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JP2608669B2 - 水和セライトおよびｄｎａの精製 - Google Patents

水和セライトおよびｄｎａの精製

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Publication number
JP2608669B2
JP2608669B2 JP5023001A JP2300193A JP2608669B2 JP 2608669 B2 JP2608669 B2 JP 2608669B2 JP 5023001 A JP5023001 A JP 5023001A JP 2300193 A JP2300193 A JP 2300193A JP 2608669 B2 JP2608669 B2 JP 2608669B2
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JP
Japan
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dna
sio
naoh
celite
buffer
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JP5023001A
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ダニエル・リー・ウッダード
エドリアン・ジーネル・ハワード
ジェームズ・アーサー・ダウン
Original Assignee
ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー filed Critical ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
Publication of JPH0622762A publication Critical patent/JPH0622762A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2608669B2 publication Critical patent/JP2608669B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

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  • Silicon Compounds (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子生物学の分野に関
する。特定すれば、本発明は、デオキシリボ核酸の精製
の領域に関する。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学における絶え間無い進歩およ
び関連した技術が、進歩した技術の十分な賞賛および開
発に関連した手段の改良に対する絶え間無い要求を示
す。
【０００３】広い範囲の技術は、さまざまな形態のデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）の使用を含む。例えば、組換え
ＤＮＡ技術の領域における進歩は、プローブ、ゲノミッ
クＤＮＡ、およびプラスミドＤＮＡの形態の使用を絶え
ず必要とする。
【０００４】治療の領域における進歩もさまざまな方法
でＤＮＡを利用し続ける。例えば、ＤＮＡプローブはヒ
トの病原体の検出および治療において日常的に使用され
ている。同様に、ＤＮＡは遺伝的疾患の検出において使
用される。ＤＮＡは、食物の汚染物の検出にも使用され
る。そして、ＤＮＡプローブは、遺伝子マッピングから
クローニングおよび組換え体の発現にわたる範囲のさま
ざまな動機に対して興味あるＤＮＡの所在を見つけだ
し、同定し、そして単離するのに日常的に使用される。
【０００５】多くの例において、ＤＮＡは極めて微量で
利用でき、そして単離法および精製法は骨が折れそして
時間を浪費しうる。時間を浪費し、骨の折れる方法はし
ばしばＤＮＡを損失する。血清、尿、および細菌培養物
から得られた検体からのＤＮＡの精製においては、付加
的な汚染の危険および偽陽性の結果が存在する。
【０００６】典型的なＤＮＡ精製プロトコルは腐食性組
成物および毒性組成物の使用を含む。典型的なＤＮＡ精
製プロトコルは、高濃度のカオトロピック（ｃｈａｏｔ
ｒｏｐｉｃ）な塩、例えば、ヨージドナトリウムおよび
過塩素酸ナトリウムを用いる。
【０００７】ＤＮＡ精製のためのプロトコルは多数存在
する。ＤＮＡ精製の領域における最近の活動により明ら
かなとおり、最適なＤＮＡ精製プロトコルのための絶え
間無い研究が存在する。米国特許第４，９２３，９７８
号は、蛋白質およびＤＮＡの溶液をヒドロキシル化され
た支持体に通過させて蛋白質を結合させ、そしてＤＮＡ
を溶出するＤＮＡの精製法を開示している。米国特許第
４，９３５，３４２号は、アニオン交換体に選択的にＤ
ＮＡを結合させ、そして次に溶出するＤＮＡの精製法を
開示している。米国特許第４，９４６，９５２号は、水
溶性ケトンを用いた沈殿によるＤＮＡ単離法を開示して
いる。カオトロプを用いてＤＮＡを透析するＤＮＡ精製
法は、米国特許第４，９００，６７７号に開示されてい
る。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡを精製するため
の本発明のプロトコルはその目的を達成することができ
るが、得るＤＮＡ量を増加させることに加えて、腐食性
および毒性化合物、例えばもっともしばしば用いられる
カオトロプ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）を用いずにＤＮＡ
を精製することが望まれる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、モノマーユニ
ットの組成物：
【化１３】 （但し、Ｒ’はＯＨ；ＲはＳｉＯ2；およびＲ’’はＯ
Ｈである）および、式；
【化１４】 （但し、Ｒ’は別々にＯＨまたは
【化１５】 ；ＲはＳｉＯ2、そしてＲ’’は別々にＯＨまたは
【化１６】 である）の該組成物の繰り返しユニットを提供する。上
記繰り返しユニットは約２以上含まれうる。範囲は約２
から約１００，０００，０００、および約２から約１０
０，０００を含む。
【００１０】本発明を実施することにより、さまざまな
源から、さまざまな形態のＤＮＡを精製することができ
る。その方法は、本発明の組成物を用い、そして結合緩
衝液、例えばカオトロプを随意に用いることが回避され
る。ＤＮＡは水性溶液、例えばＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に室温で結合させることが
できる。さらに、加熱により本発明の組成物から水中に
ＤＮＡを溶出するか、または通常用いられる緩衝液、例
えばＴＥまたは１×ＴＡＥを用いることができる。精製
されるＤＮＡの源は、バクテリア、バクテリオファー
ジ、検体、植物、動物、および類似物を含む。ＤＮＡは
さまざまな形態で見いだされ、そして一本鎖、二本鎖、
環状、および直鎖状を含みうる。本発明は、あらゆる源
のあらゆる形態のＤＮＡを用いて実施できる。
【００１１】本発明は、モノマーユニットの組成物：
【化１７】 （但し、Ｒ’はＯＨ；ＲはＳｉＯ2；およびＲ’’はＯ
Ｈである）および、式；
【化１８】 （但し、Ｒ’は別々にＯＨまたは
【化１９】 ；ＲはＳｉＯ2、そしてＲ’’は別々にＯＨまたは
【化２０】 である）の該組成物の繰り返しユニットおよび、その上
記モノマーおよび繰り返しユニットからなる組成物を提
供する。上記繰り返しユニットは約２以上含まれうる。
範囲は約２から約１００，０００，０００、および約２
から約１００，０００を含む。
【００１２】表面はＤＮＡの結合のために提供され、そ
して表面からＤＮＡが容易に回収される。また、ＤＮＡ
を、式
【化２１】 （但し、Ｒ’はＯＨ；ＲはＳｉＯ2；およびＲ’’はＯ
Ｈである）の組成物および、式；
【化２２】 （但し、Ｒ’は別々にＯＨまたは
【化２３】 ；ＲはＳｉＯ2、そしてＲ’’は別々にＯＨまたは
【化２４】 である）からなる該組成物の繰り返しユニットと接触さ
せることよりなる、ＤＮＡの精製法も提供される。
【００１３】水和剤とＳｉＯ2の反応生成物も提供され
る。
【００１４】本発明は、また、式
【化２５】 （但し、Ｒ’はＯＨ；ＲはＳｉＯ2；およびＲ’’はＯ
Ｈである）の組成物および、式；
【化２６】 （但し、Ｒ’は別々にＯＨまたは
【化２７】 ；ＲはＳｉＯ2、そしてＲ’’は別々にＯＨまたは
【化２８】 である）からなる該組成物の繰り返しユニットの製造法
も提供する。
【００１５】上記繰り返しユニットは約２以上含まれう
る。範囲は約２から約１００，０００，０００、および
約２から約１００，０００を含む。
【００１６】通常、水和剤とＳｉＯ2の反応生成物は、
上記モノマーユニットの繰り返しユニットからなるビー
ズ様構造になる。
【００１７】このポリマーの電気特性は、より慣用的な
特性である表面修飾を形成しうるが、このポリマーの存
在により、ビーズの中心において電気特性を変えること
ができる（本開示において記載されている目的のための
より効果的な表面にする）。例えば、表面は、ＳｉＣｌ
4を用いて、次に表面にシアノールコーティングをもた
らす水和により修飾されうる。繰り返しユニットの接触
とはＤＮＡとの相互作用であり、即ち、繰り返しユニッ
トからなる表面も本発明の実施に適するようになる。本
発明の組成物からなるように構成されうる表面は、ディ
ップスティックの形状、チューブ、バイアル、濾過装
置、および類似物を含む。
【００１８】本発明の組成物を得るための方法は、通常
水和剤、例えばＮａＯＨ（水性）をＳｉＯ2に添加し、
そして還流することを含む。
【００１９】本発明は、本発明の組成物とＤＮＡを接触
させることからなるＤＮＡ精製法も提供する。
【００２０】本発明の組成物およびＮａＯＨとＳｉＯ2
の反応物の生成法は、ＮａＯＨをＳｉＯ2に添加するこ
とからなる。Ｎａ+以外のあらゆるカウンターイオン
は、任意の濃度で、ＳｉＯ2に対する任意の比率で使用
できる。例えば、水酸化カリウムも使用できる。ＳｉＯ
2に対するＮａＯＨの比率は約０．１：１から１０：
１、好ましくは、約２：１である。その結果得られる生
成物を濾過し、次に洗浄および乾燥する。適切な洗浄剤
はアセトンおよび類似物を含む。生成物は、今ＤＮＡの
精製の使用のために準備された。
【００２１】あらゆるＤＮＡ精製法および単離法の開始
は、源から所望のＤＮＡを得ることを必要とする。検
体、例えば血清、尿、およびバクテリア培養物からＤＮ
Ａを得るための典型的なプロトコルはよく知られてお
り、そして日常的に実施されている。同様に、ゲノミッ
クライブラリーおよび類似物からＤＮＡを得るための能
力は日常的である。本発明の鍵は、ひとたび源から得ら
れたＤＮＡを精製する可能性にある。ＤＮＡを得るため
の典型的な方法は、ＤＮＡを溶液に懸濁することにより
終了する。引用文献は生物学的サンプルからのＤＮＡの
単離法として、ハーディング（Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｊ．
Ｄ．）、ゲビエフ（Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．）、ベビー
（Ｂｅｂｅｅ，Ｒ．）、シムズ（Ｓｉｍｍｓ，Ｄ．）、
クテバン（Ｋｔｅｖａｎ，Ｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：６９４７（１９８
９）、およびマルコ（Ｍａｒｋｏ，Ｍ．Ａ．）、チッパ
ーフィールド（Ｃｈｉｐｐｅｒｆｉｅｌｄ．Ｒ．）およ
びバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．）、Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２
１：３８２（１９８２）を含む。プラスミドＤＮＡの単
離法は、ルッツェ（Ｌｕｔｚｅ，Ｌ．Ｈ．）、ワインガ
ー（Ｗｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ａ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６１５０（１９９
０）に見いだすことができる。二本鎖ＤＮＡの抽出法
は、ヤマダ（Ｙａｍａｄａ，Ｏ．）、マツモト（Ｍａｔ
ｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．）、ナカシマ（Ｎａｋａｓｈｉｍ
ａ，Ｍ．）、ハグリ（Ｈａｇｒｉ，Ｓ．）、カマホラ
（Ｋａｍａｈｏｒａ，Ｔ．）、ウエヤマ（Ｕｅｙａｍ
ａ，Ｈ．）、キシ（Ｋｉｓｈｉ，Ｙ．）、ウエムラ（Ｕ
ｅｍｕｒａ，Ｈ．）、クリムラ（Ｋｕｒｉｍｕｒａ，
Ｔ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７：２０３（１９９０）に見い
だすことができる。ほとんどのＤＮＡ溶液は、適切な緩
衝液、例えばＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ：１ｍ
Ｍ））、ＴＥＡ（４０ｍＭ トリス−酢酸、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）緩衝液中のＤＮＡ、または溶菌液からなる。Ｄ
ＮＡが適切な溶液中に得られれば、典型的には結合マト
リックスを溶液に添加する。通常用いられる結合マトリ
ックスはガラスまたは珪藻の形態のシリカである。しか
しながら、シリカを用いる方法は、表面にＤＮＡを結合
させるために高濃度のカオトロプ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ
ｓ）またはアルコールを必要とする。最近用いられてい
るカオトロプはヨージドナトリウム（ＮａＩ）、尿素、
塩酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌ
Ｏ4）、および臭化カリウム（ＫＢｒ）を含む。カオト
ロプおよびアルコールは、毒性、腐食性、引火性および
／または高価でありうる。本発明の方法は、本発明の表
面への結合にカオトロプまたはアルコールを必要としな
い。本発明の方法は、室温において水性溶液中でＤＮＡ
を結合し、そして３７℃においてＤＮＡを水中に溶出す
る。しかしながら、もし必要であれば、カオトロプ、ア
ルコールおよび類似物を本発明の方法において使用する
ことができる。
【００２２】本発明の方法を用いるための典型的な方法
は、ＤＮＡ溶液に本発明の組成物を添加することを含む
が、添加は通常、結合緩衝液の添加の次に行われる。こ
の点において、本発明の方法が結合緩衝液を必要としな
いことは利点である。溶液は短時間室温でインキュベー
トする。遠心分離後、上清を捨て、そして沈殿を洗浄す
ることができる。次にＤＮＡを溶出する。
【００２３】本発明の組成物は、組成物重量：水が約
１：１０から約１：１の比率の範囲で用いられるのが典
型的である。好ましくは、過剰量の水を避け、緩衝液、
例えばＴＥを水の代わりに用いることができる。
【００２４】次に、もし用いるのならば結合緩衝液を添
加する。室温において約１分から約２０分間、好ましく
は約１０分間の短時間インキュベートした後に、コンテ
ナーを遠心分離後、沈殿画分と上清画分を得る。上清を
別にし、そして沈殿を試薬、例えば、５０ｍＭトリスで
希釈したエタノールで洗浄する。好ましい洗浄試薬濃度
は８０％エタノールである。次に、溶出緩衝液、例えば
ＴＥ緩衝液、１×ＴＡＥ緩衝液、および１×ＴＢＥ緩衝
液を用いてＤＮＡを本発明の組成物から溶出する。より
重要なことは、溶出緩衝液の使用が避けられ、そして、
ＤＮＡは加熱により水中に溶出することである。収量を
最大にするためには、溶出工程を繰り返す。
【００２５】本発明の化学組成物は、便利なようにキッ
トを組むことができる。本発明の組成物を含むキットは
コンテナー、例えばバイアル中に、適切な緩衝液、例え
ばＴＥ緩衝液およびＴＡＥ緩衝液と共に含むことがで
き、そして必要であれば、結合緩衝液、例えばカオトロ
プのコンテナー、洗浄緩衝液、例えば５０ｍＭトリスで
希釈したエタノール溶液、または１×ＴＡＥのコンテナ
ー、および溶出緩衝液、例えばＴＥ緩衝液、１×緩衝液
溶液および１×ＴＢＥ緩衝液のコンテナーを含むことが
できる。そのようなキットはＤＮＡの精製を便利にす
る。
【００２６】以下の実施例において、本発明の特定の態
様を例示する。当業者には明らかなとおり、さまざまな
変更および修飾は、記載された本発明の目的の範囲内で
あると考えられる。
【００２７】
【実施例】実施例１ 本実施例の目的は、ＮａＯＨのさまざまな溶液中で還流
することにより、酸で洗浄されたセライト５４５上のヒ
ドロキシル基を増加させることである。ヒドロキシルの
増加により、化学反応による表面の修飾が容易になる。
【００２８】材料 酸で洗浄されたセライト５４５（オルテック（Ａｌｌｔ
ｅｃｈ）、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ｉｌ，ストック＃９０
４３、ＱＣ２４３） ＮａＯＨ（アルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ロット＃
０４０２７ＥＰ） ＮａＯＨ量を一つの実験から次の実験において変更する
以外は、８つの実験を同じ方法で正確に行った。
【００２９】 実験 セライト５４５ ＮａＯＨ ｑ ｍＭｏｌ ｍｇ ｍＭｏｌ ｅｑセライト １ ０．５ ８．３３ １６．８ ０．４２ ０．０５ ２ ０．５ ８．３３ ３３．２ ０．８３ ０．１ ３ ０．５ ８．３３ １００．０ ２．５０ ０．３ ４ ０．５ ８．３３ １６８．０ ４．２０ ０．５ ５ ０．５ ８．３３ ２３３．０ ５．８３ ０．７ ６ ０．５ ８．３３ ３３３．０ ８．３３ １ ７ ０．５ ８．３３ ５００．０ １２．５０ １．５ ８ ０．５ ８．３３ ６６６．０ １６．６６ ２ 典型的な実験においては、セライト５４５を丸底フラス
コに添加し、次に１０ｍｌのＨ2Ｏに溶解したＮａＯＨ
を添加した。撹拌しながら４８時間還流した。濾過し、
水およびアセトンで洗浄し、そして空気乾燥した。デシ
ケーター中に保存した。実施例１の結果および結論：Ｆ
ＴＩＲ分析が行われ、出発物質に比較して、水和表面の
−ＯＨシグナルの増加を示した。
【００３０】実施例２ 本実験は、スーパーファインスーパーフロスセライト
（ＳＵＰＥＲ ＦＩＮＥＳＵＰＲＥ ＦＬＯＳＳ ＣＥ
ＬＩＴＥ）（Ｍａｎｖｉｌｌｅ）のＤＮＡ結合能力がい
かにして測定されるか、およびＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ
ＤＮＡ精製キットといかにして比較されるかを記載す
る。
【００３１】材料 スーパーファインスーパーフロスセライト（ＳＦＳＦ）
（マンビル（Ｍａｎｖｉｌｌｅ）、Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ
のサンプル、（水中で１：５ｗ／ｗ）） λＤＮＡ（ＢＲＬカタログ番号５６１２５Ａ、ロットＡ
ＪＵ７０２） ５０ｍＭトリス（ｐＨ７．０）（１Ｍストックから希
釈）（ＢＲＬカタログ番号５５０５ＵＡ、ロット６０９
２６） （Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅキット（バイオラッド（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）） 結合緩衝液（６Ｍストックから希釈）、ＮａＣｌＯ4：
フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）カタログ番号５４９０−
５００、ロット９１４１９９ 洗浄緩衝液８０％エタノール（５０ｍＭトリス中、ｐＨ
７．０） 溶出緩衝液ミリＱ水 エチジウム ブロマイド（１０ｍｇ／ｍｌ）シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）カタログ番号Ｅ−８７５１、ロット９９Ｆ３
７２２ １％アガロースＢＲＬカタログ番号５５１０ＵＡ、ロッ
ト９Ｎ２２０４ １×ＴＡＥ（５０×ストックより）トリス塩基−Ｓｉｇ
ｍａカタログ番号Ｔ−１５０３，ロット８０Ｈ５６３
３、酢酸−フィッシャー Ａ３８−５００、ＥＤＴＡ−
Ｓｉｇｍａカタログ番号ＥＤ２５５、ロット１１７Ｆ−
００２６ ＴｙｐｅＩＩローディング染料（２５％Ｆｉｃｏｌｌ４
００、０．２５％ブロムフェノールブルー、０．２５％
キシレンシアノール、Ｆｉｃｏｌｌ４００−Ｓｉｇｍａ
カタログ番号Ｆ４３７５、ブロムフェノールブルー−バ
イオラッドカタログ番号１６１−０４０４、ロットＭ１
２６４、キシレンシアノール−Ｓｉｇｍａカタログ番号
Ｘ−４１２６、ロット８０４３７４０） Ｔｙｐｅ５７およびＴｙｐｅ５５ポラロイドフィルム
（ＰＯＬＡＲＯＩＤＦｉｌｍ）方法 １．２グループの反応物を用意し、一つを各表面タイプ
に用いる。各表面は５０μｌのＤＮＡ溶液を含む８つの
チューブを有する。この溶液は、５０μｌの５０ｍＭト
リス（ｐＨ７．０）中に０．５μｌのλＤＮＡを含み、
３１μｇ／反応とする。滴定は０Ｍ ＮａＣｌＯ4から
６Ｍ ＮａＣｌＯ4の範囲である。
【００３２】２．各反応物に２０μｌの各表面を加え
る。
【００３３】３．滴定に従い、４００μｌの結合緩衝液
を加える。Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅについては、０Ｍ，
２Ｍ，２．５Ｍ，３Ｍ，３．５Ｍ，４Ｍ，４．５Ｍ，お
よび６ＭのＮａＣｌＯ4であった。ＳＦＳＦについて
は、滴定は０Ｍ，１Ｍ，１．５Ｍ，２Ｍ，２．５Ｍ，３
Ｍ，３．５Ｍ，および４Ｍ ＮａＣｌＯ4であった。
【００３４】４．ロッキングして、室温で１０分間イン
キュベートする。
【００３５】５．遠心分離し、そして上清を捨てる。
【００３６】６．８０％エタノール／５０ｍＭトリス
（ｐＨ７．０）により２回沈殿を洗浄する。
【００３７】７．３７℃において１０分間、２０μｌ
Ｈ2ＯにＤＮＡを溶出する。
【００３８】８．遠心分離し、そして別のチューブに上
清を移す。溶出工程を繰り返し、そして総量約４０μｌ
に上清を混合する。
【００３９】９．各チューブにＴｙｐｅＩＩローディン
グ染料を２μｌ加える。
【００４０】１０．１×ＴＡＥ緩衝液を用いた１％アガ
ロースで電気泳動する。１×ＴＡＥ緩衝液を用いて１０
０−１３０ボルトで約２５分間泳動する。
【００４１】１１．エチジウム ブロマイド水溶液（約
１：１０００）で１５分間染色する。約２０−３０分間
脱色する。
【００４２】１２．Ｔｙｐｅ５７ポラロイドフィルムを
用いて紫外線下で写真を撮る。可能であれば、Ｔｙｐｅ
５５フィルムでネガティブを撮る。
【００４３】結果および結論 ＳＦＳＦセライトは、ＤＮＡを結合するために３Ｍ Ｎ
ａＣｌＯ4を必要とするＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅのマト
リックスと比較して、２．５ｍＭの濃度のＮａＣｌＯ4
を用いる結合緩衝液において強くＤＮＡを結合する。こ
の理由から、ＳＦＳＦは、水和表面に匹敵する標準物と
して使用される。
【００４４】実施例３ 以下の実験の目的は、どの濃度における結合緩衝液にお
いて、水和ＳｉＯ2がサンプルからのＤＮＡ回収を可能
にするかを決定することである。結果をスーパーファイ
ンスーパーフロスセライトと比較する。
【００４５】表面 １．酸洗浄セライト５４５＋０．０５ｅｑＮａＯＨ ２．酸洗浄セライト５４５＋０．１ｅｑＮａＯＨ ３．酸洗浄セライト５４５＋０．３ｅｑＮａＯＨ ４．酸洗浄セライト５４５＋０．５ｅｑＮａＯＨ ５．酸洗浄セライト５４５＋０．７ｅｑＮａＯＨ ６．酸洗浄セライト５４５＋１ｅｑＮａＯＨ ７．酸洗浄セライト５４５＋１．５ｅｑＮａＯＨ ８．酸洗浄セライト５４５＋２．０ｅｑＮａＯＨ ９．スーパーファインスーパーフロスセライト 外の材料および方法は前記のとおりであり、そして実質
的には実施例２にしたがって実施される。
【００４６】結果 ： 試験表面に対する強いＤＮＡ結合に セライト＋ＤＮＡ 必要な結合緩衝液の濃度 ＤＮＡ結合１Ｎ−４Ｍ［ＮａＣｌＯ4］ ０．０５ｅｑＮａＯＨ ＋ ０．１０ｅｑＮａＯＨ ＋ ０．３０ｅｑＮａＯＨ ＋＋ １．５Ｍ ０．５０ｅｑＮａＯＨ ＋＋ ２．０Ｍ ０．７０ｅｑＮａＯＨ ＋＋ ２．０Ｍ １．０ｅｑＮａＯＨ ＋＋ ２．０Ｍ １．５ｅｑＮａＯＨ ＋＋ １．５Ｍ ２．０ｅｑＮａＯＨ ＋＋＋ ＊ ＳＦＳＦセライト ＋＋ ３．０Ｍ ＋ 滴定を通じてわずかな量のＤＮＡの溶出。
【００４７】＋＋ １．５，２．０または３．０Ｍ
ＮａＣｌＯ4においてほとんど全量のＤＮＡが溶出。
【００４８】＋＋＋ 滴定を通じてほとんど全量のＤＮ
Ａが溶出。
【００４９】＊ 自然条件において溶出されたＤＮ
Ａ。室温において水中においてＤＮＡが結合し、そして
３７℃において溶出された。
【００５０】結論 ゲル電気泳動の結果から、セライトに対するＮａＯＨ量
が増加するにつれて、もたらされる表面からのＤＮＡの
回収が増加したことが証明される。ＮａＯＨ：セライト
のモル比が２．０に到達すると自然条件下においてＤＮ
Ａが回収された（結合緩衝液を必要としない）。ほとん
どの表面はＳＦＳＦセライトよりも良好にＤＮＡを単離
し、この結果を得るのに通常必要とする濃縮量の結合緩
衝液を必要としなかった。
【００５１】本発明を特定の態様にしたがって記載して
きたが、その詳細は限定されるように理解されるべきで
はなく、本発明の精神または範囲を逸脱することなく、
さまざまな均等、変更および改変がなされるのは明らか
であり、そしてそのような均等な態様はここに含まれる
と理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドリアン・ジーネル・ハワード アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27704，ダーラム，ニュー・キャスル・ ロード 1321，アパートメント エイ− ４ (72)発明者 ジェームズ・アーサー・ダウン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27511，キャリー，チャーター・オーク ス・サークル 101 (56)参考文献 特開 昭53−61599（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−61600（ＪＰ，Ａ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＳｉＯ2と水和剤の混合物を４８時間以
    上還流することにより生成された、以下の構造： 【化１】 （式中、Ｒ’はＯＨであり、ＲはＳｉＯ2であり、そし
    てＲ''はＯＨであるか、またはＲ’はＯＨまたは 【化２】 であり、ＲはＳｉＯ2であり、そしてＲ''はＯＨまたは 【化３】 である） を有する水和されたシリカ化合物に、ＤＮＡを接触させ
    ることからなる、ＤＮＡの精製方法。
  2. 【請求項２】 カオトロプの使用をさらに含む、請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 水和されたシリカ化合物からＤＮＡを溶
    出する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 加熱および水により溶出する、請求項３
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＳｉＯ2と水和剤の混合物を４８時間以
    上還流することにより生成された、以下の構造： 【化４】 （式中、Ｒ’はＯＨであり、ＲはＳｉＯ2であり、そし
    てＲ''はＯＨであるか、またはＲ’はＯＨまたは 【化５】 であり、ＲはＳｉＯ2であり、そしてＲ''はＯＨまたは 【化６】 である）を有する水和されたシリカ化合物を含む、ＤＮ
    Ａを精製するためのキット。
  6. 【請求項６】 ＳｉＯ2と水和剤の混合物を４８時間以
    上還流することにより生成された、以下の構造： 【化７】 （式中、Ｒ’はＯＨであり、ＲはＳｉＯ2であり、そし
    てＲ''はＯＨであるか、またはＲ’はＯＨまたは 【化８】 であり、ＲはＳｉＯ2であり、そしてＲ''はＯＨまたは 【化９】 である） を有する、水和されたシリカ化合物。
  7. 【請求項７】 ＳｉＯ2と水和剤の混合物を４８時間以
    上還流することからなる、以下の構造： 【化１０】 （式中、Ｒ’はＯＨであり、ＲはＳｉＯ2であり、そし
    てＲ''はＯＨであるか、またはＲ’はＯＨまたは 【化１１】 であり、ＲはＳｉＯ2であり、そしてＲ''はＯＨまたは 【化１２】 である） を有する水和されたシリカ化合物の生成方法。
  8. 【請求項８】 ＳｉＯ2とＮａＯＨの混合物を還流する
    ことにより生成された、請求項６記載の水和されたシリ
    カ化合物。
  9. 【請求項９】 ＳｉＯ2をＮａＯＨと還流する、請求項
    ７記載の方法。
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