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KR102198942B1 - Pedf를 발현하거나 모세포에 비하여 pedf를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포 - Google Patents

Pedf를 발현하거나 모세포에 비하여 pedf를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포 Download PDF

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KR102198942B1
KR102198942B1 KR1020190079708A KR20190079708A KR102198942B1 KR 102198942 B1 KR102198942 B1 KR 102198942B1 KR 1020190079708 A KR1020190079708 A KR 1020190079708A KR 20190079708 A KR20190079708 A KR 20190079708A KR 102198942 B1 KR102198942 B1 KR 102198942B1
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KR
South Korea
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pedf
stem cells
mesenchymal stem
cells
retinal
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KR1020190079708A
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Inventor
김기진
박소혜
김재연
Original Assignee
의료법인 성광의료재단
차의과학대학교 산학협력단
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Abstract

PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포에 관한 것이다. 일 양상에 따른, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품은 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 망막 질환 또는 간 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PEDF를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포{GENETICALLY ENGINEERED MESENCHYMAL STEM CELL FOR EXPRESSING PEDF OR OVEREXPRESSING PEDF COMPARED TO MOTHER CELL}
PEDF를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
막은 눈의 내부에 존재하는 얇은 신경막으로서, 안구 내로 전달된 빛을 전기신호로 바꾸어 신경을 통해 뇌에 전달하는 중요한 역할을 한다. 어떤 사물을 볼 때 망막의 중심부에 위치한 황반을 통하여 보게 됨으로 중심시력이라고 말한다. 망막의 바깥쪽에 단층으로 존재하는 망막색소상피(Retinal pigment epithelium)가 시각 능력을 담당하는 광수용세포의 식세포작용을 도와줌으로써 건강한 시각 능력을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다. 이러한 망막색소상피세포의 산화적 스트레스(oxidative stress) 및 세포사멸(apoptosis)을 유도하여 황반변성이 유발된다고 알려져 있다.
황반변성의 종류는 크게 건성과 습성으로 분류된다. 황반변성 환자의 약 90% 이상은 건성 황반변성을 가지고 있다. 이는 망막에 드루젠(drusen) 이라는 세포대사로 생긴 노폐물이 쌓여 생긴 경우이며 시세포가 점점 위축되고 시력이 점차 감소하여 심한 경우 습성으로 악화될 가능성이 있다. 습성은 맥락막 신생혈관을 일으킬 때 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)의 과발현-색소상피유래인자(Pigment epithelium-derived factor; PEDF)의 저발현을 초래하여 혈관의 삼출에 의한 시력 손상 및 실명까지도 유발될 수 있는 위험성이 있다. 이러한 질병에 대한 증상을 완화시키기 위한 치료법으로 anti-VEGF 주사제 등 일부 치료법이 있지만, 현재까지 황반변성의 근본적인 치료법은 개발되지 못한 실정이다.
이에, 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 특히 망막색소상피세포 또는 간 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 예를 들어, 황반변성을 포함하는 망막 질환 또는 간 질환의 근본적인 치료법이 절실한 실정이다.
일 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 포함하는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 포함하는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료 방법에 제공하는 것이다.
일 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC)"는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래, 골수 유래, 태반(placenta) 유래 및 지방 유래 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 태반 유래 중간엽 줄기세포는 태반을 구성하는 다양한 조직, 예를 들어 양막 상피 세포, 양막, 영양막, 융모막 등의 조직으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는 상기 태반 유래 중간엽 줄기세포는 태반의 융모막판(chorionic plate)으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 융모막판막(chorionic plate membrane)으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 중간엽 줄기세포의 분리는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 PEDF 또는 그의 활성 단편을 분비하거나, PEDF 또는 그의 활성 단편을 발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 하기 a) 또는 b)의 특성을 가질 수 있다:
a) PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하는 특성;
b) CD13, CD90, CD105, HLA-ABC 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.
상기 중간엽 줄기세포는 CD13, CD90, CD105, HLA-ABC 및 HLA-G 를 발현하는 것일 수 있다. 상세하게는, 본 명세서에서 제공되는 중간엽 줄기세포는 세포 표면에 발현되는 세포 표지자에 대하여 CD13, CD90, CD105, HLA-ABC 및 HLA-G 양성 표면 마커를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 발현하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "양성"은 줄기세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 비줄기 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 CD90에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "CD90+"이다.
본 명세서에서 용어, "음성"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD34에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 "CD34-"이다. 상기 중간엽 세포는 "CD34-" 및 "HLA-DR-"의 특성을 가진다.
상기 중간엽 줄기세포는 대안적으로 그의 배양물, 용해물 또는 그의 추출물이 이용될 수 있다. 상기 배양물, 용해물 또는 추출물은 세포 그대로를 이용하기 어려운 경우 유용한 대안이 될 수 있으며, 단백질 등을 포함한 세포의 구성 성분을 포함하고 있으므로 본래 세포와 유사하거나 동등한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 상기 용해물 또는 추출물은 상업적으로 이용가능한 세포 용해 키트, 또는 추출 키트 등을 이용하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서 용어 "PEDF(pigment epithelium-derived factor)"는 인간을 포함한 척추동물, 예를 들면, 포유류, 어류, 양서류, 조류, 또는 파충류 유래의 PEDF을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PEDF는 PEDF의 전구체도 포함하는 의미일 수 있다.
상기 PEDF는 많은 생물학적 기능을 가진 다기능성 단백질로서, 최초에 망막색소상피에서에서 생산되어 분비된다는 것이 알려져 있다. 상기 PEDF는 항암 작용 및 신경영양 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 망막의 신생혈관과 혈관내피세포의 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다. 또한, PEDF는 암세포 내에서 VEGF의 발현량을 억제시킬 뿐만 아니라 암세포의 증식도 억제한다고도 알려져 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "유전적 조작(genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된(genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 예를 들면, 상기 중간엽 줄기세포 또는 숙주 세포는 PEDF 또는 그의 활성 단편의 발현 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 것, 예를 들면, PEDF 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
상기 활성 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예: 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 단백질 또는 효소의 활성에 비해, 동일한 타입의 단백질 또는 효소의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다.
상기 외인성 유전자는, 상기 중간엽 줄기세포 또는 숙주 세포에서 그 모세포에 비하여 언급된 단백 질의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터(예: 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질(예: 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 유전적 조작은 전기천공법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PEDF 또는 그의 활성 단편은 융합 단백질로써 제조될 수 있다. 융합 단백질을 제조하기 위한 방법에서, PEDF 또는 그의 활성 단편을 암호화하고 있는 폴리뉴클레오티드는 다른 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 프레임(frame)에 연결(ligate)될 수 있으며, 이것은 숙주(host)에서의 발현(expression)을 위해 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 당업계에 알려진 기술들은 이런 목적을 위해 이용될 수 있다. PEDF와 융합된 펩타이드들을 위해, FLAG, 6개의 히스티딘(His)으로 이루어진 6x His 잔기들(residues), 10x His, influenza hemagglutinin(HA), 인간 cmyc 단편, VSV-GP 단편, p18HIV 단편(fragments), T7-태그(tag), HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck 태크, 알파-튜블린(alpha-tubulin) 단편, B-태그, 및 Protein C 단편과 같이 알려진 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, 융합 단백질을 만들기 위해 PEDF 또는 그의 활성 단편을 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase, GST), influenza hemagglutinin(HA), immunoglobulin constant regions, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 말토즈-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP) 등을 연결하는 것이 가능하다.
따라서, 다른 구체예에 있어서, 상기 PEDF 또는 그의 활성 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공될 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
또한, 상기 중간엽 줄기세포, PEDF 또는 그의 활성 단편은 상피세포, 예를 들어 망막색소상피세포 또는 간상피세포 내 산화적 스트레스를 감소시켜 세포 사멸을 억제하는 것일 수 있다. 이는 산화적 스트레스를 유발하는 인자 또는 세포 사멸을 유발하는 인자의 발현을 감소시킴으로써 이루어질 수 있다.
다른 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 포함하는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "PEDF", "유전적 조작"등은 전술한 범위 내일 수 있으며, 예를 들어, 상기 유전적 조작은 전기천공법에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 "중간엽 줄기세포"는 전술한 범위 내일 수 있으며, 예를 들어, 줄기세포는 제대혈 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 상피세포는 예를 들어, 망막색소상피세포 또는 간상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 망막색소상피세포일 수 있다.
또 다른 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 망막 질환은 예를 들어, 망막동맥폐쇄, 망막정맥폐쇄, 망막정맥주위염, 고혈압망막병증, 당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 감각신경망막염증, 망막색소상피염증, 망막색소변성, 혈관무늬병증, 드루젠, 열공망막박리, 비열공망막박리, 황반변성, 황반이상증, 당뇨망막병증, 망막동정맥폐쇄, 고혈압성 망막병증, 망막대동맥류, 안허혈증후근, 방사선망막병증, 미숙아망막병증, 급성망막괴사, 망막염, 망막맥락막염, 망막박리, 망막종양, 외상에 의한 망막 손상 및 빛에 의한 망막 손상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환일 수 있으며, 바람직하게는 황반변성일 수 있다.
또 다른 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 간질환은 지방간, 간경화, 간염 및 간암으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환일 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 상피세포의 세포 사멸을 억제하여 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 망막 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다. 예를 들어, 망막색소상피세포 내 산화적 스트레스를 감소시켜 세포 사멸을 억제하여 망막색소상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환 또는 망막 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 망막 질환 또는 간 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 망막 질환 또는 간 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
또한, 상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 망막 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 망막 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물과 병행하여 투여할 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
상기 용어 "개체"란 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 망막 질환 또는 간 질환을 보유할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
일 양상에 있어서, 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 0.01 내지 1000 mg/kg/day로, 보다 구체적으로 0.1 내지 500 ㎎/kg/day로 투여될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.
또 다른 양상은 PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포를 포함하는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 "중간엽 줄기세포", "상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환" 및 "예방" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품은 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 건강기능식품은 원료에 대하여 구체적으로 약 15 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 일 양상에 따른 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도, 일 양상에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
상기 "개체", "투여", "약학적 조성물", "상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 따른 PEDF를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하는 중간엽 줄기세포, 특히 태반 유래 중간엽 줄기세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품은 상피세포의 산화적 스트레스와 사멸 관련 유전자의 발현을 현저하게 감소시킴으로써 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환, 망막 질환 또는 간 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 내지 3은 전기천공법을 이용하여 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 제작하여 특징을 분석한 결과로서, 구체적으로 도 1은 PEDF 유전자의 과발현 여부, 줄기세포의 미분화능에 대한 마커 발현 및 계대에 따른 세포의 성장 속도를 확인한 도이고, 도 2는 조혈마커 및 비-조혈 마커에 대한 결과를 나타낸 도이며, 도 3은 칼슘 축적 및 지질 세포를 염색으로 확인하고, 골세포 또는 지방세포 특이적 유전자 발현을 확인한 도이다.
도 4는 산화적 스트레스가 유도된 망막색소상피세포와 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 공배양을 통한 망막색소상피세포의 특징분석 및 향상된 증식력을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 RNA 및 단백질 수준에서 산화적 스트레스가 유도된 망막색소상피세포와 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 공배양을 통한 세포사멸 억제 및 산화적 스트레스 억제를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 RNA 수준에서의 산화적 스트레스가 유도된 간암상피세포와 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 공배양을 통한 산화적 스트레스 억제를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 PEDF 과발현된 지방, 골수, 태반 및 제대혈-유래 중간엽 줄기세포의 제작을 통한 PEDF 농도를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참조예
참조예 1. 전기천공법을 이용한 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포 제작
대한민국 공개특허 제10-2008-0104850호에 따라 제조된 태반-유래 중간엽 줄기세포(Placenta-derived stem cell, 이하 "PDSC")를 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S), 25 ng/ml 섬유아세포성장인자-4(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4), 1 ㎍/ml 헤파린이 포함된 MEM(minimum essential medium)-alpha modification 배지 중에서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포를 회수하여 1200 rpm에서 5분 간 원심분리하였다. 회수된 세포를 혈색소계(hemocytometer)를 이용하여 계수한 후, 재회수를 통해 200 g에서 10분 간 원심분리하여 보충물이 포함되어 있는 Nucleofector를 넣어 세포(5x105 / 100 ㎕)를 현탁시켰다. PEDF를 포함하는 DNA 플라스미드 2 ㎍을 넣어 큐벳 내에서 Nucelofection 장비에 넣어 U-23 조건으로 프로그램을 작동시켰다. 종료된 후 신속하게 새로운 배지를 포함하고 있는 배양접시를 37℃, 5% CO2 배양기에서 안정화시켰다. 4시간 후, 부착된 세포는 100 ㎍/ml Hygromycin을 포함하고 있는 상기 태반-유래 중간엽 줄기세포 배지(1%, P/S는 미포함)를 이용하여 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 선택적으로 배양함으로써, 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 내에 PEDF 유전자를 전기청공법을 이용하여 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 제작하였다.
참조예 2. PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 특징 분석
먼저, PEDF 유전자의 과발현 여부 및 줄기세포의 미분화능을 확인하기 위하여 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR, qRT-PCR) 및 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR) 분석을 실시하였다. 배양된 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포에 Trizol을 이용하여 용해시키고 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA 합성 단계를 진행시켰다. qRT-PCR 및 RT-PCR을 진행하기 위해, 유전자 특이적 염기서열과 FastStart universal SYBR master mix 및 중합효소(Polymerase)를 이용한 PCR 증폭단계, 그리고 증폭된 PCR 산물들의 정량적인 결과를 나타내고자 하였다. 각 유전자의 증폭 시 사용된 프라이머 서열, PCR 반응의 조성 및 반응조건은 각각 하기 표 1 내지 표 3과 같았다.
마커 유전자 서열번호 프라미머 서열(5'-3') 접합온도(℃)
줄기세포성 Oct-4 1 F: AGT GAG AGG CAA CCT GGA GA 52
2 R; GTG AAG TGA GGG CTC CCATA
Nanog 3 F: TTC TTG ACT GGG ACC TTG TC 52
4 R: GCT TGC CTT GCT TTG AAG CA
Sox-2 5 F: AGA ACC CCA AGATGC ACA AC 52
6 R: GGG CAG CGT GTA CTT ATC CT
HLA-G 7 F: GCG GCT ACTACA ACC AGA GC 58
8 R: GCA CAT GGC ACG TGT ATC TC
TERT 9 F: GAGCTGACGTGGAAGATGAG 55
10 R: CTT CAA GTG CTG TCT GAT TCC AAT G
골세포성 OC 11 F: CAC TCC TCG CCC TAT TGG C 58
12 R: CCC TCC TGC TTG GAC ACA AAG
COL1A1 13 F: AGA CAT CCC ACC AAT CAC CT 60
14 R: CGT CAT CGC ACA ACA CCT
지방세포성 Adipsin 15 F: GGT CAC CCA AGC AAC AAA GT 60
16 R: CCT CCT GCG TTC AAG TCA TC
PPAR-γ 17 F: TTG ACC CAG AAA GCG ATT CC 55
18 R: AAA GTT GGT GGG CCA GAA TG
망막색소
상피세포성		 RPE65 19 F: ATG GAC TTG GCT TGA ATC ACT T 55
20 R: GAA CAG TCC ATG AAA GGT GAC A
BEST1 21 F: ATC AGA GGC CAG GCT ACT ACA G 58
22 R: TCC ACA GTT TTC CTC CTC ACT T
RLPB1 23 F: TCA GAG GCT ATG TGA ATT TCC G 55
24 R: GCC TGC AAG ATC TCA TCA AAG
RGR 25 F: TAC TGC ACC CGT AGC CAG C 60
26 R: AAG CTG GTG AAG TTT CTG TCC C
RRH 27 F: GAT GTA ACA AAG ATG TCT GTG 52
28 R: CCT CCG AAA CTT TTT ATT AGC
산화적
스트레스성		 HO1 29 F: GCA GAG AAT GCT GAG TTC ATG 55
30 R: CAC ATC TAT GTG GCC CTG GAG GA
HO2 31 F: ATG TCA GCG GAA GTG GAA 55
32 R: GGG AGT TTC AGT GCT CGC
SOD1 33 F: GCT GTA CCA GTG CAG GTC CTC A 55
34 R: CAT TTC CAC CTT TGC CCA AGT C
SOD2 35 F: GGA GAA CCC AAA GGG GAG TTG 55
36 R: GCC GTC AGC TTC TCC TTA AAC
GPX1 37 F: ACA CCC AGA TGA ACG AGC TG 55
38 R: CAA ACT GGT TGC ACG GGA AG
- PEDF 39 F: TGC TAC TCC TCT GCA TTG GA 60
40 R: ACA GGT CAT AGC CGA AGT TG
내부 대조군 GAPDH 41 F: GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC 55
42 R: GTG GTG AAG ACG CCA GTG GA
PCR 반응 용액 용적
cDNA 5 ㎕
정방향 프라이머(Forward primer) 0.5 ㎕
역방향 프라이머(Reverse primer) 0.5 ㎕
효소(FasStart universal SYBR master mix) 12.5 ㎕
DEPC-처리된 물(DEPC-treated water)* 6.5 ㎕
총량 25 ㎕
* 디에틸피로카보네이트(Diethylpyrocarbonate, DEPC)-처리된 물
95 ℃ Tm ℃ 사이클
변성 10 분 1
증폭 10 초 30 초 (55 ℃) 40
용해 1 초 (60-94 ℃)
(melt curve 65-95℃, increasing 1℃)		 1
최종 1 분 1
또한, 세포 성장을 확인하기 위해 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포와 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 계대별로 12, 24, 48 및 72시간 별로 세포를 수확하여 혈색소계(hemocytometer)를 이용하여 세포의 수를 측정하였다. 분석은 하기 수학식 1과 같이 분석하였다. t는 시간, N0는 최초의 세포 개수, N1은 수확된 세포의 개수를 의미한다.
[수학식 1]
TD = t x lg2/(lgN1 - lgN0)
또한, 세포표면 항원을 검출하기 위해, 유세포 분석기를 이용하여 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포와 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 수확한 후, 특정 농도의 형광 이소티아네이트 (fluorescein isothiocyanate, FITC)- 또는 피코에트린 (phycoerythrin, PE)-포함하고 있는 항체를 반응시켜 유세포 분석기(FACS)로 측정하였다. 각 항체의 정보는 하기 표 4와 같았다.
마커 회사 종
CD34-PE BD 마우스
CD13-PE BD 마우스
CD90-PE BD 마우스
CD105-PE BD 마우스
HLA-ABC-FITC BD 마우스
HLA-DR-FITC BD 마우스
HLA-G-FITC Abcam 마우스
또한, 줄기세포로서의 분화능을 확인하기 위해, PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 골세포 및 지방세포로 분화를 유도하였다. PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포(5x103 cells / cm2)를 배양 후, 골세포 및 지방세포 분화유도배지(Gibco. USA)로 2일마다 1회씩 배지를 교환하였다. 21일 후, 분화 유도된 세포를 4% paraformaldehyde을 이용하여 고정시킨 후, 1시간동안 본 코사(Von Kossa, Sigma-Aldrich) 및 오일 레드 오(Oil Red O, Sigma-Aldrich) 염색법을 통해 칼슘 및 지질 소포의 축적량을 시각화하였다. 골세포 및 지방세포로 분화된 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포로부터 qRT-PCR 기법을 통해 골세포 및 지방세포 특이적 유전자 발현을 확인하였다. 증폭된 유전자의 프라이머 서열, PCR 반응조건은 각각 상기 표 1 내지 표 3과 같았다.
참조예 3. PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 공배양을 통한 망막색소상피세포 및 간암상피세포의 특징 및 증식력 분석
망막색소상피세포주(ARPE-19, ATCC CRL-2302) 또는 간암상피세포(HepG2, ATCC HB-8065)에 과산화수소(hydrogen peroxide; H2O2, 200 μM)를 2시간 처리 후 산화적 스트레스를 유발하여 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포와 PEDF 기능 강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양하여 망막색소상피세포 특이적 유전자 마커 및 증식력을 RT-PCR 및 Cell counting kit-8(CCK-8) 기법을 진행하여 분석하였다. 24-well 배양접시 내에 망막색소상피세포 또는 간암상피세포를 성장시킨 후, 과산화수소(200 μM)를 2시간 처리하여 상위 챔버에 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포와 PEDF 기능 강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양시켰다. 24시간 후, 망막색소상피세포 또는 간암상피세포를 수확하여 용해시킨 후, 역전사효소를 이용하여 cDNA 합성 단계를 진행하였다. 망막색소상피세포 특이적 유전자 마커를 확인하기 위해, RT-PCR을 위한 프라이머 서열, PCR 반응조건 및 조성은 각각 상기 표 1 내지 표 3과 같았다. 또한, 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포와 PEDF 기능 강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 포함하고 있는 상위 챔버를 회수하여 CCK-8 시약을 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기 조건 중에서 2시간동안 배양하였다. 450 nm 파장을 지정하여 흡광도를 측정하였다.
참조예 4. RNA 및 protein 수준에서의 산화적 스트레스 및 세포사멸 관련 유전자 발현 분석
상기와 동일한 조건으로 세포를 회수하여 산화적 스트레스 및 세포사멸 관련된 유전자 발현에 대하여 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR, qRT-PCR) 및 웨스턴블랏팅(Western blotting) 분석을 실시하였다. 망막색소상피세포 및 간암상피세포주를 회수하여 RNA를 추출하여 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용한 cDNA합성 단계, 산화적 스트레스 특이적 유전자 염기서열과 FastStart universal SYBR master mix를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 수치적 결과(CT value)를 바탕으로 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 각 유전자의 증폭에 사용된 프라이머 서열, PCR 반응의 조성 및 반응조건은 각각 상기 표 1 내지 표 3과 같다.
또한, 상기와 동일한 조건으로 세포를 회수하여 인산효소저해제와 단백질 분해효소 저해제가 포함된 RIPA lysis 완충액를 사용하여 단백질을 추출하였다. 단백질 샘플(20 ㎍)은 SDS-PAGE를 사용하여 이뮤노블롯팅(Immunoblotting) 플리비닐리딘다이플루오라이드((polyvinylidinedifluoride, PVDF) 반투막에서 전기영동하였다. 상기 반투막은 블로킹 완충액(5% 우혈청알부민, Bovine Serum Albumin, BSA)에서 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 항-SOD1 다클론 항체(1:1000 희석), 항-HO1 다클론 항체(1:1000 희석;), 항-Catalase 다클론 항체(1:500), 항-caspase-3 다클론 항체(1:1000 희석) 및 항-GAPDH 다클론 항체(1:3000 희석)를 사용하여 4℃에서 반응시켰다. 16시간 후, 인산완충식염수(washing solution; 0.1% 트윈-20)에서 5분 간 5번 세척하고 효소(horseradish peroxidase)와 결합된 쥐의 IgG에 대응하는 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시킨 후, 화학발광검사(chemiluminescence)를 통해 항체 특이적 밴드를 검출하였다.
참조예 5. 세포 배양액 내의 PEDF 또는 VEGF 농도 측정
PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포로 인한 세포 배양액 내의 PEDF 또는 VEGF의 농도를 측정하기 위해, 망막색소상피세포, 간암상피세포 또는 지방-유래(Adipo-derived), 골수-유래(Bone marrow-derived), 태반-유래, 제대혈-유래(Umbilical cord-derived) 중간엽 줄기세포 세포의 배양액을 수확하여 Human PEDF 또는 VEGF ELISA kit(abcam, UK)를 사용하였다. 제조사에서 제공하는 실험법에 따라 PEDF 또는 VEGF 농도를 측정하였다. 지방-유래 중간엽 줄기세포는 10% 우태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 MEM-alpha modification 배지, 골수-유래 중간엽 줄기세포는 10% 우태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-glutamine이 포함된 MEM-alpha modification 배지, 제대혈-유래 중간엽 줄기세포는 20% 우태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 MEM-alpha modification 배지 그리고 간암세포주는 10% 우태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM (dulbecco modified eagle medium) 배지 중에서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
참조예 6. 통계적 분석
하기 결과들은 평균 ± SD로 나타내었다. 통계학적 유의성은 Student's t-테스트를 사용하여 P < 0.05의 유의 수준으로 다중 비교(multiple comparison)로 측정하였다.
실시예
실시예 1. PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 특징 분석
천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 내에 PEDF 유전자를 참조예 1과 같이 전기청공법을 이용하여 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 제작하였다. PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포주를 제작한 후, 줄기세포의 기능을 유지함을 확인하기 위해 특징 분석을 하였다.
먼저, PEDF 유전자의 과발현 여부 및 줄기세포의 미분화능에 대한 마커 발현을 qRT-PCR 및 RT-PCR 기법으로 분석하였다.
그 결과, 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포에서 PEDF 유전자의 발현이 현저히 증가하였고(도 1A), 미분화성 마커(Oct4, Nanog, Sox2)의 발현 또한 증가하였다. 면역관용능력 유전자(HLA-G) 및 텔로미어 효소(TERT) 마커 발현도 유지하는 것을 확인하였다(도 1B).
또한, 계대에 따른 세포의 성장속도에서 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 passage 6에서는 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포의 성장속도의 큰 차이는 보이지 않았지만, PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 passage 1에서 12시간을 제외한 24, 48, 72시간에서 세포분열이 활발하다는 것을 알 수 있었다(도 1C).
또한, 유세포 분석기를 통해 확인한 결과, 조혈 마커(Hematopoietic markers)(CD34 및 HLA-DR)에 대해서는 음성이고(도 2A 및 2B), 비-조혈 마커(CD13, CD90, CD105, HLA-ABC 및 HLA-G)에 대해서는 양성의 결과로 확인하였다(도 2C 내지 2F).
또한, PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 확인하기 위해 21일 동안 골세포 및 지방세포로 분화를 유도하였다.
그 결과, 골세포 분화 후, 칼슘의 축적은 본 코사 염색기법을 통해 확인하였고(도 3A), qRT-PCR 분석을 통해 골세포 특이적 유전자 (Osteocalcin; OC, Collagen type 1 alpha 1; COL1A1) 발현이 미분화 대비 골세포 분화된 세포에서 현저히 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 3B 및 3C). 지방세포 분화 후, 지질 소포는 오일 레드 오 염색기법을 통해 확인하였고(도 3D), qRT-PCR 분석을 통해 지방세포 특이적 유전자(Adipsin, PPAR-γ) 발현이 미분화 대비 지방세포 분화된 세포에서 상당히 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 3E 및 3F).
실시예 2. 산화적 스트레스가 유도된 망막색소상피세포와 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포의 공배양을 통한 망막색소상피세포의 특징 및 증식력 분석
과산화수소를 처리하여 망막색소상피세포는 산화적 스트레스가 유발되었고, 이 후, 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포와 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포와 공배양 후 망막색소상피세포의 PEDF 또는 VEGF 농도, 특이적 유전자 마커 발현 및 증식력을 분석하였다.
그 결과, 배양액으로부터 수확한 망막색소상피세포 대조군 대비 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 PEDF 수치는 감소하는 반면 VEGF 수치는 증가하였다. 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹 대비 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 하였을 때 PEDF 수치는 증가하는 경향을 보이는 반면 VEGF 수치는 감소하였다. 나아가, 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 하였을 때, PEDF 수치는 현저히 증가 또는 VEGF 수치는 감소하였다(도 4A 및 4B).
또한, 망막색소상피세포 특이적 유전자 마커인 RPE65, BEST1, RLPB1, RGR 및 RRH의 발현을 RT-PCR 기법을 통하여 분석하였다.
그 결과, 망막색소상피세포 대조군 대비 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 망막색소상피로부터 발견된 칼슘 활성 음이온 채널에 관여하는 BEST1 유전자 발현 차이는 크게 나타나지 않았다. 그러나, 망막색소상피에서 빛 흡수 시 all-trans retinal에서 11-cis로 변환할 때 관여하는 효소 RPE65, 로돕신 유사 수용체에 속하며 11-cis로 이성질화 되는 단백질 RGR, 상기 과정에서 효소 이성질체화를 촉진하는 단백질 RLPB1, 망막색소상피세포 유래 시각색소 유사 수용체 퍼옵신(peropsin) RRH 유전자의 발현은 망막색소상피세포 대조군 대비 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 발현이 현저히 감소하였다. 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹 대비 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 및 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 하였을 때 RPE65, RLPB1, RGR 및 RRH 유전자 발현은 증가하였다. 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 하였을 때, RLPB1 유전자 발현차이는 크게 나타나지 않았지만, RPE65, RGR 및 RRH 유전자 발현은 현저히 증가한 것을 관찰하였다(도 4C).
또한, CCK-8 기법을 통해 증식력을 분석하였을 때, 망막색소상피세포 대조군 대비 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 증식력은 통계적으로 유의하게 감소하였고, 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹 대비 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 및 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 하였을 때 증식력은 증가하였다. 또한, 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양한 그룹에서 망막색소상피세포의 증식력이 현저히 증가한 것을 관찰하였다(도 4D).
실시예 3. 망막색소상피세포에 대한 RNA 및 protein 수준에서의 산화적 스트레스 및 세포사멸 관련 유전자 발현 분석
산화적 스트레스가 유도된 망막색소상피세포에 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 및 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양하여 산화적 스트레스 및 세포사멸 관련 유전자 발현 분석을 qRT-PCR 및 Western blotting을 통해 분석하였다.
또한, 산화적 스트레스가 유발되었을 때, Heme을 분해시킬 때 관여하는 HO1 및 HO2, 초과산화이온을 산소와 과산화수소로 바꿔주며 체내에 쌓인 과잉 활성산소를 제거하는 항산화효소인 SOD1 및 SOD2, 활성산소 분해시 산화형글루타치온과 물을 생성함으로서 최종적으로 관여하는 GPX1 유전자 발현을 qRT-PCR을 통하여 분석하였다.
또한, HO1, SOD1 및 활성산소 분해시 최종적으로 작용하는 GPX1과 함께 관여하는 Catalase 단백질 및 세포사멸의 중요한 효소 Caspase-3 단백질 발현은 Western blotting을 통해 분석하였다.
그 결과, 망막색소상피세포 대조군 대비 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 HO1, HO2, SOD1, SOD2 및 GPX1 유전자 발현이 현저히 감소하였다. 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹 대비 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 및 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 그룹에서 HO1, HO2, SOD1, SOD2 및 GPX1 유전자 발현이 상당히 증가하였다(도 5A 내지 5E)
한편, 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 그룹에서, HO1 및 GPX1 유전자 발현 차이는 크게 나타나지 않았지만 HO2, SOD1 및 SOD2 유전자 발현은 상당히 증가한 것을 발견하였다(도 5A 내지 5E).
한편, 망막색소상피세포 대조군 대비 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 HO1 단백질의 발현은 상당히 감소하였다. 반면, SOD1 단백질 발현은 망막색소상피세포의 산화적 스트레스를 자체적으로 분해하는 과정으로 발현이 일시적으로 높아지는 것을 확인하였고, 세포사멸 최종인자 cleaved caspase-3 단백질 발현은 상당히 증가하였다. 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹 대비 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 및 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 그룹에서 HO1 및 GPX1 단백질 발현은 상당히 증가하였고, cleaved caspase-3 단백질 발현은 상당히 감소하였다. 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 그룹에서 HO1 단백질 발현은 크게 차이가 없었지만, 흥미롭게도 SOD1 및 catalase 단백질 발현은 상당히 증가하였고 cleaved caspase-3 단백질 발현은 현저히 감소하였다(도 5F).
실시예 4. 간암상피세포에 대한 RNA 수준에서의 산화적 스트레스 관련 유전자 발현 분석
망막상피세포와 동일하게 산화적 스트레스가 유도된 간암상피세포에 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 및 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양하여 qRT-PCR을 통해 산화적 스트레스 관련 유전자 발현 분석 및 증식력 분석을 수행하였다.
그 결과, 간암상피세포로부터 수확한 배양액 내에서 PEDF 수치를 분석하였을 때, 간암상피세포 대조군 대비 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 PEDF 수치는 감소하였고, 증식력 또한 감소하였다. 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹 대비 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 공배양하였을 때 PEDF 수치 및 증식력이 증가하였다. 또한, 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 그룹에서 증식력은 감소하였지만 PEDF 수치는 현저히 증가하였다(도 6A 및 6B).
또한, 간암상피세포 대조군 대비 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 산화적 스트레스 관련된 유전자인 GPX1을 제외한 HO1, HO2, SOD1 및 SOD2 유전자 발현이 감소하였다. 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹에서 HO1, HO2, SOD1, SOD2 및 GPX1 유전자 발현이 현저히 감소하였다. 과산화수소(200 μM) 처리한 그룹 대비 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 및 PEDF 기능강화 태반-유래 중간엽 줄기세포를 공배양 그룹에서 HO1, HO2 및 GPX1의 유전자 발현은 차이가 없었지만, SOD1 및 SOD2 상당히 증가하였다(도 6C 내지 6G).
실시예 5. PEDF 기능강화 중간엽 줄기세포의 PEDF 농도 측정
여러 종류의 중간엽 줄기세포 내에 PEDF 농도를 측정하기 위하여 qRT-PCR 및 PEDF ELISA kit을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 지방-, 골수-, 태반- 및 제대혈-유래 중간엽 줄기세포 중에서 지방-유래 중간엽 줄기세포의 PEDF 수치가 가장 높은 것을 확인하였다. Lung fibroblast인 WI-38 대비 모든 종류의 중간엽 줄기세포에서 PEDF 수치는 증가 하였다. 골수 및 제대혈-유래 중간엽 줄기세포 대비 태반-유래 중간엽 줄기세포의 PEDF 발현 또는 수치가 높다는 것을 확인하였다(도 7A 및 7B).
또한, 여러 종류의 중간엽 줄기세포 내에 PEDF 유전자를 전기청공법을 이용하여 PEDF 과발현된 중간엽 줄기세포를 제작하였다. 천연 태반-유래 중간엽 줄기세포 제작 방법과 동일하게 실시하였다.
그 결과, PEDF 과발현된 중간엽 줄기세포 중, qRT-PCR을 통한 RNA 수준에서의 PEDF 발현 여부는 천연 중간엽 줄기세포보다 현저히 증가 하였지만, 줄기세포의 종류에 따른 발현 차이는 나타나지 않았음을 확인하였다. 반면, 천연 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 과발현된 중간엽 줄기세포의 PEDF 농도는 현저히 증가한 것을 확인하였다. PEDF 과발현된 중간엽 줄기세포 중 PEDF 과발현된 골수- 및 제대혈-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 과발현된 지방-유래 중간엽 줄기세포에서 PEDF 농도가 현저히 증가하였다. 또한, PEDF 과발현된 지방-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 과발현된 태반-유래 중간엽 줄기세포에서의 PEDF 수치가 가장 높다는 것을 확인하였다(도 7C 및 7D).
또한, 유전자도입 기법을 통한 세포 생존률이 PEDF 과발현된 지방-, 골수- 또는 제대혈-유래 중간엽 줄기세포 대비 PEDF 과발현된 태반-유래 중간엽 줄기세포에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(도 7E).
<110> CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> GENETICALLY ENGINEERED MESENCHYMAL STEM CELL FOR EXPRESSING PEDF OR OVEREXPRESSING PEDF COMPARED TO MOTHER CELL <130> PN127852KR <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4 F <400> 1 agtgagaggc aacctggaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4 R <400> 2 gtgaagtgag ggctcccata 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog F <400> 3 ttcttgactg ggaccttgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog R <400> 4 gcttgccttg ctttgaagca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox-2 F <400> 5 agaaccccaa gatgcacaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox-2 R <400> 6 gggcagcgtg tacttatcct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G F <400> 7 gcggctacta caaccagagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G R <400> 8 gcacatggca cgtgtatctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TERT F <400> 9 gagctgacgt ggaagatgag 20 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TERT R <400> 10 cttcaagtgc tgtctgattc caatg 25 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC F <400> 11 cactcctcgc cctattggc 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC R <400> 12 ccctcctgct tggacacaaa g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1 F <400> 13 agacatccca ccaatcacct 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1 R <400> 14 cgtcatcgca caacacct 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adipsin F <400> 15 ggtcacccaa gcaacaaagt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adipsin R <400> 16 cctcctgcgt tcaagtcatc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-GAMMA F <400> 17 ttgacccaga aagcgattcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-GAMMA R <400> 18 aaagttggtg ggccagaatg 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPE65 F <400> 19 atggacttgg cttgaatcac tt 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPE65 R <400> 20 gaacagtcca tgaaaggtga ca 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BEST1 F <400> 21 atcagaggcc aggctactac ag 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BEST1 R <400> 22 tccacagttt tcctcctcac tt 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RLPB1 F <400> 23 tcagaggcta tgtgaatttc cg 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RLPB1 R <400> 24 gcctgcaaga tctcatcaaa g 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGR F <400> 25 tactgcaccc gtagccagc 19 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGR R <400> 26 aagctggtga agtttctgtc cc 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRH F <400> 27 gatgtaacaa agatgtctgt g 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRH R <400> 28 cctccgaaac tttttattag c 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO1 F <400> 29 gcagagaatg ctgagttcat g 21 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO1 R <400> 30 cacatctatg tggccctgga gga 23 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO2 F <400> 31 atgtcagcgg aagtggaa 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO2 R <400> 32 gggagtttca gtgctcgc 18 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD1 F <400> 33 gctgtaccag tgcaggtcct ca 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD1 R <400> 34 catttccacc tttgcccaag tc 22 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD2 F <400> 35 ggagaaccca aaggggagtt g 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD2 R <400> 36 gccgtcagct tctccttaaa c 21 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPX1 F <400> 37 acacccagat gaacgagctg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPX1 R <400> 38 caaactggtt gcacgggaag 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDF F <400> 39 tgctactcct ctgcattgga 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDF R <400> 40 acaggtcata gccgaagttg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 41 gcaccgtcaa ggctgagaac 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 42 gtggtgaaga cgccagtgga 20

Claims (14)

  1. PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 태반 유래 중간엽 줄기세포로서,
    상기 줄기세포는 CD13, HLA-ABC 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성을 가지며,
    CD34 및 HLA-DR으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성은 가지지 않는 것인, 중간엽 줄기세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 조작은 전기천공법에 의한 것인, 중간엽 줄기세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 태반 유래 중간엽 줄기세포는 태반 융모막판막 유래 중간엽 줄기세포인, 중간엽 줄기세포.
  4. 삭제
  5. PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 태반 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 줄기세포는 CD13, HLA-ABC 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성을 가지며,
    CD34 및 HLA-DR으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성은 가지지 않는 것인, 약학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 상피세포는 간상피세포 또는 망막색소상피세포인, 약학적 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 상피세포 내 산화적 스트레스를 감소시켜 세포 사멸을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  8. PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 태반 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 줄기세포는 CD13, HLA-ABC 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성을 가지며,
    CD34 및 HLA-DR으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성은 가지지 않는 것인, 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 망막 질환은 망막동맥폐쇄, 망막정맥폐쇄, 망막정맥주위염, 고혈압망막병증, 당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 감각신경망막염증, 망막색소상피염증, 혈관무늬병증, 드루젠, 열공망막박리, 비열공망막박리, 황반변성, 황반이상증, 당뇨망막병증, 망막동정맥폐쇄, 고혈압성 망막병증, 망막대동맥류, 안허혈증후근, 방사선망막병증, 미숙아망막병증, 급성망막괴사, 망막염, 망막맥락막염, 망막박리, 망막종양, 외상에 의한 망막 손상 및 빛에 의한 망막 손상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환인, 약학적 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 망막 질환은 황반변성인, 약학적 조성물.
  11. PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 태반 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 줄기세포는 CD13, HLA-ABC 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성을 가지며,
    CD34 및 HLA-DR으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성은 가지지 않는 것인, 약학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 간 질환은 지방간, 간경화, 간염 및 간암으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환인, 약학적 조성물.
  13. PEDF(pigment epithelium-derived factor)를 발현하거나 모세포에 비하여 PEDF를 과발현하도록 유전적으로 조작된 태반 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 상피세포의 손상 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
    상기 줄기세포는 CD13, HLA-ABC 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성을 가지며,
    CD34 및 HLA-DR으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성은 가지지 않는 것인, 건강기능식품.
  14. 삭제
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