KR100714988B1

KR100714988B1 - 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 이용한ｄｎａ 정제 방법 및 정제장치

Info

Publication number: KR100714988B1
Application number: KR1020050072986A
Authority: KR
Inventors: 박종면; 백상현; 유창은
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2005-08-09
Filing date: 2005-08-09
Publication date: 2007-05-09
Anticipated expiration: 2025-08-09
Also published as: KR20070018351A; US20070197780A1

Abstract

본 발명은 DNA 정제방법 및 장치에 대한 것으로 보다 구체적으로는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용하는데, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면의 pH를 실라놀의 pKa 보다 낮게 유지하여 수산기를 띠게 하여 세포추출물등에 포함된 DNA가 상기 표면에 결합되게 한 후 상기 구조물에 결합되지 않은 나머지 물질을 제거하고, 다시 상기 구조물표면으로부터 결합된 DNA가 분리되도록 실라놀의 pKa 보다 높은 pH를 유지함으로써 DNA를 정제하는 정제방법 및 장치에 대한 것이다.

본 발명에 따른 정제방법은 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물과 DNA 포함 유체시료를 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH에서 접촉시키는 단계; 상기 유체시료가 접촉된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로부터 나머지 유체를 제거하고 세척하는 단계; 및 상기 세척된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 실라놀의 pKa 보다 높은 pH조건으로 처리하는 단계를 포함하여 구성된다.

이상의 본 발명에 따르면 아무런 표면처리 없이 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 그대로 사용하므로 장치의 제작이 극히 용이하고 환경에 유해한 카오트로픽 염(Chaotropic salt)이나 독성있는 유기용매를 사용함 없이 DNA를 포함하는 유체시료로부터 DNA를 극히 용이하게 정제할 수 있다.

Description

산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 이용한 ＤＮＡ 정제 방법 및 정제장치 {Method for DNA purification using bare surface of SiO2 structure,and Purification Apparatus thereby}

도 1은 본 발명에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 이용한 DNA 정제 방법에서 실라놀의 pKa 에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면의 상태변화 및 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면의 상태변화에 따른 DNA 결합여부를 모식화하여 도시한 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 DNA 정제 방법 및 장치에서 사용되는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 형성되는 필라 타입의 일 실시예를 확대 도시한 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 이용한 DNA 정제장치의 기능적요소를 도시한 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 이용한 DNA 정제방법에서 피코그린(picogreen)으로 표지된 gDNA(2.5ng/ul)를 이용하여 각 단계에서 얻어진 배출물(eluate) 즉 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태에서 얻어진 배출물과 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태에서 얻어진 배출물의 피코그린 측정결과를 그래프로 도시한 것이다.

도 5은 본 발명에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 이용한 DNA 정제장치, CST사의 DNA 정제키트 및 콰이아젠사의 DNA 정제키트에서 E.Coli의 세포추출물(cell lysate)을 정제할 때 마지막으로 얻어진 배출물에 함유된 단백질 양을 정량하여 그래프로 도시한 것이다.

도 6는 본 발명에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 이용한 DNA 정제장치, DRI(DNA Research Innovations, Inc., UK)사의 CST(Charge Switch Technology) DNA 정제키트 및 콰이아젠사의 DNA 정제키트에서 E.Coli의 세포추출물(cell lysate)을 정제할 때 마지막으로 얻어진 배출물의 PCR결과를 그래프로 도시한 것이다.

최근, DNA 해석 기술의 중요성이 부각되면서, 생체로부터 DNA를 분리하는 기 술도 중요한 기술로서 많은 개량이 부가되고 있다. 사실 DNA를 효율 좋게 분리 및 농축하는 기술은 여러 가지 점에서 유용하지만 특히 혈액에 극히 미량으로 포함되어 있는 병원균의 실마리를 재빨리 포착하게 함으로써 신속한 치료가 가능해질 수 있다는데 있다. 또한 세균의 유익한 DNA를 꺼내 해석하면, 의약품과 유전자 합성 작물의 연구에 유용하다. 그런데 일반적으로 혈액과 각종 세포 등 생체에 포함된 DNA는 단백질 등 다수의 물질이 섞여 있어 DNA 만을 추출하기 위해서는 특별한 처리가 필요하며 수고가 들었다. 따라서 분리에서 농축까지의 처리를 하나의 칩으로 가능하게 되면 처리 시간의 대폭적인 단축과 저비용화를 기대할 수 있다.

이러한 분리 방법의 하나로서 미국특허 제5342931호( 발명의 명칭 : Process for purifying DNA on hydrated silica)는 silica 표면을 강 알칼리로 처리하여 수산기(hydroxyl기)를 증가시킨 후 이를 이용하여 TE, TAE, TBE 버퍼조건(중성)에서 DNA를 결합시키고, 가열된 물 또는 버퍼로 DNA를 분리하는 기술을 개시하고 있고,

미국 특허번호 제5693785호(발명의 명칭 : Purification of DNA on hydroxylated silicas)는 silica 표면을 강 알칼리로 처리하여 O^-기를 증가시킨 후 산성화(pH4-5)시켜 수산기(hydroxyl기)를 증가시킨 후 이를 이용하여 TE, TAE, TBE 버퍼조건(중성)에서 DNA를 결합시키고, 가열된 물 또는 버퍼로 DNA를 분리하는 기술을 개시하고 있으며,

미국특허 제5707799호(발명의 명칭: Device and methods utilizing arrays of structures for analyte capture)는 테스트 샘플에서 분석물의 존재 또는 함량 을 결정하기 위한 검출장치에 대한 것으로, 상기 기판상에 반응물을 고정화시키기 위해 표면처리되어 있는 구조물들이 배열되는 검출장치를 개시하고 있다.

그런데, 이러한 종래의 DNA 정제를 위한 방법 및 장치들은 DNA 결합 전에 기판의 표면을 화학적으로 처리하는 공정을 필수적으로 요구한다는 문제점을 가지고 있었다.

이에, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 칩에 구현 가능한 DNA 정제 방법을 연구하던 중, 어떠한 표면처리도 하지 않은 상태의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면의 pH를 실라놀의 pKa 보다 낮게 유지하면 상기 표면이 수산기를 띠게 되어 세포추출물등에 포함된 DNA만이 상기 표면에 결합되고, 상기 구조물표면에 결합된 DNA는 실라놀의 pKa 보다 높은 pH를 유지하게 되면 상기 구조물표면으로부터 매우 쉽게 분리되는 것을 확인하고, 본발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 시료 중의 DNA가 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합하는 pH조건과 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합된 DNA가 상기 표면으로부터 분리되는 pH조건을 이용하여 시료 속에 포함된 DNA를 정제할 수 있는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제방법 및 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카이오트로픽 염(Chaotropic salt)이나 유해한 유기용매를 사용하지 않으면서도 시료 속에 포함된 DNA를 친환경적으로 정제할 수 있는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제방법 및 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 코팅 등을 통해 다시 처리할 필요 없이 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 그대로 이용하기 때문에 제작이 용이할 뿐만 아니라 핵산 증폭부 등의 다른 모듈과의 결합시 필요한 공정인 양극접합(anodic bonding) 등에 제약을 받지 않는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제방법 및 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제방법 및 장치를 마이크로플루이딕스 기술을 이용하여 프로세스-온-어-칩(process-on-a-chip) 또는 랩-온-어-칩(lab-on- a-chip)으로 구현하는 것이다

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물과 DNA 포함 유체시료를 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH에서 접촉시키는 단계; 상기 유체시료가 접촉된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로부터 나머지 유체를 제거하는 단계; 및 상기 나머지 유체가 제거된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 실라놀의 pKa 보다 높은 pH조건으로 처리하는 단계를 포함하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제 방법을 제공한다.

여기서, 상기 실리콘 구조물은 그 표면에 산화막(SiO2)이 형성되어 있으며, 그 형상이 제한되지는 않으나 DNA를 포함하는 유체시료와 접촉하는 면적이 넓을수 록 유리하게 되므로, 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물은 그 표면이 유체와 접할 때 가능한 넓은 표면적을 갖도록 형성되는 것이 바람직하다.

한편, 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 상기 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태인 유체시료가 접촉되면 상기 구조물 표면이 수산기를 띠게 되고, DNA가 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합되게 된다. 여기서, 상기 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태는 바람직하게는 pH 3 내지 6.5인 범위를 의미하는데, pH가 3보다 작으면 DNA가 손상되게 되고, pH가 6.5보다 크게 되면 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면이 수산기를 띠지 않게 되기 때문이다. 상기 pH 3 내지 6.5인 버퍼는 예를 들면, 포르메이트(formate), 싸이트레이트(citrate),숙시네이트( succinate), 아세테이트(acetate) 등이 있다.

또한 유체시료의 pH를 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태로 유지하기 위해 시료를 준비하는 과정에서 상기 버퍼를 사용하여 미리 조절하는 것이 바람직하다.

따라서, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물과 DNA를 포함하는 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH를 갖는 유체시료를 접촉시키는 단계는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 DNA를 포함하는 pH 3 내지 6.5인 유체시료로 처리한 후 일정시간 유지함으로써 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면이 수산기를 띠게 하는 것과 동시에 도1에 도시된 바와 상기 시료 중의 DNA가 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합되도록 유도하는 것이다. 이 때, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면이 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)을 갖도록 양전하를 띠게 하지 않고 산성 상태 또는 수산기를 띠게 하는 것은 산화 막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면과 DNA의 결합력을 약하게 하고 상대적으로 분리력을 향상시키기 위함이다

그 후, 상기 유체시료가 접촉된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로부터 나머지 유체를 제거하는 단계가 수행되는데, 상기 단계는 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합된 DNA만을 정제하기 위해 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로부터 나머지 유체를 제거한 후 상기 시료가 제거된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 세척하는 것이 바람직한데, 세척시에도 상기 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태 즉 pH가 3 내지 6.5인 버퍼를 흘려서 세척하는 것이 바람직하다.

그 다음 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합된 DNA를 분리함으로써 DNA 정제를 완료할 수 있는데, 이 때 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합된 DNA를 분리하기 위해 상기 나머지 유체가 제거된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 실라놀의 pKa 보다 높은 pH조건으로 처리하는 단계를 수행하게 된다. 여기서 실라놀의 pKa 보다 높은 pH조건은 pH가 8 내지 10을 의미하며 바람직한 버퍼로는 포스페이트, 보레이트(borate), 카보네이트(carbonate) 등이 있다

따라서 상기 단계는 pH가 8 내지 10인 버퍼로 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 적셔서 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면이 SiO^-상태가 되도록 하여 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합된 DNA가 도1에 도 시된 바와 같이 분리됨으로써 수행되고, 그러므로 상기 단계에서 마지막으로 얻어지는 버퍼에는 거의 DNA만이 존재하게 되어 DNA정제가 완료되는 것이다.

경우에 따라서 본 발명의 방법은 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 DNA와 결합하기에 용이한 상태가 되도록 미리 준비시키는 과정을 다른 단계에 선행하여 제일 먼저 수행할 수도 있는데, 상기 단계는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물과 DNA를 포함하는 유체시료를 접촉시키기 전에 미리 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH조건 즉 pH 3 내지 6.5인 버퍼로 처리하여 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면의 공기를 제거함과 동시에 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면이 수산기를 띠도록 하게 하는 것이다. 이와 같이 상기 단계를 미리 수행하게 되면 그 다음에 수행되는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물과 DNA를 포함하는 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태의 유체시료를 접촉시키는 단계의 수행시간이 보다 짧아질 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물은 그 표면이 필라 타입으로 형성되는 것을 특징으로 한다. 상기 필라 타입은 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면 자체가 평면으로부터 위로 올라온 기둥상 구조물이 형성된 상태로 구성되는 것으로 접촉면적을 넓히기 위해 그 기둥상 구조물의 형상 및 간격은 필요에 따라 조정가능하며 바람직한 일 형상으로는 도2에 도시된 필라 타입이 제안될 수 있는데, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 필라 타입으로 형성하는 것은 에칭 등 공지된 공정을 통해 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 일정 공간과 상기 일정공간으로 유체물질의 유입이 가능한 유입구 및 상기 일정공간으로부터 유체물질의 배출이 가능한 유출구 갖는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물; 상기 유입구를 통해 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로 투입되는 유체시료가 보관되는 시료 저장부; 및 상기 유입구를 통해 투입된 유체시료가 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로부터 상기 유출구를 통해 배출된 후 다시 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로 투입되는 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태의 버퍼가 보관되는 버퍼저장부를 포함하는, 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치를 제공한다.

여기서, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물은 그 전체적인 형상이 챔버형인 것이 바람직하며, 특히 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물에 구비되는 일정 공간은 상기 공간을 형성하는 모든 면이 상기 유입구를 통해 일정공간으로 투입되는 유체시료와 접촉 가능한 상태로서 특히 상기 일정 공간을 형성하는 모든 면의 표면은 필라 타입으로 형성되는 것이 바람직한데, 유체시료와 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면의 접촉면적을 넓혀 DNA를 더 많이 결합하게 하여 DNA정제 양을 증가시킬 수 있기 때문이다.

이러한 본 발명에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치의 기능적요소를 도시한 도 3을 참조하면, 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치가 크게 시료저장부, 버퍼저장부 및 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물이라는 3개의 기능적 요소를 갖고, 도면에 도시 되지는 않았으나 상기 각 기능적 요소를 연결하는 마이크로플루이딕 유닛 (Microfluidic units)을 포함하는 것을 알 수 있다.

또한, 도면에 도시 되지는 않았지만 본 발명에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치를 보다 정교하게 구현하는 경우 상기 유입구를 통해 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로 투입되는 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태의 버퍼가 보관되는 전처리버퍼저장부와 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유출구를 통해 배출되는 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태인 배출물이 저장되는 배출물저장부가 기능적 요소로 더 포함될 수 있다.

본 발명의 시료저장부는 본 발명은 주로 생체물질을 시료로 사용하게 되므로 정제하고자 하는 DNA가 포함된 시료가 외부에서 주입되어 보관하는 구성으로 구현되고, 본 발명의 버퍼저장부 및 전처리버퍼저장부도 외부에서 주입되는 시료가 보관되는 구성으로 구현된다.

본 발명의 버퍼저장부에 보관되는 버퍼는 그 pH상태가 실라놀의 pKa 보다 높은 것으로, 상술한 바와 같다.

본 발명의 전처리버퍼저장부에 보관되는 버퍼는 그 pH상태가 실라놀의pKa 보다 낮은 상태로서 바람직하게는 그 pH가 3 내지 6.5인 것으로, 상술한 바와 같다.

또한 본 발명의 배출물저장부는 경우에 따라서는 PCR칩과 같이 DNA증폭부와 연결되어 상기 DNA증폭부에서 증폭하고자 하는 DNA를 제공하도록 구성될 수 도 있다.

여기서, 마이크로플루이딕 유닛은 크게 시료저장부, 버퍼저장부, 전처리버퍼저장부, 및 배출물저장부를 각각 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유 입구 또는 유출구와 연결하는 연결부와, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물과 상기 시료저장부, 버퍼저장부, 전처리버퍼저장부, 및 배출물저장부 사이에 형성되어 각각 특정신호에 의해 개폐가 조절되는 조절부와, 상기 시료저장부, 버퍼저장부 및 전처리버퍼저장부로부터 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로 유체시료 및 버퍼를 이동시키고, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로부터 배출물저장부로 유체상태의 배출물을 이동시키는 구동력을 제공하는 구동부를 포함하는 개념이다.

본 발명에 사용된 마이크로플루이딕 유닛은 이미 공지된 기술적 구성요소를 사용한 것으로서 특히 상기 연결부는 상기 유체시료에 포함된 DNA가 통과할 수 있는 직경이하의 미세채널이고, 상기 조절부는 능동밸브의 일종인 구동력에 의해 나비를 열고 닫음으로써 유체의 흐름을 제어하는 나비밸브(flap valve)이며, 구동부는 마이크로펌프인 것이 바람직하다.

도3을 참조하여 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치에서 각 기능적요소의 역할을 순차적으로 살펴보면, 일단 시료저장부로 DNA를 포함하는 시료가 투입되어 보관되는데(도면에 도시하지는 않았지만 버퍼저장부에도 버퍼가 투입되어 보관된다.) 여기서 상기 투입되는 시료는 정제하고자 하는 DNA가 포함된 것이면 그 종류가 제한되지 않으나 주로 세포추출물이 될 것이다. 또한 상기 시료저장부로 투입되는 시료는 유체상태로서 특히 그 pH상태가 실라놀의 pKa 보다 낮은 상태로서 바람직하게는 그 pH가 3 내지 6.5인 것이 바람직하다.

상기 시료저장부에 보관된 유체시료는 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유입구와 연결된 연결부를 통해 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간이 채워지도록 일정량 투입된다. 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간을 구성하는 표면과 유체시료가 접촉하여 상기 표면이 수산기를 띠게되고, 상기 유체시료속의 DNA가 상기 표면과 결합하도록 일정 유속으로 투입되며 칩의 표면적에 따라 그 시간은 다르며 1분(min) 내외에서 수분이 소요될 수 있다. 그 후 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유출구를 통해 상기 일정공간에 채워졌던 유체가 모두 제거된다.

그 다음 상기 버퍼저장부에 보관되던 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태의 버퍼가 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유입구와 연결된 연결부를 통해 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간이 채워지도록 일정량 투입된다. 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간을 구성하는 표면과 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태의 버퍼가 접촉하여 상기 표면이 SiO^-상태가 되도록 하여 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합된 DNA가 분리되도록 일정시간, 바람직하게는 상기 유체시료 속의 DNA가 상기 표면과 분리하도록 일정 유속으로 투입되며 칩의 표면적에 따라 그 시간은 다르며 1분(min) 내외에서 수분이 소요될 수 있다. 그대로 둔 후 상기 유출구를 통해 배출된 유체로부터 정제된 DNA를 얻을 수 있다.

한편, 도면에 도시되지는 않았지만 좀더 정교하게 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치를 구현하게 되면, 전처리버퍼저장 부와 배출물저장부가 더 포함될 수 있다.

이 경우에는 상술한 단계에 두 가지 단계가 더 포함되어 수행되는데, 즉 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치는 시료저장부, 전처리버퍼저장부, 버퍼저장부에 각각 시료 또는 버퍼가 외부로부터 투입되어 보관된 후,

가장 먼저 상기 전처리버퍼저장부에 보관된 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태의 버퍼가 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유입구와 연결된 연결부를 통해 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간이 채워질 만큼만 투입되는 단계가 수행될 수 있다. 이 때 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간을 구성하는 표면과 버퍼가 접촉하여 상기 일정공간에 존재하는 공기를 제거하고, 상기 일정공간을 구성하는 모든 면의 표면이 수산기를 띠도록 일정 유속으로 투입되며 칩의 표면적에 따라 그 시간은 다르며 수초~수분이 소요될 수 있다.

그 후 동일한 과정을 수행하는데, 다만 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유출구를 통해 상기 일정공간에 채워졌던 유체를 모두 제거한 다음, 바로 상기 버퍼저장부에 보관되던 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태의 버퍼가 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로 투입되는 것이 아니라, 보다 완벽하게 유체시료를 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간을 구성하는 표면으로부터 제거하기 위해 상기 전처리버퍼저장부에 보관된 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태의 버퍼를 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유입구와 연결된 연결부를 통해 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간이 채워질 만큼만 투입되도록 한 후 상기 버퍼를 배출구를 통해 배출하는 과정이 수행된다.

또한, 마지막 단계에서 배출구를 통해 배출되는 버퍼는 DNA만을 포함하고 있어 DNA정제된 상태이므로 배출물저장부에 보관되어 DNA증폭 등 그 밖의 다른 실험의 기초물질로 사용될 수 있다. 따라서, 상기 배출물저장부는 DNA증폭부와 연결되도록 구성될 수 있다.

도 3에 도시된 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치는 각 기능적 구성요소를 공지된 마이크로플루이딕스 기술 및 MEMS디바이스를 이용하여 프로세스-온-어-칩(process-on-a-chip)으로 구현하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 더 나아가서는 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)으로 구현될 수도 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예 1>

피코그린(picogreen)으로 표지된 gDNA(2.5ng/ul)를 시료(pH를 3으로 함)로 하여 도3과 같은 기능적 구성요소로 된 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치의 각 단계를 수행하고, 각 단계에서 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태의 배출물과 실라놀의 pKa 높은 pH상태의 배출물을 얻었다. 이 때 상기 도3의 버퍼저장부에 저장된 버퍼의 pH는 8이다.

상기 각각의 배출물의 피코그린 함량을 측정하여 그 결과를 도4에 도시하였다.

도4로부터, 실라놀의pKa 보다 낮은 pH상태 즉 pH3인 배출물들로부터 얻어진 피코그린 함량은 거의 0에 가까워 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면이 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태 일 때는 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 DNA가 결합되어 있는 것을 알 수 있으며,

실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태 즉 pH8인배출물들로부터 얻어진 피코그린 함량은 거의 0.1에 가까워 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면이 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태 일 때는 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면으로부터 DNA가 분리되는 것을 알 수 있다.

<실험예1>

pH에 따른 DNA의 PCR 효율측정

정제된 DNA의 pH에 따라 PCR 효율에 차이가 있는지 확인하기 위해 pH3 상태의 gDNA(2.5ng/ul)와 pH8 상태의 gDNA(2.5ng/ul) 및 실시예1에서 얻어진 pH8 상태의 배출물을 각각 LightCycler PCR을 수행하였고 그 결과를 측정하여 표1에 나타내었다.

LightCycler PCR 수행 결과

조 건	PCR 결과 수치(CP)
pH3 상태의 gDNA(2.5ng/ul)	14.7
pH8 상태의 gDNA(2.5ng/ul)	14.8
pH8 상태의 배출물	15.06
DNA가 없는 상태	25.68

표1로부터 정제된 DNA의 pH에 따라 PCR 효율에 거의 차이가 없음을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 실시예1에서 얻어진 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치의 DNA정제물과 본 발명의 DNA정제장치를 통과하지 않은 pH8 상태의 gDNA(2.5ng/ul)의 PCR결과 수치가 거의 차이가 나지 않는 것으로부터 시료 속의 DNA가 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치에 의해 거의 분리되는 것을 유추할 수 있다.

<실시예 2>

E.Coli 세포를 샘플로 준비하여 상기 세포를 95℃에서 1분 동안 유지하고, 30℃에서 30초를 유지하는 가열파괴(Boiling lysis)를 4회 반복하여 E.Coli 세포 농도가 1-2ⅹ10^-9/ml가 되도록 세포추출물(cell lysate)을 준비한 후, 준비된 세포추출물을 시료로 하여 도3과 같은 기능적 구성요소로 된 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치의 각 단계를 수행한 후 최종단계에서 배출물을 얻었다.

<비교예 1>

본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치 대신 콰이아젠사의 DNA 정제 키트를 사용한 것을 제외하고는 실시예2와 동일한 조건의 시료를 사용하여 상기 DNA 정제키트의 추천 프로토콜대로 각 단계를 수행한 후 최종단계에서 비교정제물1을 얻었다.

<비교예 2>

본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치 대신 DRI(DNA Research Innovations, Inc., UK)사의 CST(Charge SwitchTechnology) DNA 정제 키트를 사용한 것을 제외하고는 실시예2와 동일한 조건의 시료를 사용하여 상기 DNA 정제키트의 추천 프로토콜대로 각 단계를 수행한 후 최종단계에서 비교정제물2를 얻었다.

<실험예2>

실시예2에서 얻어진 배출물과 비교예1 및 2에서 얻어진 비교정제물1 및 2에 함유된 단백질 함량을 비교하여 제거된 단백질 함량을 측정하여 표2에 나타내었고, 도5에 그래프로 도시하였다. 이 때 상기 측정결과는 3회 실시하여 평균한 값이다.

단백질 정량 결과

조 건	단백질감소율(%)
실시예2에서 얻어진 배출물	79
비교정제물1	57
비교정제물2	60

표2 및 도 5로부터 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치의 배출물 즉 DNA정제물에서 정량되는 단백질 함량이 상용화된 콰이아젠사의 DNA정제키드 및 CST DNA정제키트에 비해 20%이상 더 적은 것을 알 수 있어 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치가 DNA 정제효율이 높음을 알 수 있다.

<실험예3>

실시예2에서 얻어진 배출물과 비교예1 및 2에서 얻어진 비교정제물1 및 2를 각각 LightCycler PCR을 수행하였고 그 결과를 측정하여 표3에 나타내었으며, 도6에 그래프로 도시하였다. 이 때 상기 측정결과는 3회 실시하여 평균한 값이다.

LightCycler PCR 수행 결과

조 건	PCR 결과 수치(CP)
실시예2에서 얻어진 배출물	14.74
비교정제물1	15.07
비교정제물2	14.76
최적치	12.7
DNA가 하나도 없는 상태	26.19

표3 및 도 6으로부터 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치의 배출물 즉 DNA정제물의 PCR 결과 수치가 상용화된 콰이아젠사의 DNA정제키트 및 CST DNA정제키트에 비해 더 최적치에 가까운 것을 알 수 있어 본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치가 DNA 정제효율이 상대적으로 높음을 알 수 있다.

이상과 같은 본 발명에 따른 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제방법 및 장치에 의하면 다음과 같은 효과가 있다.

본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제방법 및 장치는 시료 중의 DNA가 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합하는 pH조건과 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면에 결합된 DNA가 상기 표면으로부터 분리되는 pH조건을 이용하여 시료 속에 포함된 DNA를 정제할 수 있다.

본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제방법 및 장치는 카이오트로픽 염(Chaotropic salt)이나 유해한 유기용매를 사용하지 않으면서도 시료 속에 포함된 DNA를 친환경적으로 정제하는 것이 가능하다.

본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제방법 및 장치는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 코팅 등을 통해 다시 가공할 필요 없이 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물 표면을 그대로 이용하기 때문에 제작이 용이할 뿐만 아니라 핵산 증폭부 등의 다른 모듈과의 결합시 필요한 공정인 양극접합(anodic bonding) 등에 제약을 받지 않는다.

본 발명의 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제방법 및 장치는 마이크로플루이딕스 기술을 이용하여 프로세스-온-어-칩(process-on-a-chip) 또는 랩-온-어-칩 (lab-on- a-chip)으로 구현하는 것이 가능하므로 저비용화를 기대할 수 있을 뿐만 아니라, 더 나아가서는 본 발명의 정제장치뿐만 아니라 DNA 증폭부, 검출부 및 DNA 해석 장치를 반도체기판에 일괄 가공할 수도 있을 것이다.

Claims

산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물과, DNA와 pH 3 내지 6.5의 버퍼를 포함하는 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태의 유체시료를 접촉시키는 단계 ;

상기 유체시료가 접촉된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로부터 나머지 유체를 제거하는 단계; 및

상기 나머지 유체가 제거된 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 실라놀의 pKa 보다 높은 pH의 버퍼를 처리하는 단계를 포함하는 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물과 DNA를 포함하는 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태의 유체시료를 접촉시키는 단계에 선행하여 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH조건으로 처리하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 실라놀의 pKa 보다 높은 pH의 버퍼는 pH 8 ~ 10 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서,

상기 버퍼는 포스페이트, 보레이트, 카보네이트로 구성된 그룹에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항, 제2항 제4항, 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물은 그 표면이 표면에 기둥이 돌출된 형상의 필라 타입으로 형성되는 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA 정제 방법.
일정 공간과 상기 일정공간으로 유체물질의 유입이 가능한 유입구 및 상기 일정공간으로부터 유체물질의 배출이 가능한 유출구 갖는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물;

상기 유입구를 통해 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로 투입되는 유체시료가 보관되는 시료 저장부; 및

상기 유입구를 통해 투입된 유체시료가 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로부터 상기 유출구를 통해 배출된 후 다시 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로 투입되는 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태의 버퍼가 보관되는 버퍼저장부를 포함하는, 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치.
제7항에 있어서, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 일정공간 내부 표면이 표면에 기둥이 돌출된 형상의 필라타입으로 형성되는 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치.
제7항에 있어서, 상기 유입구를 통해 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물로 투입되는 실라놀의 pKa 보다 낮은 pH상태의 버퍼가 보관되는 전처리버퍼저장부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치.
제7항에 있어서, 상기 유체시료는 pH 3 내지 6.5의 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치.
제7항에 있어서, 실라놀의 pKa 보다 높은 pH의 버퍼는 pH 8 ~ 10 버퍼인 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치.
제 11항에 있어서, 상기 버퍼는 포스페이트, 보레이트, 카보네이트로 구성된 그룹에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치.
제7항에 있어서, 상기 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물의 유출구를 통해 배출되는 실라놀의 pKa 보다 높은 pH상태인 배출물이 저장되는 배출물저장부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치.
제13항에 있어서, 상기 배출물저장부는 DNA 증폭부와 연결되는 것을 특징으로 하는 산화막이 표면에 형성된 실리콘 구조물을 이용한 DNA정제장치.
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