JPH03501925A

JPH03501925A - 合成遺伝子

Info

Publication number: JPH03501925A
Application number: JP63508168A
Authority: JP
Inventors: エドワーズ，リチャード，マーク; バーケ、ジュリアン、フランシス
Original assignee: ブリティッシュ　バイオテクノロジー　リミテッド
Priority date: 1987-10-08
Filing date: 1988-10-07
Publication date: 1991-05-09
Also published as: DK88390A; FI901765A0; DE3886411T2; EP0382762B1; US5182376A; GB8723662D0; WO1989003424A1; DE3886411D1; DK88390D0; EP0382762A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】６成遺伝子本発明は、ホースラデッシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼをコードする合成遺伝子に関する。

ホースラデッシュベルオキシダーゼＣ（Ｅ、Ｃ，１，またペルオキシダーゼの主要アイソザイムである。これは、アミノ酸３０８個のポリペプチド鎖から成る糖タンパク質単量体であり、分子ｆｆ１３３．９８０ダルトンである。中性炭水化物側鎖３個、ジスルフィド巣橋４個がある。この成熟タンパク質のアミノ酸配列は決定されている。ピロリドンカルボキシリルアミノ末端１個が存在することは、このタンパク質が前駆体としておそらく産出されそれが分泌され条と処理されることを示唆している。本酵素の活性形には、ヘミン補欠分子族が含まれる。

本酵素はとくに安定で、大幅に活性を喪失することなく架橋および誘導体化を受ける。本酵素が広範囲の発色基質を有しておりその一部が不溶性の化学発光または蛍光産物を生成することおよびほとんどの使用時においてバックグラウンド活性が低いことが観察されていることと合わせてこのことが、免疫学、組織化学、細胞学および分子生物学の分野における診断および研究応用上、ホースラデッシュペルオキシダーゼをはかり知れない程貴重な手段としてきた。これが他の酵素マーカーと比較して優れていることのひとつであり、さらに、本酵素のいくつかの基質が電子高密度の産物を産生じ、電子顕微鏡を用いてペルオキシダーゼの局在と細胞の超微細構造を相関させることができる。

さらに、ホースラデッシュペルオキシダーゼは、その中に含有するＦｅのためにそれ自体電子的に高密度であり、その結果１、それ自体で酵素マーカーとして作用することができる。特殊な応用例が免疫化学で見られ、イムノグロブリンに架橋結合したベルオキシダ・−ゼは、ＥＬＩＳＡ（エリザ）に基づくアッセイ系および免疫細胞化学の双方で広く用いられている。ペルオキシダーゼを直接イムノグロブリンに架橋結合させるかまたはビオチン標識イムノグロブリンを間接的にストレプトアビジン／ホースラデッシュベルオキシダーゼ複合体に架橋結合させるかのいずれかを用いはまた、ビオチン化プローブ配列を順次前記ストレプトアビジン／ベルオキシダ・−ゼ複合体および適切な発色性ペルオキシダーゼ基質とインキュベーションすることによって局在化できる核酸ハイブリダイゼーション法で広く応用されてきた。

ホースラデッシュベルオキシダーゼのアミノ酸配列は、ウニリンダ−（／Ｗｅｌｉ　ｎｄｅｒ＞、Ｋ、Ｇ、（Ｅｌ−ｏッピアン・ジャーナル・オブφバイオケミストリ（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｅｈａｓ、）、９８゜４８３−５０２（１９７９）　ｌが開示している。ホースラデッシュベルオキシダーゼのｃＤＮＡまたは天然の遺伝子のクローニングについては、記載されていない。

ＨＲＰの構造／機能関連の詳細な解明、発現ベクターへのその取り込みおよびＨＲＰ機能を含有する新しい全く想像を超えるような（キメラ）タンパク質の産生を促進するために、アルモラシア・ルスチカナ（Ａｒｍｏｒａｅｌａ　ｒｕｓｔｌｅａｎａＬ産生ペルオキシダーゼＣの改良新規合成遺伝子がめられている。

あるＤＮＡ配列の発現性を決定する因子についてはまだ充分にわかっていないので、改良ＨＲＰ遺伝子設計を予測することは決して容易ではない。さらに、種々の応用における前記遺伝子の有用性は、コドン使用法および制限部位のようなものの考慮の影響を受ける。本発明は合成ＨＲＰ遺伝子に関し、有用な制限部位が存在していることでこれは容易に修飾可能であるという利点を打している。

基８個以上の長さの逆方向反復塩基配列または直接反復塩基配列がある時間順が生じる。さらに、Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔが多い領域またはポリプリン／ポリピリミジン系のような不均衡塩基組成領域は非効率的発現を導くことがわかっている。

本発明は、こうした問題を克服するかまたは少な（とも緩和することを意図している。

本発明の第１の態様によれば、ＨＲＰをコードし、かつ、下記酵素の制限部位を有するＤＮＡが提供される。

ＨｐａＩ、５ａｃＩ、５ｓｐＩ、ＮｈｅＩ、Ｎ５ｉＩ。

Ｃ１ａＩ、ＰｖｕＩ、５ｐｈｌ、ＢｓｐＭｌ、ＦｓｐＩ。

Ｒｓ　ｒｎ、Ｓａ　Ｉ　Ｉ、ＢｇｌＩＩ、Ｂａ　Ｉ　Ｉ、ＰｖｕＩＩ。

ＸｈｏＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、５ｎａＢＩ。

Ｐｆ　ＩＭＩ、ＡｐａＬＩ、Ｓｐｅ　Ｉ、Ｓｃａ　Ｉ。

ＸｂａＩ、５ｔｕＩ、Ｂｃｌ　Ｉ、ＢｓｔＸＩ、Ｎｅｏｌ。

ＫｐｎＩ、および　ＰｓｔＩ。

このＤＮＡは、また、５−ＨｉｎｄＩＩＩ部位および／または５＝ＮｄｅＩ部位および／または３’ＢａｍＨ１部位および／または３’ＥｃｏＲ１部位も含有している。

本発明の第２の態様によれば、下記の配列を含むＤＮＡが提供される。

ＣＡＧ　ＴＴＡ　ＡＣＣＣＣＴ　ＡＣＡ　ＴＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＴ　ＡＧＣＴＧＴ　ＣＣＣＡＡＣＧＴＧ　ＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＣＧＣＧＡＣＡＣＡ　ＡＴＣＧＴＣＡＡＣＧＡＧ　ＣＴＣＡＧＡ　ＴＣＣＧＡＴ　ＣＣＣＡＧＧ　ＡＴＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＡＴＡＴＴＡ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＣＡＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧ　ＡＡＴ　ＧＧＴＴＧＣＧＡＣＧＣＴ　ＡＧＣＡＴＡ　ＴＴＡＣＴＧ　ＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＣＣＧＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＧＡＴＧＣＡ　ＴＴＣＧＧＧ　ＡＡＣＧＣＴ　ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧ　ＧＧＣＴＴＴ　ＣＣＡＧＴＧ　ＡＴＣＧＡＴ　ＣＧＣＡＴＧ　ＡＡＧＧＣＴ　ＧＣＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＴＣＡ　ＧＣＡＴＧＣＣＣＡ　ＣＧＡ　ＡＣＡ　ＧＴＣＡＧＴＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＴＡＴＡ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＡＧＣＧＴＧ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＧＧＣＧＧＡＣＣＧ　ＴＣＣＴＧＧ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　ＣＣＧＣＴＣＧＧＴ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＧＡＣＴＣＣＣＴＡ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣＴＡ　ＧＡＴＣＴＧ　ＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＧＣＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＴＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＴＡＧＣ’ＦＴＴ　ＡＧＡ　ＡＡＣＧＴＧ　ＧＧＴＣＴＧ　ＡＡＴ　ＣＧＣＴＣＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＴＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＴＣＣＧＧＡＧＧＡ　ＣＡＣＡＣＡ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＧＡＡＣＣＡＧ　ＴＧＴ　ＡＧＧ　ＴＴＣＡＴＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡＧＧ　ＣＴＣＴＡＣＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴ　ＧＧＧ　ＴＴＡＣＣＴ　ＧＡＣＣＣＣＡＣＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣＡＣＴ　ＡＣＧ　ＴＡＴ　ＣＴＣＣＡＧ　ＡＣＡＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＧＣＴＴＧ　ＴＧＣＣＣＡＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＧＣＡＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡ　ＣＴＡ　ＧＴＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＧＡＴＣＴＧ　ＣＧＧ　Ａｃｅ　Ｃ：ＣＡ　ＡＣＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴ　ＡＡＣＡＡＧ　ＴＡＣＴＡＴＧＴＧ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧＡＡＡ　ＧＧＣＣＴＧ　ＡＴＡ　ＧＡＧ　ＡＧＴＧＡＴ　ＣＡＡ　、ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　ＡＧＣＡＧＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣＧＣＣＡＣＴ　ＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＡ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＧＡＡＧＴ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＡＡＣＴＣＴ　ＡＣＴ＝ＣＡＡ　ＡＣＣＴＴＣＴＴＴ　ＡＡＣＧＣＣＴＴＣＧＴＧ　ＧＡＡ　Ｇｅｅ　ＡＴＧ　ＧＡＣＣＧＴ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＴＴ　ＡＣＣＣＣＴ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧ　ＡＴＴ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＡＡＣＴＧＣＡＧＡ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＡＣＡＧＣ終止コドン（ＴＡＡ）が直後に続くことができる。しかし、このＤＡＮがシグナルペプチドをコードする配列のようなリンカ−（類）および／また′はエクステンション（類）を例えば哺乳類細胞のような真核細胞内で効率的発現のために取り込んでいる場合にはこれは必ずしも該当しない。哺乳類細胞中で良好な発現を生み出すひとつのエクステンションハ、ＫＣ８ＷＶＩ　ＦＦＬＭＡＶＶＴＧＶＮＳＯアミノ酸類をコードする５′−エクステンションであり、ひとつの開始コドンと最初のＱ′Ｐｉ基をコードするコドンの間に付与される。第６図に好適なエクステンションを示した。３′−シグナル配列をコードする配列は、ＬＬＨＤＭＶＥＶＶＤＦＶＳＳＭをコードすることもできる。この系統のアミノ酸残基をコードする好適なりＮＡ配列もまた第６図に示しである。

上記で述べた合成ＨＲＰはひんばんに有用な制限部位を取り込んでおり、選択領域のカセット突然変異を促進する。

また好適な実施例には、遺伝子のあらゆる所望の発現システムへの取り込みを単純化するフランク（ｆｌａｎｋｌｎｇ）制限部位が含まれている。

コドン類はイー、コーリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）に好適なものであるが、このＤＮＡが酵母および哺乳類細胞を含む他０有機体中における発現に適切であることが期待される。

本発明の第３の態様によれば、第１または’：Ａ２の態様によりＤＮＡまたＣ１その断片から成る遺伝的構築体が提供される。本断片は、少なくとも１０，２０，３０．４０または５０のヌクレオチドから成る。第３の態様による遺伝的構築体は、プラスミド、コスミドまたはファージのようなベクターである。

本発明の第４の態様によれば、第１または第２の態様によるＤＮＡまたは第３の態様により遺伝的構築体を調製するプロセスが提供され、このプロセスは連続ヌクレオチドの結合および／または適当なオリゴマーの連結がら成る。

本発明はまた、第１または第２の態様によるＤＮＡに対応するかまたはこのＤＮＡに相補的であるかのいずれがである他の核酸（ＲＮＡを含む）に関する。

本発明は、上記に述べた遺伝的構築体を少なくとも部分的に発現させることから成る単分散ホースラデッシュペルオキシダーゼＣの製造工程を包含する。

さらに、本発明は、ペルオキシダーゼ活性を有するハイブリッドタンパク質をコードすることのできる配列を作製するために、他のＤＮＡ配列に融合した第１または第２の態様による配列の全体またはその断片から成る上述の構築体にも拡張される。前記構築体の例は、コード化された融合タンパク質がビオチン結合とペルオキシダーゼ活性の双方を有するようなホースラデッシュペルオキシダーゼをコードする遺伝子とストレプトアビジンまたはアビジンをコードする遺伝子の間の遺伝的融合体である。も、うひとりのペルオキシダーゼをコードする遺伝子とイムノグロブリン由来抗原結合機能をコードする遺伝子の間の遺伝的融合体である。この抗原結合機能は、イムノグロブリン重（Ｈ）、鎖または軽（Ｌ）１！’ Ｊまたはその断片、または工学的に作られた単量体抗原性認識部位であることができる。

興味をひく具体的な構築体としては、ホースラデッシニベルオキシダーゼとその他の興味のあるタンパク質の間の融合生成を可能とするホースラデッシュペルオキシダーゼＣ遺伝子から成るベクター、および、単一融合産物として、単一ポリシストロン性メツセージとしてまたは２つの別個ではあるが連結した転写単位としてのいずれかとしてホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子と興味あるもうひとつの遺伝子の同時発現を行う発現ベクターが含まれる。

本発明のさらに別の面によれば、コード化されたホースラデッシュペルオキシダーゼタンパク質の活性を破壊しまたは損なう突然変異１個（ミスセンス、ノンセンス、欠失、挿入、複製またはその他再配列のいずれか）を含有するホースラデッシュベルオキシダーゼ遺伝子が提供される。本発明は、このような突然変異ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子全体またはその断片を含む遺伝的構築体にも拡張される。

欠陥性または非欠陥性ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝的構築体は、哺乳類細胞および／または形質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）動物において（例えば、マーカーとして）用いることができる。

ホースラデッシュベルオキシダーゼの合成遺伝子はそれ自体で本発明のもうひとつの態様を形成するものであり、その特定の応用例を下記でさらに詳細に開示する。

ｌ）本遺伝子を適当な発現ベクターに組み入れ、適合有機体中で本酵素を効率的に産生ずることができる。これには、ホースラデッシュ根から単離された材料中に存在する混入アイソザイムを全く含まない単分散性の酵素調製物の既製供給源であるという利点である。また、調製用に選択した有機体または細胞タイプを変化させることで、糖鎖形成を全く含まないものも含めさまざまなパターンの糖鎖形成を有するＨＲＰの製造ができる。このような材料は、より要求の多い組織化学的応用および特にイムノアッセイのような感度の優れたエンザイムアッセイに対しでふされしい、より適切な優れた明確な特性を有する。

２）本遺伝子は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンまたはＨＲＰ−ア′ビジン遺伝的融合体の中へ取り込むことができる。

これによって、架橋結合を必要とすることなくストレプトアビジン−ＨＲＰまたはアビジン−ＨＲＰ複合体の産生ができる。また、これによ−コて、より明確で安定性に侵れた生成物が得られるであろうし、また、おそらく、ビオチン結合およびベルオ・キシダーゼ活性の双方の損失が少なくなる。

３）イムノグロブリンとＨＲＰ、またはプロティンＡとＨＲＰＯ間の融合体も同様に産生ずることができ、これは貴重な組織化学的′Ｊ、薬である。・通常の架橋操作の必要性が再び回避される。

４）このＨＲＰ遺伝子は、ＨＲＰと遺伝子またはｅ　ＤＮＡをクローン化したかまたはそのアミノ酸配列が公知であるその他のあらゆるタンパク質の間の融合体産生を可能とするように設計されたベクターの構築において、貴重な応ルができる。これは、その生成物のアッセイが困難である遺伝子の発現をモニターすること、および問題のタンパク質に標識しインビボにおけるその代謝および薬物動力学を適切な組織化学的技術またはエンザイムアッセイを用で追跡することの双方において有用である。さらに、ＨＲＰ融合体は、適当な抗ＨＲＰ抗体を使用し、この融合生成物を単純に免疫精製することを可能とする。

５）ＨＲＰの発現は、例えば哺乳類細胞発現系のような発現系において有用なマーカーとなりえる。このＨＰＲ遺伝子は、ひとつの融合体、または問題の遺伝子を有するポリシストロンメツセージ、または別個ではあるが近接して結合した転写単位としてのいずれかで発現されることができる。容易にアッセイされるＨＲＰの産生け、どのクローンの細胞が所望の生成物を大量に発現し易いかを簡単にスフができる。蛍°光性または化学発色性ＨＲＰの発色性基質を使用すると、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ８）により直接的に高生産性の真核細胞、を選別する可能性が提供される。

６）生成物の酵素活性を破壊しまたは障害する突然変異（ミスセンス、ノンセンス、欠失、挿入、複製またはその他の再配列）を６するＨＲＰ迫伝子は、この遺伝子に導入された特定の突然変異を復帰または抑制する頻度を追跡するために用いることのできるベクターの構築を可能とすることができる。

問題の有機体生殖細胞中にかかる欠陥性ＨＲＰ遺伝子を導入することはまた、問題の組織内におけるＨＲＰ活性パターンを組織学的に検討することによって研究者が特別の細胞型を予めマツピングすることができる。正確なインビボ復帰比率を有する突然変異ＨＲＰ遺伝子を構築する際には、ＨＲＰ活性領域およびそれによる復帰ＨＲＰ遺伝子の存在がＨＲＰ細胞のクローン起源の証拠として見なすことができるように注意しなければならない。無変化の合成非突然変異遺伝子はまた、レトロウィルスベクターまたはトランスポゾンのような適切なベクター内で６機体にＨＲＰ遺伝子を感染させることによって上記の予定マツピング実験にも用いることができる。

７）ＨＲＰ合成遺伝子の利点は、Ｎ−またはＣ−末端エクステンションのような小付加配列を何するタンパク質をコードするように改変されたＨＲＰ遺伝子の産生を可能とする点である。これらは、ＨＲＰの精製を単純化しおよび／または問題となるその他のタンパク質またはそうでなければ誘導体化されたその他のタンパク質に架橋することを容易としかつその特異性を増すことなどの点において重要な用途を持っている。例えば、６から８個のＡｒｇ残基のＣ末端エクステンションは、サセンフエルド（Ｓａｓｓｃｎｆｃｌｄ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２７Ｂ（１９８４）の技術と同様の方法による精製を単純化するのに用いることができた。これとは別に、Ｌｙｓ残基末尾は、ゲルタールアルデヒドのような２機能性架橋試薬による反応に対し接近可能で感受性をＨする部位を提供する。

本発明の好適な実施態様および実施例を次に述べる。以下の記載では、いくつかの図に対し説明が付されている。

第１図は、ホースラデッシュペルオキシダーゼＣのアミノ酸配列を示している。

第２図は、ホースラデッシュベルオキシダーゼ合成遺伝子の配列、有用な制限部位の概説、および最初にクローン化される遺伝子の前半部、後半部の配列を示している。

第３図は、オリゴヌクレオチドに分割した合成ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子の配列を示している。

第４図゛は、使用した組立て操作法をまとめて示したものスミドｐｓＤ１８の構造を示したものである。

第６図は、哺乳類細胞における効率的発現のために改変した合成ＨＲＰ遺伝子を示している。

第７図は、ＨＲＰ哺乳類発現プラスミドｐｃＰ２１の構造を示している。

実施例１本実施例では、最終サブクローニング段階で完全な長さの遺伝子を生成するように、２つに分けて合成およびクローン化するように遺伝子を設計した。この遺伝子の前記２つの部分の配列を最終産物の配列とともに第２図に示した。

最終合成遺伝子は、必要イニシエータであるメチオニン残基とともに完全な成熟型ホースラデッシュペルオキシダーゼタンパク質をコードするが、天然型遺伝子に存在すると想定されているリーダー配列を欠いている。選択した発現系に適切なリーダー配列は必要に応じて合成遺伝子に付加されるかまたは削除されこの遺伝子の細胞内発現を可能とするように処理される。

所望の遺伝子配列は、それぞれ５０１ｂｐ　（塩基）の前半部と４７４ｂｐの後半部に分けられた。２つのハーフが共通のＸｈｏ１部位を有するように設計し、単純なりローニング操作で完全な遺伝子を組み立てられるようにした。

遺伝子の前半部と後半部をそれぞれ第３図に示すように２４個と２２個のオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴマー）に分割した。この分割によって、オリゴマーの相補対をアニールした後の７個の塩基接着端が付与された。このオリゴマーの末端は、組み立て段階におけるオリゴマーの不適切な連結可能性を最小とするように選択した。

オリゴマーは、自動固体ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｌｔｅ）化学で合成した。ブ′ロックをはずし調節した多孔性ガラス支持体から除去後のオリゴマーを変性ポリアクリルアミドゲルで精製し、さらに、エタノール沈澱で精製、最終的に水に溶解後それらの濃度測定を行った。

前半部の５゛末端オリゴマーＢＢ２７９およびＢＢ３０２並びに後半部のＢＢ３０３およびＢＢ３２４を除く全てのオリゴマーを次にキナーゼ処理し、連結段階で必要とされる５゛−リン酸塩を給与した。相補オリゴマーを次にアニールし、このオリゴマーを第４図に示すようにＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。連結生成物は２％の低ゲル化温度（ＬＧＴ）ゲルで分離し、ホースラデッシュベルオキシダーゼ遺伝子の前半および後半部に対応するバンドを切り取Ａに別々に連結した。連結した生成物をＨＷ８７に形質転換し、アンピシリン１００　ｍｅｇ　ｍｌ −’含有し一寒天（ａｇａｒ）プレートに接種した。潜在的クローン含有コロニーを次いでアンピシリン１００　ｍｃｇ　ｍｌ−’含有り一培地（ｂｒｏｔｈ）で増殖し、プラスミドＤＮＡを単離した。陽性クローンは、塩基１７個の普遍的プライマー、ポリリンな−の片側にある反射鏡に相補性の復帰配列プライマー、および内部プライマーとして働く遺伝子の組み立てに用いられるオリゴマーの一部を用いて、プラスミドＤＮＡの直接ジデオキシ配列解析によって識別した。前半部１個および後半部１個を両鏡上でその後再配列し突然変異が全く起こっていないことを確認した。完全な遺伝子は、この遺伝子の３′末端を含むした前半部クローンにそれを連結することによって構築した。最終構築体の同定は、制限解析およびその後の完全な再配列によって確認した。。

本遺伝子の製造に用いられた遺伝子操作の全ての技術は、遺伝子工学技術の当業者に周知である。当技術のほとんどの記載は、下記の実験マニュアルのひとつで見い出すことができる。モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、　’ｒ、ｖ＝アチス（Ｍａｎｉａｔｌｓ、）　Ｅ、　Ｆ、フリッブ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ）およびＪ、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）出版、ボックス１００．ニューヨーク、米国デービス（Ｄａｖｌｓ）、医学博士およびＪ、Ｆ、バッチ（（Ｂａｔｔｅｙ）著、エルシビア　サイエンス　パブリッシング社（Ｅｌｓｅｖｉｃｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｐｕｂｌｌｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　Ｉｎｃ、）、　ニーニーヨーク、米国。

追加改変方法を下記に述べる。

オリゴヌクレオチドは、シアノエチルホスホルアミタイドを用いる自動化ホスホルアミダイト化学によって合成した。この法は現在広く用いられており、記載されたきた（ビューケージ（Ｂｃａｕｃａｇｅ）、Ｓ、Ｌ、およびカルーサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｍ、　Ｈ，テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２４．２４５（１９８１））。

２）オリゴヌクレオチドの精製オリゴヌクレオチドは、濃縮ＮＨ３中でインキュベーションすることによって脱保護し、ＣＰＧ支持体から脱離した。典型的には、１マイクロモルのオリゴヌクレオチドを有するＣＰＧ５０ｍｇは濃縮ＮＨ３（６００ｍｃｌ　）中で７０℃で５時間インキュベーションすることによって脱保護された。この上清を新しい試験管に移し、オリゴマーを３倍容量のエタノールで沈澱させた。遠心分離後、沈渣（ｐｅｌｌｅｔ）を乾燥し水１ｍｌに再懸濁した。その後、粗オリゴマー濃度を２６０ｎｍの吸光度測定によってめた。

ゲル精製のため、この粗オリゴヌクレオチド１０吸光度単位を乾燥させ、マーカー色素１５ｍｃｌ　（９０％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭ）リス、１０ｍＭホウ酸塩、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルー）に再懸濁した。試料を９０℃で１分間加熱後、１．６ｍｍ幅のスロットを有し１．２ｍｍ厚の変性ポリアクリルアミドゲルにのせた。このゲルは、等量のＴＢＥ中で１５％アクリルアミド、０．６％ビスアクリルアミドおよび７Ｍ尿素のストックから調製し、０．１％過硫酸アンモニアムおよび０．０２５％ＴＥＭＥＤで高分子化した。ゲルを１時間にわたり予ｆｉ展開した。試料は１５００Ｖで４−５時間展開した。

バンドはＵＶ照射によって視覚化し、完全な長さの生成物に対応するバンドを切り取ってミクロ試験管に移した。オリゴマーは、ＡＧＥＢ　（０，５Ｍ酢酸アンモニウム、０゜０１Ｍ酢酸マグネシウムおよび０．１％５ＤＳ）に−晩浸潰してゲル切片から溶出させた。このＡＧＥＢバッファを次いで新しい試験管に移し、このオリゴマーを３倍容量のエタノールで一７０℃において１５分間沈澱させた。沈澱物は、エッペンドルフ試験管で１０分間遠心分離することによって採取し、沈渣（ｐｅｌｔｅｔ）を８０％エタノールで洗浄後、精製オリゴマーを乾燥し、水１ｍｌに再溶解後、最終的１１１０．４５ミクロンのミクロフィルタ・−・でろ過した。精製生成物の濃度は、２６０ｎｒｎにおける吸光度をめることによって測定した。

３）オリゴマーのキナーゼ処理オリゴ？−２５０ｐｒｒｉｏｌｅを乾燥後、２０ｍｅｉのキナーゼバッフ　ｙ　（７０ｍ　Ｍ　トリスｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、、ｉｍλ・ｉ　ＡＴＰ、０．２ｍＭスペルミジン、Ｏｏ　５ｍ　ｈ、＝１ジチオス１／イト−ル）に再懸濁した。Ｔ４ボリヌクレオチドギナーゼ１０Ｕ（ユニット）を添加後、混合物を３７℃で３０分間インキュベートシた。このキナーゼは、８５℃で１５分間加熱ず６ｂことによって不活性化した。

７１）アニーリング δオリゴマー８ｉｅｌを混合し、９０℃に加熱後１時間にわたり室温までゆっくりと冷却した。

５）連結オリゴマー・・の各ｒニール対５ｉｅｌを混合後、１０倍容量のりガーゼバッファを添加して最終りガーゼ反応混合液を作成した（５０ｒｎＭ　トリスｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ特表千３−５０１９２５　（７）２　．２０ｍＭジチオスレイトール、１ｒｎＭ　ＡＴＰ）。反応液５０ｍｃｌに対し１００Ｕの割合でＴ４　ＤＮＡリガーゼを添加し、連結を１５℃で４時間行った。

６）アガロースゲル本気泳動連結生成物は、エチジウムプロミド０．５ｉｅｇ／ｍｌ含有ＴＢＥバッフγ（０，０９４Ｍ）リスｐＨ８，３，０，０８９Ｍホウ酸、０．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ）等量中２％の低ゲル化温度アガロースゲルを用いて分離した。

７）連結生成物の単離所望のホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子または遺伝ｒ−断片連結生成物に対応するバンドは、長波長ＵＶ照射下でサイズマーカーを参照することによって同定した。

バンドをゲルから切り取り下記の如くしてＤＮＡを抽出した。

重量からゲル切片の容積を推定し、その後６５℃で１０分間インキュベーションして溶解した。切片の容積を次にＴ　Ｅ　（１０ｒｎＭ　トリスｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で４００ｍ１とし、酢酸ナトリウムを添加後最終濃度を０．３Ｍとし、た。酵ＩすｔＲＮＡｌｏｍｅｇもまた担体として添加した。このＤＮＡを等量のＴＥ平衡フェノールで３回抽出した後、水で飽和したエーテルで３回抽出した。このＤＮＡを２倍容量のエタノールで沈澱させ、ミクロ分離管中で１０分間遠心分離後、沈渣を７０％エタノールで洗浄して最終的に乾燥した。このＤＮＡをＴＥ２０ｍｃｌに取り、その２ｍｅｌを２％アガロースゲル上で展開させて、ＤＮＡの回収を測定した。

８）断片のクローニングホースラデッシュベルオキシダーゼの２つのハーフ部分を最初にクローニングするため、ｐＵｃ１８ＤＮＡ　（０゜５ｉｃｇ）を、供給者の助言通りにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｅ。

ＲＩで切断して調製した。消化ＤＮＡを０．８％ＬＧＴゲル上に展開し、上述の如くベクターバンドを精製した。最終構築操作のため、ホースラデッシニベルオキシダーゼ逍ｏＲＩを用いて同様に処理した。

切断ベクターＤＮＡ２０ｎｇを、上述の連結バッフγを用いて、次に２から２０ｎｇの範囲の種々のペルオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡに４時間連結した。この連結生成物を用いて、既述の如く受容能のあるＨＷ８７を形質転換した。

アンピシリン耐性形質転換体を、アンピシリン１００ｇｉ１００ｇ１ｃ含有し一寒天プレート上で選択した。

９）プラスミドＤＮＡの単離プラスミドＤＮＡは、本質的に上述の如くして潜在的ホースラデッシュベルオキシダーゼクローン含有コロニーから調製した（イッシュホロビッツ（Ｉｓｈ−ｆｌｏｒｏｖｉｃｚ）、Ｄ、、パーク（Ｂｕｒｋｃ）、Ｊ、ｌ’、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｃｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９２９８９−２９９８（１９８１）　）。

１０）ジデオキシ配列決定用いたプロトコールは、本質的に既述のものであった（ビギン（８１ｇｇｉｎ）、Ｍ、ｎ、、ギプソン（Ｇｉｂｓｏｎ）、　Ｔ、Ｊ。

ホンダ（Ｉｌｏｎｇ）、Ｃ：、！’、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　８０３９６３−３９６５（１９８３））。本状を改変して既述の如くしてプラスミドＤＮＡ上でシーフェンシング（配列決定）を行った（グオ（Ｇｕｏ）　、Ｌ−Ｈ，。

１１）形質転換形質転換は、標準操作を用いて行なった。クローニングで宿主として用いた株は、下記の遺伝子型をａするＨＷ８７であった。

肛しＤ　１３９（肛し一二）ｄｅ１７６９７（田虹ＩＰＯＺＹ）　ｄｅｌ　７４且Ｕ組ＩＫ　匝ｄＲ狂ｓＬ　扛［匹虹Ａ３６ＨＢＩＯＩのようなその他の標準的なりローニング受容体も全て適切である。

実施例・２実施例１で調製した合成ＨＲＰ遺伝子の前半部の端を、下記の如くイニシエーターＡＴＧ上でＮｄｅＩ部位を有する合成リンカ−でＨｉｎｄＩ［［−ＨｐａＩ断片で置換することで改変した。

Ｍ　Ｑ　Ｌ　Ａ、、。

ＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＣＡＧＴＴＡＡＣＣ・・・Ｈｔｎｄｍ　ＮｄｅＩ　ＨｐａＩ実施例３合成ホースラデッジュペルオキシダーゼ遺伝子の発現実施例２の合成ＨＲＰ遺伝子をＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片上で発現ベクターｐＧｃ５１７にクローン化し、プラスミドｐｓＤ１８を作製した。宿主ベクターｐＧｃ５１７は、現在標準的なイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）高発現ベクターである公知のプラスミドｐＡ７１５３　（ツウィッグ（ＴＶｉｇｇ）＆シエラット（Ｓｈｅｒｒａｔｔ）、ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ）２８３．２１６−２１８（１９８０））から公知のｔａｃプロモータ配列および終止配列を標準的方法によって組み入れることによって調製した。

ｐＡＴ１５３はそれ自体ｐＢＲ３２２の誘導体である。ｐＧＣ５１７において、このＨＲＰ遺伝子は強力で調節可能なｔａＣプロモーターから発現される。非誘発培養物において発現が抑制されたままであることを確めるために、このプラスミドを広範に入手可能なイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ’ｉ　）株Ｗ３１１０１ａｃ　Ｉ”に維持した。この中で１ａＣリプレツサータンパク質が過剰に産生される。

第５図は、ｐｓＤ１８の構造を描いたものである。

株Ｗ３１１０１ａｃ　Ｉ’−ｐｓＤ１８は、０．　２％グルコースおよび、０．２％力、ザミノ酸含白°Ｍ９最小培地で増殖した。０．２−０．３のＯ，Ｄ、において、Ｉ　ＰＴＧ添加によって培養を誘発し最終５　ｍ　Ｍの濃度とした。さらに３時間この培養物を増殖させ、３０分間隔で試料を採取した。

誘発培養物のｌ１ＩＡ微鏡検査により、細胞内に凝集した不溶性タンパク質の大量の集積に特徴的な封入体の存在が明らかとなった。さらに、高レベルでＨＲＰを発現する培養物はピンク色を呈し、おそらくヘムタンパク質の過剰発現に関連していたのであろう。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析によってその後、大量の３３キロダルトンのタンパク質の存在が明らかとなったが、これは、非誘発性ではなく誘発性培養物中の総細胞タンパク質の１０〜２０％と推定された。ウェスタンプロット解析では、このタンパク質がＨＲＰであることが確認された。

封入体単離のための標準的方法を応用して変性ＨＲＰの実質的精製物を不溶性凝集体として人手することができた。

復元に先立ち、この材料を次に６ＭグアニジンＨｃｌに溶解した。復元のためには、溶解ＨＲＰを８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭ　Ｎａｃｌで２４時間透析した。

次に、Ｃａ２＋を１ｍＭとなるように（ＣａＣ１２として）添加し、室温で２時間試料をインキュベートした。標準ピロガロール比色法Ｎ１及びにタンパク質濃度および本調製物の推定純度（参照表１）を基準とすると、本操作によりＴ−測ＨＲＰ活性の約０．１２５％が日収された。

表１イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）巾で発現したＨＲＰの復元記濃度の随時調製ピロガロールおよび過酸化物を含有していた：１１ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６，ｏ、８ｍＭのＨ２０２、水中０．５５Ｖ／Ｖピロガロール。ＨＲＰを添加し、４２０ｎｍにおける吸収（ａｂｓｏｒｔｌｏｎ）の増加を追跡した。

ｃｏｌｉ）中において高レベル発現が可能であり、活性生成物の合成を導くことができる。

実施例４実施例２の合成ＨＲＰ遺伝子を下記のように改変し哺乳類細胞中における効率的発現を可能とした。

（ａ）この遺伝子の３″末端はＰｓｔ１部位から延長し、フジヤマ（Ｐｕｊｉｙａｍａ）らがヨーローピアン・ジャーナル・オ゛）に報告したＣ末端エクステンシ３ンを包含した。

（ｂ）この遺伝子の５′末端を、イムノグロブリンシグナルペプチドに基づくシグナル配列をコード化するＨｉｎｄｍ／ＨｐａＩリンカ−を付加することで改変した。

この改変ＨＲＰｉｒ１ｆｉ子を第６図に示し、ＨＲＰＸと呼ぶことにする。

実施例５哺乳類細胞における合成ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子の発現実施例４のＨＲＰＸ遺伝子は哺乳類細胞発現ベクターｐＣＰＨＩＩに挿入してｐｃＰ２１が作製され、この中でＨＲＰ遺伝子がＨＣＭＶ　（ヒトサイトメガロウィルス（ＩｌｕｍａｎＣｙｔｏｍｃｇａｌｏｖｌｒｕｓ））初期プロモーターから発現される（第７図参照）。このプラスミドｐｃＰＨ１１は、広く入手可能であるｐＵｃ１８に基づき、ｉ７図の情報を用いて標準法によってｐＵｃ１８から７Ａ製できる。

ＨＲＰ発現プラスミドｐｃＰ２１は、リン酸カルシウム沈澱の標準的技術を用いてＣＯ３細胞中に移入した（細胞１０６個当たり、２０ｇａｃｇのＤＮＡを移入）。ＨＲＰ活性は、標準的なＨＲＰ試薬であるテトラメチルベンチジン基質（ＴＭＢ）を用いて移入後、４８−７２時間の細胞培養液中でアッセイした。シグナル配列および／またはその３″エクステンシヨンを含有しない対照構築体中ではＨＲＰ活性は全く検出されなかった。これと比較して、ｐＣＰ２１を移入した（対照に比較して１０倍まで）細胞中ではＨＲＰ活性が明らかに検出可能であった。結果を表２に示す。

表２ＣＯ８細胞中におけるＨＲＰ発現抽出物容積　０．Ｄ、　４５０１００　．００４　．０２２　．００８　．００３５０　．０３３　．０１２　．０１０　．０１３本２５　．１０７　、ＯＬＯ，００３，０１ｇ本１０　．０８４　．０１１　．００７　．０１？５　．０６４本　、０１５’　、０１２　、ＯＨ１，０２ｇ　、００８　．００？　、００？キーｐｃＰ２１　：　Ｎ末およびＣ末シグナルを存し、正しい配向のＨＲＰｐＣＰ２２’：Ｎ末およびＣ末シグナルをｕし、ｐｃＰｌｌ：シグナル配列を全く有さず、正しい配向のＨＲＰｐｃＰ１２：シグナル配列を全く有さず、誤配向のＨＲＰ全ての結果は、二重の試料の平均である。

＊＝有意活性レベル）（ＲＰアッセイ細胞抽出物をアッセイするため、基質混合物を下記のようにして調製した。

ＴＭＢ　（３，３”、５．５−テトラメチルベンチジン（ジグｖ（Ｓｉｇｍａ）　）　）をＤＭＳＯ中に１０　ｍｇ／　ｍｌとなるように溶解し、本溶液１００ｉｃｌを１００ｍｃｌ　Ｈ２０２とともにアッセイバッファ１００ｍ１（クエン酸中０．１ＭＮ、ａＡｃ、ｐＨ６，０）に添加した。

細胞抽出物は、細胞を遠心分離によって採取後凍結融解または音波処理し、調製した。培地、細胞融解物および標準を下記のように９６ウ工ル微小力価プレートに一定量づつ入れた。

試　料　１００　５０　２５　１０　５　１　ｍｃＩアッセイ　０　５０　７５　９０　９５　９９　ｍｅｔバッファブランクは、１００ｍｅｌのアッセイバッファのみを用いて作製した。ＴＭＢ／Ｈ２０２混合物１００ｉｃｌを試料に添加し、室温で３０分から１時間インキュベートした。本反応を２．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４５０ｍ＋ｃｌ添加して停止させ、プレートリーダー上で４５０ｎｍにおける色の変化を読み取った。

商業的に入手可能なＨＲＰは、１０′４の係数で希釈し標準として用いた。

ｎσ万ε１（Ｍ）ＱＬＴ］’ＴＦＹＤＮＳＣＰＮＶＳＮ工ＶＲＤＴ工ＶＮＥＬＲ５ＤＰＲ工入ＡＳ工ＬＲＬＩＦ′ＨＤＣＦＶＮＧＣＤＡＳ工ＬＬＤＮＴＴＳＦＲＴＥＫＤＡＦＧＮＡＮＳＡＲＧＦＰＶｏ８０よりＲＭＫＡＡＶＥＳＡＣＰＲＴＶＳＣλＤＬＬＴ工ＡＡＱＱ！９ＶＴＬＡＧＧＰＳＷＲＶ’ｎｏ　” ＰＬＧＲＲＤＳＬＱＡＦＩ、ＤＬ入Ｎ入ＮＩ、ＰＬ３０　１４０ＡＰＦＦＴＬ’ＰＱＬ１ＣＤＳＦＲＮＶＧＬＮＲ邦０１６゜Ｓ　Ｓ　Ｄ　Ｌ　Ｖ　Ａ　Ｌ　５　Ｇ　Ｇ　ＨＴ、　Ｆ　Ｇ　Ｘ　Ｎ　Ｑ　ＣＲＦ１７０　ユ８０ＴＹＬＱＴＬＲＧＬＣＰＩ、ＮＧＮＬＳＡＬＶ２１ｏ２２゜工ＰＬ’ＶＲ５ＦλＮ５ＴＱＴＦＦＮＡＴＶＥ人ＭＤＲＭ、ＧＮ工’ｌ’ＰＬＴＧＴＱＧＱｍＲＬ２９ｏ３０゜Ｔ工σフε２為ＣＡＣＭ−αコクχニスσ罠−−−こンＡＣＲ７ス〔℃に込αゴにニＴ）Ａαに、二式ＤＪ σに六コ℃ｒχ迂ＫにＣＫλαス０工丁■λＶ久　−ゝ　−−−五　′：′７９０　ＥＩＯｏ　８１０　８２０　８３０　８４０ＦＶＥＡＭＤＲＭＧＮ工ＴＰＬＴＧＴＱＧＱＣＩＴＯπＯ；久α工に仄こ×Ｄニスα父Ｇフ込ＣＣスα℃σ℃式込α℃クスα℃ｘじαχス８５０　８６０　Ｂ２Ｏ８８０８９０９００二Ｇフε ２ｂし＠ｇｑ　ノ′甲１ノード＾１切イｆＬｅｈ鍼４１閂μ　“撃　山Ｃクリ　イｔｌｌｆ五廿Ｄ−λにズ：Ｔ　１Ｃ１ａ工　ＡＴＯｕコ　２５１？八江　０；■：ＣＧ　２５３ＳａｌＩ　Ｇ■工込Ｃ３７ＢＰ八汀工　ＣＡＧＣＴＧ　４５２Ｘｈｏ工　Ｃ〕工ｆ　４９０ＳｎａＢ工　’ＩＩＡαコλ　６１０？ロ上江　αスσＸλにに石　６４１ ℃ンユ　り＝口Ｇ入　７２１Ｓｔｕｌｌ’　Ｎ−、χ：”７　’　７３６Ｅｃｌｊ：　ワ２てλ　７５１ｒｘＱｉコε２Ｃ、＋＼゛オースラうツシζへ・ｊしオキシタ゛＝（！；ｆ、＜云シダ′丁す陥へ −）り闇己釦」η℃工　Ｄズζα −“１　。

ｎＧ−ε２ｄむβに′オースフ丁で一属へ・１シネキシ７−セ；１ン１１：ｆ３′床力障５八 −フ４配う弓９１０　９２０　．９３０　９４０　９５０ｎαコ２３１ γ℃−ε３ｂＢ５０３Ｂ５１８Ｂ３３２４う′ハーフ４翅ｌ止マ棒任８玉Ａ６＆）　舛１パ了昏−（しｗ　、’Ｌ１３ＬＡｙ９）で員し仕しちキセ→グ九棺１１（コ１マー。

、入−ＡＣ工八へＣＴふＧＣτｒ　−−ＸｈｏＺ−Ｇ　、＋入−−−−−−−−−−−−−−−−−一一−ｉへ〇＝〜コー＋　Ｘｈｏニーｃｒｚ八入＝σコニご３′八−フリ５Ｌとｔｔ六に４％／＋矛オシネン。

ａ）４７−７ｘ−１１＋υ、１４（ＡｚＢｌｔ”ＳΔ’？ｗｒ＝！ｒ−ｔＪＪｆＪ’ｑＴ’コ−−。

Ｔｘσコこ４Ｃ ”）　ＰＬＩＣｌ５（ｔ７ｏ−；ｙｒ＝　ＨＩ２Ｐ／）”；’１ｉｅ−−Ｂ’つＯ−ン＋（ｘｋｏ工ｈｋｈ−Ｅｃｏ’？Ｘ　Ｚ−ミ肖イ（ｔV＝。

イ鱈しヒ片妙／１ジ［ぷｆｐｃ　ｏ、％　７’ａ　Ｌｑ下Ｙカ゛′ローズ、７’ ｌしつ゛１賞れに。

ｂ）　ＨＦ？Ｐｎ’４’ハーフ”ｉ＠ｔｎｘｋｏｒ／Ｅｃ−ｆ？工４６　ｔｃ　）’ｋｅｎ／Ｅｃａ！ｌ？ＩＣ？１ｌｆｌ　ｔ−１１２Ｐ　秩f ｃ）　ＦＬＩＣＩＱｔ−７０−ン山七封噌し包くト■−へ゛７２−勺己ンｊｙｌａｕｒｅ　５＋２４１　吻′（鴫輸吋（Φ秒企愛＾暉佳（Ｃ諸べＨ四ｉｌ／ｉ）僧−；　了二少 −ライ基＃Ｌ（４”ｚｍ、澄戊゛ゎＥに社３イ妾−４仕麟に射口でＨ２Ｐ層セシ遭７ｔスミト’ｐｃｆ’Ｚｌｒｉａｕｒｅ　７．。

Ｈｉｎｄｌｌ！補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成２年４月　９日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、事件の表示　ＰＣＴ／ＧＢ８８１００８３３２、発明の名称　合成遺伝子３、特許出願人住　所　イギリス国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、コーレイ、ワトリングトン　ロード、プルツク　ハウス名　称　プリティッシニ　バイオテクノロジー　リミテッド４、代理人住　所　東京都千代田区二番町１１番地９ダイアパレス二番町氏名（７２３４）弁理士　へ田幹雄電話　０３−３２３０−４７６６番５、補正書の提出年月日１９９０年１月１８日６、添付書類の目録（１）補正書の写しく翻訳文）請求の範囲１、下記配列を倉むＤＮＡ　。

ＣＡＧ　ＴＴＡ−ＡＣＣＣＣＴ　ＡＣＡ　ＴＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＴ　ＡＧＣＴＧＴ　ＣＣＣＡＡＣＧＴＧ、ＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＣＧＣＧＡＣＡＣＡ　ＡＴＣＧＴＣＡＡＣＧＡＧ　ＣＴＣＡＧＡ　ＴＣＣＧＡＴ　ＣＣＣＡＧＧ　ＡＴＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＡＴＡＴＴＡ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＣＡＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧ　ＡＡＴ　ＧＧＴＴＧＣＧＡＣＧＣＴ　ＡＧＣＡＴＡ　ＴＴＡＣＴＧ　ＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＣＣＧＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＧＡＴＧＣＡ　ＴＴＣＧＧＧ　ＡＡＣＧＣＴ　ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧ　ＧＧＣＴＴＴ　ＣＣＡＧＣＴ　ＧＣＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＴＣＡ　ＧＣＡＴＧ、ＣＣＣＡ　ＣＧＡ　ＡＣＡ　ＧＴＣＡＧＴＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＴＡＴＡ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＡＧＣＧＴＧ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＧＧＣＧＧＡＣＣＧ　ＴＣＣＴＧＧ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　ＣＣＧＣＴＣＧＧＴ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＧＡＣＴＣＣＣＴＡ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣＴＡ　ＧＡＴＣＴＧ　ＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＧＣＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＴＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＴＡＧＣ，ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＡＡＣＧＴＧ　ＧＧＴＣＴＧ　ＡＡＴ　ＣＧＣＴＣＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＴ、Ｇ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＴＣＣＧＧＡＧＧＡ　ＣＡＣＡＣＡ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＧＡＡＣＣＡＧ　ＴＧＴ　ＡＧＧ　ＴＴＣＡＴＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡＧＧ　ＣＴＣＴＡＣＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴ　ＧＧＧ　ＴＴＡＣＣＴ　ＧＡＣＣＣＣＡＣＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣＡＣＴ　ＡＣＧ　ＴＡＴ　ＣＴＣＣＡＧ　ＡＣＡＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＧＣＴＴＧ　ＴＧＣＣＣＡＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＧＣＡＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡ　ＣＴＡ　ＧＴＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＧＡＴＣＴＧ　ＣＧＧ　ＡＣＣＣＣＡ　ＡＣＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴ　ＡＡＣＡＡＧ　ＴＡＣＴＡＴＧＴＧ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧＡＡＡ　ＧＧＣＣＴＧ　ＡＴＡ　ＣＡＧ　ＡＧＴＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＡ’Ａ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　ＡＧＣＡＧＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣＧＣＣＡＣＴ　ＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＡ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＧＡＡＧＴ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＡＡＣＴＣＴ　ＡＣＴＣＡＡ　ＡＣＣＴＴＣＴＴＴ　ＡＡＣＧＣＣＴＴＣＧＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＧＡＣＣＣＴ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧ　ＡＴＴ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＡＡＣＴＧＣＡＧＡ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＡＣＡＧＣ’ＡＡＣＴＣＴ２、請求項第１項に記載のＤＮＡ、またはその少なくとも１０個のヌクレオチドの断片から成る遺伝的構築体。

３、ベクターである請求項第２項に記載の構築体。

４、連続ヌクレオチド類を結合させることおよび／または適当なオリゴマー類を連結させることから成る請求項第１項に記載のＤＮＡまたは請求項第３項に記載の遺伝的構築体の調製方法。

５、第２ａ図を参照とし本文で実質的に記載のＤＮＡ。

６、ペルオキシダーゼ活性を保白°するハイブリッドタンパク質をコード化可能な配列を作製するために、その他のいずれかのＤＮＡ配列に融合させた請求項第１項に記載の全配列またはその少なくとも１０個のヌクレオチドの断片から成る＝ｈ請求項第２項たは第３項に記載の構築体。７．　：ｉ？請求項第２項記載の遺伝的構築体の少なくとも部分を発現することから成る単分散ホースラデッシュペルオキシダーゼＣの製造方法。

８、ホースラデッシニベルオキシダーゼコード化遺伝子とストレプトアビジンまたはアビジンコード化遺伝子との遺伝子融合体で、コード化された融合タンパク質がビオチン結合およびペルオキシダーゼ活性の双方を有するような構築体。

９、ホースラデッシュベルオキシダーゼコード化道伝子とイムノグロブリン由来抗原結合機能をコード化する遺伝子の遺伝子融合体で、この融合タンパク質が抗原結合およびホースラデッシュベルオキシダーゼ活性の双方を有するような遺伝子融合体。

１０、抗原結合機能がイムノグロブリン重鎮または軽鎖またはその断片または工学的に処理された単量体抗原性２．識部位である請求項第９項記載の遺伝子融合体。

１１、ホースラデッシュベオキシダーゼとその他のいずれの関心タンパク質との融合体の製造を可能とするホースラデッシュペルオキシダーゼＣの遺伝子から成るベクターである請求項第３項記載の構築体。

１２、ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子ともうひとじてのいずれかで同時に発現゛させる発現ベクータである請求項″？、４項記載の構築体。

１３、コード化されたホースラデッシュベルオキシダーゼタンパク質活性を破壊するかまたは損なう突然変異（ミスセンス、ノンセンス、欠失、挿入、複製または他の再配列のいずれか）を含有するホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子。

１４、請求項第１３項記載の突然変異ホースラデッシュベルオキシダーゼ遺伝子の全てまたはその少なくとも１０個のヌクレオチドの断片を含む遺伝的構築体。

１５、請求項第１４項記載の欠陥性ホースラデッシュベルオキシダーゼ遺伝的構築体を含む哺乳類細胞。

１６、請求項１４項記載の欠陥性ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝的構築体を含む形質転換動物。

１７、本文で開示した（別の方法で請求しているがどぅがの如何にかかわらず）全ての新規特徴または特徴の複合。

国際調査報告国際調査報告Ｇｌｌ　８８００８３３Ｓ＾　２４６６０

Claims

【特許請求の範囲】

１．ホースラデッシュペルオキシダーゼをコードし下記酵素に対する制限部位を有するＤＮＡ；ＨｐａＩ，ＳａｃＩ，ＳｓｐＩ，ＮｈｅＩ，ＮｓｉＩ，ＣｌａＩ，ＰｖｕＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＭＩ，ＦｓｐＩ，ＲｓｒＩＩ，ＳａｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢａｌＩ，ＰｖｕＩＩ，ＸｈｏＩ，ＢｓｐＭＩＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＳｎａＢＩ，ＰｆｌＭＩ，ＡｐａＬＩ，ＳｐｅＩ，ＳｃａＩ，ＸｂａＩ，ＳｔｕＩ，ＢｃｌＩ，ＢｓｔＸＩ，ＮｃｏＩ，ＫｐｎＩ，およびＰｓｔＩ．
２．下記配列を含むＤＮＡ；【配列があります】
３．請求項第１項または第２項記載のＤＮＡ、またはその断片から成る遺伝的構築体。
４．ベクターである請求項第３項から第８項のいずれかに記載の構築体。
５．連続ヌクレオチド類を結合させることおよび／または適当なオリゴマー類を連結させることから成る請求項第１項または第２項に記載のＤＮＡまたは請求項第３項に記載の遺伝的構築体の羽製方法。
６．第２ａ図を参照とし本文で実質的に記載のＤＮＡ。
７．ペルオキシダーゼ活性を保行するハイブリッドタンパク質をコード化可能な配列を作製するために、その他のいずれかのＤＮＡ配列に融合させた請求項第１項または第２項に記載の全配列またはその断片から成る請求項第３項に記載の構築体。
８．請求項第３項に記載の遺伝的構築体の少なくとも部分を発現することから成る単分数ホースラデッシュペルオキシダーゼＣの製造方法。
９．ホースラデッシュペルオキシダーゼコード化遺伝子とストレプトアビジンまたはアビジンコード化遺伝子との遺伝子融合体で、コード化された融合タンパク質がビオチン緋合およびペルオキシダーゼ活性の双方を有するような構築体。
１０．ホースラデッシュペルオキシダーゼコード化遺伝子とイムノグロブリン山来抗原結合機能をコード化する遺伝子の遺伝子融合体で、この融合タンパク質が抗原結合およびホースラデッシュペルオキシダーゼ活性の双方を行ずるような遺伝子融合体。
１１．抗原結合機能がイムノグロブリン重鎖または軽鎖またはその断片または工学的に処理された単量体抗原性認識部位である請求項第１０項記載の遺伝子融合体。
１２．ホースラデッシュペオキシダーゼとその他のいずれの関心タンパク質との融合体の製造を可能とするホースラデッシュペルオキシダーゼＣの遺伝子から成るベクターである請求項第４項記載の構築体。
１３．ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子ともうひとつの関心遺伝子を単一融合生成物、単一ボリツストロンメツセージまたは２つの別個ではあるが結合した転写単位としてのいずれかで同時に発現させる発現ベクータである請求項第４項記載の構築体。
１４．コード化されたホースラデッジュペルオキシダーゼタンパク質活性を破壊するかまたは損なう突然変異（ミスセンス、ノンセンス、欠失、挿入、複製または他の再配列のいずれか）を含有するホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子。
１５．請求項第１４項記載の突然変異ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝子の全てまたはその断片を含む遺伝的構築体。
１６．遺伝子構築体が哺乳期細胞で用いられる請求項第１５項記載の欠陥性ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝的構築体の使用。
１７．遺伝子構築体が形質転換動物で用いられる請求項１５項記載の欠陥性ホースラデッシュペルオキシダーゼ遺伝的構築体の使用。
１８．本文で開示した（別の方法で請求しているかどうかの如何にかかわらず）全ての新規特徴または特徴の複合。