JPS6137916B2 - - Google Patents
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- JPS6137916B2 JPS6137916B2 JP52094767A JP9476777A JPS6137916B2 JP S6137916 B2 JPS6137916 B2 JP S6137916B2 JP 52094767 A JP52094767 A JP 52094767A JP 9476777 A JP9476777 A JP 9476777A JP S6137916 B2 JPS6137916 B2 JP S6137916B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミツドに関する。更に詳しく
は、本発明は高度好熱性細菌から得られる新規プ
ラスミツドに関する。
は、本発明は高度好熱性細菌から得られる新規プ
ラスミツドに関する。
染色体外遺伝子であるプラスミツドは、インビ
トロ（in vitro）遺伝子組換えにおけるベクトル
（vector）として昨今の遺伝子工学において広く
用いられている。インビトロ遺伝子組換技術は、
有用な微生物の育種をはじめとしてその用途は広
いが、生物汚染の危険性を無視できない。もし、
インビトロ遺伝子組換を、高度好熱性菌でおこな
うことができたら、そのような菌は、寄生や胞子
生成がなく、しかも45℃以上、好適には75℃以上
の高温でのみ増殖が進行することから、より安全
であると考えられる。
トロ（in vitro）遺伝子組換えにおけるベクトル
（vector）として昨今の遺伝子工学において広く
用いられている。インビトロ遺伝子組換技術は、
有用な微生物の育種をはじめとしてその用途は広
いが、生物汚染の危険性を無視できない。もし、
インビトロ遺伝子組換を、高度好熱性菌でおこな
うことができたら、そのような菌は、寄生や胞子
生成がなく、しかも45℃以上、好適には75℃以上
の高温でのみ増殖が進行することから、より安全
であると考えられる。
そこで、本発明者等は高度好熱性菌におけるイ
ンビトロ遺伝子組換技術を開発すべく、先ず、高
度好熱性菌からプラスミツドを分離精製する方法
について検討した結果、本発明に到達した。
ンビトロ遺伝子組換技術を開発すべく、先ず、高
度好熱性菌からプラスミツドを分離精製する方法
について検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明の要旨はサーマスサーモフイ
ラス（Thermus thermophilus）HB−８から、
密度勾配遠心法によつて分離され、次のおよび
の特徴を有するプラスミツド。
ラス（Thermus thermophilus）HB−８から、
密度勾配遠心法によつて分離され、次のおよび
の特徴を有するプラスミツド。
分子量：6.2×106ダルトン
コピー数：7.6
更に本発明を詳細に説明するに、サーマスサー
モフイラス（Thermus thermophilus）HB−８
（ATCC 27634）からプラスミツドを分離精製す
る方法としては、密度勾配遠心法が用いられる。
すなわち、菌体をまず温和に破壊して細胞質
DNAを選択抽出し、いわゆる閉じた環状DNA
（Closed circular DNA）であるプラスミツド
が、開いた環状DNA（open circular DNA）や
染色体断片の線状DNAよりも色素（エチジウム
ブロマイド）結合量が少なく、従つて塩化セシウ
ム−エチジウムブロマイド密度勾配中でより重い
バンドを与えることを応用して精製する。具体的
には、ほゞ、J.Bacteriol.12：1487−1494に記載
の方法に準じて分離精製する。たゞ塩化セシウム
の密度を1.59〜1.60ｇ/ml付近にあわせて遠心す
る。また3Hでラベルしたプラスミツドを密度勾
配遠心による分離精製する場合には、3H−アデ
ノシンを用いて、プラスミツドDNAをラベルす
る。なお、後記の実施例においては、菌体を溶菌
後塩化ナトリウムにより沈澱させた上澄にアルコ
ールを加えて沈澱させ、該沈澱を再溶解して密度
勾配遠心にかけているが、菌体が少量の場合に
は、塩化ナトリウムによる沈澱及びアルコール沈
澱の両操作を省き、溶菌液を全量、密度勾配遠心
分離にかけてもよいし、或いは塩化ナトリウム沈
澱後の上澄を直接密度勾配遠心してもよい。
モフイラス（Thermus thermophilus）HB−８
（ATCC 27634）からプラスミツドを分離精製す
る方法としては、密度勾配遠心法が用いられる。
すなわち、菌体をまず温和に破壊して細胞質
DNAを選択抽出し、いわゆる閉じた環状DNA
（Closed circular DNA）であるプラスミツド
が、開いた環状DNA（open circular DNA）や
染色体断片の線状DNAよりも色素（エチジウム
ブロマイド）結合量が少なく、従つて塩化セシウ
ム−エチジウムブロマイド密度勾配中でより重い
バンドを与えることを応用して精製する。具体的
には、ほゞ、J.Bacteriol.12：1487−1494に記載
の方法に準じて分離精製する。たゞ塩化セシウム
の密度を1.59〜1.60ｇ/ml付近にあわせて遠心す
る。また3Hでラベルしたプラスミツドを密度勾
配遠心による分離精製する場合には、3H−アデ
ノシンを用いて、プラスミツドDNAをラベルす
る。なお、後記の実施例においては、菌体を溶菌
後塩化ナトリウムにより沈澱させた上澄にアルコ
ールを加えて沈澱させ、該沈澱を再溶解して密度
勾配遠心にかけているが、菌体が少量の場合に
は、塩化ナトリウムによる沈澱及びアルコール沈
澱の両操作を省き、溶菌液を全量、密度勾配遠心
分離にかけてもよいし、或いは塩化ナトリウム沈
澱後の上澄を直接密度勾配遠心してもよい。
このようにして得られたプラスミツドは新規で
あり、後記実施例に示すように、分子量が6.2×
106ダルトン、コピー数は7.6である。
あり、後記実施例に示すように、分子量が6.2×
106ダルトン、コピー数は7.6である。
本発明のプラスミツドは、実用化が期待される
高度好熱性細菌の宿主・ベクター系の開発におけ
るベクターとして有用である。即ち、高度好熱性
細菌は、75℃以上の高温下で生育するという性質
から、例えばこれを宿主とし、種々の機能を賦与
又は増強し、発酵生産に使用できれば、冷却コス
ト、蒸留コスト等が節減できる等の利点がある。
高度好熱性細菌の宿主・ベクター系の開発におけ
るベクターとして有用である。即ち、高度好熱性
細菌は、75℃以上の高温下で生育するという性質
から、例えばこれを宿主とし、種々の機能を賦与
又は増強し、発酵生産に使用できれば、冷却コス
ト、蒸留コスト等が節減できる等の利点がある。
このような視点から、本発明のプラスミツド
は、高度好熱性細菌の宿主・ベクター系として有
用である。
は、高度好熱性細菌の宿主・ベクター系として有
用である。
以下、本発明を実施例に従つて説明する。
実施例 １
(1) プラスミツドの製造法
１中に５ｇポリペプトン、４ｇ酵母エキ
ス、２ｇ食塩、１ｇグルコースを含む培地（PH
7.2）で１液サーマスサーモフイラス
（Thermus thermophilus）HB−８（ATCC
27634）振盪培養した菌体を集め500mlのTES
〔トリス塩酸緩衝液（30ｍＭ）PH8.0、食塩（50
ｍＭ）、EDTA（５ｍＭ）からなるもの。〕で２
回洗つた。洗浄菌体を300mlの25％シヨ糖液、
50mlの0.25M EDTA（PH8.0）に懸濁し、さら
に100mlのリゾチーム（５mg/ml：25％sucrose
液に溶解したもの）10ml、シグマケミカル社製
のリボヌクレアーゼＡ（５mg/ml）を加え、37
℃で30分間反応させた。次に17mlのSarkosyl
NL−30〔商標、加商株式会社の表面活性剤〕
を加え更に10分間反応したのち５mlのプロナー
ゼＥ（50mg/ml）を加え、37℃で30分間反応さ
せた。この溶菌液にドデシル硫酸ナトリウムと
塩化ナトリウムをそれぞれ最終濃度10％と1M
になるように加え、撹拌してよく溶かし０℃で
１夜放置した。これを17000xｇで30分間遠心
分離した上澄を得、これに２倍量のエタノール
を加え再び０℃で１夜放置した。生成した沈澱
を10000xｇでの15分間遠心分離により集め17
mlのTESに溶解した。これにエチジウムブロ
マイドを最終濃度500μｇ/mlになるように加
え、塩化セシウムを加えて密度1.595に合わせ
て38000rpm、60時間遠心分離した。染色体
DNAの下にあらわれるバンドをとり、エチジ
ウムブロマイド（500μｇ/ml）と塩化セシウム
（密度1.595）の入つたTESを加えて約７mlにし
て再び38000r.p.m.60時間遠心分離した。プラ
スミツドのバンドを分取し、0.015M Nacl及び
0.0015M Sodium citrate（PH7.1）の溶液に対
し、透析した。この操作により約300μｇのプ
ラスミツドが得られた。
ス、２ｇ食塩、１ｇグルコースを含む培地（PH
7.2）で１液サーマスサーモフイラス
（Thermus thermophilus）HB−８（ATCC
27634）振盪培養した菌体を集め500mlのTES
〔トリス塩酸緩衝液（30ｍＭ）PH8.0、食塩（50
ｍＭ）、EDTA（５ｍＭ）からなるもの。〕で２
回洗つた。洗浄菌体を300mlの25％シヨ糖液、
50mlの0.25M EDTA（PH8.0）に懸濁し、さら
に100mlのリゾチーム（５mg/ml：25％sucrose
液に溶解したもの）10ml、シグマケミカル社製
のリボヌクレアーゼＡ（５mg/ml）を加え、37
℃で30分間反応させた。次に17mlのSarkosyl
NL−30〔商標、加商株式会社の表面活性剤〕
を加え更に10分間反応したのち５mlのプロナー
ゼＥ（50mg/ml）を加え、37℃で30分間反応さ
せた。この溶菌液にドデシル硫酸ナトリウムと
塩化ナトリウムをそれぞれ最終濃度10％と1M
になるように加え、撹拌してよく溶かし０℃で
１夜放置した。これを17000xｇで30分間遠心
分離した上澄を得、これに２倍量のエタノール
を加え再び０℃で１夜放置した。生成した沈澱
を10000xｇでの15分間遠心分離により集め17
mlのTESに溶解した。これにエチジウムブロ
マイドを最終濃度500μｇ/mlになるように加
え、塩化セシウムを加えて密度1.595に合わせ
て38000rpm、60時間遠心分離した。染色体
DNAの下にあらわれるバンドをとり、エチジ
ウムブロマイド（500μｇ/ml）と塩化セシウム
（密度1.595）の入つたTESを加えて約７mlにし
て再び38000r.p.m.60時間遠心分離した。プラ
スミツドのバンドを分取し、0.015M Nacl及び
0.0015M Sodium citrate（PH7.1）の溶液に対
し、透析した。この操作により約300μｇのプ
ラスミツドが得られた。
(2) プラスミツドであることの確認
(イ) 上記(1)の分離精製において、溶菌液を塩化
セシウム−エチジウムブロマイドの密度勾配
遠心にかけた後、紫外線ランプを照射すると
染色体DNAの太いバンドの下に細いバンド
が観察された。
セシウム−エチジウムブロマイドの密度勾配
遠心にかけた後、紫外線ランプを照射すると
染色体DNAの太いバンドの下に細いバンド
が観察された。
(ロ) 3H−アデノシンでDNAをラベルし、その
溶菌液を同様に塩化セシウム−エチジウムブ
ロマイド密度勾配遠心にかけると、染色体
DNAより重い部分に放射能のピークが出
た。
溶菌液を同様に塩化セシウム−エチジウムブ
ロマイド密度勾配遠心にかけると、染色体
DNAより重い部分に放射能のピークが出
た。
(ハ) (ロ)のピークを、５〜20％の中性庶糖密度勾
配遠心にかけた。緩衝液として0.03Mトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸
（PH8.0）、0.005M EDTAおよび1M塩化ナト
リウムからなるものを使用し、更に14C−λ
−フアージDNA（33.68）をマーカーとして
入れ、トツプから何本目にピークがくるかに
よりＳ値を求めた。29S付近にピークが見ら
れた。
配遠心にかけた。緩衝液として0.03Mトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸
（PH8.0）、0.005M EDTAおよび1M塩化ナト
リウムからなるものを使用し、更に14C−λ
−フアージDNA（33.68）をマーカーとして
入れ、トツプから何本目にピークがくるかに
よりＳ値を求めた。29S付近にピークが見ら
れた。
(ニ) 電子顕微鏡により、直接、CCC DNA
（covalently closed circular DNA）が観察
された。このCCC DNAをデオキシリボヌク
レアーゼｌ（ワシントン ハイオケミカル社
製）で処理するとopen circular DNAにな
る。この長さを測定すると均一の長さであ
る。
（covalently closed circular DNA）が観察
された。このCCC DNAをデオキシリボヌク
レアーゼｌ（ワシントン ハイオケミカル社
製）で処理するとopen circular DNAにな
る。この長さを測定すると均一の長さであ
る。
(3) プラスミツドの細胞当りの数（コピー数）の
測定 (2)の(ロ)から放射能の何％（Ａ％とする。）が
プラスミツドの画分にくるかを計算する。好熱
菌の染色体DNAの分子量が測定されていない
ので、大腸菌の先色体DNAの分子量と同じ
（2.5×109ダルトン）と仮定し、それぞれのプ
ラスミツドの分子量がわかれば、下式によるコ
ピー数が求められる。
測定 (2)の(ロ)から放射能の何％（Ａ％とする。）が
プラスミツドの画分にくるかを計算する。好熱
菌の染色体DNAの分子量が測定されていない
ので、大腸菌の先色体DNAの分子量と同じ
（2.5×109ダルトン）と仮定し、それぞれのプ
ラスミツドの分子量がわかれば、下式によるコ
ピー数が求められる。
コピー数＝染色体ＤＮＡの分子量（２．５×１０９）／プラスミツドの分子量×Ａ／１００
測定の結果、コピー数は7.6であつた。
(4) プラスミツドのＳ値の測定
(2)の(ハ)の測定より、Ｓ値は29である。
(5) プラスミツドの分子量の測定
分子量が既知のDNAと共に電子顕微鏡によ
り、観察し、その長さの比から求めた。分子量
は6.2×106ダルトンであつた。
り、観察し、その長さの比から求めた。分子量
は6.2×106ダルトンであつた。
(6) プラスミツドの制限図を図−１に示す。な
お、同プラスミツドは、EcoRI、TaqIおよび
XbaIによつて切断されない。
お、同プラスミツドは、EcoRI、TaqIおよび
XbaIによつて切断されない。
図−１は本発明のプラスミツドの制限図であ
る。
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ サーマスサーモフイラス（Thermus
thermophilus）HB−８から、密度勾配遠心法に
よつて分離され、次のおよびの特徴を有する
プラスミツド。 分子量：6.2×106ダルトン コピー数：7.6
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9476777A JPS5428896A (en) | 1977-08-08 | 1977-08-08 | Preparation of plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9476777A JPS5428896A (en) | 1977-08-08 | 1977-08-08 | Preparation of plasmid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5428896A JPS5428896A (en) | 1979-03-03 |
| JPS6137916B2 true JPS6137916B2 (ja) | 1986-08-26 |
Family
ID=14119240
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9476777A Granted JPS5428896A (en) | 1977-08-08 | 1977-08-08 | Preparation of plasmid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5428896A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434631B (zh) * | 2016-09-28 | 2019-07-26 | 深圳精准医疗科技有限公司 | 一种大量提取质粒的方法及其应用 |
-
1977
- 1977-08-08 JP JP9476777A patent/JPS5428896A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5428896A (en) | 1979-03-03 |
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