CN106434631B - 一种大量提取质粒的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大量提取质粒的方法及其应用。该质粒提取的方法将GoldenView应用于CsCl质粒提取中的核酸显色，替代传统使用的溴化乙锭（EB）。与现有的应用EB进行CsCl质粒提取技术相比，应用GoldenView提取质粒的量略高，且提取质粒中内毒素、蛋白残留均未检出，说明在CsCl质粒提取中应用GoldenView染料可以保证不影响质粒的提取量和提取质量，同时GoldenView还可大幅减轻染料对实验人员的毒性影响，与现有技术相比具有明显的优势。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及一种大量抽提质粒的方法及其应用。
背景技术
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。目前，质粒通常专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体之一。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状比如标记基因。其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作(如扩增、筛选过程)中对基因工程研究及其下游的应用都是非常实用和极具价值的。
在产品研发过程中，研发人员对质粒量的需求一般不大，μg级别的质粒足以满足大量研发实验的需求；但在实际的产业化应用中，质粒的使用量往往会比研发时的高2-3个数量级，达到100μg乃至1000μg级别。以用于治疗急性淋巴细胞白血病的抗CD19嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞为例，该治疗方案的流程大致如下：首先抽取患者的血液，分离其中的外周血单个核细胞，并诱导培养其中的T细胞；接着将表达抗CD19单链抗体(scFv)基因的通过慢病毒导入到T细胞中，并继续培养这些细胞；当这些细胞的数量和质量达到临床使用的标准后，即可将这些细胞回输到患者体内开展治疗。这一流程中，最为关键的就是将基因导入细胞内所用的慢病毒。现有技术中，用于治疗的慢病毒主要是用293T细胞和慢病毒质粒、辅助质粒进行并包装并纯化所得到的。这一步骤对质粒的量要求较高，一般可达到数百μg级别。
现有技术中，大量提取质粒的方法主要包括借助质粒吸附柱和借助氯化铯(CsCl)超速离心两种。借助质粒吸附柱的方法，仅需大约2个小时即可从400mL左右的菌液中提取出1000μg左右的质粒；而借助CsCl超速离心的方法则需要离心过夜，时间相对较长。但CsCl超速离心法在其他方面远优于质粒吸附柱法：
1、基本上不存在细菌基因组DNA污染。与之相比，质粒吸附柱法提取的质粒被细菌基因组DNA污染的潜在风险要高不少。
2、提取的质粒中共价、闭合、环状DNA分子(cccDNA)是质粒在后期正常发挥作用的主要形式，借助CsCl超速离心法提取的质粒，cccDNA的比例显著高于通过质粒吸附柱法提取的质粒。
3、借助超速离心，细菌内毒素可以被更彻底地清除。
因此借助超速离心法进行质粒的大量提取是一种更好的方法，这已被本领域内的实验人员所接受。
CsCl超速离心法大量提取质粒的过程中，需要加入核酸染料，以使质粒在超速离心后显色，方便实验人员借助注射器等器具对其进行吸取。现有技术中常用的核酸染料为溴化乙锭(EB)，这是一种灵敏度非常高的核酸染料，能检测低至10ng的DNA。但是EB是一种强诱变剂，具有较高的致癌性，因此对长期使用该核酸染料的实验人员来说，如何既保护好自己的身体健康，又要获得理想的实验结果成为了他们日常工作中不得不面对的一个重要问题。现有技术中尚未有能很好解决该问题的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种大量提取质粒的方法，其特点如下：应用新型的GoldenView染料替代高毒性的EB染料进行CsCl超速离心提取质粒。
本发明的具体技术方案如下：
S1、将含有目的质粒的大肠杆菌接种至400mL TB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。然后4℃，6000g离心10min，弃上清，倒置离心管使残余的液体流出。
S2、加入预冷至4℃的P1缓冲液至终体积到10mL，震荡重悬使沉淀的细菌均匀分散。所述P1缓冲液的成分为50mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,100ug/mL Rnase A,pH＝8.0。
S3、加入20mg固体溶菌酶(hen egg white lysozyme)，完全重悬沉淀，室温放置10min。
S4、加入20mL新鲜制备的P2溶液，用移液管轻轻混匀直至溶液均一透明，室温放置5-10min。所述P2缓冲液的成分为200mmol/L NaOH,1％SDS。
S5、加入预冷至4℃的P3溶液10mL，轻轻但完全地震荡混匀数次，直至两个液相不再分离，原有的黄色消失，白色絮状物出现，然后置于冰上10min。所述P3溶液的成分为3mol/L KAc，pH＝4.8。
S6、4℃，8000rpm离心10min，弃沉淀，将上清通过四层纱布过滤到量筒中。
S7、加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10-15min，然后置于50mL离心管中。
S8、8000rpm离心15min后，将上清弃处干净，回收核酸沉淀。
S9、洗涤沉淀。在室温下，用2mL 70％乙醇涮洗管底及管壁。然后将乙醇倒出，并吸干管壁上的液滴；或8000rpm，常温离心10min，弃上清。敞开离心管管口10-15min，使剩余的乙醇完全挥发掉。
S10、加入7mL 1×TE溶液溶解沉淀，并加入7mL该溶液冲洗管壁。
S11、加入CsCl 12.5g，溶解混匀。
S12、加入GoldenView核酸染料10微升后混匀。
S13、转移上述溶液至超速离心管中，充满离心管并平衡密封。
S14、室温下55000rpm离心至少12h，或65000rpm离心4h。
S15、离心结束后，将离心管取出，置于锡箔纸包裹的试管架上，在仅有微光的室内，可见两条DNA区带，上层区带是染色体和线性DNA，下层为所需的cccDNA。
S16、用18号针管，小心收集cccDNA，置于50mL离心管中。
S17、加入等体积的水饱和异戊醇，盖紧管盖，震荡混合有机相和水相。
S18、室温下450g离心3min，使水相和有机相分离，并将上层有机相(粉红色)转移至合适的废液桶中。
S19、重复抽提上述三个步骤4-6次，直到水相和有机相均不见绿色。
S20、加入2.2倍体积的水，0.6倍体积的异丙醇，混匀。
S21、室温下，8000rpm离心15min，完全弃上清，并回收核酸沉淀。
S22、加入8mL超纯水重悬沉淀，再加入10mol/L醋酸铵溶液至终浓度2mol/L，充分混匀后加入2.5-3倍体积，预冷至-20℃的乙醇(-20℃)，混匀，置于干冰或-80℃冰箱中，孵育10min。
S23、4℃，8000rpm离心10min，弃上清。
S24、加入20mL 70％乙醇，混合，4℃，12000g离心10min，弃上清。
S25、将离心管置于超净台中风干2min，加入TE溶解质粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明对传统的CsCl超速离心法提取质粒进行了改造，应用新型的GoldenView染料替代了高毒性的EB染料，在降低实验操作对研究人员的潜在毒性风险的同时，还保证了所提取质粒的产量和质量均无明显下降。
附图说明
图1为应用GoldenView和EB进行CsCl质粒提取，获得质粒总量的结果图。
图2为CsCl提取质粒的电泳结果图。a.应用GolenView染料进行质粒提取的结果(3次重复)；b.应用EB染料进行质粒提取的结果(3次重复)。
图3为BSA标准曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。
本发明所使用的CsCl购自Sigma Aldrich，GoldenView染料购自北京赛百盛基因技术有限公司。其它实验试剂与耗材如无明确说明，均为市售商品。
实施例一大肠杆菌的培养
取含有质粒的大肠杆菌10μL，置于400mL TB培养基中，37℃，200rpm培养14h后，4℃，6000g离心10min收集菌体。
实施例二CsCl超速离心提取质粒
按照以下步骤应用CsCl超速离心法提取质粒：
1、加入预冷至4℃的P1缓冲液至10mL，重悬上述菌体，震荡重悬使沉淀的细菌均匀分散。
2、加入20mg固体溶菌酶(hen egg white lysozyme)，完全重悬沉淀，室温放置10min。
3、加入20mL新鲜制备的P2溶液，用移液管轻轻混匀直至溶液均一透明，室温放置5-10min。
4、加入预冷至4℃的P3溶液10mL，轻轻但完全地震荡混匀数次，直至两个液相不再分离，原有的黄色消失，白色絮状物出现，然后置于冰上10min。
5、4℃，8000rpm离心10min，弃沉淀，将上清通过四层纱布过滤到量筒中。
6、加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10-15min，然后置于50mL离心管中。
7、8000rpm离心15min后，将上清弃处干净，回收核酸沉淀。
8、洗涤沉淀。在室温下，用2mL 70％乙醇涮洗管底及管壁。然后将乙醇倒出，并吸干管壁上的液滴；或8000rpm，常温离心10min，弃上清。敞开离心管管口10-15min，使剩余的乙醇完全挥发掉。
9、加入7mL 1×TE溶液溶解沉淀，并加入7mL该溶液冲洗管壁。
10、加入氯化铯12.5g，溶解混匀。
11、加入GoldenView核酸染料10微升后混匀。
12、转移上述溶液至超速离心管中，充满离心管并平衡密封。
13、室温下55000rpm离心至少12h，或65000rpm离心4h。
14、离心结束后，将离心管取出，置于锡箔纸包裹的试管架上，在仅有微光的室内，可见两条DNA区带，上层区带是染色体和线性DNA，下层为所需的cccDNA。
15、用18号针管，小心收集cccDNA，置于50mL离心管中。
16、加入等体积的水饱和异戊醇，盖紧管盖，震荡混合有机相和水相。
17、室温下450g离心3min，使水相和有机相分离，并将上层有机相(粉红色)转移至合适的废液桶中。
18、重复抽提上述三个步骤4-6次，直到水相和有机相均不见绿色。
19、加入2.2倍体积的水，0.6倍体积的异丙醇，混匀。
20、室温下，8000rpm离心15min，完全弃上清，并回收核酸沉淀。
21、加入8mL超纯水重悬沉淀，再加入10mol/L醋酸铵溶液至终浓度2mol/L，充分混匀后加入2.5-3倍体积，预冷至-20℃的乙醇(-20℃)，混匀，置于干冰或-80℃冰箱中，孵育10min。
22、4℃，8000rpm离心10min，弃上清。
23、加入20mL 70％乙醇，混合，4℃，12000g离心10min，弃上清。
24、将离心管置于超净台中风干2min，加入TE溶解质粒。
实施例三质粒提取量的检测
抬起Thermo Nanodrop 2000检测仪的样品臂，取1μL TE溶液加到检测基座上，用于仪器调零，完成后用干净的擦拭纸将基座擦拭干净；然后再取1μL溶于TE的质粒加到检测基座上，然后将样品臂放下，运行控制软件读取吸光值；再由软件根据吸光值估算出质粒的浓度。
按照以下公式对质粒的提取量进行计算：n＝C×V。其中n为质粒的提取量，C为质粒的浓度，V为溶解质粒所用的TE的体积。
发明人用GoldenView和溴化乙锭(EB)各重复质粒提取实验三次，提取情况如下表所示：
表1质粒提取情况
对这些数据进行T检验分析，结果如图1所示。可以看到，应用GoldenView染料提取所得质粒的总量高于应用EB染料提取的，但无显著差异(p>0.05)。
实施例四提取质粒内毒素的检测
使用湛江安度斯生物有限公司生产的凝胶法鲎试剂检测质粒样品中的内毒素残留。用超纯水将内毒素标准品稀释为10EU/mL、1EU/mL、0.5EU/mL、0.25EU/mL、0.125EU/mL、0.0625EU/mL 6个浓度梯度作标准曲线；再按凝胶法鲎试剂说明书对样品进行稀释(MVD＝CL/λ)，并进行内毒素的检测。每个样品进行2次重复，所得结果表明，全部质粒样品均呈内毒素阴性，表明质粒样品内所含内毒素均≦5EU/mL，即在要样品控制内毒素限值为5EU/mL范围，说明质粒样品内内毒素含量极低。
实施例五提取质粒残留蛋白质的检测
使用北京全式金生物技术有限公司生产的BCA检测试剂盒对提取质粒中的残留蛋白质含量进行测定。用超纯水配制浓度分别为0、25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL、300ng/μL、400ng/μL和500ng/μL的BSA标准品，绘制标准曲线，结果表2和如图3所示。可以看到，吸光值与标准品浓度呈线性相关趋势，r2值大于0.99。
表2 BSA标准曲线绘制数据
| 标准品浓度 | 0 | 25 | 50 | 100 | 200 | 300 | 400 | 500 |
| 吸光值 | 0.169 | 0.186 | 0.210 | 0.244 | 0.335 | 0.417 | 0.488 | 0.551 |
按照相同步骤对实施例三中获得的6个质粒提取样品进行残留蛋白质含量的检测，其吸光值如表3所示。可以看到，6个样品检测所得到的吸光度值均小于标准品浓度为0时对应的吸光度值，未检测出蛋白质残留，说明提取质粒的纯度很高。
表3 6个质粒样品残留蛋白质检测结果
| 样品名 | GoldenView-1 | GoldenView-2 | GoldenView-3 | EB-1 | EB-2 | EB-3 |
| 吸光值 | 0.164 | 0.165 | 0.166 | 0.163 | 0.165 | 0.163 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种大量提取质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将含有目的质粒的大肠杆菌接种至400mL TB培养基中，37℃，200rpm培养过夜；然后4℃、6000g离心10min，弃上清，倒置离心管使残余的液体流出；
S2、加入预冷至4℃的P1缓冲液至终体积到10mL，震荡重悬使沉淀的细菌均匀分散，所述P1缓冲液包括50mmol/L的Tris-HCl、10mmol/L的EDTA、100ug/mL的RNase A ，且所述P1缓冲液的pH为8.0；
S3、加入20mg的溶菌酶，完全重悬沉淀，室温放置10min，所述溶菌酶为固体，且所述溶菌酶为hen egg white lysozyme；
S4、加入20mL新鲜制备的P2溶液，用移液管轻轻混匀直至溶液均一透明，室温放置5min～10min，所述P2溶液包括200mmol/L的NaOH及质量百分含量为1％SDS；
S5、加入预冷至4℃的P3溶液10mL，轻轻但完全地震荡混匀数次，直至两个液相不再分离，原有的黄色消失，白色絮状物出现，然后置于冰上10min，所述P3溶液为pH4.8、2mol/L的KAc水溶液；
S6、4℃、8000rpm离心10min，弃沉淀，将上清通过四层纱布过滤到量筒中；
S7、加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min～15min，置于50mL离心管中；
S8、8000rpm离心15min后，将上清弃处干净，回收核酸沉淀；
S9、洗涤所述核酸沉淀：在室温下用2mL 70％乙醇涮洗管底及管壁，然后将乙醇倒出并吸干管壁上的液滴，或8000rpm常温离心10min弃上清；敞开离心管管口10min～15min，使剩余的乙醇完全挥发掉；
S10、加入7mL 1×TE溶液溶解沉淀，并加入7mL 1×TE溶液冲洗管壁；
S11、加入12.5g的氯化铯，溶解混匀；
S12、加入10微升的GoldenView核酸染料混匀；
S13、将混匀后的溶液转移至超速离心管中，充满离心管并平衡密封；
S14、室温下55000rpm离心至少12h或者65000rpm离心4h；
S15、离心结束后，将离心管取出并置于锡箔纸包裹的试管架上，在仅有微光的室内，可见离心后的所述离心管具有两条DNA区带，上层区带是染色体和线性DNA，下层为所需的cccDNA；
S16、用18号针管小心收集cccDNA，置于50mL离心管中；
S17、加入等体积的水饱和异戊醇，盖紧管盖，震荡混合有机相和水相；
S18、室温下450g离心3min，使水相和有机相分离，并将上层的所述有机相转移至合适的废液桶中，所述有机相呈粉红色；
S19、重复步骤S16～S17的步骤4次～6次，直到水相和有机相均不见绿色；
S20、向所述水相中加入2.2倍体积的水和0.6倍体积的异丙醇混匀；
S21、室温下8000rpm离心15min，弃上清，并回收核酸沉淀；
S22、加入8mL超纯水重悬沉淀，再加入10mol/L醋酸铵溶液至终浓度2mol/L，充分混匀后加入2.5倍～3倍体积、预冷至-20℃的乙醇，混匀，置于干冰或-80℃冰箱中，孵育10min；
S23、4℃、8000rpm离心10min，弃上清；
S24、加入20mL 70％乙醇混合，4℃、12000g离心10min，弃上清；
S25、将装有沉淀的离心管置于超净台中风干2min，加入TE溶解，得到质粒。
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| US6214586B1 (en) * | 1997-12-08 | 2001-04-10 | Genzyme Corporation | Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNA substantially free of genomic DNA |
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