JP2024037864A

JP2024037864A - ヒトｒｐｅ細胞医薬品およびその使用

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Publication number: JP2024037864A
Application number: JP2023209915A
Authority: JP
Inventors: ロジャーゲイ，; Gay Roger; イリナクリマンスカヤ，; Klimanskaya Irina; ロバートランサ，; Lanza Robert
Original assignee: Astellas Institute for Regenerative Medicine
Current assignee: Astellas Institute for Regenerative Medicine
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2023-12-13
Publication date: 2024-03-19
Also published as: GB2496969A; EP2780022B2; WO2013074681A1; DK2780022T3; JP2014533289A; AU2025201277A1; EP3563860A1; IL320536A; EP2780022A1; CY1121819T1; US20200405767A1; JP2018048144A; HUE044778T2; AU2021204719B2; AU2019201201A1; HRP20191110T1; CA2855941A1; JP6899865B2; TWI842079B; IL287381A

Abstract

【課題】シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＳＭＤ）および乾燥型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を治療するための組成物を提供する。
【解決手段】複数の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞と；薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物であって、前記複数のＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量が８ｐｇ／細胞未満である、医薬組成物を提供する。
【選択図】図１Ａ－Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書に援用する、２０１１年１１月１４日に出願された米国仮出願第６１／５５９，５２１号明細書、２０１２年１１月８日に出願された米国仮出願第６１／７２４，０４７号明細書、および２０１２年１月２３日に出願された米国仮出願第６１／５８９，７４１号明細書の優先権を主張する。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、再生医療のための代替細胞の有望な供給源と見なされている（１）。大きな科学的進歩にもかかわらず、ｈＥＳＣは、今までに臨床利用のために提案された、最も複雑な生物学的治療的実体の１つである（２）。それらの生物学の動的複雑さに加えて、奇形腫形成リスク、および組織不適合性に関連する課題をはじめとする、多数の調節上の懸念が、臨床移行を妨げてきた。体細胞核移植（３）または人工多能性幹細胞（４、５）などの細胞再プログラミング技術がさらに発展するまで、眼およびその他の免疫特権部位に影響を及ぼす疾患は、患者における多能性幹細胞ベースの初めての治療法となる可能性が高い。血液と眼の関門によって網膜下腔が保護されることは、確立されており、細胞免疫および体液性免疫応答どちらも抗原特異的に阻害されることで特徴付けられる（６）。

網膜内では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の変性が多様な視覚を脅かす疾患において光受容体喪失をもたらし、これらの疾患としては、それぞれ成人および若年失明の世界的な二大原因である、乾燥型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）およびシュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＳＭＤ）が挙げられる。どちらも目下治療不能であるが、黄斑変性の前臨床モデルにおいて、ｈＥＳＣ由来ＲＰＥの移植が、光受容体を救出して視力喪失を阻止し得る証拠がある（７、８）。その機能として、ＲＰＥは、感光色素を再循環させ、ビタミンＡを送達し代謝して貯蔵し、視細胞外節を貪食し、網膜と脈絡膜の間で鉄および小型分子を輸送し、迷光を吸収してより良い画像分解能を可能にすることで、光受容体の健康を保つ（９、１０）。ＲＰＥ機能障害が原因で視力劣化する動物モデルである、ＲｏｙａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｕｒｇｅｏｎｓ（ＲＣＳ）ラットでは、ｈＥＳＣ由来ＲＰＥの網膜下移植が、有害な病変の形跡なしに、大規模な光受容体救出および視覚機改善（未処置対照を１００％上回る）をもたらした（７）。
網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、下層の脈絡膜（網膜背後の血管層）と、それに重なる網膜視細胞（例えば光受容体の桿体および錐体）の間の、網膜神経感覚上皮の外部にある色素性細胞層である。ＲＰＥは、光受容体および網膜の機能と健康にとって、重要である。ＲＰＥは、光色素を再循環し、ビタミンＡを送達し代謝して貯蔵し、桿体視細胞外節を貪食し、網膜と脈絡膜の間で鉄および小型分子を輸送し、ブルッフ膜を維持し、迷光を吸収してより良い画像分解能を可能にすることで、光受容体機能を維持する。ＥｎｇｅｌｍａｎｎａｎｄＶａｌｔｉｎｋ（２００４）”ＲＰＥＣｅｌｌＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ”。Ｇｒａｅｆｅ’ｓＡｒｃｈｉｖｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ２４２（１）：６５－６７（非特許文献１）；ＩｒｉｎａＫｌｉｍａｎｓｋａｙａ，ＲｅｔｉｎａｌＰｉｇｍｅｎｔＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍＤｅｒｉｖｅｄＦｒｏｍＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ｉｎＳＴＥＭＣＥＬＬＡＮＴＨＯＬＯＧＹ３３５－３４６（ＢｒｕｃｅＣａｒｌｓｏｎｅｄ．，２００９）（非特許文献２）もまた参照されたい。ＲＰＥの変性は、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、（加齢黄斑変性をはじめとする）黄斑変性、色素性網膜炎、およびシュタルガルト病（黄色斑眼底）などの光受容体損傷と失明をもたらす、いくつかの視覚変性疾患と関連付けられている、網膜離脱、網膜異形成、または網膜萎縮を引き起こし得る。例えば、国際公開第２００９／０５１６７１号パンフレットを参
照されたい。

ＲＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞組成物を作成する方法、およびその使用をはじめとする特定の主題は、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書に援用する、２００５年７月２０日に米国特許出願第１１／１８６７２０号明細書として出願された現在の米国特許第７７３６８９６号明細書；２００６年７月２１日に米国特許出願第１１／４９０９５３号明細書として出願された現在の米国特許第号明細書７７９５０２５；２００５年１月２４日に米国特許出願第１１／０４１３８２号明細書として出願された現在の米国特許第７７９４７０４号明細書；２００４年１月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／５３８９６４号明細書；２０１０年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第１２／６８２，７１２号明細書；２００７年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９９８６６８号明細書；２００７年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第号明細書６０／９９８７６６；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／００９９０８号明細書；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／００９９１１号明細書；２０１０年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／３６７０３８号明細書；２０１０年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／４１４７７０号明細書；２０１１年７月２５日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／４５２３２号明細書；２０１０年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第１２／６８２７１２号明細書；２００５年１月２４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／０２２７３号明細書；２０１０年１１月１７に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５７０５６号明細書（国際公開第２０１１／０６３００５号パンフレットとして公開された）；および２００９年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／２６２，００２号明細書をはじめとする、所有者共通の米国特許出願および特許で開示される。

ＥｎｇｅｌｍａｎｎａｎｄＶａｌｔｉｎｋ（２００４）"ＲＰＥＣｅｌｌＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ"。Ｇｒａｅｆｅ’ｓＡｒｃｈｉｖｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ２４２（１）：６５－６７ＩｒｉｎａＫｌｉｍａｎｓｋａｙａ，ＲｅｔｉｎａｌＰｉｇｍｅｎｔＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍＤｅｒｉｖｅｄＦｒｏｍＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ｉｎＳＴＥＭＣＥＬＬＡＮＴＨＯＬＯＧＹ３３５－３４６（ＢｒｕｃｅＣａｒｌｓｏｎｅｄ．，２００９）

一次ＲＰＥ細胞の無傷のシートおよび懸濁液の移植が、以前にヒト対象で試みられているが、移植片の生存および視覚改善の双方に関して、結果は入り交じっていた。（１１～１９）。今まで、一次ＲＰＥ細胞を使用する、一貫して効果的なヒトの治療薬は、報告されていない。

本開示は、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＳＭＤ）および乾燥型加齢黄斑変性（乾燥型ＡＭＤ）を治療するための、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の安全性を実証するのを助ける、１／２相臨床データを報告する。１／２相臨床試験のそれぞれにおいて初例である、２人の患者について結果が報告される。不都合な安全性問題が示されないことに加えて、構造的証拠は、ｈＥＳＣ由来細胞が生存し、報告された試験期間中持続し続けたことを立証した。双方の患者は、視覚に測定可能な改善を有
し、それは少なくとも１年間持続した。

処置の１年後、いかなる時点でも、過剰増殖、腫瘍原性、異所性組織形成、または明らかな拒絶反応は、どちらの患者でも観察されなかった。詳細な臨床および診断検査評価は、移植後の複数の評価において実施された。幹細胞ベースの治療法、特にｈＥＳＣ由来幹細胞ベースの治療法では、それらの多分化能のために、異常増殖（または腫瘍形成）が重大な安全上の懸念と見なされており；したがってｈＥＳＣの分化を制御することが、重要である。報告された結果は、これらの患者において、幹細胞分化が良好に制御されたことを示す。不都合な安全性シグナルは、検出されなかった。

成功裏の幹細胞由来ＲＰＥ移植の解剖学的証拠は、ＳＭＤ患者において、臨床的に、および高分解能画像診断技術により、観察された。この証拠は、移植後１週間目に開始して経過観察期間全体に及ぶ、移植領域内における、ＲＰＥレベルでの色素沈着増大を含んだ。移植された幹細胞由来ＲＰＥは、適切な位置に生着して、正常なＲＰＥ形態を取るようであった。乾燥型ＡＭＤ患者では、生着および色素沈着増大は検出されなかった。しかしどちらの患者も、４ヶ月の経過観察期間でいくらかの視覚改善を示し、それは少なくとも１年間の経過観察期間にわたり持続した。

以下に詳述するように、シュタルガルト病患者の視力は、手動弁のみから２０／８００の視覚まで改善された。治療前、患者は、ＥＴＤＲＳ視力チャート上のいかなる文字も読み取れなかった。しかし移植後２週間で、彼女は、治療された眼で、文字を読み始めることができ、それは１～３ヶ月で５文字に、１年間で１５文字に改善された（２０／５００視覚）。

湿潤型ＡＭＤを治療するための新しい薬剤はいくつか利用できるが、乾燥型ＡＭＤまたはシュタルガルト病のどちらにも、目下存在する実証された治療法はない。これらの病状の進行性の性質にもかかわらず、最低投与量においてさえも、双方の患者の視覚は、細胞移植後に改善されたようであった。出願人らは、より顕著な結果が潜在的に期待されるかもしれない疾病経過のより初期に患者を治療した場合に、さらにより顕著な改善を期待する。細胞投与量の増大もまた、より顕著な改善をもたらしてもよい。

ヒト胚性幹細胞は、潜在的に免疫原性が低下している、健康な「幼若」細胞を無限に生成することで、代替組織の優れた供給源を提供し得る。眼は、血液と眼の間の障壁による網膜下腔の保護に起因する免疫特権を持つ部位であり、その結果、低い一過性用量の免疫抑制のみが使用された。いずれの患者でも、拒絶反応または炎症の徴候は観察されず、医師らは双方の患者をモニターし続けている。

本明細書で提示される結果は、疾患によって損傷を受けた組織を修復または置換する可能性の実現に対する、幹細胞療法再生医療の将来性を強調する。

ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞には、移植前の広範な安全性試験を施行した。細胞には、動物およびヒト病原体がないことが確認され、高感度アッセイを実施して、腫瘍形成のリスク因子である、あらゆる未分化ｈＥＳＣの存在を最終製品から排除した。制御されたｈＥＳＣ分化は、ほぼ１００パーセント純粋なＲＰＥをもたらした。ｈＥＳＣの中心的特徴は、生体外分化段階を制御して、生存および機能性を最大化し得ることである。本明細書のデータは、ＲＰＥ成熟度および色素沈着の程度が、移植後における細胞の引き続く付着と成長に、劇的に影響を及ぼしてもよいことを示す。

どちらの治験も前向き非盲検試験であり、ＳＭＤおよび乾燥型ＡＭＤ患者への網膜下移植に続いて、研究の主要エンドポイントである１２ヶ月目に、ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の
安全性と耐容性を判定するようにデザインされる。各治験には、漸増用量形式の各３人の患者のコホートで、それぞれ１２人の患者が登録する。ＳＭＤおよび乾燥型ＡＭＤの患者は、どちらも最低用量（５０，０００個の細胞）で、ｈＥＳＣに由来する完全分化ＲＰＥ細胞の網膜下移植を受けた。

一態様では、本開示は、複数の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞と；薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物を提供し、前記複数のＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、８ｐｇ／細胞未満である。前記ＲＰＥ細胞は、懸濁液、ゲル、コロイド、基材、基質、スキャフォールド、または移植片中に含有されてもよい。

前記薬学的に許容できる担体は、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する無菌溶液を含んでなってもよい。前記薬学的に許容できる担体は、平衡塩類溶液を含んでなってもよい。前記平衡塩類溶液は、１ｍＬあたり、水中の塩化ナトリウム７．１４ｍｇ、塩化カリウム０．３８ｍｇ、塩化カルシウム二水和物０．１５４ｍｇ、塩化マグネシウム六水和物０．２ｍｇ、二塩基性リン酸ナトリウム０．４２ｍｇ、炭酸水素ナトリウム２．１ｍｇ、デキストロース０．９２ｍｇ、グルタチオンジスルフィド（酸化型グルタチオン）０．１８４ｍｇ、および塩酸および／または水酸化ナトリウム（ｐＨを約７．４に調節するため）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になってもよい。

前記医薬組成物の容積は、約１００μＬ～１０００μＬであってもよく、または少なくとも約１５０μＬであってもよい。前記医薬組成物は、約１，０００～約１×１０^９個の生ＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。前記医薬組成物は、約３３３個の生ＲＰＥ細胞／μＬ～約２，０００個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約４４４個の生ＲＰＥ細胞／μＬ～約１７６６個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約３３３個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約４４４個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約６６６個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約８８８個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約９９９個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、または約１，３３３個の生ＲＰＥ細胞／μＬを含んでなってもよい。

前記医薬組成物中のＲＰＥ細胞の濃度は、前記ＲＰＥ細胞の約３０％以下が６０分間以内に生存度を失い、任意選択的に前記ＲＰＥ細胞の約１０％以下が４時間に生存度を失う程度に十分に高くあってもよい。ＲＰＥ細胞の前記濃度は、少なくとも約１，０００個の細胞／μＬ、少なくとも約２，０００個の細胞／μＬ、約１，０００～１０，０００個の細胞／μＬ、または約２，０００～５，０００個の細胞／μＬであってもよい。

医薬品は、約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％未満のＲＰＥ細胞でなくてもよい細胞を含んでなってもよい。

前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、および少なくとも０．１ｐｇ／細胞、および任意選択的に少なくとも０．５ｐｇ／細胞または１ｐｇ／細胞；０．１～８ｐｇ／細胞、０．１～７ｐｇ／細胞，０．１～６ｐｇ／細胞，０．１～５ｐｇ／細胞、０．１～４ｐｇ／細胞、０．１～３ｐｇ／細胞、０．１～２ｐｇ／細胞、０．１～１ｐｇ／細胞、１～７ｐｇ／細胞、０．５～６ｐｇ－細胞、または１～５ｐｇ／細胞であってもよい。

前記医薬組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％は、ベストロフィン＋であってもよい。前記医薬組成物中の細胞
の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＰＡＸ６＋および／またはＭＩＴＦ＋であってもよい。前記医薬組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＰＡＸ６＋および／またはベストロフィン＋であってもよい。前記医薬組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＺＯ－１＋であってもよい。医薬組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％は、ＰＡＸ６＋およびベストロフィン＋であってもよい。前記医薬組成物中の細胞の少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＰＡＸ６＋であってもよい。

例示的実施形態では、前記医薬組成物中の１００万個の細胞あたり約１個以下の細胞、および任意選択的に９００万個の細胞あたり２個以下の細胞が、ＯＣＴ－４およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現の双方について陽性であってもよい。

針または注入カニューレは、前記ＲＰＥ細胞の少なくとも一部を含有してもよい。前記ＲＰＥ細胞の濃度は、前記針または注入カニューレへの装填に際して、約４４４個の生細胞／μＬ～約１，７６６個の生細胞／μＬであってもよい。前記針または注入カニューレから送達される生ＲＰＥ細胞の濃度は、約３３３個の生細胞／μＬ～約１，３３３個の生細胞／μＬであってもよい。前記針または注入カニューレ径は、約０．３ｍｍ～約０．９であってもよい。前記針または注入カニューレ径は、約０．５～約０．６ｍｍであってもよい。前記針または注入カニューレは、約０．０９ｍｍ～約０．１５ｍｍの径を有する先端を含んでなってもよい。前記カニューレは、ＭＥＤＯＮＥＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２５／３８ｇ（０．１２ｍｍ（３８ｇ）×５ｍｍ先端付き０．５０ｍｍ（２５ｇ）×２８ｍｍカニューレ）またはＳｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓＡｎｇｌｅｄ３９ｇ注入カニューレであってもよい。

前記ＲＰＥ細胞は、冷凍保存されて解凍されているＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。

前記ＲＰＥ細胞は、ヒト細胞であってもよい。

医薬組成物は、前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与されてもよい、少なくとも１つの血管新生阻害剤をさらに含んでなってもよい。例示的な血管新生阻害剤は、ペプガタニブナトリウム；アフリベルセプト；ベバシラニブ；ラパマイシン；ＡＧＮ－７４５；バタラニブ（ｖｉｔａｌａｎｉｂ）；パゾパニブ；ＮＴ－５０２；ＮＴ－５０３；ＰＬＧ１０１；ＣＰＤ７９１；抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片；ベバシズマブ；ラニビズマブ；抗ＶＥＧＦＲ１抗体；抗ＶＥＧＦＲ２抗体；抗ＶＥＧＦＲ３抗体；ＩＭＣ－１１２１（Ｂ）；ＩＭＣ－１８Ｆ１；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（アフリベルセプト）；ＡＺＤ－２１７１（セジラニブ）；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）；ＶＥＧＦＲ－１および／またはＶＥＧＦＲ－２を阻害するＴＫＩ；ソラフェニブ（ネクサバール）；ＳＵ５４１６（セマキシニブ）；ＳＵ１１２４８／スニチニブ（スーテント）；バンデタニブ（ＺＤ６４７４）；Ｌｙ３１７６１５（エンザスタウリン）；抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片；ボロシキシマブ；３－（２－｛１－アルキル－５－［（ピリジン－２－イルアミノ）－メチル］－ピロリジン－３－イルオキシ｝－アセチルアミノ）－１－（アルキル－アミノ）－プロピオン酸；（Ｓ）－２－［（２，４，６－トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ－３－［７－ベンジルオキシカルボニル－８－（２－ピリジニルアミノメチル）－１－オキサ－２，７－ジアザスピロ－（４，４）－ノン－２－エン－３－イル］カルボニルアミノプロピオン酸；ＥＭＤ４７８７６１；またはＲＣ^＊Ｄ（ＴｈｉｏＰ）Ｃ^＊（Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－チオプロリン－Ｃｙｓ（星印はシステイン残基を通じたジスルフィド結合による環化を意
味する）；２－メトキシエストラジオール；αＶβ３阻害剤；アンギオポエチン２；抗血管新生ステロイドおよびヘパリン；アンギオスタチン；アンギオスタチン関連分子；抗カテプシンＳ抗体；抗トロンビンＩＩＩ断片；カルレティキュリン；カンスタチン；カルボキシアミドトリアゾール；軟骨由来血管新生阻害因子；ＣＤＡＩ；ＣＭ１０１；ＣＸＣＬ１０；エンドスタチン；ＩＦＮ－α；ＩＦＮ－β；ＩＦＮ－γ；ＩＬ－１２；ＩＬ－１８；ＩＬ－４；リノミド；マスピン；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；Ｍｅｔｈ－１；Ｍｅｔｈ－２；オステオポンチン；ペガプタニブ；血小板因子－４；プロラクチン；プロリフェリン関連タンパク質；プロトロンビン（クリングルドメイン－２）；レスチン；可溶性ＮＲＰ－１；可溶性ＶＥＧＦＲ－１；ＳＰＡＲＣ；ＳＵ５４１６；スラミン；テコガラン；テトラチオモリブデート；サリドマイド；レナリドミド；トロンボスポンジン；ＴＩＭＰ；ＴＮＰ－４７０；ＴＳＰ－１；ＴＳＰ－２；バソスタチン；ＶＥＧＦＲ拮抗薬；ＶＥＧＩ；ボロシキシマブ（Ｍ２００）；フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；レンバチニブ（Ｅ７０８０）；モテサニブ（ＡＭＧ７０６）；パゾパニブ（ヴォトリエント）；ＶＥＧＦの阻害剤；ＶＥＧＦＲ１の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；α５β１インテグリンの阻害剤；ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、および／またはα５β１インテグリンのペプチド、ペプチド模倣剤、小分子、化学的、および／または核酸阻害剤；ＩＬ－６拮抗薬；抗ＩＬ－６抗体；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から、任意選択的に増殖性（血管新生）眼疾患を予防または治療するのに十分な量で選択されてもよい。

ＲＰＥ細胞は、遺伝子改変されていてもよい。例えば、前記ＲＰＥ細胞は、遺伝子改変された多能性細胞から生成されてもよい。前記遺伝子操作は、前記ＲＰＥ細胞による、血管新生を阻害する１つまたは複数の因子の産生をもたらしてもよい。血管新生を阻害する例示的な因子は、フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；特異的抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗ＶＥＧＦ受容体抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片またはドメイン；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの因子を含む。

血管新生を阻害する前記因子の産生は、ＲＰＥ特異的プロモーターによって調節されてもよい。前記ＲＰＥ－特異的プロモーターは、ＲＰＥ６５プロモーター、カテプシンＤ近位プロモーター、およびＶＭＤ２プロモーターからなる群から選択されてもよい。

前記ＲＰＥ細胞は、多能性細胞から生成されてもよい。前記多能性幹細胞は、ＯＣＴ－４、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、および／またはＴＲＡ－１－８０を含んでなってもよい、１つまたは複数のマーカーの発現について陽性であってもよい。前記多能性細胞は、前記培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な時間にわたり、多層集団または胚様体中で培養されてもよい、ヒト多能性細胞であってもよい。前記培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な前記時間は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、または少なくとも約７週間、少なくとも約８週間を含んでなってもよい。前記多層集団または胚様体は、ＤＭＥＭを含んでなってもよい培地中で培養されてもよい。前記培地は、ＥＢ－ＤＭを含んでなっても、それから本質的になっても、またはそれからなってもよい。前記色素性上皮細胞は単離して培養し、それによってＲＰＥ細胞集団を生成してもよい。前記単離は、培養から、細胞または細胞塊を酵素的、化学的、または物理的に分離するステップと、色素性上皮細胞、または色素性上皮細胞を含んでなってもよい細胞塊を選択するステップを含んでなってもよい。前記胚様体は懸濁状態で、および／または付着培養として、培養されてもよい（例えば懸濁状態とそれに続く付着培養）。付着培養として培養された前記胚様体は、色
素性上皮細胞を含んでなる１つまたは複数の増殖物を生じてもよい。前記多能性幹細胞は、低下したＨＬＡ抗原複雑度を有する。ＲＰＥ形成に先だって、前記多能性細胞は、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、ヘパラン硫酸、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ、ヒト基底膜抽出物、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択されてもよい基材上で、培養されてもよい。前記基材は、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）を含んでなってもよい。

１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーの実質的発現が欠如した細胞を含んでなってもよい医薬組成物。前記１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーは、ＯＣＴ－４、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ－１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、および／またはＴＲＡ－１－８０を含んでなってもよい。

前記ＲＰＥ細胞は、１つまたは複数のＲＰＥ細胞マーカーの発現について陽性であってもよい。前記１つまたは複数のＲＰＥ細胞マーカーは、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ベストロフィン、ＭＩＴＦ、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、ＺＯ－１、および／またはチロシナーゼを含んでなってもよい。

前記ＲＰＥ細胞は、前記平均メラニン含有量を得るのに十分な時間にわたり、ＲＰＥ細胞を静止細胞として維持するステップを含んでなる方法によって、生成されてもよい。前記ＲＰＥ細胞は、前記ＲＰＥ細胞の少なくとも５０％中におけるベストロフィン発現を確立するのに十分な時間にわたり、ＲＰＥ細胞を静止細胞として維持するステップを含んでなる方法によって、生成されてもよい。

前記医薬組成物は、マウス胚性支持細胞（ＭＥＦ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を実質的に含まなくてもよい。

前記ＲＰＥは、例えばαインテグリンサブユニット１、αインテグリンサブユニット２、αインテグリンサブユニット３、αインテグリンサブユニット４、αインテグリンサブユニット５、αインテグリンサブユニット６、またはαインテグリンサブユニット９などのαインテグリンサブユニットの１つまたは複数の発現を増大させる条件下で、前記ＲＰＥ細胞を培養するステップを含んでなる方法によって生成されてもよい。前記条件は、マンガンへの曝露、抗ＣＤ２９抗体への曝露、モノクローナル抗体ＨＵＴＳ－２１への曝露、ノクローナル抗体ｍＡｂＴＳ２／１６への曝露、および／または前記ＲＰＥ細胞の少なくとも約４代の継代を含んでなってもよい。

ＲＰＥ細胞は、表５に列挙される基準の少なくとも１つを満たし、および／または優良製造規範（ＧＭＰ）に従って製造される。

医薬組成物は、前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与されてもよい、少なくとも１つの免疫抑制または免疫寛容化剤をさらに含んでなってもよい。前記免疫抑制または免疫寛容化剤は、間葉幹細胞、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、バシリキシマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、ダクリズマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、リツキシマブ（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｍｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）の１つまたは複数を含んでなっ
てもよい。

一態様では、本開示は、上述したような医薬組成物と、前記複数のＲＰＥ細胞を所望の標的濃度に希釈するのに十分な容積の薬学的に許容可能な希釈剤を含んでなる別の容器とを含んでなる、キットを提供する。前記薬学的に許容可能な希釈剤の容積は、前記薬学的に許容可能な希釈剤の全容積を前記複数のＲＰＥ細胞の全体と組み合わせると、前記所望の標的濃度を有する前記複数のＲＰＥ細胞をもたらすような容積であってもよい。前記薬学的に許容可能な希釈剤の温度は、約０～１０℃、任意選択的に約２～８℃であってもよい。前記複数のＲＰＥ細胞、または前記複数のＲＰＥ細胞を含有する薬学的に許容できる担体の温度は、約０～１０℃、任意選択的に約２～８℃であってもよい。

キットは、前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与されてもよい、少なくとも１つの免疫抑制または免疫寛容化剤をさらに含んでなってもよく、該免疫抑制または免疫寛容化剤としては、上に列挙したものの１つまたは複数が挙げられる。

キットは、前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与されてもよい、上に列挙した血管新生阻害剤の１つまたは複数などの、１つまたは複数の血管新生阻害剤をさらに含んでなってもよい。

一態様では、本開示は、解凍に引き続いて回収されてもよいＲＰＥ細胞が、少なくとも約６０％の播種効率を有するような平均成熟レベルを凍結時点で有する、複数の冷凍保存網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含んでなる冷凍保存組成物を提供する。前記播種効率は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％であってもよい。前記平均的成熟度レベルは、前記複数の冷凍保存ＲＰＥ細胞に典型的である細胞集団の平均メラニン含有量を測定することで判定されてもよい。前記複数の冷凍保存ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、８ｐｇ／細胞未満であってもよい。

一態様では、本開示は、複数の冷凍保存網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含んでなる冷凍保存組成物を提供し、前記複数の冷凍保存ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、８ｐｇ／細胞未満であってもよい。

前記細胞は、冷凍保存媒体中に含有されてもよい。前記冷凍保存媒体は、例えば約５％～約５０％のＤＭＳＯと約３０％～約９５％の血清のような、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、エチレングリコール、グリセロール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール（ＭＰＤ）、プロピレングリコール、およびスクロースの１つまたは複数を含んでなってもよく、前記血清は、任意選択的にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）であってもよい。前記冷凍保存培地は、約９０％のＦＢＳおよび約１０％のＤＭＳＯを含んでなってもよい。

解凍に引き続いて回収されたＲＰＥ細胞は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％などの少なくとも約６０％の播種効率を有してもよい。

前記冷凍保存組成物は、凍結時点で約２００，０００～約１０，０００，０００、約２０，０００～約５０，０００，０００、約２５０，０００～約５，０００，０００、約５００，０００～約４，０００，０００、または約１，０００，０００～約４，０００，０００個の生ＲＰＥ細胞などの、凍結時点で約５，０００～約１×１０^８個の生ＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。

解凍に引き続いて回収されたＲＰＥ細胞は、凍結の少なくとも約３、６、９、または１２ヶ月後の時点で、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の播種効率を有してもよい。

解凍時に生存能力がある細胞の少なくとも８５％は、解凍後、２～８℃で最高１時間、最高２時間、最高３時間、最高４時間、最高５時間、または最高６時間の保存時に、生存能力を維持してもよい。

冷凍保存組成物は、約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％未満のＲＰＥ細胞でない細胞を含んでなってもよい。

一実施形態では、前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、１０ｐｇ／細胞未満であってもよい。一実施形態では、前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、９ｐｇ／細胞未満であってもよい。一実施形態では、前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、８ｐｇ／細胞未満であってもよい。一実施形態では、前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、７ｐｇ／細胞未満であってもよい。一実施形態では、前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、６ｐｇ／細胞未満であってもよい。一実施形態では、前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量は、５ｐｇ／細胞未満であってもよい。

前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％は、ベストロフィン＋であってもよい。前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＰＡＸ６＋および／またはＭＩＴＦ＋であってもよい。前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＰＡＸ６＋および／またはベストロフィン＋であってもよい。前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＺＯ－１＋であってもよい。冷凍保存組成物中の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％の細胞は、ＰＡＸ６＋およびベストロフィン＋であってもよい。前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも９５％、または少なくとも９９％はＰＡＸ６＋であってもよい。

冷凍保存組成物中では、任意選択的に前記冷凍保存組成物中の１００万個の細胞あたり約１個以下の細胞、および任意選択的に９００万個の細胞あたり２個以下の細胞が、ＯＣＴ－４およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現の双方について陽性であってもよい。

冷凍保存組成物は、前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与されてもよい、上に列挙した血管新生阻害剤の１つまたは複数などの少なくとも１つの血管新生阻害剤をさらに含んでなってもよい。

前記ＲＰＥ細胞は、遺伝子改変されていてもよい。前記ＲＰＥ細胞は、多能性細胞から生成されてもよい。前記ＲＰＥ細胞は、遺伝子改変されていてもよい多能性細胞から生成されてもよい。前記遺伝子操作は、前記ＲＰＥ細胞による、血管新生を阻害する１つまたは複数の因子の産生をもたらす。血管新生を阻害する前記１つまたは複数の因子は、例えばＲＰＥ６５プロモーター、カテプシンＤ近位プロモーター、およびＶＭＤ２プロモーターなどのＲＰＥ特異的プロモーターによって調節される、フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；特異的抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗ＶＥＧＦ受容体抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片またはドメイン；ＶＥＧＦ断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの因子を含む。

前記多能性幹細胞は、ＯＣＴ－４、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、および／またはＴＲＡ－１－８０を含んでなる、１つまたは複数のマーカーの発現について陽性であってもよい。

前記多能性細胞は、前記培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な時間にわたり、多層集団または胚様体中で培養されてもよい、ヒト多能性細胞であってもよい。

前記培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な前記時間は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、または少なくとも約７週間、少なくとも約８週間を含んでなってもよい。

一態様では、本開示は、（ａ）ＲＰＥ細胞を付着条件下で培養して、敷石状形態を有する色素性ＲＰＥ細胞の実質的に単層の培養を形成するステップと；および（ｂ）冷凍保存または製剤処方のために、培養からＲＰＥ細胞を収穫するステップとを含んでなる、医薬品中で使用するための網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法を提供し、収穫時点で、収穫された色素性ＲＰＥ細胞の集団は、８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を有する。

少なくとも１０^６個のＲＰＥ細胞が、冷凍保存または製剤処方のために収穫されてもよい。前記ＲＰＥ細胞は多能性幹細胞から生成されてもよく、前記多能性幹細胞は、任意選択的にヒト胚性幹細胞またはヒトｉＰＳ細胞であってもよい。

平均メラニン含有量は、色素が最も濃い５パーセントと色素が最も薄い５パーセントの収穫されたＲＰＥ細胞を除外した、細胞集団について判定してもよい。前記平均メラニン含有量は、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、および少なくとも０．１ｐｇ／細胞、および任意選択的に少なくとも０．５ｐｇ／細胞または１ｐｇ／細胞；０．１～８ｐｇ／細胞、０．１～７ｐｇ／細胞，０．１～６ｐｇ／細胞，０．１～５ｐｇ／細胞、０．１～４ｐｇ／細胞、０．１～３ｐｇ／細胞、０．１～２ｐｇ／細胞、０．１～１ｐｇ／細胞、１～７ｐｇ／細胞、０．５～６ｐｇ－細胞、または１～５ｐｇ／細胞であってもよい。

一態様では、本開示は、（ａ）ＲＰＥ細胞を付着条件下で培養して、敷石状形態を有する色素性ＲＰＥ細胞の実質的に単層の培養を形成するステップと；（ｂ）ＲＰＥ細胞が８ｐｇ／細胞を超える平均メラニン含有量に達する前の時点で、ＲＰＥ細胞を少なくとも１代継代するステップと；および（ｃ）任意選択的に、１代または複数の継代後、冷凍保存
または製剤処方のためにＲＰＥ細胞を収穫するステップとを含んでなる、医薬品中で使用するための網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法を提供し、前記ＲＰＥ細胞は収穫時点で８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を有する。

一態様では、本開示は、（ａ）任意選択的にヒト胚性幹細胞またはヒトｉＰＳ細胞であってもよい多能性幹細胞を培養して胚様体（ＥＢ）を形成する、または多能性幹細胞を培養して多層集団を形成するステップと；（ｂ）細胞質中に分散する褐色色素を含んでなってもよい色素性細胞の出現に十分な時間にわたって、多層細胞集団またはＥＢを培養するステップと；および（ｃ）（ｂ）の色素性細胞を単離して培養し、の平均色素レベルを有するＲＰＥ細胞を含有する培養集団を生成するステップとを含んでなる、膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法を提供する。ステップ（ｂ）は、前記胚様体を培養して付着培養を形成するステップを含んでなってもよい。ステップ（ａ）は、多能性細胞の培養を過成長させ、それによって多層集団を形成するステップを含んでなってもよい。ステップ（ａ）は、前記多能性細胞を低付着性基質上で培養し、または前記多能性細胞を懸滴法を利用して培養し、それによって前記多能性細胞から胚様体を形成するステップを含んでなってもよい。前記多能性幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成人幹細胞、造血幹細胞、胎児幹細胞、間葉幹細胞、分娩後幹細胞、多分化能幹細胞、または胚性胚芽細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、遺伝子改変されていてもよい。前記遺伝子操作は、前記ＲＰＥ細胞による、上で同定されたものなどの血管新生を阻害する因子の産生をもたらす。ステップ（ａ）で胚様体がその中で形成されてもよい培地、および／またはステップ（ｃ）で色素性細胞がその中で培養されてもよい培地は、ＤＭＥＭを含んでなってもよい。胚様体がステップ（ａ）で形成されてもよく、および／または色素性細胞がステップ（ｃ）で培養されてもよく、ＥＢ－ＤＭを含んでなり、それから本質的になり、またはそれからなってもよい。ステップ（ｃ）で、前記色素性細胞がその中で培養されてもよい培地は、ＥＢ－ＤＭを含んでなってもよい。前記色素性上皮細胞がステップ（ｃ）で培養されてもよく、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭを含んでなり、それから本質的になり、またはそれからなってもよい。ステップ（ｂ）の培養期間は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、または８週間、または少なくとも約１、２、３、４、５、または６ヶ月であってもよい。ステップ（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）で使用される培地は、ＥＢ－ＤＭ、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ、ＭＤＢＫ－ＧＭ、ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ、ＶＰ－ＳＦＭ、ＥＧＭ－２、またはＭＤＢＫ－ＭＭであってもよい。ステップ（ｃ）は、培養をトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、パパイン、コラゲナーゼとディスパーゼの混合物、およびコラゲナーゼとトリプシンの混合物からなる群から選択される酵素に接触させるステップを含んでなってもよく、または培養を機械的に破壊しまたは単離するステップを含んでなってもよく、または培養をＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに接触させるステップを含んでなってもよく、それによって前記色素性細胞の培養基質への付着を妨害する。多能性幹細胞は、低下したＨＬＡ抗原複雑度を有する。ＲＰＥ細胞は、１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーの実質的発現を欠いてもよい。前記１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーは、Ｏｃｔ－４、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ－１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＤＰＰＡ－２、および／またはＤＰＰＡ－４であってもよい。

例えば増殖物が成長できるようにするために、胚様体をそれらの形成に引き続いて、付着培養物として培養してもよい。ＲＰＥ細胞は、少なくとも１つのＲＰＥ細胞マーカーについて陽性であってもよい。前記少なくとも１つのＲＰＥ細胞マーカーは、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ベストロフィン、ＭＩＴＦ、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６，またはチロシナーゼの１つまたは複数、または任意選択的にＰＡＸ６およびベストロフィンを含む。

方法は、例えば上述したように、αインテグリンサブユニット発現を増大させる条件下
で、前記ＲＰＥ細胞を培養するステップをさらに含んでなってもよい。

前記ＥＢは、Ｙ－２７６３２などの（ｗｕｃｈａｓ）ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で形成されもよい。前記ＲＰＥ形成に先だって、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）上で、前記多能性細胞を培養してもよい。

一態様では、本開示は、８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を含有して、移植後少なくとも約１ヶ月間にわたりそれらの表現型を維持する、培養中で少なくとも約１ヶ月間にわたりそれらの表現型を維持する、移植後に宿主に組み込まれる、移植後に実質的に増殖しない、食作用性（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｔｉｃ）であってもよい、ビタミンＡを送達して代謝しまたは貯蔵する、移植後に網膜と脈絡膜の間で鉄を輸送する、移植後にブルッフ膜に付着する、移植後に迷光を吸収する、αインテグリンサブユニット発現の上昇を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより大きな平均テロメア長を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて培養中でより長い複製寿命を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて１つまたは複数のαインテグリンサブユニットのより大きな発現を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより低いＡ２Ｅ含有量を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより低いリポフスチン含有量を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより少ない紫外線損傷蓄積を示す、または提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより多数の食胞を含有する特性の少なくとも１つを有してもよい、網膜劣化の治療に適するＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品を提供する。一態様では、本開示は、８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を含有してもよく、移植後にブルッフ膜に付着する、移植後に迷光を吸収する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより大きな平均テロメア長を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて培養中でより長い複製寿命を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより低いＡ２Ｅ含有量を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより低いリポフスチン含有量を有する、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより少ない紫外線損傷蓄積を示す、または提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べてより多数の食胞を含有する特性の少なくとも１つを有してもよい、網膜劣化の治療に適するＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品を提供する。

一態様では、本開示は、組成物またはキットのＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品、上述した方法に従って製造された医薬品を、それを必要とする対象の眼に、前記網膜変性病状を治療するのに効果的な量で投与するステップを含んでなる、網膜変性病状を治療する方法を提供する。

網膜変性病状は、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（乾燥型または湿潤型）、網膜離脱、色素性網膜炎、シュタルガルト病、色素線条、または近視性黄斑変性を含んでなってもよい。前記投与するステップは、それを必要とする眼に、前記ＲＰＥ細胞を眼内投与するステップを含んでなってもよい。前記眼内投与は、前記ＲＰＥ細胞を網膜下空隙に注入するステップを含んでなってもよい。前記眼内投与は、任意選択的に等張溶液および／または食塩溶液である水溶液を網膜下腔内に注入し、それによって事前ブレブを形成するステップと、前記水溶液と同一の網膜下腔に前記ＲＰＥ細胞を投与する前に、前記水溶液を除去するステップとを含んでなってもよい。前記注入は、針または注入カニューレを通じてもよい。前記針または注入カニューレ径は、約０．３ｍｍから０．９ｍｍまたは約０．５～約０．６ｍｍであってもよい。前記針または注入カニューレは、約０．０９ｍｍ～約０．１５ｍｍの径を有する先端を含んでなってもよい。前記カニューレは、ＭＥＤＯＮＥＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２５／３８ｇ（０．１２ｍｍ（３８ｇ）×５ｍｍ先端付き０．５０ｍｍ（２５ｇ）×２８ｍｍカニューレ）であってもよい
。治療の有効性は、細隙灯生体顕微鏡写真、眼底撮影、ＩＶＦＡ、およびＳＤ－ＯＣＴ、および最良矯正視力（ＢＣＶＡ）の１つまたは複数の視力結果を判定することで、評価してもよい。方法は、矯正視力（ＢＣＶＡ）を改善し、および／または糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）視力表における可読文字数を増大させもよい。網膜変性の病状は、乾燥型ＡＭＤまたはシュタルガルト病であってもよい。

前記網膜変性病状を治療するのに有効な量は、約２０，０００～２００，０００個のＲＰＥ細胞、約２０，０００～５００，０００個のＲＰＥ細胞、約２０，０００～２，０００，０００個のＲＰＥ細胞、または少なくとも約２０，０００個のＲＰＥ細胞、または少なくとも約２０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、２００，０００、または５００，０００個のＲＰＥ細胞であってもよい。

前記対象は、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロンなどの前記ＲＰＥ細胞の前記投与に先だって、またはそれと同時に、コルチコステロイドを投与されなくてもよい。前記対象は、前記ＲＰＥ細胞の前記投与に先だって、または前記ＲＰＥ細胞の前記投与と同時に、少なくとも３、６、１２、２４、４８、７２、または９６時間以内に、コルチコステロイドを投与されなくてもよい。前記対象は、前記ＲＰＥ細胞の前記投与に先だって、または前記ＲＰＥ細胞の前記投与の直前またはそれと同時に、少なくとも１時間以内に、コルチコステロイドを投与されなくてもよい。前記対象は、前記ＲＰＥ細胞の前記投与に引き続いて、少なくとも１２、２４、４８、７２、または９６時間以内に、コルチコステロイドを投与されなくてもよい。前記対象は、前記ＲＰＥ細胞の前記投与に引き続いて、少なくとも４８時間以内に、コルチコステロイドを投与されなくてもよい。

前記ＲＰＥ細胞は、血管新生阻害剤、抗酸化剤、抗酸化剤補助因子、抗酸化活性の増大に寄与するその他の因子、黄斑キサントフィル、長鎖ω－３脂肪酸、アミロイド阻害剤、ＣＮＴＦ作動薬、ＲＰＥ６５の阻害剤、Ａ２Ｅおよび／またはリポフスチン蓄積を標的とする因子、光受容体機能および／または代謝の下方制御剤または阻害剤、α２－アドレナリン作受容体作動薬、選択的セロトニン１Ａ作動薬、Ｃ－５を標的にする因子、膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ－９）および任意選択のその他のドルーゼン成分、免疫抑制剤、およびリポフスチン蓄積を予防または治療する薬剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤と組み合わせて患者に投与されてもよい。

前記１つまたは複数の薬剤は、前記ＲＰＥ細胞製剤と同時に、それに先だって、および／またはそれに引き続いて、前記患者に投与してもよい。

前記組成物、キット、または医薬品は、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、乾燥型加齢黄斑変性、湿潤型加齢黄斑変性、網膜離脱、色素性網膜炎、シュタルガルト病、色素線条、または近視性黄斑変性などの網膜変性病状を治療するための薬剤の製造で使用してもよい。

前記多能性幹細胞は、ＯＣＴ－４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、およびＴＲＡ－１－８０からなる群から選択される、１つまたは複数のマーカーを発現する。

前記ＲＰＥ細胞は、その他の起源から得られるＲＰＥ細胞の複製寿命と比べて、長くてもよい複製寿命；ｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞（またはｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞集団の平均）のテロメア長の少なくとも３０パーセント、またはｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞のテロメア長の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０または９０パーセントであってもよい平均テロメア長；４ｋｂより長く、または５、６
、７、８、９、１０、１１、１２または１３ｋｂより長く、または１０ｋｂ以上であってもよい平均最終制限酵素断片長（ＴＲＦ）；成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均リポフスチン含有量の５０パーセント未満であり、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均リポフスチン含有量の４０、３０、２０または１０パーセント未満であってもよい、平均リポフスチン含有量；成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の平均Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）含有量の５０パーセント未満であってもよく、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均Ａ２Ｅ含有量の４０、３０、２０または１０パーセント未満であってもよい、平均Ａ２Ｅ含有量；１０^５（１００，０００）個の細胞あたり５０ｎｇ未満であってもよい、平均Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）含有量；成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の視細胞外節（ＰＯＳ）の食作用速度と比べて少なくとも５０パーセント大きくてもよく、または成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞のＰＯＳの食作用速度と比べて少なくとも７５、１００、１５０または２００パーセント大きくてもよい、ＰＯＳの食作用速度；２４時間後のＰＯＳ総濃度の少なくとも２０パーセントであり、または２４時間後のＰＯＳ総濃度の少なくとも２５、３０、２５、４０または５０パーセントであってもよい、視細胞外節（ＰＯＳ）の食作用速度；成人宿主から単離されたＲＰＥ細胞と比較して、低下している酸化的ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷の蓄積レベル；成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の平均プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）活性よりも少なくとも５０パーセント大きくてもよく、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）活性よりも少なくとも６０、７０、８０、９０または１００パーセント大きくてもよい、平均プロテアソーム活性；成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞のユビキチン抱合体の平均蓄積の５０パーセント未満であってもよく、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞のユビキチン抱合体の平均蓄積の４０、３０、２０または１０パーセント未満であってもよい、ユビキチン抱合体の平均蓄積の特性の１つまたは複数を示す。

図１。ｈＥＳＣＭＡ０９から作成されたＲＰＥの特性解析である。Ａ：胚様体の分化培養中で形成されたＲＰＥの色素斑を示す６ウェルプレート。Ｂ～Ｈ：解凍および調合されたＲＰＥ中の分子マーカーの評価。ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６（Ｃ～Ｄ）は、新鮮に調合された細胞とベストロフィン／ＰＡＸ６の一晩培養物中で評価し、ＺＯ－１免疫染色は、３週齢培養物で実施した。Ｂ：中程度の色素形成が確立されている、コンフルエントな敷石状単層を示す、調合後３週齢ＲＰＥのＨＭＣ顕微鏡写真。Ｃ：マージさせたＭＩＴＦ／ＰＡＸ６（ＭＩＴＦは原本では赤色、ＰＡＸ６は原本では緑色）、Ｄ：ＭＩＴＦ／ＰＡＸ６に対応するＤＡＰＩ；Ｅ：マージさせたベストロフィン／ＰＡＸ６、Ｆ：対応するＤＡＰＩ；Ｇ：ＺＯ－１、Ｈ：対応するＤＡＰＩ。Ｃ～Ｈ中のほぼ１００％の細胞が、マーカー評価について陽性であることに留意されたい。倍率、×４００（Ｂ～Ｈ）。Ｉ～ｑ：基準ＲＰＥロット（各グループの左パネル、原本では青色）と比較した、解凍された医療用ＲＰＥ（各グループの右パネル、原本では緑色）中における、ＲＰＥマーカーの上方制御およびｈＥＳＣマーカーの下方制御を示すＰＣＲ。示される遺伝子は（左から右の順で）、ベストロフィン、Ｐａｘ－６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ－６５、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ－４、およびＳＯＸ－２である。Ｊ：３７℃および４℃（対照）における、ｈＥＳ－ＲＰＥによるＰｈＲｏｄｏ生体粒子の食作用を示すＦＡＣＳ。未処置細胞（原本では黒線；一番左の曲線）および４℃対照細胞（原本では赤線；未処置細胞曲線の右にわずかに上昇する曲線の左部分および未処置細胞曲線の右部分と重なる曲線の右部分）、および３７℃処理細胞（原本では青線；一番右の曲線）が示される。Ｋ：医療用ＲＰＥロットの正常な女性（４６ＸＸ）核型。図１。ｈＥＳＣＭＡ０９から作成されたＲＰＥの特性解析である。Ａ：胚様体の分化培養中で形成されたＲＰＥの色素斑を示す６ウェルプレート。Ｂ～Ｈ：解凍および調合されたＲＰＥ中の分子マーカーの評価。ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６（Ｃ～Ｄ）は、新鮮に調合された細胞とベストロフィン／ＰＡＸ６の一晩培養物中で評価し、ＺＯ－１免疫染色は、３週齢培養物で実施した。Ｂ：中程度の色素形成が確立されている、コンフルエントな敷石状単層を示す、調合後３週齢ＲＰＥのＨＭＣ顕微鏡写真。Ｃ：マージさせたＭＩＴＦ／ＰＡＸ６（ＭＩＴＦは原本では赤色、ＰＡＸ６は原本では緑色）、Ｄ：ＭＩＴＦ／ＰＡＸ６に対応するＤＡＰＩ；Ｅ：マージさせたベストロフィン／ＰＡＸ６、Ｆ：対応するＤＡＰＩ；Ｇ：ＺＯ－１、Ｈ：対応するＤＡＰＩ。Ｃ～Ｈ中のほぼ１００％の細胞が、マーカー評価について陽性であることに留意されたい。倍率、×４００（Ｂ～Ｈ）。Ｉ～ｑ：基準ＲＰＥロット（各グループの左パネル、原本では青色）と比較した、解凍された医療用ＲＰＥ（各グループの右パネル、原本では緑色）中における、ＲＰＥマーカーの上方制御およびｈＥＳＣマーカーの下方制御を示すＰＣＲ。示される遺伝子は（左から右の順で）、ベストロフィン、Ｐａｘ－６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ－６５、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ－４、およびＳＯＸ－２である。Ｊ：３７℃および４℃（対照）における、ｈＥＳ－ＲＰＥによるＰｈＲｏｄｏ生体粒子の食作用を示すＦＡＣＳ。未処置細胞（原本では黒線；一番左の曲線）および４℃対照細胞（原本では赤線；未処置細胞曲線の右にわずかに上昇する曲線の左部分および未処置細胞曲線の右部分と重なる曲線の右部分）、および３７℃処理細胞（原本では青線；一番右の曲線）が示される。Ｋ：医療用ＲＰＥロットの正常な女性（４６ＸＸ）核型。図１。ｈＥＳＣＭＡ０９から作成されたＲＰＥの特性解析である。Ａ：胚様体の分化培養中で形成されたＲＰＥの色素斑を示す６ウェルプレート。Ｂ～Ｈ：解凍および調合されたＲＰＥ中の分子マーカーの評価。ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６（Ｃ～Ｄ）は、新鮮に調合された細胞とベストロフィン／ＰＡＸ６の一晩培養物中で評価し、ＺＯ－１免疫染色は、３週齢培養物で実施した。Ｂ：中程度の色素形成が確立されている、コンフルエントな敷石状単層を示す、調合後３週齢ＲＰＥのＨＭＣ顕微鏡写真。Ｃ：マージさせたＭＩＴＦ／ＰＡＸ６（ＭＩＴＦは原本では赤色、ＰＡＸ６は原本では緑色）、Ｄ：ＭＩＴＦ／ＰＡＸ６に対応するＤＡＰＩ；Ｅ：マージさせたベストロフィン／ＰＡＸ６、Ｆ：対応するＤＡＰＩ；Ｇ：ＺＯ－１、Ｈ：対応するＤＡＰＩ。Ｃ～Ｈ中のほぼ１００％の細胞が、マーカー評価について陽性であることに留意されたい。倍率、×４００（Ｂ～Ｈ）。Ｉ～ｑ：基準ＲＰＥロット（各グループの左パネル、原本では青色）と比較した、解凍された医療用ＲＰＥ（各グループの右パネル、原本では緑色）中における、ＲＰＥマーカーの上方制御およびｈＥＳＣマーカーの下方制御を示すＰＣＲ。示される遺伝子は（左から右の順で）、ベストロフィン、Ｐａｘ－６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ－６５、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ－４、およびＳＯＸ－２である。Ｊ：３７℃および４℃（対照）における、ｈＥＳ－ＲＰＥによるＰｈＲｏｄｏ生体粒子の食作用を示すＦＡＣＳ。未処置細胞（原本では黒線；一番左の曲線）および４℃対照細胞（原本では赤線；未処置細胞曲線の右にわずかに上昇する曲線の左部分および未処置細胞曲線の右部分と重なる曲線の右部分）、および３７℃処理細胞（原本では青線；一番右の曲線）が示される。Ｋ：医療用ＲＰＥロットの正常な女性（４６ＸＸ）核型。図１。ｈＥＳＣＭＡ０９から作成されたＲＰＥの特性解析である。Ａ：胚様体の分化培養中で形成されたＲＰＥの色素斑を示す６ウェルプレート。Ｂ～Ｈ：解凍および調合されたＲＰＥ中の分子マーカーの評価。ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６（Ｃ～Ｄ）は、新鮮に調合された細胞とベストロフィン／ＰＡＸ６の一晩培養物中で評価し、ＺＯ－１免疫染色は、３週齢培養物で実施した。Ｂ：中程度の色素形成が確立されている、コンフルエントな敷石状単層を示す、調合後３週齢ＲＰＥのＨＭＣ顕微鏡写真。Ｃ：マージさせたＭＩＴＦ／ＰＡＸ６（ＭＩＴＦは原本では赤色、ＰＡＸ６は原本では緑色）、Ｄ：ＭＩＴＦ／ＰＡＸ６に対応するＤＡＰＩ；Ｅ：マージさせたベストロフィン／ＰＡＸ６、Ｆ：対応するＤＡＰＩ；Ｇ：ＺＯ－１、Ｈ：対応するＤＡＰＩ。Ｃ～Ｈ中のほぼ１００％の細胞が、マーカー評価について陽性であることに留意されたい。倍率、×４００（Ｂ～Ｈ）。Ｉ～ｑ：基準ＲＰＥロット（各グループの左パネル、原本では青色）と比較した、解凍された医療用ＲＰＥ（各グループの右パネル、原本では緑色）中における、ＲＰＥマーカーの上方制御およびｈＥＳＣマーカーの下方制御を示すＰＣＲ。示される遺伝子は（左から右の順で）、ベストロフィン、Ｐａｘ－６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ－６５、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ－４、およびＳＯＸ－２である。Ｊ：３７℃および４℃（対照）における、ｈＥＳ－ＲＰＥによるＰｈＲｏｄｏ生体粒子の食作用を示すＦＡＣＳ。未処置細胞（原本では黒線；一番左の曲線）および４℃対照細胞（原本では赤線；未処置細胞曲線の右にわずかに上昇する曲線の左部分および未処置細胞曲線の右部分と重なる曲線の右部分）、および３７℃処理細胞（原本では青線；一番右の曲線）が示される。Ｋ：医療用ＲＰＥロットの正常な女性（４６ＸＸ）核型。図１。ｈＥＳＣＭＡ０９から作成されたＲＰＥの特性解析である。Ａ：胚様体の分化培養中で形成されたＲＰＥの色素斑を示す６ウェルプレート。Ｂ～Ｈ：解凍および調合されたＲＰＥ中の分子マーカーの評価。ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６（Ｃ～Ｄ）は、新鮮に調合された細胞とベストロフィン／ＰＡＸ６の一晩培養物中で評価し、ＺＯ－１免疫染色は、３週齢培養物で実施した。Ｂ：中程度の色素形成が確立されている、コンフルエントな敷石状単層を示す、調合後３週齢ＲＰＥのＨＭＣ顕微鏡写真。Ｃ：マージさせたＭＩＴＦ／ＰＡＸ６（ＭＩＴＦは原本では赤色、ＰＡＸ６は原本では緑色）、Ｄ：ＭＩＴＦ／ＰＡＸ６に対応するＤＡＰＩ；Ｅ：マージさせたベストロフィン／ＰＡＸ６、Ｆ：対応するＤＡＰＩ；Ｇ：ＺＯ－１、Ｈ：対応するＤＡＰＩ。Ｃ～Ｈ中のほぼ１００％の細胞が、マーカー評価について陽性であることに留意されたい。倍率、×４００（Ｂ～Ｈ）。Ｉ～ｑ：基準ＲＰＥロット（各グループの左パネル、原本では青色）と比較した、解凍された医療用ＲＰＥ（各グループの右パネル、原本では緑色）中における、ＲＰＥマーカーの上方制御およびｈＥＳＣマーカーの下方制御を示すＰＣＲ。示される遺伝子は（左から右の順で）、ベストロフィン、Ｐａｘ－６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ－６５、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ－４、およびＳＯＸ－２である。Ｊ：３７℃および４℃（対照）における、ｈＥＳ－ＲＰＥによるＰｈＲｏｄｏ生体粒子の食作用を示すＦＡＣＳ。未処置細胞（原本では黒線；一番左の曲線）および４℃対照細胞（原本では赤線；未処置細胞曲線の右にわずかに上昇する曲線の左部分および未処置細胞曲線の右部分と重なる曲線の右部分）、および３７℃処理細胞（原本では青線；一番右の曲線）が示される。Ｋ：医療用ＲＰＥロットの正常な女性（４６ＸＸ）核型。図１。ｈＥＳＣＭＡ０９から作成されたＲＰＥの特性解析である。Ａ：胚様体の分化培養中で形成されたＲＰＥの色素斑を示す６ウェルプレート。Ｂ～Ｈ：解凍および調合されたＲＰＥ中の分子マーカーの評価。ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６（Ｃ～Ｄ）は、新鮮に調合された細胞とベストロフィン／ＰＡＸ６の一晩培養物中で評価し、ＺＯ－１免疫染色は、３週齢培養物で実施した。Ｂ：中程度の色素形成が確立されている、コンフルエントな敷石状単層を示す、調合後３週齢ＲＰＥのＨＭＣ顕微鏡写真。Ｃ：マージさせたＭＩＴＦ／ＰＡＸ６（ＭＩＴＦは原本では赤色、ＰＡＸ６は原本では緑色）、Ｄ：ＭＩＴＦ／ＰＡＸ６に対応するＤＡＰＩ；Ｅ：マージさせたベストロフィン／ＰＡＸ６、Ｆ：対応するＤＡＰＩ；Ｇ：ＺＯ－１、Ｈ：対応するＤＡＰＩ。Ｃ～Ｈ中のほぼ１００％の細胞が、マーカー評価について陽性であることに留意されたい。倍率、×４００（Ｂ～Ｈ）。Ｉ～ｑ：基準ＲＰＥロット（各グループの左パネル、原本では青色）と比較した、解凍された医療用ＲＰＥ（各グループの右パネル、原本では緑色）中における、ＲＰＥマーカーの上方制御およびｈＥＳＣマーカーの下方制御を示すＰＣＲ。示される遺伝子は（左から右の順で）、ベストロフィン、Ｐａｘ－６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ－６５、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ－４、およびＳＯＸ－２である。Ｊ：３７℃および４℃（対照）における、ｈＥＳ－ＲＰＥによるＰｈＲｏｄｏ生体粒子の食作用を示すＦＡＣＳ。未処置細胞（原本では黒線；一番左の曲線）および４℃対照細胞（原本では赤線；未処置細胞曲線の右にわずかに上昇する曲線の左部分および未処置細胞曲線の右部分と重なる曲線の右部分）、および３７℃処理細胞（原本では青線；一番右の曲線）が示される。Ｋ：医療用ＲＰＥロットの正常な女性（４６ＸＸ）核型。図１。ｈＥＳＣＭＡ０９から作成されたＲＰＥの特性解析である。Ａ：胚様体の分化培養中で形成されたＲＰＥの色素斑を示す６ウェルプレート。Ｂ～Ｈ：解凍および調合されたＲＰＥ中の分子マーカーの評価。ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６（Ｃ～Ｄ）は、新鮮に調合された細胞とベストロフィン／ＰＡＸ６の一晩培養物中で評価し、ＺＯ－１免疫染色は、３週齢培養物で実施した。Ｂ：中程度の色素形成が確立されている、コンフルエントな敷石状単層を示す、調合後３週齢ＲＰＥのＨＭＣ顕微鏡写真。Ｃ：マージさせたＭＩＴＦ／ＰＡＸ６（ＭＩＴＦは原本では赤色、ＰＡＸ６は原本では緑色）、Ｄ：ＭＩＴＦ／ＰＡＸ６に対応するＤＡＰＩ；Ｅ：マージさせたベストロフィン／ＰＡＸ６、Ｆ：対応するＤＡＰＩ；Ｇ：ＺＯ－１、Ｈ：対応するＤＡＰＩ。Ｃ～Ｈ中のほぼ１００％の細胞が、マーカー評価について陽性であることに留意されたい。倍率、×４００（Ｂ～Ｈ）。Ｉ～ｑ：基準ＲＰＥロット（各グループの左パネル、原本では青色）と比較した、解凍された医療用ＲＰＥ（各グループの右パネル、原本では緑色）中における、ＲＰＥマーカーの上方制御およびｈＥＳＣマーカーの下方制御を示すＰＣＲ。示される遺伝子は（左から右の順で）、ベストロフィン、Ｐａｘ－６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ－６５、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ－４、およびＳＯＸ－２である。Ｊ：３７℃および４℃（対照）における、ｈＥＳ－ＲＰＥによるＰｈＲｏｄｏ生体粒子の食作用を示すＦＡＣＳ。未処置細胞（原本では黒線；一番左の曲線）および４℃対照細胞（原本では赤線；未処置細胞曲線の右にわずかに上昇する曲線の左部分および未処置細胞曲線の右部分と重なる曲線の右部分）、および３７℃処理細胞（原本では青線；一番右の曲線）が示される。Ｋ：医療用ＲＰＥロットの正常な女性（４６ＸＸ）核型。図２。ｈＥＳＣ－ＭＡ０９から作成されたＲＰＥの９ヶ月後の生存とＮＩＨＩＩＩマウス眼への組み込みである。抗ヒトミトコンドリア染色された切片（Ａ、原本では赤色）および抗ヒトベストロフィン染色された切片（Ｂ、原本では緑色）。同一細胞（Ｃ：マージさせたＡおよびＢ）中のヒトミトコンドリアおよびベストロフィン染色の正確な共局在、およびマウスＲＰＥ（Ｆ：マージさせたＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ）中の染色の不在に留意されたい。明視野画像（Ｅ）上の囲みを「Ｄ」で拡大して、ヒトＲＰＥの形態を示す。倍率２００×（Ａ～Ｃ、Ｅ、Ｆ）、Ｄはさらに×４．５拡大した。図２。ｈＥＳＣ－ＭＡ０９から作成されたＲＰＥの９ヶ月後の生存とＮＩＨＩＩＩマウス眼への組み込みである。抗ヒトミトコンドリア染色された切片（Ａ、原本では赤色）および抗ヒトベストロフィン染色された切片（Ｂ、原本では緑色）。同一細胞（Ｃ：マージさせたＡおよびＢ）中のヒトミトコンドリアおよびベストロフィン染色の正確な共局在、およびマウスＲＰＥ（Ｆ：マージさせたＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ）中の染色の不在に留意されたい。明視野画像（Ｅ）上の囲みを「Ｄ」で拡大して、ヒトＲＰＥの形態を示す。倍率２００×（Ａ～Ｃ、Ｅ、Ｆ）、Ｄはさらに×４．５拡大した。図３。色素形成程度が異なるＲＰＥの付着および成長における差異である。顕微鏡写真は、色素がより薄い（Ａ～Ｃ）およびより濃い（Ｄ～Ｆ）ロットの付着および挙動を示す。Ｇは、より濃いロット（各グループの左パネル）およびより薄いロット（各グループの右パネル）のＲＰＥの成長速度を図示し、播種後連続３日間のウェルあたり細胞総数を示す。ＡおよびＤは、播種後２１時間の全細胞数を示し、ＢおよびＥは、浮遊細胞除去後のＡおよびＤと同一培養物を示し、ＣおよびＦは、播種後３日目の同一培養物を示す。解凍後２１時間目に、色素がより薄いロット（Ａ、Ｂ、Ｇ）では、細胞の大部分が付着する一方、より濃いロットでは、わずかな細胞のみが付着して（Ｄ、Ｅ、Ｇ矢印）、大部分の細胞は浮遊していることに留意されたい。培養後３日目には、色素がより薄いロット（Ｃ）では細胞数がより多く、コンフルエントな単層が確立された一方、より濃いロットでは、依然としてコンフルエント以下であった。倍率、×２００。図３。色素形成程度が異なるＲＰＥの付着および成長における差異である。顕微鏡写真は、色素がより薄い（Ａ～Ｃ）およびより濃い（Ｄ～Ｆ）ロットの付着および挙動を示す。Ｇは、より濃いロット（各グループの左パネル）およびより薄いロット（各グループの右パネル）のＲＰＥの成長速度を図示し、播種後連続３日間のウェルあたり細胞総数を示す。ＡおよびＤは、播種後２１時間の全細胞数を示し、ＢおよびＥは、浮遊細胞除去後のＡおよびＤと同一培養物を示し、ＣおよびＦは、播種後３日目の同一培養物を示す。解凍後２１時間目に、色素がより薄いロット（Ａ、Ｂ、Ｇ）では、細胞の大部分が付着する一方、より濃いロットでは、わずかな細胞のみが付着して（Ｄ、Ｅ、Ｇ矢印）、大部分の細胞は浮遊していることに留意されたい。培養後３日目には、色素がより薄いロット（Ｃ）では細胞数がより多く、コンフルエントな単層が確立された一方、より濃いロットでは、依然としてコンフルエント以下であった。倍率、×２００。図３。色素形成程度が異なるＲＰＥの付着および成長における差異である。顕微鏡写真は、色素がより薄い（Ａ～Ｃ）およびより濃い（Ｄ～Ｆ）ロットの付着および挙動を示す。Ｇは、より濃いロット（各グループの左パネル）およびより薄いロット（各グループの右パネル）のＲＰＥの成長速度を図示し、播種後連続３日間のウェルあたり細胞総数を示す。ＡおよびＤは、播種後２１時間の全細胞数を示し、ＢおよびＥは、浮遊細胞除去後のＡおよびＤと同一培養物を示し、ＣおよびＦは、播種後３日目の同一培養物を示す。解凍後２１時間目に、色素がより薄いロット（Ａ、Ｂ、Ｇ）では、細胞の大部分が付着する一方、より濃いロットでは、わずかな細胞のみが付着して（Ｄ、Ｅ、Ｇ矢印）、大部分の細胞は浮遊していることに留意されたい。培養後３日目には、色素がより薄いロット（Ｃ）では細胞数がより多く、コンフルエントな単層が確立された一方、より濃いロットでは、依然としてコンフルエント以下であった。倍率、×２００。図３。色素形成程度が異なるＲＰＥの付着および成長における差異である。顕微鏡写真は、色素がより薄い（Ａ～Ｃ）およびより濃い（Ｄ～Ｆ）ロットの付着および挙動を示す。Ｇは、より濃いロット（各グループの左パネル）およびより薄いロット（各グループの右パネル）のＲＰＥの成長速度を図示し、播種後連続３日間のウェルあたり細胞総数を示す。ＡおよびＤは、播種後２１時間の全細胞数を示し、ＢおよびＥは、浮遊細胞除去後のＡおよびＤと同一培養物を示し、ＣおよびＦは、播種後３日目の同一培養物を示す。解凍後２１時間目に、色素がより薄いロット（Ａ、Ｂ、Ｇ）では、細胞の大部分が付着する一方、より濃いロットでは、わずかな細胞のみが付着して（Ｄ、Ｅ、Ｇ矢印）、大部分の細胞は浮遊していることに留意されたい。培養後３日目には、色素がより薄いロット（Ｃ）では細胞数がより多く、コンフルエントな単層が確立された一方、より濃いロットでは、依然としてコンフルエント以下であった。倍率、×２００。ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ移植部位の画像である。術前術後のＳＭＤ患者の左網膜黄斑のカラー眼底写真（Ａ～Ｃ）。矩形の内側領域は、外科的移植部位と、外科的注入に含まれなかった対応する黄斑萎縮との境界を二分する。Ａ：広汎性のＲＰＥおよび神経感覚黄斑萎縮がある、ベースライン黄斑のカラー画像。Ｂ：ｈＥＳＣ－ＲＰＥ移植後１週間目の黄斑のカラー画像。ベースラインＲＰＥ萎縮領域で最も明白である、軽度の色素形成に留意されたい。この色素形成は、６週目に増大した（Ｃ）。パネルＤおよびＥは、スペクトル領域眼球干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）および重ね合せモノクロ写真（ＨｉｅｄｅｌｂｅｒｇＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を示す。パネルＥに示される断面図は、パネルＤで矢印によって示される横線（原本では鮮緑色）に相当する。パネルＥの破線の円（原本では赤色）は、損傷された生得のＲＰＥ層上に沈降または付着するｈＥＳＣ－ＲＰＥ細胞のように見えるものを強調する。ＡＭＤ患者のフルオレセイン血管造影画像である。異なる時間間隔において、漏出の形跡は認められない。Ａ：ベースライン初期、Ｂ：ベースライン後期、Ｃ：４週間初期、Ｄ：４週間後期、Ｅ：８週間初期、Ｆ：８週間後期。（選択された画像は、移植領域を表すために下方に偏心されている）。シュタルガルト患者のフルオレセイン血管造影画像である。異なる時間間隔において、漏出の形跡は認められない。Ａ：ベースライン初期、Ｂ：ベースライン後期、Ｃ：４週間初期、Ｄ：４週間後期、Ｅ：８週間初期、Ｆ：８週間後期。（選択された画像は、移植領域を表すために下方に偏心されている）。異なる時間間隔における、シュタルガルト患者のＯＣＴ画像である。異なる時間間隔における画像のいずれでも、浮腫または網膜下流体の形跡は認められなかった。（ＯＣＴは、選択された移植領域に相当する）。パネルＡ：ベースライン、Ｂ：１週間、Ｃ：４週間、Ｄ：８週間。ＡＭＤ患者の細隙灯画像である。パネルＡおよびＢ：術後１週間。前部炎症や角膜浮腫の形跡は認められない。シュタルガルト患者の細隙灯画像である。パネルＡおよびＢ：術後１週間。前部炎症や角膜浮腫の形跡は認められない。ＡＭＤ患者で実施されたゴールドマン視野試験である。パネルＡ：ベースライン、パネルＢ：６週間。わずかにより小さい中心暗点が観察される。シュタルガルト患者で実施されたゴールドマン視野検査である。パネルＡ：ベースライン、パネルＢ：６週間．暗点の最小の減少が観察された。異なる培地を使用して生成された、２ロットのＲＰＥ細胞に対する食作用アッセイ結果である。ＲＰＥは、ＭＤＢＫ培地（パネルＡ）、またはＥＢ－ＤＭおよびＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ（パネルＢ）のいずれかを使用して生成された。結果は、蛍光性生体粒子なしで培養された細胞（「未処置」）、４℃で蛍光性生体粒子と共に培養された陰性対照細胞（「４℃」）、３７℃で蛍光性生体粒子と共に培養された細胞（「３７℃」）のＦＡＣＳ分析からのヒストグラムとして提示する。図１３。シュタルガルト黄斑ジストロフィー患者のｈＥＳＣ－ＲＰＥ移植部位の画像である。患者の左網膜黄斑の術前術後のカラー眼底写真（Ａ～Ｃ）。矩形の内側領域は、外科的移植部位と、外科的注入に含まれなかった対応する黄斑萎縮との境界を二分する。（Ａ）広汎性のＲＰＥおよび神経感覚黄斑萎縮がある、ベースライン黄斑のカラー画像。（Ｂ）ｈＥＳＣ－ＲＰＥ移植後１週間目の黄斑のカラー画像。ベースラインＲＰＥ萎縮領域で最も明白である、軽度の色素形成に留意されたい。この色素形成は、６週目に増大した（Ｃ）。（Ｄ～Ｇ）ベースライン（Ｄ）および移植の３ヶ月後（Ｆ）のカラー眼底写真およびＳＤ－ＯＣＴ画像。カラー画像は、ベースラインから３ヶ月目までの、増大するＲＰＥレベルの色素形成を示す。重ね合わせＳＤ－ＯＣＴ画像（Ｅ、Ｇ）は、色素形成の増大が、ＲＰＥのレベルであること、正常な単層ＲＰＥ生着、および生得のＲＰＥを欠いている露出ブルッフ膜に隣接する領域における３ヶ月目の生存（矢印）を示す。ｈＥＳＣ＝ヒト胚性幹細胞。ＲＰＥ＝網膜色素上皮。ＳＤ－ＯＣＴ＝スペクトル領域眼球干渉断層撮影。図１３。シュタルガルト黄斑ジストロフィー患者のｈＥＳＣ－ＲＰＥ移植部位の画像である。患者の左網膜黄斑の術前術後のカラー眼底写真（Ａ～Ｃ）。矩形の内側領域は、外科的移植部位と、外科的注入に含まれなかった対応する黄斑萎縮との境界を二分する。（Ａ）広汎性のＲＰＥおよび神経感覚黄斑萎縮がある、ベースライン黄斑のカラー画像。（Ｂ）ｈＥＳＣ－ＲＰＥ移植後１週間目の黄斑のカラー画像。ベースラインＲＰＥ萎縮領域で最も明白である、軽度の色素形成に留意されたい。この色素形成は、６週目に増大した（Ｃ）。（Ｄ～Ｇ）ベースライン（Ｄ）および移植の３ヶ月後（Ｆ）のカラー眼底写真およびＳＤ－ＯＣＴ画像。カラー画像は、ベースラインから３ヶ月目までの、増大するＲＰＥレベルの色素形成を示す。重ね合わせＳＤ－ＯＣＴ画像（Ｅ、Ｇ）は、色素形成の増大が、ＲＰＥのレベルであること、正常な単層ＲＰＥ生着、および生得のＲＰＥを欠いている露出ブルッフ膜に隣接する領域における３ヶ月目の生存（矢印）を示す。ｈＥＳＣ＝ヒト胚性幹細胞。ＲＰＥ＝網膜色素上皮。ＳＤ－ＯＣＴ＝スペクトル領域眼球干渉断層撮影。シュタルガルト黄斑ジストロフィー患者の未処置眼（「他眼」）、およびＳＭＤ患者のＲＰＥ細胞注入施行眼（「手術眼」）における、ｈＥＳＣ－ＲＰＥ移植後の視力変化の表形式の概要である。手術眼が、ＥＴＤＲＳおよびＢＣＶＡによって検出可能な改善を示したのに対し、未処置眼では視力変化は検出されなかった。ｈＥＳＣ＝ヒト胚性幹細胞。ＲＰＥ＝網膜色素上皮。ＢＣＶＡ＝最良矯正視力。ＥＴＤＲＳ＝糖尿病網膜症の早期治療研究視力表。ｈＥＳＣ供給源に由来する５０，０００個のＲＰＥ細胞でそれぞれ治療された、２人の追加的なシュタルガルト患者の網膜、視神経円板、網膜黄斑、および後極を含む２枚の眼底写真を示す。各写真は、注入部位、およびＲＰＥ細胞含有溶液の注入時にできるブレブの領域を示す。図１６および１７（２人の異なる追加的なＳＭＤ患者、各患者について指示された時点（すなわちベースライン、１ヶ月、および２または３ヶ月）で撮影された、３枚の眼底写真をそれぞれ示し、色素性ＲＰＥ細胞の増大する斑を有する注入ブレブ内領域の確立を示し、新しいＲＰＥ層による網膜領域の生着と表面再構成が示される。図１６および１７（２人の異なる追加的なＳＭＤ患者、各患者について指示された時点（すなわちベースライン、１ヶ月、および２または３ヶ月）で撮影された、３枚の眼底写真をそれぞれ示し、色素性ＲＰＥ細胞の増大する斑を有する注入ブレブ内領域の確立を示し、新しいＲＰＥ層による網膜領域の生着と表面再構成が示される。図１６および図１７の上部パネルに示される患者の治療された（「注入施行」）眼と、治療されない（「注入未施行」）眼の評価された視力を示す。垂直軸は、糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳスコアを示し、水平軸は、術後日数を示す。可視光顕微鏡写真（ｍｉｇｒｏｇｒａｐｈｓ）は、胚破壊なしに作成されたｈＥＳＣから生成された、ＲＰＥ培養物の予測された色素形成および形態を図示する。上部３枚のパネル（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、３つの異なるヒトｉＰＳ（ｈｉＰＳ）細胞系から生成されたＲＰＥを示す。下部の３枚のパネル（Ｄ、Ｅ、Ｆ）は、生検された割球から作成されたｈＥＳ細胞（細胞系はＤ３０４６９およびＮＥＤ７と命名される）から生成されたＲＰＥを示し、残りの胚は生存能力を維持して冷凍保存された。図４において、より初期の時点で示された、同一ＳＭＤ患者における長期ＲＰＥ生着である。（Ａ）ベースラインおよび（Ｂ）ＲＰＥ注入の１年後に撮影された眼底写真は、色素性細胞の存在を示し、注入後少なくとも１年間持続するＲＰＥ細胞の長期生着を示唆する。治療から最高１年間の時点までのＡＭＤ患者の周辺ＥＴＤＲＳ／ＢＣＶＡスコアである。治療から最高１年間の時点までのＳＭＤ患者の中心ＥＴＤＲＳ／ＢＣＶＡスコアである。

本開示は、乾燥型ＡＭＤおよびシュタルガルト病患者における、これらのｈＥＳＣ由来ＲＰＥの安全性と耐容性を探索した前向き臨床試験における、２人の患者について最初の結果を記載する。ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞は、この報告の時点で、拒絶または腫瘍原性の徴候を示さなかった。視覚測定は、双方の患者における改善を示唆する。これらの結果は、ｈＥＳＣが、一連の網膜変性疾患を効果的に治療するためのＲＰＥの潜在的に安全で無尽蔵の供給元としての役割を果たし得ることを示唆する。

また有利な特性を有するｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団を生成する方法についても、記載される。遺伝子および色素発現の程度をはじめとする分化経路を制御することで、注入後の細胞の生存、付着、および成長が有意に向上することが実証された。具体的には、ここで提示されるデータは、ＲＰＥの成熟および色素形成の程度が、生体外における細胞の引き続く付着と成長に劇的に影響することを示す。これらの結果は、一次細胞の使用と比較して、治療用のｈＥＳＣから分化した細胞を使用して得られてもよい利点を例証する。これらの結果は、潜在的に免疫原性（２０、２１）が低下している健康な「幼若」細胞を無限に生成するのに加えて、生体外分化段階を細胞および分子レベルで制御して、患者への移植前に、安全性、同一性、純度、および効力を確実にし得ることを示す。

我々は２つの前向き臨床試験を開始して、先進国における失明の主要原因であるシュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＳＭＤ）および乾燥型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）がある患者における、ｈＥＳＣ由来網膜色素上皮（ＲＰＥ）の網膜下移植の安全性および耐容性を判定した。視力、フルオレセイン血管造影、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、および視野検査をはじめとする術前術後の眼科検査は、各治験の最初の患者について行った。

制御されたｈＥＳＣ分化は、ほぼ１００％純粋なＲＰＥ集団をもたらした。外科手術直後に、双方の患者の移植部位で色素沈着過剰を見ることができ、細胞が生得のＲＰＥ層に付着して組み込まれたことの引き続く証拠があった。炎症または過剰増殖の徴候は、観察されなかった。視力測定は、最初の２か月間に改善の兆しを示した。２週間目には、ＡＭＤ患者の治験眼では、最良矯正視力（ＢＣＶＡ）が処置前の２０／５００から２０／２００に改善され、糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）視力表における改善（２０／２００～２０／３２０）、および文字数の増大が継続した。ＳＭＤ患者は、同一期間中に手動弁から指数弁まで改善し；１および２ヶ月間で、ＢＣＶＡは２０／８００に改善した。ＲＰＥ移植前、患者はＥＴＤＲＳチャート上のいかなる文字も読み取れなかったが、２週間目には文字を読み取り始めて、それは研究期間中に改善し続けた（１および２ヶ月間で５文字）。

ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞は、この報告の時点で、拒絶または腫瘍原性の徴候を示さなかった。視覚測定は、双方の患者における改善を実証する。

定義
本明細書に記載される本発明の完全な理解のために、以下の詳細な説明を記載する。本発明の様々な実施形態が詳細に説明され、提供される実施例によってさらに例証されることもある。

特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似したまたは同等の方法および材料を、本発明でまたは本発明の試験で使用し得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。材料、方法、および実施例は例証のみを意図し、限定的であることは意図されない。本明細書では、以下の用語および定義が提供される。

本明細書の説明、およびそれに続く特許請求の範囲全体にわたる用法では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は、文脈上例外が明記されていない限り複数への言及を含む。本明細書の説明で使用されるように、文脈上例外が明記されていない限り、「ｉｎ」の意味は、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。

本明細書全体を通じて「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」と言う語または「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、記述される整数または整数群の包含を暗示するが、あらゆるその他の整数または整数群の排除は、意味しないものとする。

「有効量」は、本明細書の用法では、疾患を治療するために患者に投与されると、このような疾患の治療をもたらすのに十分な化合物または細胞の量を広義に指す。有効量は、予防法に有効な量、および／または予防のために有効な量であってもよい。有効量は、低下させるのに有効な量、徴候／症状発生を防止し、徴候／症状発生の重症度を低下させ、徴候／症状発生を排除し、徴候／症状発生の進行を遅延させ、徴候／症状発生の進行を阻止し、および／または徴候／症状発生の予防法をもたらすのに有効な量であってもよい。「有効量」は、疾患およびその重症度、そして治療される患者の年齢、体重、病歴、易罹患性、および既存の病状に応じて変動してもよい。「有効量」という用語は、本開示の目的では「治療有効量」と同義である。

「胚」または「胚性」は、本明細書の用法では、母親宿主の子宮膜内に着床していない発生中の細胞集団を広義に指す。「胎芽細胞」は、胚から単離され、またはその中に含有
される細胞である。これは、二細胞期に早くも得られた割球、および凝集割球もまた含む。

「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）は、本明細書の用法では、細胞系として連続的に継代されている胚盤胞または桑実胚の内部細胞集団に由来する細胞を広義に指す。ＥＳ細胞は、精子またはＤＮＡによる卵細胞の受精、核移植、単為生殖から、またはＨＬＡ領域のホモ接合性があるＥＳ細胞を作成する手段によって、誘導されてもよい。ＥＳ細胞はまた、精子と卵細胞の融合によって生じる、接合子、割球、または胚盤胞段階の哺乳類胚；核移植；単為発生；またはクロマチンの再プログラミングと引き続く細胞作成のための再プログラムクロマチンの原形質膜への組み込みに由来する細胞に、言及してもよい。胚性幹細胞は、それらの起源またはそれらを作成するために使用される特定の方法にかかわりなく、（ｉ）細胞を３つの全胚芽層に分化させる能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ－４およびアルカリホスファターゼの発現、および（ｉｉｉ）免疫不全動物に移植すると奇形腫を生じる能力に基づいて同定し得る。本用語はまた、好ましくは残りの胚を破壊せずに、胚の１つまたは複数の割球から単離される細胞も含む（例えば、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書に援用する、Ｃｈｕｎｇｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．２００８Ｆｅｂ７；２（２）：１１３－７；米国特許第２００６０２０６９５３号明細書（付与前公表）；米国特許第２００８／００５７０４１号明細書（付与前公表）を参照されたい）。この用語はまた、非胚細胞がプロセスで使用される場合であっても、体細胞核移植によって生成される細胞を含む。ＥＳ細胞は、精子またはＤＮＡによる卵細胞の受精、核移植、単為生殖から、またはＨＬＡ領域のホモ接合性があるＥＳ細胞を作成する手段によって、誘導されてもよい。ＥＳ細胞はまた、精子と卵細胞の融合によって生じる、接合子、割球、または胚盤胞段階の哺乳類胚；核移植；単為発生；またはクロマチンの再プログラミングと引き続く細胞作成のための再プログラムされたクロマチンの原形質膜への組み込みに由来する細胞である。本開示のヒト胚性幹細胞としては、ＭＡ０１、ＭＡ０９、ＡＣＴ－４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４、およびＡＣＴ３０胚性幹細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、ＲＰＥ細胞を作成するのに使用されるヒトＥＳ細胞は、ＧＭＰ基準に従って誘導され維持される。

「胚由来細胞」（ＥＤＣ）は、本明細書の用法では、桑実胚由来細胞、内部細胞集団のものを含む胚盤胞由来細胞、胎盾、またはエピブラスト、または原始内胚葉、外胚葉、および中胚葉をはじめとする初期胚のその他の多能性幹細胞、およびそれらの誘導体を広義に指す。「ＥＤＣ」はまた、割球、および発生の様々な段階における、凝集単一割球または胚からの細胞集団も含むが、細胞系として継代されているヒト胚性幹細胞は除外される。

「黄斑変性」は、本明細書の用法では、ブルッフ膜、神経網膜、および膜色素上皮の異常と関連付けられている、中心視野の進行性喪失によって特徴付けられる疾患を広義に指す。黄斑変性疾患としては、年齢関連黄斑変性、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底ジストロフィー、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、マラチアレベンティニーズ、ドイン蜂巣状脈絡膜症、優性ドルーゼン、および放射状ドルーゼンが挙げられるが、これに限定されるものではない。

「多能性幹細胞」は、本明細書の用法では、それらの未分化状態を保ちながら長期のまたは実質的に無期限の生体外増殖ができ、安定した（好ましくは正常な）核型を示して、適切な条件下において３つの全胚芽層（すなわち外胚葉、中胚葉、および内胚葉）に分化する能力を有する、細胞を広義に指す。

「多能性胚性幹細胞」は、本明細書の用法では、（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植すると奇形腫を誘発でき；（ｂ）３つの全胚芽層（例えば外胚葉、中胚葉、および内
胚葉細胞型）の細胞型に分化でき；（ｃ）少なくとも１つの分子胚性幹細胞マーカーを発現する（例えばＯｃｔ－４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３表面抗原、ＳＳＥＡ
４表面抗原、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１を発現する）細胞を広義に指す。追加的な例として、多能性細胞は、ＯＣＴ－４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、および／またはＴＲＡ－１－８０を発現してもよい。例示的な多能性幹細胞は、例えば当該技術分野で公知の方法を使用して、作成し得る。例示的な多能性幹細胞としては、胚盤胞段階胚のＩＣＭに由来する胚性幹細胞、ならびに卵割段階または桑実胚段階胚の１つまたは複数の割球に由来する胚性幹細胞が挙げられる（任意選択的に残りの胚の破壊なしで）。このような胚性幹細胞は、受精によって、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為発生、および雄性発生をはじめとする無性生殖手段によって生じた、胚性材料から作成し得る。さらなる例示的な多能性幹細胞としては、（本明細書で再プログラミング因子と称される）因子の組み合わせを発現させることで、または発現を誘導することで、体細胞を再プログラミングして作成される、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、胎児、出生後、新生児、幼若、または成人体細胞を使用して作成し得る。特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするのに使用し得る因子としては、例えばＯｃｔ４（時にＯｃｔ３／４と称される）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするのに使用し得る因子としては、例えばＯｃｔ－４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、少なくとも２つの再プログラミング因子、少なくとも３つの再プログラミング因子、または４つの再プログラミング因子を発現させることで、体細胞を再プログラムする。別の実施形態では、追加的な再プログラミング因子が同定され、単独で、または１つまたは複数の既知の再プログラミング因子との組み合わせで使用して、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムする。ｉＰＳ細胞は、典型的に、胚性幹細胞と同じマーカーの発現によって同定され得るが、特定のｉＰＳ細胞系は、その発現プロファイルが変動することもある。

「ＲＰＥ細胞」、「分化ＲＰＥ細胞」、「ＥＳ由来ＲＰＥ細胞」、およびは、本明細書の用法では、全体を通じて同義的に使用されて、例えば本明細書で開示される方法を使用して、多能性幹細胞から分化させたＲＰＥ細胞を広義に指してもよい。用語は包括的に使用されて、細胞成熟度のレベルにかかわりなく分化ＲＰＥ細胞に言及し、したがって様々な成熟度レベルのＲＰＥ細胞を包含してもよい。ＲＰＥ細胞は、それらの敷石状形態と初期の色素出現によって、視覚的に認識され得る。ＲＰＥ細胞はまた、Ｏｃｔ－４およびＮＡＮＯＧなどの胚性幹細胞マーカー発現の実質的欠如に基づいて、ならびにＲＰＥ６５、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ、およびベストロフィンなどのＲＰＥマーカー発現に基づいて、分子的に同定し得る。例えば細胞は、例えばＰＡＸ６の核内局在化、ベストロフィンの多角形パターンの原形質膜内局在化（細胞周辺の明確な線でベストロフィン染色の局在化を示す）、多角形パターンで細胞の輪郭を描く密着結合中に存在するＺＯ－１染色、および核限定で検出されるＭＩＴＦ染色などの予測された染色パターンが観察されれば、所与のマーカーについて陽性と見なしてもよい。特に断りのない限り、本明細書の用法では、ＲＰＥ細胞は、多能性幹細胞から生体外分化したＲＰＥ細胞を指す。

「成熟ＲＰＥ細胞」および「成熟分化ＲＰＥ細胞」は、本明細書の用法では、全体を通じて同義的に使用して、ＲＰＥ細胞の初期分化に続いて生じる変化を広義に指してもよい。具体的には、ＲＰＥ細胞は、色素の初期出現に基づいてある程度認識され得るが、分化後は、成熟ＲＰＥ細胞は、高度な色素形成に基づいて認識され得る。

「播種効率」は、本明細書の用法では、解凍に際して生存能力を維持して培養基質に付着し得る、回収された細胞画分に言及する。例えば播種効率は、細胞を解凍、洗浄、および（好ましくはゼラチン上に）播種し；総細胞数を播種前に測定し、生細胞数を播種後に
測定することで判定し得て、次に生存能力があり播種後に基質に付着する、播種前の全細胞の画分として、播種効率を計算し得る。より具体的な例として、播種効率は、細胞を３７℃の水浴内で、絶え間なく撹拌しながら（１～２分間または細胞が解凍するのに十分な時間など）解凍し、それに続いてリン酸緩衝食塩水（または別の適切な洗浄液）で細胞を３回洗浄し、（血球計などを使用して）生細胞および非生細胞を含めた総細胞数を測定し、細胞を（ＲＰＥ－ＧＭなどの）成長培地添加ゼラチン上に播種して、細胞を（好ましくは３７℃で）培養し、細胞をゼラチンに約２４時間付着させ、次に生細胞計数を測定する（例えば血球計を使用して、トリパンブルー排除が生存度の測定に使用される）ことで判定され；次に播種後に、生細胞数を播種前の総細胞数で除算して、播種効率を判定する。

「色素」は、本明細書の用法では、例えばＲＰＥ細胞がＥＳ細胞から分化する際に、初期に起きる（ｉｎｉｔｉａｌｏｃｃｕｒｓ）色素形成などのあらゆるレベルの色素形成を広義に指す。色素形成は、分化ＲＰＥ細胞の細胞密度と成熟度によって変動することもある。ＲＰＥ細胞の色素形成は、ＲＰＥ細胞の最終分化後に、平均的ＲＰＥ細胞と同一であってもよい。ＲＰＥ細胞の色素形成は、ＲＰＥ細胞の最終分化後に、平均的ＲＰＥ細胞より多量であってもよい。ＲＰＥ細胞の色素形成は、最終分化後に、平均的ＲＰＥ細胞より少量であってもよい。

疾患の「徴候」は、本明細書の用法では、患者の検査で発見できる疾患を示すあらゆる異常；疾患の主観的指標である症状とは対照的な疾患の客観的指標を広義に指す。

疾患の「症状」は、本明細書の用法では、患者によって経験されて、疾患を示唆する、あらゆる病的現象、または構造、機能、または知覚における正常からの逸脱を広義に指す。

「治療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」、「治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書の用法では、疾患またはその臨床症状退縮を引き起こす、疾患の治療、疾患またはその臨床症状の進行抑止または低減、および／または疾患の緩和を広義に指す。治療法は、疾患の予防法、予防、治療、治癒、矯正、低減、緩和、および／または疾患、徴候、および／または症状の緩和の提供を包含する。治療法は、進行中の疾患徴候および／または症状（例えば失明、網膜悪化）がある患者における、徴候および／または症状の緩和を包含する。治療法はまた、「予防法」および「予防」も包含する。予防法は、患者における疾患の治療に引き続いて、疾患が現れるのを予防すること、または患者における疾患発生率または重症度を低減することを含む。「軽減された」という用語は、治療法の目的で、臨床的に顕著な（ｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）徴候および／または症状の低減を広義に指す。治療法は、再発または再発性徴候および／または症状（例えば網膜変性、視力喪失）を治療することを含む。治療法は、常に、徴候および／または症状の出現を阻止すること、ならびに既存の徴候および／または症状を低減すること、および既存の徴候および／または症状を排除することを包含するが、これに限定されるものではない。治療法は、慢性疾患の治療（「維持」）および急性疾患の治療を含む。例えば治療は、再発または徴候および／または症状再燃（例えば失明、網膜変性）を治療または予防することを含む。

本明細書で使用される「コルチコステロイド」という用語は、天然および人工コルチコステロイド、類似体などをはじめとするグルココルチコイド受容体に結合するステロイドホルモンのクラスを指す。例示的なコルチコステロイドとしては、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、（フルチカソンプロピオネート（ＦＰ）をはじめとする）フルチカソン、ブデソニド、シクレソニド、モメタゾン
、およびフルニソリドが挙げられるが、これに限定されるものではない。

ＲＰＥ細胞製剤および併用療法
本開示は、ＲＰＥ細胞、実質的に精製されたＲＰＥ細胞集団、ＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品、およびＲＰＥ細胞の冷凍保存製剤をはじめとする、ＲＰＥ細胞製剤を提供する。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、その天然環境で見られる、少なくとも１つのタンパク質、分子、またはその他の不純物を実質的に含まなくてもよい（例えば「単離されている」）。ＲＰＥ細胞は、ヒトＲＰＥ細胞をはじめとする哺乳類細胞であってもよい。本開示はまた、ヒトＲＰＥ細胞、実質的に精製されたヒトＲＰＥ細胞集団、ヒトＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品、およびヒトＲＰＥ細胞の冷凍保存製剤も提供する。製剤は、ヒト胚性幹細胞由来ＲＰＥ細胞を含んでなる製剤、ヒトｉＰＳ細胞由来ＲＰＥ細胞、および分化したＥＳ由来ＲＰＥ細胞を含んでなる（非ＲＰＥ細胞に関して）実質的に精製された製剤であってもよい。

製剤のＲＰＥ細胞は、その他の起源から得られるＲＰＥ細胞（例えば、胎児、乳児、小児、青年または成人組織などの提供されたヒト組織に由来する培養物）の複製寿命と比べて、より長い複製寿命を有してもよい。複製寿命は、複製の老化前に、培養中の集団倍加数を測定することで評価してもよい。例えば製剤のＲＰＥ細胞は、提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ集団よりと比べて、少なくとも１０パーセント長く、好ましくは提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ集団と比べて、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００パーセントまたはそれ以上長い複製寿命を有してもよい。

製剤のＲＰＥ細胞は、ｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞のテロメア長（またはｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞集団の平均）の少なくとも３０パーセントの平均テロメア長、好ましくはｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞のテロメア長（またはｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞集団の平均）の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０または９０パーセントにさえ至るテロメア長を有してもよい。例えば前記ｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞（または前記ｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞集団）は、それから前記ＲＰＥ細胞が分化した細胞または細胞集団であってもよい。

製剤のＲＰＥは、４ｋｂより長く、好ましくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２より長く、または１３ｋｂにさえ至る、制限酵素末端断片長（ＴＲＦ）を有してもよい。例示的実施形態では、製剤のＲＰＥ細胞は、１０ｋｂ以上のＴＲＦを有してもよい。

製剤のＲＰＥ細胞は、成人（例えば年齢２５～８０才のヒト成人患者、より好ましくは年齢５０～８０才の成人）の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均リポフスチン含有量の５０パーセント未満であり、より好ましくは、成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均リポフスチン含有量の４０、３０、２０または１０パーセント未満である、平均リポフスチン含有量を有してもよい。

製剤のＲＰＥ細胞は、成人（例えば年齢２５～８０才のヒト成人患者、より好ましくは年齢５０～８０才の成人）の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の平均Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）含有量の５０パーセント未満であり、より好ましくは、成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均Ａ２Ｅ含有量の４０、３０、２０または１０パーセント未満である、平均Ａ２Ｅ含有量を有してもよい。

製剤のＲＰＥ細胞は、（Ｓｐａｒｒｏｗｅｔａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１９９９ｖｏｌ．４０ｎｏ．１２，ｐｇ．２９８８－２９９５に記載されるように）統合ピーク強度から判定されてもよい平
均Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）含有量が、１０^５（１００，０００）個の細胞あたり５０ｎｇ未満であり、より好ましくは４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ未満であり、１０^５個の細胞あたり５ｎｇであってもよい。

製剤のＲＰＥ細胞は、成人（すなわち年齢２５～８０才のヒト成人患者、より好ましくは年齢５０～８０才の成人）の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の食作用速度よりも少なくとも５０パーセント大きく、より好ましくは、少なくとも７５、１００、１５０、２００パーセント大きい、視細胞外節（ＰＯＳ）の食作用速度を有してもよい。ＰＯＳ食作用は、例示的かつ非限定的な一例として、Ｂｅｒｇｍａｎｎｅｔａｌ．ＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌＭａｒｃｈ２００４
ｖｏｌ．１８ｐａｇｅｓ５６２－５６４に記載されるプロトコルを使用して、評価され得る。

製剤のＲＰＥ細胞は、２４時間後に、ＰＯＳ総濃度の少なくとも２０パーセントであり、より好ましくは２４時間後に、ＰＯＳ総濃度の少なくとも（ａｔｌｅａｓｔｔｈａｎ）２５、３０、２５、４０であり、または５０パーセントにさえ至る、桿体視細胞外節（ＰＯＳ）の食作用速度を有してもよい。ＰＯＳ食作用は、例示的かつ非限定的な一例として、Ｂｅｒｇｍａｎｎｅｔａｌ．ＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌＭａｒｃｈ２００４ｖｏｌ．１８ｐａｇｅｓ５６２－５６４に記載されるプロトコルを使用して、評価され得る。

ＲＰＥ細胞は、成人宿主から単離されたＲＰＥ細胞と比較して、低下している酸化的ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷の蓄積レベルを示してもよい。

製剤のＲＰＥ細胞は、成人（すなわち年齢２５～８０才のヒト成人患者、より好ましくは年齢５０～８０才の成人）の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の平均プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）活性よりも少なくとも５０パーセント大きく、より好ましくは、成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）活性の少なくとも６０、７０、８０、９０、または１００パーセントである、平均プロテアソーム活性を有してもよい。プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）活性は、例示的かつ非限定的な一例として、キモトリプシン様活性のためのスクシニル－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－アミドメチルクマリン（ＬＬＶＹ－ＡＭＣ）、トリプシン様活性のためのＮ－ｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－アミドメチルクマリン（ＬＳＴＲ－ＡＭＣ）、およびペプチジルグルタミル－ペプチドヒドロラーゼ活性のためのベンジルオキシカルボニル－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－アミドメチルクマリン（ＬＬＥ－ＡＭＣ）を利用して、測定し得る。

製剤のＲＰＥ細胞は、成人（例えば年齢２５～８０才のヒト成人患者、より好ましくは年齢５０～８０才の成人）の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞のユビキチン抱合体の平均蓄積の５０パーセント未満であり、より好ましくは、成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞のユビキチン抱合体の平均蓄積の４０、３０、２０または１０パーセント未満である、ユビキチン抱合体の平均蓄積を有してもよい。ユビキチン抱合体の蓄積は、例示的かつ非限定的な一例として、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．Ａｕｇｕｓｔ
２００８ｖｏｌ．４９ｎｏ．８３６２２－３６３０に記載されるプロトコルを使用して評価し得る。

好ましくは、血管新生関連眼球疾患などの眼球疾患を予防または治療する治療有効量で、ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、１つまたは複数の血管新生阻害剤を投与してもよい。
例示的な眼球疾患としては、黄斑変性（例えば湿潤型ＡＭＤまたは乾燥型ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、および脈絡膜血管新生が挙げられる。例示的な血管新生阻害剤としては、例えばペガプタニブナトリウム、アフリベルセプト、ベバシラニブ、ラパマイシン、ＡＧＮ－７４５、バタラニブ（ｖｉｔａｌａｎｉｂ）、パゾパニブ、ＮＴ－５０２、ＮＴ－５０３、またはＰＬＧ１０１、ＣＰＤ７９１（ＶＥＧＦＲ－２を阻害するジ－Ｆａｂ’ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）抱合体）、抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片（ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））またはラニビズマブ（ルセンティス（登録商標）など）、または抗ＶＥＧＦ受容体抗体（ＩＭＣ－１１２１（Ｂ）（ＶＥＧＦＲ－２に対するモノクローナル抗体）、またはＩＭＣ－１８Ｆ１（ＶＥＧＦＲ－１の細胞外結合領域に対する抗体）など）のような、ペプチド、ペプチド模倣剤、小型分子、化学物質、または核酸などの、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ、例えばＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ１、ＦＬＴ）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ、ＦＬＫ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ３０９）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＰＣＬ））阻害剤などのＶＥＧＦ拮抗薬が挙げられる。追加的な例示的ＶＥＧＦ活性阻害剤としては、ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメインが挙げられ、その一例は、ＶＥＧＦＲ－１のドメイン２およびＶＥＧＦＲ－２のドメイン３と、ＩｇＧ１のＦｃ断片との融合タンパク質である、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（アフリベルセプト）である。別の例示的ＶＥＧＦＲ阻害剤は、ＶＥＧＦ受容体１および２を阻害するＡＺＤ－２１７１（セジラニブ）である。追加的な例示的ＶＥＧＦ拮抗薬としては、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、ＳＵ５４１６（Ｓｅｍａｘｉｎｉｂ）、ＳＵ１１２４８／スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、およびバンデタニブ（ＺＤ６４７４）などの、ＶＥＧＦＲ－１および／またはＶＥＧＦＲ－２を阻害すると報告されているＴＫＩをはじめとする、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が挙げられる。追加的な例示的ＶＥＧＦ拮抗薬としては、ＶＥＧＦＲシグナル伝達（タンパク質キナーゼＣ）に関与する下流キナーゼを標的とすると考えられている、Ｌｙ３１７６１５（エンザスタウリン）が挙げられる。追加的な例示的血管新生阻害剤としては、抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片（ボロシキシマブなど）、ペプチド、ペプチド模倣剤、小分子、３－（２－｛１－アルキル－５－［（ピリジン－２－イルアミノ）－メチル］－ピロリジン－３－イルオキシ｝－アセチルアミノ）－２－（アルキル－アミノ）－プロピオン酸、（Ｓ）－２－［（２，４，６－トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ－３－［７－ベンジルオキシカルボニル－８－（２－ピリジニルアミノメチル）－１－オキサ－２，７－ジアザスピロ－（４，４）－ノン－２－エン－３－イル］カルボニルアミノプロピオン酸、ＥＭＤ４７８７６１、またはＲＣ^＊Ｄ（ＴｈｉｏＰ）Ｃ^＊（Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－チオプロリン－Ｃｙｓ；星印は、システイン残基を通じたジスルフィド結合による環化を意味する）などの化学物質または核酸をはじめとする（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｎｄ）、α５β１インテグリン活性阻害剤が挙げられる。追加的な例示的な血管新生阻害剤としては、２－メトキシエストラジオール、αＶβ３阻害剤、アンギオポエチン２、抗血管新生ステロイドおよびヘパリン、アンギオスタチン、アンギオスタチン－関連分子、抗α５β１インテグリン抗体、抗カテプシンＳ抗体、抗トロンビンＩＩＩ断片、ベバシズマブ、カルレティキュリン、カンスタチン、カルボキシアミドトリアゾール、軟骨由来血管新生阻害因子、ＣＤＡＩ、ＣＭ１０１、ＣＸＣＬ１０、エンドスタチン、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－４、リノミド、マスピン、基材メタロプロテイナーゼ阻害剤、Ｍｅｔｈ－１、Ｍｅｔｈ－２、オステオポンチン、ペガプタニブ、血小板因子－４、プロラクチン、プロリフェリン関連タンパク質、プロトロンビン（クリングルドメイン－２）、ラニビズマブ、レスチン、可溶性ＮＲＰ－１、可溶性ＶＥＧＦＲ－１、ＳＰＡＲＣ、ＳＵ５４１６、スラミン、テコガラン、テトラチオモリブデート、サリドマイド、レナリドミド、トロンボスポンジン、ＴＩＭＰ、ＴＮＰ－４７０、ＴＳＰ－１、ＴＳＰ－２、バソスタチン、ＶＥＧＦＲ拮抗薬、ＶＥＧＩ、ボロシキシマブ（Ｍ２００としてもまた知られている）、フィブロネクチン断片などのアナステリン（ＹｉａｎｄＲｕｏｓｌａｈｔｉ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００１Ｊａｎ１６；９８（２）：６２０－４を参照されたい）またはそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。前記血管新生阻害
剤は、好ましくは、湿潤型ＡＭＤおよびその他の網膜疾患と関連付けられている、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶ）などの増殖性（血管新生）眼疾患を予防または治療するのに十分な量である。追加的な例示的血管新生阻害剤としては、レンバチニブ（Ｅ７０８０）、モテサニブ（ＡＭＧ７０６）、パゾパニブ（ヴォトリエント）、および抗ＩＬ－６抗体などのＩＬ－６拮抗薬が挙げられる。追加的な例示的血管新生阻害剤としては、前述のいずれかの断片、模倣剤、キメラ、融合物、類似体、および／またはドメインが挙げられる。追加的な例示的血管新生阻害剤としては、前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。例示的実施形態では、ＲＰＥ細胞製剤は、例えば眼内注入あたり約１．２５ｍｇおよび約２．５ｍｇのベバシズマブなど、例えば約０．１ｍｇ～約６．０ｍｇのベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体を含んでなる。さらなる例示的な実施形態では、ＲＰＥ細胞製剤は、１つまたは複数のＶＥＧＦ活性阻害剤と、１つまたは複数のα５β１インテグリン活性阻害剤とを含んでなる。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、１つまたは複数の抗炎症剤を投与してもよい。例示的な抗炎症剤としては、グルココルチコイド、非ステロイド性抗炎症薬、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素阻害剤、アルドステロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、コルチコステロイド、コルチゾール、酢酸コルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、酢酸フルドロコルチゾンエステル、フルオシノロンアセトニド（例えばＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標））、グルココルチコイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ステロイド、およびトリアムシノロンが挙げられる。任意選択的に、抗炎症剤は、コルチコステロイドでなくてもよい。例えば抗炎症剤は、非ステロイド性抗炎症剤であってもよい。

さらに患者には、ＲＰＥ細胞製剤の投与前に、それと同時に、および／またはそれに引き続いて、コルチコステロイドが投与されなくてもよい。理論によって限定されることは望まないが、出願人らは、コルチコステロイド投与が、ＲＰＥ細胞沈降および／または生着に干渉するという仮説を立てる。特定の好ましい実施形態では、患者は、ＲＰＥ細胞製剤の投与前に、それと同時に、および／またはそれに引き続いて、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロンで治療されない。より好ましい実施形態では、患者は、ＲＰＥ細胞製剤の投与前に、それと同時に、および／またはそれに引き続いて、プレドニゾロンで治療されない。例えば患者には、ＲＰＥ細胞製剤の投与前、少なくとも３、６、１２、２４、４８、７２、９６、または１２０時間以上内に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロンまたは別のコルチコステロイド（ｃｏｒｔｏｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）が投与されなくてもよい。さらに患者には、ＲＰＥ細胞製剤の投与に引き続いて、少なくとも３、６、１２、２４、４８、７２、９６、または１２０時間以上内に、プレドニゾロンまたはメチルプレドニゾロンまたは別のコルチコステロイド（ｃｏｒｔｏｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）が投与されなくてもよい。

患者には、ＲＰＥ細胞製剤の投与前におよび／またはそれに引き続いて、非コルチコステロイド免疫抑制剤が投与されてもよい。例示的な非コルチコステロイド免疫抑制剤としては、タクロリムス（ＦＫ－５０６マクロライド）およびＭＭＦ（ミコフェノール酸プロドラッグ）が挙げられる。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、１つまたは複数の抗酸化剤、抗酸化剤補助因子、および／または抗酸化剤活性増大に寄与するその他の因子を投与してもよく、その例としては、ＯＴ－５５１（Ｏｔｈｅｒａ）、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロテン、亜鉛（例えば酸化亜鉛）、および／または銅（例えば酸化銅）が挙げられる。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、１つまたは複数の黄斑キサントフィル（ルテインおよび／またはゼアキサンチンなど）を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ））などの１つまたは複数の長鎖ω－３脂肪酸を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、フェンレチニド、Ａｒｃ－１９０５、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（酢酸グラチラマー、Ｔｅｖａ）、ＲＮ６Ｇ（ＰＦ－４３８２９２３、Ｐｆｉｚｅｒ）（ＡＢｅｔａ４０およびＡＢｅｔａ４２に対するヒト化モノクローナル抗体）、ＧＳＫ９３３７７６（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）（抗アミロイド抗体）などの１つまたは複数のアミロイド阻害剤を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、１つまたは複数の毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）作動薬（例えばＮＴ－５０１（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ）などの眼内装置で送達されてもよいＣＮＴＦ）を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、ＡＣＵ－４４２９（Ａｃｕｌｅａ，Ｉｎｃ．）などの１つまたは複数のＲＰＥ６５阻害剤を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、フェンレチニドおよびＡＣＵ－４４２９などの、Ａ２Ｅおよび／またはリポフスチン蓄積を標的とする１つまたは複数の因子を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、フェンレチニドおよびＡＣＵ－４４２９などの、１つまたは複数の光受容体機能および／または代謝下方制御剤または阻害剤を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、酒石酸ブリモニジンなどの１つまたは複数のα２アドレナリン受容体作動薬を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、タンドスピロン（ＡＬ－８３０９Ｂ）などの１つまたは複数の選択的セロトニン１Ａ作動薬を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、Ｃ－５を標的にする１つまたは複数の因子、膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ－９）および／または任意選択のその他のドルーゼン成分を投与してもよく、その例としては、ＡＲＣ１９０５（Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃ）（Ｃ５を選択的に阻害する抗Ｃ５アプタマー）、ＰＯＴ－４（Ｐｏｔｅｎｔｉａ）（Ｃ３を阻害するコンプスタチン誘導体）、補体因子Ｈ、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ、Ａｌｅｘｉｏｎ）（Ｃ５を阻害するヒト化ＩｇＧ抗体）、および／またはＦＣＦＤ４５１４Ｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）（補体因子Ｄに対するモノクローナル抗体）などの、補体因子Ｄ、Ｃ－３、Ｃ－３ａ、Ｃ５、およびＣ５ａ阻害剤、および／または因子Ｈ作動薬が挙げられる。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、シロリムス（ラパマイシン）などの１つまたは複数の免疫抑制剤を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、ピラセタム、セントロフェノキシン、アセチル－Ｌ－カルニチン、イチョウ（Ｇｉｎｋｏｂｉｌｏｂａ）（ＧｉｎｋｏＢｉｌｏｂａ）またはその抽出物または製剤、および／またはＤＭＡＥ（ジメチルエタノールアミン）などの、リポフスチン蓄積を予防または治療する１つまたは複数の薬剤を投与してもよい。

ＲＰＥ細胞製剤と組み合わせて、１つまたは複数の薬剤（血管新生阻害剤、抗酸化剤、抗酸化剤補助因子、抗酸化剤活性増大に寄与するその他の因子、黄斑キサントフィル、長鎖ω－３脂肪酸、アミロイド阻害剤、ＣＮＴＦ作動薬、ＲＰＥ６５阻害剤、Ａ２Ｅおよび／またはリポフスチン蓄積を標的とする因子、光受容体機能および／または代謝の下方制御剤または阻害剤、α２アドレナリン受容体作動薬、選択的セロトニン１Ａ作動薬、Ｃ－５を標的にする因子、膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ－９）および／または任意選択のその他のドルーゼン成分、免疫抑制剤、リポフスチン蓄積を予防または治療する薬剤など）を投与する場合、前記薬剤は、前記ＲＰＥ細胞製剤と同時に、それに先だって、および／またはそれに引き続いて投与してもよい。例えば前記薬剤は、その中で前記ＲＰＥ細胞製剤が前記患者の眼に装入される手順において、患者の眼に投与されてもよい。前記薬剤の投与は、前記ＲＰＥ細胞の患者の眼への投与前に開始して、および／またはその後に継続してもよい。例えば前記薬剤は、溶液、懸濁液中で、徐放形態として、および／または徐放系（例えばＡｌｌｅｒｇａｎＮｏｖａｄｕｒ（商標）送達系、ＮＴ－５０１、または別の眼内装置または徐放系）内で、提供されてもよい。

ＲＰＥ細胞集団は、様々な成熟度レベルの分化ＲＰＥ細胞を含んでもよく、または特定の成熟度レベルの分化ＲＰＥ細胞に関して実質的に純粋であってもよい。ＲＰＥ細胞は、様々な成熟度／色素形成レベルのＲＰＥ細胞を含んでなる、実質的に精製された調製品であってもよい。例えば実質的に精製されたＲＰＥ細胞培養物は、分化ＲＰＥ細胞と成熟分化ＲＰＥ細胞の双方を含有してもよい。成熟ＲＰＥ細胞間で、色素レベルが変動してもよい。しかし成熟ＲＰＥ細胞は、色素形成レベルの増大と、より円柱状である形状に基づいて、ＲＰＥ細胞から視覚的に区別されてもよい。実質的に精製されたＲＰＥ細胞製剤は、異なる成熟度レベルのＲＰＥ細胞（例えば分化ＲＰＥ細胞および成熟分化ＲＰＥ細胞）を含んでなる。このような事例では、色素形成を示唆するマーカーの発現に関して製剤全体にわたり変動があってもよい。細胞培養中のＲＰＥ細胞の色素形成は、均質であってもよい。さらに細胞培養中におけるＲＰＥ細胞の色素形成は、不均一であってもよく、ＲＰＥ細胞培養物は、分化ＲＰＥ細胞と成熟ＲＰＥ細胞の双方を含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞を含んでなる製剤としては、非ＲＰＥ細胞型に関して実質的に純粋であるが、分化ＲＰＥ細胞と成熟分化ＲＰＥ細胞の混合物を含有する製剤が挙げられる。ＲＰＥ細胞を含んでなる製剤としてはまた、非ＲＰＥ細胞型に関して、ならびにその他の成熟度レベルのＲＰＥ細胞に関して、実質的に純粋な製剤が挙げられる。

培養物中の成熟分化ＲＰＥ細胞の百分率は、培養密度を下げることで低下させてもよい。したがって本明細書に記載される方法は、成熟ＲＰＥ細胞の集団を継代培養して、成熟ＲＰＥ細胞のより低い百分率を含有する培養物を生成するステップをさらに含んでなってもよい。製剤中のＲＰＥ細胞数は、成熟度レベルにかかわりなく、および分化ＲＰＥ細胞と成熟分化ＲＰＥ細胞との相対的百分率にかかわりなく、分化ＲＰＥ細胞を含む。製剤中のＲＰＥ細胞数とは、分化ＲＰＥ細胞または成熟ＲＰＥ細胞のいずれかの数を指す。製剤は、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の分化ＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。製剤は、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の成熟ＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞製剤は、分化ＲＰＥ細胞と成熟ＲＰＥ細胞の混合集団を含んでなってもよい。

本開示は、色素性であり、ヒトＲＰＥでない細胞中では発現しない少なくとも１つの遺伝子を発現する、ヒトＲＰＥ細胞を含んでなる、細胞培養物を提供する。例えばこのようなＲＰＥ細胞は、天然ヒトＲＰＥ細胞と実質的に同じＲＰＥ６５、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ、およびベストロフィンの発現を有してもよいが。ＲＰＥ細胞は、ＰＡＸ２、Ｐａｘ６、ＭＩＴＦ、および／またはチロシナーゼの１つまたは複数の発現に関して、成熟度レベ
ル次第で変動してもよい。分化後の色素形成の変化はまた、ＰＡＸ２発現の変化にも相関することに留意されたい。成熟ＲＰＥ細胞は、色素形成レベル、ＰＡＸ２、Ｐａｘ６、および／またはチロシナーゼ発現レベルによって、ＲＰＥ細胞と区別されてもよい。例えば成熟ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞と比較して、より高い色素形成レベル、またはＰＡＸ２、Ｐａｘ６、および／またはチロシナーゼのより高い発現レベルを有してもよい。

製剤は、非ＲＰＥ細胞に関して実質的に精製されて、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞製剤は、非ＲＰＥ細胞を本質的に含まず、またはＲＰＥ細胞からなってもよい。例えば実質的に精製されたＲＰＥ細胞製剤は、約２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の非ＲＰＥ細胞型を含んでなってもよい。例えばＲＰＥ細胞製剤は、約２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％未満の非ＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。

ＲＰＥ細胞製剤は、非ＲＰＥ細胞に関して、ならびにその他の成熟度レベルのＲＰＥ細胞に関して、実質的に純粋であってもよい。製剤は、非ＲＰＥ細胞に関して実質的に精製され、成熟ＲＰＥ細胞が濃縮されていてもよい。例えば成熟ＲＰＥ細胞が濃縮されたＲＰＥ細胞製剤中では、少なくとも約３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％または１００％のＲＰＥ細胞が、成熟ＲＰＥ細胞である。製剤は、非ＲＰＥ細胞に関して実質的に精製され、成熟ＲＰＥ細胞でなく、分化ＲＰＥ細胞が濃縮されていてもよい。例えば少なくとも約３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＲＰＥ細胞が、成熟ＲＰＥ細胞でなく分化ＲＰＥ細胞であってもよい。

ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約１×１０^３、２×１０^３、３×１０^３、４×１０^３、５×１０^３、６×１０^３、７×１０^３、８×１０^３、９×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約５，０００～１０，０００、５０，０００～１００，０００、１００，０００～２００，０００、２００，０００～５００，０００、３００，０００～５００，０００、または４００，０００～５００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約２０，０００～５０，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。またＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約５，０００、１０，０００、
２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、１００，０００、または５００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。

ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約１×１０^３、２×１０^３、３×１０^３、４×１０^３、５×１０^３、６×１０^３、７×１０^３、８×１０^３、９×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０個のＲＰＥ細胞／ｍＬを含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約５，０００～１０，０００、５０，０００～１００，０００、１００，０００～２００，０００、２００，０００～５００，０００、３００，０００～５００，０００、または４００，０００～５００，０００個のＲＰＥ細胞／ｍＬを含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約２０，０００～５０，０００個／ｍＬのＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。またＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００、１００，０００、または５００，０００個のＲＰＥ細胞／ｍＬを含んでなってもよい。

本明細書に記載される製剤は、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、パルボウィルスＢ１９、エプスタイン・バーウイルス、またはヘルペスウイルス６の存在をはじめとするが、これに限定されるものではない、細菌、ウイルス、または真菌汚染または感染を実質的に含まなくてもよい。本明細書に記載される製剤は、マイコプラズマ汚染または感染を実質的に含まなくてもよい。

本明細書に記載されるＲＰＥ細胞はまた、移植後に、機能性ＲＰＥ細胞として作用してもよく、ＲＰＥ細胞は、細胞移植を受けた患者の神経感覚網膜と脈絡膜の間に、単層を形成する。ＲＰＥ細胞はまた、隣接する光受容体に栄養素を供給し、脱落した桿体視細胞外節を食作用によって処理してもよい。さらに、本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、眼の提供者に由来する細胞よりも大きな増殖可能性を有してもよい（例えばＲＰＥ細胞は提供者のものに比べて「より若い」）。これは、本明細書に記載されるＲＰＥ細胞が、眼の提供者に由来する細胞に比べて、より長い有用寿命を有することを可能にする。

ＲＰＥ細胞を含んでなる製剤は、優良製造規範（ＧＭＰ）（例えば製剤はＧＭＰ準拠である）および／または現行の組織取扱優良実務規範（ＧＴＰ）（例えば製剤はＧＴＰ準拠であってもよい）に従って調製されてもよい。

ＲＰＥ細胞培養物
本開示はまた、ヒトＲＰＥ細胞をはじめとする、実質的に精製されたＲＰＥ細胞培養物も提供する。本明細書に記載されるＲＰＥ培養物は、少なくとも約１，０００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；または９，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。培養は、少なくとも約１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×
１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。

ＲＰＥ細胞をさらに培養して、成熟ＲＰＥ細胞培養物を生成してもよい。ＲＰＥ細胞を成熟させてもよく、ＲＰＥ細胞を例えばＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭまたはＭＤＢＫＭＭ培地中で、所望の成熟レベルが得られるまでさらに培養してもよい。これは、成熟中の色素形成レベルの増大をモニターすることで、判定されてもよい。ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭまたはＭＤＢＫＭＭ培地の代案として、機能的に同等のまたは類似した培地を使用してもよい。ＲＰＥ細胞を成熟させるために使用される特定の培地に関係なく、培地には、任意選択的に成長因子または薬剤が補給されてもよい。ＲＰＥ細胞および成熟ＲＰＥ細胞は、どちらも分化ＲＰＥ細胞である。しかし成熟ＲＰＥ細胞は、分化ＲＰＥ細胞と比較して、色素レベルの増大によって特徴付けられる。成熟度および色素形成のレベルは、分化ＲＰＥ細胞の培養密度を増大または低下させることで調節してもよい。したがってＲＰＥ細胞培養物をさらに培養して、成熟ＲＰＥ細胞を生成してもよい。代案としては、成熟ＲＰＥ細胞を含有する培養の密度を下げて、成熟分化ＲＰＥ細胞の百分率を低下させ、分化ＲＰＥ細胞の百分率を増大させてもよい。

ＲＰＥ細胞は、このような細胞と生体内誘導された細胞とで、メッセンジャーＲＮＡ転写物を比較することで、同定してもよい。細胞アリコートを胚性幹細胞のＲＰＥ細胞への分化中の様々な間隔で収集し、上述のいずれかのマーカーの発現についてアッセイする。これらの特性は、分化ＲＰＥ細胞を区別する。

ＲＰＥ細胞培養物は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の分化ＲＰＥ細胞を含んでなる、実質的に精製された培養物であってもよい。実質的に精製された培養物は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の成熟分化ＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。

ＲＰＥ細胞培養物は、優良製造規範（ＧＭＰ）（例えば培養物はＧＭＰ準拠である）および／または現行の組織取扱優良実務規範（ＧＴＰ）（例えば培養物はＧＴＰ準拠であってもよい）に従って調製されてもよい。

ＲＰＥ細胞の冷凍保存製剤
ＲＰＥ細胞は、当該技術分野で公知のあらゆる適切な方法（例えば低温凍結）によって保存されてもよく、凍結は、細胞の保存にふさわしいあらゆる温度であってもよい。例えば細胞は、約－２０℃、－８０℃、－１２０℃、－１３０℃、－１３５℃、－１４０℃、－１５０℃、－１６０℃、－１７０℃、－１８０℃、－１９０℃、－１９６℃、および細胞の保存にふさわしいあらゆるその他の温度で凍結してもよい。低温凍結細胞は、適切な容器中で保存してもよく、細胞損傷リスクを低下させ、細胞が解凍を乗り切る可能性を最大化するために、保存準備をしてもよい。ＲＰＥ細胞は、分化に続いて即座に、生体外成
熟に続いて、または培養中でいくらかの期間後に、冷凍保存してもよい。ＲＰＥ細胞はまた、室温で維持してもよく、または例えば約４℃で冷蔵してもよい。

同様に、ＲＰＥ細胞を冷凍保存する方法もまた提供される。ＲＰＥ細胞は、収穫され、緩衝液または培地中で洗浄され、計数され、（遠心分離によって）濃縮され、凍結媒質中で調合され（例えば９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ）、またはこれらの手順を任意に組み合わせてもよい。例えばＲＰＥ細胞をいくつかの培養容器内に播種して、連続的に増殖させてもよい。ＲＰＥ細胞を収穫して、約４℃においてＦＢＳ中で維持する一方で、いくつかのフラスコのＲＰＥ細胞を合わせて、単一ロットにする。ＲＰＥ細胞はまた、食塩溶液（例えばＤＰＢＳ）で、少なくとも１、２、３、４、または５回洗浄してもよい。さらにＲＰＥ細胞は、ジストロフィンが細胞膜で組織化されて、ＰＡＸ６発現が低下した後に冷凍保存してもよい。さらに、バイアルを一次および／または二次ラベルで標識してもよい。ラベル上の情報としては、細胞タイプ（例えばｈＲＰＥ細胞）、ロット番号および日付、細胞数（例えば１×１０^６個の細胞／ｍＬ）、使用期限（例えばバイアルをそれまでに使用すべき推奨日）、製造情報（例えば名称および住所）、警告、および保存手段（例えば液体窒素内保存）が挙げられる。

本明細書に記載される冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約５０，０００～１００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤はまた、少なくとも約２０，０００～５００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。また冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００、または１００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００、１００，０００、または５００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤のＲＰＥ細胞は、ヒトＲＰＥ細胞をはじめとする哺乳類ＲＰＥ細胞であってもよい。

さらに本明細書に記載される冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約５０，０００～１００，０００個のＲＰＥ細胞／ｍＬを含んでなってもよい。冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤はまた、少なくとも約２０，０００～５００，０００個のＲＰＥ細胞／ｍＬを含んでなってもよい。また冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００、および１００，０００個のＲＰＥ細胞／ｍＬを含んでなってもよい。冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００、１００，０００、または５００，００
０個のＲＰＥ細胞／ｍＬを含んでなってもよい。冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０個のＲＰＥ細胞／ｍＬを含んでなってもよい。冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤のＲＰＥ細胞は、ヒトＲＰＥ細胞をはじめとする哺乳類ＲＰＥ細胞であってもよい。

本開示のＲＰＥ細胞は、冷凍保存に続いて保存から回収されてもよい。冷凍保存から回収されたＲＰＥ細胞は、それらの生存度および分化状態もまた維持する。例えば少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＲＰＥ細胞が、冷凍保存に続いて生存度と分化を保持してもよい。さらに本開示のＲＰＥ細胞は冷凍保存されて、少なくとも約１、２、３、４、５、６、または７日間の保存後に、それらの生存度を維持してもよい。本開示のＲＰＥ細胞はまた、冷凍保存されて、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月の保存後に、それらの生存度を維持してもよい。本開示のＲＰＥ細胞は冷凍保存されて、少なくとも約１、２、３、４、５、６、または７年間の保存後に、それらの生存度を維持してもよい。例えば本開示のＲＰＥ細胞は、少なくとも約４年間冷凍保存されて、少なくとも約８０％の生存度を示してもよい。ＲＰＥ細胞を含んでなる冷凍保存製剤は、ＤＭＳＯを実質的に含まなくてもよい。

ＲＰＥ細胞を生成する方法
主題方法によって分析される細胞集団は、多能性幹細胞から生成されもよい。生成されてもよい細胞型としては、ＲＰＥ細胞、ＲＰＥ始原細胞、虹彩色素性上皮（ｉｒｉｓｐｉｇｍｅｎｔｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）（ＩＰＥ）細胞、および（例えば内顆粒層（ＩＮＬ）の「中継」ニューロンのような）介在ニューロンやアマクリン細胞などのその他の視覚関連神経細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、網膜細胞、桿体、錐体、および角膜細胞が生成されてもよい。眼の血管系を提供する細胞もまた、本明細書に記載される方法によって生成されてもよい。

特定理論に拘束されることなく、本発明者らは、本明細書に記載される方法が、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＷＮＴ４、ＴＧＦ－β、および／または酸化的ストレスを通じて作用し、ＭＡＰ－キナーゼおよび可能なＣＪｕｎ最終キナーゼ経路にシグナルを送り、Ｐａｉｒｅｄ－ｂｏｘ６（ＰＡＸ６）転写因子の発現を誘発してもよいことを発見した。ＰＡＸ６は、ＰＡＸ２と相乗的に作用して、ＭＩＴＦおよびＯｔｘ２の協調を介して、成熟ＲＰＥを最終分化させ、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）などのＲＰＥ特異的遺伝子と、ＲＰＥ６５、ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰ、およびＰＥＤＦなどの下流標的とを転写する。国際公開第２００９／０５１６７１号パンフレットの図１を参照されたい。

本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、ヒト胚性幹細胞などの多能性幹細胞から分化してもよく、分子的に胚性幹細胞、成人由来ＲＰＥ細胞、および胎児由来ＲＰＥ細胞と異なっ
てもよい。例えば本明細書に記載される製造工程段階は、これらの細胞が、生得ＲＰＥ細胞と酷似して、胎児由来ＲＰＥ細胞またはＲＰＥ細胞系（例えばＡＲＰＥ１９）と異なるように、特有の構造的および機能的特性を最終ＲＰＥ細胞製品に与えてもよい。

出願人らは、多能性細胞からＲＰＥを生成する方法を以前開示している。その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書に援用する、米国特許第７７３６８９６号明細書、米国特許第７７９５０２５号明細書、および米国特許第７７９４７０４号明細書、および国際公開第／２０１２／０１２８０３号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０６３００５号パンフレットを参照されたい。ＲＰＥは、多層集団または胚様体として培養された多能性細胞から、生成されてもよい。例えば胚様体は、例えば低付着性基質上、または「懸滴」中などの非付着条件下で多能性細胞を培養することで、形成されてもよい。これらの培養中では、ＥＳ細胞は、胚様体と称される細胞塊またはクラスターを形成し得る。その内容全体を参照によって援用する、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ－Ｅｌｄｏｒｅｔａｌ．，ＭｏｌＭｅｄ．２０００Ｆｅｂ；６（２）：８８－９５を参照されたい。典型的に、胚様体は、最初に多能性細胞の中実の塊またはクラスターとして形成し、時間経過と共に、一部の胚様体は液体で満たされた窩洞を含むようになり、同文献中で前者は「単純」ＥＢ、後者は「嚢胞性」胚様体と称される。出願人らが以前報告したように、これらのＥＢ（中実および嚢胞性形態の双方）中の細胞は、分化し得て、時間経過と共にＲＰＥ細胞数を増大させる。任意選択的に、次にＥＢを付着培養物として培養し、増殖物を形成させてもよい。同様に、出願人らは、過成長させて多層細胞集団を形成させた多能性細胞が、時間経過と共に分化して、ＲＰＥ細胞を形成し得ることを以前報告している。ひとたびＲＰＥが形成されると、それらは、色素形成および敷石状外観をはじめとするそれらの形態学的特性に基づいて容易に同定され、さらなる使用のために単離し得る。

多能性細胞は、当該技術分野で公知のあらゆる培養方法を使用して、ＲＰＥ細胞形成に先だって増殖させて維持してもよい。例えば多能性細胞は、マウス細胞（例えばマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ））、ヒト支持細胞（例えばヒト成人皮膚細胞、新生児皮膚線維芽細胞（ＨＮＤＦ）など）のような支持細胞の存在下で、培養してもよい。多能性細胞は、異種成分を含まない培養中で、および／または支持細胞を含まない条件下で培養してもよい。その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書に援用する、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２００５Ｍａｙ７－１３；３６５（９４７１）：１６３６－４１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．２００３；２１（５）：５４６－５６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，４１０，７９８；Ｉｌｉｃｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｅｖ．２００９Ｎｏｖ；１８（９）：１３４３－５；Ｘｕｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１Ｏｃｔ；１９（１０）：９７１－４を参照されたい。例えば多能性細胞は、基材上で培養してもよい。基材は、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、ヘパランスルフェート、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ、ヒト基底膜抽出物、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択されてもよい。基材は、ヒト起源、またはウシ、マウスまたはラットなどの非ヒト動物起源であってもよい。多能性細胞は、馴化培地中で培養してもよい。例えば馴化培地は、そのいずれかがヒト細胞であってもなくてもよい、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、支持細胞、胎児細胞などの多能性細胞によって、馴化されてもよい。

ＲＰＥの生成中に、多能性細胞をｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養してもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞中のｒｈｏ関連キナーゼ機能またはそのシグナル伝達経路を阻害し、または低下させる、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどのあらゆる物質を指す。「ＲＯＣＫシグナル伝達経路」は、本明細
書の用法では、細胞中のＲｈｏ－ＲＯＣＫ－ミオシンＩＩシグナル伝達経路、その上流のシグナル伝達経路、またはその下流のシグナル伝達経路などのＲＯＣＫ関連シグナル伝達経路に関与する、あらゆるシグナルプロセッサを含んでもよい。使用してもよい例示的なＲＯＣＫ阻害剤は、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤であるＳｔｅｍｇｅｎｔ’ｓＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅＹ－２７６３２（Ｗａｔａｎａｂｅｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７Ｊｕｎ；２５（６）：６８１－６を参照されたい）であり、その他のＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｈ－１１５２、Ｙ－３０１４１、Ｗｆ－５３６、ＨＡ－１０７７、ヒドロキシル－ＨＡ－１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、およびＳＢ－７７２０７７－Ｂが挙げられる。全体が記載されているかのように、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、Ｄｏｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３２：８９－９８，２００７；Ｉｓｈｉｚａｋｉ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７：９７６－９８３，２０００；Ｎａｋａｊｉｍａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５２：３１９－３２４，２００３；およびＳａｓａｋｉｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９３：２２５－２３２，２００２。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えばその内容全体を参照によって援用する、米国特許第２０１２／０２７６０６３号明細書（付与前公表）に記載される、当該技術分野で公知の濃度および／または培養条件で利用してもよい。例えばＲＯＣＫ阻害剤は、例えば少なくとも、または約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０μＭなど、約０．０５～約５０μＭの濃度を有してもよく、その中で推論できるあらゆる範囲、または細胞成長または生存を促進するのに効果的なあらゆる標的濃度が含まれる。

例えば多能性細胞生存度は、ＲＯＣＫ阻害剤の包含によって改善されてもよい。例示的実施形態では、多能性細胞は、マトリゲル（商標）または別の基材などの、支持細胞を含まない条件下で維持されてもよい。その後、トリプシンを使用せずに、ＥＤＴＡ、コラゲナーゼなどを使用して、または機械的に、分離させた多能性細胞から、胚様体を生成してもよい。胚様体は、Ｙ－２７６３２または別のＲＯＣＫ阻害剤を含んでなる培地中で形成されてもよい。例えばＲＯＣＫ阻害剤は、マトリゲル（商標）または別の基材中で培養された、多能性細胞から生成される胚様体中の細胞生存度を高めてもよい。それによってＲＰＥ細胞収率が、改善されてもよい。

例示的なＲＰＥ細胞を生成する方法は、（ａ）多能性幹細胞を提供するステップと；（ｂ）任意選択的に無血清Ｂ２７補給剤を含んでなる、栄養素に富む低タンパク質培地中で、多能性幹細胞を胚様体として培養するステップと；（ｃ）任意選択的に無血清Ｂ２７補給剤を含んでなる、栄養素に富む低タンパク質培地中で、胚様体を付着培養として培養するステップと；（ｄ）無血清Ｂ２７補給剤を含まない、栄養素に富む低タンパク質培地中で、（ｃ）の付着培養細胞を培養するステップと；（ｅ）高密度体細胞培養物の成長を支持できる培地中で（ｄ）の細胞を培養し、それによってＲＰＥ細胞が細胞培養物中に現れるステップと；（ｆ）好ましくは機械的または化学的に（例えばプロテアーゼまたはその他の酵素、または別の分離媒体を使用して）、細胞または細胞塊を（ｅ）の培養から分離するステップと；（ｇ）ＲＰＥ細胞を培養から選択し、ＲＰＥ細胞を成長因子が補給された別の培地を含有する培養に移して、ＲＰＥ細胞の富化培養を生成するステップと；（ｇ）ＲＰＥ細胞の富化培養を増殖させて、ＲＰＥ細胞を生成するステップとを含んでなる。これらの方法手順を少なくとも１回実施して、実質的に精製されたＲＰＥ細胞培養物を生成してもよい。さらにこれらの方法手順を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上繰り返して、より多くのＲＰＥ細胞を生成してもよい。

さらに、本開示はまた、（ａ）多能性幹細胞を提供するステップと；（ｂ）任意選択的に無血清Ｂ２７補給剤を含んでなる、栄養素に富む低タンパク質培地中で、多能性幹細胞
を胚様体として培養するステップと；（ｃ）任意選択的に無血清Ｂ２７補給剤を含んでなる、栄養素に富む低タンパク質培地中で、胚様体を付着培養として培養するステップと；（ｄ）無血清Ｂ２７補給剤を含まない、栄養素に富む低タンパク質培地中で、ステップ（ｃ）の付着培養細胞を培養するステップと；（ｅ）高密度体細胞培養物の成長を支持できる培地中で、（ｄ）の細胞を培養し、それによってＲＰＥ細胞が細胞培養物中に現れるステップと；（ｆ）好ましくは機械的または化学的に（例えばプロテアーゼまたはその他の酵素、または別の分離媒体を使用して）、細胞または細胞塊を（ｅ）の培養から分離するステップと；（ｇ）ＲＰＥ細胞を培養から選択し、ＲＰＥ細胞を成長因子が補給された別の培地を含有する培養に移して、ＲＰＥ細胞の富化培養を生成するステップと；（ｈ）ＲＰＥ細胞の富化培養を増殖させるステップと；（Ｉ）ＲＰＥ細胞の富化培養を培養して、成熟ＲＰＥ細胞を生成するステップとを含んでなる、成熟網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法も提供する。これらの方法手順を少なくとも１回実施して、実質的に精製された成熟ＲＰＥ細胞培養物を生成してもよい。さらにこれらの方法手順を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上繰り返して、より多くの成熟ＲＰＥ細胞を生成してもよい。

連結した手順のいずれでも、細胞は少なくとも約１～１０週間培養してもよい。例えば細胞は、少なくとも約３～６週間培養してもよい。連結した手順のいずれでも、細胞は、例えば少なくとも約１～３、３～４、７、４～９、７～１０、７～１２、８～１１、９～１２、７～１４、１４～２１、および３～４５日間など、約１日間～５０日間培養してもよい。細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０日間培養してもよい。細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間培養してもよい。例えば細胞は、２～４および３～６時間培養してもよい。上の連結した方法手順のそれぞれで、細胞は各ステップで同じ期間にわたり、または手順の１つまたは複数で異なる期間にわたり、培養してもよい。さらに上の連結した方法手順のいずれかを繰り返して、より多くのＲＰＥ細胞を生成してもよい（例えばスケールアップして多数のＲＰＥ細胞を生成する）。

本明細書に記載される方法では、ＲＰＥ細胞は、ＥＢの付着培養中の細胞間で分化し始めてもよい。ＲＰＥ細胞は、それらの敷石状形態と、色素形成の初期出現に基づいて視覚的に認識されてもよい。ＲＰＥ細胞が分化し続けるにつれて、ＲＰＥ細胞のクラスターが観察されてもよい。

機械的または酵素的方法を使用して、胚様体培養中の非ＲＰＥ細胞クラスター間でＲＰＥ細胞を選択し、または付着細胞の継代培養を容易にしてもよい。例示的な機械的方法としては、ピペットによる磨砕（ｔｉｔｕｒａｔｉｏｎ）、または引き出し針（ｐｕｌｌｅｄｎｅｅｄｌｅ）による切断が挙げられるが、これに限定されるものではない。例示的な酵素的方法としては、細胞を分離するのに適したあらゆる酵素（例えばトリプシン（例えばトリプシン／ＥＤＴＡ）、コラゲナーゼ（例えばコラゲナーゼＢ、コラゲナーゼＩＶ）、ディスパーゼ、パパイン、コラゲナーゼおよびディスパーゼ混合物、コラゲナーゼおよびトリプシン混合物）が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えばハンクスベースの細胞分離緩衝液のような高ＥＤＴＡ含有量の溶液などの非酵素溶液を使用して、細胞を分離してもよい。

ＲＰＥ細胞は、胚様体から分化してもよい。ＥＢからＲＰＥ細胞を単離することで、ＲＰＥ細胞が生体外富化培養中で増殖できるようにする。ヒト細胞では、ＲＰＥ細胞は、９
０日未満成長させたＥＢから得られてもよい。さらにＲＰＥ細胞は、少なくとも約７～１４日間、１４～２８日間、２８～４５日間、または４５～９０日間成長させたヒトＥＢ中で生じてもよい。多能性幹細胞、胚様体、およびＲＰＥ細胞を培養するのに使用する培地は、任意選択の間隔で除去してもおよび／または同一または異なる培地で置換してもよい。例えば培地は、少なくとも約０～７日間、７～１０日間、１０～１４日間、１４～２８日間、または２８～９０日後に、除去および／または置換してもよい。さらに培地は、少なくとも毎日、隔日、または少なくとも３日毎に置換してもよい。

ＲＰＥ細胞を濃縮して、実質的に精製されたＲＰＥ細胞培養物を確立するために、機械的および／または化学的（酵素的を含む）方法を使用してＲＰＥ細胞を互いに、および非ＲＰＥ細胞から分離してもよい。次にＲＰＥ細胞懸濁液を新鮮培地および新鮮培養容器に移して、ＲＰＥ細胞の富化集団を提供してもよい。

分離細胞からＲＰＥ細胞を選択し、別々に培養して、実質的に精製されたＲＰＥ細胞培養物を生成してもよい。ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞に付随する特性に基づいて選択される。例えばＲＰＥ細胞は、敷石状細胞形態および色素形成によって認識され得る。これに加えて、頂端微絨毛にもまた見られる細胞質タンパク質である細胞レチナールデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）；レチノイド代謝に関与する細胞質タンパク質であるＲＰＥ６５；ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー遺伝子（ＶＭＤ２）産物であるベストロフィン；および抗血管新生特性がある４８ｋＤの分泌タンパク質である色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をはじめとする、いくつかの既知のＲＰＥマーカーがある。ＰＣＲ（例えばＲＴ－ＰＣＲ）またはノーザンブロットを使用して、これらのマーカーのメッセンジャーＲＮＡ転写物をアッセイしてもよい。また免疫ブロット技術またはウエスタンブロットを使用して、これらのマーカーのタンパク質レベルをアッセイしてもよい。

ＲＰＥ細胞はまた、脱落した桿体および錐体外節の食作用（またはポリスチレンビーズなどの別の基材の食作用）、迷光吸収、ビタミンＡ代謝、レチノイド再生、および組織修復などにより、細胞機能に基づいて選択してもよい。評価はまた、適切な宿主動物（自然発生的または誘発的網膜変性病状に罹患しているヒトまたは非ヒト動物など）へのＲＰＥ細胞移植後に、例えば行動試験、蛍光血管造影、組織学、密着結合導電率、または電子顕微鏡検査を使用した評価を使用して、生体内機能を検査することで実施してもよい。

ＲＰＥ細胞の富化培養は、例えばＥＧＭ２培地などの適切な培地中で培養してもよい。この培地、または機能的に同等または同様の培地には、成長因子または薬剤（例えばｂＦＧＦ、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、血管内皮成長因子、組換えインスリン様成長因子、アスコルビン酸、またはヒト表皮成長因子）を補給してもよい。ＲＰＥ細胞は、培養中で長期にわたり（例えば＞６週間）、表現型が安定していてもよい。

任意選択的に、ＲＰＥは、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ’ｓＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅＹ－２７６３２などのｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養してもよい。例えばＲＰＥは、冷凍保存に先だって、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養してもよい。

多能性幹細胞
本明細書に記載される方法を、多能性幹細胞から生成された（ＲＰＥ細胞などの）分化細胞に使用してもよい。適切な多能性幹細胞としては、多能性幹細胞が誘導される方法にかかわりなく、胚性幹細胞、胚由来幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。多能性幹細胞は、例えば当該技術分野で公知の方法を使用して、作成してもよい。例示的な多能性幹細胞としては、胚盤胞段階胚の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来する胚性幹細胞、ならびに卵割段階または桑実胚段階胚の１つまたは複数の割球に由来する、胚性幹細胞が挙げられる（任意選択的に残りの胚の破壊なしで）。このよ
うな胚性幹細胞は、受精によって、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為発生、細胞再プログラミング、および雄性発生をはじめとする無性生殖手段によって生じた、胚性材料から作成し得るさらに、適切な多能性幹細胞としては、多能性幹細胞が誘導される方法にかかわりなく、ヒト胚性幹細胞、ヒト胚由来幹細胞、およびヒト人工多能性幹細胞が挙げられるがこれに限定されるものではない。

多能性幹細胞（例えばｈＥＳ細胞）を懸濁培養として培養して、胚様体（ＥＢ）を生成してもよい。胚様体は、懸濁状態で約７～１４日間培養してもよい。しかし特定の実施形態では、ＥＢを懸濁状態で、７日未満（７、６、５、４、３、２日未満、または１日未満）、または１４日間を超えて培養してもよい。ＥＢは、Ｂ２７補給剤が添加された培地中で培養してもよい。

ＥＢを懸濁培養中で培養後、ＥＢを移して付着培養を生成してもよい。例えばＥＢは、培地中のゼラチン被覆プレート上に播種してもよい。付着培養として培養する場合、ＥＢは、懸濁状態で成長させる場合と同じタイプの培地中で培養してもよい。細胞を付着培養として培養する場合、培地にＢ２７補給剤を添加してもよい。また培地には、最初に（例えば約７日間以下）Ｂ２７が補給されるが、次に残りの期間は付着培養として、Ｂ２７不在下で引き続いて培養される。ＥＢは付着培養として、少なくとも約１４～２８培養してもよい。しかし特定の実施形態では、ＥＢを付着培養として、約１４日未満（１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日未満、または１日未満）または約２８日間を超えて培養してもよい。

ヒト胚性幹細胞
本明細書に記載される方法では、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を多能性幹細胞として使用してもよい。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）としては、胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）の子孫、または別の起源に由来する細胞が挙げられ、実質的に無期限に多能性のままであってもよい。ｈＥＳ細胞は、任意選択的に破壊なしで、または胚を損傷せずに、初期卵割段階胚の１つまたは複数の割球から誘導されてもよい。ｈＥＳ細胞は、核移植を使用して生成されてもよい。ｈＥＳ細胞はまた、下でさらに詳述される人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよい。また冷凍保存ｈＥＳ細胞を使用してもよい。ｈＥＳ細胞は、支持細胞の存在または不在下などの当該技術分野で公知のあらゆる方法で培養してもよい。例えばｈＥＳ細胞はＥＢ－ＤＭ、ＭＤＢＫＧＭ、ｈＥＳＣ培地、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）幹細胞培地、ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ、ＶＰＳＦＭ、ＥＧＭ２、またはＭＤＢＫＭＭ中で培養してもよい。ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（ｈＥＳＣ））［ＮＩＨウェブサイト、２０１０年］を参照されたい。ｈＥＳ細胞は、ＧＭＰ標準規格に従って使用され維持されてもよい。

規定条件において支持細胞層上で培養すると、ｈＥＳ細胞は特異的形態を維持して、細胞質に対する核の比率が高い小さな緊密に詰め込まれた細胞、細胞間の透明な境界線、および鮮明な屈折性のコロニー境界を含んでなる、扁平コロニーを形成する。ｈＥＳ細胞は、八量体結合タンパク質４（Ｏｃｔ－４、別名Ｐｏｕ５ｆ１）、段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３およびＳＳＥＡ４、腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡ）１６０、ＴＲＡ１８０、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、およびＲｅｘ１などの分子マーカーの組を発現する。所定の系統に分化するＩＣＭ細胞と同様に、培養中のｈＥＳ細胞を誘導して分化させてもよい。例えばｈＥＳ細胞を本明細書に記載される規定条件下で、ヒトＲＰＥに分化させてもよい。

使用してもよいヒト胚性幹細胞としては、ＭＡ０１、ＭＡ０４、ＭＡ０９、ＡＣＴ４、ＭＡ０３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、およびＨ１４が挙げられるが、これに限定されるもので
はない。追加的な例示的細胞系としては、ＮＥＤ１、ＮＥＤ２、ＮＥＤ３、ＮＥＤ４、およびＮＥＤ５が挙げられる。ＮＩＨＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙもまた参照されたい。使用してもよい例示的なヒト胚性幹細胞系は、ＭＡ０９細胞である。ＭＡ０９細胞の単離および調製は、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，ｅｔａｌ．（２００６）”ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｌｉｎｅｓＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＳｉｎｇｌｅＢｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ４４４：４８１－４８５に、以前記載されている。

ｈＥＳ細胞は、最初に、マウス胚性支持細胞（ＭＥＦ）細胞と共培養してもよい。ＭＥＦ細胞は、共培養中へのｈＥＳ細胞の播種に先だって、マイトマイシンＣへの曝露によって有糸分裂を不活性化してもよく、したがってＭＥＦは培養中で増殖しない。さらにｈＥＳ細胞培養物は、顕微鏡的に検査してもよく、例えば幹細胞切断ツール、レーザー焼灼、またはその他の手段を使用して、非ｈＥＳ細胞形態を含有するコロニーを選択して破棄してもよい。典型的に、胚様体形成のための播種用ｈＥＳ細胞の収穫時以降、追加的なＭＥＦ細胞は工程で使用されない。ＭＥＦ除去と本明細書に記載されるＲＰＥ細胞収穫との間の時間は、ＭＥＦを含まない細胞培養中で、最低限少なくとも１、２、３、４、または５代の継代で、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００日間であってもよい。ＭＥＦ除去とＲＰＥ細胞収穫の間の時間はまた、ＭＥＦを含まない細胞培養中で最低限少なくとも約３代の継代で、少なくとも約８０～９０日間であってもよい。本明細書に記載される生成方法のために、ＲＰＥ細胞培養物および本明細書に記載される製剤は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を実質的に含まなくてもよい。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）
さらなる例示的な多能性幹細胞としては、因子組み合わせ（「再プログラミング因子」）の発現または発現誘導によって、体細胞を再プログラミングすることで作成された、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、胎児、出生後、新生児、幼若、または成人体細胞を使用して作成してもよい。ｉＰＳ細胞は、細胞バンクから得られてもよい。代案としては、ＲＰＥ細胞または別の細胞型への分化を開始するのに先だって、（当該技術分野で公知の方法によって）ｉＰＳ細胞を新たに作成してもよい。ｉＰＳ細胞の作成は、分化細胞を生成する最初の段階であってもよい。ｉＰＳ細胞は、組織適合性ＲＰＥ細胞を作成する目的で、特定の患者または適合提供者からの材料を使用して、特に作成されてもよい。ｉＰＳ細胞は、意図される受容者中で実質的に免疫原性でない細胞から生成され得て、例えば自己細胞から、または意図される受容者と組織適合性の細胞から生成される。

人工多能性幹細胞は、体細胞中で１つまたは複数の再プログラミング因子を発現または発現誘導することで、生成されてもよい。体細胞は、皮膚線維芽細胞、滑膜線維芽細胞、または肺線維芽細胞などの線維芽細胞であり、または非線維芽体細胞である。体細胞は、少なくとも１、２、３、４、５を発現することで、再プログラムされる。再プログラミング因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、Ｌｉｎ２８、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４から選択されてもよい。再プログラミング因子の発現は、再プログラミング因子の発現を誘発する小型有機分子剤などの少なくとも１つの薬剤に、体細胞を接触させることで誘発してもよい。

体細胞はまた、コンビナトリアルアプローチを使用して再プログラムしてもよく、（例えばウイルスベクター、プラスミドなどを使用して）再プログラミング因子を発現させて、（例えば小型有機分子を使用して）再プログラミング因子発現を誘導する。例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用した感染によって、再プログラミング因子を体細胞中で発現させてもよい。またエピソームプラ
スミドなどの非組み込み型ベクターを使用して、再プログラミング因子を体細胞中で発現させてもよい。例えばその内容全体を参照によって援用する、Ｙｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９Ｍａｙ８；３２４（５９２８）：７９７－８０１を参照されたい。非組込みベクターを使用して、再プログラミング因子を発現させる場合、電気穿孔、形質移入、またはベクターによる体細胞の変換を使用して、因子を細胞中で発現させてもよい。例えばマウス細胞中では、組み込みウイルスベクターを使用した４つの因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃｍｙｃ、およびＫｌｆ４）の発現が、体細胞を再プログラムするのに十分である。ヒト細胞中では、組み込みウイルスベクターを使用した４つの因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬｉｎ２８）の発現が、体細胞を再プログラムするのに十分である。

ひとたび再プログラミング因子が細胞中で発現したら、細胞を培養してもよい。時間経過と共に、ＥＳ特性のある細胞が、培養皿内に出現する。細胞は、例えば、ＥＳ形態に基づいて、または選択可能なまたは検出可能なマーカーの発現に基づいて選択し、継代培養してもよい。細胞を培養して、ＥＳ細胞と似ている細胞培養を生成してもよく、これらは推定上のｉＰＳ細胞である。

ｉＰＳ細胞の多分化能を確認するために、細胞を１つまたは複数の多分化能アッセイで検査してもよい。例えばＥＳ細胞マーカーの発現について、細胞を検査してもよく；ＳＣＩＤマウスに移植した場合に奇形腫を生じる能力について、細胞を評価してもよく；分化して、３つの全胚芽層の細胞タイプを生じる能力について、細胞を評価してもよい。ひとたび多能性ｉＰＳ細胞が得られたら、それを使用してＲＰＥ細胞を生成してもよい。

網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞
本開示は、ヒト胚性幹細胞などの多能性幹細胞から分化してもよく、分子的に胚性幹細胞、成人由来ＲＰＥ細胞、および胎児由来ＲＰＥ細胞と異なってもよい、ＲＰＥ細胞を提供する。本明細書で、および上で特定される関連出願で、開示される方法の例示的な実施形態に従って生成されるＲＰＥは、以前の方法によって達成可能もの、およびＲＰＥ細胞のその他の起源からのものとは異なってもよい。例えば本明細書に記載される製造工程段階は、胎児由来ＲＰＥ細胞またはＲＰＥ細胞系（例えばＡＲＰＥ１９）などのその他の起源から得られるこれらの単離されたＲＰＥ細胞からの細胞が、ように、特有の構造的および機能的特性を最終ＲＰＥ細胞製品に与えてもよい。

さらに本明細書に記載されるＲＰＥ細胞を生成する方法の例示的な実施形態は、ＥＳ細胞を許容せず、ＥＳ細胞が持続し得ず、ＲＰＥ細胞培養物および製剤に許容できない汚染リスクをもたらさないようにする。

本開示によって提供される細胞としては、ＲＰＥ、ＲＰＥ始原細胞、虹彩色素性上皮（ｉｒｉｓｐｉｇｍｅｎｔｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）（ＩＰＥ）細胞、および（例えば内顆粒層（ＩＮＬ）の「中継」ニューロンのような）介在ニューロンおよびアマクリン細胞などのその他の視覚関連神経細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。本開示の実施形態はまた、網膜細胞、桿体、錐体、および角膜細胞、ならびに眼の血管系を提供する細胞を提供してもよい。

ＲＰＥ細胞は、網膜離脱、網膜異形成、色素線条、近視性黄斑変性または網膜萎縮に起因する、あるいはコロイデレミア、糖尿病性網膜症、黄斑変性（例えば加齢黄斑変性）、色素性網膜炎、およびシュタルガルト病（黄色斑眼底）などの光受容体損傷および失明をもたらすいくつかの視覚変性疾患と関連付けられている、網膜変性疾患を治療するために使用してもよい。

ＲＰＥ細胞は、非ＲＰＥ細胞型に脱分化しない、安定した末端分化ＲＰＥ細胞であってもよい。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、ヒトまたは非ヒト動物への角膜、網膜下、またはその他の投与に際して、網膜中に組み込まれる能力によって特徴付けられる、機能性ＲＰＥ細胞であってもよい。

ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞マーカーを発現してもよい。例えば、ＲＰＥ６５、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、チロシナーゼ、ベストロフィン、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ、Ｏｔｘ２、およびＭＩＴＦなどのマーカーの発現レベルは、天然ＲＰＥ細胞と同等であってもよい。ＲＰＥ細胞の成熟度のレベルは、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、およびチロシナーゼの少なくとも１つの発現、またはそれらのそれぞれの発現レベルを測定することで、評価してもよい。

対照的にＲＰＥ細胞は、ＥＳ細胞マーカーを発現してもよい。例えば、ＥＳ細胞遺伝子Ｏｃｔ－４、ＮＡＮＯＧ、および／またはＲｅｘ－１の発現レベルは、ＲＰＥ細胞中でＥＳ細胞よりも約１００～１０００倍より低くてもよい。例えばＲＰＥ細胞は、八量体結合タンパク質４（Ｏｃｔ－４、別名Ｐｏｕ５ｆ１）、段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）－３およびＳＳＥＡ－４、腫瘍拒絶反応抗原（ＴＲＡ）－１－６０、ＴＲＡ－１－８０、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ－１、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ３（ＳＴＥＬＬＡ）、ＤＰＰＡ４、および／またはＤＰＰＡ５をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＥＳ細胞マーカーの発現を実質的に欠いていてもよい。したがってＲＰＥ細胞は、ＥＳ細胞と比較して、好ましくはＯｃｔ－４、ＮＡＮＯＧ、および／またはＲｅｘ－１の発現を実質的に欠いている。

本明細書に記載されるＲＰＥ細胞はまた、無培養ＲＰＥ細胞またはその他のＲＰＥ細胞製剤との比較で、αインテグリンサブユニット１～６または９の発現レベルの上昇も示してもよい。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞はまた、αインテグリンサブユニット１、２、３、４、５、または９の発現レベルの上昇も示してもよい。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、αインテグリンサブユニット１～６の発現を促進する条件下で、培養してもよい。例えばＲＰＥ細胞は、マンガンおよび活性化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＴＳ２／１６をはじめとするが、これに限定されるものではない、インテグリン活性化剤と共に培養してもよい。Ａｆｓｈａｒｉ，ｅｔａｌ．Ｂｒａｉｎ（２０１０）１３３（２）：４４８－４６４を参照されたい。ＲＰＥ細胞は、ラミニン（１μｇ／ｍＬ）上に播種されて、Ｍｎ^２＋（５００μＭ）に少なくとも約８、１２、２４、３６、または４８時間曝露されてもよい。またＲＰＥ細胞は、数代の継代（例えば少なくとも約４、５、６、７、または８継代）で培養してもよく、それはαインテグリンサブユニットの発現を増大させてもよい。

ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥマーカーを発現してｈＥＳマーカーを発現しない、正常な核型を示してもよい。

本明細書に記載されるＲＰＥ細胞はまた、細胞の色素形成の程度に基づいて、同定され特徴付けられてもよい。色素の変化は、ＲＰＥ細胞が培養され維持される密度、およびＲＰＥが培養中に維持される時間によって制御することができる。急速に分裂している分化ＲＰＥ細胞は、色素形成がより少ない。対照的に、より緩慢に分裂するまたは非分裂ＲＰＥは、それらの特徴的な多角形または六角形の形状を取り、メラニンおよびリポフスシンを蓄積することによって、色素形成レベルを増大させる。例えば（例えばコンフルエンスのために）静止状態のＲＰＥ培養物は、典型的にそれらの色素形成レベルを経時的に増大させる。したがって色素形成の蓄積は、ＲＰＥ成熟度の指標の役割を果たす細胞密度と関連付けられている、ＲＰＥ分化および色素形成増大の指標の役割を果たす。例えば成熟ＲＰＥ細胞は、色素形成を低下させるように、より低い密度で継代培養してもよい。この文脈で、成熟ＲＰＥ細胞を培養して、より未熟なＲＰＥ細胞を生成してもよい。このような
ＲＰＥ細胞は、依然として、ＲＰＥ分化マーカーを発現する分化ＲＰＥ細胞である。

本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、生体外で長期にわたりそれらの表現型を維持してもよい。例えばＲＰＥ細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０代の継代にわたり、それらの表現型を維持してもよい。ＲＰＥ細胞は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間にわたり、それらの表現型を維持してもよい。ＲＰＥ細胞は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間にわたり、それらの表現型を維持してもよい。

さらに本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、移植に続いてそれらの表現型を維持してもよい。ＲＰＥ細胞は、移植後、受容者の生存期間にわたり、それらの表現型を維持してもよい。例えばＲＰＥ細胞は、移植に続いて、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間にわたり、それらの表現型を維持してもよい。さらにＲＰＥ細胞は、移植に続いて、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間にわたり、それらの表現型を維持してもよい。さらにＲＰＥ細胞は、移植に続いて、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月にわたり、それらの表現型を維持してもよい。ＲＰＥ細胞は、移植に続いて、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０年以上にわたり、それらの表現型を維持してもよい。

ＲＰＥ細胞集団のメラニン含有量
本開示の例示的な実施形態は、低いまたは中程度の平均色素形成レベルを有するＲＰＥ細胞集団と、低いまたは中程度の平均色素形成レベルを有するＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品とを提供する。下の実施例で詳述するように、出願人らは、細胞が付着して生存する能力を評価するアッセイにおいて、比較的より低い色素形成レベルを有するＲＰＥ細胞が、より良く機能したことを示した。理論によって限定されることは望まないが、ＲＰＥ細胞が成熟するにつれて、それらは冷凍保存後に、細胞付着を形成して生存し増殖する能力が低下することもあると考えられ、これは、より成熟したＲＰＥ細胞中に含有される色素形成（メラニン）レベルの増大、および／または（例えば、細胞骨格、膜組成物、細胞表面受容体発現、付着強度、核構造、遺伝子発現、またはその他の表現型、または表現型組み合わせの変化をはじめとする）色素形成増大と概して相関する傾向がある、成熟ＲＰＥのその他の表現型の増大に起因するかもしれない。また理論によって限定されることは望まないが、ＲＰＥ細胞がより成熟するにつれて、それらは、冷凍保存なしで継代および／または維持した場合でさえも、細胞付着を形成して生存し増殖する能力が低下することもあると考えられ；これもまた、より成熟したＲＰＥ細胞に、および／または色素形成増大と概して相関する傾向がある、成熟ＲＰＥのその他の表現型に、含有される色素形成（メラニン）レベルの増大に起因するかもしれない。

色素形成のレベルは、集団の細胞あたりの平均メラニンとして測定されてもよく、例えば細胞あたりのピコグラム（ｐｇ／細胞）として表され、一般に、集団内の細胞中のメラニンレベルには、いくらかの変動があってもよいことが理解されるであろう。例えば平均メラニン含有量は、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、または５ｐｇ／細胞未満、例えば０．１～ｐｇ／細胞、０．１～７ｐｇ／細胞、０．１～６ｐｇ／細胞、０．１～５ｐｇ／細胞、０．１～４ｐｇ／細胞、０．１～３ｐｇ／細胞、０．１～２ｐｇ／細胞、０．１～１ｐｇ／細胞、１～８ｐｇ／細胞、１～７ｐｇ／細胞、１～６ｐｇ／細胞、１～５ｐｇ／細胞、１～４ｐｇ／細胞、１～３ｐｇ／細胞、１～２ｐｇ／細胞、２～６ｐｇ／細胞、３～５ｐｇ／細胞、または４．２～４．８ｐｇ／細胞などの４～５
ｐｇ／細胞、または０．１～５ｐｇ／細胞であってもよい。さらなる実施例では、平均メラニン含有量は、５ｐｇ／細胞未満、例えば０．１～５ｐｇ／細胞、０．２～５ｐｇ／細胞、０．５～５ｐｇ／細胞、１～５ｐｇ／細胞、２～５ｐｇ／細胞、３～５ｐｇ／細胞、４～５ｐｇ／細胞、または４．５～５ｐｇ／細胞であってもよい。

メラニン含有量は、細胞抽出物を利用する方法、ＦＡＣＳベースの方法などをはじめとする多様な方法を使用して測定してもよい。例えば、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書に援用する、Ｂｏｉｓｓｙｅｔａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１９８９Ｎｏｖ；１０（６）：７７９－８７；Ｓｗｏｐｅｅｔａｌ．，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ．１９９７Ｓｅｐ；１０９（３）：２８９－９５；Ｗａｔｔｓｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９８１；４１：４６７－４７２；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ
ｅｔａｌ．，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．１９７３Ｎｏｖ；５６（１）：９１－９を参照されたい。例えば、平均メラニン含有量を判定するために、代表的サンプル中の細胞数を測定してもよく、代表的サンプル中の細胞を溶解してもよく、（例えばＮａＯＨ抽出細胞ペレットからの）細胞溶解産物の全メラニン含有量を（例えば分光光度法により）測定し、代表的サンプル中の細胞数で除して、細胞あたりの平均メラニン含有量を得る。任意選択的に、培養中のＲＰＥ以外の細胞を無視して、代表的サンプル中の細胞数を測定し（例えばＲＰＥの１つまたは複数のマーカーについて陽性であり、および／またはＲＰＥ細胞の形態特性を示す細胞を計数する）、それによって代表的サンプル中のＲＰＥ細胞あたりの平均メラニン含有量を得てもよい。

平均メラニン含有量は、色素が最も濃い５パーセントと色素が最も薄い５パーセントの収穫されたＲＰＥ細胞を除外した、細胞集団について判定してもよい。

所望の平均メラニン含有量を有するＲＰＥ集団は、容易に得られ得る。例えば、（例えばコンフルエントな培養中の）分裂していない代謝的に活性なＲＰＥのメラニン含有量は、合成されたメラニンの蓄積のために経時的に増大する傾向がある一方で、分裂細胞中ではメラニン含有量が比較的低下するように、蓄積したメラニンが細胞分裂によって希釈される。例えばＤｕｎｎｅｔａｌ．，ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ．１９９６Ｆｅｂ；６２（２）：１５５－６９を参照されたい。したがって所望の平均メラニン含有量を有するＲＰＥ集団は、例えば１、２、３、４、５、または６日間、または１、２、３、４、５、６、７、８週間以上にわたる静止状態培養など、例えば所望の平均メラニン含有量をもたらす持続期間にわたる静止状態集団としての維持などの、適切な成長史を選択することで得られ得る。静止状態集団としてしばらく維持し、それに続いて、細胞を規定の時間または分裂回数で再度分裂させる（それによって静止状態集団中で達成される平均メラニン含有量を低下させる）ことをはじめとする、追加的な成長史もまた使用して、平均メラニン含有量を調節してもよい。メラニン含有量はまた、様々な培地および／または培地補給剤の使用によって調節されてもよく、例えば培養ＲＰＥ中のメラニン蓄積は、タンパク質キナーゼ阻害剤（例えばＨ－７、Ｗ－７、Ｈ－８、およびスタウロスポリン）の存在下で低下し（Ｋｉｓｈｉｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔ．２０００；２４（２）：７９－８３）、全トランス型レチノイン酸の存在下（１０（－５）から１０（－７）Ｍ）またはＴＧＦ－β １の存在下（１から１００Ｕ／ｍｌ）で増大する（Ｋｉｓｈｉｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＥｙｅＲｅｓ．１９９８Ｍａｙ；１７（５）：４８３－６）ことが報告されている。メラニン含有量はまた、亜鉛α－２－糖タンパク質（ＺＡＧ）による（米国特許第７，８０３，７５０号明細書を参照されたい）による、および／またはアデノシン－１受容体拮抗薬、アデノシン－２受容体作動薬、アデノシン－１受容体作動薬、アデノシン－２受容体拮抗薬、およびアデノシン－１受容体拮抗薬とアデノシン－２受容体作動薬との組み合わせ、またはそれらの組み合わせ（米国特許第５，９９８，４２３号明細書を参照されたい）による細胞処理によって、増大させてもよい。前述の文献のそれぞれは、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。

前述の方法の代案として、またはそれに加えて、所望の平均メラニン含有量を有するＲＰＥ細胞は、例えばフローサイトメーターを使用して、細胞選別を通じて得られてもよい。例えばメラニン含有細胞は、増大した側方散乱と低下した前方散乱をはじめとする、それらの光散乱特性によって検出可能であり；これらの特性を使用して、色素形成レベルによって集団を選別し、それによって所望の平均メラニン含有量を有する集団を精製してもよい。その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書に援用する、Ｂｏｉｓｓｙｅｔａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１９８９Ｎｏｖ；１０（６）：７７９－８７；Ｓｗｏｐｅｅｔａｌ．，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ．１９９７Ｓｅｐ；１０９（３）：２８９－９５。

ヒト胚性幹細胞中のＭＨＣ遺伝子を改変して複雑度が低下したＲＰＥ細胞を得る
（例えば本明細書に記載されるようにそれからＲＰＥが由来してもよい）ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、ヒト胚性幹細胞ライブラリーに由来してもよい。ヒト胚性幹細胞ライブラリーは幹細胞を含んでなってもよく、そのそれぞれはヒト集団内に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子についてヘミ接合性、ホモ接合性、またはヌル欠損であり、前記幹細胞ライブラリーの各メンバーは、ライブラリのー残りのメンバーに対して、ＭＨＣ対立遺伝子の異なる組について、ヘミ接合性、ホモ接合性、またはヌル欠損である。ヒト胚性幹細胞ライブラリーは、ヒト集団内に存在する全てのＭＨＣ対立遺伝子について、ヘミ接合性、ホモ接合性、またはヌル欠損である、幹細胞を含んでなってもよい。本開示の文脈で、１つまたは複数の組織適合性抗原遺伝子についてホモ接合性である幹細胞としては、１つまたは複数の（およびいくつかの実施形態では全ての）このような遺伝子についてヌル欠損である細胞が挙げられる。遺伝子座のヌル欠損は、遺伝子がその位置で欠損している（すなわちその遺伝子の対立遺伝子がどちらも欠失しまたは不活性化されている）ことを意味する。

ｈＥＳ細胞は、細胞のＭＨＣ複合体中の姉妹染色体の対立遺伝子の１つに、改変を含んでなってもよい。遺伝子標的化などの遺伝子改変を作成する多様な方法を使用して、ＭＨＣ複合体中の遺伝子を改変してもよい。さらに姉妹染色体上に同一対立遺伝子が存在するように、細胞中のＭＨＣ複合体の改質対立遺伝子を引き続いて改変して、ホモ接合性にしてもよい。ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）などの方法を利用して、細胞を遺伝子操作し、ＭＨＣ複合体中でホモ接合性対立遺伝子を有するようにしてもよい。例えば、親対立遺伝子からのＭＨＣ遺伝子の組の１つまたは複数の遺伝子を標的化して、ヘミ接合性細胞を作成し得る。他のＭＨＣ遺伝子の組は、遺伝子標的化またはＬＯＨによって除去して、ヌル系統を作成し得る。このヌル系統を胎芽細胞系統としてさらに利用して、その中に、ＨＬＡ遺伝子アレイまたは個々の遺伝子を入れて、その他の点では均一の遺伝的背景があるヘミ接合性またはホモ接合性バンクを作成し得る。全てのＭＨＣ遺伝子に対してヌル欠損の幹細胞は、例えば遺伝子標的化および／またはヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）などの当該技術分野で公知の標準法によって生成されてもよい。例えば米国特許出願第２００４／００９１９３６号明細書、米国特許出願第２００３／０２１７３７４号明細書、および米国特許出願第２００３／０２３２４３０号明細書、および米国仮特許出願第６０／７２９，１７３号明細書を参照されたい。

したがって本開示は、ＭＨＣ複雑度が低下した、ＲＰＥ細胞のライブラリーをはじめとする、ＲＰＥ細胞を得る方法に関する。患者マッチングに関わる困難さを排除することもあるので、ＭＨＣ複雑度が低下したＲＰＥ細胞を使用して、治療用途で利用できる細胞供給を増大させてもよい。このような細胞は、ＭＨＣ複合体の遺伝子について、ヘミ接合性またはホモ接合性であるように改変された幹細胞に由来してもよい。

本開示は、数種の系統のＥＳ細胞が選択されてＲＰＥ細胞に分化される、ＲＰＥ細胞（
および／またはＲＰＥ系統細胞）のライブラリーもまた提供する。細胞ベースの治療法を必要とする患者のために、これらのＲＰＥ細胞および／またはＲＰＥ系統細胞を使用してもよい。本開示はまた、そのそれぞれがヒト集団内に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子についてヘミ接合性、ホモ接合性、またはヌル欠損であるＲＰＥ細胞ライブラリーも提供し、前記ＲＰＥ細胞ライブラリーの各メンバーは、ライブラリーの残りのメンバーに対して、ＭＨＣ対立遺伝子の異なる組について、ヘミ接合性、ホモ接合性、またはヌル欠損である。本開示は、ヒト集団内の全てのＭＨＣ対立遺伝子について、ヘミ接合性、ホモ接合性、またはヌル欠損である、ヒトＲＰＥ細胞ライブラリーを提供する。

培地
本明細書に記載される方法では、ウイルス、細菌、または真核生物細胞培養用培地などの細胞培養を支持できるあらゆる培地を使用してもよい。例えば培地は、ＥＢ－ＤＭまたはＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭであってもよい。さらなる例として、培地は、高栄養タンパク質非含有培地または高栄養低タンパク質培地であってもよい。さらに、培地はまた、アルブミン、Ｂ－２７補給剤、エタノールアミン、フェチュイン、グルタミン、インスリン、ペプトン、精製リポタンパク質、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、またはビタミンＥなどの栄養成分を含んでもよい。例えば栄養素に富む低タンパク質培地は、培養中で細胞成長を支持して、低タンパク質含有量を有する、あらゆる培地であってもよい。例えば栄養素に富む低タンパク質培地としては、ＭＤＢＫ－ＧＭ、ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ、ＶＰ－ＳＦＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ培地１６４０、ＩＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ－１２栄養素混合物、Ｆ－１０栄養素混合物ＥＧＭ－２、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地、培地１９９９、またはＭＤＢＫ－ＭＭが挙げられるが、これに限定されるものではない。表１もまた参照されたい。さらに栄養素に富む低タンパク質培地は、胚性幹細胞の成長または維持を支持しない培地であってもよい。

低タンパク質培地が使用される場合、培地は、少なくとも約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．２０％、０．１０％、０．０５％、０．０２％、０．０１６％、０．０１５％、または０．０１０％の動物由来タンパク質を含有する成分を含有してもよい（例えば１０％のＦＢＳ）。低タンパク質培地中に存在するタンパク質百分率への言及は、培地のみに言及して、例えばＢ－２７サプリメント中に存在するタンパク質を考慮していないことに留意されたい。したがって細胞が、低タンパク質培地およびＢ－２７補給剤中で培養される場合、培地中に存在するタンパク質百分率は、より高くあってもよいものと理解される。

低タンパク質またはタンパク質非含有培地には、無血清Ｂ－２７補給剤が添加される。Ｂ２７補給剤の栄養成分は、ビオチン、Ｌ－カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ＋ガラクトース、還元グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、酢酸レチニル、セレン、トリヨード－ｌ－サイロニン（ｔｒｉｏｄｏ－１－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）（Ｔ３）、ＤＬ－αトコフェロール（ビタミンＥ）、ＤＬ－α酢酸トコフェロール、ウシ血清アルブミン、カタラーゼ、インスリン、超酸化物ジスムターゼ、およびトランスフェリンを含んでなってもよい。細胞が、Ｂ－２７が補給されたタンパク質非含有培地中で培養される場合、タンパク質非含有は、Ｂ－２７添加前の培地に言及する。

本明細書に記載される成長因子、薬剤、およびその他の補給剤は、培地に含めるために、単独で、またはその他の因子、薬剤、または補給剤との組み合わせで使用してもよい。因子、薬剤、および補給剤は、即座に、または細胞培養中または後のあらゆる時点で、培地に添加してもよい。

培地はまた、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、血清（例えばウシ胎仔血清）などの補給剤；または成長基材（例えばウシ角膜上皮からの細胞外基質、マトリゲル（商標）（基底膜基材）、またはゼラチン）；フィブロネクチン；フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンジン、アグリカン、およびシンデカン（ｓｙｎｄｅｚａｎ）のタンパク質分解断片も含有してもよい。

培地には、１つまたは複数の因子または薬剤が補給されてもよい。

使用してもよい成長因子としては、例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、および組換えインスリン様成長因子が挙げられる。本開示で使用してもよい成長因子としてはまた、６Ｃｋｉｎｅ（組換え体）、アクチビンＡ、αインターフェロン、αインターフェロン、アンフィレグリン、アンジオゲニン、β内皮細胞成長因子、βセルリン、βインターフェロン、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン－１、毛様体神経栄養因子、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質－１、内皮細胞成長補給剤、エオタキシン、表皮成長因子、上皮好中球活性化ペプチド－７８、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｔｅｎ）、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、線維芽細胞成長因子（酸性／塩基性ヘパリン安定化組換え体）、ＦＬＴ－３／ＦＬＫ－２リガンド（ＦＬＴ－３リガンド）、γインターフェロン、グリア細胞系由来神経栄養因子、Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＲＯ－α／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ－Ｂ、ＧＲＯ－γ、ＨＣＣ－１、ヘパリン結合表皮成長因子様成長因子、肝実質細胞成長因子、ヘレグリン－α（ＥＧＦドメイン）、インスリン成長因子結合タンパク質－１、インスリン様成長因子結合タンパク質－１／ＩＧＦ－１複合体、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子ＩＩ、２．５Ｓ神経成長因子（ＮＧＦ）、７Ｓ－ＮＧＦ、マクロファージ炎症性タンパク質１β、マクロファージ炎症性タンパク質２、マクロファージ炎症性タンパク質３α、マクロファージ炎症性タンパク質３β、単球走化性タンパク質１、単球走化性タンパク質２、単球走化性タンパク質３、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、ＮＧＦ－β（ヒトまたはラット組換え体）、オンコスタチンＭ（ヒトまたはマウス組換え体）、下垂体抽出物、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、プレイオトロフィン、ランテス、幹細胞因子、間質細胞由来因子１Ｂ／プレＢ細胞成長刺激因子、トロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｅｔｉｎ）、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、腫瘍壊死因子（αおよびβ）、および血管内皮成長因子も挙げられる。

本開示によって使用してもよい薬剤としては、インターフェロンα、インターフェロンα Ａ／Ｄ、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０、インターロイキン－１、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン－５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン－１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１５、インターロイキン－１７、ケラチノサイト増殖因子、レプチン、白血病阻害因子、マクロファージコロニー刺激因子、およびマクロファージ炎症性タンパク質１αなどのサイトカインが挙げられる。

培地には、１７Ｂ－エストラジオール、副腎皮質刺激ホルモン、アドレノメデュリン、αメラノサイト刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコステロイド結合グロブリン、コルチコステロン、デキサメタゾン、エストリオール、濾胞刺激ホルモン、ガストリン１、グルカゴン、ゴナドトロピン、ヒドロコルチゾン、インスリン、インスリン様成長因子結合タンパク質、Ｌ－３，３’，５’－トリヨードチロニン、Ｌ－３，３’，５’－トリヨードチロニン、レプチン、黄体形成（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン、Ｌ－チ
ロキシン、メラトニン、ＭＺ－４、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、ＰＥＣ－６０、下垂体成長ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、セクレチン、性ホルモン結合グロブリン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、チロキシン結合グロブリン、およびバソプレシンをはじめとするが、これに限定されるものではない、ホルモンおよびホルモン拮抗薬が補給されてもよい。培地には、抗低密度リポタンパク質受容体抗体、抗プロゲステロン受容体、内部抗体、抗αインターフェロン受容体鎖２抗体、抗ｃ－ｃケモカイン受容体１抗体、抗ＣＤ１１８抗体、抗ＣＤ１１９抗体、抗コロニー刺激因子－１抗体、抗ＣＳＦ－１受容体／ｃ－ｆｉｎｓ抗体、抗表皮成長因子（ＡＢ－３）抗体、抗表皮成長因子受容体抗体、抗表皮成長因子受容体、ホスホ－特異的抗体、抗表皮成長因子（ＡＢ－１）抗体、抗エリスロポエチン受容体抗体、抗エストロゲン受容体抗体、抗エストロゲン受容体、Ｃ末端抗体、抗エストロゲン受容体Ｂ抗体、抗線維芽細胞成長因子受容体抗体、抗線維芽細胞成長因子、塩基性抗体、抗γインターフェロン受容体鎖抗体、抗γインターフェロンヒト組換え抗体、抗ＧＦＲ α－１Ｃ末端抗体、抗ＧＦＲ α－２Ｃ末端抗体、抗顆粒球コロニー刺激因子（ＡＢ－１）抗体、抗顆粒球コロニー刺激因子受容体抗体、抗インスリン受容体抗体、抗インスリン様成長因子－１受容体抗体、抗インターロイキン－６ヒト組換え抗体、抗インターロイキン－１ヒト組換え抗体、抗インターロイキン－２ヒト組換え抗体、抗レプチンマウス組換え抗体、抗神経成長因子受容体抗体、抗ｐ６０、ニワトリ抗体、抗副甲状腺ホルモン様タンパク質抗体、抗血小板由来成長因子受容体抗体、抗血小板由来成長因子受容体Ｂ抗体、抗血小板由来成長因子α抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗レチノイン酸受容体α抗体、抗甲状腺ホルモン核内受容体抗体、抗甲状腺ホルモン核内受容体α １／Ｂｉ抗体、抗トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｓｆｅｒｉｎ）受容体／ＣＤ７１抗体、抗形質転換成長因子α抗体、抗形質転換成長因子Ｂ３抗体、抗腫瘍（ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ）壊死因子α抗体、および抗血管内皮成長因子抗体をはじめとするが、これに限定されるものではない、様々な因子に対する抗体が補給されてもよい。

本明細書に記載される方法で使用するのに潜在的に適する例示的な成長培地は、表１に列挙される。

治療法
本明細書に記載される方法によって製造されたＲＰＥ細胞およびＲＰＥ細胞を含んでな
る医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）は、細胞ベースの治療法のために使用してもよい。本開示は、ＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品の有効量を投与するステップを含んでなる、網膜変性を伴う病状を治療する方法を提供し、ＲＰＥ細胞は、生体外多能性幹細胞に由来する。網膜変性を伴う病状としては、例えば、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、網膜萎縮、網膜離脱、網膜異形成、色素性網膜炎、色素線条（ナップ線条またはナップ線とも称され、ブルッフ膜の小さな切断によって特徴付けられ、それは石灰化してひび割れる）、および近視性黄斑変性（変性近視とも称される）が挙げられる。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞はまた、加齢による黄斑変性（乾燥型または湿潤型）、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底ジストロフィー、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、マラチアレベンティニーズ、ドイン蜂巣状脈絡膜症、優性ドルーゼン、および放射状ドルーゼンをはじめとするが、これに限定されるものではない、黄斑変性を治療する方法において使用してもよい。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞はまた、パーキンソン病（ＰＤ）を治療する方法で使用してもよい。

先行文献に記載される細胞移植に共通する特徴は、移植片の低生存率であり、例えば多数の細胞移植研究において、移植に続いて即座に（例えば最初の１週間以内に）、細胞が失われる傾向がある。この細胞の損失は、移植細胞の拒絶反応ではなく、むしろ移植部位において、一定割合の細胞が保持され得ないことに起因するようである。この細胞保持の欠如は、九分通り、細胞の下層構造への付着の失敗、十分な栄養素の欠如、または移植部位における物理的ストレスなどのいくつかの要素に起因する。この最初の細胞数低下に続いて、移植後の様々な時点における細胞生存は、研究毎に大幅に変動し得る。したがっていくつかの研究は、数の着実な低下を示すが、その他は、移植細胞が安定数に到達し得る結果を示す。しかし移植成功の考察における重要な要素は、細胞移植に続いて生き残った移植片がある受容者の百分率である。

以前の製剤とは対照的に、本明細書に記載される製剤中のＲＰＥ細胞は、移植に続いて長期間生存してもよい。例えばＲＰＥ細胞は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間生存してもよい。さらにＲＰＥ細胞は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間；少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヶ月；または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年間生存してもよい。さらにＲＰＥ細胞は、移植受容者（ｒｅｃｅｉｐｔ）の生存期間全体にわたり、生存してもよい。さらに本明細書に記載されるＲＰＥ細胞の受容者（ｒｅｃｅｉｐｔｓ）の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、移植ＲＰＥ細胞の生存を示してもよい。さらに本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、移植受容者（ｒｅｃｅｉｐｔ）のＲＰＥ層中に成功裏に組み込まれて、半連続細胞系を形成し、主要ＲＰＥ分子マーカー（例えばＲＰＥ６５およびベストロフィン）の発現を維持してもよい。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞はまた、ブルッフ膜に付着して、移植受容者（ｒｅｃｅｉｐｔ）中で、安定したＲＰＥ層を形成してもよい。また本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、ＥＳ細胞を実質的に含まず、移植受容者（ｒｅｃｅｉｐｔ）は、移植部位において異常増殖または腫瘍形成を示さない。

網膜変性と関連付けられている病状に罹患している患者を治療する方法は、（例えば本開示の医薬品を含んでなる基材の眼内注入または挿入によって）本開示の組成物を局所的に投与するステップを含んでなってもよい。本開示の医薬品眼内投与としては、例えば硝子体中、経角膜、結膜下、網膜下、黄斑下（例えば経中心窩黄斑下注入による）、強膜近傍、後部強膜、および眼のテノン嚢下部分への送達が挙げられる。例えば米国特許第７，７９４，７０４号明細書；米国特許第７，７９５，０２５号明細書；６，９４３，１４５；および米国特許第６，９４３，１５３号明細書を参照されたい。

本開示はまた、複雑度が低下した胚性幹細胞に由来するヒトＲＰＥ細胞を、患者に投与する方法も提供する。この方法は、（ａ）ヒトＲＰＥ細胞の投与を伴う治療が必要な患者を同定するステップと；（ｂ）患者の細胞表面に発現されるＭＨＣタンパク質を同定するステップと；（ｃ）本開示のＲＰＥ細胞を生成する方法によって作成された、ＭＨＣ複雑度が低下したヒトＲＰＥ細胞のライブラリーを提供するステップと；（ｄ）この患者の細胞上のＭＨＣタンパク質に一致するＲＰＥ細胞を、ライブラリーから選択するステップと；（ｅ）ステップ（ｄ）のいずれかの細胞を前記患者に投与するステップとを含んでなってもよい。この方法は、例えば、病院、クリニック、診療所、およびその他の医療施設などの、地域センターで行われてもよい。さらに患者に一致するとして選択されたＲＰＥ細胞は、保存細胞数が少ない場合、患者の治療に先だって増殖させてもよい。

ＲＰＥ細胞は、移植に先だって、無培養ＲＰＥ細胞またはその他のＲＰＥ細胞製剤との比較で、αインテグリンサブユニット１～６または９の発現を増大させる条件下で培養してもよい。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、培養して、αインテグリンサブユニット１、２、３、４、５、６、または９の発現レベルを高めてもよい。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、αインテグリンサブユニット１～６の発現を促進する条件下で、培養してもよい。例えばＲＰＥ細胞は、マンガンおよび活性化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＴＳ２／１６をはじめとするが、これに限定されるものではない、インテグリン活性化剤と共に培養してもよい。Ａｆｓｈａｒｉ，ｅｔａｌ．Ｂｒａｉｎ（２０１０）１３３（２）：４４８－４６４を参照されたい。

特定の病状、病状の重症度、および患者の全体的な健康に基づいて、特定の治療計画、投与経路、および合併療法を調整してもよい。ＲＰＥ細胞を含んでなる製剤の投与は、症状の重症度を低下させ、および／または患者の病状のさらなる変性を予防するのに効果的であってもよい。例えばＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品の投与は、患者の視力を改善してもよい。さらに特定の実施形態では、ＲＰＥ細胞の投与は、あらゆる失明またはその他の症状を完全に回復させるのに効果的であってもよい。さらにＲＰＥ細胞の投与が、内在性ＲＰＥ層損傷の症状を治療してもよい。

ＲＰＥ細胞医薬品
ＲＰＥ細胞は、薬学的に許容できる担体と共に調合してもよい。例えばＲＰＥ細胞は、単独で、または製剤処方成分として投与してもよい。被験化合物は、医薬に使用するための任意の都合良い方法での投与のために、調合してもよい。投与に適する医薬品は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な無菌等張水性または非水性溶液（例えば平衡塩類溶液（ＢＳＳ））、分散体、懸濁液またはエマルジョン、または使用直前に、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、溶質または懸濁または増粘剤を含有してもよい無菌の注入可能な溶液または分散体に戻されてもよい無菌粉末と組み合わされた、ＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。例示的な医薬品は、ＡＬＣＯＮ（登録商標）ＢＳＳＰＬＵＳ（１ｍＬあたり塩化ナトリウム７．１４ｍｇ、塩化カリウム０．３８ｍｇ、塩化カルシウム二水和物０．１５４ｍｇ、塩化マグネシウム六水和物０．２ｍｇ、二塩基性リン酸ナトリウム０．４２ｍｇ、炭酸水素ナトリウム２．１ｍｇ、デキストロース０．９２ｍｇ、グルタチオンジスルフィド（酸化型グルタチオン）０．１８４ｍｇ、（ｐＨをおよそ７．４に調節する）塩酸および／または水酸化ナトリウムを含有する平衡塩類水溶液）と組み合わされたＲＰＥ細胞を含んでなる。

本開示の例示的な組成物は、発熱性物質なし、または本質的に発熱性物質なし、および無菌など、ヒト患者の治療で使用するのに適する製剤であってもよい。投与時に、本開示で使用される医薬品は、発熱性物質なしで無菌の生理学的に許容できる形態であってもよい。本明細書に記載される方法で使用されるＲＰＥ細胞を含んでなる製剤は、懸濁液、ゲ
ル、コロイド、スラリー、または混合物中で移植されてもよい。さらに製剤は、望ましくは、網膜または脈絡膜損傷部位への送達のために、粘稠な形態で硝子体液中にカプセル化されまたは注入されてもよい。また注入の時点で、冷凍保存ＲＰＥ細胞を市販の平衡塩類溶液に再懸濁して、網膜下注入による投与に所望される浸透圧と濃度を達成してもよい。製剤は、疾患によって完全に消失していない、網膜黄斑中心周囲の領域に投与してもよく、それは投与される細胞の付着および／または生存を促進することもある。

本開示の組成物は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ’ｓＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅＹ－２７６３２などのｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含んでもよい。例えば例示的な組成物としては、患者への投与後に、ＲＰＥ生存および／または生着を促進するのに十分な量で存在してもよい、ＲＰＥおよびＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。

本開示のＲＰＥ細胞は、眼内注入によって、薬学的に許容可能な点眼剤中で送達されてもよい。例えば硝子体内注入によって製剤を投与する場合、最小化された容積が送達されてもよいように、溶液を濃縮してもよい。注入のための濃度は、本明細書に記載される要素に応じて、効果的で無毒な任意選択の量であってもよい。患者を治療するためのＲＰＥ細胞医薬品は、少なくとも約１０^４細胞／ｍＬの用量で調合されてもよい。患者を治療するためのＲＰＥ細胞製剤は、少なくとも約１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、または１０^１０個々のＲＰＥ細胞／ｍＬの用量で調合される。例えばＲＰＥ細胞は、薬学的に許容できる担体または賦形剤中で調合されてもよい。

本明細書に記載されるＲＰＥ細胞医薬品は、少なくとも約１，０００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；または９，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞医薬品は、少なくとも約１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞医薬品は、少なくとも約１×１０^２～１×１０^３、１×１０^２～１×１０^４、１×１０^４～１×１０^５、または１×１０^３～１×１０^６個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。ＲＰＥ細胞医薬品は、少なくとも約１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、または２００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。例えばＲＰＥ細胞医薬品は、少なくとも約５０～２００μＬの容積中に、少なくとも約２０，０００～２００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。さらにＲＰＥ細胞医薬品は、１５０μＬの容積中に約５０，０００個のＲＰＥ細胞、１５０μＬの容積中に約２００，０００個のＲＰＥ細胞、または少なくとも約１５０μＬ容積中に少なくとも約１８０，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。

前述の医薬品および組成物では、生細胞を計数して非生細胞を除外することで、ＲＰＥ細胞数またはＲＰＥ細胞濃度を判定してもよい。例えば生存不能ＲＰＥは、生体用染料（トリパンブルーなど）を排除できないことで、または機能アッセイ（培養基質への付着能力、食作用など）を使用して、検出してもよい。さらにＲＰＥ細胞数またはＲＰＥ細胞濃
度は、１つまたは複数のＲＰＥ細胞マーカーを発現した細胞を計数して、および／またはＲＰＥ以外の細胞型を示す１つまたは複数のマーカーを発現する細胞を除外することで判定してもよい。

ＲＰＥは、例えば、前眼房、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜、網膜、強膜、脈絡膜上腔（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｉｄａｌｓｐａｃｅ）、結膜、結膜下腔、強膜外隙、角膜内隙、角膜上隙、毛様体扁平部、外科的に誘発された無血管領域、または網膜黄斑などの眼の罹患領域に、細胞を侵入させるのに十分な時間にわたり、製剤が眼球表面との接触を維持するように、薬学的に許容可能な眼科用ビヒクル中での送達するために調合されてもよい。

ＲＰＥ細胞は、細胞シートに含有されてもよい。例えばＲＰＥ細胞を含んでなる細胞シートは、例えば、培養温度において、その上に細胞が付着して増殖し、次に（例えば下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）未満への冷却による、温度移行に際して、表面特性が変化し、培養された細胞シートの遊離を引き起こす、熱応答性ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）移植表面のような熱応答性ポリマーのなどの、それから損傷のない細胞シートを遊離し得る基質上で、ＲＰＥ細胞を培養して、調製してもよい。（その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書に援用する、ｄａＳｉｌｖａｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７Ｄｅｃ；２５（１２）：５７７－８３；Ｈｓｉｕｅｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００６Ｆｅｂ１５；８１（３）：４７３－６；Ｉｄｅ，Ｔ．ｅｔａｌ．（２００６）；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２７，６０７－６１４，Ｓｕｍｉｄｅ，Ｔ．ｅｔａｌ．（２００５），ＦＡＳＥＢＪ．２０，３９２－３９４；Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔａｌ．（２００４），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７７，３７９－３８５；およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔａｌ．（２００４），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５１，１１８７－１１９６を参照されたい）。細胞シートは、シートを宿主生物に移植した際に、生体内で溶解してもよい基質などの移植に適する基質に付着していてもよく、例えば細胞を移植に適する基質上で培養することで、または細胞を（熱応答性ポリマーなどの）別の基質から移植に適する基質上に遊離させることで調製される。潜在的に移植に適する例示的な基質は、ゼラチンを含んでなってもよい（Ｈｓｉｕｅｅｔａｌ．、前出を参照されたい）。移植に適してもよい代案の基質としては、線維素ベースの基材などが挙げられる。細胞シートは、網膜変性疾患を予防または治療する薬剤の製造で使用されてもよい。ＲＰＥ細胞シートは、それを必要とする対象の眼に装入するために調合されてもよい。例えば細胞シートは、ＲＰＥ細胞シートを移植する中心窩下膜切除術によって、それを必要とする眼に装入されてもよく、または中心窩下膜切除術後の移植用薬剤を製造するために使用されてもよい。

本明細書に記載される方法によって投与される製剤の容積は、投与様式、ＲＰＥ細胞数、患者の年齢と体重、および治療される疾患のタイプと重症度などの要因に左右されてもよい。注入によって投与される場合、本開示のＲＰＥ細胞の医薬品の容積は、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、４、または５ｍＬからであってもよい。容積は、少なくとも約１～２ｍＬであってもよい。例えば注入によって投与される場合、本開示のＲＰＥ細胞医薬品の容積は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７，６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、
１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１００、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００μＬ（マイクロリットル）であってもよい。例えば本開示の製剤の容積は、少なくとも約１０～５０、２０～５０、２５～５０、または１～２００μＬからであってもよい。本開示の製剤の容積は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μＬ以上であってもよい。

例えば製剤は、１μＬあたり少なくとも約１×１０^３、２×１０^３、３×１０^３、４×１０^３、５×１０^３、６×１０^３、７×１０^３、８×１０^３、９×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、または９×１０^４個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。製剤は、例えば、５０μＬあたり１００，０００個のＲＰＥ細胞または９０μＬあたり１８０，０００個のＲＰＥ細胞など、１μＬあたり２０００個のＲＰＥ細胞を含んでなってもよい。

網膜変性を治療する方法は、免疫抑制剤を投与するステップをさらに含んでなってもよい。使用してもよい免疫抑制剤としては、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、ＢＡＳＩＬＩＸＩＭＡＢ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、ＤＡＣＬＩＺＵＭＡＢ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、リツキシマブ（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、およびタクロリムスが挙げられるが、これに限定されるものではない。免疫抑制剤は、少なくとも約１、２、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇで投与されてもよい。免疫抑制剤を使用する場合、それらは全身的にまたは局所的に投与してもよく、それらはＲＰＥ細胞投与前に、それと同時に、またはそれに続いて投与してもよい免疫抑制治療法は、ＲＰＥ細胞の投与に続いて、数週間、数ヶ月間、数年間、または無期限に継続してもよい。例えばＲＰＥ細胞の投与に続いて、５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンを患者に６週間にわたり投与してもよい。

網膜変性の治療法は、ＲＰＥ細胞の単回用量の投与を含んでなってもよい。また本明細書に記載される治療法は、ＲＰＥ細胞が一定期間にわたり、複数回投与される治療過程を含んでなってもよい。例示的な治療過程は、毎週、隔週、毎月、年４回、年２回、または毎年の治療を含んでなってもよい。代案としては、治療は段階的に進行してもよく、それによって複数回投与が最初に施され（例えば最初の１週間は毎日の投与）、引き続いてより少量で頻度の低い投与が必要とされる。

眼内注入によって投与される場合、ＲＰＥ細胞は、患者の生涯を通じて、周期的に１回または複数回送達されてもよい。例えばＲＰＥ細胞は、年に１回、６～１２ヶ月毎に１回、３～６ヶ月毎に１回、１～３ヶ月毎に１回、または１～４週間毎に１回、送達されてもよい。代案としては、特定の病状または障害では、より頻繁な投与が望ましいことがある。移植片または装置によって投与される場合、治療される特定の患者および疾患または病状の必要に応じて、ＲＰＥ細胞は、１回、または患者の生涯を通じて周期的に１回または複数回、投与されてもよい。経時的に変化する薬剤投与計画も、同様に検討される。例え
ば最初は、より頻繁な治療が必要とされることもある（例えば毎日のまたは毎週の治療）。時間経過と共に、患者の病状改善するにつれて、より頻度の低い治療が必要になり、あるいはさらなる治療が不要になることすらある。

本明細書に記載される方法は、対象において、網膜電図応答、視運動明瞭度閾値、または輝度閾値を測定することで、治療または予防の効能をモニターするステップをさらに含んでなってもよい。方法はまた、眼の中の細胞の免疫原性または細胞移動をモニターすることで、治療または予防の効能をモニターするステップを含んでなってもよい。

ＲＰＥ細胞は、網膜変性を治療する薬剤の製造で使用してもよい。本開示はまた、失明の治療における、ＲＰＥ細胞を含んでなる製剤の使用もを包含する。例えばヒトＲＰＥ細胞を含んでなる製剤を使用して、光受容体損傷および失明をもたらす、糖尿病性網膜症、（例えば湿潤型加齢黄斑変性および乾燥型加齢黄斑変性などの加齢黄斑変性をはじめとする）黄斑変性、色素性網膜炎、およびシュタルガルト病（黄色斑眼底）などのいくつかの視覚変性疾患と関連付けられている、網膜変性を治療してもよい。製剤は、少なくとも約５，０００～５００，０００個のＲＰＥ細胞（例えば１００，００個のＲＰＥ細胞）を含んでなってもよく、それを網膜に投与して、光受容体損傷および失明をもたらす、糖尿病性網膜症、（加齢黄斑変性をはじめとする）黄斑変性、色素性網膜炎、およびシュタルガルト病（黄色斑眼底）などのいくつかの視覚変性疾患と関連付けられている、網膜変性を治療してもよい。

本明細書で提供されるＲＰＥ細胞は、ヒトＲＰＥ細胞であってもよい。しかしヒト細胞は、ヒト患者と同様に、動物モデルまたは動物患者でも使用されてよいことに留意されたい。例えばヒト細胞は、網膜変性のマウス、ラット、ネコ、イヌ、または非ヒト霊長類モデル中で試験してもよい。さらに獣医学などにおいて、ヒト細胞を治療的に使用して、それを必要とする動物を治療してもよい。

投与様式
医薬品は、投与経路によって薬学的に許容できる担体中で調合されてもよい。例えば製剤は眼の網膜下腔に投与されるように、調合されてもよい。ＲＰＥ細胞を含んでなる製剤は、同一患者の片方または双方の眼に投与してもよい。双方の眼への投与は、逐次または同時であってもよい。例えばＲＰＥ細胞を含んでなる製剤は、懸濁液、溶液、スラリー、ゲル、またはコロイドとして調合されてもよい。

本開示のＲＰＥ細胞は、注入（例えば硝子体内注入）によって、または（例えば移植片などの）装置または移植片の一部として、局所的に投与してもよい。上述のようにＲＰＥ細胞は、水性担体、ゲル、基材、ポリマーなどに含有されてもよい、個々の細胞、塊、クラスター、シート、またはそれらのあらゆる組み合わせなどの様々な可能な配置を有してもよい。例えば製剤は、眼の網膜下腔への注入によって投与してもよい。また製剤は、経角膜投与してもよい。例えば本開示の細胞は、硝子体切除術を使用して、網膜下腔内に移植してもよい。さらに注入の時点で、ＲＰＥ細胞を市販の平衡塩類溶液（例えばＡｌｃｏｎＢＳＳ添加（登録商標））に再懸濁して、網膜下注入による投与に所望される浸透圧と濃度を達成してもよい。

任意選択的に、ＲＰＥ細胞は、３ポート経毛様体扁平部硝子体切除などの経毛様体扁平部硝子体切除術を含んでなる方法によって投与されてもよい。方法としては、小規模な網膜切開が挙げられる。細胞投与前に、例えば生理食塩水または別の適切な流体の注入によって、網膜下ブレブを形成してもよく（「事前ブレブ」）、次にそれを細胞投与前に除去してもよい。しかし細胞は、事前ブレブ形成なしに投与してもよい。細胞は、側頭窩位置のブレブ中で投与してもよい。例えばブレブは、任意選択的に、アーケード血管内で拡張
させてもよい。ブレブは、網膜黄斑中心窩を剥離させないように配置されてもよい。

投与方法に応じて、ＲＰＥ細胞は、緩衝電解質平衡水溶液；潤滑ポリマー、鉱物油またはペトロラタムベースの軟膏、その他の油、リポソーム、シクロデキストリン（ｃｙｌｃｏｄｅｘｔｒｉｎｓ）、持続放出ポリマーまたはゲルを添加した緩衝電解質平衡水溶液に、添加されてもよい。

ＲＰＥ細胞のために使用される基材
本明細書に記載される方法は、移植片または装置として、本開示のＲＰＥ細胞を投与するステップを含んでなってもよい。特定の実施形態では、装置は、生分解性ポリマー基材に分散した活性薬剤を含んでなる、眼の疾患治療のための生体内分解性移植片であり、少なくとも約７５％の活性薬剤の粒子は、約１０μｍ未満の直径を有する。生体内分解性移植片は、眼球領域への移植用のサイズにされていてもよい。眼球領域は、前眼房、後眼房、硝子体腔、脈絡膜、脈絡膜上腔、結膜、結膜下腔、強膜外隙、角膜内隙、角膜上隙、強膜、毛様体扁平部、外科的に誘発された無血管領域、網膜黄斑、および網膜のいずれか１つまたは複数であってもよい。生分解性ポリマーは、例えば、ポリ（乳酸－コ－グリコール）酸（ＰＬＧＡ）共重合体、生分解性ポリ（ＤＬ－乳酸‐コ‐グリコール酸）フィルム、またはＰＬＬＡ／ＰＬＧＡポリマー基質であってもよい。ポリマー中のグリコール酸モノマーの比率は、約２５／７５、４０／６０、５０／５０、６０／４０、７５／２５、より好ましくは約５０／５０重量パーセントである。ＰＬＧＡ共重合体は、生体内分解性移植片の約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０～約９０重量％であってもよい。ＰＬＧＡ共重合体は、生体内分解性移植片の約３０～約５０重量％、好ましくは約４０重量％であってもよい。ＲＰＥ細胞は、ポリ乳酸、ポリ（乳酸‐コ‐グリコール酸）、５０：５０ＰＤＬＧＡ、８５：１５ＰＤＬＧＡ、およびＩＮＩＯＮＧＴＲ（登録商標）生分解性膜（生体適合性ポリマー混合物）などの生体適合性ポリマーと併せて移植してもよい。米国特許第６，３３１，３１３号明細書；米国特許第７，４６２，４７１号明細書；および米国特許第７，６２５，５８２号明細書を参照されたい。Ｈｕｔａｌａ，ｅｔａｌ．（２００７）”Ｉｎｖｉｔｒｏｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆｄｅｇｒａｄａｂｌｅｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓｉｎｃｅｌｌｌｉｎｅｃｕｌｔｕｒｅｓｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｏｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｓ：Ｄｉｒｅｃｔｃｏｎｔａｃｔｓｔｕｄｉｅｓ．”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈ８３Ａ（２）：４０７－４１３；Ｌｕ，ｅｔａｌ．（１９９８）ＪＢｉｏｍａｔｅｒＳｃｉＰｏｌｙｍＥｄ９：１１８７－２０５；およびＴｏｍｉｔａ，ｅｔａｌ．（２００５）ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２３：１５７９－８８もまた参照されたい。

別の態様では、本開示は、膜上に位置するＲＰＥを含んでなる組成物と、同組成物を網膜の疾病、疾患、または病状の予防または治療で使用する方法とを提供する。例えば膜は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、米国特許第２０１１０２３６４６４号明細書（付与前公表）に記載される膜であってもよい。膜は実質的に非生分解性かつ多孔性で、孔はおよそ０．２μｍ～０．５μｍ径であってもよい。例えば、孔径は０．３μｍ～０．４５μｍであってもよい。非生分解性膜の使用は、それがひとたび眼の中に移植されると、身体への挿入に続いて、例えば少なくとも５年間、少なくとも１０年間、または少なくとも１５年間にわたり、細胞を支持し続けることを確実にしてもよい。

細孔密度は、１平方ｃｍあたり５×１０７および１×１０＾８個の孔などの１平方ｃｍあたりおよそ１×１０＾７～３×１０＾８個の孔であってもよい。この密度は、所望の透過レベルを可能にし、血管新生もまた可能にしてもよい。特に孔のサイズと密度は、例えば移植後に、膜の片側からもう一方の側への栄養素の移動を可能にし、膜を通じた血管新生もまた可能にしてもよい。ポリマー体は、豊富な脈絡膜床からの血管新生を受け得る。
これは眼の外部の豊富な血管床で示されているが（Ｃａｓｓｅｌｌｅｔａｌ，２００２；Ｐａｔｒｉｃｋｅｔａｌ，１９９９；Ｓａｘｅｎａｅｔａｌ１９９９，Ｐｅｔｅｒｅｔａｌ１９９８）、空隙率が十分な場合にのみ起きる（Ｍｅｎｇｅｒｅｔａｌ，１９９０）。

例えば膜の水透過率は、５０×１０＾－１０ｍｓｅｃ＾－１Ｐａ＾－１を超えてもよい具体的には、膜の水透過率は、およそ３３ｍＬ／ｍｉｎ／ｃｍ＾２であってもよい。これは８０１．２１×１０＾－１０ｍｓｅｃ＾－１Ｐａ＾－１に等しく、若年者の黄斑の死体ブルッフ膜の水透過率の８倍である。人工膜は、完全に受動的過程に依存してもよいので、この余剰透過率は、潜在的に有用である。栄養素拡散の観点から、上に重なる細胞の要求を満たせるのみならず、それは好ましくは、ＲＰＥ層の底側からの流体輸送を妨げず、さもなければＲＰＥが、ポリマー表面から剥離することもある。この予測と一致して、高齢者におけるブルッフ膜の水透過率の低下が、ＡＭＤにおける色素上皮剥離を引き起こすという仮説が立てられている（Ｂｉｒｄ＆Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９８６）。

好ましくは膜は、分解することなく、γ照射、酸化エチレン、高圧蒸気滅菌またはＵＶ滅菌によって滅菌されてもよい。

好ましくは膜は、超音波シール、高周波シールまたはインサート成形によって密封されてもよい。これは、その他の層が膜に付着できるようにして（Ｔｈｅａｌｌｏｗｓｏｔｈｅｒｌａｙｅｒｓｔｏｂｅａｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅ）、例えば製剤または被覆層を膜に付着させる。例えば膜に剛性を提供して送達を助けるために、ＰＬＧＡなどのより剛性の生分解性層を付着させたい場合があるかもしれない。代案としては、薬理作用物質または生物剤を含有する層、またはその他の細胞を支持する層を付属させてもよい。

膜は、好ましくはおよそ１１μｍの最大厚を有する。より好ましくは、膜の厚さは９μｍ～１１μｍである。膜の厚さは、栄養素を拡散させて血管新生させ、また膜を眼に容易に挿入できるように、選択し得る。

したがってＲＰＥは、細胞成長を支持する膜上に提供され、またはその上で培養されてもよく、膜は実質的に非生分解性で多孔性であり、およそ１１μｍの最大厚を有する。膜は、好ましくは実質的に平面であり、その最小寸法は、好ましくはおよそ１１μｍ未満である。その寸法中の厚さは変動してもよいが、好ましくは９μｍ～１１μｍの厚さである。

膜は、およそ１．５ｍｇ／ｃｍ＾２の最大重量を有してもよい。より好ましくは、膜の重量は、１．０ｍｇ／ｃｍ＾２～１．４ｍｇ／ｃｍ＾２である。膜の最小引張強度は、好ましくは少なくとも１００バールであり、外科手術中に適切にできるのに十分な強度を提供する。最大引張強度は、好ましくは３００バールであり、膜が外科手術中に容易に取り扱えるようにする。膜の破裂強度は、好ましくは少なくとも１０ｐｓｉである。

好ましくは、膜は親水性である。これは膜に優れた湿潤能力を与えて、細胞およびその他の望ましいコーティングの容易な付着を可能にしてもよい。

膜は、好ましくは、例えば４～８のｐＨなどの生理学的に許容されるｐＨを有する。

膜は、好ましくは少なくとも片側にコーティングを含んでなる。コーティングは、好ましくは、ラミニン、マトリゲル（ＴＭ）、コラーゲン、フィブロネクチンおよび／またはＰＬＧＡポリ（乳酸‐コ‐グリコール酸）などのタンパク質または糖タンパク質である。
コーティングはまた、コーティング成分に結合した薬理作用物質または生物剤を含んでなってもよい。例えばコーティングは、神経栄養剤、抗炎症剤、または血管新生阻害剤を含んでもよい。

特に、コーティングは、好ましくは、特にＩｇＶＡＶなどのラミニン－１またはその断片のような、ラミニンを含有する。特に、コーティングは、その他のタンパク質または糖タンパク質よりも、ラミニン－１をさらに多く含有してもよい。好ましくはコーティングは、少なくとも３０％または少なくとも４０％のラミニン－１などのラミニンを含んでなってもよい。コーティングは、膜上におよそ４０～４５μｇ／ｃｍ＾２のラミニン－１の濃度を生じるように、塗布してもよい。

したがってＲＰＥは、細胞成長を支持する膜上に提供され、またはその上で培養されてもよく、膜は、少なくとも片側がラミニン－１を含んでなるコーティングで被覆された、実質的に非生分解性で多孔性の支持層を含んでなる。

膜は、親水性ポリマーからできていてもよい。ＵＶ光でポリマーを照射することで、親水性にした疎水性ポリマーもまた使用してもよい。例示的なポリマーとしては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレートなどのポリエステル；特にポリカーボネートおよびポリシロキサンを含有するもの、およびポリエステルベースまたはポリエーテルベースのものである、ポリウレタンおよびポリ尿素ウレタン；ナイロンなどのポリアミド；Ｓｙｍｐａｔｅｘなどのポリエーテルエステル；Ｍａｋｒｏｌｏｎなどのポリカーボネート；Ｐｅｒｓｐｅｘなどのポリアクリレート；ポリ（テトラフルオロエテン）（ＰＴＦＥ）；ポリシロキサン；ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリオレフィン；およびＤｕＰｏｎｔの商標名Ｄｅｌｒｉｎの下で一般に知られているポリオキシメチレン（ＰＯＭ）が挙げられる。膜が、ポリエチレンテレフタレートまたはポリブチレンテレフタレートからできていることが特に好ましい。別の好ましい実施形態では、膜はポリエステルからできている。

膜を使用して、本開示のＲＰＥ細胞層を培養してもよい。膜は、好ましくは、膜上に細胞層を含んでなってもよい。細胞は、膜および細胞の目的の用途に従って選択された、あらゆる細胞であってもよい。

膜および細胞層は、好ましくは少なくとも３ｍｍ×５ｍｍの長さと幅である。好ましくは、膜および細胞層は、少なくとも４ｍｍ×６ｍｍである。

膜および細胞層は、例えば、加齢による黄斑変性、網膜裂孔、黄斑ジストロフィー（ｍａｃｕｌａｒｄｉｓｔｒｏｐｈｙ）、コロイデレミア（ｃｈｏｒｏｉｄｅｍｉａ）、レーバー先天黒内障（ＬｅｂｅｒＣｏｎｇｅｎｉｔａｌＡｍａｒｏｓｉｓ）、シュタルガルト病、およびその他の網膜の疾患または病状の治療において、それを必要とする患者の眼に移植してもよい。

スクリーニングアッセイ
本開示は、ＲＰＥ細胞成熟度を調節する薬剤をスクリーニングして、同定する方法を提供する。例えばヒトＥＳ細胞から分化したＲＰＥ細胞を使用して、ＲＰＥの成熟を促進する薬剤をスクリーニングしてもよい。同定された薬剤は、治療計画の一部として、単独で、またはＲＰＥ細胞との組み合わせで使用してもよい。代案としては、同定された薬剤は、生体外で分化したＲＰＥ細胞の生存を改善する培養方法の一部として使用してもよい。

ＲＰＥ細胞は、製薬、化学、またはバイオ企業、病院、または学術または研究機関などの状況における研究ツールとして使用してもよい。このような使用としては、例えば、生
体外または生体内のＲＰＥ生存を促進するのに使用してもよい、またはＲＰＥの成熟、生存、および／または生着を促進するのに使用してもよい薬剤を同定するスクリーニングアッセイにおける、胚性幹細胞から分化したＲＰＥ細胞の使用が挙げられる。同定された薬剤は、生体外または動物モデルで研究して、例えば単独で、またはＲＰＥ細胞との組み合わせでのそれらの可能な使用を評価してもよい。

本開示は、ＲＰＥ細胞を提供するステップと、前記ＲＰＥ細胞を薬剤に接触させるステップと、前記ＲＰＥ細胞を成熟度の徴候について評価するステップと、次に前記薬剤によってＲＰＥ細胞が成熟度の徴候を示した場合、ＲＰＥ成熟を促進する薬剤を同定するステップとを含んでなる、ＲＰＥ成熟を促進する薬剤を同定する方法を提供する。成熟度の徴候は、本明細書で考察されるように、色素形成レベル、遺伝子発現レベル、および形態であってもよい。

本開示の特定の態様は、商業的量に達するＲＰＥ細胞の生成に関係する。ＲＰＥ細胞は、大規模に生成され、所望ならば保存されて、病院、臨床医またはその他の医療機関に供給されてもよい。

したがって本開示の特定の態様は、本明細書で開示される方法によって製造されるＲＰＥ細胞の生成、保存、および流通方法に関する。ＲＰＥ生成に続いて、ＲＰＥ細胞は、収穫、精製され、任意選択的に患者の治療に先だって保存されもよい。ＲＰＥ細胞は、任意選択的に患者特異的であってもよく、またはＨＬＡまたはその他の免疫性プロファイルに基づいて特に選択されてもよい。例えば、ひとたび患者が、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性（加齢黄斑変性をはじめとする）、色素性網膜炎、網膜萎縮、網膜離脱、網膜異形成、およびシュタルガルト病（黄色斑眼底）、色素線条、または近視性黄斑変性などの徴候を呈すれば、ＲＰＥ細胞を注文して、タイムリーに提供することができる。したがって本開示は、商業規模で細胞を得るＲＰＥ細胞を生成する方法、前記方法に由来するＲＰＥ細胞を含んでなる細胞製剤、ならびにＲＰＥ細胞を病院および臨床医に提供する（すなわち生成し、任意選択的に保存して、販売する）方法に関する。分化ＲＰＥ細胞または成熟分化ＲＰＥ細胞の生成は、商業的利用のためにスケールアップしてもよい。

本開示はまた、販売のために製剤を流通させる流通システムを確立するステップを含んでなり、または医薬品をマーケティングする販売グループを確立するステップを含んでもよい、医薬品事業を行う方法も提供する。

本開示は、ＲＰＥ細胞を病院、医療センター、および臨床医に提供する方法を提供し、本明細書で開示される方法によって生成されたＲＰＥ細胞は、保存されて、病院、医療センター、または臨床医の要求に応じて注文され、ＲＰＥ細胞療法を必要とする患者に投与される。病院、医療センター、または臨床医は、患者特異的データに基づいてＲＰＥ細胞を注文し、ＲＰＥ細胞は患者の規格に従って生成され、引き続いて注文を出した病院または臨床医に供給される。例えば、特定のＲＰＥ細胞製剤が患者に適するとして選択された後、それはその後患者の治療に適する量になるまで増殖される。

本開示のさらなる側面は、可能な患者受容者に対する適合性細胞を提供し得る、ＲＰＥ細胞ライブラリーに関する。したがって本開示は、少なくとも１つの組織適合性抗原についてホモ接合性であるＲＰＥ細胞製剤を提供するステップを含んでなる、医薬品事業を行う実施する方法を提供し、細胞は、本明細書で開示される方法によって増殖されてもよいＲＰＥ細胞ライブラリーを含んでなる細胞バンクから選択され、各ＲＰＥ細胞製剤は、ヒト集団内に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子についてヘミ接合性またはホモ接合性であり、前記ＲＰＥ細胞バンクは、細胞バンクの別のメンバーに対して、ＭＨＣ対立
遺伝子の異なる組について、それぞれヘミ接合性またはホモ接合性である細胞を含んでなる。上述したように、遺伝子標的化またはヘテロ接合性の消失を使用して、ＲＰＥ細胞を誘導するのに使用される、ヘミ接合性またはホモ接合性ＭＨＣ対立遺伝子幹細胞を作成してもよい。

本開示はまた、患者または組織適合性提供者からヒトＥＳ細胞（例えば人工多能性（ｉＰＳ）細胞、または体細胞核移植によって生成されたＥＳ細胞、またはその他の再プログラミング法によって生成されたＥＳ細胞）を得て、または生成して、次にＥＳ細胞に由来するＲＰＥ細胞を作成して増殖させる方法も含む。これらのＲＰＥ細胞は、保存してもよい。さらにこれらのＲＰＥ細胞を使用して、ＥＳがそれから得られた患者、またはその患者の血縁者、または組織適合性の個人を治療してもよい。

本開示は、ヒトＲＰＥ細胞が、明確に定義された再現可能な条件下で、ヒトＥＳ細胞から信頼性をもって分化し増殖してもよいことを実証し、これは網膜変性障害のある患者にとって、無尽蔵の細胞供給源に相当する。これらの細胞の濃度は、入手可能性によって制限されず、むしろ個人の正確な臨床要件について用量設定され得る。医師によって、必要であると考えられる場合、患者の生存期間にわたる、同一細胞集団の繰り返しの輸液または移植もまた可能である。さらに、それからＲＰＥ細胞を生成し得る、マッチするまたは複雑度が低下したＨＬＡｈＥＳ系統のバンクを作成する能力は、免疫抑制剤および／または免疫調節プロトコルに対する必要性を全て潜在的に低下させ、または排除し得る。

ここで本発明を一般的に説明するが、それは本発明の特定の態様および実施形態を単に例証する目的で含まれ、本発明を限定することは意図されない、以下の実施例を参照して、より容易に理解されるであろう。

実施例に提示される結果に関するさらなる情報および／または追加的な実験結果は、本出願の特許請求の範囲の直前に含まれる添付原稿に含まれる。

実施例１
方法
ｈＥＳＣマスター細胞バンクの作成
これらの研究で使用されたｈＥＳＣ系統は、ＭＡ０９（２２）として以前記載されており、完全なインフォームドコンセントによって得られ、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＥｔｈｉｃｓＡｄｖｉｓｏｒｙＢｏａｒｄおよびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄに従って使用された、未使用生体外受精（ＩＶＦ）胚から誘導された。現行の優良製造規範を使用して、ＭＡ０９種培養ストックを解凍し、有糸分裂不活性化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上での４代の連続継代を通じて増殖させた。医療用ｈＥＳＣマスター細胞バンク（ｈＥＳＣ－ＭＣＢ）を冷凍保存して、正常な女性（４６、ＸＸ）核型を有して、細菌およびマイコプラズマ汚染物質、ならびにヒト、ウシ、ブタおよびマウスウイルスがないことを確認した。ＰＣＲ解析は、ＣＴＲＰ５、ＥＶＬＶ４、ＲＰＥ－６５、ＶＭＤ２、およびＡＢＣＡ４をはじめとする、黄斑変性と関連付けられている遺伝子に変化または変異がないことを示した（下の表３）。

網膜色素上皮の製造
ｈＥＳＣ－ＭＣＢのバイアルを解凍して、マイトマイシンＣ処理ＭＥＦ上で３代の継代にわたり増殖させた。ｈＥＳＣｓは動物細胞と共培養されたので、分化した誘導体は異種移植製品に分類され、ドナー動物および生成物処理、検査、およびアーカイビング、ならびに患者、モニタリング、および登録のためのＦＤＡガイドラインの対象となった（下の実施例２に詳述される）。ｈＥＳＣ増殖後、細胞は順次誘発されて胚様体を形成し、細胞
増生と、色素性ＲＰＥ斑への局在性分化がそれに続いた。本実施例で使用されるＲＰＥの生成は、下の実施例４で詳述される。色素斑をコラゲナーゼで単離して、精製およびトリプシン処理後、分離細胞を播種し、コンフルエンスまで成長させて、合計３代の連続継代にわたり再分化を誘発した。継代２代目のＲＰＥは冷凍保存されて、臨床利用のための細胞を調合する出発原料の役割を果たした。

前臨床試験
以前記載されているように、ＮＩＨＩＩＩ免疫ヌードマウス、（腫瘍形成能および生体内分布研究）およびジストロフィーＲＣＳラットおよびＥＬＯＶ４マウス（効能研究）に、ヒトＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞を網膜下注入した（８）。注入施行眼およびその他の器官の中のヒト細胞の検出は、ヒトＡｌｕＹＤＮＡ配列を増幅するようにデザインされたＤＮＡＱ－ＰＣＲによって、およびヒトミトコンドリアとヒトベストロフィンのパラフィン切片免疫染色によって実施された（実施例２に詳述される）。

細胞特性解析および安全性試験
ＲＰＥ細胞は、製造過程試験、および解凍、最終製品調合、移植細胞の運命を生体外でシミュレートするための成熟培養後に実施される試験をはじめとする様々な時点で、安全性について評価し、いくつかのＲＰＥ特異的属性について特性解析した。可能な細菌、マイコプラズマ、マウスウイルス、および残留マウスＤＮＡ安全性評価は、ＷｕＸｉＡｐｐｔｅｃ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮにより、標準プロトコルに従って実施された。核型分析のための細胞遺伝学分析、細胞系認定のためのＤＮＡフィンガープリント法、および蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、ＣｅｌｌＬｉｎｅｓＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによって実施された。内毒素試験は、臨床注入のための最終製品として調合された冷凍保存ＲＰＥに対して、ＣａｐｅＣｏｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，ＥａｓｔＦａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡによって実施された。定量的免疫組織化学染色は標準法を使用して実施し、検査されたＤＡＰＩ染色された核の数について、陽性染色された細胞の百分率を正規化した。ＲＰＥ純度および分化程度の評価は、ベストロフィン、Ｐａｘ６、ＺＯ－１および／またはＭＩＴＦ染色された細胞の百分率に基づいた。多分化能マーカーの不在を確認するスクリーニングは、ＯＣＴ－４およびアルカリホスファターゼについて染色することで実施した。食作用（効力アッセイ）は、ＰｈＲｏｄｏ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）蛍光性生体粒子に曝露させた、ＲＰＥ培養物の定量的蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析によって評価した。定量的逆転写（ｑ－ＲＴ）ＰＣＲアッセイを実施して、ＲＰＥ特異的遺伝子（ＲＰＥ－６５、ＰＡＸ－６、ＭＩＴＦ、ベストロフィン）の上方制御と、ｈＥＳＣ特異的遺伝子（ＯＣＴ－４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ－２）の下方制御を確認した。細胞あたりのメラニン含有量は、細胞数が既知のＮａＯＨ抽出ペレット中で、分光光度法で測定した（実施例２に詳述される）。

細胞調合および注入
冷凍保存ＭＡ０９－ＲＰＥのバイアルを解凍し、遠心分離によって３回洗浄し、１μＬのＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ）あたり２×１０^３個の生細胞／の密度に再懸濁した。適切な容積の調合ＲＰＥを含有するバイアルと、適切な容積のＢＳＳＰＬＵＳ（登録商標）を含有する対のバイアルを２～８℃でＯＲに届けた。注入の直前に、１ｍＬシリンジ内で２本のバイアルを戻し、所望されるＲＰＥ数の送達（各患者の眼の網膜下腔への５０，０００個の生ＲＰＥ細胞）をもたらす、装填細胞密度を得た。意図される投与量の正確な送達を確実にするために、装填細胞密度を増大して、混合、装填、およびカニューレを通じた送達中に遭遇する、生ＲＰＥの予測される損失を埋め合わせた。この生細胞損失は、下の実施例３に記載されるように測定され、使用されるカニューレに左右されることが示された。これらの実施例では、ＭＥＤＯＮＥＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２５／３８（０．１２ｍｍ（３８ｇ）×５ｍｍ先端付き０．５０ｍｍ（２５ｇ）×２８ｍｍカニューレ）が使用され、装填細胞密度は４４４個の生細胞／μＬであり
、３３６＋／－４０個の生細胞／μＬ（Ｎ＝６）の予測送達がもたらされ、各患者の眼の網膜下腔中に、１５０μＬの容積中に期待される５０，４００個の生ＲＰＥの送達がもたらされた。

患者選択
患者は、末期疾患、中心視野喪失、その他の重大な眼科病変の不在、病歴にがんがないこと、現行のがんスクリーニング、全身性免疫抑制に対する禁忌の不在、モニターされる麻酔ケアの下で硝子体網膜外科手術を受ける能力、およびｈＥＳＣ由来移植組織を伴う初めてのヒト臨床試験に参加する心理学的適合性をはじめとする、いくつかの組み入れ基準および除外基準に基づいて選択された（下の表７および表８）。

移植および理論的根拠
硝子体基底部後縁に対して前方の視神経から後部硝子体を分離する、外科的誘導を含む、経毛様体扁平部硝子体切除を実施した。疾患によって完全に消失していない、網膜黄斑中心周囲の事前に選択した領域に、１５０μｌの容積中の５×１０^４個のｈＥＳＣ－ＲＰＥ細胞の黄斑下注入を送達した。移植部位は、損傷してはいるが生得のＲＰＥと上に重なる光受容体の存在に基づいて注意深く選択し、移植片が組み込まれる確率と、光受容体細胞救出の可能性を最適化した。完全に萎縮した黄斑中心の病理解剖学的（ｐａｔｈｏａｎｏｔｏｍｉｃ）複合体内の移植付着はありそうになく、幹細胞ベースの再生移植ストラテジーの究極的治療標的であってもよい、変性のより初期段階における黄斑中心の状態を模倣しない。

免疫抑制レジメンは、外科手術１週間前の低用量のタクロリムス（血液レベル３～７ｎｇ／ｍＬを標的とする）およびミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｍｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）（０．２５ｇ～２ｇの経口／日の範囲のＭＭＦ）を含み、６週間にわたり継続される。６週目には、レジメンは、タクロリムスの中断と、さらに６週間のＭＭＦの継続を求める。

結果
ＲＰＥの特性解析
制御されたｈＥＳＣ分化は、ほぼ１００％純粋なＲＰＥをもたらした（図１）。色素斑の単一（９．６ｃｍ２）６ウェルプレート（図１Ａ）は、およそ１．５×１０^８個のＲＰＥ細胞（例えば患者あたり最高３×１０^６個の細胞投与量で、５０人の患者を治療するのに十分である）を生成した。細胞は典型的なＲＰＥの挙動を示し、（トリプシン処理後）増殖中にそれらの色素性敷石状形態を失い；ひとたびコンフルエンスが再確立されると、それらは多角形立方状色素性上皮の単層に再分化した。Ｑ－ＰＣＲは、多分化能のマーカー（Ｏｃｔ－４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＯＸ２）が、顕著に下方制御された一方で、ＲＰＥマーカーＲＰＥ６５、ベストロフィン、Ｐａｘ６、ＭＩＴＦが高レベルで発現したことを示した（図１Ｂ～Ｆおよび表５）。成熟培養物の免疫染色は、分化ＲＰＥの後期マーカーであるベストロフィンが、収穫前の細胞の大部分では膜状に組織化され；全ての（＞９９％）細胞が、ベストロフィンおよび／またはＰＡＸ６ついて（より成熟した細胞中では、ＰＡＸ６はより弱くなりまたは消失する）、および密着結合成分であるＺＯ－１について陽性であったことを示した（図示せず）。冷凍保存後、細胞のバイアルを解凍して、移植のために調合した。網膜マーカーＰａｘ６および／またはＭＩＴＦ（色素性細胞のマーカー）の染色は、１００％のＲＰＥ純度を確認した（図１Ｃ）。調合細胞をさらに検証するために、それらを２～３週間培養して、ＲＰＥ形態が確立するまで成長させ成熟させた。Ｐａｘ６／ベストロフィン（図１Ｅ）およびＺＯ－１（図１Ｇ）免疫染色は、収穫前培養物と同様であり、効力アッセイは、＞８５％の細胞が生体粒子断片を貪食したことを示した（図１Ｊ）。

安全性試験
ｈＥＳＣは動物細胞および産物に曝露されたので、ＭＣＢおよびＲＰＥは、動物およびヒト病原体について広範に検査した。細胞は、全ての段階で、動物およびヒト病原性ウイルスをはじめとする微生物汚染物質を含まないことが確認された（下の表３）。最終ＲＰＥ製品は、正常な女性（４６、ＸＸ）核型（図１Ｋ）、およびｈＥＳＣ系統ＭＡ０９に一致するＤＮＡフィンガープリントプロファイルを有した。ＲＰＥ製造工程は、多能性細胞を支持しない条件下で実施されたが、高感度アッセイを実施して、最終ＲＰＥ製品中のあらゆる混入ｈＥＳＣの存在を排除した。Ｏｃｔ－４およびアルカリホスファターゼについて染色された（Ｐ１／Ｐ２における）２／９００万個の細胞ＲＰＥサンプルの検査は、いかなる多能性細胞の存在も示さなかった。ＮＩＨ－ＩＩＩマウスで実施された腫瘍形成能、生体内分布、および添加試験は、いずれの動物でも、いかなる有害なまたは安全性の問題も示さなかった。さらに、０．０１％、０．１％、または１％の未分化ｈＥＳ細胞のいずれかを添加した５０，０００～１００，０００個のＲＰＥ細胞が注入された動物で、腫瘍は観察されなかった。ヒトＲＰＥ細胞の生存は、注入後最高３ヶ月まで１００％、９ヶ月まで９２％の動物の眼の中で確認された（下の表６）。ヒトＲＰＥは、動物の生存期間にわたり生存して、マウスＲＰＥ層に組み込まれ；宿主ＲＰＥ細胞と形態学的にほぼ識別不能であったが（図２）、それらは免疫染色によって確認され得て、ベストロフィンを典型的な基底外側様式で発現した（図２Ｂ）。Ｋｉ－６７染色は、移植の１～３ヶ月後に低レベルの増殖を示したが、９ヶ月目にＫｉ－６７陽性細胞は見られず、ｈＥＳＣ由来ＲＰＥが、成熟静止状態単層を形成したことが示唆された。

分化段階は細胞付着と生存に影響する
移植細胞のブルッフ膜への付着、およびそれらの引き続く生存と宿主ＲＰＥ層への統合は、この治療ストラテジーの成功にとって重要と考えられる。ｈＥＳＣ技術の際立った特徴は、分化程度を生体内で管理し得ることである。ＲＰＥ分化の程度は、色素形成のレベルをはじめとする、一連の調節された遺伝子型および表現型発現に現れる。同様の条件下で維持されたが、異なる時点で収穫され冷凍保存された細胞は、様々なレベルの色素形成を示す。図３は、見かけ上異なる色素レベルで収穫された、冷凍保存ＲＰＥの２つの代表的なロットを示す（メラニン含有量は、色素がより薄いロットおよびより濃いロットのそれぞれで、４．８±０．３ＳＤｐｇ／細胞および１０．４±０．９ＳＤｐｇ／細胞であった）。双方のＲＰＥロットの細胞は、臨床移植プロトコルを使用して処理し、調合した。注入カニューレを通じた押出後、細胞をゼラチン被覆組織培養プレートに播種して、付着と引き続く成長をモニターした。色素がより薄いロットからのＲＰＥ細胞は、一晩培養物中に最小数の浮遊細胞を示し；細胞の大部分は付着して広がり、この成長段階に典型的なＲＰＥの挙動および形態を示した（図３Ａ）。培養中で３日後、ＲＰＥ細胞数は、播種された４．０×１０^４個から１０．６×１０^４個の細胞に増加した（図３Ｃおよび図１Ｇ）。全く対照的に、色素がより濃いＲＰＥは、多数の浮遊細胞を示し；培養中で３日後、細胞のわずかな割合のみが付着して生存し、細胞数は顕著に低下した（より薄い色素形成ロットの１０分の１未満［９．０×１０^３］）（図３Ｆおよび図３Ｇ）。これらの結果は、ＲＰＥの分化段階と生体外付着および成長能力の間の強力な相関を示唆する。本臨床研究で使用されたＲＰＥロットは、４．１ｐｇ／細胞のメラニン含有量を有し、色素がより薄いロットと同様の付着および成長を示した。凍結解凍サイクル、解凍後洗浄、遠心分離、および調合、ならびに注入カニューレを通じた押出に付随するストレスは、ある程度は、色素がより薄いロットとより濃いロットの間で観察された違いの原因であってもよい。

臨床結果
ＳＭＤ患者は２６年才の白人女性であり、ベースライン最良矯正視力（ＢＣＶＡ）は、手動弁（ＨＭ）であり、糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）視力表上のいかなる文字も読み取れなかった。移植に続くあらゆる時点で、眼内炎症または過剰増殖のいかな
る徴候も検出されなかった。臨床的に検出可能な炎症の不在は、細隙灯生体顕微鏡写真、眼底撮影、ＩＶＦＡ、およびＳＤ－ＯＣＴで裏付けられた（実施例２および図８および図９に詳述される）。ＲＰＥのレベルにおける臨床的色素形成増大は、術後１週間目に始まって観察され、それは外科的移植部位の外に広がったようである（図４）。ゴールドマン視野は、ベースラインから、移植の２ヶ月後まで改善された（術前および術後視野は図１０および図１１に示される）。２週目には、ＢＣＶＡは指数弁（ＣＦ）（ＥＴＤＲＳ１文字）であり、それは研究期間中改善し続けた（１および２ヶ月めに５文字のＥＴＤＲＳ［ＢＣＶＡ２０／８００］）（表２）。患者は、非常に信頼でき、多年にわたりグラフィックアーティストとして働いていた。彼女は、手術眼に主観的に改善された色覚と改善されたコントラストおよび暗順応があり、他眼には変化がなかったことを報告した。

ＡＭＤ患者は７７才の白人女性であり、ベースラインＢＣＶＡは、２１文字のＥＴＤＲＳ（２０／５００）である。免疫抑制レジメンの中程度の不履行があったにもかかわらず、移植に続くあらゆる時点で、眼内炎症または過剰増殖のいかなる徴候も検出されなかった。臨床的に検出可能な炎症の不在は、細隙灯生体顕微鏡写真、眼底撮影、ＩＶＦＡ、およびＳＤ－ＯＣＴで裏付けられた（実施例２および図８および図９に詳述される）。ＯＣＴ画像は、図４および図７に示される。２週目には、ＥＴＤＲＳＢＣＶＡは３３文字（２０／２００）であった。６週目には、ＢＣＶＡは２８文字のＥＴＤＲＳ（２０／３２０）であり、８週間目まで安定し続けた。中心暗点によって測定されるゴールドマン視野は、ベースラインとの比較で、８週間目にわずかにサイズが減少した。

考察
ヒト胚性幹細胞の治療的使用は、困難な技術移転の課題を提起する。この報告は、ｈＥＳＣ由来細胞をヒト患者に安全に移植し得ることを示唆する、初めての臨床証拠を提供す。本研究では、ｈＥＳＣから作成された低用量（５×１０^４個の細胞）のＲＰＥ細胞を、先進国における、成人および若年失明のそれぞれ主要原因である、乾燥型ＡＭＤおよびＳＭＤの異なる形態の黄斑変性がある、２人の患者の眼に移植した。

細胞がブルッフ膜に付着する確率を改善するために、黄斑複合体（光受容体、ブルッフ膜、およびＲＰＥ）がなおも存在して、潜在的に生存能力がある、黄斑下注入部位を選択し、したがって移植細胞が生得のＲＰＥに組み込まれて、損傷した黄斑周囲組織を潜在的に救出する予測可能性を増大させた。どちらの患者も移植を良好に耐容して、この報告の時点で、術後炎症、拒絶反応、または腫瘍形成能の徴候はなかった。臨床および検査所見
は、移植したＲＰＥ細胞が、付着して組み込まれ、損傷した生得のＲＰＥに影響を与え始めてもよいことを示唆する。

患者の継続的なモニタリングおよび評価は、移植されたｈＥＳＣ－ＲＰが、低下した免疫原性を有するかどうか、それらが長期的な免疫抑制不在下で拒絶反応を受けるかどうか、観察された視力増大が持続するかどうかを判定してもよい。免疫反応は、たとえあったとしても、免疫抑制および／または寛容化レジメンをはじめとする当該技術分野で公知の方法を通じて、管理し得ることが予測される。より多数のＲＰＥ細胞の投与を通じて、より大きな視力増大が達成可能であってもよいこともまた予期される。さらにＲＰＥ細胞の投与は、ＡＭＤ、ＳＭＤなどをはじめとする網膜変性病状と関連付けられている視力喪失を遅延させ、または阻止することが期待される。

一次ＲＰＥ細胞の無傷のシートおよび懸濁液の移植は以前試みられているが（１１～１９）、成人臓器提供者に由来するＲＰＥは、増殖能力が制限され（２３）、標準培養条件を使用してメラニン生合成に必要な遺伝子を発現できないことをはじめとして、生体外で分化する能力もまた制限されている（２４）。臨床的には、ＡＭＤ患者の網膜下腔内に移植された成人ＲＰＥシートは、視覚機能改善に失敗している（２５）。出生前後の組織由来のＲＰＥが成功裏に分離され、生体外で完全に分化したＲＰＥを示唆する属性を持って、成長し成熟するように誘導されているが（２６～２８）、このような情報源は極めて限定的であり、質および増殖能力についてばらつきがある。成人および胎児組織とは対照的に、ｈＥＳＣの特徴は、それらが老化することなく無期限に増殖する能力を有し、分化の出発原料として、「若い」細胞の実質的に無制限の起源を提供することである。ｈＥＳＣから得られる子孫を使用することの別の期待される利点は、生体外分化段階を管理して、移植後の生存および機能性を最大化し得ることである。実際に、ここで提示されるデータは、ＲＰＥ成熟度および色素形成の程度が、生体外における細胞の引き続く付着および増殖に劇的に影響することを示す。

この研究で使用されたＲＰＥの出発原料は、管理条件下で大量の多能性幹細胞を信頼性をもって生成するように最適化された手順を使用して作り出され、良好に特性解析されたｈＥＳＣマスター細胞バンクであった。ＲＰＥ分化手順は、ｈＥＳＣの生存の支持には非許容性であるが、広範な前臨床安全性試験は、移植されたｈＥＳＣ－ＲＰＥが、動物の生存期間中に異所性組織形成または腫瘍を引き起こさなかったことを確認した。百万個以上の細胞中の１個未満の未分化ｈＥＳ細胞を検出する能力のある免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ）ベースのアッセイは、この研究で使用した臨床ＲＰＥロットが、検出可能な多能性細胞を有しないことを確認し、これは生体内添加試験で腫瘍を引き起こすことが示されているｈＥＳＣ用量よりも、５桁低い検出レベルに相当する。ｈＥＳＣ－ＭＣＢの作成および各ＲＰＥ細胞ロットの製造は、一次マウス胚線維芽細胞支持細胞層上における増殖を伴う。したがってｈＥＳＣ－ＲＰＥは異種移植製品に分類され、ＦＤＡ異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）ガイドラインによって規定される、全ての試験およびモニタリングの対象となり、細胞にマウス病原体がないことを確実にした。ＲＰＥはまた、広範な一連の安全性検査を受けて、微生物汚染物質およびウイルスの不在が確認され、貪食能力、遺伝子発現、形態学的評価、およびＲＰＥ特異的マーカーの免疫組織化学染色をはじめとする、多様なＲＰＥ特異的属性によって特性解析された。これらの臨床試験の開始に先だって、ｈＥＳＣ－ＲＰＥのジストロフィー動物への移植は、用量依存様式で光受容体および視覚機能を救出する能力が、細胞にあることを示した。

本研究は、末期のＳＭＤおよび乾燥型ＡＭＤがある患者における、ｈＥＳＣ－ＲＰＥの安全性および耐容性を検証するようにデザインされた。これまでのところ、双方の患者に移植された細胞には、異常増殖、奇形腫形成、移植片拒絶またはその他の有害な病的反応がないようである。継続する経過観察およびさらなる研究が、必要である。しかし究極的
な治療の目的は、疾患経過のより初期にある患者を治療して、光受容体および中心視覚救出の可能性を潜在的に増大させることである。

実施例２
本実施例は、実施例１に関する補足的情報および方法を提供する。

（実施例１で使用されるＲＰＥ細胞がそれから生成される）臨床ｈＥＳＣマスター細胞バンク（ｈＥＳＣ－ＭＣＢ）の特性は、表３に示される。

マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）マスター細胞バンク
ＭＡ０９－ｈＲＰＥ細胞は生体外で非ヒト（マウス）細胞と接触したので、２００３年４月のＧｕｉｄａｎｃｅｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｙ“ＳｏｕｒｃｅＡｎｉｍａｌ，Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ，ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｓｓｕｅｓＣｏｎｃｅｒｎｉｎｇｔｈｅＵｓｅｏｆＸｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
ＰｒｏｄｕｃｔｓｉｎＨｕｍａｎｓ”ａｎｄ“ＰｏｉｎｔｓｔｏＣｏｎｓｉｄｅｒｏｎＸｅｎｏｇｅｎｅｉｃＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ”（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＣＰＷＰ／８３５０８／２００９）］に従って、これらのヒト細胞は、異種移植製品として定義される。ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＫｉｎｇｓｔｏｎＦａｃｉｌｉｔｙ，Ｓｔｏｎｅｒｉｄｇｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）の育種コロニーをＭＥＦ細胞の起源として使用した。このＡＡＡＬＡＣ（ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔａｎｄＡｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣａｒｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）公認施設は、広範な健康モニタリングの下、遮断された室内で、ＣＤ－１特定病原体除去（ＳＰＦ）マウスの閉鎖コロニーを飼育する。ドナー動物は、時間指定交尾させ、妊娠中に隔離した。交尾の１２日後、屠殺前に、獣医によって、全てのマウスについて身体的健康診断が実施され；動物を安楽死させ、白血球および血漿製剤を保存して、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡによって、マウス病原体について血清学的試験をするために、各ドナーマウスから血液を採取した。有資格の獣医病理学者が、各ドナー動物の屠体および子宮、および各同腹仔からの１つの胚の剖検を実施した。各動物からの臓器は、血漿および冷凍保存白血球と共に、少なくとも３０年間保存される（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＣＰＷＰ／８３５０８／２００９の定めるところによる）。以前記載されているように、ＭＥＦを単離して培養し（ＫｌｉｍａｎｓｋａｙａａｎｄＭｃＭａｈｏｎ，２００５）、Ｐ１で凍結して、マイトマイシンＣ不
活性化後にＰ２で使用した。マウスウイルスおよびその他の病原体を導入するリスクを最小化するために、ＭＥＦは、ＷｕＸｉＡｐｐＴｅｃ，Ｉｎｃ．によって検査され特性解析された。ｈＥＳＣ－ＭＣＢ製剤およびｈＲＰＥ医療用ロットで使用されるロットＭＥＦ－０８の検査の規格および結果は、表４に提示される。

ヒトＤＮＡのＤＮＡＱ－ＰＣＲ
マウス組織中のヒトＤＮＡ含量の検出は、１５０，０００個のマウス細胞あたり１個のヒト細胞の感度で、ＡｌｕＹ配列のためのＴａｑｍａｎアッセイを使用して、ＡｌｔｈｅａＤＸ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡによって実施された。

細胞の免疫染色
４ウェルまたは６ウェルプレート内の細胞は、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ）で１０分間固定して、Ｐ
ＢＳ中の０．１％ＮＰ－４０代替品（Ｓｉｇｍａ）中で１０分間透過化して、ＰＢＳ中の１０％ヤギ血清で１時間以上ブロックし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次に細胞を０．１％ツイーン／ＰＢＳ中で３×１５分間洗浄し、二次抗体と共に室温で１時間インキュベートして、上記と同じく洗浄し、ＤＡＰＩ添加Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用してマウントした。逆転蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で、染色した細胞を検査した。使用した抗体は、ベストロフィン（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＰＡＸ６（Ｃｏｖａｎｃｅ），ＭＩＴＦ（Ａｂｃａｍ）、ＺＯ－１－ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＯＣＴ－４（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗マウス－Ａｌｅｘａ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ウサギ－ＦＩＴＣ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、抗マウス－Ａｌｅｘａ－４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ウサギ－Ａｌｅｘａ－５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。Ｖｅｃｔｏｒｂｌｕｅｋｉｔ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、アルカリホスファターゼ活性を検出した。

マウス組織切片の免疫染色
抗原回収（ベストロフィンおよびヒトミトコンドリア）のために、蒸し器内で４０分間、またはＫｉ６７のために、圧力釜内で３０分間、脱パラフィン切片を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でインキュベートした。抗体染色は上述したように実施したが、場合によっては、Ｖｅｃｔｏｒ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）からのキットを使用して内因性ビオチンをブロックした後に、ビオチン共役二次抗体を使用した。使用した抗体は、抗ベストロフィン（Ａｂｃａｍ、ウサギ）、抗ヒトミトコンドリア（マウス、ＳｐｒｉｎｇＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ｋｉ６７（ウサギ、Ａｂｃａｍ）であった。二次抗体は、抗マウス－ビオチン、抗マウス－Ｃｙ３（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、抗ウサギ－Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｎ－Ｃｙ３はＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手された。ｈＥＳＣによって形成されるマウス奇形腫切片を抗ヒトミトコンドリアおよびＫｉ６７のための陽性対照として使用し、固定してパラフィン包埋したｈＲＰＥペレット切片をベストロフィン陽性対照として使用した。陰性対照は、マウスウサギおよびマウスＩｇＧ（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）であった。

ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ
ＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙＲＮＡ単離キットを使用して、細胞混合物からＲＮＡを抽出し、サンプルあたり３０μＬＲＮＡの最終容積がもたらされた。次にＱｉａｇｅｎからのＱｕａｎｔｉｔｅｃｔｃＤＮＡ合成キットを用いて、１０μＬのＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、２０μＬのｃＤＮＡの最終容積がもたらされた。次に各サンプル中に存在するβアクチンシグナルについて正規化された、三重反復複製試験において、１μＬのｃＤＮＡを相対的遺伝子発現について試験した。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓソフトウェアバージョン２．１、およびＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを使用して、製造会社が推奨する比較Ｃｔ相対定量化のサイクル条件に従って、遺伝子発現プロファイリングを実施した。ｈＥＳマーカー（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）およびｈＲＰＥマーカー（ＲＰＥ－６５、ＰＡＸ－６、ＭＩＴＦ、およびベストロフィン）のｑＲＴ－ＰＣＲアッセイは、ゼロ設定点の役割を果たす、１００％ｈＥＳ細胞サンプル中で観察された発現のレベルについて正規化した（ＲＱ＝相対定量化）。相対的遺伝子発現は、各サンプル中に存在するβアクチンシグナルについて正規化した三重反復複製試験でアッセイした。データは、３回の反復試験の平均＋／－ＳＤとして表される。

食作用アッセイ
食作用は、細胞内食胞の低ｐＨ環境で内部に取り入れられると蛍光を発する、ｐＨｒｏ
ｄｏ（商標）ｅｃｏｌｉ蛍光性生体粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＦＡＣＳベースのアッセイによって評価される。生体粒子は、製造会社の使用説明書に従って調製された。コンフルエントなＲＰＥは、ＣＯ_２非依存性培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、４ウェルプレートの１ウェルあたり５０～２００μＬの生体粒子で、３７℃で１６～２０時間培養された。陰性対照プレートは、４℃で培養された。細胞を顕微鏡下で検査し、トリプシンによって収集し、Ｃ６フローサイトメーター上で１０，０００回の事象を数えて、ＦＡＣＳで分析した。

メラニン測定
ＲＰＥ細胞懸濁液を１６０×Ｇで５分間室温で遠心分離して、サンプルを血球計細胞計数のために取り出した。ペレットを１ＮのＮａＯＨに再懸濁して、８０℃で１０分間加熱してボルテックスし、５～１８０μｇ／ｍＬの範囲の合成メラニン（Ｓｉｇｍａカタログ番号８６３１）標準曲線と対比させて、吸光度を４７５ｎｍで測定した。サンプルを三重反復試験で評価し、抽出された全細胞数についてデータを正規化した。

実施例３
正確な投与量の送達を確実にするための細胞密度の調節
この研究は、生ＲＰＥの送達に対する、装填および注入処置ステップの影響の判定について記載する。具体的には、本実施例では、装填および注入処置がいくらかの生細胞損失をもたらすこと、この損失が容易に評価し得る（そして例えば使用される特定の注入カニューレ次第など、送達プロトコルによって異なってもよい）こと、そして細胞濃度を増大させることでこの損失を埋め合わせ、期待される細胞数を送達できるようし得ることを示した。さらに、装填と２本のカニューレを通じた押出に続いて、細胞の播種および成長が、有意に悪影響を受けないことを示した。

これらの研究には、以下をはじめとする装填および注入処置の全体が組み込まれる：（１）注入される所望の細胞密度を得るための、２０００個の生細胞／μＬでの、濃縮最終製品ＲＰＥ細胞への冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓの最後の添加。（２）１ｍｌ注入シリンジ（ＢＤ
ＬＵＥＲ－ＬＯＫ（商標）に装着した、１８ｇのブラントフィルニードル（ＢＤ）を使用した、ＲＰＥ細胞とＢＳＳ－Ｐｌｕｓの穏やかな混合。（３）注入カニューレを通じた、充填シリンジからの１５０μＬの調合ＲＰＥ細胞の押出。

氷上のＡｌｃｏｎＢＳＳＢＳＳ－Ｐｌｕｓ（登録商標）中における、ＲＰＥ細胞の維持は、細胞が１０００個の細胞／μＬ以上の濃度で調合されるという条件で、４時間を超えて不変であることが実証された。これらの条件下で、生細胞数に検出可能な損失はない。細胞完全性を確実にするために、正確な容積のＲＰＥ最終製品細胞は、２０００個の生細胞／μＬで手術室に届けられる。ＲＰＥ細胞の各管は、注入の直前に細胞に添加されて混合される、正確な容積の冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓを含有する第２の管が付随する。あらかじめ分注されたＲＰＥ細胞およびＢＳＳ－Ｐｌｕｓは、２～８℃で無菌微量遠心管内でＯＲに届けられる。

試験１－ＭＥＤＯＮＥＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２３／３８
意図される臨床ＲＰＥロットと特性が類似したＲＰＥ細胞を解凍して処理し、実施例１に記載される冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中で調合した解凍および調合後に、合計４１０万個の生細胞が回収された。出発生存度は９１％であり、解凍および調合後に回収された細胞数は、このロットに典型的であった。細胞を冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中で指示される出発濃度に希釈して、氷上に保存した。次に１ｍＬシリンジ（ＢＤＬＵＥＲ－ＬＯＫ商標）に装着した１８ｇブラントフィルニードル（ＢＤ）を使用して、細胞を穏やかに摩砕した。およそ２００μＬの細胞をフィルニードルを通じて、シリンジ内に移し入れた。フィルニードルを除去して、細胞を含有するシリンジに、ＭＥＤＯＮＥＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２３／３８を装着した。シリンジのプランジャーを穏やかに叩いて、注入カニューレを通じて１５０Ｌの細胞を投与した。注入の総時間は、２～３分間であった。細胞を無菌管内に採取して、生細胞数を評価した。

試験１は、ＭｅｄＯｎｅカニューレを通じて装填され押出されたＲＰＥ細胞が、試験し
た細胞密度範囲にわたり、送達された細胞密度に予測可能な損失をもたらすことを実証した（２９５～１１４４個の生細胞／μＬ）。生細胞密度の平均損失は、２２．８＋／－７．０％（Ｎ＝６）であった。結果は、下の表９に示される。

注入カニューレを通じて送達された細胞数の低下は、２９５～１１４４個の生細胞／μＬの範囲の試験した全ての細胞密度で観察された。細胞密度の百分率の低下は、試験した範囲にわたり概して一定しているようである。試験した２つの最低密度（１９９および２９６）で観察された百分率の低下は、より変わりやすく、恐らくはこれらのより低い細胞密度における細胞計数の正確度を反映する。

ＭｅｄＯｎｅカニューレを通じて押出された細胞と、調合されたがカニューレを通じて押出されていない対照細胞とを遠心分離して、ＲＰＥ成長培地に再懸濁し、ゼラチン被覆フルエリア９６ウェルプレートに、ウェルあたり１０，０００個の細胞で播種した。比較のために、同一細胞製剤の部分をＳｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓカニューレ（３９ｇａ硬質マイクロ注入カニューレ、Ａｎｇｌｅｄ）に装填して通過させ、上記のように処理して播種した。播種の４日後に、細胞をトリプシン処理して計数した。下の表１０は、３種類の細胞計数について、平均細胞数＋／－ＳＤを示す。

いずれのカニューレを通じて押出された細胞の引き続く播種と成長は、カニューレを通じて押出されていない対照細胞と同等であった。

試験２－Ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．注入カニューレ、Ａｎｇｌｅｄ、３９ｇ
意図される臨床ＲＰＥロットと特性が類似したロットからのＲＰＥ細胞を解凍して処理し、実施例１に記載される冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中で調合した。解凍および調合後に、合計
２６０万個の生細胞が回収された。出発生存度は９７％であり、解凍および調合後に回収された細胞数は、このロットに典型的であった。細胞を冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中で３７５個の生細胞／μＬの出発濃度に希釈して、氷上で保存した。次に１ｍＬシリンジ（ＢＤＬＵＥＲ－ＬＯＫ（商標））に装着した１８ｇブラントフィルニードル（ＢＤ）を使用して、細胞を穏やかに摩砕した。およそ２００Ｌの細胞をフィルニードルを通じて、シリンジ内に移し入れた。フィルニードルを除去して、細胞を含有するシリンジに、Ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．３９ｇａ硬質マイクロ注入カニューレ、Ａｎｇｌｅｄを装着した。シリンジのプランジャーを穏やかに叩いて、注入カニューレを通じて１５０Ｌの細胞を投与した。注入の総時間は、２～３分間であった。細胞を無菌管内に採取して、生細胞数を評価した。一連の８回の注入にわたり、送達された平均生細胞数は、２３８＋／－２５個の生細胞／μＬであり、またはこの試験の最低細胞用量（眼あたり５０，０００個の細胞）として意図された送達よりも、生細胞がおよそ１００個少なかった。

したがって試験２では、装填されＳｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓカニューレを通じて押出されたＲＰＥ細胞が、意図される最低細胞用量範囲において、細胞密度に予測可能な損失をもたらすことを実証した（３７５個の生細胞／μＬの装填密度が試験された）。生細胞密度の平均損失は、３８．４＋／－６．８％（Ｎ＝８）であった。装填細胞密度は、それ相応に増大させて、予期される損失を代償し、したがって生ＲＰＥの意図される数（本試験のような５０，０００個の細胞／眼など）の正確な送達を確実にし得る。

試験３－ＭｅｄＯｎｅＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２３／３８およびＳｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓ３９ｇａ硬質マイクロ注入カニューレ、Ａｎｇｌｅｄ
試験３は、上の実施例１で患者への投与のために使用されたＲＰＥロットについて実施した。この試験では、用量ー対ー送達細胞密度よりも２５％高いＲＰＥ細胞が装填され、シリンジへの装填とＭｅｄＯｎｅカニューレを通じた注入において予期される損失を代償した。同じ２５％の補正装填密度を使用して、Ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓカニューレを検証した。

最低標的用量（４４４個の生細胞／μＬー対ー送達された３３３個の細胞／μＬ）よりも２５％高く調合された細胞を装填すると、ＭｅｄＯｎｅカニューレは３３６＋／－４０個の生細胞／μＬを送達した。同様に最低標的用量（１７７６個の生細胞／μＬー対ー送達された１，３３３個の細胞／μＬ）よりも２５％高く調合された細胞を装填すると、ＭｅｄＯｎｅカニューレは１４３３＋／－１８７個の生細胞／μＬを送達した。Ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓカニューレを使用した最低細胞用量注入の結果は、１００個の生細胞／μＬの装填細胞密度の追加的な増大（ａｄｄｉｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅ）が、低密度での標的用量を達成することを確認した。

８本のバイアル（合計１６００万個の細胞）を解凍して上述したように処理し（３回の遠心分離）、全ての処理は室温で実施した。収率は、９５％の生存度で３７８万個の細胞であった（２３．６％の回収率、以前の解凍と同様）。細胞を冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓで、保存および輸送密度の２００万個の生細胞／ｍｌ（２，０００個の生細胞／μＬ）に再懸濁して、その後氷上で保存した。１００万個の細胞／ｍＬを上回る細胞密度を選択して、ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中の冷蔵における細胞生存を促進した。１７７，６００個の全生細胞を含有する、２１個の８９μＬアリコートを、最終製品蓋付き微量遠心管内に分注した。

細胞アリコートは、最終希釈まで氷上で保存して、その時点でシリンジ装填およびカニューレを通じた押出を実施した。低用量送達では（５０，０００個の生ＲＰＥ／眼）、細胞を含有する管に３１１μＬの冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓを分注し、最終容積を４４４個の細胞／μＬで４００μＬにした。この密度は、３３３個の細胞／μＬの意図される送達密度よりも２５％高く、フィルニードルでの混合、シリンジ装填、およびＭｅｄＯｎｅカニュー
レを通じた送達時に起きる、予期される損失を代償する。

高用量送達（２００，０００個の生ＲＰＥ／眼）では、２つの８９μＬのアリコート細胞を１本の管（３５６，０００個の細胞）にプールして、細胞を含有する管に２２μＬの冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓを分注し、最終容積を１，７７６個の細胞／μＬで２００μＬにした。この密度は、１，３３３個の細胞／Ｌの意図される送達密度よりも２５％高く、フィルニードルでの混合、シリンジ装填、およびＭｅｄＯｎｅカニューレを通じた送達時に起きる、予期される損失を代償する。

希釈細胞を含有する微量遠心管に栓をして、１本の指で穏やかに叩いて混合を促進した。ブラントフィルニードル（空隙容積９０μＬ）を１ｍＬＢＤシリンジに装着し、シリンジとの接触を最小化するように注意しながら、細胞をブラントフィルニードル内で１～２回穏やかに摩砕した。シリンジに、およそ２００μＬの細胞を充填した。ブラントニードルを除去して、注入カニューレを装着した（ＭｅｄＯｎｅ３８ｇまたはＳｙｎｅｒｇｅｎｉｃ３９ｇ）。およそ１５０μＬの細胞を微量遠心管内に分注した。各分注アリコートをトリパンブルー排除によって、細胞密度と生存度について評価した。これらの結果は、下の表１１および１２に要約される。

最初の装填密度を標的用量を超えて２５％増大させることは、装填とＭｅｄＯｎｅカニューレを通じた押出中に遭遇する、細胞密度の損失を効果的に補正した。投与される最低用量では、３３３個の生細胞／μＬの標的送達に対して、ＭｅｄＯｎｅカニューレは、３３６＋／－４０個の生細胞／μＬ（Ｎ＝６）の平均細胞密度を送達した。送達される最高細胞密度（１３３３個の生細胞／μＬ）では、ＭｅｄＯｎｅカニューレは１４３３＋／－１８７個の生細胞／μＬ（Ｎ＝３）を送達した。

ＭｅｄＯｎｅまたはＳｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓカニューレを通じた最低用量送達後、細胞
をＲＰＥ成長培地で希釈し、遠心分離して、ゼラチン被覆フルエリア９６ウェルプレートに、ウェルあたり４０，０００個の細胞を播種した。カニューレを通じて押出された細胞と同じ管から取った、カニューレ注入されなかった対照細胞は、同様に処理して播種した。播種の２４時間後に、試験したいずれの条件下でも、全ての細胞は付着して、細胞死または播種効率障害を示す浮遊細胞はな観察されなかった。

ＭｅｄＯｎｅカニューレを通じて押出された細胞と、Ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃカニューレを通じて押出された細胞と、調合されたがカニューレを通じて押出されていない対照細胞とを遠心分離して、ＲＰＥ成長培地に再懸濁し、ゼラチン被覆フルエリア９６ウェルプレートに、ウェルあたり４０，０００個の細胞で播種した。播種の３日後に、細胞をトリプシン処理して計数した。下の表１３は、平均細胞数＋／－ＳＤを示す。これらの結果は、引き続く播種および成長が、いずれかのカニューレを通じた押出によって、悪影響を受けなかったことを示す。対照およびＭｅｄＯｎｅカニューレ注入細胞は、培養への播種の２日後に顕微鏡的に検査され、細胞が活発に分裂する典型的なＲＰＥ形態が示された。対照とカニューレ注入細胞の間に、差は観察されなかった。

要約すると、冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中のＲＰＥ細胞は、１０００個の細胞／μＬを超える濃度でより安定しており、最終製品は、最終製品蓋付き微量遠心管内で冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓに２０００個の細胞／μＬで再懸濁して、カニューレに最高で１５０μＬの容積中の３００，０００個の細胞の用量が装填されるようにし得る。ＧＭＰ無菌室内での処理後、２～８℃の２本の微量遠心管を手術室に届け得る：１本のバイアルは、２０００個の生細胞／μＬの正確な容積のＲＰＥ細胞を含有し、１本のバイアルは、細胞に添加して細胞密度を注入される密度（すなわち、例えばＭｅｄＯｎｅカニューレによる生細胞の損失を考慮した最後の標的用量よりも２５％高い密度など、装填およびカニューレを通じた押出中の生細胞損失を考慮した密度）にする、正確な容積の冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓを含有する。１，０００個の細胞／μＬよりも高いまたは２，０００個の細胞／μＬよりも高い濃度がカニューレに装填される場合、希釈段階を省き、その代わりに所望の濃度で冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中の細胞を手術室に届けてもよい。

ＭｅｄＯｎｅカニューレ用にカスタマイズされた策定装填密度および対応する用量は、表１４に示される。同様のカスタマイゼーションは、Ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓカニューレまたは別のカニューレまたは送達系のために容易に特定される。

実施例４
ＥＳ細胞からのＲＰＥ分化
本実施例は、ｈＥＳＣからのＲＰＥの分化を説明する。得られたＲＰＥは、実施例１に記載される試験で使用された。

胚様体分化培地（ＥＢ－ＤＭ）は、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｔｈａｎｏｌ）、およびノックアウト（商標）血清代替物が添加された、ノックアウト（商標）ＤＭＥＭから構成され、胚様体形成開始時から、色素斑を収穫および分離する時点まで、すなわち胚様体形成、増生、および引き続く色素斑の形成を通じて、使用された。各バッチのＥＢ－ＤＭは、２５０ｍＬのノックアウト（商標）ＤＭＥＭ、３ｍＬのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉ、３ｍｌの非必須アミノ酸、０．３ｍＬの２－メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｔｈａｎｏｌ）および３８ｍＬのノックアウト（商標）血清代替物で構成された。

ＲＰＥ成長／維持培地（ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ）は、１部のＥＢ－ＤＭ（先行する段落に記載される）と、１部のＤＭＥＭ（高グルコース）、ＦＢＳ、およびＧｌｕｔａｍａｘで構成された。この培地は、色素斑からのＲＰＥ細胞誘導後、継代０代目から継代２代目を通じて、最終バルク製品の収穫時点に至る、引き続くＲＰＥの成長および維持において使用された。ＲＰＴ－ＧＭ／ＭＭの各バッチは、１００ｍＬのＥＢ－ＤＭ、９０ｍＬのＤＭＥＭ高グルコース、１０ＭＬウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および１ｍＬのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉで構成された。

これらの培地中で誘導され培養されたＲＰＥ細胞は、ＲＰＥベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰ、ＲＰＥ６５の分子マーカーを発現した。ＰＥＤＦは食作用能力があり、ＲＣＳラットにおいて視覚機能をレスキューした。

上記培地を使用して作成されたＲＰＥロットは、形態学的評価、免疫組織化学染色、およびＲＰＥ遺伝子の上方制御とｈＥＳ細胞遺伝子発現の下方制御に対するｑ－ＲＴ－ＰＣＲをはじめとする、全ての製造過程品質試験に合格した。収量および細胞純度は、以前にＭＤＢＫ－ＧＭおよびＭＤＢＫ－ＭＭ培地（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、ＯｐｔｉＰＲＯ－ＳＦＭ、またはＶＰ－ＳＦＭを使用して作成されたＲＰＥ細胞と、同等であった。

胚様体（ｅｍｂｒｙｏｂｏｄｙ）形成時から、色素斑収穫時点まで、（ＭＤＢＫ－ＧＭまたはＯｐｔｉＰＲＯ－ＳＦＭの代わりに）ＥＢ－ＤＭを使用して、ＲＰＥのロットを製造した。色素斑を収穫してトリプシン処理した後、継代０代目のＲＰＥ細胞を上で定義されるような）ＲＰＥ－ＧＭ（ＥＧＭ－２培地）中に引き続いて播種し、次にＭＤＢＫ－ＭＭまたはＶＰ－ＳＦＭの代わりにＲＰＥ成長／維持培地に切り替えた。代案としては、
ＲＰＥをＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭに直接播種して、継代の持続期間全体にわたり、成長および分化させてもよい。適切な分化レベルが観察された後、継代０代目のＲＰＥ細胞を収穫して、継代２代目のバルク製品の最終収穫と冷凍保存まで、これらの培地中でさらに２回分割した。

下のデータは、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｃｂｏｄｙ）形成時から、色素斑収穫時点まで、ＥＢ－ＤＭ中で維持されたＲＰＥの５つのサブロットの製造過程試験の概要を示す。この時点で、色素斑を異なる日に異なるウェルから収穫し、トリプシン処理して継代０代目のＲＰＥとして播種した。ロットＢ１Ａ、Ｂ２Ａ、およびＢ２Ｂは、コンフルエントまでＥＧＭ－２培地中に播種して、ＲＰＥ成長／維持培地への切り替えがそれに続き、継代０、１、および２代目にわたり分化を促進した。ロットＢ３ＢおよびＢ３Ａは、継代の持続期間全体にわたりＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ中のみで維持された場合、それぞれ継代１または２代目を除いて同様に処理した。したがって全てのロットは、コンフルエンスに達したら、適切な分化レベルが観察されるまで、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ中で維持された。継代２代目の終了後、ＲＰＥ細胞をバルク製品として冷凍保存した。初期成長期のためにＥＧＭ－２中で維持され、それに続いてＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭに切り替えたロット、または数代の継代の持続期間全体にわたりＲＰＥ成長／維持培地中で維持されたロットは、ＥＧＭ－２培地で観察されたわずかにより迅速な成長速度を除いて、類似していた。全てのロットは、継代０、１、および２代目の形態学的評価に合格し、合格規格は、典型的な上皮、敷石状形態、および中程度の色素形成を含んだ。ＲＰＥマーカー発現は、以下の一次抗体を使用して、間接免疫蛍光法によって検出された（希釈は約１：１００～１：１０００であり、各抗体バッチについて経験的に判定された）。ベストロフィン－マウスモノクローナル；ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（＃ＮＢ３００－１６４）；ＰＡＸ６－Ｃｏｖａｎｃｅ、ウサギポリクローナル（ＰＲＢ－２７８Ｐ）；ＺＯ－１－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；マウスモノクローナル（３３９１００）；ＺＯ－１－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ウサギポリクローナル（６１－７３００）；ＺＯ－１－ＦＩＴＣ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；マウスモノクローナル（３３９１１１）；ＭＩＴＦ－マウスモノクローナル、Ａｂｃａｍ（ａｂ３２０１）。

二次抗体は、ブロッキング溶液中で１：５００希釈（またはその他の示される希釈）で使用され、次のとおりであった：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１１００１；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗ウサギ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１１００８；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４抗マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１１０３２；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４抗ウサギ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１１０１２；ヤギ抗マウスＣｙ３共役（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１１５－１６５－１４６）、１：２００で使用された。

ＲＰＥマーカーの免疫染色を実施して、ＰＡＸ６およびＭＩＴＦ；ベストロフィンおよびＰＡＸ６の組み合わせと、ＺＯ－１単独によって純度を評価した。ＲＰＥ成熟は、ベストロフィン陽性染色ＲＰＥの百分率を測定して、評価した。免疫染色は、ＲＰＥ細胞の製造の４つの時点で実施した：（１）継代１代目および播種継代２代目の収穫前に、ＲＰＥをベストロフィン、ＰＡＸ６、およびＺＯ－１について染色した；（２）継代２代目の収穫および冷凍保存前に、ＲＰＥをベストロフィン、ＰＡＸ６、およびＺＯ－１について染色した；（３）ＲＰＥバルク製品を解凍して実施例１に記載されるように調合し、１，０００生細胞／μＬでＢＳＳ－ＰＬＵＳに再懸濁した。次に細胞をＲＰＥ－ＧＭ中で希釈して、１０００ＲＰＭで遠心分離し、再懸濁してゼラチン被覆４ウェルプレートに、ウェルあたり１００，０００～３００，０００個の細胞を播種し、ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６で染色する前に１～２日間培養した；（４）ＲＰＥバルク製品を解凍して実施例１に記載されるように調合し、１，０００生細胞／μＬでＢＳＳ－ＰＬＵＳに再懸濁した。次に細胞をＲＰＥ－ＧＭ中で希釈し、１０００ＲＰＭで遠心分離して、再懸濁してゼラチン被覆４ウ
ェルプレートに、ウェルあたり５０，０００～２００，０００個の細胞を播種して、染色に先だって、コンフルエントまで維持した。この時点で、培養をＲＰＥ－ＭＭに切り替えて、中程度の色素形成と敷石状形態が観察されるまで維持し、その時点で培養物をＰＡＸ６、ベストロフィン、およびＺＯ－１について染色した。手短に述べると、細胞をＣａ２＋、Ｍｇ２＋なしのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０）で２～３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定して、２×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ＮＰ－４０代替品溶液（Ｓｉｇｍａ＃７４３８８）と共に１５分間インキュベートして、２×ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液（１０％の正常なヤギ血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ＃００５－０００－１２１）、ＰＢＳ中の使用濃度２％で調製された１６％パラホルムアルデヒド（新鮮に作成されたまたは冷凍アリコート）（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ＃１５７１０））と共に、３０分間から一晩インキュベートした。次に細胞を、ブロッキング溶液中の一次抗体（異なる種からの一次抗体を使用してウェルあたり最高２種の抗体）と共に、室温で１～２時間、または４℃で一晩インキュベートして、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ－ツイーン溶液（０．５％のツイーン２０（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ７９４９）を添加した、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋なしのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０））中で撹拌しながら、３回洗浄した（各洗浄は１０～１５分間）。次にサンプルを二次抗体と共に培養して、一次抗体と同様に洗浄した。最後の洗浄液の除去後、ＤＡＰＩ添加Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを１～２滴添加して、細胞を倒立蛍光顕微鏡上で検査して計数した。最低限１０００個の核を含有する、３～６個の無作為の視野を全てのチャンネルで２０×の倍率で写真撮影した。写真をマージさせて画像を必要に応じて調節し、いずれの細胞がベストロフィンおよびＰＡＸ６について陰性であり、またはＰＡＸ６およびＭＩＴＦについて陰性であり、またＺＯ－１について陰性であるかを可視化させた。細胞は、例えばＰＡＸ６の核内局在化、ベストロフィンの多角形パターンの原形質膜内局在化（細胞周辺の明確な線でベストロフィン染色の局在化を示す）、多角形パターンの細胞の輪郭を描く密着結合中に存在するＺＯ－１染色、および核限定で検出されるＭＩＴＦ染色などの予測された染色パターンが観察されれば、所与のマーカーについて陽性と見なされた。マージさせた画像中の陽性細胞を計数して、マージさせていないＤＡＰＩ染色画像からの核を計数することで細胞の総数を求めることにより、各マーカーまたはマーカー組み合わせについて陽性の細胞の百分率を判定した。

さらに実施例１に記載されるｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって、ｍＲＮＡ発現を検出した。各ロットから得られた結果を表１６に示し、予測されたようにＲＰＥ遺伝子が上方制御されて、ＥＳ細胞遺伝子が下方制御されたことを実証する。

上記の培地調合物（ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭおよびＥＢ－ＤＭ）を使用して製造されたＲＰＥ、さらに以前その他の培地（ＭＤＢＫ－ＧＭおよびＭＤＢＫ－ＭＭ）を使用して製造された冷凍保存ＲＰＥ細胞を、それらの貪食能力について試験した。この試験では、冷凍保存ＲＰＥを解凍して、ＲＰＥ成長／維持培地に播種した。胚様体形成および色素斑形成中にＥＢ－ＤＭを使用して、ＲＰＥ成熟中にＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭを使用して、作成された、本ロットからのＲＰＥ細胞をトリプシン処理して、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ中に同様に播種した。双方の培養をコンフルエンスに成長させ、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ中で分化するまで維持してから、ＲＰＥ細胞の食胞の酸性環境で内部に取り入れられると蛍光を発する、蛍光性生体粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｐ３５３６１）を貪食するそれらの能力について検査した。細胞は、蛍光性生体粒子と共に３７℃で培養して食作用を可能にし、または４℃で陰性対照として培養した。３７℃で培養した細胞について、生体粒子食作用を示す蛍光強度の移行をＦＡＣＳによって検出した（図１２）。ピークの統計的統合は、各ロットおよび培養温度について、食作用陽性細胞の百分率をもたらす。

これらの結果は、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ上で維持されたＲＰＥ細胞の双方のロット中の高百分率の細胞で食作用を示し、ＲＰＥ細胞の成長および成熟のために、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭを使用する適切さをさらに実証する。

実施例５
ＲＰＥ誘導の追加的な例示的方法
本実施例の方法を使用して、胚を破壊することなく生成された追加的なｈＥＳＣ系統か
ら分化したＲＰＥが生成され、これらの追加的なｈＥＳＣ系統は、特にｉＰＳ細胞（特に非組込み型エピソームベクターを使用して生成されるｉＰＳ細胞）であり、および割球がそれから得られる胚が生存能力を維持して引き続いて冷凍保存される（ｃｙｒｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）生検割球から生成されるＮＥＤ（「胚破壊なし」）ｈＥＳ細胞であった。ＮＥＤ細胞は、その内容全体を参照によって援用する、Ｃｈｕｎｇｅｔａｌ．（ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．２００８Ｆｅｂ７；２（２）：１１３－７）に記載されるようにして、生成された。

ｈＥＳＣは、ＴＥＳＲ－１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に関する製造会社の使用説明書に従って希釈された、マトリゲル（商標）上で増殖された。ＲＰＥは、以前記載されているように（その内容全体を参照によって援用するＫｌｉｍａｎｓｋａｙａｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ６：２１７－２４５（２００４））、胚様体（「ＥＢ」）または多層ｈＥＳＣ培養物から生成され；ＥＢは、懸濁培養後、ＲＰＥ収穫に先だって、増生のために播種された。しかしマトリゲル（商標）上で培養されたｈＥＳＣからのＥＢ形成は、効率に劣ることが観察され、細胞は、より低い成功裏の凝集率と生存度低下を示した。以下のプロトコル修正によって、ＥＢ形成効率を改善した。

ｈＥＳＣは、コロニーがより「分厚く」なるように、すなわち少し隆起し／または多層構造になるように、常態では継代する時間を超えて過成長させた。ＥＢ形成のためには、機械的掻き取り、コラゲナーゼＩ、アキュターゼ、アキュターゼ添加コラゲナーゼまたはコラゲナーゼとそれに続くアキュターゼ、ＥＤＴＡベースの分離緩衝液を使用して、ｈＥＳＣを単細胞懸濁液に分離させることなく分離した。これらの方法は、ｈＥＳＣコロニーを単細胞に分離させることなく、引きはがせるようにした。トリプシン（通常の使用条件では単細胞懸濁液を容易に生成する傾向がある）は、利用しなかった。

次に分離ｈＥＳＣを超低付着性プレート上で培養して、ＥＢを形成をさせた。任意選択的に、ＥＢ形成のために、懸滴などのその他の方法を使用してもよい。典型的に、６ウェル培養皿の１～３個のウェルからのｈＥＳＣを、低付着性プレートの１～２個のウェル内の２～７ｍｌの培地中で培養した。細胞は、ＥＢ培地（ノックアウト高グルコースＤＭＥＭ、１％非必須アミノ酸溶液、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＩ、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、および１３％血清代替物（ＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で培養した。ＥＢ培地中での最初の２～３日間の培養中、ＥＢが形成する間、ＥＢ培地には、１０マイクロモル濃度のＳｔｅｍｇｅｎｔのＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅＹ－２７６３２、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を補給した（その内容全体を参照によって援用するＷａｔａｎａｂｅｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７Ｊｕｎ；２５（６）：６８１－６を参照されたい）。ＲＯＣＫ阻害剤の使用は、特に、ＥＤＴＡまたは酵素的分離を使用して得られたｈＥＳ細胞について、細胞生存度を改善した。ＲＯＣＫ阻害剤の使用は、それがなくても良好に生存する、機械的に掻き取ったｈＥＳＣでは任意であった。

ＥＢ形成の７～１２日後、増生のためにＥＢをゼラチン被覆プレート上に播種した。ＲＰＥは、それらの上皮形態（敷石状外観）および色素形成によって容易に確認された。

ＲＰＥはまた、支持細胞の代わりにマトリゲル（商標）上で細胞を培養したこと以外は、本質的に以前記載されているようにして（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａｅｔａｌ．，２００４，前出）、マトリゲル（商標）上で成長させた、ｈＥＳＣの多層培養物からも生成された。手短に述べると、ｈＥＳＣをマトリゲル（商標）上のｍＴＥＳＲ－１培地中で、ｈＥＳＣコロニーが多層構造になるまで過成長させ（およそ１０～１４日間の培養）、その時点で（上述したように）培地をＥＢ培地で置換した。ＲＯＣＫ阻害剤は、任意選択的
に培地に含まれるが、効率的なＲＰＥ形成および回収のために必須ではない。ＲＰＥは、それらの上皮形態（敷石状外観）および色素形成によって容易に確認された。色素性ＲＰＥ細胞が観察されるまで（典型的に４～５週間以内）、培地を１～２日毎に取り替えた。

得られたＥＢまたは多層培養物は、肉眼で見える暗い領域を含む「そばかす状」の外観を呈した。顕微鏡検査は、これらの暗い領域が、それらの特徴的な色素形成および敷石状の上皮形態によって識別可能なＲＰＥ細胞で構成されることを確認した。得られたＲＰＥ細胞培養物は、図１９に示される。ｈＥＳＣからの分化後、ＲＰＥ細胞は、機械的または酵素的分離のいずれかによって単離した。

実施例６
ＲＰＥ移植方法
乾燥型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）患者およびシュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＳＭＤ）患者への細胞移植のために、以下の方法を使用した。

外科手術直前に、いかなるコルチコステロイドも患者に投与されなかった。外科手術は、外科医の自由裁量による覚醒鎮静ありまたはなしで、全身または局所麻酔下で実施した。

移植用の細胞は、液体窒素貯蔵システムの気相内（およそ－１４０℃）に保存された凍結懸濁液として提供された。投与のために細胞を調合するために、バイアルを液体窒素冷凍庫から取り出して、次に３７℃の水浴に入れて、解凍するまで１～２分間にわたり絶えず撹拌した。次にバイアルに７０％イソプロパノールを噴霧して、乾燥させた。各バイアルの内容物（凍結時点で１００万個の細胞を含む１ｍＬの冷凍保存媒体）を５０ｍＬの円錐管に移し、４０ｍＬの無血清ＤＭＥＭで洗浄した。細胞を遠心分離して、各ペレットを４０ｍＬのＢＳＳ－ＰＬＵＳに再懸濁した。細胞懸濁液を再度遠心分離して、２個以上の凍結保存バイアルを解凍した場合は、ペレットを合わせてプールした。容積をＢＳＳＰＬＵＳ中で１０ｍＬの最終容積にして、３度目の遠心分離をした。上清を完全に吸引して、細胞を各１ｍＬの解凍細胞あたりおよそ１５０μＬのＢＳＳＰＬＵＳの最終容積にした（より濃縮した懸濁液が所望される場合、より低い容積を使用し得る）。サンプルを取り出して、生細胞数を数えた。全生細胞数を測定して、適切な容積のＢＳＳ－ＰＬＵＳを添加して、１μＬあたり２，０００個の生細胞などの標的生細胞濃度を得た。調合製品の適切な容積を０．５ｍＬの無菌微量遠心管に移し、アーカイビング、生存度判定、グラム染色、および無菌性試験のために、サンプルを取り出した。正確な容積のＢＳＳ－Ｐｌｕｓを含有する、対の０．５ｍＬ無菌微量遠心管もまた準備してラベルした。対のバイアルは、最後の混合および手術室での移植に備えて、２～８℃で４時間以下貯蔵した。

標準３ポート経毛様体扁平部硝子体切除を患者に実施した。小規模な網膜切開を行って、次に硝子体切除装置を通じた流体注入システムを使用して、小規模な神経感覚網膜離脱が起こるまで、網膜下腔内へのＢＳＳＰｌｕｓの輸液を実施した。外科医は、側頭窩位置にブレブが作成されたことを確実にした。ブレブは、任意選択的にアーケード血管内に広がり得るが、中心網膜黄斑／窩は剥離させなかった。ブレブが、中心網膜黄斑に向かって拡大するのが観察された場合、外科医には、その位置で同じ規則を守り、中止して別の網膜切開を行う選択肢があった。次に網膜下に注入されたＢＳＳＰｌｕｓは、除去された。

次に事前装填カニューレを装入して、作成された空隙内に、およそ１分間にわたり１５０μＬの体積中で細胞を輸液した。直視によるモニタリングを実施して、正確なカニューレの位置調整を確実にした。術後所見をブレブの位置と正確に相関させるために、手術用顕微鏡を通じて、写真または（好ましくは）ビデオによって、ブレブの正確な位置を記録
した。

所望のｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞数（例えば５０，０００、１００，０００、１５０，０００、または２００，０００個）を１５０ｕＬのＢＳＳＰｌｕｓ中に含有する懸濁液を移植した。細胞は、およそ１分間輸液した。カニューレをその位置でさらに１分間保ち、還流を回避した。外科医の自由裁量で、例えば網膜切開が拡大した場合、空気流体交換を任意選択的に実施した。次に標準手順を使用して、切開を閉じた。次に患者は麻酔から回復したが、背臥位に６時間維持した。

処置に続いて４８時間にわたり、コルチコステロイド投与は許されなかった。必要な場合、手術後の不快感を管理するために、局所または全身性の非ステロイド性抗炎症剤の使用は許された。

実施例７
冷凍保存ＲＰＥ細胞製剤の安定性
本実施例は、冷凍保存ＲＰＥ細胞が、凍結の６および１２ヶ月後の時点で試験した際に、リリース基準に合格して使用に適したままであることを実証する。それに基づいて、冷凍保存ＲＰＥは、冷凍保存後１２ヶ月間にわたり、それらの機能と製品属性を維持することが示された。冷凍保存ＲＰＥ細胞は、凍結後、多年にわたり移植に適したままであることが予期される（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０年以上）。

冷凍保存ＲＰＥサンプルは、上の実施例４に記載されるように生成され、液体窒素中の冷凍保存媒体（９０％ＦＢＳで１０％ＤＭＳＯ）中で凍結されて、液体窒素貯蔵システムの気相内（およそ－１４０℃）に保存された。６または１２ヶ月の保存後、実施例６に記載されるようにして冷凍保存細胞を解凍して洗浄した（手短に述べると、３７℃の水浴中で解凍し、容器外部を７０％エタノールで洗浄し、細胞を洗浄して冷凍保存媒体を除去した）。解凍後、細胞を検査に供して、製品の安定性を確認した。下の表１８に示されるように、各リリース基準に合格した。

実施例８
調合ＲＰＥ細胞の安定性
本実施例は、ＲＰＥ細胞を２～６℃に保った場合、解凍および投与のための調製後、少なくとも４時間、使用に適したままであることを実証する。

冷凍保存細胞を解凍して、上の実施例６に記載されるように調合して、最終製品容器（０．５ｍＬのガスケット付き無菌微量遠心管）内で２～８℃で保存した。表１９は、調合時点および４時間の冷蔵後に試験した２つのロットについて、トリパンブルー排除による評価で平均生存度百分率±ＳＤを示す（ロットあたり３つの最終製剤）。

これらのデータは、調合ＲＰＥ細胞が、調製後４時間まで細胞生存度を維持したことを示した。

追加的な実験では、ＲＰＥ細胞最終製品を２，０００個の生存細胞／μＬで調合し、ＭｅｄＯｎｅＲＥＦ３２３３ＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２３／３８を通じた押出に先だって、様々な時間にわたり冷蔵した。この試験（データは表２０に示される）では、（臨床使用のためのバルク製品のリリース試験に合格した）ＲＰＥ細胞ロットを解凍し、上記のように処理した。細胞を再懸濁して、ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中に２，０００個の生存細胞／μＬの密度で保存し、その後、氷上に保った。１，０００個の生細胞／μＬを上回る細胞密度を選択して、ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中の冷蔵における細胞生存を促進した。この時点で、１７７，６００個の全生細胞を含有する、２１個の８９μＬの細胞アリコートを、最終製品蓋付き微量遠心管に分注した。細胞アリコートは、最終希釈まで氷上で保存して、その時点でシリンジ装填およびカニューレを通じた押出を実施した。低用量送達では、３１１μＬの冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓを細胞を含有する管内に分注し、最終容積を４４４個の細胞／μＬで４００μＬにした。この密度は、３３３個の細胞／μＬの意図される送達密度よりも２５％高く、フィルニードルでの混合、シリンジ装填、およびＭｅｄＯｎｅカニューレを通じた送達時に起きる、予期される損失を代償する。

高用量送達では、２つの８９μＬのアリコート細胞を１本の管（３５６，０００）にプールして、細胞を含有する管に２２μＬの冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓを分注し、最終容積を１，７７６個の細胞／μＬで４００μＬにした。この密度は、１，３３３個の細胞／μＬの意図される送達密度よりも２５％高く、フィルニードルでの混合、シリンジ装填、およびＭｅｄＯｎｅカニューレを通じた送達時に起きる、予期される損失を代償する。

希釈細胞を含有する微量遠心管に栓をして、１本の指で穏やかに叩いて混合を促進した。ブラントフィルニードル（空隙容積９０μＬ）を１ｍＬＢＤシリンジに装着し、シリンジとの接触を最小化するように注意しながら、細胞をブラントフィルニードル内で１～２回（１－２ｔｉｍｅ）穏やかに摩砕した。シリンジに、およそ２００μＬの細胞を充填した。ブラントニードルを除去し、ＭｅｄＯｎｅ３８ｇ注入カニューレを装着した。（およそ１５０μＬの細胞を微量遠心管内に分注した。各分注アリコートをトリパンブルー排除によって、細胞密度と生存度について評価した。調合後の時間は、冷ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中２，０００個の生細胞／μＬの細胞の再懸濁から経過した時間（分）であった。これらのデータは、指示される濃度で送達された細胞について表２０に示される。

データは、試験された時間にわたり冷蔵された場合、注入カニューレを通じて押出された最終製品ＲＰＥ細胞の生細胞数が、低下しないことを示す。調合後２４０分間（４時間）を上回る時間に観察された生細胞密度は、少なくとも４時間の失効時間を支持する。この試験では、ＢＳＳ－Ｐｌｕｓ中のＲＰＥ細胞が、氷上の最終製品密封内で保存された。引き続いて較正プローブを使用して、氷上で保存された微量遠心管内のＢＳＳ－Ｐｌｕｓの温度が評価され、３℃と測定された。

さらなる実験は、最高６時間までの調合ＲＰＥ細胞の生存度を試験した。生存度は、調
合時点（０時間）および冷蔵（２～８℃）の４および６時間後に評価した。この試験で使用したＲＰＥロットは、ＧＭＰ製造について記載される手順、工程、および材料を使用して、製造し冷凍保存した。上の実施例６に記載される手順に従って、ＲＰＥ細胞の冷凍保存バイアルを解凍して調合した。細胞は、調合時点（０時間）および冷蔵（２～８℃）の４および６時間後に、生細胞数について評価した。さらに引き続く純度および効力アセスメントのために、０、４および６時間目の細胞を播種して培養した。各播種時点（０、４、および６時間）で、ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６免疫染色によって純度を評価し、ＦＡＣＳ分析によって蛍光粒子の食作用を評価した。

生細胞密度は、血球計でトリパンブルー排除細胞を計数して判定した。データは、４個の血球計チャンバー上で実施した計数の平均＋／－ＳＤである。結果は、下の表２１に示される。

調合細胞を保存したＧＭＰ保存冷蔵庫の温度読み取りは、実験全体を通じて温度が６℃のままであることを確認した。

２，５９０個／μＬおよび１，７００個／μＬの０時間目の出発生細胞密度は、医療用製剤を目した２，０００個の生細胞／μＬを一括して考える。６時間の冷蔵において、試験した出発細胞密度範囲にわたる生細胞数の損失は、観察されなかった。

実施例９
本実施例は、２人の追加的なシュタルガルト病（Ｓｔａｒｔａｒｄｔ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）患者の最初の治療結果を提供する。２人の患者は、それぞれ、上の実施例６に記載されるＲＰＥ移植法を使用して、ｈＥＳＣ起源から誘導された５０，０００個のＲＰＥ細胞（実施例１に記載される）で治療された。２人のシュタルガルト患者の網膜、視神経円板、網膜黄斑、および後極を含む眼底写真は、注入部位およびＲＰＥ細胞を含有する溶液注入に際して作成されたブレブ領域を示す（図１５）。

さらなる眼底写真は、２人のＳＭＤ患者について、色素性ＲＰＥ細胞斑が増大している、注射ブレブ内の領域の確立を示す（図１６および１７）。これらの結果は、新しいＲＰＥ層による網膜領域の生着と表面再構成を示唆する。

図１６に示される患者の処置眼について、視力もまた評価した。垂直軸は、糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳスコアを示し、水平軸は、術後日数間を示す。

これらの結果は、処置後少なくとも３ヶ月間持続するＲＰＥ細胞の安定した生着を示す。処置眼の視力は、処置後１４日でベースラインレベルに戻り、示される最終時点の８４日目までベースラインを上回り続けた。

実施例１０
１年間の患者評価
ＡＭＤ患者およびＳＭＤ患者は、上の実施例１に記載されるＲＰＥ処置後、１年間にわたり評価した。

ＳＭＤ患者の眼底撮影は、処置の１年後における処置眼中の色素性細胞の存在を実証した（図２０Ｂ）。対照的に、治療前のベースラインでは、色素性細胞は検出不能であった（図２０Ａ）。これらの結果は、処置後少なくとも１年間維持された、ＲＰＥの長期生着を示す。

ＡＭＤ患者について、周辺？ＥＴＤＲＳ／ＢＶＣＡスコアを図２１にグラフで図示する。患者の周辺ＥＲＴＤＳ－ＢＶＣＡスコアは、最初の基線値２１から、外科手術の１および３日後には０に低下したが、外科手術の７日後には、少なくともベースラインレベルに戻り、その後はベースラインを上回り続けた。処置後１年目には、患者の周辺ＥＲＴＤＳ－ＢＶＣＡスコアは３４であった。

ＳＭＤ患者では、治療後１年目には、中心ＥＴＤＲＳ／ＢＶＣＡスコアは１５であった。周辺スコアは、図２２にグラフで図示される。患者の周辺ＥＲＴＤＳ－ＢＶＣＡスコアは、最初の基線値０から、外科手術の２週間後には１に増大し、その後、処置後１年目の１５の値まで増大し続けた。

これらの結果は、ＲＰＥ細胞投与に起因する、ＡＭＤおよびＳＭＤ患者の双方における視力改善を示し、それは処置後少なくとも１年間維持された。

参考文献
１．ＴｈｏｍｓｏｎＪＡ，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ－ＥｌｄｏｒＪ，ＳｈａｐｉｒｏＳＳ，ｅｔａｌ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００８；２８２：１１４５－１１４７．
２．ＦｉｎｋＤＷ，ＢａｕｅｒＳＲ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｉｅｓ：ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔａｎｄｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：ＬａｎｚａＲ，ＨｏｇａｎＢ，ＭｅｌｔｏｎＤ，ＰｅｄｅｒｓｅｎＲ，Ｔｈｏｍａｓ，ＥＤ，ＴｈｏｍｓｏｎＪ，ＷｉｌｍｕｔＩ，ｅｄｓ．ＥｓｓｅｎｔｉａｌｓｏｆＳｔｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．ＳａｎＤｉｅｇｏ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００９：６１９－６３０．
３．ＬａｎｚａＲＰ，ＣｈｕｎｇＨＹＹｏｏＪＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｔｉｓｓｕｅｓｕｓｉｎｇｎｕｃ
ｌｅａｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００２；２０，６８９－６９６．
４．ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ＴａｎａｂｅＫ，ＯｈｎｕｋｉＭ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍａｄｕｌｔｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｂｙｄｅｆｉｎｅｄｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ２００７；１３１，８６１－８７２．
５．ＫｉｍＤ，Ｋｉｍ，ＣＨ，ＭｏｏｎＪＩ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｄｉｒｅｃｔｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００９；４，４７２－４７６．
６．ＫａｐｌａｎＨＪ，ＴｅｚｅｌＴＨ，ＢｅｒｇｅｒＡＳ，ＤｅｌＰｒｉｏｒｅＬＶ．Ｒｅｔｉｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎ：ＳｔｒｅｉｌｅｉｎＪＷ，ｅｄ．ＩｍｍｕｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｔｈｅＥｙｅ．Ｃｈｅｍ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｂａｓｅｌ：Ｋａｒｇｅｒ，１９９９：２０７－２１９．
７．ＬｕｎｄＲＤ，ＷａｎｇＳ，ＫｌｉｍａｎｓｋａｙａＩ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌｓｒｅｓｃｕｅｖｉｓｕａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃｒａｔｓ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００６；８，１８９－１９９．
８．ＬｕＢ，ＭａｌｃｕｉｔＣ，ＷａｎｇＳ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｓａｆｅｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＲＰＥｆｒｏｍｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｍｏｄｅｌｓ
ｏｆｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００９；２１，２１２５－２１３５．
９．ＳｐａｒｒｏｗＪＲ，ＨｉｃｋｓＤ，ＨａｍｅｌＣＰ．Ｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉｎｈｅａｌｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ．ＣｕｒｒＭｏｌＭｅｄ２０１０；１０，８０２－８２３．
１０．ＳｔｒａｕｓｓＯ．Ｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉｎｖｉｓｕａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ２００５；８５，８４５－８８１．
１１．ＢｉｎｄｅｒＳ．，ｅｔａｌ．Ｏｕｔｃｏｍｅｏｆｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉｎａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｔｒｉａｌ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ
ＶｉｓＳｃｉ２００４；４５，４１５１－４１６０．
１２．ＡｌｇｖｅｒｅＰＶ，ＢｅｒｇｌｉｎＬ，ＧｏｕｒａｓＰ，ＳｈｅｎｇＹ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｆｅｔａｌｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉｎａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｕｂｆｏｖｅａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ＧｒａｅｆｅｓＡｒｃｈＣｌｉｎＥｘｐＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ１９９４；２３２，７０７－７１６．
１３．ＫａｐｌａｎＨＪ，ＴｅｚｅｌＴＨ，ＢｅｒｇｅｒＡＳ，ＤｅｌＰｒｉｏｒｅＬＶ．Ｒｅｔｉｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＣｈｅｍＩｍｍｕｎｏｌ１９９９；７３，２０７－２１９．
１４．ＢｉｎｄｅｒＳ，ＳｔｏｌｂａＵ，ＫｒｅｂｓＩ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔ
ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉｎｅｙｅｓｗｉｔｈｆｏｖｅａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａｐｉｌｏｔｓｔｕｄｙ．ＡｍＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ２００２；１３３，２１５－２２５．
１５．ＭａｃＬａｒｅｎＲＥ，ＢｉｒｄＡＣ，ＳａｔｈｉａＰＪ，Ａｙｌｗａｒｄ
ＧＷ．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｕｂｍａｃｕｌａｒｓｕｒｇｅｒｙｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｍａｃｕｌａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉｎｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ２００５；１１２，２０８１－２０８７．
１６．ＬａｐｐａｓＡ，ＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒＡＷ，ＦｏｅｒｓｔｅｒＡＭ，ＫｕｂｅＴ，ＲｅｚａｉＫＡ，ＫｉｒｃｈｈｏｆＢ．Ｉｒｉｓｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｉｎｅｘｕｄａｔｉｖｅ
ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｐｉｌｏｔｓｔｕｄｙｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ．ＧｒａｅｆｅｓＡｒｃｈＣｌｉｎＥｘｐＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ２０００；２３８，６３１－６４１．
１７．ＡｉｓｅｎｂｒｅｙＳ，ＬａｆａｕｔＢＡ，ＳｚｕｒｍａｎＰ，ｅｔａｌ．Ｉｒｉｓｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｘｕｄａｔｉｖｅｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａ３－ｙｅａｒｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ．ＡｒｃｈＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ２００６；１２４，１８３－１８８．
１８．ＴｈｕｍａｎｎＧ，ＡｉｓｅｎｂｒｅｙＳ，ＳｃｈｒａｅｒｍｅｙｅｒＵ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｉｒｉｓ
ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｆｔｅｒｒｅｍｏｖａｌｏｆｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｍｅｍｂｒａｎｅｓ．ＡｒｃｈＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ２０００；１１８，１３５０－１３５５．
１９．ＢｅｒｇｅｒＡＳ，ＴｅｚｅｌＴＨ，ＤｅｌＰｒｉｏｒｅＬＶ，ＫａｐｌａｎＨＪ．Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ：ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ２００３；１１０，３８３－３９１．
２０．ＤｒｕｋｋｅｒＭ，ＫａｔｃｈｍａｎＨ，ＫａｔｚＧ，ｅｔａｌ．ＨｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｉｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓａｒｅｌｅｓｓｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｔｏｉｍｍｕｎｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎｔｈａｎａｄｕｌｔｃｅｌｌｓＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００６；２４，２２１－２２９．
２１．ＯｋａｍｕｒａＲＭ，ＬｅｂｋｏｗｓｋｉＪ，ＡｕＭ，ＰｒｉｅｓｔＣＡ，ＤｅｎｈａｍＪ，ＭａｊｕｍｄａｒＡＳ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．ＪＮｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ２００７；１９２，１３４－１４４．
２２．ＫｌｉｍａｎｓｋａｙａＩ，ＣｈｕｎｇＹ，ＢｅｃｋｅｒＳ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｓｉｎｇｌｅｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ２００６；４４４，４８１－４８５．
２３．ＴｅｚｅｌＴＨ，ＤｅｌＰｒｉｏｒｅＬＶ．Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅｍｅｄｉａｆｏｒｃｕｌｔｕｒｉｎｇａｎｄｓｅｒｉａｌｌｙ－ｐａｓｓａｇｉｎｇｏｆａｄｕｌｔｈｕｍａｎｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ１９９８；６６，８０７－８１５．
２４．ＬｕＦ，ＺｈｏｕＸ，ＨｕＤＮ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ｍｅｌａｎｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄａｄｕｌｔ
ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｎｄｕｖｅａｌｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＶｉｓ２００７；１３，２０６６－２０７２．
２５．ＴｅｚｅｌＴＨ，ＤｅｌＰｒｉｏｒｅＬＶ，ＢｅｒｇｅｒＡＳ，ｅｔａｌ．Ａｄｕｌｔｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｅｘｕｄａｔｉｖｅａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕ
ｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＡｍＪ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ２００７；１４２，５８４－５９５．
２６．ＳｏｎｇＭＫ，ＬｕｉＧＭ．ＰｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆｆｅｔａｌｈｕｍａｎＲＰＥｃｅｌｌｓ：ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｆｔｅｒｓｅｒｉａｌｐａｓｓａｇｅ．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ１９９０；１４３，１９６－２０３．
２７．ＧａｍｍＤＭ，ＷｒｉｇｈｔＬＳ，ＣａｐｏｗｓｋｉＥＥ，ｅｔａｌ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｅｎａｔａｌｈｕｍａｎｒｅｔｉｎａｌｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｃｅｌｌｆａｔｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｙｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｎｄＭａｓｈ１．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００８；２６，３１８２－３１９３．
２８．ＭａｍｉｎｉｓｈｋｉｓＡ，ＣｈｅｎＳ，ＪａｌｉｃｋｅｅＳ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔｍｏｎｏｌａｙｅｒｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｆｅｔａｌｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｅｘｈｉｂｉｔ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆｎａｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ．２００６；４７，３６１２－３６２４．

全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によってその内容全体を援用すると具体的かつ個別に示されているかのように、本明細書でその内容全体を参照によって援用する。２００７年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９９８，７６６号明細書、２００７年１０月１２日出願された米国仮特許出願第６０／９９８，６６８号明細書、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／００９，９０８号明細書、および２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／００９，９１１号明細書、前述の各出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。さらに国際公開第２００９／０５１６７１号パンフレットの開示は、その内容全体を参照によって援用する。

当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims

複数の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞と；
薬学的に許容できる担体と
を含んでなる医薬組成物であって、前記複数のＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量が８ｐｇ／細胞未満である、医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、懸濁液、ゲル、コロイド、基材、基質、スキャフォールド、または移植片中に含有される、請求項１に記載の医薬組成物。
前記薬学的に許容できる担体が、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する無菌溶液を含んでなる、請求項１～２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記薬学的に許容できる担体が、平衡塩類溶液を含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記平衡塩類溶液が、１ｍＬの水中に、塩化ナトリウム７．１４ｍｇ、塩化カリウム０．３８ｍｇ、塩化カルシウム二水和物０．１５４ｍｇ、塩化マグネシウム六水和物０．２ｍｇ、二塩基性リン酸ナトリウム０．４２ｍｇ、炭酸水素ナトリウム２．１ｍｇ、デキストロース０．９２ｍｇ、グルタチオンジスルフィド（酸化型グルタチオン）０．１８４ｍｇ、および塩酸および／または水酸化ナトリウム（ｐＨを約７．４に調節するため）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になる、請求項４に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物の容積が、約１００μＬ～１０００μＬであり、または少なくとも約１５０μＬである、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、約１，０００～約１×１０^９個の生ＲＰＥ細胞を含んでなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、約３３３個の生ＲＰＥ細胞／μＬ～約２，０００個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約４４４個の生ＲＰＥ細胞／μＬ～約１７６６個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約３３３個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約４４４個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約６６６個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約８８８個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、約９９９個の生ＲＰＥ細胞／μＬ、または約１，３３３個の生ＲＰＥ細胞／μＬを含んでなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物中のＲＰＥ細胞濃度が、前記ＲＰＥ細胞の約３０％以下が６０分間以内に生存度を失い、任意選択的に前記ＲＰＥ細胞の約１０％以下が４時間以内に生存度を失う程度に十分に高い、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞濃度が、少なくとも約１，０００個の細胞／μＬ、少なくとも約２，０００個の細胞／μＬ、約１，０００～１０，０００個の細胞／μＬ、または約２，０００～５，０００個の細胞／μＬである、請求項９に記載の医薬組成物。
前記医薬品が、約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％未満のＲＰＥ細胞でない細胞を含んでなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量が、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、および少なくとも０．１ｐｇ／細胞、および任意選択的に少なくとも０．５ｐｇ／細胞または１ｐｇ／細胞；０．１～８ｐｇ／細胞、０．１～７ｐｇ／細胞、０．１～６ｐｇ／細胞、０．１～５ｐｇ／細胞、０．１～４ｐｇ／細胞、０．１～３ｐｇ／細胞、０．１～２ｐｇ／細胞、０．１～１ｐｇ／細胞、１～７ｐｇ／細胞、０．５～６ｐｇ－細胞、または１～５ｐｇ／細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％がベストロフィン＋である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％がＰＡＸ６＋および／またはＭＩＴＦ＋である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％がＰＡＸ６＋および／またはベストロフィン＋である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％がＺＯ－１＋である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％がＰＡＸ６＋およびベストロフィン＋である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物中の細胞の少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％がＰＡＸ６＋である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物中の１００万個の細胞あたり約１個以下の細胞、および任意選択的に９００万個の細胞あたり約２個以下の細胞が、ＯＣＴ－４およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現の双方について陽性である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
針または注入カニューレが、前記ＲＰＥ細胞の少なくとも一部を含有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞の濃度が、前記針または注入カニューレ内への装填時に、約４００個の生細胞／μＬ～約２，０００個の生細胞／μＬである、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記針または注入カニューレから送達される生ＲＰＥ細胞の濃度が、約３３３個の生細胞／μＬ～約１，３３３個の生細胞／μＬまたは約４４４個の生細胞／μＬ～約１，７６６生細胞／μＬである、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
前記針または注入カニューレ径が、約０．３ｍｍ～約０．９ｍｍである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記針または注入カニューレ径が、約０．５ｍｍ～約０．６ｍｍである、請求項２０～
２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記針または注入カニューレが、約０．０９ｍｍ～約０．１５ｍｍ径の先端を含んでなる、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記カニューレが、ＭＥＤＯＮＥＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２５／３８ｇ（０．１２ｍｍ（３８ｇ）×５ｍｍ先端付き０．５０ｍｍ（２５ｇ）×２８ｍｍカニューレ）、またはＳｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓＡｎｇｌｅｄ３９ｇ注入カニューレである、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、冷凍保存されて解凍されたＲＰＥ細胞を含んでなる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞がヒト細胞である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与される、少なくとも１つの血管新生阻害剤をさらに含んでなる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記１つまたは複数の血管新生阻害剤が、ペプガタニブナトリウム；アフリベルセプト；ベバシラニブ；ラパマイシン；ＡＧＮ－７４５；バタラニブ（ｖｉｔａｌａｎｉｂ）；パゾパニブ；ＮＴ－５０２；ＮＴ－５０３；ＰＬＧ１０１；ＣＰＤ７９１；抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片；ベバシズマブ；ラニビズマブ；抗ＶＥＧＦＲ１抗体；抗ＶＥＧＦＲ２抗体；抗ＶＥＧＦＲ３抗体；ＩＭＣ－１１２１（Ｂ）；ＩＭＣ－１８Ｆ１；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（アフリベルセプト）；ＡＺＤ－２１７１（セジラニブ）；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）；ＶＥＧＦＲ－１および／またはＶＥＧＦＲ－２を阻害するＴＫＩ；ソラフェニブ（ネクサバール）；ＳＵ５４１６（セマキシニブ）；ＳＵ１１２４８／スニチニブ（スーテント）；バンデタニブ（ＺＤ６４７４）；Ｌｙ３１７６１５（エンザスタウリン）；抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片；ボロシキシマブ；３－（２－｛１－アルキル－５－［（ピリジン－２－イルアミノ）－メチル］－ピロリジン－３－イルオキシ｝－アセチルアミノ）－２－（アルキル－アミノ）－プロピオン酸；（Ｓ）－２－［（２，４，６－トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ－３－［７－ベンジルオキシカルボニル－８－（２－ピリジニルアミノメチル）－１－オキサ－２，７－ジアザスピロ－（４，４）－ノン－２－エン－３－イル］カルボニルアミノプロピオン酸；ＥＭＤ４７８７６１；またはＲＣ^＊Ｄ（ＴｈｉｏＰ）Ｃ^＊（Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－チオプロリン－Ｃｙｓ（星印はシステイン残基を通じたジスルフィド結合による環化を意味する）；２－メトキシエストラジオール；αＶβ３阻害剤；アンギオポエチン２；抗血管新生ステロイドおよびヘパリン；アンギオスタチン；アンギオスタチン関連分子；抗カテプシンＳ抗体；抗トロンビンＩＩＩ断片；カルレティキュリン；カンスタチン；カルボキシアミドトリアゾール；軟骨由来血管新生阻害因子；ＣＤＡＩ；ＣＭ１０１；ＣＸＣＬ１０；エンドスタチン；ＩＦＮ－α；ＩＦＮ－β；ＩＦＮ－γ；ＩＬ－１２；ＩＬ－１８；ＩＬ－４；リノミド；マスピン；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；Ｍｅｔｈ－１；Ｍｅｔｈ－２；オステオポンチン；ペガプタニブ；血小板因子－４；プロラクチン；プロリフェリン関連タンパク質；プロトロンビン（クリングルドメイン－２）；レスチン；可溶性ＮＲＰ－１；可溶性ＶＥＧＦＲ－１；ＳＰＡＲＣ；ＳＵ５４１６；スラミン；テコガラン；テトラチオモリブデート；サリドマイド；レナリドミド；トロンボスポンジン；ＴＩＭＰ；ＴＮＰ－４７０；ＴＳＰ－１；ＴＳＰ－２；バソスタチン；ＶＥＧＦＲ拮抗薬；ＶＥＧＩ；ボロシキシマブ（Ｍ２００）；フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；レン
バチニブ（Ｅ７０８０）；モテサニブ（ＡＭＧ７０６）；パゾパニブ（ヴォトリエント）；ＶＥＧＦの阻害剤；ＶＥＧＦＲ１の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；α５β１インテグリンの阻害剤；ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、および／またはα５β１インテグリンのペプチド、ペプチド模倣剤、小分子、化学的、および／または核酸阻害剤；ＩＬ－６拮抗薬；抗ＩＬ－６抗体；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から、任意選択的に増殖性（血管新生）眼疾患を予防または治療するのに十分な量で選択される、請求項２９に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、遺伝子改変されている、請求項１～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、多能性細胞から生成される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、遺伝子改変されている多能性細胞から生成される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記遺伝子操作が、前記ＲＰＥ細胞による、血管新生を阻害する１つまたは複数の因子の産生をもたらす、請求項３１または３３に記載の医薬組成物。
血管新生を阻害する前記１つまたは複数の因子が、フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；特異的抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗ＶＥＧＦ受容体抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片またはドメイン；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
血管新生を阻害する前記因子の産生が、ＲＰＥ特異的プロモーターによって調節される、請求項３４～３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ特異的プロモーターが、ＲＰＥ６５プロモーター、カテプシンＤ近位プロモーター、およびＶＭＤ２プロモーターからなる群から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
前記多能性幹細胞が、ＯＣＴ－４、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、および／またはＴＲＡ－１－８０を含んでなる、１つまたは複数のマーカーについて陽性である、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記多能性細胞が、培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な時間にわたり、多層集団または胚様体中で培養されたヒト多能性細胞である、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な前記時間が、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、または少なくとも約７週間、少なくとも約８週間を含んでなる、請求項３９に記載の医薬組成物。
前記多層集団または胚様体が、ＤＭＥＭを含んでなる培地中で培養される、請求項３９
または４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記培地が、ＥＢ－ＤＭを含んでなり、それから本質的になり、またはそれからなる、請求項４１に記載の医薬組成物。
前記色素性上皮細胞が単離されて培養され、それによってＲＰＥ細胞集団を生じる、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記単離するステップが、培養から細胞または細胞塊を酵素的に、化学的に、または物理的に分離して、色素性上皮細胞または色素性上皮細胞を含んでなる細胞塊を選択するステップを含んでなる、請求項４３に記載の医薬組成物。
前記胚様体が懸濁状態で培養される、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記胚様体が付着培養として培養される、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
付着培養として培養される前記胚様体が、色素性上皮細胞を含んでなる１つまたは複数の増殖物を生じる、請求項４６に記載の医薬組成物。
前記多能性幹細胞が、低下したＨＬＡ抗原複雑度を有する、請求項３２～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ＲＰＥ生成に先だって、前記多能性細胞が基材上で培養される、請求項３２～４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記基材が、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、ヘパランスルフェート、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ、ヒト基底膜抽出物、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、請求項４９に記載の医薬組成物。
前記基材が、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）を含んでなる、請求項４９に記載の医薬組成物。
実質的な１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーが欠如した細胞を含んでなる、請求項１～５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーが、ＯＣＴ－４、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ－１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、および／またはＴＲＡ－１－８０を含んでなる、請求項５２に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、１つまたは複数のＲＰＥ細胞マーカーについて陽性である、請求項１～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記１つまたは複数のＲＰＥ細胞マーカーが、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、
ベストロフィン、ＭＩＴＦ、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、ＺＯ－１、および／またはチロシナーゼを含んでなる、請求項５４に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、前記平均メラニン含有量を得るのに十分な時間にわたり、ＲＰＥ細胞を静止細胞として維持するステップを含んでなる方法によって生成される、請求項１～５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、前記ＲＰＥ細胞の少なくとも５０％中におけるベストロフィン発現を確立するのに十分な時間にわたり、ＲＰＥ細胞を静止細胞として維持するステップを含んでなる方法によって生成される、請求項１～５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、マウス胚性支持細胞（ＭＥＦ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を実質的に含まない、請求項１～５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、１つまたは複数のαインテグリンサブユニットの発現を増大させる条件下で、前記ＲＰＥ細胞を培養するステップを含んでなる方法によって生成される、請求項１～５８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記１つまたは複数のαインテグリン（ｉｎｔｅｇｅｒｉｎ）サブユニットが、αインテグリンサブユニット１、αインテグリンサブユニット２、αインテグリンサブユニット３、αインテグリンサブユニット４、αインテグリンサブユニット５、αインテグリンサブユニット６、またはαインテグリンサブユニット９の１つまたは複数を含んでなる、請求項５９に記載の医薬組成物。
前記条件が、マンガンへの曝露、抗ＣＤ２９抗体への曝露、モノクローナル抗体ＨＵＴＳ－２１への曝露、モノクローナル抗体ｍＡｂＴＳ２／１６への曝露、および／または前記ＲＰＥ細胞の少なくとも約４代の継代を含んでなる、請求項５９または６０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、表５に列挙される基準の少なくとも１つを満たす、請求項１～６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、優良製造規範（ＧＭＰ）に従って製造される、請求項１～６２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与される、少なくとも１つの免疫抑制または免疫寛容化剤をさらに含んでなる、請求項１～６３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記免疫抑制または免疫寛容化剤が、間葉幹細胞、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、バシリキシマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、ダクリズマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、リツキシマブ（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｍｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）の１つまたは複数を含んでなる、請求項６４に記載の医薬組成物。
請求項１～６５のいずれか一項に記載の医薬組成物と、前記複数のＲＰＥ細胞を所望の標的濃度に希釈するのに十分な容積の薬学的に許容可能な希釈剤を含んでなる別個の容器とを含んでなる、キット。
前記薬学的に許容可能な希釈剤の容積が、前記薬学的に許容可能な希釈剤の全容積を前記複数のＲＰＥ細胞の全体と組み合わせると、前記所望の標的濃度を有する前記複数のＲＰＥ細胞をもたらすような容積である、請求項６６に記載のキット。
前記薬学的に許容可能な希釈剤の温度が、約０～１０℃、任意選択的に約２～８℃である、請求項６６～６７のいずれか一項に記載のキット。
前記複数のＲＰＥ細胞または前記複数のＲＰＥ細胞を含有する薬学的に許容できる担体の温度が、約０～１０℃、任意選択的に約２～８℃である、請求項６６～６８のいずれか一項に記載のキット。
前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与される、少なくとも１つの免疫抑制または免疫寛容化剤をさらに含んでなる、請求項６６～６９のいずれか一項に記載のキット。
前記免疫抑制または免疫寛容化剤が、間葉幹細胞、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、バシリキシマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、ダクリズマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、リツキシマブ（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｍｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）の１つまたは複数を含んでなる、請求項７０に記載のキット。
前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与される、１つまたは複数の血管新生阻害剤をさらに含んでなる、請求項６６～７１のいずれか一項に記載のキット。
前記１つまたは複数の血管新生阻害剤が、ペプガタニブナトリウム；アフリベルセプト；ベバシラニブ；ラパマイシン；ＡＧＮ－７４５；バタラニブ（ｖｉｔａｌａｎｉｂ）；パゾパニブ；ＮＴ－５０２；ＮＴ－５０３；ＰＬＧ１０１；ＣＰＤ７９１；抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片；ベバシズマブ；ラニビズマブ；抗ＶＥＧＦＲ１抗体；抗ＶＥＧＦＲ２抗体；抗ＶＥＧＦＲ３抗体；ＩＭＣ－１１２１（Ｂ）；ＩＭＣ－１８Ｆ１；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（アフリベルセプト）；ＡＺＤ－２１７１（セジラニブ）；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）；ＶＥＧＦＲ－１および／またはＶＥＧＦＲ－２を阻害するＴＫＩ；ソラフェニブ（ネクサバール）；ＳＵ５４１６（セマキシニブ）；ＳＵ１１２４８／スニチニブ（スーテント）；バンデタニブ（ＺＤ６４７４）；Ｌｙ３１７６１５（エンザスタウリン）；抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片；ボロシキシマブ；３－（２－｛１－アルキル－５－［（ピリジン－２－イルアミノ）－メチル］－ピロリジン－３－イルオキシ｝－アセチルアミノ）－２－（アルキル－アミノ）－プロピオン酸；（Ｓ）－２－［（２，４，６－トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ－３－［７－ベンジルオキシカルボニル－８－（２－ピリジニルアミノメチル）－１－オキサ－２，７－ジアザスピロ－（４，４）－ノン－２－エン－３－イル］カルボニルアミノプロピオン酸；ＥＭＤ４７８７６１；またはＲＣ^＊Ｄ（ＴｈｉｏＰ）Ｃ^＊（Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－チオプロリン－Ｃｙｓ（星印はシステイン残基を通じたジスルフィド結合による環化を意味する）；２－メトキシエストラジオール；αＶβ３阻害剤；アンギオポエチン２；抗血管新生ステロイドおよびヘパリン；アンギオスタチン；アンギオスタチン関連分子；抗カテプシンＳ抗体；抗トロンビンＩＩＩ断片；カルレティキュリン；カンスタチン；カルボキシアミドトリアゾール；軟骨由来血管新生阻害因子；ＣＤＡＩ；ＣＭ１０１；ＣＸＣＬ１０；エンドスタチ
ン；ＩＦＮ－α；ＩＦＮ－β；ＩＦＮ－γ；ＩＬ－１２；ＩＬ－１８；ＩＬ－４；リノミド；マスピン；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；Ｍｅｔｈ－１；Ｍｅｔｈ－２；オステオポンチン；ペガプタニブ；血小板因子－４；プロラクチン；プロリフェリン関連タンパク質；プロトロンビン（クリングルドメイン－２）；レスチン；可溶性ＮＲＰ－１；可溶性ＶＥＧＦＲ－１；ＳＰＡＲＣ；ＳＵ５４１６；スラミン；テコガラン；テトラチオモリブデート；サリドマイド；レナリドミド；トロンボスポンジン；ＴＩＭＰ；ＴＮＰ－４７０；ＴＳＰ－１；ＴＳＰ－２；バソスタチン；ＶＥＧＦＲ拮抗薬；ＶＥＧＩ；ボロシキシマブ（Ｍ２００）；フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；レンバチニブ（Ｅ７０８０）；モテサニブ（ＡＭＧ７０６）；パゾパニブ（ヴォトリエント）；ＶＥＧＦの阻害剤；ＶＥＧＦＲ１の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；α５β１インテグリンの阻害剤；ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、および／またはα５β１インテグリンのペプチド、ペプチド模倣剤、小分子、化学的、および／または核酸阻害剤；ＩＬ－６拮抗薬；抗ＩＬ－６抗体；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から、任意選択的に増殖性（血管新生）眼疾患を予防または治療するのに十分な量で選択される、請求項７２に記載のキット。
解凍に引き続いて回収された網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が、少なくとも約６０％の播種効率を有するような平均成熟レベルを凍結時点で有する、複数の冷凍保存ＲＰＥ細胞を含んでなる、冷凍保存組成物。
前記播種効率が、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である、請求項７４に記載の冷凍保存組成物。
前記平均成熟レベルが、前記複数の冷凍保存ＲＰＥ細胞を代表する細胞集団の平均メラニン含有量を測定することで判定される、請求項７４または７５に記載の冷凍保存組成物。
前記複数の冷凍保存ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量が、８ｐｇ／細胞未満である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
複数の冷凍保存網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含んでなり；前記複数の冷凍保存ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量が８ｐｇ／細胞未満である、冷凍保存組成物。
前記細胞が、冷凍保存媒体中に含有される、請求項７４～７８のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存媒体が、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、エチレングリコール、グリセロール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール（ＭＰＤ）、プロピレングリコール、およびスクロースの１つまたは複数を含んでなる、請求項７９に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存媒体が、約５％～約５０％のＤＭＳＯおよび約３０％～約９５％の血清を含んでなり、前記血清が任意選択的にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である、請求項７９～８０のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存媒体が、約９０％のＦＢＳおよび約１０％のＤＭＳＯを含んでなる、請求項７９に記載の冷凍保存組成物。
解凍に引き続いて回収されたＲＰＥ細胞が、少なくとも約６０％の播種効率を有する、請求項７８～８２のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記播種効率が、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である、請求項８３に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物が、凍結時点で約５，０００～約１×１０^８個の生ＲＰＥ細胞を含んでなる、請求項７４～８４のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物が、凍結時点で約２００，０００～約１０，０００，０００、約２０，０００～約５０，０００，０００、約２５０，０００～約５，０００，０００、約５００，０００～約４，０００，０００、または約１，０００，０００～約４，０００，０００個の生ＲＰＥ細胞を含んでなる、請求項７４～８５のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
解凍に引き続いて回収された前記ＲＰＥ細胞が、凍結の少なくとも約３、６、９、または１２ヶ月後の時点で、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の播種効率を有する、請求項７４～８６のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
解凍時に生存能力がある前記細胞の少なくとも８５％が、解凍後、２～８℃で最高１時間、最高２時間、最高３時間、最高４時間、最高５時間、または最高６時間の保存時に、生存能力を維持する、請求項７４～８７のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物が、約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％未満のＲＰＥ細胞でない細胞を含んでなる、請求項７４～８８のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含有量が、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満および少なくとも０．１ｐｇ／細胞、および任意選択的に少なくとも０．５ｐｇ／細胞または１ｐｇ／細胞；０．１～８ｐｇ／細胞、０．１～７ｐｇ／細胞、０．１～６ｐｇ／細胞、０．１～５ｐｇ／細胞、０．１～４ｐｇ／細胞、０．１～３ｐｇ／細胞、０．１～２ｐｇ／細胞、０．１～１ｐｇ／細胞、１～７ｐｇ／細胞、０．５～６ｐｇ－細胞、または１～５ｐｇ／細胞である、請求項７４～８９のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％がベストロフィン＋である、請求項７４～９０のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％がＰＡＸ６＋および／またはＭＩＴＦ＋である、請求項７４～９１のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％がＰＡＸ６＋および／またはベストロフィン＋である、請求項７４～９２のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％がＺＯ－１＋である、請求項７４～９３
のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％が、ＰＡＸ６＋およびベストロフィン＋である、請求項７４～９４のいずれか一項に記載の冷凍保存冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物中の細胞の少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％がＰＡＸ６＋である、請求項７４～９５のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記冷凍保存組成物中の１００万個の細胞あたり約１個以下の細胞、および任意選択的に９００万個の細胞あたり約２個以下の細胞が、ＯＣＴ－４およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現の双方について陽性である、請求項７４～９６のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与される、少なくとも１つの血管新生阻害剤をさらに含んでなる、請求項７４～９７のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記１つまたは複数の血管新生阻害剤が、ペプガタニブナトリウム；アフリベルセプト；ベバシラニブ；ラパマイシン；ＡＧＮ－７４５；バタラニブ（ｖｉｔａｌａｎｉｂ）；パゾパニブ；ＮＴ－５０２；ＮＴ－５０３；ＰＬＧ１０１；ＣＰＤ７９１；抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片；ベバシズマブ；ラニビズマブ；抗ＶＥＧＦＲ１抗体；抗ＶＥＧＦＲ２抗体；抗ＶＥＧＦＲ３抗体；ＩＭＣ－１１２１（Ｂ）；ＩＭＣ－１８Ｆ１；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（アフリベルセプト）；ＡＺＤ－２１７１（セジラニブ）；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）；ＶＥＧＦＲ－１および／またはＶＥＧＦＲ－２を阻害するＴＫＩ；ソラフェニブ（ネクサバール）；ＳＵ５４１６（セマキシニブ）；ＳＵ１１２４８／スニチニブ（スーテント）；バンデタニブ（ＺＤ６４７４）；Ｌｙ３１７６１５（エンザスタウリン）；抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片；ボロシキシマブ；３－（２－｛１－アルキル－５－［（ピリジン－２－イルアミノ）－メチル］－ピロリジン－３－イルオキシ｝－アセチルアミノ）－２－（アルキル－アミノ）－プロピオン酸；（Ｓ）－２－［（２，４，６－トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ－３－［７－ベンジルオキシカルボニル－８－（２－ピリジニルアミノメチル）－１－オキサ－２，７－ジアザスピロ－（４，４）－ノン－２－エン－３－イル］カルボニルアミノプロピオン酸；ＥＭＤ４７８７６１；またはＲＣ^＊Ｄ（ＴｈｉｏＰ）Ｃ^＊（Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－チオプロリン－Ｃｙｓ（星印はシステイン残基を通じたジスルフィド結合による環化を意味する）；２－メトキシエストラジオール；αＶβ３阻害剤；アンギオポエチン２；抗血管新生ステロイドおよびヘパリン；アンギオスタチン；アンギオスタチン関連分子；抗カテプシンＳ抗体；抗トロンビンＩＩＩ断片；カルレティキュリン；カンスタチン；カルボキシアミドトリアゾール；軟骨由来血管新生阻害因子；ＣＤＡＩ；ＣＭ１０１；ＣＸＣＬ１０；エンドスタチン；ＩＦＮ－α；ＩＦＮ－β；ＩＦＮ－γ；ＩＬ－１２；ＩＬ－１８；ＩＬ－４；リノミド；マスピン；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；Ｍｅｔｈ－１；Ｍｅｔｈ－２；オステオポンチン；ペガプタニブ；血小板因子－４；プロラクチン；プロリフェリン関連タンパク質；プロトロンビン（クリングルドメイン－２）；レスチン；可溶性ＮＲＰ－１；可溶性ＶＥＧＦＲ－１；ＳＰＡＲＣ；ＳＵ５４１６；スラミン；テコガラン；テトラチオモリブデート；サリドマイド；レナリドミド；トロンボスポンジン；ＴＩＭＰ；ＴＮＰ－４７０；ＴＳＰ－１；ＴＳＰ－２；バソスタチン；ＶＥＧＦＲ拮抗薬；ＶＥＧＩ；ボロシキシマブ（Ｍ２００）；フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；レンバチニブ（Ｅ７０８０）；モテサニブ（ＡＭＧ７０６）；パゾパニブ（ヴォトリエント）
；ＶＥＧＦの阻害剤；ＶＥＧＦＲ１の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；α５β１インテグリンの阻害剤；ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、および／またはα５β１インテグリンのペプチド、ペプチド模倣剤、小分子、化学的、および／または核酸阻害剤；ＩＬ－６拮抗薬；抗ＩＬ－６抗体；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から、任意選択的に増殖性（血管新生）眼疾患を予防または治療するのに十分な量で選択される、請求項９８に記載の冷凍保存組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、遺伝子改変されている、請求項７４～９９のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、多能性細胞から生成される、請求項７４～１００のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、遺伝子改変されている多能性細胞から生成される、請求項７４～１０１のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記遺伝子操作が、前記ＲＰＥ細胞による、血管新生を阻害する１つまたは複数の因子の産生をもたらす、請求項１０１または１０２に記載の冷凍保存組成物。
血管新生を阻害する前記１つまたは複数の因子が、フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；特異的抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗ＶＥＧＦ受容体抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片またはドメイン；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項１０３に記載の冷凍保存組成物。
血管新生を阻害する前記因子の産生が、ＲＰＥ特異的プロモーターによって調節される、請求項１０３～１０４のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記ＲＰＥ特異的プロモーターが、ＲＰＥ６５プロモーター、カテプシンＤ近位プロモーター、およびＶＭＤ２プロモーターからなる群から選択される、請求項１０５に記載の冷凍保存組成物。
前記多能性幹細胞が、ＯＣＴ－４、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、および／またはＴＲＡ－１－８０を含んでなる、１つまたは複数のマーカーについて陽性である、請求項１０１～１０６のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記多能性細胞が、培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な時間にわたり、多層集団または胚様体中で培養された、ヒト多能性細胞である、請求項１０１～１０７のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な前記時間が、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、または少なくとも約７週間、少なくとも約８週間を含んでなる、請求項１０８に記載の冷凍保存組成物。
前記多層集団または胚様体が、ＤＭＥＭを含んでなる培地中で培養される、請求項１０８または１０９のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記培地が、ＥＢ－ＤＭを含んでなり、それから本質的になり、またはそれからなる、請求項１１０に記載の冷凍保存組成物。
前記色素性上皮細胞が単離されて培養され、それによってＲＰＥ細胞集団を生じる、請求項１０８～１１１のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記単離するステップが、培養から細胞または細胞塊を酵素的に、化学的に、または物理的に分離して、色素性上皮細胞または色素性上皮細胞を含んでなる細胞塊を選択するステップを含んでなる、請求項１１２に記載の冷凍保存組成物。
前記胚様体が懸濁状態で培養される、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記胚様体が付着培養として培養される、請求項１０８～１１４のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
付着培養として培養される前記胚様体が、色素性上皮細胞を含んでなる１つまたは複数の増殖物を生じる、請求項１１５に記載の冷凍保存組成物。
前記多能性幹細胞が、低下したＨＬＡ抗原複雑度を有する、請求項１０８～１１６のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
ＲＰＥ生成に先だって、前記多能性細胞が基材上で培養される、請求項１０８～１１７のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記基材が、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、ヘパランスルフェート、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ、ヒト基底膜抽出物、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、請求項１１８に記載の冷凍保存組成物。
前記基材が、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）を含んでなる、請求項１１８に記載の冷凍保存組成物。
１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーの実質的発現が欠如した細胞を含んでなる、請求項７４～１２０のいずれか一項に記載の冷凍保存組成物。
前記１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーが、ＯＣＴ－４、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ－１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、および／またはＴＲＡ－１－８０を含んでなる、請求項１２１に記載の組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、１つまたは複数のＲＰＥ細胞マーカーについて陽性である、請求項７４～１２２のいずれか一項に記載の組成物。
前記１つまたは複数のＲＰＥ細胞マーカーが、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ベストロフィン、ＭＩＴＦ、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、ＺＯ－１、および／または
チロシナーゼを含んでなる、請求項１２３に記載の組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、前記平均メラニン含有量を得るのに十分な時間にわたり、ＲＰＥ細胞を静止細胞として維持するステップを含んでなる方法によって生成される、請求項７４～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、前記ＲＰＥ細胞の少なくとも５０％中におけるベストロフィン発現を確立するのに十分な時間にわたり、ＲＰＥ細胞を静止細胞として維持するステップを含んでなる方法によって生成される、請求項７４～１２５のいずれか一項に記載の組成物。
前記組成物が、マウス胚性支持細胞（ＭＥＦ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を実質的に含まない、請求項７４～１２６のいずれか一項に記載の組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、１つまたは複数のαインテグリンサブユニットの発現を増大させる条件下で、前記ＲＰＥ細胞を培養するステップを含んでなる方法によって生成される、請求項７４～１２７のいずれか一項に記載の組成物。
前記１つまたは複数のαインテグリン（ｉｎｔｅｇｅｒｉｎ）サブユニットが、αインテグリンサブユニット１、αインテグリンサブユニット２、αインテグリンサブユニット３、αインテグリンサブユニット４、αインテグリンサブユニット５、αインテグリンサブユニット６、またはαインテグリンサブユニット９の１つまたは複数を含んでなる、請求項１２８に記載の組成物。
前記条件が、マンガンへの曝露、抗ＣＤ２９抗体への曝露、モノクローナル抗体ＨＵＴＳ－２１への曝露、モノクローナル抗体ｍＡｂＴＳ２／１６への曝露、および／または前記ＲＰＥ細胞の少なくとも約４代の継代を含んでなる、請求項１２８または１２９のいずれか一項に記載の組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、表５に列挙される基準の少なくとも１つを満たす、請求項７４～１３０のいずれか一項に記載の組成物。
前記ＲＰＥ細胞が、優良製造規範（ＧＭＰ）に従って製造される、請求項７４～１３１のいずれか一項に記載の組成物。
前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与される、少なくとも１つの免疫抑制または免疫寛容化剤をさらに含んでなる、請求項７４～１３２のいずれか一項に記載の組成物。
前記免疫抑制または免疫寛容化剤が、間葉幹細胞、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、バシリキシマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、ダクリズマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、リツキシマブ（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｍｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）の１つまたは複数を含んでなる、請求項１３３に記載の組成物。
請求項７４～１３４のいずれか一項に記載の組成物と、前記複数のＲＰＥ細胞を所望の標的濃度に希釈するのに十分な容積の薬学的に許容可能な希釈剤を含んでなる別個の容器とを含んでなる、キット。
前記薬学的に許容可能な希釈剤の容積が、前記薬学的に許容可能な希釈剤の全容積を前記複数のＲＰＥ細胞の全体と組み合わせると、前記所望の標的濃度を有する前記複数のＲＰＥ細胞をもたらすような容積である、請求項１３５に記載のキット。
前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与される、少なくとも１つの免疫抑制または免疫寛容化剤をさらに含んでなる、請求項１３５～１３６のいずれか一項に記載のキット。
前記免疫抑制または免疫寛容化剤が、間葉幹細胞、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、バシリキシマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、ダクリズマブ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、リツキシマブ（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｍｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）の１つまたは複数を含んでなる、請求項１３７に記載のキット。
前記ＲＰＥ細胞に先だって、それと同時に、それに引き続いて、および／またはそれと共に、必要とする対象に投与される、１つまたは複数の血管新生阻害剤をさらに含んでなる、請求項１３５～１３８のいずれか一項に記載のキット。
前記１つまたは複数の血管新生阻害剤が、ペプガタニブナトリウム；アフリベルセプト；ベバシラニブ；ラパマイシン；ＡＧＮ－７４５；バタラニブ（ｖｉｔａｌａｎｉｂ）；パゾパニブ；ＮＴ－５０２；ＮＴ－５０３；ＰＬＧ１０１；ＣＰＤ７９１；抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片；ベバシズマブ；ラニビズマブ；抗ＶＥＧＦＲ１抗体；抗ＶＥＧＦＲ２抗体；抗ＶＥＧＦＲ３抗体；ＩＭＣ－１１２１（Ｂ）；ＩＭＣ－１８Ｆ１；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（アフリベルセプト）；ＡＺＤ－２１７１（セジラニブ）；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）；ＶＥＧＦＲ－１および／またはＶＥＧＦＲ－２を阻害するＴＫＩ；ソラフェニブ（ネクサバール）；ＳＵ５４１６（セマキシニブ）；ＳＵ１１２４８／スニチニブ（スーテント）；バンデタニブ（ＺＤ６４７４）；Ｌｙ３１７６１５（エンザスタウリン）；抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片；ボロシキシマブ；３－（２－｛１－アルキル－５－［（ピリジン－２－イルアミノ）－メチル］－ピロリジン－３－イルオキシ｝－アセチルアミノ）－２－（アルキル－アミノ）－プロピオン酸；（Ｓ）－２－［（２，４，６－トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ－３－［７－ベンジルオキシカルボニル－８－（２－ピリジニルアミノメチル）－１－オキサ－２，７－ジアザスピロ－（４，４）－ノン－２－エン－３－イル］カルボニルアミノプロピオン酸；ＥＭＤ４７８７６１；またはＲＣ^＊Ｄ（ＴｈｉｏＰ）Ｃ^＊（Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－チオプロリン－Ｃｙｓ（星印はシステイン残基を通じたジスルフィド結合による環化を意味する）；２－メトキシエストラジオール；αＶβ３阻害剤；アンギオポエチン２；抗血管新生ステロイドおよびヘパリン；アンギオスタチン；アンギオスタチン関連分子；抗カテプシンＳ抗体；抗トロンビンＩＩＩ断片；カルレティキュリン；カンスタチン；カルボキシアミドトリアゾール；軟骨由来血管新生阻害因子；ＣＤＡＩ；ＣＭ１０１；ＣＸＣＬ１０；エンドスタチン；ＩＦＮ－α；ＩＦＮ－β；ＩＦＮ－γ；ＩＬ－１２；ＩＬ－１８；ＩＬ－４；リノミド；マスピン；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；Ｍｅｔｈ－１；Ｍｅｔｈ－２；オステオポンチン；ペガプタニブ；血小板因子－４；プロラクチン；プロリフェリン関連タンパク質；プロトロンビン（クリングルドメイン－２）；レスチン；可溶性ＮＲＰ－１；可溶性ＶＥＧＦＲ－１；ＳＰＡＲＣ；ＳＵ５４１６；スラミン；テコガラン；テトラチオモリブデート；サリドマイド；レナリドミド；トロンボスポンジン；ＴＩＭＰ；ＴＮＰ－４７０；ＴＳＰ－１；ＴＳＰ－２；バソスタチン；ＶＥＧＦＲ拮抗薬；ＶＥＧＩ；ボロシキシマブ（Ｍ２００）；フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；レン
バチニブ（Ｅ７０８０）；モテサニブ（ＡＭＧ７０６）；パゾパニブ（ヴォトリエント）；ＶＥＧＦの阻害剤；ＶＥＧＦＲ１の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；ＶＥＧＦＲ２の阻害剤；α５β１インテグリンの阻害剤；ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、および／またはα５β１インテグリンのペプチド、ペプチド模倣剤、小分子、化学的、および／または核酸阻害剤；ＩＬ－６拮抗薬；抗ＩＬ－６抗体；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から、任意選択的に増殖性（血管新生）眼疾患を予防または治療するのに十分な量で選択される、請求項１３９に記載のキット。
（ａ）ＲＰＥ細胞を付着条件下で培養して、敷石状形態を有する色素性ＲＰＥ細胞の実質的に単層の培養を形成するステップと；
（ｂ）冷凍保存または製剤処方のために、培養からＲＰＥ細胞を選択および単離するステップと
を含んでなり、単離時点で色素性ＲＰＥ細胞の単離集団が、８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を有する、医薬品中で使用するための網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法。
冷凍保存または剤処方のために、少なくとも１０^６個のＲＰＥ細胞が単離される、請求項１４１に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞が多能性幹細胞から生成されて、前記多能性幹細胞が任意選択的にヒト胚性幹細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項１４１または１４２に記載の方法。
色素が最も濃い５パーセントと色素が最も薄い５パーセントの単離ＲＰＥ細胞を除外した細胞集団について平均メラニン含有量が判定される、請求項１４１～１４３のいずれか一項に記載の方法。
前記平均メラニン含有量が、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、および少なくとも０．１ｐｇ／細胞、および任意選択的に少なくとも０．５ｐｇ／細胞または１ｐｇ／細胞；０．１～８ｐｇ／細胞、０．１～７ｐｇ／細胞、０．１～６ｐｇ／細胞、０．１～５ｐｇ／細胞、０．１～４ｐｇ／細胞、０．１～３ｐｇ／細胞、０．１～２ｐｇ／細胞、０．１～１ｐｇ／細胞、１～７ｐｇ／細胞、０．５～６ｐｇ－細胞、または１～５ｐｇ／細胞である、請求項１４１～１５５のいずれか一項請求項に記載の方法。
（ａ）ＲＰＥ細胞を付着条件下で培養して、敷石状形態を有する色素性ＲＰＥ細胞の実質的に単層の培養を形成するステップと；
（ｂ）前記ＲＰＥ細胞が８ｐｇ／細胞を超える平均メラニン含有量に達する前の時点で、前記ＲＰＥ細胞を少なくとも１代継代するステップと；
（ｃ）任意選択的に、１代または複数の継代後、冷凍保存または製剤処方のためにＲＰＥ細胞を収穫するステップと
を含んでなり、収穫時点で、前記ＲＰＥ細胞が８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を有する、医薬品中で使用するための網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法。
（ａ）任意選択的にヒト胚性幹細胞またはヒトｉＰＳ細胞である多能性幹細胞を培養して胚様体（ＥＢ）を形成する、または多能性幹細胞を培養して多層集団を形成するステップと；
（ｂ）細胞質中に分散する褐色色素を含んでなる色素性細胞の出現に十分な時間にわたり、前記多層細胞集団またはＥＢを培養するステップと；
（ｃ）（ｂ）の色素性細胞を単離して培養し、８ｐｇ／細胞未満の平均色素レベルを有するＲＰＥ細胞を含有する培養集団を生成するステップと
を含んでなる、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法。
ステップ（ｂ）が、前記胚様体を培養して付着培養を形成するステップを含んでなる、請求項１４７に記載の方法。
ステップ（ａ）が、多能性細胞培養を過成長させ、それによって多層集団を形成するステップを含んでなる、請求項１４７に記載の方法。
ステップ（ａ）が、前記多能性細胞を低付着性基質上で培養し、または前記多能性細胞を懸滴法を利用して培養し、それによって前記多能性細胞から胚様体を形成するステップを含んでなる、請求項１４７～１４９のいずれか一項に記載の方法。
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成人幹細胞、造血幹細胞、胎児幹細胞、間葉幹細胞、分娩後幹細胞、多分化能幹細胞、または胚性胚芽細胞である、請求項１４７～１５０のいずれか一項に記載の方法。
前記多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項１４７～１５０のいずれか一項に記載の方法。
前記多能性幹細胞が、遺伝子改変されている、請求項１４７～１５２のいずれか一項に記載の方法。
前記遺伝子操作が、前記ＲＰＥ細胞による、血管新生を阻害する因子の生成をもたらす、請求項１５３に記載の方法。
前記血管新生を阻害する１つまたは複数の因子が、フィブロネクチン断片またはドメイン；アナステリン；特異的抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗ＶＥＧＦ受容体抗体またはその機能性断片またはドメイン；特異的抗α５β１インテグリン抗体またはその機能性断片またはドメイン；ＶＥＧＦの断片またはドメイン；ＶＥＧＦＲ受容体の断片またはドメイン；ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ；およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項１５４に記載の方法。
ステップ（ａ）で前記胚様体がその中で形成され、および／またはステップ（ｃ）で前記色素性細胞がその中で培養される前記培地が、ＤＭＥＭを含んでなる、請求項１４７～１５５のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ａ）で前記胚様体がその中で形成され、および／またはステップ（ｃ）で前記色素性細胞がその中で培養される前記培地が、ＥＢ－ＤＭを含んでなり、それから本質的になり、またはそれからなる、請求項１４７～１５５に記載の方法。
ステップ（ｃ）で前記色素性細胞がその中で培養される前記培地が、ＥＢ－ＤＭを含んでなる、請求項１４７～１５６のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｃ）で前記色素性上皮細胞がその中で培養される前記培地が、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭを含んでなり、それから本質的になり、またはそれからなる、請求項１４７～１５５に記載の方法。
ステップ（ｂ）の前記培養期間が、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、または８週間、または少なくとも約１、２、３、４、５、または６ヶ月である、請求項１４７～
１５９のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）で使用される前記培地が、ＥＢ－ＤＭ、ＲＰＥ－ＧＭ／ＭＭ、ＭＤＢＫ－ＧＭ、ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ、ＶＰ－ＳＦＭ、ＥＧＭ－２、またはＭＤＢＫ－ＭＭである、請求項１４７～１６０のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｃ）が、前記培養をトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、パパイン、コラゲナーゼとディスパーゼの混合物、およびコラゲナーゼとトリプシンの混合物からなる群から選択される酵素に接触させるステップを含んでなり、または前記培養を機械的破壊または単離するステップを含んでなり、または前記培養をＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに接触させて、それによって前記色素性細胞の前記培養基質への付着を妨害するステップを含んでなる、請求項１４７～１６１のいずれか一項に記載の方法。
前記多能性幹細胞が、低下したＨＬＡ抗原複雑度を有する、請求項１４７～１６２のいずれか一項に記載の方法。
１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーの実質的発現が、前記ＲＰＥ細胞に欠如している、請求項１４７～１６３のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーが、Ｏｃｔ－４、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ－１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＤＰＰＡ－２、および／またはＤＰＰＡ－４である、請求項１６４に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞が、少なくとも１つのＲＰＥ細胞マーカーについて陽性である、請求項１４７～１６５のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも１つのＲＰＥ細胞マーカーが、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ベストロフィン、ＭＩＴＦ、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、またはチロシナーゼの１つまたは複数または任意選択的にＰＡＸ６およびベストロフィンを含む、請求項１６６に記載の方法。
αインテグリンサブユニット発現を増大させる条件下で、前記ＲＰＥ細胞を培養するステップをさらに含んでなる、請求項１４７～１６７のいずれか一項に記載の方法。
前記αインテグリンサブユニットが１～６または９である、請求項１６８に記載の方法。
前記条件が、マンガンへの曝露、ＣＤ２９に対する抗体への曝露、または前記ＲＰＥ細胞の少なくとも約４代の継代を含んでなる、請求項１６８または１６９に記載の方法。
前記ＣＤ２９に対する抗体が、モノクローナル抗体、任意選択的にＨＵＴＳ－２１またはＴＳ２／１６である、請求項１７０に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞の富化培養物を増殖させるために使用される前記培地が、未分化多能性幹細胞の成長または維持を支持しない、請求項１４７～１７１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞が、表５に列挙される基準の少なくとも１つを満たす、請求項１４７～１７２のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、優良製造規範（ＧＭＰ）に従って実施される、請求項１４７～１７３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＥＢが、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で形成される、請求項１４７～１７４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、請求項１７５に記載の方法。
前記ＲＰＥ形成に先だって、前記多能性細胞をマトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）上で培養する、請求項１７５または１７６に記載の方法。
（ａ）ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の多層集団を提供するステップと；
（ｂ）細胞質内に分散する褐色色素を含んでなる推定上のヒトＲＰＥ細胞を出現させるのに十分な時間にわたり、前記ｈＥＳ細胞の未分化状態を維持しない条件下で、ｈＥＳ細胞の前記多層集団を培養するステップと；
（ｃ）前記推定上のヒトＲＰＥ細胞の１つまたは複数を、ステップ（ｂ）の培養から選択するステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記ヒトＲＰＥ細胞を培養して、ベストロフィン＋であり、特徴的な敷石多角形の上皮様外観を示して、細胞質内に分散する褐色色素を含んでなる細胞を含有する培養物を形成し、それによってヒトＲＰＥ細胞の富化集団を生成するステップと
を含んでなる、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の富化集団を生成する方法。
（ａ）ヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞の培養を提供するステップと；
（ｂ）前記ｈＥＳ細胞を培養して、１つまたは複数の胚様体を生成するステップと；
（ｃ）前記１つまたは複数の胚様体の少なくとも１つ内の推定上のヒトＲＰＥ細胞の出現に十分な時間にわたり、前記１つまたは複数の胚様体を培養し、前記推定上のヒトＲＰＥ細胞が細胞質内に分散する褐色色素を含んでなり、それによって推定上のヒトＲＰＥ細胞を含有する１つまたは複数の胚様体が形成されるステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）の培養から、推定上のヒトＲＰＥ細胞を含有する前記胚様体の１つまたは複数を選択して分離し、ヒトＲＰＥ細胞を得るステップと；
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られた前記ヒトＲＰＥ細胞を培養して、ベストロフィン＋であり、特徴的な敷石多角形の上皮様外観を示して、細胞質内に分散する褐色色素を含んでなる細胞を含有する培養物を形成し、それによってヒトＲＰＥ細胞の富化集団を生成するステップと
を含んでなる、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の富化集団を生成する方法。
ステップ（ｂ）の前記培養するステップが、外部から添加されたＦＧＦを欠く培地中で培養するステップを含んでなる、請求項１７８または１７９に記載の方法。
ステップ（ｂ）の前記培養するステップが、外部から添加されたＬＩＦを欠く培地中で培養するステップを含んでなる、請求項１８０に記載の方法。
ステップ（ｂ）の前記培養するステップが、外部から添加されたＰＬＡＳＭＡＮＡＴＥ（登録商標）を欠く培地（１００ｍＬあたり５ｇの血漿タンパク質を含有して炭酸ナトリウムで緩衝され、０．００５Ｍのカプリル酸ナトリウムおよび０．００４Ｍのアセチルトリプトファンで安定化される水溶液、前記血漿タンパク質はおよそ８８％の正常なヒトアルブミン、１２％のαおよびβグロブリン、および１％以下のγグロブリンを含んでなり、ナトリウム１４５ｍＥｑ／Ｌ、カリウム０．２５ｍＥｑ／Ｌ、および塩化物１００ｍＥ
ｑ／Ｌを含有する）中で培養するステップを含んでなる、請求項１８１に記載の方法。
ステップ（ｂ）の前記培養期間が、約６週間である、請求項１７８～１８３のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）の前記培養期間が、約４週間～約５ヶ月、約７週間～約４ヶ月、約３ヶ月～約５ヶ月、または約６週間～約８週間である、請求項１７８～１８３のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）の前記培養期間が、約３ヶ月～約５ヶ月である、請求項１７８～１８３のいずれか一項に記載の方法。
結果として得られるＲＰＥ細胞培養物が、ベストロフィン＋、ＣＲＡＬＢＰ＋、ＰＥＤＦ＋、およびＲＰＥ６５＋であるＲＰＥ細胞を含有する、請求項１７８～１８５のいずれか一項に記載の方法。
結果として得られるＲＰＥ細胞培養物が、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２からなる群から選択される少なくとも１つのＥＳ細胞マーカーの不在を有する、請求項１８６のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）に先だって、外部から添加されたＦＧＦの存在下で前記ｈＥＳ細胞を培養する、請求項１７８～１８７のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）に先だって、外部から添加されたＦＧＦおよびＬＩＦの存在下で前記ｈＥＳ細胞を培養する、請求項１７８～１８８のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）に先だって、外部から添加されたＦＧＦ、ＰＬＡＳＭＡＮＡＴＥ（登録商標）（１００ｍＬあたり５ｇの血漿タンパク質を含有して炭酸ナトリウムで緩衝され、０．００５Ｍのカプリル酸ナトリウムおよび０．００４Ｍのアセチルトリプトファンで安定化される水溶液、前記血漿タンパク質はおよそ８８％の正常なヒトアルブミン、１２％のαおよびβグロブリン、および１％以下のγグロブリンを含んでなり、ナトリウム１４５ｍＥｑ／Ｌ、カリウム０．２５ｍＥｑ／Ｌ、および塩化物１００ｍＥｑ／Ｌを含有する）、および線維芽細胞支持細胞層の存在下で、前記ｈＥＳ細胞を培養する、請求項１７８～１８８のいずれか一項に記載の方法。
８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を含有するＲＰＥ細胞集団を生成する、請求項１７８～１９０のいずれか一項に記載の方法。
前記平均メラニン含有量が、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、および少なくとも０．１ｐｇ／細胞、および任意選択的に少なくとも０．５ｐｇ／細胞または１ｐｇ／細胞；０．１～８ｐｇ／細胞、０．１～７ｐｇ／細胞、０．１～６ｐｇ／細胞、０．１～５ｐｇ／細胞、０．１～４ｐｇ／細胞、０．１～３ｐｇ／細胞、０．１～２ｐｇ／細胞、０．１～１ｐｇ／細胞、１～７ｐｇ／細胞、０．５～６ｐｇ－細胞、または１～５ｐｇ／細胞である、請求項１９１に記載の方法。
前記メラニン含有量を得るのに十分な時間にわたり、前記ＲＰＥ細胞を静止細胞として維持するステップをさらに含んでなる、請求項１９１または１９２のいずれか一項に記載の方法。
ＲＰＥ生成に先だって、前記多能性細胞が基材上で培養される、請求項１７９～１９３のいずれか一項に記載の方法。
前記基材が、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、ヘパランスルフェート、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ、ヒト基底膜抽出物、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、請求項１９４に記載の方法。
前記基材が、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）を含んでなる、請求項１９４に記載の方法。
前記ＥＢが、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で形成される、請求項１７９～１９６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、請求項１９７に記載の方法。
前記ＲＰＥ形成に先だって、前記多能性細胞をマトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性製剤）上で培養する、請求項１９７または１９８に記載の方法。
結果として得られるＲＰＥ細胞培養物が、Ｐａｘ６＋であるＲＰＥ細胞を含有する、請求項１７８～１９９のいずれか一項に記載の方法。
結果として得られるＲＰＥ細胞培養物が、Ｐａｘ６－であるＲＰＥ細胞を含有する、請求項１７８～２００のいずれか一項に記載の方法。
請求項１７８～２０１のいずれか一項に記載の方法によって生成されたＲＰＥ細胞を含んでなる、医薬品。
８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を含有して、
移植後少なくとも約１ヶ月間にわたり、それらの表現型を維持する、
培養中で少なくとも約１ヶ月間にわたり、それらの表現型を維持する、
移植後に宿主に組み込まれる、
移植後に実質的に増殖しない、
食作用性（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｔｉｃ）である、
ビタミンＡを送達、代謝、または貯蔵する、
移植後に網膜と脈絡膜の間で鉄を輸送する、
移植後にブルッフ膜に付着する、
移植後に迷光を吸収する、
αインテグリンサブユニット発現の上昇を有する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より大きな平均テロメア長を有する
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、培養中でより長い複製寿命を有する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、１つまたは複数のαインテグリンサブユニットのより大きな発現を有する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より低いＡ２Ｅ含有量を有する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より低いリポフスチン含有量を有
する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より少ない紫外線損傷蓄積を示し、または
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より多数の食胞を含有する
特性の少なくとも１つを有する、網膜劣化の治療に適するＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品。
８ｐｇ／細胞未満の平均メラニン含有量を含有して、
移植後にブルッフ膜に付着する、
移植後に迷光を吸収する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より大きな平均テロメア長を有する
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、培養中でより長い複製寿命を有する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より低いＡ２Ｅ含有量を有する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より低いリポフスチン含有量を有する、
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より少ない紫外線損傷蓄積を示し、または
提供されたヒト組織に由来するＲＰＥ細胞と比べて、より多数の食胞を含有する
特性の少なくとも１つを有する、網膜劣化の治療に適するＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品。
前記平均メラニン含有量が、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満および少なくとも０．１ｐｇ／細胞、および任意選択的に少なくとも０．５ｐｇ／細胞または１ｐｇ／細胞；０．１～８ｐｇ／細胞、０．１～７ｐｇ／細胞、０．１～６ｐｇ／細胞、０．１～５ｐｇ／細胞、０．１～４ｐｇ／細胞、０．１～３ｐｇ／細胞、０．１～２ｐｇ／細胞、０．１～１ｐｇ／細胞、１～７ｐｇ／細胞、０．５～６ｐｇ－細胞、または１～５ｐｇ／細胞である、請求項２０２～２０４のいずれか一項に記載の医薬品。
解凍されている、請求項７４～１３４のいずれか一項に記載の冷凍保存ＲＰＥ細胞、または請求項１３５～１４０のいずれか一項に記載のキットに含有される冷凍保存ＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品であって、前記ＲＰＥ細胞が薬学的に許容できる担体中にある、医薬品。
請求項１～７３のいずれか一項に記載の組成物またはキットの前記ＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品。
網膜変性を治療するのに使用するための、請求項２０２～２０７のいずれか一項に記載の医薬品。
必要とする患者において、シュタルガルト病、乾燥型または湿潤型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、コロイデレミア、色素性網膜炎、網膜離脱、網膜異形成、網膜萎縮、色素線条、または近視性黄斑変性に起因する網膜変性を予防または治療するのに有効な量のＲＰＥ細胞を含んでなる、請求項２０２～２０８のいずれか一項に記載の医薬品。
懸濁液、ゲル、またはコロイドなどの注入可能な形態で、移植のために前記製剤が調合される、請求項２０２～２０９のいずれか一項に記載の医薬品。
前記製剤が、基材、基質、スキャフォールド、または移植片との移植のために調合される、請求項２０２～２１０のいずれか一項に記載の医薬品。
前記製剤が眼の網膜下腔への投与のために調合される、請求項２０２～２１１のいずれか一項に記載の医薬品。
前記製剤が、少なくとも約１０^３～１０^９個のＲＰＥ細胞、約１０，０００～約１０^６個のＲＰＥ細胞、約２５，０００～約４００，０００個のＲＰＥ細胞、または約５０，０００～約２００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでなる、請求項２０２～２１２のいずれか一項に記載の医薬品。
１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーの実質的発現が、前記ＲＰＥ細胞に欠如している、請求項２０２～２１３のいずれか一項に記載の医薬品。
前記１つまたは複数の胚性幹細胞マーカーが、Ｏｃｔ－４、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ－１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ－１、ＤＰＰＡ－２、および／またはＤＰＰＡ－４を含んでなる、請求項２１４に記載の医薬品。
前記ＲＰＥ細胞が、少なくとも１つのＲＰＥ細胞マーカーについて陽性である、請求項２０２～２１５のいずれか一項に記載の医薬品。
前記少なくとも１つのＲＰＥ細胞マーカーが、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ベストロフィン、ＭＩＴＦ、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、またはチロシナーゼの少なくとも１つを含む、請求項２１６に記載の医薬品。
前記ＲＰＥ細胞が、増大するαインテグリンサブユニット発現を示す、請求項２０２～２１７のいずれか一項に記載の医薬品。
前記αインテグリンサブユニットが、α１、２、３、４、５、６、または９である、請求項２０８に記載の医薬品。
前記ＲＰＥ細胞が、表５に列挙される基準の少なくとも１つを満たす、請求項２０２～２１９のいずれか一項に記載の医薬品。
前記製剤が、少なくとも約７５％のＲＰＥ細胞を含んでなる、請求項２０２～２２０のいずれか一項に記載の医薬品。
前記製剤が、ウイルス、細菌、および／または真菌汚染を実質的に含まない、請求項２０２～２２１のいずれか一項に記載の医薬品。
前記製剤が、薬学的に許容できる担体中で調合される、請求項２０２～２２２のいずれか一項に記載の医薬品。
前記製剤が眼への投与のために調合される、請求項２０２～２２３のいずれか一項に記載の医薬品。
前記製剤が、網膜下空隙への投与のために調合される、請求項２２４に記載の医薬品。
前記ＲＰＥ細胞が、移植時に網膜に組み込まれることができる機能性ＲＰＥ細胞である、請求項２０２～２２５のいずれか一項に記載の医薬品。
前記医薬品が、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を実質的に含まない、２０２～２２６のいずれか１つに記載の医薬品。
前記製剤が優良製造規範（ＧＭＰ）に準拠している、２０２～２２７のいずれか１つに記載の医薬品。
請求項１～１４０のいずれか一項に記載の組成物またはキットの前記ＲＰＥ細胞を含んでなる医薬品、請求項２０２～２２８のいずれか一項に記載の医薬品、または請求項１４７～２０１のいずれか一項に記載の方法に従って製造されたＲＰＥ細胞を、それを必要とする対象の眼に、ＲＰＥ細胞移植が治療的に望ましい前記網膜変性病状またはその他の病状を治療するのに効果的な量で投与するステップを含んでなる、ＲＰＥ細胞の移植が治療的に望ましい網膜変性の病状またはその他の病状を治療する方法。
前記網膜変性病状が、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（乾燥型または湿潤型）、網膜離脱、色素性網膜炎、シュタルガルト病、色素線条、または近視性黄斑変性を含んでなる、請求項２２９に記載の方法。
前記投与するステップが、前記ＲＰＥ細胞をそれを必要とする眼に眼内投与するステップを含んでなる、請求項２２９または２３０に記載の方法。
前記眼内投与が、前記ＲＰＥ細胞を網膜下腔に注入するステップを含んでなる、請求項２３１に記載の方法。
前記眼内投与が、任意選択的に等張溶液および／または食塩溶液である水溶液を網膜下腔に注入し、それによって事前ブレブを形成するステップと、前記水溶液と同一の網膜下腔に前記ＲＰＥ細胞を投与する前に、前記水溶液を除去するステップとを含んでなる、請求項２３２に記載の方法。
前記注入が、針または注入カニューレを経由する、請求項２３２または２３２に記載の方法。
前記針または注入カニューレ径が、約０．３ｍｍ～０．９ｍｍまたは約０．５～約０．６ｍｍである、請求項２３４に記載の方法。
前記針または注入カニューレが、約０．０９ｍｍ～約０．１５ｍｍ径の先端を含んでなる、請求項２３４～２３５のいずれか一項に記載の方法。
前記カニューレが、ＭＥＤＯＮＥＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２５／３８ｇ（０．１２ｍｍ（３８ｇ）×５ｍｍの先端付き０．５０ｍｍ（２５ｇ）×２８ｍｍカニューレ）である、請求項２３４～２３６のいずれか一項に記載の方法。
治療有効性が、細隙灯生体顕微鏡写真、眼底撮影、ＩＶＦＡ、およびＳＤ－ＯＣＴ、および最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の１つまたは複数によって、視覚的結果を判定することで評価される、請求項２２９～２３７のいずれか一項に記載の方法。
矯正視力（ＢＣＶＡ）に改善を生じる、および／または糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）視力表上の可読文字数を増大させる、請求項２２９～２３８のいずれか一項に記載の方法。
前記網膜変性の病状が、乾燥型ＡＭＤまたはシュタルガルト病である、請求項２３９に記載の方法。
前記網膜変性の病状を治療するのに有効な前記量が、約２０，０００～２００，０００個のＲＰＥ細胞、約２０，０００～５００，０００個のＲＰＥ細胞、約２０，０００～２，０００，０００個のＲＰＥ細胞、または少なくとも約２０，０００個のＲＰＥ細胞である、請求項２２９～２４０のいずれか一項に記載の方法。
前記網膜変性の病状を治療するのに有効な前記量が、少なくとも約２０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、２００，０００、または５００，０００個のＲＰＥ細胞である、請求項２４１に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞の前記投与に先だって、またはそれと同時に、コルチコステロイドが前記対象に投与されない、請求項２２９～２４２のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞の前記投与の少なくとも３、６、１２、２４、４８、７２、または９６時間前に、または前記ＲＰＥ細胞の前記投与と同時に、コルチコステロイドが前記対象に投与されない、請求項２２９～２４２のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞の前記投与の少なくとも１時間前に、または前記ＲＰＥ細胞の前記投与の直前に、またはそれと同時に、コルチコステロイドが前記対象に投与されない、請求項２２９～２４４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞の前記投与に引き続いて、少なくとも１２、２４、４８、７２、または９６時間以内に、前記対象にコルチコステロイドが投与されない、請求項２２９～２４５のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞の前記投与に引き続いて、少なくとも４８時間以内に、前記対象にコルチコステロイドが投与されない、請求項２２９～２４５のいずれか一項に記載の方法。
血管新生阻害剤、抗酸化剤、抗酸化剤補助因子、抗酸化活性増大に寄与するその他の因子、黄斑キサントフィル、長鎖ω－３脂肪酸、アミロイド阻害剤、ＣＮＴＦ作動薬、ＲＰＥ６５の阻害剤、Ａ２Ｅおよび／またはリポフスチン蓄積を標的とする因子、光受容体機能および／または代謝の下方制御剤または阻害剤、α２－アドレナリン受容体作動薬、選択的セロトニン１Ａ作動薬、Ｃ－５を標的にする因子、膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ－９）および任意選択のその他のドルーゼン成分、免疫抑制剤、およびリポフスチン蓄積を予防または治療する薬剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬剤と組み合わされて、前記ＲＰＥ細胞が患者に投与される、請求項２２９～２４７のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の薬剤が、前記ＲＰＥ細胞製剤と同時に、それに先だって、および／またはそれに引き続いて、前記患者に投与される、請求項２４８に記載の方法。
ＲＰＥ細胞の移植が治療的に望ましい、網膜変性の病状またはその他の病状を治療するための薬剤の製造における、請求項１～１４０または２０２～２２８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または医薬品の使用。
前記網膜変性の病状が、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、乾燥型加齢黄斑変性、湿潤型加齢黄斑変性、網膜離脱、色素性網膜炎、シュタルガルト病、色素線条、または近視性黄斑変性を含んでなる、請求項２５０に記載の使用。
前記多能性幹細胞が、ＯＣＴ－４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、およびＴＲＡ－１－８０からなる群から選択される、１つまたは複数のマーカーを発現する、請求項１４７～２０１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＰＥ細胞が、
その他の起源から得られるＲＰＥ細胞の複製寿命と比べて、より長い複製寿命；
ｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞（またはｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞集団の平均）のテロメア長の少なくとも３０パーセント、またはｈＥＳＣおよび／またはヒトｉＰＳ細胞のテロメア長の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０または９０パーセントである平均テロメア長；
４ｋｂより長く、または５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ｋｂより長く、または１０ｋｂ以上の平均最終制限酵素断片長（ＴＲＦ）；
成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均リポフスチン含有量の５０パーセント未満であり、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均リポフスチン含有量の４０、３０、２０または１０パーセント未満である、平均リポフスチン含有量；
成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の平均Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）含有量の５０パーセント未満であり、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均Ａ２Ｅ含有量の４０、３０、２０または１０パーセント未満である、平均Ａ２Ｅ含有量；
１０^５（１００，０００）個の細胞あたり５０ｎｇ未満である、平均Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）含有量；
成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の視細胞外節（ＰＯＳ）の食作用速度と比べて少なくとも５０パーセント大きく、または成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞のＰＯＳの食作用速度と比べて少なくとも７５、１００、１５０または２００パーセント大きい、ＰＯＳの食作用速度；
２４時間後のＰＯＳ総濃度の少なくとも２０パーセントであり、または２４時間後のＰＯＳ総濃度の少なくとも２５、３０、２５、４０または５０パーセントである、視細胞外節（ＰＯＳ）の食作用速度；
成人宿主から単離されたＲＰＥ細胞と比較して、低下している酸化的ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷の蓄積レベル；
成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の平均プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）活性よりも少なくとも５０パーセント大きく、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）活性よりも少なくとも６０、７０、８０、９０または１００パーセント大きい、平均プロテアソーム活性；
成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞のユビキチン抱合体の平均蓄積の５０パーセント未満であり、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞ユビキチン抱合体の平均蓄積の４０、３０、２０または１０パーセント未満である、ユビキチン抱合体の平均蓄積
の特性の１つまたは複数を示す、請求項１～１４０または２０２～２２８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または医薬品。
前記ＲＰＥ細胞が、
その他の起源から得られるＲＰＥ細胞の複製寿命と比べて、より長い複製寿命；
成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均リポフスチン含有量の５０パーセント未満であり、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均リポフスチン含有量の４０、３０、２０または１０パーセント未満である、平均リポフスチン含有量；
成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ
細胞の平均Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）含有量の５０パーセント未満であり、または成人の眼から単離された同等数のＲＰＥ細胞の平均Ａ２Ｅ含有量の４０、３０、２０または１０パーセント未満である、平均Ａ２Ｅ含有量；
１０^５（１００，０００）個の細胞あたり５０ｎｇ未満である、平均Ｎ－レチニリデン－Ｎ－レチニルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）含有量；
成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞の視細胞外節（ＰＯＳ）の食作用速度と比べて少なくとも５０パーセント大きく、または成人の眼から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄａｄｕｌｔｅｙｅｓ）同等数のＲＰＥ細胞のＰＯＳの食作用速度と比べて少なくとも７５、１００、１５０または２００パーセント大きい、ＰＯＳの食作用速度；または
成人宿主から単離されたＲＰＥ細胞と比較して、低下している酸化的ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷の蓄積レベル
の特性の１つまたは複数を示す、請求項１～１４０または２０２～２２８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または医薬品。