ートした10nm金ビーズとともにインキユベートした。フ
リーズフラクチャーレプリカ中で10nmビーズがクロス割
断赤血球の周囲の周りに観察された。観察ビーズの数毎
細胞はフラクチャーの偶然性に依存し、必らずしもその
細胞に結合したビーズの実際の数の尺度ではない。最良
の場合にビーズはクロス割断赤血球の１側に沿って40〜
50nmの間隔で規則的に並んで見える。エッチングにより
生じた「タマネギ環」効果のために赤血球膜からのビー
ズの距離を正確に決定することができない。同一試料の
薄片中に電子濃密10nm金ビーズもまた赤血球の膜表面に
観察される。HIV感染H9細胞とともにインキユベートし
た後のCD4保持赤血球のフリーズエッチング像は赤血球
膜面上の膜タンパク質の分布を変えた100nmの「不規則
性」または「押出」を示した。これはウイルスの赤血球
との（おそらくCD4抗原に対する）融合を示唆する。

二重層中にCD4を有する調製リポソーム（実施例１、
後記、による）はフリーズエッチング電子顕微鏡検査に
より調べることができ、300〜500nmの範囲の直径の単ラ
メラおよび多重ラメラの両方であると認められる。リポ
ソームをHIV感染H9細胞とともに８時間インキユベート
した後、ウイルス粒子はCD4タンパク質挿入リポソーム
に結合されるが、しかしこのタンパク質のないものには
結合しないことが認められる。これはまた、本発明によ
り膜中へ挿入されるとタンパク質が適当に配向されるこ
とを示す。ウイルス粒子は大きさ（約100nm）および膜
タンパク質の存在の両方により確認することができる。
リポソームは大きさおよび封入デキストランにより確認
された。

CD4リポソームと感染細胞との融合およびリポソーム
の内容物の細胞内部への送達を示すために次の操作を用
いることができる。フエリチンを封入しているCD4−リ
ポソーム〔実施例１（後記）の一般操作による〕をHIV
感染H9細胞または正常H9細胞とともに８時間インキユベ
ートする。次いで細胞を洗浄して固定する。CD4を有し
ないがしかしフエリチンを封入しているリポソームを同
様に用いる。

薄片電子顕微鏡検査はリポソームに封入されたフエリ
チンが感染細胞中の脂質小滴へ移動したことを示した。
リポソームが感染細胞内の大細胞質液泡内に認められ
た。細胞の形質膜とのリポソームの融合の例もまた認め
られた。これらの結果はリポソームがCD4抗原を有しな
かった場合に認められなかった。

膜中にホスフアチジルエタノールアミンリサミンロー
ダミン〔ローダミンは蛍光染料であり、こゝでは脂質に
結合している）を有して形成され、F1−デキストランを
封入するCD4保持リポソームをHIV感染H9細胞とともに８
時間インキユベートし、次いで洗浄して固定する。同様
の、しかし二重層中に存在するCD4抗原のないリポソー
ムを用いて類似の操作を追跡する。

フリーズエッチング像は、ウイルス粒子がCD4をもつ
リポソームに結合したが、それのないものに結合しなか
ったことを示した。さらにCD4抗原を有するリポソーム
がHIV感染H9細胞との融合の過程中に示された（すなわ
ち、それらが明らかな膜の連続性を示した）。CD4抗原
の存在しないリポソームは細胞膜上の上に載っている
が、しかし実際の融合の証拠を示さなかった。

これらの細胞の蛍光分析は、リポソームがそれらの二
重層中にCD4抗原、並びに脂質−ローダミン接合体を有
した実験で有意なローダミン蛍光を示した。この蛍光は
拡散し、また中断したが、しかしすべての場合に細胞の
核から排除された。拡散蛍光はリポソームが細胞の形質
膜と融合したことを示す。中断蛍光は細胞表面上に集ま
るがしかし融合しないけれどもおそらく結合および融合
の初期段階にあるリポソームのためであることができ
る。それはまた細胞の消化画室中のリポソーム成分の隔
離、並びにリポソームのエンドサイトーシスの結果に基
くことができる。しかし、核からの染料の排除が細胞が
なお生存可能なことを示す。

同様の試験に未感染健全H9細胞を用いた場合に、単に
ときどき蛍光が細胞表面に付着したリポソームから検出
された。CD4抗原をもたないリポソームを用いたときにH
9細胞の感染または非感染に関係なく有意な蛍光が検出
されなかった。

CD4抗原をもつ細胞はまたウイルス糖タンパク質（gp1
20）をもつ感染細胞に結合するので、毒素積載細胞また
はリポソーム（膜中に取込まれたCD4抗原を有する）の
使用はこれらの細胞またはリポソームとHIV感染細胞と
を融合させ、その後、それらが健全なT4細胞に結合して
それと融合できる前に後者が破壊される。これは患者の
免疫系をHIV感染細胞によるそれ以上の破壊から、望ま
しくはそれが修復できない損傷をうける前に防止作用を
する。

本発明に有利に使用できる毒素の限定的でない例には
リシン（MW25,000のタンパク質、その毒性Ａ鎖が必要な
すべてである）、アブリン（一定植物の種子から得られ
る有毒アルブミン）、ゲロニン（MW23,000の、非免疫源
である利点を有するタンパク質）およびジフテリア毒素
が含まれる。これらの多くは市販されている。ゲロニン
はピール（Pihl）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、255、6947〜695
3（1980）の方法により調製される。本発明の実施例が
後に示され、毒素としてリシンおよび（または）ゲロニ
ンの使用に関して示されるが、しかし、任意の適当な細
胞障害物質を、基本操作を大きく変形することなくこれ
らの代りに用いることができる。

（ｉ） 臨床使用 本発明を構成する修飾細胞を、HIV感染リンパ球を抹
梢循環から選択的に排除することによるエイズの治療に
用いることができる。操作にはエイズウイルスに対する
受容体（CD4抗原）を自己赤血球膜中へ挿入することを
包含される。感染細胞はその外部表面上にgp120フソー
ゲンタンパク質を発現し従ってCD4含有細胞を結合す
る。エイズ患者中でリンパ球（通常CD4抗原をもつ）はH
IV感染細胞（通常gp120タンパク質をもつ）に結合し、
これが、すべての細胞が感染するかまたは死ぬまで感染
の拡散を生じ、従って免疫系の一般的減退をもたらす。
もちろん、HIV感染リンパ球は、正確にＴヘルパーリン
パ球とではなく、CD4をもつ細胞と結合し、融合する。
前記のように、これにはCD4をもつ赤血球が含まれる。C
D4−赤血球がその中に細胞障害物質を含む場合に、融合
は両細胞の死を生ずる。さらに、ウイルス自体がCD4タ
ンパク質に結合するので、血流中の遊離ウイルスがCD4
保持赤血球に結合し、その中に隔離される。赤血球が遺
伝装置を欠くのでウイルスはその中で繁殖できない。従
って二重の効果があり：血流中の少量の遊離ウイルスを
隔離し、また一層重要なことにはgp120をもつ感染リン
パ球が健全なＴ細胞に結合しウイルスを拡散することが
できる前にそれと融合し、破壊する。

エンジニアド赤血球の静脈内注射に加えて、毒素をリ
ポソームの使用により他の組織中へ選択的に導入するこ
とができる。例えば、リポソーム（その二重層内にCD4
抗原をもち、リポソーム内に封入されたゲロニン、リシ
ンまたは若干の他の毒素を含有する）のリンパ節内への
組織内（interstitial）注射（例えば指間）によりリン
パ節中に存在する感染細胞を選択的に攻撃することがで
きる。そのような治療の方法の利点は、こゝに提供され
る方法により発生されるリポソームが小細胞の大きさに
接近する大きさであり、従って注射後のエンドサイト−
シスにより分解されないことである。

さらに、本発明を構成するCD4をもつ細胞およびリポ
ソームは、試験管内検定の一部としてgp120をもつ（す
なわち、感染した）リンパ球の存在の検出に使用できる
（後記実施例５の操作を用いる）。そのような操作には
本発明による細胞またはリポソームの生成が包含され
る。診断試薬を構成する細胞またはリポソームはそれら
の膜中にCD4抗原を有し、それらの細胞質中に細胞障害
物質を含有し、放射性物質、有利にはクロム−51で標識
される。HIV感染細胞がgp120ウイルスタンパク質をそれ
らの膜内にもつのでそのような細胞は、CD4をもち、毒
素を含有し、放射性標識した細胞と融合し、次いで放射
性標識を周囲媒質中へ遊離する。

本発明を診断試薬として用いるには、患者、場合によ
りエイズをもつ疑いのあるもの、から血液をとり、白血
球（殊にリンパ球）を標準操作（例えば、本明細書に既
に記載した操作）により捕集し、リポソームが例示のた
めに使用される後記実施例５に記載されるように、小分
割量を試験管内で本発明の細胞またはリポソームの分割
量と混合する。37℃またはその付近で細胞融合が起る十
分な時間、最適には24時間まで、インキユベートした
後、細胞媒質の試料を捕集し、放射能を測定する。測定
は正常なヒトの血液の白血球を対照として用いて二重に
行なわれる。対照細胞と比較して患者からとった細胞の
周囲の媒質中の放射能（補正式による計算後）の高水準
の検出は融合、それにより患者の血液中にgp120タンパ
ク質を含む細胞の存在することを示す。後者は前記細胞
がエイズウイルスで感染されたことおよび従って患者が
エイズをもつことを意味すると解釈される。CD4以外の
抗原を本発明の細胞またはリポソームの膜内に導入でき
るので他のウイルス疾患を、この操作を用いて診断する
ことができる。これまでは、エイズに対する診断操作は
通常エイズをもつ疑いのある患者の血液中の抗HIV抗体
の存在の検出による。しかし、そのような所見は必らず
しも疾患の発生を示さないで、単に患者がウイルスまた
はその抗原の若干にさらされたことを示す。こゝに開示
された診断法は、ウイルスが複製されている感染細胞の
存在、すなわち活性感染、を示す利点を有する。出願人
はそれらのすべての等価物を期待する意図である。

本発明を構成する細胞およびリポソームは、さらに治
療量の抗ウイルス薬を細胞例えばマクロフアージおよび
クッパー細胞に直接送達する手段として利用できる。後
者の型の細胞（細網内皮系の一部）はHIVに対する受容
体をもたない。しかしHIV感染細胞はそれらの表面上に
異質抗原を発現し、ついにはマクロフアージおよびクッ
パー細胞により吸収され捕食される。この経路は細網内
皮系の細胞の感染に、不本意にもそれらの表面上のCD4
抗原がウイルスにより使用される。これらの細胞を、ウ
イルスの住拠となりその複製を許すことから保護するた
めに本発明の細胞およびリポソームを、治療量の抗エイ
ズ薬をマクロフアージ、クッパー細胞および細網内皮系
の他の細胞に直接送達するために使用できる。これは、
これらの食細胞の細胞が感染細胞および他のウイルス汚
染破片を摂取した後ウイルスで感染されるのを保護する
効果を有する。

例としてAZT（アジド−３′−デオキシチミジン）、
リババリンおよびDDCが本発明の細胞およびリポソーム
内に容易に封入される。これは1987年３月24日に発行さ
れた米国特許第4,652,449号に開示された封入操作を用
いることにより最も容易に達成され、それらの開示は特
にこゝに参照される。治療薬の封入の前または後に、本
発明の操作を用いて適当な抗原タンパク質（エイズが治
療される疾患である場合にはCD4）を赤血球およびリポ
ソームの膜中へ挿入する。その結果、赤血球またはリポ
ソームは中に治療量の活性抗エイズ薬を含有し、それを
エイズウイルスで感染された細胞へ向かわせ、その細胞
との融合を誘発させる作用をするCD4抗原を膜中に取込
んでいる。融合後、この融合細胞複合体は異質（感染細
胞または細胞類の膜中のウイルスコードタンパク質のた
め）と認識され、マクロフアージおよび他の細網内皮細
胞により捕食される。その結果、抗エイズ薬が直接食細
胞の細胞内へ導入され、これらの細胞中のウイルスの複
製を防ぎ、従ってウイルスがそれ自体複製できる他の道
筋を閉鎖する。

そのような方法の利点は、薬物が血液中に遊離してお
らず、従って望ましくなく有害な副作用の生起に利用で
きないことである。さらに、薬物を運ぶ細胞またはリポ
ソームの膜内の抗原が、膜中にgp120タンパク質をもつ
細胞（すなわち、HIV感染細胞）に対し特異性であり、
健全な細胞が薬物にさらされず、従って薬物の固有の毒
性が非常に低下する。最終の結果は薬物の全量を減少で
き、従って全コストが低下され、薬物の有効治療細胞質
濃度がまた増加される（それが身体全体に無駄に拡散し
ないため）。他の利点は、薬物が抗原修飾された赤血球
およびリポソーム内に有効に隔離されるので、身体の組
織液（ウイルス感染細胞が存在することがほとんどない
場所）に拡散することができないことである。

本発明は次に以下の限定的でない実施例に関して記載
される。

実 施 例 実施例１ ヒト白血球抗原CD4の赤血球形質膜中への挿入 （ａ） リポソームの典型的な調製を次のように行なっ
た：使用する脂質（使用前に2:1（v/v）クロロホルム／
エタノール中に−30℃で保存した）を種々の割合で混合
した。最も普通の操作にはホスフアチジルエタノールア
ミン〔シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.,St.Lo
uis,MO）から購入し、シングレトン（Singleton）ほ
か、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・オイル・ケミ
スツ・ソサイエテイー（J.Am.Oil.Chem.Soc.）、42巻、
53〜61（1965）に従って精製〕、ホスフアチジルコリン
（シグマ・ケミカル社製〕ホスフアチジルセリン（シグ
マ社製）およびコレステロール（シグマ社製）をそれぞ
れ1:2:1:1.5のモル比で混合することが含まれ、典型的
には5mgの全重量を用いた。この混合物（最終濃度10〜3
0mM）を窒素の流れ下に、次に真空下に１時間（残留す
る微量の有機溶媒を除去するため）薄膜に乾燥した。リ
ポソームは逆相蒸発（reverse phase evaporation）に
より調製した〔スゾカ（Szoka），プロシーデイングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc.Nat.Acad.Sci.）、USA,75巻、4194〜4198（19
78）参照〕。簡単に記載すると、脂質物質を新蒸留エー
テル4.5mlに溶解し、浴型音波処理器中でリン酸塩緩衝
食塩水（PBS）1.5mlとともに15秒間音波処理した。可溶
化は洗浄剤／脂質モル比が8:1にあるようにｎ−オクチ
ル−Ｄ−グルコピラノシド（OG）の添加により補助し
た。エーテルを回転蒸発器中で減圧下に除去し、リポソ
ーム懸濁液をPBSで、またはホウ酸塩緩衝液pH7.2、中に
4.5mlに希釈した。あるいはリポソームを、疎水性ビー
ズ上の吸着を用いるフイリポット（Philippot）ほか、
ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ（Biochim.Biop
hys.Acta）、137〜143（1983）に記載された操作により
発生させることができる。

（ｂ） 細構成のために、リポソームの懸濁液（ホウ酸
塩緩衝液pH7.2、1ml中に脂質5mgを含む）を取込ませる
タンパク質を含む溶液と混合した。精製CD4（１％のOG
を含むPBS中４〜6mgタンパク質/mlの濃度で）を脂質−
洗浄剤混合物に加えた。脂質とタンパク質との重量比は
５〜10に維持した。ジメチルスベルイミダート（シグマ
社から購入）を10℃の温度で1.5mg/mlの最終スベルイミ
ダート濃度に達するまで徐々に加えた。次いで混合物を
10℃の温度で30分間インキユベートし、次いでホウ酸塩
緩衝液に対して４℃の温度で２時間透析した。生じた混
合物を次に、未反応タンパク質からリポソームを分離す
るためにセフアロース（Sepharose）4Bカラム上でクロ
マトグラフにかけた。

この操作はCD4抗原約5,000〜20,000分子毎リポソーム
を生ずる。リポソームはフローサイトメトリーおよびフ
リーズフラクチャーを用いて確認した。それらの内部容
積は12〜16リットル毎モル脂質であると認められ、それ
らの平均外径は約450nmであると認められた。

純CD4を有する再構成に加えて、またタンパク質混合
物の一部としてCD4の量に等しい量のリゾチームを用い
て操作を行なった。これはそのときCD4とともに取込ま
れ、修飾赤血球を生成させる後者の融合段階中のリポソ
ーム相互の融合を防ぐ利点を有する。

リゾチームの酵素活性は（リゾチームが使用されれ
ば）ミクロコッカス・レイソデイクチカス（Micrococcu
s leisodeikticus）検定〔アービンテ（Arvinte）ほ
か、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、U
SA、83、962〜966（1986）〕により検定することができ
る。

（ｃ） 新全血を同容積のリン酸塩緩衝食塩水（PBS、5
mMリン酸塩、145mM−NaCl、pH7.4）で希釈し、遠心分離
（640g、４℃で30分）により血漿から分離した。上澄み
および白血球のバフイーコートはともに廃棄した。多形
核白血球を吸収性綿濾過により除去した。次いで赤血球
をPBS、pH7.4、中に再懸濁し、次いでさらに３回洗浄す
る（各2,000rpmで４℃で30分間遠心分離）。

（ｄ） ヘマトクリットを70％に調整し、次いで赤血球
（約500〜1000万）を等容積のリポソーム懸濁液（リゾ
チームを有するかまたは有さず、１〜10リポソーム毎赤
血球の比を与える十分なリポソームを使用）および酢酸
ナトリウム緩衝液（0.02M酢酸ナトリウム/0.145M−NaC
l）1.4mlとともに最終pH5.5で、37℃の温度で30分間イ
ンキユベートした。次いで1400gで、20℃で20分間遠心
分離することにより赤血球を捕集した。蛍光標識抗CD4
抗体による免疫蛍光検定を用いて赤血球／リポソームハ
イブリッドの小試料の形質膜中のCD4抗原の存在を定量
的に測定した。

あるいは、CD4をリポソームの使用なく挿入すること
ができる。このとき、酢酸ナトリウム緩衝液（0.02N、p
H4.7、0.145M−NaCl）15ml、CD4を0.1〜0.4mg含む溶液
（１％オクチルグルコシド中）60μおよび赤血球懸濁
液（RBCペレット50μとPBS、pH7.4、1mlとの混合によ
り生成）30μをエッペンドルフ（Eppendorf）遠心管
（15mlサイズが便宜であった）中で混合し、37℃で60〜
90秒間インキユベートした。上記３溶液（緩衝液、タン
パク質およびRBC）は混合前に37℃に加温すべきであ
る。インキユベーション後、PBS、pH7.4、10mlを加え
（細胞の低pHに対する暴露を停止するため）、次いで反
応混合物をエッペンドルフ遠心分離機の固定角ローター
中で3000rpmで４分間遠心分離することにより細胞を濃
縮した。上澄みを除き、次いで細胞をPBS、pH7.4、中に
再懸濁させた。さらにPBS中で同条件下に３洗浄を行な
った。

実施例２ 取込みCD4抗原の測定 取込みCD4抗原の抗原活性の存在をフルオレセインイ
ソチオシアナート標識抗CD4抗体を用いて蛍光活性化細
胞選別法〔コールター（Coulter）からのエピックス（E
pics）Ｖ細胞選別器を使用〕により測定した。この測定
に２試料を用いた： 試料A:CD4分子を取込んだ赤血球、 試料B:CD4タンパク質を含まない赤血球。

以下の記載においてFITCはタンパク質鎖に対する蛍光標
識のフルオレセインイソチオシアナートを示す。

用いた操作は次のとおりであった： 両試料、ＡおよびＢ、をPBS、pH7.4、で洗浄し、遠心
分離（エッペンドルフ遠心分離機中で3,000rpmで４分
間）により濃縮した。各試験において、細胞ペレット上
に次の単クローン性抗体の１溶液、各10μを層にし
た： （１） 抗T4−FITC〔Pel−Freez単クローン性抗体、M1
02−10−OAX、Brown Deer、WI 53223〕10μ、 （２） 「Leu−3a−Pe」〔抗ヒトLeu−3aフイコエリト
リン接合体、ベクトン・デイキンソン（Becton Dickins
on,Mountain View,CA94039製〕10μ、 （３） 「OKT−4A−FITC」（Ortho−mune OKT−4aマウ
ス単クローン性抗体−FITC接合体、抗−ヒトインデュー
サー／ヘルパーＴ細胞、オルト・デイアグノステイック
・システムズ社（Ortho Diagnostic Systems,Inc.,Rari
tan,NJ 08869製〕10μ。

懸濁液をかくはんして細胞塊を抗体溶液と混合した。
細胞を22℃で15分間蛍光標識抗CD4抗体と反応させた。

インキユベーション後、PBS、pH7.4、1mlを２試料に
加え、細胞懸濁液を再び遠心分離（前記のように）によ
り濃縮した。上澄み（ＡおよびＢ）は細胞に結合しなか
った抗体を含有し、これを除去した。PBSによる洗浄お
よび遠心分離機による濃縮の操作を２回繰返して各上澄
みを除去した。

細胞をPBS中に懸濁させて試験した。試料Ａの細胞の
みが顕微鏡検査、分光測光およびFACS検定により蛍光性
であったので、それらだけがそれらの膜中へCD4抗原を
取込んだと考えることができた。

さらに、プールした上澄み中の蛍光物質（FITC）の量
を、470nmの励起波長および480〜600nmにおける発光波
長検定を用いて蛍光分光法により測定した。

タンパク質蛍光測定は280nmの励起波長を前記と同じ
発光範囲で用いた。

プールした上澄みＡおよびＢ間の蛍光強度の差異は赤
血球に結合した蛍光標識の量に正比例した。従って、初
期抗体濃度および赤血球の数を知るとCD4分子毎細胞の
数に対する平均値を計算することが簡単であった。

上記操作において、各試料ＡおよびＢは約1400万の細
胞を含み、蛍光単クローン性抗体の全量は約0.0021mgで
あった。CD4抗原の平均分子量が約58,000ドルトンであ
り、各インキユベーション混合物は約７兆個の抗体分子
を含有した。

これらの値を および、Ｎ＝抗体分子の数×（１−Ｒ） に用い、タンパク質蛍光スペクトル（励起＝280nm）か
ら計算した値はＲ＝1.1であった。

FIFC蛍光に対する相当する値はＲ＝1.33であった。

細胞膜中のCD4分子が抗体により飽和されたと仮定す
ると、結合した抗体の数は取込んだCD4分子の数（上式
中のＮ）に等しい。Ｒ＝1.1を用いるとＮに対する値は3
7,000であった。

Ｒ＝1.33を用いると値はＮ＝59,300であった。用いた値
はタンパク質蛍光またはタンパク質結合FITC蛍光を測定
するかにより、結果は従ってこれらの値の平均である。
従って我々の計算は37,000〜60,000CD4分子毎細胞を示
した。

実施例３ 赤血球中のリシン毒素の封入 （ａ） 実施例１に示した操作により調製した赤血球を
冷0.15M−NaClで数回洗浄し、遠心分離してペレットを
得た。次いで細胞をPBS中にpH7.4で再懸濁した。

（ｂ） 次いで赤血球の懸濁液をPBS、pH7.4、中に0.1m
Mまでの純リシン毒素（シグマ・ケミカル社の精製Ａ
鎖）を含む溶液で洗浄した。赤血球を1,000gで10分間遠
心分離し、上澄みを廃棄し、最終ヘマトクリットを食塩
水で70％に調整した。

（ｃ） 赤血球懸濁液を４℃に冷却し、0.41平方メート
ルの透析表面および13.4ミクロンの膜厚を有する普通の
血液透析器の血液画室中へ連続的に流れさせた。蠕動ポ
ンプで20〜60ml/分の定赤血球流量を維持した。血液透
析器は低イオン強度緩衝液（0.01Mリン酸ナトリウム、
0.01M炭酸水素ナトリウム、0.002Mグルコース）をpH7.4
で、温度を４℃に維持して500ml/分の定流量で供給し
た。この透析段階の間に、赤血球を、8.3のＫ対Na比で1
M塩化物塩を含む（毎リットル）高張液1/10容積の添加
による再封の前に37℃で溶解して捕集した（高ATP含量
を再封細胞中に維持するため）。

（ｄ） 次いで細胞懸濁液を捕集し、37℃で30分間維持
して細胞を再封させた。次いで赤血球を、1mM塩化カル
シウム、1mM塩化マグネシウムおよび2mMグルコースを含
む（毎リットル）0.15M−NaCl溶液で２回洗浄する。次
いで赤血球を、選択ヘマトクリットで融合前に未変性自
己血漿中に懸濁させる。

実施例４ 赤血球中ヘリシンまたはゲロニン毒素を封入させる他の
操作 （ａ） 実施例１の同じ脂質混合物で開始し、残留有機
溶媒の蒸発によりそれをとり、封入させる毒性物質（例
えば、リシン、ゲロニンなど）をフイリポット（Philip
pot）ほかにより記載された操作によりHEPES緩衝液〔10
mM−HEPES（pH7.4）/1mM−EGTA/150mM−NaCl）中で導入
した。約0.01〜0.02μｇ毎十億リポソームの最終値を与
える十分な毒素を用いた。２相系を短時間渦動し、脂質
を混合物中の成分の最高転移温度以上の温度で30分間水
和させた。少量の洗浄剤〔トライトン（Triton）Ｘ−10
0〕を加え、試料の容積をHEPES緩衝液で0.625mlに調整
した。激しく振りまぜた後洗浄剤を除去した。

（ｂ） ３つの異なる方法を洗浄剤の除去に用いた： ｉ 試料を1cm幅の透析袋中に置き、0.01Mトリ
ス−HCl（pH7.4）/1mM−EDTA/0.15M−NaCl1に対し、
媒質を４交換して透析した。

ii 透析媒質の量を100mlに減少し、バイオ−ビ
ーズ（Bio−Beads）〔型SM−２、バイオ−ラド社（Bio
−Rad,Richmond,CA）製〕を袋の外側緩衝液中に加え
た。媒質は交換しなかった。

iii 若干の試験において、バイオ−ビーズを試
験管中のリポソーム調製物に直接加え、回転ミキサー上
に置き、10RPMで少くとも３時間回転した。

（ｃ） 必要なときには、リポソーム懸濁液をセフアロ
ース4Bカラムに通して非封入物質を除去した。次いでリ
シン含有リポソームを実施例１におけるようにリゾチー
ムおよびCD4の挿入に用いる。

（ｄ） 次いで赤血球を実施例１に記載のようにリシン
（またはゲロニン）含有リポソームとともにインキユベ
ートする。融合効率は蛍光顕微鏡検査により、およびFA
CS分析によりモニターした。大規模製造に対し、蛍光標
識が単にモニターのために要求されたので蛍光標識なく
リシンを用いて操作を行なうことができる。

実施例５ ゲロニンを含むCD4−リポソームによるHIV感染細胞の試
験管内相互作用 （ａ） Ｔ細胞集団、H9、をHT細胞系からクローン化
し、細胞の若干をHIV分離株で持続感染した。次いで細
胞をRPMI 1640媒質（10％補体除去ウシ胎仔血清、0.2mM
グルタミンを含む）中でヨフエ（Yoffe）ほか、プロシ
ーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Proc.Nat.Acad.Sci.）USA、84、1429
〜1433（1987）に記載されたように培養する。H9/HIV細
胞は光学顕微鏡検査により試験したときに未感染細胞と
は形態的に区別できない。従って、H9/HIV細胞によるウ
イルス生成は電子検微鏡検査並びに標準逆転写酵素検定
によりモニターした。

（ｂ） 若干が抗HIV抗体に対し陰性であり、若干が陽
性であった血液供与者からCD4抗原を含む細胞を得た
〔ヨフエ（Yoffe）ほか、前掲、に記載されたよう
に〕。

（ｃ） 細胞を、（Cr−51）クロム酸ナトリウム0.5mCi
〔ニュー・イングランド・ニュークリア社（New Englan
d Nuclear,Boston,MA）製〕を用いて37℃で90分間標識
し、次いでリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄した。次いで
標識細胞を10,000細胞毎ウエルの濃度に培養皿中へ塗布
した。

（ｄ） CD4−リポソーム、CD4−リポソームプラス遊離
ゲロニン、およびゲロニン封入CD4−リポソームのそれ
ぞれを、Ｔ細胞を入れた個々のウエルに、５リポソーム
毎Ｔ細胞の比に加えた。次いで非感染H9細胞およびHIV/
H9細胞を個々にそれぞれのリポソーム調製物とともに37
℃で18時間インキユベートする。

（ｅ） インキユベーション後、培養から上澄み液の10
0μ分割量を捕集し、放射能を液体シンチレーション
により測定した。各試験に対し試験を３回行なった（す
なわち、３培養を各試験に用いる）。結果はパーセント
比クロム−51遊離（SP REL）に関して解釈され、それ
は細胞融合の程度を示し、式、 （式中、 ER＝試験遊離 MR＝最大遊離 SR＝自然遊離である） により示される。

自然遊離（SR）は標識細胞（すなわち、H9またはHIV/
H9）のみを入れたウエル中の上澄み液から0.1ml分割量
を捕集することにより測定した。

最大遊離は１％トライトンＸ−100、0.1mlで溶解した
標識細胞の上澄み液0.1mlをとることにより測定した。

放射能はウエルカウンターを用いて測定した。

（ｆ） 18時間のインキユベーション後にH9細胞および
HIV/H9細胞の両方を回収し、洗浄し、トリパンブルーで
常法により染色して生存の程度を測定した。

有意量のCr−51遊離がHIV感染H9細胞をCD4抗原および
ゲロニンの両方を含むリポソームに暴露した試験にのみ
認められ、CD4−リポソームのみを用いた場合、または
ゲロニンが媒質中に遊離しCD4−リポソーム内に封入さ
れなかった場合には認められなかった。この試験に対す
る結果は表１に示される。

実施例６ エンジニアド赤血球による抗HIV陽性患者の臨床治療 抗HIV抗体に対して陽性と試験されたヒト患者はリシ
ン、アブリン、ゲロニンまたはジフテリア毒素を含有す
るエンジニアド赤血球で次のように治療される。患者は
充填エンジニアド赤血球（実質的にすべての細胞がCD4
抗原および細胞毒を含む）の食塩水懸濁液20mlまでを静
脈内（例えば腕中）に注射される。患者の状態を循環中
の抗HIV抗体の濃度の測定並びに患者の状態の一般的進
行によりモニターする。初期注射は医師が是認されると
考えると追加注射により事後処置することができる。

実施例７ リポソームおよびエンジニアド赤血球を用いるARCを有
する患者の治療 ARC（エイズ関連コンプレックス）を有すると思われ
るヒト患者は実施例６とほゞ同様に容態に対して治療さ
れる。しかし、このとき患者はエンジニアド赤血球とリ
ボソーム（ともに膜中のCD4および細胞素を含有する）
との組合せで注射される。この疾患状態における主標的
がリンパ節であるので、有利には患者は組織内（例えば
指間）に約1000億個のリポソームおよび最適活性量の修
飾赤血球の混合物を注射される。患者の状態は実施例６
におけるようにモニターされ、必要に応じて追加治療が
与えられる。

実施例８ AZTを含有するエンジニアド赤血球による抗HIV陽性患
者の臨床治療 抗HIV抗体に対しまたは本出願において開示された診
断法により陽性と試験された患者はアジド−３′−デオ
キシチミジン（AZT）を含む本発明の抗原修飾赤血球ま
たはリポソームで次のように治療される。患者は充填赤
血球またはリポソーム（該細胞またはリポソームは実質
的にすべてCD4抗原および細胞質隔離治療量のAZTを含有
する）の食塩水懸濁液20mlまでを静脈内（例えば腕中）
に注射される。そのような処置は臨床医により調整さ
れ、薬物の全用量は安全限界内、最適には４〜６時間当
り100〜300mg、に保たれる。次いで患者の状態が循環中
の抗HIV抗体の存在の測定（または本出願において示さ
れる診断法により）、並びに患者の状態の一般的進行が
モニターされる。次いで初期注射は、主治医が是認され
ると考えると４〜６時間毎に追加注射により事後処置さ
れる。

明細書および特許請求の範囲が本発明の例示であって
限定でなく、また発明の精神および範囲内の他の態様が
当業者に連想されると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ガレット エム イーラー アメリカ合衆国 テキサス州 77840 カレッジ ステーション ラングフォー ド ストリート 1115 (56)参考文献 特開 昭56−85287（ＪＰ，Ａ) 西独国公開3218121（ＤＥ，Ａ) 大阪大学医学雑誌，昭和60年，第37巻 ５号，第271−277ページ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】哺乳動物由来の赤血球細胞が標的細胞と選
   択的に結合しかつ融合するように誘導するヒトCD4タン
   パク質を、細胞膜中に導入した哺乳動物由来の赤血球細
   胞であって、前記哺乳動物由来の赤血球細胞の寿命が、
   少なくとも、通常の赤血球細胞の寿命に近く、かつ前記
   ヒトCDタンパク質が非免疫原性であることを特徴とする
   赤血球細胞。
2. 【請求項２】中に取込まれた１種又はそれ以上の細胞障
   害物質を更に含有する請求項１に記載の哺乳動物由来の
   赤血球細胞。
3. 【請求項３】前記細胞障害物質が、リシン、アブリン、
   ゲロニン及びジフテリア毒素、並びにそれらの毒性学的
   活性フラグメントからなる群から選択される、請求項２
   に記載の哺乳動物由来の赤血球細胞。
4. 【請求項４】前記細胞障害物質が、ゲロニン又はその毒
   性学的活性フラグメントである請求項３に記載の哺乳動
   物由来の赤血球細胞。
5. 【請求項５】中に取込まれた１種又はそれ以上の治療薬
   を更に含有する請求項１に記載の哺乳動物由来の赤血球
   細胞。
6. 【請求項６】前記治療薬が、抗ウイルス薬である請求項
   ５に記載の哺乳動物由来の赤血球細胞。
7. 【請求項７】前記治療薬が、AZT、アジド−３′−デオ
   キシチミジン（AZT）三リン酸、ジデオキシシチジン三
   リン酸、及びリバビリンからなる群から選択される請求
   項５に記載の哺乳動物由来の赤血球細胞。
8. 【請求項８】薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁され
   た請求項２に記載の哺乳動物由来の赤血球細胞を治療有
   効量で含有することを特徴とする組成物。
9. 【請求項９】薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁され
   た請求項５に記載の哺乳動物由来の赤血球細胞を治療有
   効量で含有することを特徴とする組成物。