JPS61242583A - ｔｒｐオペロンのシヤイン‐ダルガーノ配列と開始コードンとの間のＤＮＡ配列におけるタンパク質発現を増大させるための改変 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 ｔｒｐオペロンの調節配列は、大腸菌における真核生物
のタンパク質の発現のためにしばしば使用される。１：
　ｒ　ｐオペロンのプ［コモ−ター及びオペレーターを
含むＤＮＡ断片は、現在商業的に入手可能である。

ｔｒｐオペロンの調節配列の改変については既に開示さ
れていた。例えば、セラデア・マルセセンス（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）由来ｔｒｐオペロ
ンの調節因子であるヌクレオチド配列において、リポソ
ーム結合部位と開始コードンとの間に１−１ｉ　ｎ　ｄ
　ｌｌ切断部位を組込みつる可能性のあることが、たと
えば西独公開用３，２４７．９２２号明細書（南アフリ
カ特許第８３／９５１９号及び公開オース１〜ラリア特
許出願第８３／２２８３２号に対応する）に記載されて
いる。Ｃ１ａＩ切断部位を大腸菌の対応配列に挿入する
ことは、ジエイ・シー・エドマンら、ネーチャー、第２
９１巻、１９８１年、第５０３−５０６頁（Ｊ、　Ｃ，
ｌＥｄｍａｎ　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　２９１（’
１９８１）５０３−５０６　）に開示されている。しか
し２ｋがら、この改変によって、自然配列と比較してリ
ポソーム結合部位ど開始コードンとの間のヌクレオチド
数が変わることになる。

木「明の概要 制限酵素の切断部位を、ヌクレオチド数を変えずに一つ
のヌクレオチドを置換することによって、リポソーム結
合部位と開始コードンどの間のＤＮＡ配列に挿入するこ
とが可能であることが見出された。本発明では、開始コ
ードンのすぐ上流に位置するヌクレオシドアデノシンが
シチジンに置換されている。

このように、本発明は大腸菌ｔｒｐオペロンの改変ＤＮ
Ａ断片に関し、この断片はシャイン−ダルガーノ（Ｓｈ
ｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列ど第一開始コードンと
の間に位置覆るものであって、下記のＤＮＡ配列■を有
するものである。

５’　　ＧＴＡＴＣＧＡＣＣ３’　　　　（Ｉ）３’　
　ＣＡＴＡＧＣＴＧＧ　　５’ この配列■は、上部鎖の５′末端で下記のｔｒｐオペロ
ンのシャイン−ダルガーノ配列（ＲＮＡの段階では、現
実のリポソーム結合部位に対応）と結合し、上部鎖の３
′末端で開始コードンΔＴＧと結合している。

５’　　ＡＡＧＧ　　３′ ３’　　ＴＴＣＣｂ’ 本発明の配列■は、「コーディング鎖」ど称される上部
鎖のみについて、下記のように明確化を期して示される
ように、天然大腸菌配列及び前記エドマンらにより開示
された配列と比較される。

大腸菌　　　　ＧＴＡ　　ＴＣＧ　　ＡＣＡエドマンら
　　ＧＴＡ　　ＴＣＧ　　ＡＴ配列Ｔ　　　　　ＧＴＡ
　　ＴＣＧ　　ＡＣΩ（大腸菌配列との違いは下線部分
である）天然配列にお１プるＡをＣとする本発明による
置換にＪ：れば、下記の利点が得られる。

ヌクレオシドグアノシンを開始コードンＡＴＧの下流に
結合させれば、制限酵素ＮＣＯ■についての認識配列が
形成される。

Ｃ↓ＣＡＴＧＧ　　ｉ この切断部位のおかげで、例えば下式■の合成オーリゴ
メクレＡチドを用いることにより、開始コードンのＪぐ
隣りにＤＮＡを挿入することが可能にイｒる。

５　’　　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｘ・・・・・・３’　　　　
　（Ｉ）３’　　　　　　　Ｙ・・・・・・５′（−に
開式中、Ｘ及びＹは構造遺伝子の開始コードン下流にお
【）る最初の相補的ヌクレオチド対を表わす） この式においてＸがＧを表わし、ＹがＣを表わす場合は
、ＮｃｏＩ切断部位は結合生成物中に残存する。逆に、
例えば合成リンカ−が挿入され、゛その突出配列５’　
ＣＡＴＧ３’　が別のヌクレオチドと結合することにな
るならば、ＮｃｏＩ切断部位は消失するものの、一方で
は開始コードンの下流の最初のアミノ酸は各種多様のも
のに変えることができる。

勿論、Ｎ　ＣＯＩで切断されたＤＮＡの突出末端を、例
えばフレノウポリメラーゼを用いて酵素的に埋填し、更
にこのようにして得られた配列■：５’　　ＧＴＡ　Ｔ
ＣＧΔＣＣＡＴＧ　３’　　　（ＩＩＩ）３’　　ＣＡ
Ｔ　ＡＧＣＴＧＧ　ＴＡＣ５’の平滑（プラント）末端
ＤＮＡを、平滑末端配列Ｉｖ： ５’　　Ｘ・・・・・・３　’　　　　　　（ＩＶ　）
３’　　Ｙ・・・・・・５′ と結合さＵて、ＤＮＡ配列Ｖ： ５’　　ＧＴＡ　ＴＣＧ　ＡＣＣＡＴＧ　Ｘ−・・・・
・３’　　　ｆｆ）３’　　　ＣＡＴ　　ＡＧＣＴＧＧ
　　ＴＡＣＹ・・・・・・５′（×及びＹは前記の意味
を有Ｊる） を得ることも可能である。発現すべき特定の構造遺伝子
のための開始コードンは、この場合では更に必要とはさ
れない。これは、例えば、Ｎ末端が短くなったタンパク
質を製造するためには好ましい〜ｂのである。

伯の可能性は突出末端を酵素的に分解することぐあっ−
Ｃ１それにＪ、−）Ｃ同様に平滑末端ＤＮＡ配列■： ５’　　ＧＴＡ　　ＴＣＧ　　ＡＣ３’　　　（Ｖｌ）
３’　　ＣＡＴ　　ＡＧＣＴＧ　　５’を得て、これを
平滑末端配列■： ５　’　　Ｚ　　　Ａ　Ｔ　Ｇ　　Ｘ　−−３’　　　
　（ＶＨ）３’　　７’　　ＴＡＣＹ・・・・・・５′
と結合１ノで、Ｄ　Ｎ　Ａ配列■： ５’　　ＧＴＡ　ＴＣＧ　ＡＣＺ　　ＡＴＧ　Ｘ−・・
−・・３’　　　（■）３’　　　　ＣＡＴ　　ＡＧＣ
ＴＧＺ’　　　　−丁ＡＣＹ・・・・・・５′（Ｚ及び
Ｚ′は所望のヌクレオシド対を表わ寸が、これらは省略
覆ることもできる） とすることができる。天然大腸菌配列は、７及びＺ′が
それぞれ八及び］−を表わす場合に形成される。

これらが様々なりローニングの可能性を有していること
の仙に、本発明では構造遺伝子の発現量が著しい程にま
で改善されるという利点を生じる本発明のもう一面は、
大腸菌由来のにｒ　ｐ発現系を含むベクターのｉｌ！Ｊ
造法に関するものである。

その方法は、ｌ）　Ｎ　Ａ配列■（コーディング鎖）と
それに続＜　５　’　Ａ　−ｒ　Ｇ　Ｇ　３　’　を含
む大腸菌ベクターを制限酵素ＮｃｏＩで切断し、更に、
ａ）　　ＤＮＡ配列■【の構造遺伝子をこの切断部位に
結合さけるか、あるいは 旧　この切断部位を酵素的に埋填して、配列■のＤＮＡ
を配列ＩＶのＤＮＡと結合させるか、あるいはＣ）この
切断部位の突出配列を酵素的に分解し、配列ＶｌのＤＮ
Ａを配列ＶｌのＤＮＡと結合させる、ことからなる。

本発明の他の一面は、本発明により得られたベクターを
含む大腸菌宿主生物に関する。更に、本発明は、一般に
］−ド可能なアミノ酸からなるポリペプチドの＋ＪＡ造
法に関するものであって、この方法は本発明のベクター
で形質転換された大胆菌細胞による発現を公知の方法で
誘発させることからなるもので゛ある。

本発明の他の而及びそれらの好ましい態様は、以下で詳
細に説明されており、しかも特許請求の範囲において掲
げられている。

１１の具体的説明 本発明の具体的態様は、ｔｒｐプロモーターと同じよう
に配向Ｊるβ−ラクタマーゼプロモーターを右し、アン
ピシリン耐性をもつベクターからなる。即ら、このベク
ターは、本発明に従って改変されたｔ：　ｒ　ｐオペロ
ンであるため、開始コードン下流の遺伝子の極めて顕著
な弁用とβ−ラクタマーゼ誘導の可能性とが意外なこと
に生じているのである。β−ラクタマーゼ濃度が高まる
と比較的高ｆｆ［のアンピシリンに対しても耐性を示す
ため、それを利用して選別するもう一つの可能性が開り
でくる。これにより、発現すべき各タンパク質について
のリポソーム結合部位領域におけるヌクレオチドが特に
好ましいプロモーター変異ないし改変を起こしたか否か
を調べることが迅速になるのである。

β−ラクタマーゼの同時的形成は望まれないがアンピシ
リン耐性をもつベクターを利用しようとする場合は、所
望のポリペプチドについての構造遺伝子とβ−ラクタマ
ーゼについての構造遺伝子との間にターミネータ−を挿
入することによって、その同時的形成を抑制することが
できる。したがって、本発明のこの点におりるもう一つ
の態様は、上記遺伝子間に適切なターミネータ−１好ま
しくは細菌性ターミネータ−１を挿入することからなる
。ｔｒｐオペロンのターミネータ−が特に適切であり、
例えば構造遺伝子にお【）る停止コードン（２種以上の
停止コードン）の下流か、又はβ−ラクタマーゼオペロ
ンのすぐ上流に存在する１０〜２０個のヌクレオチドの
Ｊ：うな適切な部位に組込まれる。

本発明によるｔｒｐプロモーター／オペレーターをもつ
遺伝子構成体は、大胆菌内で複製されるすべてのプラス
ミドの中に組込むことができる。

商業的に利用可能な大腸菌ベクター、例えばｐ　Ｂ　Ｒ
３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、＝　　１１
　− ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵｃ８及びそれらの誘導体を使用
することが有利である。適切な誘導体の例は、非本質的
領域が除去され、切断部位もしくはマーカーが組込まれ
るか又は修正されたそれらのプラスミドである。

遺伝子配列■、■、ｖ、ｖｎ及び■は、ヌクレオチド対
ＸＹとともに、所望の構造遺伝子、例えば第一には、宿
主に内イ「しかつペリプラズム腔又は細胞膜に輸送され
るタンパク質を］−ドする遺伝子の最初の部分を含む。

この場合には、細胞質からの分離が可能であるために容
易に単離され、あるいは（また）細胞に内在する酵素に
よる分解から保護される融合タンパク質を製造すること
ができる。しかしながら、不溶性であるために細胞内在
タンパク質から容易に分離することができる融合タンパ
ク質を生成することも可能である。更には、開始コード
ンＡＴＧのずぐ下流に構造遺伝子を組込むことによって
、直接に所望のタンパク質を発現さ仕ることもできる。

本発明によって得ることができるポリペプチド〜　　１
２　− の例としては、インシュリン、インターフェロン類、イ
ンターロイキン−２のようなインターロイキン類、ヒル
ジン又はソマトスタチンがある。

本発明は下記の路側により詳細に説明される。

各プロレス段階については、マニアディス（Ｈａｎ−ｉ
ａｔｉｓ　）ら、二］−ルド・スプリング・ハーバ−（
Ｃｏｌｄ　５ｐｒｉｒ＋ｏ　１ｌａｒｂｏｒ）　　（１
９８２年）の゛モレ゛　キュラー・りローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）　”を参考にする
ことができる。

例　　１ 大腸菌染色体ＤＮＡをｌ−１ｉ　ｎ　ｆ　Ｉで切断して
、プロモーター、オペレーター、１−−ベプヂドの構造
遺伝子、アテニュエーター及び最初の６個のアミノ酸に
ついてのトリプトファンＥ　’Ｒ造遺伝子の］−トンを
含むｔｒｐＪペロンの４９２塩基対断片を単１ｌＩＩｔ
する。この断片をクレノウボリメラーゼによってデオキ
シヌクレオチド三リン酸でＪ！［！填し、その両端部を
Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｌｒ［Ｗ＆識配列をもつオリゴヌクレオ
チドと結合させ、それから）ｌｉｎｄｌｒｆで切断Ｍる
。このようにして得たＩ−１ｉ　ｎ　ｄ　ｉｌｌ断片を
ｐＢ　Ｒ３２２のｌｌ１ｎｄｌ［切断部位と結合させる
。

こうして得られるプラスミドがｐｌ：ｒｐＥ２−１であ
る（前記ジ１−イ・シー・エドマンらの文献参照）。こ
のプラスミドは、記述のようにしてプラスミドｐ　ｔ　
ｒ　ｐ　Ｌ、　１に転換される。

この出発物質を本発明のベクターに変えるために、これ
をＣＩａＩと反応させる（製造者にコーイングランドバ
イオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏ−１ａｈ
ｓ）　）の勧めに従う〕。インキコベー］−終了後、イ
ンキュベート混合物をフェノールで抽出し、有機相を分
離し、続いて２，５倍容晶のエタノールを加え、−２０
℃でインキュベートすることにより、ＤＮＡを沈澱させ
る。

ＤＮＡを遠心除去し、しかる後５′　−リン酸残塁を除
くためにアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハ
イム社）で処理する。

合成的に得られるオリゴヌクレオチド■：５　’　　Ｃ
Ｇ　Ａ　ＣＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　　３　’　　　（Ｉ
Ｘ　）をポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰにより５
′末端でリン酸化する。このためには、この合成オリゴ
ヌクレオチドを７０℃で５分間加熱し、しかる後直ちに
水浴中で冷却する。リン酸化は、１００μＭ　　ＡＴＰ
及びＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位が添加さ
れた緩衝液２５μｍ（５０ｍＭトリス１−ＩＣＩ　、Ｆ
）Ｈ７，６０，１０ｍＭ　　ＭｏｃＩ　　　５ｍＭジチ
オスレイト−ル（ＤＴＴ））中、３７℃で３０分間にわ
たり処理する。反応を、最終濃度５０μＭとなるまでエ
チレンジアミン四酢Ｍ　（ＦＤＴＡ）のす］・リウム塩
を加えることににって停止させる。過剰のＡＴＰは、例
えばセファロース（商標名Ｓ　Ｅ　Ｐ　ＨＡ　Ｄ　Ｅ　
Ｘ　　Ｇ　５０、細粒）のゲルｉ濾過ににって除去する
ことができる。

オリゴヌクレオチドＩＸは自己相補的であって、自ら会
合して二重鎖構造Ｘを形成することができる。

Ｔ　Ｇ　Ｇ王ＡＣＣＡＧに の二重鎖オリゴヌクレオチドＸは突出末端を有している
ので、これを開環状プラスミドＤ　ｔ　ｒ　ｐＬ　１の
Ｃ’ｌ　ａ　Ｉ部位に挿入することができる。

このＡリボヌクレオチド約５０ｎＧをプラスミド約１μ
Ｑと一緒にインキュベートするが、このプラスミドは１
ｍＭ　　ＡＴＰ及び０．１ｎＧ／ｍ１牛而清アルブミン
（ＢＳＡ）が添加された緩衝液３０／−Ｚｌ　（５０ｍ
ｔｖｌトリスｌ−１０１、ｐｌ−１７，４０，１０ｍＭ
　　Ｍ（ＪＣＩ　　　１０ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ　）中１２℃
で２０時間ホスファターゼで処理されたものである。プ
ラスミドｐＨ１３１１５が得られる（図１）。

この反応混合物は、］ンピテン１へ大腸菌ｌｌ１ｌ胞の
形質転換のために直ちに使用することができる。

選別は、Ｌブイヨン〔エッチ・ジエイ・ミラー（１１，
Ｊ、Ｈｉｌｌｅｒ）　　１分子遺伝学の実験Ｊ　　（Ｅ
ｘｐｅｒｉｍ−ｅｎｔＳ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、：］−ルド・スプリング・ハー
バ−１１９７２年）及び５０μ０／ｍ１アンピシリンを
用いて寒天プレート上で行なわれる。

ＮｃｏＩ切断部位がプラスミドｐＨ１３１１５に挿入さ
れているため、アンピシリン耐性１ロ二−を試験して、
プラスミド１）ＮＡが約３００塩基対のＨｉｎｄｌ［Ｉ
−ＮｃｏＩ断片を有しているか否かについて調べた。８
０％以上のコ［に一がこの断片を有していた。マキサム
−ギルバート法での配列決定により、合成りＮＡ断片の
組込みと図１に示したプラスミドｐｌ−１１３１１５の
配列どが確認された。

鮫−ス 西独公開第３．４．１９．’９９５号明細書の図５に示
されたプラスミド１）１５９／６を製造者が勧めるよう
に酵素ＥＣ０ＲＩ及び５ａｌＩと一緒にインキュベート
し、ヒ］〜インターロイキン−２についての遺伝情報を
もつ４２０塩基対のＤＮＡ断片をゲル電気泳動ににり分
離する。−重鎮突出末端を、製造者が勧める条件下でＶ
エナリ（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレアーゼ（ファルマシ
アＰ　−Ｌバイオケミカルズ社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で分解する。

このプラスミドｐｌ−１１３１／　５をＮＧＯ■と反応
させ、突出−重鎖末端を同様にヤ■ナリヌクレアーゼで
分解する。次いで、平滑末端となっているインター［１
イキンー２についての構造遺伝子を、「平滑末端］条件
下でＤＮＡリガーゼを用いて、開環させかつ平滑末端と
ｊノであるプラスミドに組込む。これにより、ＮＣＯ］
切断部位を再形成させる。大腸菌２９４への形質転換を
行ない、適切な制限断片、例えば約２６０塩基対の［Ｅ
Ｃ０ＲＩ−ＸｂａＩ断片又は約１５０塩基対１７）ＥＣ
ＯＲＩ−３ａＣＪ断片、をもつアンピシリン耐性クロー
ンを選別する。

配列決定により、プラスミドｐＨ１８５／１１（図２）
のヌクレオチド配列を確認した。ＮＣＯ■制限部位はこ
の構造中に残存している。

インターロイキン−２０発現のために、プラスミドルｌ
−１１８５／１１含有大腸菌２９４を５０μｇ７’ｍ＋
アンピシリン含有Ｌ８培地（エッチ・ジエイ・ミラーの
前記文献参照）中で通気しながら一夜インキコベートす
る。次いで、１μＱ／ｍｌチアミン及び５００μ０／ｍ
１カザミノ酸含有Ｍ９培地（エッチ・ジエイ・ミラーの
前記文献参照）により１：１００希釈物を調製覆る。Ｏ
Ｄｏ、５の状態で、＠終濃度１５μｏ／ｍｌとなるまで
インドリル−３〜アクリル酸を加えて誘発を行なうこと
ができる。更に２〜３時間後、遠心分離して細菌を除去
１−る。ＳＤＳゲル電気泳動により、誘発細菌から、西
独公開用 ：３，４１９．９９５号明細書で製造されたインターロ
イキン−２に対する抗体ど反応する強タンパク質バンド
を検出することができる。このバンドは予想される分子
量をもつインターロイキン−２と一致し、非誘発細菌か
らは得られない。生物学的活性をもつインターロイキン
−２は誘発細菌において高濃度で検出することができる
。

上記細菌培養条件は、振盪フラスコ法でも適用される。

この場合は、更に高濃度のカザミノ酸及び（又は）Ｌ−
トリプトファンをより高いＯＤ値（３以上）で発酵する
まで添加するようにする。

例　　３ ヒトβ−インターフェロンについての構造遺伝子をｃＤ
ＮＡバンクから入手した。このクローンは、プラスミド
ｐ　Ｂ　Ｒ３，２２のＰｓｔＩ部位にその挿入断片を有
している。β−インターフェロンの構造遺伝子由来の１
’　２０塩基対の断片を、制限酵素１−１　ｉ　ｎ　ｆ
’　■及びＰｓｔＩと接触させることにＪこり単離した
。ｌ−１ｉ　ｎ　ｆ　Ｔ部位の認識配列は、この生物学
的（こ活性なβ−インターフェロンのＮ末端メヂオニン
についての］−トンのヌクレオチド１６個下流から始ま
る。

合成にＪ：り得られるオリゴヌクレオチドＸ■：５’　
　ＣＡＴＧＡ’ＧＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＴＧＧ　　
　　　３’　（ＸＩ）３’　　　　　ＴＣＧＡＴＧＴＴ
ＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＡＡ　　　５’ＮＣＯＴ　　　　
　　　　　　　　Ｈｔｎｔ’　　ＴをＤＮＡリガーゼに
よって断片のＨｉｎｆＩ末端に付着させる。ＤＮＡ断片
Ｘ■が得られる。

更に、３６５塩基対のＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ及びＢｑ
ｌＩＩを用いてβ−インターフェロンの構造遺伝子から
単能した。この断片を、予めｐｓｔ■及びＢ　ａ　ｍ　
ｌ−Ｉ　Ｉと反応させである商業的に入手可能なプラス
ミドｐＵｃ１２を用いてクローン化した。プラスミドｌ
）　Ｈｌ　８８が得られる。増殖・再単離後、プラスミ
下ｐＨ１８８をＰｓｔＩ及びＥＣ０ＲＩと一緒にインキ
ュベートし、β−インターフェロン遺伝子断片を単離す
る（ＤＮＡ断片Ｘ■）。

プラスミドＩ）　Ｈ１’　３１　／　５を制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＥｃｏＲＩと反応させる。次いで、ＤＮＡリガ
ーゼ酵素の存在下、共有結合を生じる条ｆ１にて、ＤＮ
Ａ断片Ｘ■及びＸ■をこの開環状プラスミドと一緒にイ
ンキュベートする。プラスミドｐｌ−１１９２１５の予
想される配列を制限分析法及び配列決定法にＪ：り確認
する（図３）。

β−インターフエ［トンの発現プロセスは例と同様であ
る。この場合にも、誘発後に電気泳動ゲルにＪ：って顕
著なバンドが検出されるが、このバンドは非誘発細菌で
は存在しない。生物学的活性をもつβ−インターフェロ
ンは、細菌からの抽出物中に検出することができる。

インターロイキン−２についての構造遺伝子を例２に従
いプラスミドｐｌ−１１３１１５のＮＣＯＩ部位に挿入
した。プラスミドとＥＣ０ＲＩとの反応後、デオキシア
デノシン三リン酸及びデオキシチミジン三リン酸の存在
下にフレノウポリメラーゼと共にインキコベ−１〜する
ことにより、突出末端を平滑末端にしＩＣ０ 開環させかつ平滑末端としたプラスミドに、「平滑末端
」条件下で、商業的に入手可能なｔｒｐオペロンのター
ミネータ−（ファルマシアＰ−１−バイオケミカルズ社
）を組込み、同時に閉環させる。

例２で予め述べたように細菌を増殖させかつ誘発させた
後、細菌を分離し、溶菌させる。ＳＤＳゲル電気泳動で
はインターロイキン−２タンパク質のバンドに変化が見
られず、例２と同じ強度を有している。しかしながら、
β−ラクタマーゼに相当するバンドは著しく低い強度を
示す。

【図面の簡単な説明】

図１〜３は、本発明の具体例を詳細に説明するものであ
って、図１は公知のプラスミド１）ｔｒｌ）Ｌｌからの
プラスミド１）Ｈ１３１１５（７）製造法を示す説明図
、図２は公知のプラスミド１）１５９／６及びプラスミ
ドｐＨ１３１１５（図１）からの、インターロイキン−
２を」−ドするプラスミドｐｌ−１１８５／１１の製造
法を示す説明図、および図３はβ−インターフェロンを
コードするプラスミドｐＨ１９２１５を示す説明図、で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、５′末端がシャイン−ダルガーノ配列 ＡＡＧＧに結合し、３′末端が開始コードンＡＴＧに結
   合している、下記のコーディング鎖配列 I を有する、
   大腸菌由来ｔｒｐオペロンのＤＮＡ断片。 ５′ＧＴＡＴＣＧＡＣＣ３′　（ I ） ２、５′末端がシャイン−ダルガーノ配列 ＡＡＧＧに結合し、３′末端のＧが開始コードン下流の
   構造遺伝子の最初のヌクレオチドである下記のコーディ
   ング鎖配列 I ａを有する、特許請求の範囲第１項記載
   のＤＮＡ。 ５′ＧＴＡＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧ３′　（ I ａ）３、
   コーディング鎖ＤＮＡ配列 I とそれに続く５′ＡＴＧ
   Ｇ３′とを含む大腸菌のベクターを制限酵素Ｎｃｏ I
   で切断し、更に、 ａ）この切断部位において、下記のＤＮＡ配列II： 【遺伝子配列があります】（II） （上記式中、Ｘ及びＹは、構造遺伝子の開始コードンの
   下流における最初の相補的ヌクレオチド対を表わす） の構造遺伝子を結合させるか、あるいは ｂ）この切断部位を酵素的に埋填し、下記の配列IIIの
   ＤＮＡ： 【遺伝子配列があります】（III） を下記の配列IVのＤＮＡ： ５′Ｘ・・・・・・３′　（IV） ３′Ｙ・・・・・・５′ （上記式中、Ｘ及びＹは上記の意味を有する）と結合さ
   せるか、あるいは ｃ）この切断部位における突出配列を酵素的に分解し、
   下記の配列VIのＤＮＡ： 【遺伝子配列があります】（VI） を下記の配列VIIのＤＮＡ： 【遺伝子配列があります】（VII） （ＺおよびＺ′　は所望のヌクレオチド対を表わすが、
   これらは省略することもできる） と結合させることからなる、大腸菌のｔｒｐ発現系を有
   するベクターの製造法。 ４、特許請求の範囲第３項記載の方法により得られたベ
   クター。 ５、図１に示されたプラスミドｐＨ１３１／５である、
   特許請求の範囲第４項記載のベクター。 ６、図２に示されたプラスミドｐＨ１８５／１１である
   、特許請求の範囲第４項記載のベクター。 ７、図３に示されたプラスミドｐＨ１９２／５である、
   特許請求の範囲第４項記載のベクター。 ８、特許請求の範囲第４項記載のベクターを含む大腸菌
   。 ９、特許請求の範囲第８項記載の大腸菌細胞における発
   現を誘発させることからなる、一般にコード可能なアミ
   ノ酸から構成されるポリペプチドの製造法。