KR20140096368A

KR20140096368A - 인간 ｒｐｅ 세포의 약제학적 제제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20140096368A
Application number: KR1020147016228A
Authority: KR
Inventors: 로저 게이; 이리나 클리만스카야; 로버트 란자
Original assignee: 어드밴스드 셀 테크놀로지, 인코포레이티드
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2014-08-05
Anticipated expiration: 2032-11-14
Also published as: GB2496969A; EP2780022B2; WO2013074681A1; DK2780022T3; JP2014533289A; AU2025201277A1; EP3563860A1; IL320536A; EP2780022A1; CY1121819T1; US20200405767A1; JP2018048144A; HUE044778T2; AU2021204719B2; AU2019201201A1; HRP20191110T1; CA2855941A1; JP6899865B2; TWI842079B; IL287381A

Abstract

본 개시는 인간 환자로 이식된 hESC-유래 세포의 최초의 기술을 제공한다. 각각 스타르가르트 황반 이영양증(Stargardt's Macular Dystrophy, SMD) 및 건성 연령-관련 황반 변성(AMD)를 갖는 환자에 대한 결과가 보고된다. 제어된 hESC 분화는 거의 100% 순수한 RPE 집단을 초래했다. 수술 직후, 두 환자 모두에서 이식 부위에서 과색소침착(hyperpigmentation)이 뚜렷했고, 그 후, 세포가 원래의(native) RPE 층에 부착되고 통합되었다는 증거를 보였다. 염증 및 과다증식의 징후는 관찰되지 않았다. hESC-유래 RPE 세포는 이 보고의 시점에 거부 또는 종양형성(tumorigenicity)의 징후를 보이지 않았다. 시각 측정은 두 환자 모두에서 개선을 시사했다.

Description

인간 ＲＰＥ 세포의 약제학적 제제 및 그의 용도{Pharmaceutical preparations of human RPE cells and uses thereof}

관련 출원에 대한 교차 인용

본 특허출원은 각각 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 2011년 11월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/559,521호, 2012년 11월 8일자로 출원된 미국 가출원 제61/724,047호, 및 2012년 1월 23일자로 출원된 미국 가출원 제61/589,741호의 이익을 주장한다.

인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell)(hESC)는 재생 의학을 위한 대체 세포의 유망한 소스(source)로 간주된다 (1). 비약적인 과학적 진보에도 불구하고, hESC는 현재까지 임상적 용도를 위해 제안된 가장 복잡한 생물학적 치료제(biological therapeutic entity)에 속한다(2). 그들의 생물학적인 동적 복잡성(dynamic complexity) 외에, 기형종(teratoma) 형성의 위험 및 조직부적합성(histoincompatibility)과 연관된 과제를 포함한, 다수의 규제적 문제가 임상적 실현(clinical translation)에 장애가 되고 있다. 체세포 핵 이식 (3) 또는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell) (4, 5)와 같은 세포 재프로그래밍(cellular reprogramming) 기술이 더 발전할 때까지, 눈 및 기타 면역면제(immunoprivileged) 부위에 영향을 주는 질환이 환자에서 최초의 다능성 줄기 세포-기반 치료가 될 것 같다. 망막하 공간이 혈액-안구 장벽에 의해 보호되고, 세포성 및 체액성 면역 반응의 항원-특이적 억제를 특징으로 한다는 것이 확립되어 있다 (6).

망막에서, 망막 색소 상피(RPE)의 변성은 각각 세계적으로 성인 실명(adult blindness) 및 청소년 실명(juvenile blindness)의 주요 원인 중 두 가지인, 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration)(AMD) 및 스트가르트 황반 이영양증(Stargardt's macular dystrophy)(SMD)을 포함한, 다양한 실명성 질환(sight-threatening disease)에서 광수용체 소실을 초래한다. 현재 두 질환 모두가 치료가능하지 않으나(unbeatable), 황반변성의 전임상 모델에서 hESC-유래 RPE의 이식이 광수용체를 구제(rescue)하고, 시력 상실을 방지할 수 있다는 증거가 있다 (7, 8). 그의 기능 중에서, RPE는 광색소를 리사이클링하고, 비타민 A를 전달하고, 대사하고, 및 저장하고, 광수용체 외부 세그먼트(photoreceptor outer segment)를 식작용시키고(phagocytose), 망막과 맥락막 간에 철과 소형 분자를 수송하고, 미광(stray light)을 흡수하여 더 우수한 이미지 해상도(image resolution)를 가능하게 하는 것에 의해 광수용체의 건강을 유지한다 (9, 10). RPE 기능장애로 인해 시력이 악화되는 동물 모델인 RCS(Royal College of Surgeons) 랫트에서, hESC-유래 RPE의 망막하 이식은 불리한 병리의 증거 없이 광범위한 광수용체 구제 및 시각적 능력(visual performance)의 향상(미처리 대조군 대비 100%)을 가져왔다 (7).

망막 색소 상피 (RPE)는 하부 맥락막(underlying choroid) (망막 뒤의 혈관층)과 상부 망막 시각 세포(overlying retinal visual cell)(예를 들면, 광수용체-간상(rod) 및 원추 세포) 사이의 망막내 시신경(neurosensory retina) 외부에 있는 착색 세포 층(pigmented cell layer)이다. RPE는 광수용체 및 망막의 기능 및 건강에 결정적(critical)이다. RPE는 광색소를 리사이클링하고, 비타민 A를 전달하고, 대사하고, 및 저장하고, 광수용체 외부 세그먼트를 식작용시키고, 망막과 맥락막 간에 철과 소형 분자를 수송하고, 맥란막(Bruch's membrane)을 유지하고, 미광을 흡수하여 더 우수한 이미지 해상도를 가능하게 하는 것에 의해 광수용체의 기능을 유지한다. Engelmann and Valtink (2004) "RPE Cell Cultivation." Graefe's Archive for Clinical and Experimental 0phthalmology 242(1): 65-67; 또한, Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, in STEM CELL ANTHOLOGY 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009) 참조. RPE의 변성은 광수용체 손상 및 실명을 초래하는 다수의 시력-변형 질환(vision-altering ailment), 예를 들면, 맥락막 결손(choroideremia), 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 황반 변성(연령-관련 황반변성 포함), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa), 및 스타르가르트병(Stargardt's Disease)(황반안저)과 연관된 망막 탈리, 망막 이형성, 또는 망막 위축증을 유발할 수 있다. 예를 들면, WO 2009/051671 참조.

RPE 세포의 제조 방법, RPE 세포의 조성물 및 그의 용도를 포함한 일부 대상이 2005년 7월 20일에 미국출원 제11/186720호로 출원된, 미국특허 제7736896호; 2006년 7월 21일에 미국출원 제11/490953호로 출원된, 미국특허 제7795025호; 2005년 1월 24일에 미국출원 제11/041382호로 출원된, 미국특허 제7794704호; 2004년 1월 23일에 출원된 미국 가출원 제60/538964호; 2010년 10월 10일에 출원된 미국출원 제12/682,712호; 2007년 10월 12일에 출원된 미국 가출원 제60/998668호; 2007년 10월 12일에 출원된 미국 가출원 제60/998766호; 2008년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 제61/009908호; 2008년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 제61/009911호; 2010년 7월 23일에 출원된 미국 가출원 제61/367038호; 2010년 11월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/414770호; 2011년 7월 25일에 출원된 국제 특허출원 PCT/US11/45232; 2010년 12월 14일에 출원된 미국출원 제12/682712호; 2005년 1월 24일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US05/02273; 2010년 11월 17일에 출원된 국제 특허출원 PCT/US2010/57056(WO2011/063005로 공개됨); 및 2009년 11월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/262,002호를 포함한 공동-소유(co-owned) 미국 출원 및 특허에 개시되고, 이들 각각은 참조에 의해 그 전체가 포함된다.

일차 RPE 세포의 온전한 쉬트(intact sheet) 및 현탁액의 이식이 이전에 인간에서 시도되었으나, 결과는 이식물 생존 및 시력 향상의 측면에서 혼재되었다 (11-19). 현재까지, 일차 RPE 세포를 이용한 일관되게 효과적인 인간 치료제는 보고된 바 없다.

요약

본 개시는 스타르가르트 황반 이영양증(Stargardt's Macular Dystrophy, SMD) 및 건성 연령-관련 황반 변성(dry AMD)의 치료를 위한 인간 배아 줄기 세포(hESC)-유래 망막 색소 상피(RPE) 세포의 안전성을 입증하는 1/2 상 임상 데이터(Phase1/2 clinical data)를 보고한다. 결과는 각각 1/2 상 임상 시험에서의 최초인 두 환자에 대해 보고된다. 유해한 안전성 이슈를 보이지 않는 것 외에, 구조적 증거는 hESC-유래 세포가 생존했고 보고된 연구 기간 동안 지속적으로 유지되었다는 것을 확인했다. 두 환자는 모두 1년 이상 동안 지속된 시력의 측정가능한 개선을 보였다.

치료 후 1년 차에, 과다증식, 종양 형성, 전위 조직(ectopic tissue) 형성, 또는 명백한 거부가 두 환자 모두에서 관찰되지 않았다. 다수의 이식후 평가(post-transplantation evaluation)에서 상세한 임상 및 진단 시험 평가를 수행했다. 비정상 증식(또는 종양 형성)이 줄기-세포 기반 치료법, 특히, 다능성(pluripotency) 때문에 hESC 유래 줄기 세포 기반 치료법에 대해 중대한 안전성 문제로 간주될 것이다; 따라서, hESC의 분화를 제어하는 것이 중요하다. 보고된 결과는 줄기 세포 분화가 이 환자들에서 잘 제어되었다는 것을 나타낸다. 부정적인 안전성 신호는 검출되지 않았다.

성공적인 줄기 세포 유래 RPE 이식의 해부학적 증거를 SMD를 가진 환자에서 임상적으로 및 고해상도 영상 기술(high resolution imaging technology)로 관찰하였다. 이 증거는 이식물의 영역 내에서, 이식 후 1주부터 시작하여 추적(follow-up) 기간 내내 RPE의 수준에서 증가되는 착색(pigmentation)을 포함했다. 이식된 줄기 세포 유래 RPE는 적절한 위치에 생착(engraft)되고, 정상적인 RPE 형태를 갖는 것으로 나타났다. 건성 AMD 환자에서는 생착 및 증가된 착색이 검출되지 않았다. 그러나, 두 환자 모두 4개월의 추적 기간에 일부 시각 개선을 보였고, 이는 적어도 1년의 추적 기간까지 지속되었다.

하기에서 더 설명되는 바와 같이, 스타르가르트병 환자의 시력(visual acuity)은 단지 손 동작(hand motion)으로부터 20/800 비전(vision)까지 개선되었다. 치료 전에, 환자는 ETDRS 시력 차트 상에서 어느 문자도 읽을 수 없었다. 그러나, 이식 후 2주 차까지, 그녀는 문자를 읽기 시작할 수 있었고, 이는 치료된 눈으로 1 내지 3개월 차에 5개의 문자까지 개선되고, 1년 차에 15개의 문자까지 개선되었다(20/500 비전).

여러 신약들이 AMD의 습성 타입의 치료를 위해 이용가능하나, 현재 건성 AMD나 스타르가르트병을 위한 입증된 치료제는 존재하지 않는다.

이 질환들의 진행성 속성에도 불구하고, 두 환자의 비전은 최소 투여량에서도, 세포의 이식 후에 개선된 것으로 나타났다. 출원인은 질환의 보다 초기에 환자를 치료하면 훨씬 더 유의한 개선이 있을 것으로 기대하며, 보다 유의한 결과가 얻어질 것으로 잠재적으로 기대된다. 증가된 세포 투여량도 더 유의한 개선을 가져올 수 있다.

인간 배아 줄기 세포는 잠재적으로 감소된 면역원성을 갖는 건강한 "어린(young)" 세포의 무한량(unlimited number)을 생성하는 것에 의해 대체 조직(replacement tissue)의 탁월한 소스를 제공할 수 있다. 눈은 혈액-안구 장벽에 의한 망막하 공간의 보호 때문에 면역 면제 부위(immune privileged site)이고, 그 결과, 낮고 일시적인 용량의 면역 억제제가 사용되었다. 거부 또는 염증의 징후는 어느 환자에서도 관찰되지 않았고 의사들이 두 환자를 지속적으로 모니터링하고 있다.

본 명세서에 제시된 결과는 질병에 의해 손상된 조직을 회복시키거나 또는 대체하는 가능성을 실현하기 위한 줄기 세포 치료법 및 재생 의학의 잠재력을 강조한다.

hESC-유래 RPE 세포는 이식 전에 집중적인 안전성 연구를 거쳤다. 세포는 동물 및 인간 병원체를 포함하지 않는 것으로 확인되었고, 최종 산물 중에 종양 형성에 대한 위험 인자인 미분화 hESC의 존재를 배제시키기 위해 고민감도 분석을 수행했다. 제어된 hESC 분화는 거의 100 퍼센트 순수한 RPE를 생성했다. hESC의 중심적 특징은 인 비트로 분화의 단계가 생존율 및 기능성(functionality)을 최대화하기 위해 제어될 수 있다는 것이다. 본 명세서에서 데이터는 RPE 성숙도(maturity) 및 착색(pigmentation)이 이식 후 세포의 후속 부착(attachment) 및 증식에 급격하게 영향을 미칠 수 있다는 것을 보여준다.

두 시험은 모두 SMD 및 건성 AMD를 갖는 환자로의 망막하 이식 후 연구의 일차 종말점(primary endpoint)인 12개월에 hESC-유래 RPE 세포의 안전성 및 내성(tolerability)를 결정하도록 설계된 전향적, 개방 연구(prospective, open-label study)이다. 각 시험은 각각 12명의 환자를 등록시키고, 각각 3명의 환자의 코호트는 상승적인 투여량 포맷(ascending dosage format)으로 구성된다. SMD 환자 및 건성 AMD 환자는 모두 hESC로부터 유래된 완전-분화 RPE의 최소량 (50,000개의 세포)의 망막하 이식을 받았다.

일 양태에서, 본 개시는 복수 개의 망막 색소 상피(RPE) 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 복수 개의 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만인 것인 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 RPE 세포는 현탁액, 겔, 콜로이드, 매트릭스, 기질(substrate), 스캐폴드(scaffold), 또는 이식물(graft)에 담길 수 있다.

상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 약 290 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 또는 약 300 mOsm/kg 내지 310 mOsm/kg 또는 약 305 mOsm/kg의 삼투질 농도(osmolality)를 갖는 멸균 용액을 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 평형 염 용액(balanced salt solution)을 포함할 수 있다. 상기 평형 염 용액은 각 mL 당, 염화나트륨 7.14 mg, 염화칼륨 0.38 mg, 염화칼슘 이수화물 0.154 mg, 염화마그네슘 육수화물 0.2 mg, 제2인산나트륨(dibasic sodium phosphate) 0.42 mg, 중탄산나트륨 2.1 mg, 덱스트로오스 0.92 mg, 글루타티온 디술피드(glutathione disulfide)(산화 글루타티온) 0.184 mg, 및 물 중 염산 및/또는 수산화나트륨 (pH를 약 7.4까지 조정하기 위함)을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 필수적으로 이들로 구성될 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 부피는 약 100 ㎕ 내지 1000 ㎕이거나, 또는 약 150 ㎕ 이상일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 약 1,000개 내지 lx10⁹개의 생(viable) RPE 세포를 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 약 333개 생 RPE 세포/㎕ 내지 약 2,000개 생 RPE 세포/㎕, 약 444개 생 RPE 세포/㎕ 내지 약 1766개 생 RPE 세포/㎕, 약 333개 생 RPE 세포/㎕, 약 444개 생 RPE 세포/㎕, 약 666개 생 RPE 세포/㎕, 약 888개 생 RPE 세포/㎕, 약 999개 생 RPE 세포/㎕, 또는 약 1,333개 생 RPE 세포/㎕을 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물 중 RPE 세포의 농도는 충분히 높아서, 상기 RPE 세포의 약 30% 이하가 60분 내에 생존력(viability)을 상실하고, 선택적으로 상기 RPE 세포의 약 10% 이하가 4시간 내에 생존력을 상실할 수 있다. 상기 RPE 세포의 농도는 약 1,000개 세포/㎕ 이상, 약 1,000-10,000개 세포/㎕, 또는 약 2,000-5,000개 세포/㎕일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0.0001% 미만의 RPE 세포가 아닌 세포를 포함할 수 있다.

상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 5 pg/세포 미만, 4 pg/세포 미만, 3 pg/세포 미만, 2 pg/세포 미만, 및 0.1 pg/세포 이상, 및 선택적으로 0.5 pg/세포 또는 1 pg/세포 이상; 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-7 pg/세포, 0.5-6 pg/세포, 또는 1-5 pg/세포일 수 있다.

상기 약제학적 조성물 중 세포의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상은 베스트로핀(bestrophin)+일 수 있다. 상기 약제학적 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+ 및/또는 MITF+일 수 있다. 상기 약제학적 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+ 및/또는 베스트로핀+일 수 있다. 상기 약제학적 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 ZO-1+일 수 있다. 상기 약제학적 조성물 중 세포의 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상은 PAX6+ 및 베스트로핀+일 수 있다. 상기 약제학적 조성물 중 세포의 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+일 수 있다.

전형적인 구체예에서, 상기 약제학적 조성물에서 백만 개의 세포 당 약 1개 이하의 세포 및 선택적으로 900만개의 세포 당 2개 이하의 세포가 OCT-4와 알칼리 포스파타아제 (AP) 발현 모두에 대해 양성일 수 있다.

니들 또는 주사 캐뉼라(injection cannula)는 상기 RPE 세포의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 상기 RPE 세포의 농도는 상기 니들 또는 주사 캐뉼라 내로의 로딩(loading)시 약 444개 생 세포/㎕ 내지 약 1,766 생 세포/㎕일 수 있다. 상기 니들 또는 주사 캐뉼라로부터 전달될 생 RPE 세포의 농도는 약 333개 생 세포/㎕ 내지 약 1,333개 생 세포/㎕일 수 있다. 상기 니들 또는 주사 캐뉼라의 직경은 약 0.3 mm 내지 약 0.9 mm일 수 있다. 상기 니들 또는 주사 캐뉼라의 직경은 약 0.5 mm 내지 약 0.6 mm일 수 있다. 상기 니들 또는 주사 캐뉼라는 약 0.09 mm 내지 약 0.15 mm의 직경을 갖는 팁(tip)을 포함할 수 있다. 상기 캐뉼라는 MEDONE POLYTIP^® Cannula 25/38g (0.12mm (38g) x 5mm 팁을 갖는 0.50mm (25g) x 28mm 캐뉼라) 또는 Synergetics Angled 39g Injection Cannula일 수 있다.

상기 RPE 세포는 동결보존되고 해동된 RPE 세포를 포함할 수 있다.

상기 RPE 세포는 인간 세포일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여될 수 있는 하나 이상의 혈관신생 억제제를 더 포함할 수 있다. 대표적인 혈관신생 억제제는 페가타닙 소디움(pegaptanib sodium); 아플리베르셉트(aflibercept); 베바시라닙(bevasiranib); 라파마이신(rapamycin); AGN-745; 비탈라닙(vitalanib); 파조파닙(pazopanib); NT-502; NT-503; PLG101; CPD791; 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편; 베바시주맙(bevacizumab); 라니비주맙(ranibizumab); 항-VEGFR1 항체; 항-VEGFR2 항체; 항-VEGFR3 항체; IMC-1121(B); IMC-18F1; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap(Aflibercept); AZD-2171 (Cediranib); 티로신 키나아제 억제제(TKI); VEGFR-1 및/또는 VEGFR-2를 억제하는 TKI; 소라페닙(sorafenib) (Nexavar); SU5416(Semaxinib); SU11248/수니티닙(Sunitinib)(Sutent); 반데타닙(Vandetanib)(ZD6474); Ly317615 (Enzastaurin); 항-알파5베타l 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편; 볼로시키맙(volociximab); 3-(2-{1-알킬-5-[(피리딘-2-일아미노)-메틸]-피롤리딘-3-일옥시}-아세틸아미노)-2-(알킬-아미노)-프로피온산; (S)-2-[(2,4,6-트리메틸페닐)술포닐]아미노-3-[7-벤질옥시카르보닐-8-(2-피리디닐아미노메틸)-1-옥사-2,7-디아자스피로-(4,4)-논-2-엔-3-일]카르보닐아미노 프로피온산; EMD478761; 또는 RC*D(ThioP)C*(Arg-Cys-Asp-Thioproline-Cys (아스테리스크는 시스테인 잔기를 통한 디술피드 결합에 의한 고리화를 나타냄); 2-메톡시에스트라디올; 알파V베타3 억제제; 안지오포이에틴 2; 혈관신생 억제 스테로이드(angiostatic steroid) 및 헤파린; 안지오스타틴(angiostatin); 안지오스타틴-관련 분자(angiostatin-related molecule); 항-카텝신 S 항체; 항트롬빈 III 단편; 칼레티쿨린(calreticulin); 칸스타틴(canstatin); 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole); 연골-유래 혈관신생 억제 인자(Cartilage-Derived Angiogenesis Inhibitory Factor); CDAI; CM101; CXCL10; 엔도스타틴(endostatin); IFN-α; IFN-β; IFN-γ; IL-12; IL-18; IL-4; 리노미드(linomide); 마스핀(maspin); 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제; Meth-1; Meth-2; 오스테오폰틴(osteopontin); 페가프타닙(pegaptanib); 혈소판 인자-4(platelet factor-4); 프로락틴(prolactin); 프롤리페린-관련 단백질(proliferin-related protein); 프로트롬빈 (kringle domain-2); 레스틴(restin); 가용성 NRP-1; 가용성 VEGFR-1; SPARC; SU5416; 수라민(suramin); 테코갈란(tecogalan); 테트라티오몰리브데이트(tetrathiomolybdate); 탈리도마이드(thalidomide); 레날리도마이드(lenalidomide); 트롬보스폰딘(thrombospondin); TIMP; TNP-470; TSP-1; TSP-2; 바소스타틴(vasostatin); VEGFR 길항제; VEGI; 볼록시키맙(Volociximab) (M200); 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린(anastellin); 렌바티닙(Lenvatinib)(E7080); 모테사닙(Motesanib)(AMG706); 파조파닙(Pazopanib) (Votrient); VEGF의 억제제; VEGFR1의 억제제; VEGFR2의 억제제; 알파5베타1 인테그린의 억제제; VEGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 및/또는 알파5베타1 인테그린의 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 소형 분자, 화합물(chemical) 및/또는 핵산 억제제; IL-6 길항제; 항-IL-6 항체; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고; 선택적으로, 증식성(혈관신생) 안구 질환(proliferative (neovascular) eye disease)을 예방 또는 치료하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.

상기 RPE 세포는 유전적으로 조작될 수 있다(genetically engineered). 예를 들면, 상기 RPE 세포는 유전적으로 조작된 다능성 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 유전적 조작은 상기 RPE 세포에 의한, 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자의 생성을 초래할 수 있다. 혈관신생을 억제하는 예시적인 인자는 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린(anastellin); 특이적 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-VEGF 수용체 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-알파5베타1 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함한다.

상기 혈관신생을 억제하는 인자의 생성은 RPE-특이적 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 상기 RPE-특이적 프로모터는 RPE65 프로모터, 카텝신 D 근위 프로모터(Cathepsin D Proximal Promoter), 및 VMD2 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 RPE 세포는 다능성 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 다능성 줄기 세포는 OCT-4, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-80을 포함하는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 양성일 수 있다. 상기 다능성 세포는 배양물에서 착색 상피 세포(pigmented epithelial cell)가 나타나기에 충분한 시간 동안 다층 집단(multilayer population) 또는 배상체(embryoid body)에서 배양될 수 있는 인간 다능성 세포일 수 있다. 상기 배양물에 착색 상피 세포가 나타나기에 충분한 시간은 약 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 5주 이상, 약 6주 이상, 또는 약 7주 이상, 약 8주 이상을 포함할 수 있다. 상기 다층 집단 또는 배상체는 DMEM을 포함할 수 있는 배지에서 배양될 수 있다. 상기 배지는 EB-DM을 포함하거나, 필수적으로 그로 구성되거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 착색 상피 세포는 단리되고, 배양되어, RPE 세포의 집단을 생성할 수 있다. 상기 단리는 세포 또는 세포의 덩어리(clump)를 효소에 의해(enzymaticall), 화학적으로, 또는 물리적으로 배양물로부터 분리하는 단계, 및 착색 상피 세포, 또는 착색 상피 세포를 포함할 수 있는 세포의 덩어리를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배상체는 현탁, 및/또는 부착 배양물(adherent culture)로 배양될 수 있다(예를 들면, 현탁 배양 및 뒤이은 부착 배양). 상기 부착 배양물로 배양된 배상체는 착색 상피 세포를 포함하는 하나 이상의 외향 성장물(outgrowth)을 생성할 수 있다. 상기 다능성 줄기 세포는 감소된 HLA 항원 복잡성(HLA antigen complexity)을 갖는다. RPE 형성 전에, 상기 다능성 세포는 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴(entactin), 콜라겐, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 콜라겐 VIII, 헤파란 술페이트, 매트리겔(Matrigel)™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제(soluble preparation)), CellStart, 인간 기저막(basement membrane) 추출물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 매트릭스 상에서 배양될 수 있다. 상기 매트릭스는 매트리겔™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제)을 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커의 실질적인 발현을 갖지 않는 세포를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커는 OCT-4, NANOG, Rex-1, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-80을 포함할 수 있다.

상기 RPE 세포는 하나 이상의 RPE 세포 마커의 발현에 대해 양성일 수 있다. 상기 하나 이상의 RPE 세포 마커는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀(Bestrophin), MITF, Otx2, PAX2, PAX6, ZO-1, 및/또는 티로시나아제를 포함할 수 있다.

상기 RPE 세포는 상기 평균 멜라닌 함량을 얻기 위해 충분한 시간 동안 RPE 세포를 휴지기 세포(quiescent cell)로 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 RPE 세포는 상기 RPE 세포의 50% 이상에서 베스트로핀 발현을 달성하기에 충분한 시간 동안 RPE 세포를 휴지기 세포(quiescent cell)로 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 마우스 배아 피더 세포(mouse embryonic feeder cell, MEF) 및 인간 배아 줄기 세포(hES)가 실질적으로 없을 수 있다.

상기 RPE 세포는 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛, 예를 들면, 알파 인테그린 서브유닛 1, 알파 인테그린 서브유닛 2, 알파 인테그린 서브유닛 3, 알파 인테그린 서브유닛 4, 알파 인테그린 서브유닛 5, 알파 인테그린 서브유닛 6, 또는 알파 인테그린 서브유닛 9의 발현을 증가시키는 조건 하에서 상기 RPE 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 조건은 망간(manganese)으로의 노출, 항-CD29 항체로의 노출, 단일클론 항체 HUTS-21로의 노출, 단일클론 항체 mAb TS2/16으로의 노출, 및/또는 상기 RPE 세포를 약 4 계대(passage) 이상 동안 계대시키는 것을 포함할 수 있다.

상기 RPE 세포는 표 5에 기재된 기준 중 하나 이상을 충족시키고 및/또는 GMP(Good Manufacturing Practices)에 따라 제조될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 면역 억제제 또는 면역 내성제(immune tolerizing agent)를 더 포함할 수 있다. 상기 면역 억제제 또는 면역 내성제는 중간엽 줄기 세포, ALG(anti-lymphocyte globulin) 다중클론 항체, ATG(anti-thymocyte globulin) 다중클론 항체, 아자티오프린(azathioprine), 바실릭시맙(BASILIXIMAB)® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), 다클리주맙(DACLIZUMAB)® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 에베롤리무스(everolimus), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 리툭시맙(RITUXIMAB)®(항-CD20 항체), 시롤리무스(sirolimus), 타크롤리무스(tacrolimus), 및 마이코페놀레이트 모페틸(mycophemolate mofetil) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 양태에서, 본 개시는 전술된 약제학적 조성물 및 복수 개의 RPE 세포를 원하는 표적 농도까지 희석시키기에 충분한 부피로 약제학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 별개의 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제의 부피는 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제의 전체 부피를 상기 복수 개의 RPE 세포 전체와 합치면 상기 RPE 세포의 원하는 표적 농도를 갖게 하는 것일 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제의 온도는 약 0 내지 10℃, 선택적으로 약 2 내지 8℃일 수 있다. 상기 복수 개의 RPE 세포 또는 상기 복수 개의 RPE 세포를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 담체의 온도는 약 0 내지 10℃, 선택적으로 약 2 내지 8℃일 수 있다.

상기 키트는 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여될 수 있는 하나 이상의 면역 억제제 또는 면역 내성제를 더 포함할 수 있고, 상기 면역 억제제 또는 면역 내성제는 앞서 열거된 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 키트는 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여될 수 있는 하나 이상의 혈관신생 억제제, 예를 들면, 앞서 열거된 혈관신생 억제제들 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 동결시, 해동 후 회수될 수 있는 RPE 세포가 약 60% 이상의 접종 효율(seeding frequency)를 갖게 하는 평균 성숙도 수준(maturity level)을 갖는 복수 개의 동결보존 망막 색소 상피(RPE) 세포를 포함하는 동결보존 조성물(cryopreserved composition)을 제공한다. 상기 접종 효율은 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상일 수 있다. 상기 평균 성숙도 수준은 상기 복수 개의 동결보존된 RPE 세포를 대표하는 세포 집단의 평균 멜라닌 함량을 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 상기 복수 개의 동결보존 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만일 수 있다.

일 양태에서, 본 개시는 복수 개의 동결보존 망막 색소 상피(RPE) 세포를 포함하는 동결보존 조성물로서, 상기 복수 개의 동결보존 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만인 것인 동결보존 조성물을 제공한다.

상기 세포는 동결보존 배지(cryopreservation medium)에 담길 수 있다. 상기 동결보존 배지는 DMSO(디메틸 술폭시드), 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 2-메틸-2,4-펜탄디올(MPD), 프로필렌 글리콜, 및 수크로오스 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 예를 들면, 약 5% 내지 약 50%의 DMSO 및 약 30% 내지 약 95%의 혈청을 포함할 수 있고, 상기 혈청은 선택적으로 우태아혈청(FBS)일 수 있다. 상기 동결보존 배지는 약 90% FBS 및 약 10% DMSO를 포함할 수 있다.

해동 후 회수될 수 있는 RPE 세포는 약 60% 이상의 접종 효율, 예를 들면, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상의 접종 효율을 갖는다.

상기 동결보존 조성물은 동결시 약 5,000개 내지 약 1x10⁸개의 생 RPE 세포, 예를 들면, 동결시 약 200,000개 내지 약 10,000,000개, 약 20,000개 내지 약 50,000,000개, 약 250,000개 내지 약 5,000,000개, 약 500,000개 내지 약 4,000,000개, 또는 약 1,000,000개 내지 약 4,000,000개의 생 RPE 세포를 포함할 수 있다.

해동 후 회수된 RPE 세포는 동결 후 약 3, 6, 9, 또는 12개월 이상 경과 시점에 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상의 접종 효율을 가질 수 있다.

해동 후 생존가능한 세포의 85% 이상은 해동 후 2 내지 8℃에서 최대 1시간, 최대 2시간, 최대 3시간, 최대 4시간, 최대 5시간, 또는 최대 6시간 동안 보관시 생존가능한 상태로 유지될 수 있다.

상기 동결보존 조성물은 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0.0001% 미만의 RPE 세포가 아닌 세포를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 10 pg/세포 미만일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 9 pg/세포 미만일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 7 pg/세포 미만일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 6 pg/세포 미만일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 5 pg/세포 미만일 수 있다.

상기 동결보존 조성물 중 세포의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상은 베스트로핀+일 수 있다. 상기 동결보존 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+ 및/또는 MITF+일 수 있다. 상기 동결보존 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+ 및/또는 베스트로핀+일 수 있다. 상기 동결보존 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 ZO-1+일 수 있다. 상기 동결보존 조성물 중 세포의 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상은 PAX6+ 및 베스트로핀+일 수 있다. 상기 동결보존 조성물 중 세포의 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+일 수 있다.

상기 동결보존 조성물에서, 선택적으로 상기 동결보존 조성물 중 백만 개의 세포당 1개 이하의 세포 및 선택적으로 9백만 개의 세포당 2개 이하의 세포가 OCT-4 및 알칼리 포스파타아제(AP) 발현 모두에 대해 양성일 수 있다.

상기 동결보존 조성물은 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는, 하나 이상의 혈관신생 억제제, 예를 들면, 앞서 열거된 혈관신생 억제제 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 RPE 세포는 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 상기 RPE 세포는 다능성 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 RPE 세포는 유전적으로 조작될 수 있는 다능성 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 유전적 조작은 상기 RPE에 의한 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자의 생성을 초래할 수 있다. 상기 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자는: 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린; 특이적 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-VEGF 수용체 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-알파5베타1 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자, 에를 들면, 그의 생성이 RPE65 프로모터, 카텝신 D 근위 프로모터(Cathepsin D Proximal Promoter), 및 VMD2 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터에 의해 조절된 인자를 포함할 수 있다.

상기 다능성 줄기 세포는 OCT-4, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-80을 포함하는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 양성일 수 있다.

상기 다능성 세포는 배양물에서 착색 상피 세포(pigmented epithelial cell)가 나타나기에 충분한 시간 동안 다층 집단(multilayer population) 또는 배상체(embryoid body)로 배양된 인간 다능성 세포일 수 있다.

상기 배양물에 착색 상피 세포가 나타나기에 충분한 시간은 약 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 5주 이상, 약 6주 이상, 또는 약 7주 이상, 약 8주 이상을 포함할 수 있다.

일 양태에서, 본 개시는 (a) RPE 세포를 부착 조건(adherent condition) 하에 배양하여, 자갈(cobblestone) 형태를 갖는 착색 RPE 세포의 실질적으로 단층 배양물을 형성하는 단계; 및

(b) 상기 배양물로부터 동결보존 또는 약제학적 제제를 위한 RPE 세포를 회수(harvest)하는 단계로서, 회수 시, 착색 RPE 세포의 단리된 집단은 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 갖는 것인 단계를 포함하는, 약제학적 제제(pharmaceutical preparation)에서 사용하기 위한 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

10⁶개 이상의 RPE 세포가 동결보존 또는 약제학적 제제화를 위해 회수될 수 있다. 상기 RPE 세포는 다능성 줄기 세포로부터 제조될 수 있고, 상기 다능성 줄기 세포는 선택적으로 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 iPS 세포일 수 있다.

평균 멜라닌 함량은 회수된 RPE 세포 중 가장 많이 착색된 5 퍼센트와 가장 적게 착색된 5 퍼센트를 제외한 세포 집단에 대해 결정될 수 있다. 상기 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 5 pg/세포 미만, 4 pg/세포 미만, 3 pg/세포 미만, 2 pg/세포 미만, 및 0.1 pg/세포 이상, 및 선택적으로 0.5 pg/세포 또는 1 pg/세포 이상; 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-7 pg/세포, 0.5-6 pg/세포, 또는 1-5 pg/세포일 수 있다.

일 양태에서, 본 교시는 (a) RPE 세포를 부착 조건 하에 배양하여, 자갈 형태를 갖는 착색 RPE 세포의 실질적으로 단층 배양물을 형성하는 단계; (b) RPE 세포가 8 pg/세포보다 높은 평균 멜라닌 함량에 도달하기 전에 1회 이상 RPE 세포를 계대시키는 단계; 및 (c) 선택적으로, 상기 1회 이상의 계대 후에, 동결보존 또는 약제학적 제제를 위해 RPE 세포를 회수하는 단계로서, 회수 시, 상기 RPE 세포는 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 갖는 것인 단계를 포함하는, 약제학적 제제에서 사용하기 위한 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

일 양태에서, 본 개시는 (a) 다능성 줄기 세포를 배양하여 배상체(EB)를 형성하거나, 또는 다능성 줄기 세포를 배양하여 다층 집단을 형성하는 단계로서, 상기 다능성 줄기 세포는 선택적으로 인간 배아 줄기 세포이거나 인간 iPS 세포인 것인 단계; (b) 세포질에 분산된 갈색 색소를 포함하는 착색 세포의 출현을 위한 충분한 시간 동안, 세포의 다층 집단 또는 EB를 배양하는 단계; 및 (c) (b)의 착색 세포를 단리하고 배양하여 평균 착색(pigmentation) 수준을 갖는 RPE 세포를 포함하는 배양된 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 단계 (b)는 상기 배상체를 배양하여 부착성 배양물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (a)는 다능성 세포의 배양물이 더 증식하게 하여, 그에 의해 다층 집단을 형성할 수 있게 하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (a)는 상기 다능성 세포를 저-부착성 기질(low-adherent substrate) 상에서 배양하거나 또는 상기 다능성 세포를 현적(hanging drop) 방법을 이용하여 배양하여, 상기 다능성 세포로부터 배상체를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 다능성 줄기 세포는 유도 다능성 줄기(iPS) 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후(postpartum) 줄기 세포, 다분화능(multipotent) 줄기 세포, 또는 배아 생식 세포(embryonic germ cell)일 수 있다. 상기 다능성 세포는 인간 ES 세포이거나 또는 인간 iPS 세포일 수 있다. 상기 다능성 세포는 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 상기 유전적 조작은 상기 RPE에 의한 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자, 예를 들면, 앞서 열거된 것들의 생성을 초래한다. 단계 (a)에서 배상체가 형성될 수 있고 및/또는 단계 (c)에서 착색 세포가 배양될 수 있는 배양 배지는 DMEM을 포함할 수 있다. 상기 단계 (a)에서 배상체가 형성될 수 있고 및/또는 단계 (c)에서 착색 세포가 배양될 수 있는 배지는 EB-DM을 포함하거나, 그로 필수적으로 구성되거나 또는 그로 구성될 수 있다. 단계 (c)에서 상기 착색 세포가 배양되는 배지는 EB-DM을 포함할 수 있다. 단계 (c)에서 상기 착색 상피 세포가 배양될 수 있는 배지는 RPE-GM/MM을 포함하거나, 그로 필수적으로 구성되거나 또는 그로 구성될 수 있다. 단계 (b)에서 배양의 지속 시간은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 이상이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 이상일 수 있다. 단계 (a), (b), 또는 (c)에서 사용되는 배양 배지는 EB-DM, RPE-GM/MM, MDBK-GM, OptiPro SFM, VP-SFM, EGM-2, 또는 MDBK-MM일 수 있다. 단계 (c)는 배양물을 트립신, 콜라게나아제, 디스파아제(dispase), 파파인, 콜라게나아제와 디스파아제의 혼합물, 및 콜라게나아제와 트립신의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 효소와 접촉시키는 단계를 포함하거나, 또는 배양물의 기계적 파쇄(mechanical disruption) 또는 단리를 포함하거나, 또는 배양물을 EDTA 또는 EGTA와 접촉시켜, 상기 착색 세포의 배양 기질(culture substrate)로의 부착을 파괴시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 다능성 줄기 세포는 감소된 HLA 항원 복잡성을 갖는다.상기 RPE 세포는 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커의 실질적인 발현이 없는 것일 수 있다. 상기 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커는 OCT-4, NANOG, Rex-1, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, DPPA-2, 및/또는 DPPA-4일 수 있다.

상기 배상체는 그들의 형성 후에, 예를 들면, 외향 성장물(outgrowth)이 성장할 수 있게 하기 위해, 부착 배양물로 배양될 수 있다. 상기 RPE 세포는 하나 이상의 RPE 세포 마커에 대해 양성일 수 있다. 상기 하나 이상의 RPE 세포 마커는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MITF, Otx2, PAX2, PAX6, 또는 티로시나아제 중 하나 이상, 또는 선택적으로 PAX6 및 베스트로핀을 포함한다.

상기 방법은 상기 RPE 세포를 알파 인테그린 서브유닛 발현을 증가시키는 조건 하에서, 예를 들면, 전술된 바와 같이 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 EB는 ROCK(rho-associated protein kinase) 억제제, 예를 들면, Y-27632의 존재 하에 형성될 수 있다. 상기 RPE 형성 전에, 상기 다능성 세포는 매트리겔™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제) 상에서 배양될 수 있다.

일 양태에서, 본 개시는 망막 변성(retinal degradation)의 치료를 위해 적합한 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제로서, 상기 RPE 세포는 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 포함하고, 상기 RPE 세포는: 이식 후 약 1개월 이상 동안 그들의 표현형 유지, 약 1개월 이상 동안 배양에서 그들의 표현형 유지, 이식 후 숙주로의 통합(integrate), 이식 후 실질적으로 증식하지 않음, 식세포 활성(phagocytositic)을 가짐, 비타민 A의 전달, 대사, 또는 저장, 이식 후, 망막과 맥란막 간 철의 수송, 이식 후 맥란막(Bruch's membrane)으로의 부착, 이식 후, 미광 흡수, 알파 인테그린 서브유닛의 상승된 발현, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE 세포보다 긴 평균 텔로미어 길이, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 배양에서의 더 긴 복제 수명(replicative lifespan), 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 높은 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛의 발현, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 A2E 함량, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 리포푸신(lipofuscin) 함량, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 축적된 자외선 손상, 또는 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 많은 수의 식포(phagosome) 중 하나 이상의 특징을 갖는 것인 약제학적 제제를 제공한다.

일 양태에서, 본 개시는 망막 변성의 치료를 위해 적합한 RPE 세포를 포함할 수 있는 약제학적 제제로서, 상기 RPE 세포는 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 포함하고, 상기 RPE 세포는: 이식 후 맥란막으로의 부착, 이식 후, 미광 흡수, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE 세포보다 긴 평균 텔로미어 길이, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 배양에서의 더 긴 복제 수명, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 A2E 함량, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 리포푸신 함량, 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 축적된 자외선 손상, 또는 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 많은 수의 식포 중 하나 이상의 특징을 갖는 것인 약제학적 제제를 제공한다.

일 양태에서, 본 개시는 전술된 조성물, 또는 키트, 약제학적 제제 또는 전술된 방법에 따라 제조된 RPE 세포를 망막 변성 질환을 치료하기에 유효한 양으로 필요로 하는 개체의 안구에 투여하는 단계를 포함하는, 망막 변성 질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 망막 변성 질환은 맥란막 결손(choroideremia), 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 연령-관련 황반 변성(건성 또는 습성)(age-related macular degeneration (dry or wet)), 망막 박리(retinal detachment), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa), 스타르가르트병(Stargardt's Disease), 혈관무늬 망막증(Angioid streaks), 또는 근시성 황반 변성(Myopic Macular Degeneration)을 포함할 수 있다. 상기 투여하는 단계는 필요로 하는 안구로의 상기 RPE 세포의 안구내(intraocular) 투여를 포함할 수 있다. 상기 안구내 투여는 상기 RPE 세포의 망막하 공간으로의 주사를 포함할 수 있다. 상기 안구내 투여는 수용액, 선택적으로 등장액 및/또는 염수(saline solution)의 망막하 공간으로의 주사에 의한 전-수포(pre-bleb)의 형성, 및 상기 RPE 세포의 상기 수용액과 동일한 망막하 공간으로의 투여 전 상기 수용액의 제거를 포함할 수 있다. 상기 주사는 니들 또는 주사 캐뉼라를 통해 이루어질 수 있다. 상기 니들 또는 주사 캐뉼라의 직경은 약 0.3 mm 내지 0.9 mm 또는 약 0.5 내지 약 0.6 mm일 수 있다. 상기 니들 또는 주사 캐뉼라는 약 0.09 mm 내지 약 0.15 mm의 직경을 갖는 팁을 포함할 수 있다. 상기 캐뉼라는 MEDONE POLYTIP^® Cannula 25/38g (0.12mm (38g) x 5mm 팁을 갖는 0.50mm (25g) x 28mm 캐뉼라)일 수 있다. 치료의 유효성(effectiveness)은 세극등 바이오현미경 촬영(slit lamp biomicroscopic photography), 안저 촬영(fundus photography), IVFA, 및 SD-OCT, 및 BCVA(best corrected visual acuity) 중 하나 이상에 의한 시각적 결과를 결정하는 것에 의해 평가될 수 있다. 상기 방법은 BCVA(best corrected visual acuity)의 개선 및/또는 ETDRS(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study) 시력 차트에서 판독가능한 문자의 증가를 가져올 수 있다. 상기 망막 변성 질환은 건성 AMD 또는 스타르가르트병일 수 있다.

상기 망막 변성 질환을 치료하기에 유효한 양은 약 20,000-200,000개의 RPE 세포, 약 20,000-500,000개의 RPE 세포, 약 20,000-2,000,000개의 RPE 세포, 또는 약 20,000개 이상의 RPE 세포, 또는 약 20,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 200,000, 또는 500,000개 이상의 RPE 세포일 수 있다.

상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 전에 또는 그와 동시에 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론을 투여받을 수 없다. 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 전 적어도 3, 6, 12, 24, 48, 72, 또는 96 시간 내에, 또는 상기 RPE 세포의 투여와 동시에 코르티코스테로이드를 투여받지 않을 수 있다. 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 전 적어도 1시간 내에 또는 상기 RPE 세포의 투여 직전에 또는 그와 동시에 코르티코스테로이드를 투여받지 않을 수 있다. 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 후 적어도 12, 24, 48, 72, 또는 96 시간 내에 코르티코스테로이드를 투여받지 않을 수 있다. 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 후 적어도 48 시간 내에 코르티코스테로이드를 투여받지 않을 수 있다.

상기 RPE 세포는 혈관신생 억제제, 항산화제, 항산화제 보조인자(antioxidant cofactor), 증가된 항산화 활성에 기여하는 기타 인자, 황반 크산토필(macular xanthophyll), 장쇄 오메가-3 지방산, 아밀로이드 억제제, CNTF 효능제(agonist), RPE65의 억제제, A2E 및/또는 리포푸신 축적을 표적화하는 인자, 광수용체 기능 및/또는 대사의 하향조절제(downregulator) 또는 억제제, α2-아드레날린 수용체 효능제, 선택적 세레토닌1A 효능제, C-5를 표적화하는 인자, 막 공격 복합체(membrane attack complex)(C5b-9) 및 기타 드루센(Drusen) 성분, 면역 억제제, 및 리포푸신의 축적을 예방 또는 치료하는 작용제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제와 조합되어 환자에게 투여될 수 있다.

상기 하나 이상의 작용제는 상기 RPE 세포의 제제와 동시에, 그 전에, 및/또는 그 후에 상기 환자에게 투여될 수 있다.

상기 조성물, 키트, 또는 약제학적 제제는 맥란막 결손, 당뇨 망막병증, 건성 연령-관련 황반 변성, 습성 연령-관련 황반 변성, 망막 박리, 망막색소 변성증, 스타르가르트병, 혈관무늬 망막증, 또는 근시성 황반 변성과 같은, 망막 변성 질환의 치료용 약제의 제조에서 이용될 수 있다.

상기 다능성 줄기 세포는 OCT-4, 알칼리 포스파타아제, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및 TRA-1-80으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다.

상기 RPE 세포는 하기 특징 중 하나 이상을 보인다: 다른 소스로부터 수득된 RPE 세포의 복제 수명보다 길 수 있는 복제 수명; hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 텔로미어 길이(또는 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 집단의 평균)의 30% 이상, 또는 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 텔로미어 길이의 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 퍼센트 이상일 수 있는 평균 텔로미어 길이; 4 kb보다 길거나, 또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 심지어 13 kb, 또는 10 kb 또는 그보다 더 길 수 있는 평균 TRF(terminal rescrtiction fragment) 길이; 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 리포푸신 함량의 50% 미만, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 리포푸신 함량의 40, 30, 20, 또는 10 퍼센트 미만일 수 있는 평균 리포푸신 함량; 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E) 함량의 50 퍼센트 미만, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 A2E 함량의 40, 30, 20, 또는 10 퍼센트 미만일 수 있는 평균 A2E 함량; 10⁵ (100,000)개의 세포당 50 ng 미만일 수 있는 평균 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E) 함량; 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수에 대한 POS(photoreceptor outer segment)의 식세포 작용 속도보다 50 퍼센트 이상 더 크거나, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포에 대한 POS의 식세포 작용의 속도보다 75, 100, 150, 또는 200 퍼센트 이상 더 클 수 있는 POS의 식세포 작용 속도(rate of phagocytosis); 24시간 후 POS(photoreceptor outer segment)의 총 농도의 20 퍼센트 이상, 또는 24시간 후 POS의 총 농도의 25, 30, 25, 40, 또는 50 퍼센트 이상일 수 있는 POS의 식세포 작용의 속도; 성체 숙주로부터 단리된 RPE 세포 대비 축적된 산화적 스트레스 및/또는 DNA 손상의 감소된 수준; 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 평균 프로테오솜(proteasome) 활성보다 50 퍼센트 이상 더 높거나, 또는 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 평균 프로테오솜 활성보다 60, 70, 80, 90 또는 100 퍼센트 이상 더 높을 수 있는 평균 프로테오솜 활성; 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수에 대한 유비퀴틴 접합체(ubiquitin conjugate)의 평균 축적의 50 퍼센트 미만이거나 또는 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 유비퀴틴 접합체의 평균 축적의 40, 30, 20, 또는 10 퍼센트 미만일 수 있는 유비퀴틴 접합체의 평균 축적.

발명의 상세한 설명

본 개시는 건성 AMD 및 스타르가르트병을 가진 환자에서 이러한 hESC-유래 RPE의 안전성 및 내성을 연구하는 두 개의 전향적 임상 시험에서 두 환자에 대한 초기 결과를 설명한다. hESC-유래 RPE 세포는 이 보고의 작성 시점에 거부 또는 종양 형성의 어떠한 징후도 보이지 않았다. 시각 측정(visual measurement)은 두 환자 모두에서 개선을 시사한다. 이 결과는 hESC가 다양한 망막 변성 질환의 효과적인 치료를 위한 RPE의 잠재적으로 안전하고 고갈되지 않는 소스로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.

또한, 유리한 특징을 갖는 hESC-유래 RPE 세포 집단을 제조하는 방법이 기술된다. 유전자 및 색소 발현의 정도를 포함한, 분화 경로의 제어가 주사 후 세포의 생존, 부착 및 증식을 유의성 있게 증가시킨다는 것이 확인되었다. 구체적으로, 본 명세서에 제시된 데이터는 RPE 성숙도 및 착색의 정도가 인 비트로에서 세포의 후속 부착 및 증식에 급격하게 영향을 미친다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 일차 세포(primary cell)의 사용 대비, 치료적 용도를 위해 hESC로부터 분화된 세포를 사용하여 수득될 수 있는 장점을 보여준다. 이러한 결과는 잠재적으로 감소된 면역원성을 갖는 무한한 수의 건강한 "어린" 세포를 제조하는 것 외에(20, 21), 인 비트로 분화의 단계가 환자로의 이식 전에 안전성, 정체(identity), 순도 및 효능(potency)을 보장하기 위해 세포 및 분자 수준에서 제어될 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명자들은 선진국에서 실명의 주요 원인인 스타르가르트 황반 이양증(SMD) 및 건성 연령-관련 황반 변성(AMD)을 가진 환자에서 hESC-유래 망막 색소 상피(RPE)의 망막하 이식의 안전성 및 내성을 결정하기 위하여 두 개의 전향적 임상 연구를 개시하였다. 시력(visual acuity), 플루오레세인 혈관조영술(fluorescein angiography), 광 간섭성 단층촬영 기술(optical coherence tomography, OCT), 및 시야 검사(visual field testing)를 포함한, 수술전- 및 수술후 안과 검사를 각 시험에서 제1 환자에 대해 수행했다.

제어된 hESC 분화는 거의 100% 순수한 RPE 집단을 초래했다. 수술 직후에, 두 환자 모두에서 이식 부위에 과색소침착을 볼 수 있었고, 후속 증거는 세포가 원래의(native) RPE 층에 부착되고 그에 통합되었다는 것을 보여 주었다. 염증 또는 과다증식의 징후는 관찰되지 않았다. 시각 척도(visual measure)는 최초 2개월 동안 개선의 징후를 보여주었다. 2주 차에, BCVA(best corrected visual acuity)는 AMD 환자의 연구 대상 눈에서 치료-전 20/500으로부터 20/200까지 향상되고, 지속적으로 향상되었으며(20/200-20/320) 및 ETDRS(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study) 시력 차트에서 문자의 증가를 보였다. SMD 환자는 동일한 기간 동안 손 동작(hand motion, HM)에서 손가락을 세는 것(counting fingers, CF)까지 개선되었고, 1개월 및 2개월 차에 BCVA는 20/800까지 개선되었다. RPE 이식 전에, 환자는 ETDRS 차트 상에서 어떠한 문자도 읽을 수 없었으나, 2주 차에 문자를 읽기 시작했고, 이는 연구 기간 동안 지속적으로 개선되었다(1개월 및 2개월 차에 5개의 문자).

hESC-유래 RPE 세포는 이 보고의 작성 시점에 이식이나 종양 형성의 징후를 전혀 보이지 않았다. 시각 측정은 두 환자 모두에서 개선을 보였다.

정의

본 명세서에 기재된 발명이 완전히 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기의 상세한 설명이 제공된다. 본 발명의 다양한 구체예가 상세하게 설명되고 제공된 실시예에 의해 더 예시될 수 있다.

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것들과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 또는 그와 동등한 방법 및 물질이 본 발명에서 또는 본 발명의 테스트에서 이용될 수 있으나, 적절한 방법 및 물질이 하기에 설명된다. 물질, 방법 및 실시예는 예시적인 것에 불과하고, 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 하기의 용어 및 정의가 본 명세서에서 제공된다.

본 명세서에서 설명 및 뒤따르는 청구항에서 사용된 바와 같이, "하나의(a, an)" 및 "그의(the)" 의미는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수 지칭을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "안에(in)"의 의미는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않으며, "안에(in)" 및 "위에(on)"를 포함한다.

본 명세서 전체에서, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 그의 변형, 예를 들면, "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 기재된 정수 또는 정수의 군의 포함을 암시하나, 다른 정수 또는 정수의 군의 배제를 암시하지 않는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용된, "유효량(effective amount)"은 질병을 치료하기 위해 환자에게 투여되는 경우, 그 질병의 치료를 달성하기에 충분한, 화합물 또는 세포의 양을 광범위하게 의미한다. 유효량은 예방(prophylaxis)을 위해 유효한 양, 및/또는 방지(prevention)를 위해 유효한 양일 수 있다. 유효량은 징후/증상의 발생을 예방하고, 징후/증상의 발생의 중증도를 감소시키고, 징후/증상의 발생을 제거하고, 징후/증상의 발생의 발달을 둔화시키고, 징후/증상의 발생의 발단을 예방하고, 및/또는 징후/증상의 발생의 예방을 달성하기에 유효한 양일 수 있다. "유효량"은 질병 및 그의 중증도, 및 치료대상 환자의 연령, 체중, 병력(medical history), 감수성(susceptibility), 및 기존의 질환에 따라 다를 수 있다. 용어 "유효량"은 본 개시의 목적을 위해 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"과 동의어이다.

본 명세서에서 사용된, "배아(embryo)" 또는 "배아의(embryonic)"는 모계 숙주의 자궁 막 내로 착상되지 않은 발생 중인 세포 매스(developing cell mass)를 광범위하게 의미한다. "배아 세포(embryonic cell)"는 배아로부터 단리되거나, 배아 내에 담긴 세포이다. 이는 또한 2-세포기 만큼 초기에 수득된 할구(blastomere), 및 할구 집단(aggregated blastomeres)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된, "배아 줄기 세포(embryonic stem cell)" (ES 세포)는 세포 계통(cell line)으로서 연속적으로 계대된 배반포(blastocyst) 또는 상실배(moralae)의 내부 세포 매스로부터 유래된 세포를 광범위하게 의미한다. ES 세포는 난 세포와 정자의 수정, 또는 DNA, 핵 이식, 단위생식(parthenogenesis)으로부터 유래되거나, 또는 HLA 영역에서 동형 접합성을 갖는 ES 세포를 생성하는 수단에 의해 유래될 수 있다. ES 세포는 또한 세포를 생성하기 위한 정자와 난 세포의 융합, 핵 이식, 단위생식, 또는 크로마틴의 재프로그래밍 및 뒤이은 재프로그래밍된 크로마틴의 원형질막으로의 후속 통합(incorporating)에 의해 생성된, 접합체, 할구, 또는 배반포-단계 포유동물 배아(blastocyst-staged mammalian embryo)로부터 유래된 세포를 의미할 수 있다. 그들의 출처 또는 그들을 제조하기 위해 사용된 특정한 방법에 관계 없이, 배아 줄기 세포는 (i) 모든 3개의 배엽(germ layer)의 세포로 분화하는 능력, (ii) 적어도 Oct-4 및 알칼리 포스파타아제의 발현, 및 (iii) 면역약화(immunocompromised) 동물로 이식되는 경우 기형종(teratoma)을 생성하는 능력에 기반하여 식별될 수 있다. 이 용어는 또한 배아의 하나 이상의 할구로부터 단리된 세포, 바람직하게는 배아의 나머지 부분을 파괴시키지 않으면서 단리된 세포를 포함한다(예를 들면, 각각 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, Chung et al., Cell Stem Cell. 2008 Feb 7;2(2): 113-7; U.S. PGPub No. 20060206953; U.S. PGPub No. 2008/0057041 참조). 이 용어는 또한 비-배아(non-embryonic) 세포가 과정에 사용되는 경우에도, 체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer)에 의해 생성된 세포들을 포함한다. ES 세포는 난자(egg cell)와 정자 또는 DNA의 수정, 핵 이식, 무성생식, 또는 HLA 영역에서 동형 접합성을 갖는 ES 세포를 생성하기 위한 수단에 의해 유래될 수 있다. ES 세포는 또한 세포를 생성하기 위한 정자와 난자의 융합, 핵 이식, 단위 생식, 또는 크로마틴의 재프로그래밍 및 뒤이은 재프로그래밍된 크로마틴의 원형질막으로의 내포에 의해 생성된 접합체, 할구, 또는 배반포-단계 포유동물 배아(blastocyst-staged mammalian embryo)로부터 유래된 세포이다. 본 개시의 인간 배아 줄기 세포는 MA01, MA09, ACT-4, No. 3, H1, H7, H9, H14 및 ACT30 배아 줄기 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 구체예에서, RPE 세포를 생성하기 위해 이용된 인간 ES 세포는 GMP 기준에 따라 유래되고 유지된다.

본 명세서에서 사용된 "배아-유래 세포(Embryo-derived cell)" (EDC)는 내세포 집단(inner cell mass), 배순(embryonic shield), 또는 외배반(epiblast), 또는 원시 내배엽, 외배엽 및 중배엽 및 그들의 파생물(derivative)을 포함한, 초기 배아의 기타 다능성 줄기 세포를 포함한, 상실배-유래 세포, 배반포-유래 세포를 광범위하게 의미한다. "EDC"는 또한 응집된 단일 배반포 또는 발생의 다양한 단계로부터의 배아로부터의 할구 및 세포 집단(cell mass)를 포함하나, 세포주로부터 계대된(passaged) 인간 배아 줄기 세포는 배제한다.

본 명세서에서 사용된, "황반 변성(macular degeneration)"은 맥란막, 신경 망막(neural retina), 및 망막 색소 상피의 이상과 연관된 중심 시력(central vision)의 점진적인 상실을 특징으로 하는 질병을 광범위하게 의미한다. 황반 변성 질환은 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration), 노스 캐롤라이나 황반 이영양증(North Carolina macular dystrophy), 소르스비 안저 이영양증(Sorsby's fundus dystrophy), 스타르가르트병(Stargardt's disease), 패턴 이영양증(pattern dystrophy), 베스트병(Best disease), 황반병증(malattia leventinese), 디온 벌집 맥란막염(Doyne's honeycomb choroiditis), 우성 드루센(dominant drusen), 및 방사상 드루센(radial drusen)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된, "다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell)"는 미분화 상태를 유지하고, 안정한 (바람직하게는 정상적인) 핵형을 보이고, 적절한 조건 하에 모든 3개의 배엽(즉, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽)으로 분화할 수 있는 능력을 가지면서, 인 비트로에서 연장된 또는 실질적으로 무한정 증식이 가능한 세포를 광범위하게 의미한다.

본 명세서에서 사용된, "다능성 배아 줄기 세포(pluripotent embryonic stem cell)"는 (a) 면역결핍(immunodeficient)(SCID) 마우스에 이식되는 경우 기형종을 유도할 수 있고; (b) 모든 3개의 배엽의 세포 종류(예를 들면, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포 종류)로 분화할 수 있으며; (c) 하나 이상의 분자 배아 줄기 세포 마커를 발현(예를 들면, Oct-4, 알칼리 포스파타아제, SSEA 3 표면 항원, SSEA 4 표면 항원, NANOG, TRA 1 60, TRA 1 81, SOX2, REX1을 발현)하는 세포를 광범위하게 의미한다. 추가적인 예로서, 다능성 세포는 OCT-4, 알칼리 포스파타아제, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-80을 발현할 수 있다. 대표적인 다능성 줄기 세포는 예를 들면, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 대표적인 다능성 줄기 세포는 포배기(blastocyst stage) 배아의 ICM으로부터 유래된 배아 줄기 세포, 및 분할기(cleavage stage) 또는 상실기(morula stage) 배아의 하나 이상의 세포로부터 (선택적으로 배아의 나머지를 파괴하지 않으면서) 유래된 배아 줄기 세포를 포함한다. 이러한 배아 줄기 세포는 수정, 또는 체세포 핵 이식(SCNT), 단위생식(parthenogenesis), 및 웅성 단위생식(androgenesis)을 포함한 무성 수단에 의해 제조된 배아 물질(embryonic material)로부터 생성될 수 있다. 추가적인 대표적 다능성 줄기 세포는 인자들의 조합(본 명세서에서 재프로그래밍 인자(reprogramming factor)로 지칭됨)을 발현하거나 또는 그의 발현을 유도하는 것에 의해 생성된 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 포함한다. iPS 세포는 태아 체세포, 신생아(postnatal, newborn) 체세포, 소년(juvenile) 체세포, 또는 성체 체세포를 이용하여 생성될 수 있다. 특정한 구체예에서, 체세포를 다능성 줄기세포로 재프로그래밍하기 위해 이용될 수 있는 인자는 예를 들면, Oct4 (가끔, Oct 3/4로도 지칭됨), Sox2, c-Myc, 및 Klf4의 조합을 포함한다. 다른 구체예에서, 체세포를 다능성 줄기세포로 재프로그래밍하기 위해 이용될 수 있는 인자는 예를 들면, Oct-4, Sox2, Nanog, 및 Lin28의 조합을 포함한다. 다른 구체예에서, 체세포는 2개 이상의 재프로그래밍 인자, 3개 이상의 재프로그래밍 인자, 또는 4개의 재프로그래밍 인자를 발현시키는 것에 의해 재프로그래밍된다. 다른 구체예에서, 체세포를 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위해, 추가적인 재프로그래밍 인자가 확인되고, 단독으로, 또는 하나 이상의 공지된 재프로그래밍 인자와 조합하여 이용될 수 있다. iPS 세포는 통상적으로 배아 줄기 세포와 동일한 마커의 발현에 의해 확인될 수 있고, 특정한 iPS 세포주는 그의 발현 프로파일이 다를 수 있다.

"RPE 세포", "분화된(differentiated) RPE 세포," "ES 유래 RPE 세포,"는 다능성 줄기 세포로부터 분화된, 예를 들면, 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 분화된 RPE 세포를 광범위하게 지칭하기 위해 호환적으로 사용될 수 있다. 이 용어는 세포의 성숙도의 수준과 관계없이, 분화된 RPE 세포를 지칭하기 위해 일반적으로 이용되고, 따라서, 다양한 성숙도 수준의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포는 그들의 자갈 형태(cobblestone morphology) 및 색소의 초기 출현(initial appearance)에 의해 시각적으로 인식될 수 있다. RPE 세포는 또한 Oct-4 및 NANOG와 같은 배아 줄기 세포 마커의 발현의 실질적인 부재에 근거하여, 및 RPE 65, PEDF, CRALBP, 및 베스트로핀(bestrophin)과 같은 RPE 마커의 발현에 근거하여 분자적으로 식별될 수 있다. 예를 들면, 예상되는 염색 패턴이 관찰되는 경우, 예를 들면, 핵에 국소화된 PAX6, 다각형 패턴으로 원형질 막에 국소화된 베스트로핀(세포의 주변에 선명한 선으로 국소화된 베스트로핀 염색을 보임), 다각형 패턴으로 세포를 둘러싼(outlining) 밀착 연접에 존재하는 ZO-1 염색, 및 핵에 한정된 MITF 염색이 관찰되는 경우, 세포는 주어진 마커에 대해 양성으로 간주된다. 달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 RPE 세포는 다능성 줄기 세포로부터 인 비트로에서 분화된 RPE 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용된, "성숙 RPE 세포(mature RPE cell)" 및 "성숙 분화 RPE 세포(mature differentiated RPE cell)"는 RPE 세포의 초기 분화 후 일어나는 변화를 광범위하게 지칭하기 위해 호환적으로 사용될 수 있다. 구체적으로, RPE 세포는 부분적으로 색소의 초기 출현에 근거하여 인식될 수 있으나, 분화 후에, 성숙 RPE 세포는 증가된 착색(enhanced pigmentation)에 근거하여 인식될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "접종 효율(seeding efficiency)"은 해동 후, 생존 상태로 유지되고, 배양 기질(culture substrate)에 부착될 수 있는 회수된 세포의 비율을 의미한다. 예를 들면, 접종 효율은 세포를 해동, 세척, 및 플레이팅(바람직하게는 젤라틴 상에 플레이팅)하는 것에 의해 측정될 수 있다; 총 세포 계수(total cell count)는 플레이팅 전에 결정되고, 생 세포 수(viable cell count)는 플레이팅 후에 결정되며; 그 후, 접종 효율은 플레이팅 전 총 세포 중 플레이팅 후 살아있고, 기질에 부착하는 세포의 비율을 의미한다. 보다 구체적인 예로서, 접종 효율은 세포를 37℃ 수조에서 지속적인 교반 하에 (예를 들면, 1 내지 2분 또는 세포를 해동시키기에 충분한 시간 동안) 해동시키고, 뒤이어 세포를 인산염 완충 염수(또는 다른 적절한 세척 용액)로 3회 세척하고, 생(viable) 세포 및 비-생(non-viable) 세포를 포함한 총 세포 수를 결정하고(예를 들면, 혈구계수기를 이용하여), 세포를 성장 배지(예를 들면, RPE-GM)를 포함하는 젤라틴 상에 세포를 플레이팅하고, 세포를 (바람직하게는 37℃에서) 인큐베이션하고, 약 24시간 동안 세포가 젤라틴에 부착될 수 있게 하고, 생 세포 수를 결정하는 것에 의해(예를 들면, 혈구계수기를 이용하고, 생존력(viability)을 결정하기 위해 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)를 이용함) 결정된다; 접종 효율은 플레이팅 후 생존 세포 수를 플레이팅 전 총 세포 수로 나누는 것에 의해 결정된다.

본 명세서에서 사용된, "착색된(pigmented)"은 착색(pigmentation)의 수준, 예를 들면, RPE 세포가 ES 세포로부터 분화될 때 초기에 일어나는 색소침착의 수준을 광범위하게 지칭한다. 착색은 세포 밀도 및 분화된 RPE 세포의 성숙도에 따라 변할 수 있다. RPE 세포의 착색은 RPE 세포의 최종 분화(terminal differentiation) 후 평균 RPE 세포와 동일할 수 있다. RPE 세포의 착색은 RPE 세포의 최종 분화 후 평균 RPE 세포보다 더 착색될 수 있다. RPE 세포의 착색은 최종 분화 후 평균 RPE 세포보다 덜 착색될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 질병의 "징후(sign)"는 광범위하게, 환자의 검사시 발견될 수 있는, 질병을 나타내는 이상(abnormality); 질병의 주관적 표시인 증상과 대조적으로, 질병의 객관적 표시를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 질병의 "증상(symptom)"은 병리적 현상(morbid phenomenon), 또는 환자에 의해 경험되고 질병을 나타내는, 구조, 기능, 또는 감각의 정상으로부터의 이탈을 광범위하게 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "요법(therapy)," "치료적(therapeutic)," "치료하는(treating)," "치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)"는 광범위하게, 질병을 치료하고, 질병 또는 그의 임상적 증상의 발병을 중지(arrest)시키거나 감소시키고, 및/또는 질병을 완화하고, 질병 또는 그의 임상적 증상의 퇴행(regression)을 유발하는 것을 의미한다. 요법은 질병, 질병의 징후, 및/또는 증상의 예방(prophylaxis), 방지(prevention), 치료(treatment), 치유(cure), 해소(remedy), 감소, 경감, 및/또는 완화(relief)를 제공하는 것을 포함한다. 요법은 진행 중인 질병 징후 및/또는 증상(예를 들면, 실명, 망막 손상(retinal deterioration))을 가진 환자에서 징후 및/또는 증상의 경감을 포함한다. 요법은 또한 "예방" 및 "방지"를 포함한다. 예방은 환자에서 질병의 치료 후에 질병이 발생하는 것을 방지하거나, 또는 환자에서 질병의 발생 또는 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 요법의 목적을 위해, 용어 "감소된(reduced)"은 징후 및/또는 증상의 임상적으로 유의한 감소를 광범위하게 의미한다. 요법은 징후 및/또는 증상(예를 들면, 망막 변성, 시력 상실)의 재발 또는 반복을 치료하는 것을 포함한다. 요법은 징후 및/또는 증상의 출현을 배제시키는 것 및 기존 징후 및/또는 증상을 감소시키는 것 및 기존 징후 및/또는 증상을 제거하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 요법은 만성 질환("유지(maintenance)") 및 급성 질환을 치료하는 것을 포함한다. 예를 들면, 치료는 징후 및/또는 증상(예를 들면, 실명, 망막 변성)의 재발 또는 반복을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "코르티코스테로이드(corticosteroid)"는 천연 및 인공 코르티코스테로이드, 유사체, 등을 포함한, 글루코코르티코이드 수용체에 결합하는 스테로이드 호르몬의 종류를 지칭하기 위해 사용된다. 대표적인 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 히드로코르티손, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손, 트리암시놀론, 베클로메타손, 플루드로코르티손 아세테이트, 플루티카손(플루티카손 프로피오네이트 (FP) 포함), 부데소니드, 시클레소니드, 모메타손, 및 플루니솔리드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

RPE 세포의 제제 및 조합 요법(Combination Therapy)

본 개시는 RPE 세포, 실질적으로 정제된 RPE 세포의 집단을 포함한, RPE 세포의 제제(preparation), RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제, 및 RPE 세포의 동결보존 제제(cryopreserved preparation)을 제공한다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 그의 천연 환경에서 발견되는 하나 이상의 단백질, 분자, 또는 기타 불순물이 실질적으로 없을 수 있다(예를 들면, "단리됨(isolated)"). RPE 세포는 인간 RPE 세포를 포함한, 포유동물 RPE 세포일 수 있다. 본 개시는 또한 인간 RPE 세포, 실질적으로 정제된 인간 RPE 세포의 집단, 인간 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제, 인간 RPE 세포의 동결보존 제제를 제공한다. 상기 제제는 인간 배아 줄기 세포-유래 RPE 세포, 인간 iPS 세포-유래 RPE 세포를 포함하는 제제, 및 분화된 ES 유래 RPE 세포를 포함하는 (비-RPE 세포에 대해) 실질적으로 정제된 제제일 수 있다.

상기 제제의 RPE 세포는 기타 소스(예를 들면, 공여된 인간 조직, 예를 들면, 태아, 영아, 아동, 청소년 또는 성인 조직으로부터 유래된 배양물)로부터 수득된 RPE 세포의 복제 수명(replicative lifespan)보다 더 긴 복제 수명을 가질 수 있다. 복제 수명은 복제 노화(replicative senescence) 전에 배양물에서 집단 배가(population doubling)의 횟수를 결정하는 것에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, 제제의 RPE 세포는 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE 집단의 복제 수명보다 10 퍼센트 이상, 바람직하게는 공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE 집단의 복제 수명보다 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100 퍼센트 이상 더 큰 복제 수명을 가질 수 있다.

제제의 RPE 세포는 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 텔로미어(telomere) 길이 (또는 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 집단의 평균)의 30 퍼센트 이상, 바람직하게는 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 텔로미어 길이 (또는 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 집단의 평균)의 40, 50, 60, 70, 80 퍼센트 이상, 또는 심지어 90 퍼센트인 평균 텔로미어 길이를 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 hESC 및/또는 인간 iPS 세포 (또는 상기 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 집단)는 상기 RPE 세포로 분화된 세포 또는 세포 집단일 수 있다.

제제의 RPE 세포는 4 kb보다 길고, 바람직하게는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 kb보다 길거나, 심지어 13 kb보다 긴 말단 제한 절편 길이(terminal restriction fragment length, TRF)를 가질 수 있다. 대표적인 구체예에서, 제제의 RPE 세포는 10 kb 이상인 TRF를 가질 수 있다.

제제의 RPE 세포는 성체 안구(예를 들면, 25 내지 80세의 성인 환자, 보다 바람직하게는 50 내지 80세의 성인 환자)로부터 단리된 RPE의 동일한 수(equivalent number)의 평균 리포푸신(lipofuscin) 함량의 50% 미만, 보다 바람직하게는 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 평균 리포푸신 함량의 40, 30, 20, 또는 심지어 10 퍼센트 미만인 평균 리포푸신 함량을 가질 수 있다.

제제의 RPE 세포는 성체 안구(예를 들면, 25 내지 80세의 성인 환자, 보다 바람직하게는 50 내지 80세의 성인 환자)로부터 단리된 RPE의 동일한 수의 평균 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민 (A2E) 함량의 50 퍼센트 미만, 보다 바람직하게는 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 평균 A2E 함량의 40, 30, 20, 또는 심지어 10 퍼센트 미만인 평균 A2E 함량을 가질 수 있다.

제제의 RPE 세포는 통합된 피크 강도(integrated peak intensity)(예를 들면, Sparrow el al, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. November 1999 vol. 40 no. 12, pg. 2988-2995에 개시된 것)로부터 결정될 수 있는, 10⁵ (100,000)개의 세포당 50 ng 미만, 보다 바람직하게는 10⁵ 개의 세포당 40ng, 30ng, 20ng, 10ng 미만 또는 심지어 5ng 미만인 평균 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민 (A2E) 함량을 가질 수 있다.

제제의 RPE 세포는 성체 안구(예를 들면, 25 내지 80세의 성인 환자, 보다 바람직하게는 50 내지 80세의 성인 환자)로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수에 대한 광수용체 외부 세그먼트(POS)의 식세포 작용의 속도보다 50 퍼센트 이상 크고, 보다 바람직하게는 75, 100, 150 또는 심지어 200 퍼센트 이상 더 큰 POS의 식세포 작용의 속도를 갖는다. POS 식세포 작용은 하나의 예시적이고 비-한정적인 예로서, Bergmann et al. FASEB Journal March 2004 vol. 18 pages 562-564에 기재된 프로토콜을 이용하여 측정될 수 있다.

제제의 RPE 세포는 24시간 후 POS(photoreceptor outer segment)의 총 농도의 20 퍼센트 이상, 및 보다 바람직하게는 24시간 후 POS의 총 농도의 25, 30, 25, 40, 또는 심지어 50 퍼센트 이상인 POS의 식세포 작용의 속도를 갖는다. POS 식세포 작용은 하나의 예시적이고, 비-한정적인 예로서, Bergmann et al. FASEB Journal March 2004 vol. 18 pages 562-564에 기재된 프로토콜을 이용하여 측정될 수 있다.

RPE 세포는 성체 숙주로부터 단리된 RPE 세포에 비해 축적된 산화적 스트레스 및/또는 DNA 손상의 감소된 수준을 보일 수 있다.

제제의 RPE 세포는 성체 안구(예를 들면, 25 내지 80세의 성인 환자, 보다 바람직하게는 50 내지 80세의 성인 환자)로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 평균 프로테오솜 활성보다 50 퍼센트 이상 더 큰, 보다 바람직하게는 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 평균 프로테오솜 활성의 60, 70, 80, 90, 또는 심지어 100 퍼센트 이상 더 큰 평균 프로테오솜 활성을 가질 수 있다. 프로테오솜 활성은 하나의 예시적이고 비-한정적인 예로서 키모트립신-유사 활성을 위해 숙시닐-Leu-Leu-Val-Tyr-아미도메틸쿠마린 (LLVY-AMC), 트립신-유사 활성을 위해 N-t-부틸옥시카르보닐-Leu-Ser-Thr-Arg-아미도메틸쿠마린 (LSTR-AMC), 및 펩티딜글루타밀-펩티드 히드롤라아제 활성을 위해 벤질옥시카르보닐-Leu-Leu-Glu-아미도메틸쿠마닐 (LLE-AMC)을 이용하여 측정될 수 있다.

제제의 RPE 세포는 성체 안구(예를 들면, 25 내지 80세의 성인 환자, 보다 바람직하게는 50 내지 80세의 성인 환자)로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수에 대한 유비퀴틴 접합체(ubiquitin conjugate)의 평균 축적의 50 퍼센트 미만, 보다 바람직하게는 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 유비퀴틴 접합체의 평균 축적의 40, 30, 20, 또는 심지어 10 퍼센트 미만인 유비퀴틴 접합체의 평균 축적을 가질 수 있다. 유비퀴틴 접합체의 축적은 하나의 예시적이고 비-한정적인 예로서, Zhang et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. August 2008 vol. 49 no. 8 3622-3630에 기재된 프로토콜을 이용하여 측정될 수 있다.

하나 이상의 혈관신생 억제제가 RPE 세포의 제제와 함께, 바람직하게는 안질환, 예를 들면, 혈관신생-연관 안질환의 예방 또는 치료를 위한 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 대표적인 안질환은 황반 변성(예를 들면, 습성 AMD 또는 건성 AMD), 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 및 맥란막 혈관신생(choroidal neovascularization)을 포함한다. 대표적인 혈관신생 억제제는 VEGF 길항제, 예를 들면, VEGF 및/또는 VEGF 수용체 (VEGFR, 예를 들면, VEGFR1 (FLT1, FLT), VEGFR2 (KDR, FLK1, VEGFR, CD309), VEGFR3 (FLT4, PCL))의 억제제, 예를 들면, 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 소형 분자, 화합물, 또는 핵산, 예를 들면, 페가프타닙(pegaptanib) 소디움, 아플리베르셉트(aflibercept), 베바시라닙(bevasiranib), 라파마이신(rapamycin), AGN-745, 비탈라닙(vitalanib), 파조파닙(pazopanib), NT-502, NT-503, 또는 PLG101, CPD791 (VEGFR-2를 억제하는 디-Fab' 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 접합체), 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편 (예를 들면, 베바시주맙(bevacizumab) (AVASTIN®) 또는 라니비주맙(ranibizumab) (LUCENTIS®)), 또는 항-VEGF 수용체 항체 (예를 들면, IMC-1121(B) (VEGFR-2에 대한 단일클론 항체), 또는 IMC-18F1 (VEGFR-1의 세포외 결합 도메인에 대한 항체))를 포함한다. 추가적인 VEGF 활성의 대표적 억제제는 VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인, 예를 들면, VEGF-Trap (아플리베르셉트), VEGFR-1의 도메인 2 및 VEGFR-2의 도메인 3과 IgG1의 Fc 단편의 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 대표적인 VEGFR 억제제는 AZD-2171 (세디라닙(Cediranib))이고, 이는 VEGF 수용체 1 및 2를 억제한다. 추가적인 대표적 VEGF 길항제는 VEGFR-1 및/또는 VEGFR-2를 억제하는 것으로 보고된 TKI를 포함한, 티로신 키나아제 억제제(TKI), 예를 들면, 소라페닙(sorafenib) (Nexavar), SU5416 (Semaxinib), SU11248/수니티닙(Sunitinib) (Sutent), 및 반데타닙(Vandetanib) (ZD 6474)을 포함한다. 추가적인 대표적 VEGF 길항제는 Ly317615 (Enzastaurin)를 포함하고, 이는 VEGFR 신호전달에 관여하는 하류(down-stream) 키나아제(단백질 키나아제 C)를 표적화하는 것으로 생각된다. 추가적인 대표적 혈관신생 억제제는 항-알파5베타1 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편(예를 들면, 볼로시키맙(volociximab))을 포함한 알파5베타1 인테그린 활성의 억제제, 펩티드, 펩티도미메틱, 소형 분자, 화합물, 또는 핵산, 예를 들면, 3-(2-{1-알킬-5-[(피리딘-2-일아미노)-메틸]-피롤리딘-3-일옥시}-아세틸아미노)-2-(알킬-아미노)-프로피온산, (S)-2-[(2,4,6-트리메틸페닐)술포닐]아미노-3-[7-벤질옥시카르보닐-8-(2-피리디닐아미노메틸)-1-옥사-2,7-디아자스피로-(4,4)-논-2-엔-3-일]카르보닐아미노 프로피온산, EMD478761, 또는 RC*D(ThioP)C* (Arg-Cys-Asp-티로프롤린-Cys; 아스테리스크는 시스테인 잔기를 통한 디술피드 결합을 나타냄)을 포함한다. 추가적인 대표적 혈관신생 억제제는 2-메톡시에스트라디올, 알파V베타3 억제제, 안지오포이에틴(Angiopoietin) 2, 혈관신생 억제 스테로이드(angiostatic steroid) 및 헤파린, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오스타틴-관련 분자(angiostatin-related molecule), 항-알파5베타1 인테그린 항체, 항-카텝신 S 항체, 항트롬빈 III 단편, 베바시주밥(bevacizumab), 칼리레티쿨린(calreticulin), 칸스타틴(canstatin), 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole), 연골-유래 혈관신생 억제 인자(Cartilage-Derived Angiogenesis Inhibitory Factor), CDAI, CM101, CXCL10, 엔도스타틴(endostatin), IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-12, IL-18, IL-4, 리노미드(linomide), 마스핀(maspin), 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제(matrix metalloproteinase inhibitor), Meth-1, Meth-2, 오스테오폰틴(osteopontin), 페가프타닙, 혈소판 인자-4, 프로락틴(prolactin), 프롤리페린-관련 단백질(proliferin-related protein), 프로트롬빈 (kringle domain-2), 라니비주맙(ranibizumab), 레스틴(restin), 가용성 NRP-1, 가용성 VEGFR-1, SPARC, SU5416, 수라민(suramin), 테코갈란(tecogalan), 테트라티오몰리브데이트(tetrathiomolybdate), 탈리도마이드(thalidomide), 레날리도마이드(lenalidomide), 트롬보스폰딘(thrombospondin), TIMP, TNP-470, TSP-1, TSP-2, 바소스타틴(vasostatin), VEGFR 길항제, VEGI, 볼록시키맙(Volociximab) (M200으로도 알려짐), 아나스텔린(anastellin)과 같은 피브로넥틴 단편 (Yi and Ruoslahti, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jan 16;98(2):620-4 참조) 또는 이들의 단편을 포함한다. 상기 혈관신생 억제제는 바람직하게는 증식성(혈관신생) 안구 질환, 예를 들면, 습성 AMD 및 기타 망막 질환과 연관된 맥란막 신생 혈관 막(choroidal neovascular membrane)(CNV)을 예방 또는 치료하기에 충분한 양으로 존재한다. 추가적인 대표적 혈관신생 억제제는 레바티닙(Lenvatinib)(E7080), 모테사닙(Motesanib)(AMG 706), 파조파닙(Pazopanib) (Votrient), 및 IL-6 길항제, 예를 들면, 항-IL-6 항체를 포함한다. 추가적인 대표적 혈관신생 억제제는 전술된 것들의 단편, 미메틱, 키메라, 융합체(fusion), 유사체, 및/또는 도메인을 포함한다. 추가적인 대표적 혈관신생 억제제는 전술된 것들의 조합을 포함한다. 대표적인 구체예에서, RPE 세포의 제제는 항-VEGF 항체, 예를 들면, 베바시주맙을 포함하고, 예를 들면, 안구로의 주사 당, 약 0.1 mg 내지 약 6.0 mg, 예를 들면, 약 1.25 mg 내지 약 2.5 mg 베바시주맙을 포함한다. 다른 대표적 구체예에서, RPE 세포의 제제는 하나 이상의 VEGF 활성의 억제제 및 하나 이상의 알파5베타1 인테그린 활성의 억제제를 포함한다.

하나 이상의 항염증제가 RPE 세포의 제제와 함께 투여될 수 있다. 대표적인 항염증제는 글루코코르티코이드, 비-스테로이드 항-염증 약물(on-steroidal anti-inflammatory drug), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 시클로옥시게나아제 (COX) 효소 억제제, 알도스테론, 베클로메타손(beclometasone), 베타메타손(betamethasone), 코르티코스테로이드, 코르티솔, 코르티손 아세테이트, 데옥시코르티코스테론 아세테이트, 덱사메타손, 플루드로코르티손 아세테이트, 플루오시놀론 아세토니드(예를 들면, ILUV1EN®), 글루코코르티코이드, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 스테로이드, 및 트리암시놀론을 포함한다. 선택적으로, 항-염증제는 코르티코스테로이드가 아닐 수 있다. 예를 들면, 항-염증제는 비-스테로이드 항염증제일 수 있다.

추가적으로, 환자는 RPE 세포의 제제의 투여 전에, 그와 동시에, 및/또는 그 후에 코르티코스테로이드를 받지 않을 수 있다. 이론에 의해 한정될 의도 없이, 출원인은 코르티코스테로이드의 투여는 RPE 세포 정착(settling) 및/또는 생착을 방해할 수 있는 것으로 가정한다. 특정한 바람직한 구체예에서, 환자는 RPE 세포의 제제의 투여 전에, 그와 동시에, 및/또는 그 후에 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론으로 치료되지 않는다. 보다 바람직한 구체예에서, 환자는 RPE 세포의 제제의 투여 전에, 그와 동시에, 및/또는 그 후에 프레드니솔론으로 치료되지 않는다. 예를 들면, 환자는 RPE 세포의 제제의 투여 전 적어도 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 또는 120 시간 또는 그 이상 내에 프레드니솔론 또는 메틸프로드니솔론 또는 또 다른 코르티코스테로이드를 투여받을 수 없다. 추가적으로, 환자는 RPE 세포의 제제의 투여 후 적어도 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 또는 120 시간 또는 그 이상 내에 프레드니솔론 또는 메틸프로드니솔론 또는 또 다른 코르티코스테로이드를 투여받을 수 없다.

환자는 RPE 세포의 제제의 투여 전 및/또는 그 후에 비-코르티코스테로이드 면역 억제제(non-corticosteroid immune suppressant)를 투여받을 수 있다. 대표적인 비-코르티코스테로이드 면역 억제제는 타클로리무스(tacrolimus)(FK-506 macrolid) 및 MMF (마이코페놀산 전구약물)를 포함한다.

하나 이상의 항산화제, 항산화제 보조인자(antioxidant cofactor), 및/또는 증가된 항산화제 활성에 기여하는 기타 인자가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있고, 이들의 예는 OT-551 (Othera), 비타민 C, 비타민 E, 베타 카로틴, 아연(예를 들면, 산화아연), 및/또는 구리 (예를 들면, 산화구리)를 포함할 수 있다.

하나 이상의 황반성 크산토필(macular xanthophyll)(예를 들면, 루테인 및/또는 제아크산틴)이 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

하나 이상의 장쇄 오메가-3 지방산, 예를 들면, 도코사헥사엔산 (DHA) 및/또는 에이코사펜타엔산 (EPA)이 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

하나 이상의 아밀로이드 억제제, 예를 들면, 펜레티니드(fenretinide), Arc-1905, 코팍손(Copaxone)(글라티라머(glatiramer) 아세테이트, Teva), RN6G (PF-4382923, Pfizer) (ABeta40 및 ABeta42 대비 인간화 단일클론 항체), GSK933776 (GlaxoSmith line) (항-아밀로이드 항체)이 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

하나 이상의 섬모 신경영양 인자(ciliary neurotrophic factor)(CNTF) 효능제(예를 들면, T-501 (Neurotech)과 같은 안구내 장치로 전달될 수 있는 CNTF)가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

하나 이상의 RPE65의 억제제, 예를 들면, ACU-4429 (Aculea, Inc.)가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

A2E 및/또는 리포푸신 축적을 표적화하는 하나 이상의 인자, 예를 들면, 펜레티니드 및 ACU-4429가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

하나 이상의, 광수용체 기능 및/또는 대사의 하향조절제(downregulator) 또는 억제제, 예를 들면, 펜레티니드 및 ACU-4429가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

하나 이상의 α2-아드레날린 수용체 효능제, 예를 들면, 브리모니딘 타르트레이트(Brimonidine tartrate)가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

하나 이상의 선택적 세로토닌 1A 효능제, 예를 들면, 탄도스피론(Tandospirone) (AL-8309B)이 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

RPE 세포의 제제와 조합되어, C-5, 막 공격 복합체(membrane attack complex)(C5b-9) 및/또는 기타 드루센(Drusen) 성분을 표적화하는 하나 이상의 인자가 투여될 수 있고, 이들의 예는 보체 인자(complement factor) D, C-3, C-3a, C5, 및 C5a의 억제제, 및/또는 인자 H의 효능제, 예를 들면, ARC1905 (Ophthotec) (C5를 선택적으로 억제하는 항-C5 앱타머), POT-4 (Potentia) (C3를 억제하는 컴스타틴(compstatin) 유도체), 보체 인자 H, 에쿨리주맙(Eculizumab) (Solids, Alexion) (C5를 억제하는 인간화 IgG 항체), 및/또는 FCFD4514S (Genentech, San Francisco) (보체 인자 D에 대한 단일클론 항체)를 포함한다.

하나 이상의 면역 억제제, 예를 들면, 시롤리무스(Sirolimus)(라파마이신)가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

리포푸신의 축적을 예방 또는 치료하는 하나 이상의 작용제, 예를 들면, 피라세탐(piracetam), 센트로페녹신(centrophenoxine), 아세틸-L-카르니틴, 징코 빌로바(Ginko Biloba) 또는 그의 추출물 또는 제제, 및/또는 DMAE (디메틸에탄올아민)가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여될 수 있다.

하나 이상의 작용제 (예를 들면, 혈관신생 억제제, 항산화제, 항산화제 보조인자, 증가된 항산화제 활성에 기여하는 기타 인자, 황반성 크산토필, 장쇄 오메가-3 지방산, 아밀로이드 억제제, CNTF 효능제, RPE65의 억제제, A2E 및/또는 리포푸신 축적을 표적화하는 인자, 광수용체 기능 및/또는 대사의 하향조절제 또는 억제제, α2-아드레날린 수용체 효능제, 선택적 세로토닌 1A 효능제, C-5, 막 공격 복합체(C5b-9) 및/또는 기타 드루센 성분을 표적화하는 인자, 리포푸신의 축적을 예방 또는 치료하는 작용제, 등)가 RPE 세포의 제제와 조합되어 투여되는 경우, 상기 작용제는 상기 RPE 세포의 제제와 동시에, 그 전에, 및/또는 그 후에 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 작용제는 상기 RPE 세포의 제제가 환자의 눈에 도입되는 것인 시술 동안 환자의 눈에 투여될 수 있다. 상기 작용제의 투여는 상기 RPE 세포의 환자의 눈으로의 투여 전에 개시되고 및/또는 그 투여 후에 지속될 수 있다. 예를 들면, 상기 작용제는 지속 방출형(sustained release form)으로 용액, 현탁액, 및/또는 지속 전달 시스템(sustained delivery system)(예를 들면, Allergan Novadur™ 전달 시스템, NT-501, 또는 또 다른 안구내 장치(intraocular device) 또는 지속 방출 시스템)으로 제공될 수 있다.

RPE 세포 집단은 다양한 수준의 성숙도의 분화된 RPE 세포를 포함할 수 있거나, 또는 특정한 수준의 성숙도의 분화된 RPE 세포에 대해 실질적으로 순수할 수 있다. RPE 세포는 다양한 수준의 성숙도/착색(pigmentation)의 RPE 세포를 포함하는 실질적으로 정제된 제제일 수 있다. 예를 들면, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물은 분화된 RPE 세포 및 성숙 분화 RPE 세포(mature differentiated RPE cell)를 포함할 수 있다. 성숙 RPE 세포에서, 색소의 수준은 다양할 수 있다. 그러나, 성숙 RPE 세포는 착색의 증가된 수준 및 보다 원주형(columnar)인 형태에 근거하여 RPE 세포로부터 시각적으로 구별될 수 있다. RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제는 상이한 수준의 성숙도의 RPE 세포(예를 들면, 분화 RPE 세포 및 성숙 분화 RPE 세포)를 포함한다. 그러한 경우에, 착색을 나타내는 마커의 발현에 대해, 제제 전체에서 가변성(variability)이 있을 수 있다. 세포 배양물 중 RPE 세포의 착색은 균일(homogeneous)할 수 있다. 또한, 세포 배양물 중 RPE 세포의 착색은 이질적일 수 있고, RPE 세포의 배양물은 분화된 RPE 세포 및 성숙 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포를 포함하는 제제는 비-RPE 세포 타입에 대해 실질적으로 순수하나, 분화된 RPE 세포와 성숙 분화 RPE 세포의 혼합물을 포함하는 제제를 포함한다. RPE 세포를 포함하는 제제는 또한 비-RPE 세포 타입 및 다른 수준의 성숙도의 RPE 세포 모두에 대해 실질적으로 순주한 제제를 포함한다.

배양물 중 성숙 분화 RPE 세포의 비율은 배양물의 밀도를 감소시키는 것에 의해 감소될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 보다 낮은 비율의 성숙 RPE 세포를 포함하는 배양물을 생성하기 위해 성숙 RPE 세포의 집단을 계대배양(subculturing)하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제제 중 RPE 세포의 수는 성숙도의 수준과 관계없이 및 분화된 RPE 세포 및 성숙 분화 RPE 세포의 상대적 비율과 관계없이, 분화된 RPE 세포를 포함한다. 제제 중 RPE 세포의 수는 분화된 RPE 세포 또는 성숙 RPE 세포의 수를 의미한다. 제제는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100%의 분화된 RPE 세포를 포함할 수 있다. 제제는 성숙 RPE 세포를 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100% 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 분화된 RPE 세포와 RPE 세포의 혼합된 집단을 포함할 수 있다.

본 개시는 착색되고, 인간 RPE가 아닌 세포에서 발현되지 않는 하나 이상의 유전자를 발현하는 인간 RPE 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공한다. 예를 들면, 이러한 RPE 세포는 천연 인간 RPE 세포와 실질적으로 동일한 RPE65, PEDF, CRALBP, 및 베스트로핀의 발현을 가질 수 있다. RPE 세포는 PAX2, Pax6, M1TF, 및/또는 티로시나아제 중 하나 이상의 발현에 대해, 성숙도의 수준에 따라 다를 수 있다. 분화-후 착색의 변화는 또한 PAX2 발현의 변화와 상관된다는 것에 유의한다. 성숙 RPE 세포는 착색의 수준, PAX2, Pax6, 및/또는 티로시나아제의 발현 수준에 의해 RPE 세포로부터 구별될 수 있다. 예를 들면, 성숙 RPE 세포는 RPE 세포에 비해 더 높은 수준의 착색 또는 PAX2, Pax6, 및/또는 티로시나아제의 더 높은 발현을 가질 수 있다.

상기 제제는 비-RPE 세포에 대해 실질적으로 정제되어, 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100% RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 필수적으로 비-RPE 세포를 포함하지 않거나, 또는 RPE 세포로 구성될 수 있다. 예를 들면, RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제는 약 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 비-RPE 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, RPE 세포 제제는 약 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, 또는 0.0001% 미만의 비-RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포 제제는 비-RPE 세포에 대해 및 다른 수준의 성숙도의 RPE 세포에 대해 실질적으로 순수할 수 있다. 상기 제제는 비-RPE 세포에 대해 실질적으로 정제되고, 성숙 RPE 세포에 대해 강화(enrich)될 수 있다. 예를 들면, 성숙 RPE 세포에 대해 강화된 RPE 세포 제제에서, RPE 세포의 약 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99% 이상, 또는 100%가 성숙 RPE 세포이다. 상기 제제는 비-RPE 세포에 대해 실질적으로 정제되고, 성숙 RPE 세포가 아닌, 분화된 RPE 세포에 대해 강화될 수 있다. 예를 들면, RPE 세포의 약 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100%가 성숙 RPE 세포가 아닌, 분화된 RPE 세포일 수 있다.

RPE 세포 제제는 약 1x10³, 2x10³, 3x10³, 4x10³, 5x10³, 6x10³, 7x10³, 8x10³, 9x10³, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 또는 9x10¹⁰ 개 이상의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000-10,000, 50,000-100,000, 100,000-200,000, 200,000-500,000, 300,000-500,000, 또는 400,000-500,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 적어도 약 20,000-50,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 또한, RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 75,000, 80,000, 100,000, 또는 500,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포 제제는 적어도 약 1x10³, 2x10³, 3x10³, 4x10³, 5x10³, 6x10³, 7x10³, 8x10³, 9x10³, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 또는 9x10¹⁰ 개 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000-10,000, 50,000-100,000, 100,000-200,000, 200,000-500,000, 300,000-500,000, 또는 400,000-500,000개 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. RPE 세포 제제는 적어도 약 20,000-50,000개 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 또한, RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 100,000, 또는 500,000개 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 제제는 HIV 1, HIV 2, HBV, HCV, CMV, HTLV 1, HTLV 2, 파보바이러스(parvovirus) B19, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, 또는 헤르페스바이러스(herpesvirus) 6의 존재를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 박테리아, 바이러스, 또는 균류 오염 또는 감염이 실질적으로 없는 것일 수 있다. 본 명세서에 기재된 제제는 마이코플라스마(mycoplasma) 오염 또는 감염이 실질적으로 없는 것일 수 있다.

본 명세서에 기재된 RPE 세포는 또한 이식 후 기능성 RPE 세포로 작용할 수 있어서, RPE 세포는 이식된 세포를 받은 환자에서 감각신경 망막(neurosensory retina)과 맥란막 사이에 단층(monolayer)을 형성한다. RPE 세포는 또한 영양분을 인접한 광수용체로 공급하고 식세포 작용에 의해 소진된 광수용체 외부 세그먼트(shed photoreceptor outer segment)를 처리할 수 있다. 추가적으로, 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 안구 공여자로부터 유래된 세포보다 더 큰 증식력(proliferative potential)을 가질 수 있다(예를 들면, RPE 세포는 안구 공여자의 세포들보다 "더 젊다(younger)"). 이는 본 명세서에 기재된 RPE 세포가 안구 공여자로부터 유래된 세포보다 긴 유효 수명(useful lifespan)을 가질 수 있게 한다.

RPE 세포를 포함하는 제제는 GMP(Good Manufacturing Practices)(예를 들면, 제제는 GMP-준수(GMP-compliant)임) 및/또는 현재의 GTP(Good Tissue Practices)(예를 들면, 제제는 GTP-준수(GTP-compliant)임)에 따라 제조될 수 있다.

RPE 세포 배양물(RPE Cell Culture)

본 개시는 인간 RPE 세포를 포함하는, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물을 제공한다. 본 명세서에 기재된 RPE 배양물은 적어도 약 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 6,000; 7,000; 8,000; 또는 9,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 상기 배양물은 적어도 약 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 또는 9x10¹⁰ 개의 RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포는 성숙 RPE 세포의 배양물을 생성하기 위해 더 배양될 수 있다. RPE 세포는 성숙될 수 있고, RPE 세포는 원하는 성숙도의 수준이 수득될 때까지, 예를 들면, RPE-GM/MM 또는 MDBK MM 배지에서 더 배양될 수 있다. 이는 성숙(maturation) 동안, 착색 수준의 증가를 모니터링하는 것에 의해 결정될 수 있다. RPE-GM/MM 또는 MDBK MM 배지의 대안으로서, 기능적으로 동등하거나, 또는 유사한 배지가 이용될 수 있다. RPE 세포를 성숙시키기 위해 이용되는 특정한 배지에 관계없이, 배지는 선택적으로 성장 인자 또는 작용제에 의해 보충될 수 있다. RPE 세포 및 성숙 RPE 세포는 모두 분화된 RPE 세포이다. 그러나, 성숙 RPE 세포는 분화된 RPE 세포 대비 색소의 증가된 수준을 특징으로 한다. 성숙도 및 착색의 수준은 분화된 RPE 세포의 배양물의 밀도를 증가시키거나 또는 감소시키는 것에 의해 조절될 수 있다. 따라서, RPE 세포의 배양물은 성숙 RPE 세포를 생성하기 위해 더 배양될 수 있다. 대안적으로, 성숙 RPE 세포를 포함하는 배양물의 밀도는 성숙 분화 RPE 세포의 비율을 감소시키고, 분화된 RPE 세포의 비율을 증가시키기 위해 감소될 수 있다.

RPE 세포는 그 세포의 mRNA 전사물을 인 비보에서 유래된 세포와 비교하는 것에 의해 식별될 수 있다. 배아 줄기 세포의 RPE 세포로의 분화 동안 다양한 간격으로 세포의 분량(aliquot)을 채취하고 전술된 마커의 발현에 대해 분석한다. 이러한 특징은 분화된 RPE 세포를 구별시킨다.

RPE 세포 배양물은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 또는 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100%의 분화된 RPE 세포를 포함하는, 실질적으로 정제된 배양물일 수 있다. 상기 실질적으로 정제된 배양물은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 또는 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 성숙 분화 RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포 배양물은 GMP(Good Manufacturing Practices)(예를 들면, 배양물은 GMP-준수(GMP-compliant)임) 및/또는 현재의 GTP(Good Tissue Practices)(예를 들면, 배양물은 GTP-준수(GTP-compliant)임)에 따라 제조될 수 있다.

RPE 세포의 동결보존 제제

RPE 세포는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 적합한 방법(예를 들면, 극저온으로 동결됨(cryogenically frozen))에 의해 보관될 수 있고, 세포의 보관에 적합한 온도에서 동결될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 약 -20℃, -80℃, -120℃, -130℃, -135℃, -140℃, -150℃, -160℃, -170℃, -180℃, -190℃, -196℃에서, 세포의 보관에 적합한 다른 온도에서 동결될 수 있다. 극저온으로 동결된 세포는 세포 손상의 위험을 감소시키고 세포가 해동 후 생존할 가능성을 최대화하기 위해 보관을 위해 준비되고, 적합한 용기 내에 보관된다. RPE 세포는 분화 직후, 또는 인 비트로 성숙 후, 또는 배양에서의 일정 기간 후에 동결보존될 수 있다. RPE 세포는 또한 실온에서 유지되거나, 또는 예를 들면, 약 4℃에서 냉장될 수 있다.

RPE 세포를 동결보존하는 방법이 유사하게 제공된다. RPE 세포를 수집하고, 완충액 또는 배지로 세척하고, 계수하고, (원심분리를 통해)농축하고, 동결 배지(freezing media)(예를 들면, 90% FBS/10% DMSO) 중에서 제제화되거나, 또는 이 단계들의 조합을 거칠 수 있다. 예를 들면, RPE 세포는 여러 개의 배양 용기에 접종되고, 연속적으로(serially) 확장될 수 있다. RPE 세포를 수집하고 약 4℃에서 FBS 중에 유지시키면서, RPE 세포의 여러 플라스크를 하나의 로트(lot)로 합친다. RPE 세포는 또한 염수(saline solution)(예를 들면, DPBS)로 1, 2, 3, 4, 또는 5회 이상 세척될 수 있다. 또한, RPE 세포는 디스트로핀(dystrophin)이 세포막에 배치되고(organized), PAX6 발현이 낮을 때 동결보존될 수 있다. 또한, 바이알을 일차 및/또는 2차 라벨로 표시할 수 있다. 라벨(label)의 정보는 세포의 종류(예를 들면, hRPE 세포), 로트 번호(lot number) 및 일자, 세포의 수(예를 들면, 1x10⁶ 세포/mL), 만료(expiration) 일자(예를 들면, 바이알이 사용되어야 하는 기한으로 권장된 일자), 제조사 정보 (예를 들면, 명칭 및 주소), 경고, 및 보관 수단 (예를 들면, 액체 질소 중 보관)을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 동결보존 RPE 세포 제제는 적어도 약 50,000-100,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 동결보존 RPE 세포 제제는 또한 적어도 약 20,000-500,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 또한, 동결보존 RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 또는 100,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 동결보존 RPE 세포 제제는 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 100,000, 또는 500,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 동결보존 RPE 세포 제제는 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 또는 9x10¹⁰개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 동결보존 RPE 세포 제제의 RPE 세포는 인간 RPE 세포를 포함한, 포유동물 RPE 세포일 수 있다.

또한, 본 명세서에 기재된 동결보존 RPE 세포 제제는 적어도 약 50,000-100,000개 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 동결보존 RPE 세포 제제는 또한 적어도 약 20,000-500,000개 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 또한, 동결보존 RPE 세포 제제는 적어도 약 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 및 100,000 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 동결보존 RPE 세포 제제는 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 75,000, 80,000, 100,000, 또는 500,000개 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 동결보존 RPE 세포 제제는 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 또는 9x10¹⁰개 RPE 세포/mL를 포함할 수 있다. 동결보존 RPE 세포 제제의 RPE 세포는 인간 RPE 세포를 포함한, 포유동물 RPE 세포일 수 있다.

본 개시의 RPE 세포는 동결보존 후 보관으로부터 회수(recover)될 수 있다. 동결보존으로부터 회수된 RPE 세포는 또한 생존력(viability) 및 분화 상태를 유지한다. 예를 들면, RPE 세포의 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%는 동결보존 후 생존력 및 분화를 보유할 수 있다. 또한, 본 개시의 RPE 세포는 동결보존될 수 있고, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 보관된 후 그들의 생존력을 유지할 수 있다. 본 개시의 RPE 세포는 또한, 동결보존될 수 있고, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안 보관된 후 그들의 생존력을 유지할 수 있다. 본 개시의 RPE 세포는 동결보존될 수 있고, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7년 동안 보관된 후 그들의 생존력을 유지할 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 RPE 세포는 약 4년 이상 동안 동결보존되고, 약 80% 이상의 생존력을 보일 수 있다. RPE 세포를 포함하는 동결보존 제제는 실질적으로 DMSO를 포함하지 않을 수 있다.

RPE 세포의 제조 방법

해당 방법(subject method)에 의해 분석되는 세포 집단은 다능성 줄기 세포로부터 제조될 수 있다. 제조될 수 있는 세포 타입은 RPE 세포, RPE 전구 세포(progenitor cell), 홍채 색소 상피(iris pigmented epithelial)(IPE) 세포, 및 기타 시각 관련 신경 세포, 예를 들면, 개재 신경 세포(internuncial neuron)(예를 들면, 내핵층(inner nuclear layer)(INL)의 "중개(relay)" 신경세포) 및 아마크린(amacrine) 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적으로, 망막 세포, 간상체(rod), 추상체(cone), 및 각막 세포가 제조될 수 있다. 안구의 혈관 구조(vasculature)를 제공하는 세포가 또한 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.

특정한 이론에 구속되지 않으면서, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 방법이 PAX6(Paired-box6) 전사 인자의 발현을 유도하기 위해 MAP-inase 및 잠재적인 C Jun 말단 키나아제(C Jun terminal Kinase) 경로에 신호를 전달하는 FGF, EGF, WNT4, TGF-beta, 및/또는 산화적 스트레스를 통해 작용할 수 있다는 것을 발견했다. PAX6은 RPE-특이적 유전자, 예를 들면, 티로시나아제 (Tyr), 및 하류 표적(downstream target), 예를 들면, RPE 65, 베스트로핀(Bestrophin), CRALBP, 및 PEDF를 전사하는 MITF와 Otx2의 조화(coordination)를 통해 성숙 RPE를 최종적으로 분화시키기 위해 PAX2와 상승적으로 작용한다. WO 2009/05 1671, 도 1 참조.

본 명세서에 기재된 RPE 세포는 다능성 줄기 세포, 예를 들면, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화될 수 있고, 배아 줄기 세포, 성체-유래 RPE 세포, 및 태아-유래 RPE 세포로부터 분자적으로 구별될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 제조 과정 단계는 최종 RPE 세포 생성물에 독특한 구조적 및 기능적 특징을 부여하므로 이 세포들은 원래의(native) RPE 세포와 근접하게 유사하고 태아 유래 RPE 세포 또는 RPE 세포주(예를 들면, ARPE 19)와 구별된다.

출원인은 이전에 다능성 세포로부터 RPE를 제조하는 방법을 개시했다. 각각 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, 미국특허 제7736896호, 제7795025호 및 제7794704호, 및 국제출원 공개 WO/2012/012803 및 WO 2011/063005를 참조한다. RPE는 다층 집단 또는 배상체(embyoid body)로 배양된 다능성 세포로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 배상체는 다능성 세포를 비-부착 조건(non-attached condition) 하에서, 예를 들면, 저-부착성 기질(low-adherent substrate) 상에서 또는 "현적(hanging drop)"으로 배양하는 것에 의해 형성될 수 있다. 이러한 배양에서, ES 세포는 배상체로 명명되는 세포의 덩어리(clump) 또는 세포의 무리(cluster)를 형성할 수 있다. 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, Itskovitz-Eldor et al., Mol Med. 2000 Feb;6(2):88-95를 참조한다. 통상적으로, 배상체는 먼저 다능성 세포의 고형 덩어리 또는 무리로 형성되고, 시간의 경과에 따라 일부 배상체가 유체 충진 공동(fluid filled cavities)을 포함하게 되고, 전자는 문헌에서 "단순한(simple)" EB로 지칭되고, 후자는 "낭포성(cystic)" 배상체로 지칭된다. Id. 출원인이 이전에 보고한 바와 같이, 이러한 EB(고형 및 낭포성 형태 모두) 중 세포는 분화되고, 시간의 경과에 따라 증가되는 수의 RPE 세포를 생성할 수 있다. 선택적으로, EB는 부착성 배양물(adherent culture)로 배양되고, 외향 성장물(outgrowth)을 형성할 수 있게 된다. 마찬가지로, 출원인은 이전에 더 성장하여(outgrow) 다층 세포 집단을 형성할 수 있게 된 다능성 세포가 시간의 경과에 따라 분화되어 RPE 세포를 형성할 수 있다는 것을 보고했다. 일단 RPE가 형성되면, 이들은 착색 및 자갈 외형을 포함한 형태학적 특징에 근거하여 용이하게 식별될 수 있고, 추후 사용을 위해 단리될 수 있다.

다능성 세포는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 배양 방법을 이용하여, RPE 세포 형성 전에 증식되고 유지될 수 있다. 예를 들면, 다능성 세포는 피더 세포(feeder cell), 예를 들면, 마우스 세포(예를 들면, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)), 인간 피더 세포(예를 들면, 인간 성체 피부 세포, 신생아 진피 섬유모세포(neonatal dermal fibroblast)(HNDFs), 등)의 존재 하에 배양될 수 있다. 다능성 세포는 제노-프리(xeno-free) 배양물로, 및/또는 피더-불포함(feeder-free) 조건 하에서 배양될 수 있다. 각각 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Klimanskaya et al., Lancet. 2005 May 7-13;365(9471): 1636-41; Richards et al., Stem Cells. 2003;21 (5):546-56; U.S. Pat. No. 7,410,798; Ilic et al.. Stem Cells Dev. 2009 Nov; 18(9): 1343-5; Xu et al. Nat Biotechnol. 2001 Oct; 19(10):971-4를 참조한다. 예를 들면, 다능성 세포는 매트릭스 상에서 배양될 수 있다. 매트릭스는 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴(entactin), 콜라겐, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 콜라겐 VIII, 헤파란 술페이트, 매트리겔(Matrigel)™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제), CellStart, 인간 기저막 추출물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 매트릭스는 인간 기원 또는 인간이 아닌 동물 기원, 예를 들면, 소, 마우스 ,또는 랫트 기원일 수 있다. 다능성 세포는 조정 배지(conditioned medium)에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 조정 배지는 다능성 세포, 예를 들면, ES 세포, iPS 세포, 피더 세포, 태아 세포 등에 의해 조정될 수 있고, 상기 세포들은 인간 기원이거나 또는 아닐 수 있다.

RPE 형성 동안, 다능성 세포는 ROCK(rho-associated protein kinase) 억제제의 존재 하에 배양될 수 있다. ROCK 억제제는 세포에서 Rho-연관 키나아제 또는 그의 신호전달(signaling) 경로의 기능을 억제하거나 감소시키는 물질, 예를 들면, 소형 분자, siRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 등을 의미한다. 본 명세서에서 사용된, "ROCK 신호전달 경로(ROCK signaling pathway)"는 ROCK-관련 신호전달 경로, 예를 들면, 세포에서 Rho-ROCK-Myosin II 신호전달 경로, 그의 상류(upstream) 신호전달 경로, 또는 그의 하류 신호전달 경로에 관여되는 신호 처리자(signal processor)를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 대표적인 ROCK 억제제는 rho-연관 단백질 키나아제(ROCK) 억제제인 Stemgenf's Stemolecule Y-27632이다 (Watanabe et al., Nat Biotechnol. 2007 Jun;25(6):681-6 참조). 기타 ROCK 억제제는 예를 들면, H-l152, Y-30141, Wf-536, HA-1077, 히드록실-HA-1077, GSK269962A 및 SB-772077-B를 포함한다(각각 참조에 의해 그 전체가 기재된 것처럼 본 명세서에 포함된, Doe et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 32:89-98, 2007; Ishizaki, et al, Mol. Pharmacol., 57:976-983, 2000; Nakajima et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 52:319-324, 2003; 및Sasaki et al., Pharmacol. Ther., 93 :225-232, 2002 참조). ROCK 억제제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 바와 같은, 예를 들면, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된 US PGPub No. 2012/0276063에 기재된 바와 같은 농도 및/또는 배양 조건으로 이용될 수 있다. 예를 들면, ROCK 억제제는 약 0.05 내지 약 50 μM(microM), 예를 들면, 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1, 1.5, 2, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 μM, 또는 그 이상, 그로부터 유래될 수 있는 범위를 포함한 농도, 또는 세포 성장 또는 생존을 촉진하기 위해 유효한 농도를 가질 수 있다.

예를 들면, 다능성 세포 생존력은 ROCK 억제제의 내포에 의해 개선될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 다능성 세포는 피더-불포함 조건 하에서, 예를 들면, 매트리겔(TM) 또는 또 다른 매트릭스에서 유지될 수 있다. 그 후, 트립신의 사용 없이, 예를 들면, EDTA, 콜라게나아제의 사용에 의해 또는 기계적으로 분리된(dissociated) 다능성 세포로부터 배상체가 형성될 수 있다. 배상체는 Y-27632 또는 또 다른 ROCK 억제제를 포함하는 배양 배지에서 형성될 수 있다. 예를 들면, ROCK 억제제는 매트리겔™ 또는 또 다른 매트릭스 상에서 배양된 다능성 세포로부터 형성된 배상체에서 세포 생존력을 촉진할 수 있다. RPE 세포 수율이 그에 의해 개선될 수 있다.

RPE 세포를 제조하는 대표적인(exemplary) 방법은: (a) 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 다능성 줄기 세포를 부 영양, 저 단백질 배지(nutrient rich, low protein medium)에서 배상체로 배양하는 단계로서, 상기 배지는 선택적으로 무혈청 B-27 보충제(supplement)를 포함하는 것인 단계; (c) 상기 배상체를 부 영양, 저 단백질 배지에서 부착 배양물(adherent culture)로 배양하는 단계로서, 상기 배지는 선택적으로 무혈청 B-27 보충제를 포함하는 것인 단계; (d) 단계 (c)의 세포의 부착 배양물을 부 영양, 저 단백질 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 배지는 무혈청 B-27 보충제를 포함하지 않는 것인 단계; (e) 고밀도(high-density) 체세포 배양물의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 (d)의 세포를 배양하고, 그에 의해 세포의 배양물에 RPE 세포가 나타나는 것인 단계; (f) 단계 (e)의 배양물로부터 세포 또는 세포의 덩어리를, 바람직하게는 기계적으로 또는 화학적으로(예를 들면, 프로테아제 또는 기타 효소, 또는 또 다른 분리 배지(dissociation medium)를 이용하여) 분리하는 단계; (g) 상기 배양물로부터 RPE 세포를 선택하고, 상기 RPE 세포를 성장 인자가 보충된 배지를 포함하는 별개의 배양으로 옮겨서, RPE 세포의 강화 배양물(enriched culture)을 생성시키는 단계; 및 (g) 상기 RPE 세포의 강화 배양물을 증식시켜 RPE 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 이러한 방법의 단계들은 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물을 생성하기 위해 1회 이상 수행될 수 있다. 또한, 이러한 방법의 단계들은 더 많은 RPE 세포를 생성하기 위해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 이상 반복될 수 있다.

추가적으로, 본 개시는 하기를 포함하는 성숙 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법을 제공한다: (a) 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 다능성 줄기 세포를 부 영양, 저 단백질 배지에서 배상체로 배양하는 단계로서, 상기 배지는 선택적으로 무혈청 B-27 보충제를 포함하는 것인 단계; (c) 상기 배상체를 부 영양, 저 단백질 배지에서 부착 배양물로 배양하는 단계로서, 상기 배지는 선택적으로 무혈청 B-27 보충제를 포함하는 것인 단계; (d) 단계 (c)의 세포의 부착 배양물을 부 영양, 저 단백질 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 배지는 무혈청 B-27 보충제를 포함하지 않는 것인 단계; (e) 고밀도 체세포 배양물의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 (d)의 세포를 배양하고, 그에 의해 세포의 배양물에 RPE 세포가 나타나는 것인 단계; (f) 단계 (e)의 배양물로부터 세포 또는 세포의 덩어리를, 바람직하게는 기계적으로 또는 화학적으로(예를 들면, 프로테아제 또는 기타 효소, 또는 또 다른 분리 배지를 이용하여) 분리하는 단계; (g) 상기 배양물로부터 RPE 세포를 선택하고, 상기 RPE 세포를 성장 인자가 보충된 배지를 포함하는 별개의 배양물로 옮겨서, RPE 세포의 강화 배양물을 생성시키는 단계; (h) 상기 RPE 세포의 강화 배양물을 증식시키는 단계; 및 (i) 상기 RPE 세포의 강화 배양물을 배양하여 성숙 RPE 세포를 제조하는 단계. 이러한 방법의 단계들은 성숙 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물을 생성하기 위해 1회 이상 수행될 수 있다. 또한, 이러한 방법의 단계들은 더 많은 성숙 RPE 세포를 생성하기 위해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 이상 반복될 수 있다.

기술된 단계들에 대해, 세포는 약 1 내지 10 주 이상 배양될 수 있다. 예를 들면, 세포는 적어도 약 3-6주 동안 배양될 수 있다. 기술된 단계들의 경우, 세포는 약 1일 내지 50일 동안, 예를 들면, 적어도 약 1-3, 3-4, 7, 4-9, 7-10, 7-12, 8-11, 9-12, 7-14, 14-21, 및 3-45일 동안 배양될 수 있다. 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50일 동안 배양될 수 있다. 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 시간 동안 배양될 수 있다. 예를 들면, 세포는 2-4 및 3-6 시간 동안 배양될 수 있다. 앞서 기술된 방법 단계들 각각의 경우, 세포는 각 단계에서 동일한 기간 동안 또는 하나 이상의 단계에서 상이한 기간 동안 배양될 수 있다. 추가적으로, 앞서 기술된 방법 단계들은 더 많은 RPE 세포를 제조하기 위해 반복될 수 있다(예를 들면, 보다 많은 수의 RPE 세포를 제조하기 위해 확대됨(scaled up)).

본 명세서에 기재된 방법에서, RPE 세포는 EB의 부착 배양물 중 세포로부터 분화되기 시작할 수 있다. RPE 세포는 그들의 자갈 형태 및 착색의 초기 출현에 근거하여 시각적으로 인지될 수 있다. RPE 세포가 지속적으로 분화되면서, RPE 세포의 무리(cluster)가 관찰될 수 있다.

기계적 또는 효소적 방법이 배상체의 배양물에서 비-RPE 세포의 무리 중에서 RPE 세포를 선택하거나 또는 부착 세포의 계대배양(sub culture)을 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 대표적인 기계적 방법은 피펫을 이용한 분쇄(tituration) 또는 당겨진(pulled) 니들에 의한 절단(cutting)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대표적인 효소 방법은 세포를 분리시키기에 적합한 효소(예를 들면, 트립신 (예를 들면, 트립신/EDTA), 콜라게나아제 (예를 들면, 콜라게나아제 B, 콜라게나아제 IV), 디스파아제, 파파인, 콜라게나아제와 디스파아제의 혼합물, 및 콜라게나아제와 트립신의 혼합물)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고-EDTA 함유 용액과 같은 비-효소 용액(non-enzymatic solution), 예를 들면, Hanks-기반 세포 분리 완충액이 세포를 분리시키기 위해 이용될 수 있다.

RPE 세포는 배상체로부터 분화될 수 있다. EB로부터 RPE 세포를 단리하는 것은 인 비트로에서 강화 배양물에서 RPE 세포의 확장(expansion)을 가능하게 한다. 인간 세포의 경우, RPE 세포는 90일 미만 동안 배양된 EB로부터 수득될 수 있다. 또한, RPE 세포는 적어도 약 7-14일, 14-28일, 28-45일, 또는 45-90일 동안 배양된 인간 EB로부터 유래될 수 있다. 다능성 줄기 세포, 배상체, 및 RPE 세포를 배양하기 위해 사용된 배지는 간격을 두고(at any interval) 제거되고, 및/또는 동일하거나 또는 상이한 배지로 교체될 수 있다. 예를 들면, 배지는 적어도 약 0-7일, 7-10일, 10-14일, 14-28일, 또는 28-90일 후에 제거되고 및/또는 교체될 수 있다. 또한, 배지는 적어도 매일, 또는 격일로, 또는 적어도 3일 마다 교체될 수 있다.

RPE 세포를 강화시키고 RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물을 확립하기 위해, RPE 세포를 기계적 및/또는 화학적(효소적 방법 포함) 방법을 이용하여 상호 간에 및 비-RPE 세포로부터 분리시킬 수 있다. 그 후, RPE 세포의 강화 집단을 제공하기 위해 RPE 세포의 현탁액이 신선한 배지 및 신선한 배양 용기로 옮겨질 수 있다.

RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물을 생성하기 위해, RPE 세포를 분리된 세포로부터 선택하고 별개로 배양할 수 있다. RPE 세포는 RPE 세포와 연관된 특징에 근거하여 선택된다. 예를 들면, RPE 세포는 자갈형 세포 형태 및 착색에 의해 인지될 수 있다. 또한, 정단 미세융기(apical microvilli)에서도 발견되는 세포질 단백질인 세포 레틴알데히드-결합 단백질(CRALBP); 레티노이드 대사에 관여되는 세포질 단백질인 RPE65; Best 난황형 황반 이영양증(vitelliform macular dystrophy) 유전자 (VMD2)의 산물인 베스트로핀, 및 혈관형성 억제(angiostatic) 성질을 갖는 48kD 분비 단백질인 색소 상피 유래 인자(PEDF)를 포함한, 여러 개의 RPE의 공지된 마커가 있다. 이 마커들의 mRNA 전사물을 PCR (예를 들면, RT-PCR) 또는 노던 블롯을 이용하여 분석할 수 있다. 또한, 이 마커들의 단백질 수준은 면역블롯(immunoblot) 기술 또는 웨스턴 블롯을 이용하여 분석할 수 있다.

RPE 세포는 또한 세포 기능에 근거하여, 예를 들면, 소진된 간상체 및 추상체 외부 세그먼트의 식세포 작용(또는 폴리스티렌 비드와 같은, 또 다른 기질의 식세포 작용), 미광의 흡수, 비타민 A 대사, 레티노이드의 재생, 및 조직 회복(tissue repair)에 의해 선택될 수 있다. 평가는 또한 적절한 숙주 동물(예를 들면, 자연적인 또는 유도된 망막 변성의 질환을 앓는 인간 또는 인간이 아닌 동물)로의 RPE 세포의 이식 후에 인 비보 기능을 예를 들면, 행동 테스트(behavioral test), 형광 혈관조영검사, 조직학, 밀착 연접 전도도(tight junctions conductivity)를 이용하거나 또는 전자현미경을 이용한 평가에 의해 테스트하는 것에 의해 수행될 수 있다.

RPE 세포의 강화 배양물은 적절한 배지, 예를 들면, EGM 2 배지에서 배양될 수 있다. 이 배지, 또는 기능적으로 동등하거나 또는 유사한 배지가 성장 인자 또는 작용제 (예를 들면, bFGF, 헤파린, 히드로코르티손, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor), 재조합 인슐린-유사 성장 인자, 아스코르브산, 또는 인간 상피 성장 인자)로 보충될 수 있다. RPE 세포는 배양물에서 장기간 동안(예를 들면, > 6주) 표현형적으로 안정할 수 있다.

선택적으로, RPE는 ROCK(rho-associated protein kinase)의 억제제, 예를 들면, Stemgent's Stemolecule Y-27632의 존재 하에 배양될 수 있다. 예를 들면, RPE는 동결보존 전에 ROCK 억제제의 존재 하에 배양될 수 있다.

다능성 줄기 세포

본 명세서에 기재된 방법은 다능성 줄기 세포로부터 제조된 분화된 세포(예를 들면, RPE 세포)를 이용할 수 있다. 적합한 다능성 줄기 세포는 다능성 줄기 세포의 유래 방법에 관계없이, 배아 줄기 세포, 배아-유래 줄기 세포 및 유도된 다능성 줄기 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다능성 줄기 세포는 예를 들면, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 대표적인 다능성 줄기 세포는 포배기 배아의 내세포 집단(ICM)으로부터 유래된 배아 줄기 세포, 및 (선택적으로 배아의 나머지를 파괴하지 않으면서) 분할기 또는 상실기 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래된 배아 줄기 세포를 포함한다. 이러한 배아 줄기 세포는 수정, 또는 체세포 핵 이식(SCNT), 단위생식(parthenogenesis), 세포 재프로그래밍(cellular reprogramming) 및 웅성 단위생식(androgenesis)을 포함한 무성 수단에 의해 제조된 배아 물질(embryonic material)로부터 생성될 수 있다. 또한, 적절한 다능성 줄기 세포는 다능성 줄기 세포의 유래 방법에 관계없이, 인간 배아 줄기 세포, 인간 배아-유래 줄기 세포 및 인간 유도 다능성 줄기 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다능성 줄기 세포(예를 들면, hES 세포)는 배상체(EB)를 생성하기 위해 현탁 배양물로 배양될 수 있다. 배상체는 약 7 내지 14일 동안 현탁 배양될 수 있다. 그러나, 특정 구체예에서, EB는 7일 미만(7, 6, 5, 4, 3, 2일 미만, 또는 1일 미만) 동안 또는 14일보다 긴 기간 동안 현탁액으로 배양될 수 있다. EB는 B-27 보충제로 보충된 배지에서 배양될 수 있다.

EB를 현탁 배양으로 배양한 후, EB를 부착 배양물을 생성하기 위해 옮길 수 있다. 예를 들면, EB를 배지 중 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 플레이팅할 수 있다. 부착 배양물로 배양되는 경우, EB는 현탁액으로 배양되는 경우와 동일한 종류의 배지에서 배양될 수 있다. 세포가 부착 배양물로 배양되는 경우, 배지는 B-27 보충제로 보충될 수 없다. 또한, 배지는 초기에(예를 들면, 약 7일 이하 동안) B-27 보충제로 보충되나, 뒤이어 부착 배양물로서 나머지 기간 동안 B-27의 부재 하에 배양된다. EB는 적어도 약 14-28일 동안 부착 배양물로 배양될 수 있다. 그러나, 특정 구체예에서, EB는 약 14일 미만(14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 미만, 또는 1일 미만) 동안 또는 약 28일보다 긴 기간 동안 부착 배양물로 배양될 수 있다.

인간 배아 줄기 세포

인간 배아 줄기 (hES) 세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 다능성 줄기 세포로 이용될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포(hES)는 배반포의 내세포 집단(ICM)의 자손 또는 다른 소스로부터 유래된 세포를 포함하고, 실질적으로 무기한으로 다능성으로 유지될 수 있다. hES 세포는 선택적으로 배아를 파괴하거나 또는 손상시키지 않으면서, 초기 분할기 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래될 수 있다. hES 세포는 핵 이식을 이용하여 생성될 수 있다. hES 세포는 또한 하기에서 보다 상세하게 설명되는 유도된 다능성 세포(iPS 세포)일 수 있다. 또한, 동결보존 hES 세포가 이용될 수 있다. hES 세포는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방식으로, 예를 들면, 피더 세포의 존재 또는 부재 하에 배양될 수 있다. 예를 들면, hES 세포는 EB-DM, MDBK GM, hESC Medium, INVITROGEN® Stem Cell Media, OptiPro SFM, VP SFM, EGM 2, 또는 M DBK MM에서 배양될 수 있다. Stem Cell Information (Culture of Human Embryonic Stem Cells (hESC)) [NIH website, 2010] 참조. hES 세포가 GMP 기준에 따라 사용되고 유지될 수 있다.

정의된 조건에서 피더 층(feeder layer) 상 배양물로 배양되는 경우, hES 세포는 특이적 형태를 유지하고, 세포질 대비 핵의 높은 비율, 세포간 명확한 경계, 및 선명하고 수축성있는(sharp, retractile) 콜로니 경계를 갖는 작은, 밀착된 세포(tightly packed cells)로 이루어진 편평한 콜로니를 형성한다. hES 세포는 일련의 분자 마커, 예를 들면, 옥타머 결합 단백질 4(Octamer binding protein 4)(Oct-4, a.k.a., Pou5fl), SSEA(stage specific embryonic antigen) 3 및 SSEA 4, TRA(tumor rejection antigen) 1 60, TRA 1 80, 알칼리 포스파타아제, NANOG, 및 Rex1을 발현한다. 미리 정해진 계통(predetermined lineage)으로 분화되는 ICM의 세포들과 유사하게, 배양물 중 hES 세포는 분화하도록 유도될 수 있다. 예를 들면, hES 세포는 본 명세서에 기재된 정의된 조건 하에서 인간 RPE로 분화될 수 있다.

사용될 수 있는 인간 배아 줄기 세포는 MA01, MA04, MA09, ACT 4, MA03, H 1, H7, H9, 및 H14를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 대표적 세포 계통은 NED1, NED2. NED3, NED4, 및 NED5를 포함한다. 또한, NIH Human Embryonic Stem Cell Registry를 참조한다. 사용될 수 있는 대표적인 인간 배아 줄기 세포주는 MA09 세포이다. MA09 세포의 단리 및 제조는 이전에 Klimanskaya, et al. (2006) "Human Embryonic Stem Cell lines Derived from Single Blastomeres." Nature 444: 481-485에 기재되었다.

hES 세포는 초기에 마우스 배아 줄기 피더 세포(MEF)와 공동-배양될 수 있다. MEF 세포는 공동-배양물(co-culture) 중 hES 세포의 접종 전에 미토마이신(mitomycin) C로의 노출에 의해 유사분열을 불활성화시킬 수 있고(mitotically inactivated), 따라서 MEF는 배양물에서 증식하지 않는다. 추가적으로, hES 세포 배양물을 현미경에 의해 검사하고 비-hES 세포 형태를 포함하는 콜로니를 선별하고, 예를 들면, 줄기 세포 절단 툴(stem cell cutting tool)을 이용하여, 레이저 절제(laser ablation) 또는 기타 수단에 의해 제거할 수 있다. 통상적으로, 배상체 형성을 위한 접종용으로 hES 세포를 회수하는 시점 후에, 이 방법에서 추가적인 MEF 세포가 사용되지 않는다. 본 명세서에 기재된 MEF 제거와 RPE 세포 회수 간의 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 계대(passages) 및 MEF-불포함 세포 배양물에서 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100일일 수 있다. MEF 제거와 RPE 세포의 회수 사이의 시간은 또한 적어도 약 3 계대 및 MEF-불포함 세포 배양물에서 적어도 약 80-90일일 수 있다. 본 명세서에 기재된 제조 방법 때문에, 본 명세서에 기재된 RPE 세포 배양물 및 제제는 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 및 인간 배아 줄기 세포(hES)가 실질적으로 없을 수 있다.

유도 다능성 줄기 세포(Induced Pluripotent Stem Cell)(iPS 세포)

추가적인 대표적 다능성 줄기 세포는 인자들("재프로그래밍 인자")의 조합을 발현시키거나 또는 그의 발현을 유도하여 체세포를 재프로그래밍하는 것에 의해 생성된 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 포함한다. iPS 세포는 태아 체세포, 신생아(postnatal, newborn) 체세포, 소년(juvenile) 체세포, 또는 성체 체세포를 이용하여 생성될 수 있다. iPS 세포는 또한 세포 은행으로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, iPS 세포는 RPE 세포 또는 다른 세포 종류로의 분화를 개시하기 전에, (본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해) 새로 생성될 수 있다. iPS 세포의 제조가 분화된 세포의 생성에서 초기(initial) 단계이다. iPS 세포는 조직-일치(tissue-matched) RPE 세포의 제조를 위한 목적으로 특정한 환자 또는 일치된 공여자로부터의 물질을 이용하여 특이적으로 생성될 수 있다. iPS 세포는 의도된 수령자(recipient)에서 실질적으로 면역원성이 아닌 세포로부터 제조될 수 있고, 예를 들면, 자가 세포로부터 또는 의도된 수령자와 조직 적합성이 있는(histocompatible) 세포로부터 제조될 수 있다.

유도 다능성 줄기 세포는 체세포에서 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 발현시키거나 또는 그의 발현을 유도하는 것에 의해 제조될 수 있다. 상기 체세포는 섬유모세포, 예를 들면, 진피 섬유모세포, 활액 섬유모세포, 또는 폐 섬유모세포, 또는 비-섬유모세포 체세포(non-fibroblastic somatic cell)이다. 체세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 발현시키는 것에 의해 재프로그래밍된다. 재프로그래밍 인자는 Oct 3/4, Sox2, NANOG, Lin28, cMyc, 및 Klf4로부터 선택된다. 재프로그래밍 인자의 발현은 체세포를 재프로그래밍 인자의 발현을 유도하는, 하나 이상의 작용제, 예를 들면, 소형 유기 분자 작용제와 접촉시키는 것에 의해 유도될 수 있다.

체세포는 또한 재프로그래밍 인자가 (예를 들면, 바이러스 벡터, 플라스미드 등을 이용하여) 발현되고, 재프로그래밍 인자의 발현이 (예를 들면, 소형 유기 분자를 이용하여) 유도되는 것인 조합 방식(combinatorial approach)를 이용하여 재프로그래밍될 수 있다. 예를 들면, 재프로그래밍 인자는 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용한 감염에 의해 체세포에서 발현될 수 있다. 또한, 재프로그래밍 인자는 비-통합적 벡터(non-integrative vector), 예를 들면, 에피좀 플라스미드(episomal plasmid)를 이용하여 체세포에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, Yu et al., Science. 2009 May 8;324(5928):797-801을 참조한다. 재프로그래밍 인자가 비-통합적 벡터를 이용하여 발현되는 경우, 상기 인자들은 벡터에 의한 체세포의 전기천공, 형질감염(transfection), 또는 형질전환을 이용하여 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 마우스 세포에서, 통합적 바이러스 벡터(integrative viral vector)를 이용한 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, c myc, 및 Klf4)의 발현은 체세포를 재프로그래밍하기에 충분하다. 인간 세포에서, 통합적 바이러스 벡터를 이용한 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, NANOG, 및 Lin28)의 발현은 체세포를 재프로그래밍하기에 충분하다.

재프로그래밍 인자가 세포에서 발현되면, 세포를 배양할 수 있다. 시간의 경과에 따라, ES 특징을 갖는 세포가 배양 디쉬에서 나타난다. 예를 들면, ES 형태에 근거하여, 또는 선택 마커 또는 검출가능한 마커의 발현에 근거하여 세포를 선택하고 계대배양할 수 있다. ES 세포를 닮은 세포의 배양물을 생성하기 위해 이 세포들을 배양할 수 있다-이들이 추정적(putative) iPS 세포이다.

iPS 세포의 다능성을 확인하기 위해, 세포들을 다능성의 하나 이상의 분석법에서 테스트할 수 있다. 예를 들면, 세포를 ES 세포 마커의 발현에 대해 테스트할 수 있다; 세포들을 SCID 마우스로 이식된 경우, 기형종을 생성하는 능력에 대해 평가할 수 있다; 모든 3개의 배엽의 세포 종류를 생성하기 위해 분화하는 능력에 대해 세포를 평가할 수 있다. 다능성 iPS 세포가 수득되면, 이를 RPE 세포를 생성하기 위해 이용할 수 있다.

망막 색소 상피 (RPE) 세포

본 개시는 인간 배아 줄기 세포와 같은, 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있고, 배아 줄기 세포, 성체-유래 RPE 세포, 및 태아-유래 RPE 세포로부터 분자적으로 구별될 수 있는 RPE 세포를 제공한다. 본 명세서 및 앞서-확인된 관련 출원에 개시된 방법의 대표적 구체예에 따라 생성된 RPE는 이전의 방법 및 RPE 세포의 다른 소스로부터 수득가능한 세포들과 다를 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 제조 방법 단계들은 최종 RPE 세포 생성물에 독특한 구조적 및 기능적 특징을 부여하여, 이 세포들은 태아 유래 RPE 세포 또는 RPE 세포주 (예를 들면, ARPE19)와 같은 다른 소스로부터 수득된 단리된 RPE 세포와 구별될 수 있다.

또한, 본 명세서에 기재된 RPE 세포를 제조하는 방법의 대표적 구체예는 ES 세포에 대해 허용적(permissive)이지 않아서, ES 세포는 RPE 세포 배양물 및 제제에서 지속될 수 없고, 오염의 허용가능하지 않은 위험을 일으키지 않는다.

이 개시에 의해 제공된 세포 종류는 RPE 세포, RPE 전구 세포, 홍채 색소 상피(IPE) 세포, 및 기타 시각 관련 신경 세포, 예를 들면, 개재 신경 세포(예를 들면, 내핵층(inner nuclear layer)(FNL)의 "중개(relay)" 신경세포) 및 아마크린(amacrine) 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 개시의 구체예는 또한, 망막 세포, 간상체, 추상체, 및 각막 세포, 및 안구의 혈관 구조(vasculature)를 제공하는 세포를 제공할 수 있다.

RPE 세포는 망막 박리(retinal detachment), 망막 이형성(retinal dysplasia), 혈관무늬 망막증(Angioid streaks), 근시성 황반 변성(Myopic Macular Degeneration), 또는 망막 위축증(retinal atrophy)에 의하거나, 광수용체 손상 및 실명을 초래하는 다수의 시력-변형 질환(vision-altering ailment)과 연관된 망막 변성 질환, 예를 들면, 맥란막 결손(choroideremia), 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 황반변성(예를 들면, 연령-관련 황반변성), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa), 및 스타르가르트병(Stargardt's Disease)(황반 안저)의 치료를 위해 이용될 수 있다.

RPE 세포는 비-RPE 세포 종류로 탈-분화(de-differentiate)되지 않는, 안정하고, 최종적으로 분화된 RPE 세포일 수 있다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 인간 또는 인간이 아닌 동물로의 각막 투여, 망막하(sub-retinal) 투여, 또는 기타 투여 후 망막으로 통합되는 능력을 특징으로 하는, 기능성 RPE 세포일 수 있다.

RPE 세포는 RPE 세포 마커를 발현할 수 있다. 예를 들면, RPE65, PAX2, PAX6, 티로시나아제, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2, 및 MITF와 같은 마커의 발현 수준은 원래의 RPE 세포의 발현 수준과 동등할 수 있다. RPE 세포의 성숙도의 수준은 PAX2, PAX6, 및 티로시나아제 중 하나 이상의 발현, 또는 그들의 개별적인 발현 수준을 측정하는 것에 의해 평가될 수 있다.

대조적으로, RPE 세포는 ES 세포 마커를 발현하지 않을 수 있다. 예를 들면, ES 세포 유전자 Oct-4, NANOG, 및/또는 Rex-I의 발현 수준은 ES 세포에서보다 RPE 세포에서 약 100-1000배 더 낮을 수 있다. 예를 들면, RPE 세포는 옥타머 결합 단백질 4 (Oct-4, a.k.a., Pou5fl), SSEA(stage specific embryonic antigen)-3 및 SSEA-4, TRA(tumor rejection antigen)-1-60, TRA-1-80, 알칼리 포스파타아제, NANOG, Rex-1, Sox2, TDGF-1, DPPA2, DPPA3 (STELLA), DPPA4, 및/또는 DPPA5를 포함하나, 이에 한정되지 않는 ES 세포 마커의 발현이 실질적으로 결핍될 수 있다. 따라서, ES 세포에 비해, RPE 세포는 바람직하게는 Oct-4, NANOG, 및/또는 Rex-1의 발현이 실질적으로 없다.

본 명세서에 기재된 RPE 세포는 배양되지 않은(uncultured) RPE 세포 또는 기타 RPE 세포 제제에 비해 알파 인테그린 서브유닛 1-6 또는 9의 상승된 발현 수준을 보일 수 있다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 또한 알파 인테그린 서브유닛 1, 2, 3, 4, 5, 또는 9의 상승된 발현 수준을 보일 수 있다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 알파 인테그린 서브유닛 1-6의 발현을 촉진하는 조건 하에 배양될 수 있다. 예를 들면, RPE 세포를 망간 및 활성화 단일클론 항체(mAb) TS2/16을 포함하나, 이에 한정되지 않는 인테그린-활성화제(integrin-activating agent)와 함께 배양될 수 있다. Afshari, et al . Brain (2010) 133(2): 448-464 참조. RPE 세포를 라미닌 (1 ㎍/mL) 상에 플레이팅하고 적어도 약 8, 12, 24, 36, 또는 48 시간 동안 Mn²⁺ (500 μM)에 노출시킬 수 있다. 또한, RPE 세포를 여러 계대 동안(예를 들면, 적어도 약 4, 5, 6, 7, 또는 8 계대) 배양할 수 있고, 이는 알파 인테그린 서브유닛 발현을 증가시킬 수 있다.

RPE 세포는 정상 핵형을 보이고, RPE 마커를 발현할 수 있고, hES 마커를 발현하지 않을 수 있다.

세포의 착색의 정도에 근거하여, 본 명세서에 기재된 RPE 세포를 식별하고 규명할 수 있다. 색소의 변화는 RPE 세포가 배양되고 유지되는 빈도 및 RPE 세포가 배양에서 유지되는 지속 기간에 의해 제어될 수 있다. 빠르게 분열하는, 분화된 RPE 세포는 보다 엷게 착색된다. 대조적으로, 보다 서서히 분열하거나 또는 분열하지 않는(non-dividing) RPE는 그들의 특징적인 다각형 또는 육각형 형태를 취하고 멜라닌 및 리포푸신을 축적하는 것에 의해 착색 수준을 증가시킨다. 예를 들면, 휴지기(quiescent) RPE 배양물(예를 들면, 융합(confluence)에 의함)은 통상적으로 시간의 경과에 따라 착색 수준을 증가시킨다. 따라서, 착색의 축적은 RPE 분화의 지표로 작용하고, 세포 밀도와 연관된 증가된 착색은 RPE 성숙도의 지표로 작용한다. 예를 들면, 성숙 RPE 세포는 착색이 감소되도록 보다 낮은 밀도로 계대배양될 수 있다. 이러한 상황에서, 성숙 RPE 세포는 덜 성숙한 RPE 세포를 제조하기 위해 배양될 수 있다. 이러한 RPE 세포는 여전히 RPE 분화의 마커를 발현하는 분화된 RPE 세포이다.

본 명세서에 기재된 RPE 세포는 인 비트로에서 장기간 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다. 예를 들면, RPE 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 계대 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17,18, 19, 또는 20일 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다.

또한, 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 이식(transplantation) 후 그들의 표현형을 유지할 수 있다. 상기 RPE 세포는 이식 후 수령자(recipient)의 수명 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다. 예를 들면, RPE 세포는 이식 후, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다. 또한, RPE 세포는 이식 후, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 이식 후, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 이식 후, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20년, 또는 그 이상 동안 그들의 표현형을 유지할 수 있다.

RPE 세포 집단의 멜라닌 함량

본 개시의 대표적 구체예는 낮은 또는 중간 평균 수준의 착색을 갖는 RPE 세포집단 및 낮은 또는 중간 평균 수준의 착색을 갖는 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 하기 실시예에서 더 설명되는 바와 같이, 출원인은 부착 및 생존에 대한 세포의 능력을 측정하는 분석에서 상대적으로 더 낮은 수준의 착색을 갖는 RPE 세포가 보다 우수하다는 것을 확인했다. 이론에 의해 한정되는 의도 없이, RPE 세포가 보다 성숙해지면서, 동결보존 후, 세포 부착(cell attachment)을 형성하고, 생존하고, 증식하는 능력이 더 낮아질 수 있고, 이는 보다 성숙한 RPE 세포에 포함된 착색(멜라닌)의 증가된 수준 및/또는 일반적으로 증가된 착색과 상관되는 경향이 있는 성숙한 RPE 세포의 기타 표현형(예를 들면, 세포골격(cytoskeleton), 막 조성, 세포 표면 수용체 발현, 부착 강도(attachment strength), 핵 구조(nuclear architecture), 유전자 발현, 또는 기타 표현형, 또는 표현형의 조합의 변화를 포함할 수 있음) 때문일 수 있는 것으로 사료된다. 또한, 이론에 의해 한정되는 의도 없이, RPE 세포가 보다 성숙해지면서, 동결보존 없이 계대되고 및/또는 유지되는 경우, 세포 부착을 형성하고, 생존하고, 증식하는 능력이 더 낮아질 수 있고; 다시, 이는 보다 성숙한 RPE 세포에 포함된 착색(멜라닌)의 증가된 수준 및/또는 일반적으로 증가된 착색과 상관되는 경향이 있는 성숙한 RPE 세포의 기타 표현형 때문일 수 있는 것으로 사료된다.

착색의 수준은 집단에 대해 세포당 평균 멜라닌으로 측정될 수 있고, 예를 들면, 세포당 파이코그램(pg/세포)으로 표현되며, 일반적으로 집단 내 세포에서 멜라닌의 수준의 일부 변이가 있을 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 또는 5 pg/세포 미만, 예를 들면, 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-8 pg/세포, 1-7 pg/세포, 1-6 pg/세포, 1-5 pg/세포, 1-4 pg/세포, 1-3 pg/세포, 1-2 pg/세포, 2-6 pg/세포, 3-5 pg/세포, 또는 4-5 pg/세포, 예를 들면, 4.2-4.8 pg/세포, 또는 0.1-5 pg/세포일 수 있다. 다른 실시예에서, 평균 멜라닌 함량은 5 pg/세포 미만, 예를 들면, 0.1-5 pg/세포, 0.2-5 pg/세포, 0.5-5 pg/세포, 1-5 pg/세포, 2-5 pg/세포, 3-5 pg/세포, 4-5 pg/세포, 또는 4.5-5 pg/세포일 수 있다.

멜라닌 함량은 세포 추출물을 이용하는 방법, FACS-기반 방법, 및 기타를 포함한, 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 각각 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, Boissy et al., Cytometry. 1989 Nov; 10(6):779-87; Swope et al., J Invest Dermatol. 1997 Sep; 109(3):289-95; Watts et al., Cancer Res 1981;41:467-472; Rosenthal et al., Anal Biochem. 1973 Nov;56(l):91-9를 참조한다. 예를 들면, 평균 멜라닌 함량을 결정하기 위해, 대표적인 시료 중 세포의 수를 결정하고, 대표적인 시료 중 세포를 용해시키고, 세포 용해물(예를 들면, NaOH-추출 세포 펠릿으로부터의 용해물)의 총 멜라닌 함량을 (예를 들면, 분광분석법(spectrophotometry)에 의해) 결정하고, 대표적인 시료 중 세포의 수로 나누어서 세포당 평균 멜라닌 함량을 얻을 수 있다. 선택적으로, 대표적인 시료 중 세포의 수는 배양물 중 RPE가 아닌 세포를 무시하고(예를 들면, RPE의 하나 이상의 마커에 대해 양성이고 및/또는 특징적인 RPE 세포 형태를 보이는 세포를 계수하는 것에 의해), 그에 의해 대표적 시료 중 RPE 세포당 평균 멜라닌 함량을 수득하는 것에 의해 결정될 수 있다.

평균 멜라닌 함량은 회수된 RPE 세포 중 가장 많이 착색된 5 퍼센트 및 가장 적게 착색된 5 퍼센트를 제외시킨 세포 집단에 대해 결정될 수 있다.

원하는 평균 멜라닌 함량을 갖는 RPE 집단을 용이하게 수득할 수 있다. 예를 들면, 분열하지 않는, 대사적으로 활성인 RPE(예를 들면, 융합된 배양물(confluent culture) 중 RPE)의 멜라닌 함량은 합성된 멜라닌의 축적 때문에 시간의 경과에 따라 증가되는 경향이 있고, 축적된 멜라닌은 세포 분열에 의해 희석되어 멜라닌 함량은 분열하는 세포에서 상대적으로 더 낮다. 예를 들면, Dunn et al., Exp Eye Res. 1996 Feb;62(2): 155-69 참조. 따라서, 원하는 평균 멜라닌 함량을 갖는 RPE 집단을 적절한 배양 이력(growth history)을 선택하는 것에 의해, 예를 들면, 원하는 평균 멜라닌 함량을 초래하는 지속 기간 동안 휴지기 집단으로서의 유지, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 동안, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주, 또는 그 이상 동안 휴지기 집단(quiescent population)으로서의 유지를 선택하는 것에 의해 수득될 수 있다.

평균 멜라닌 함량을 제어하기 위해 또한 이용될 수 있는 추가적인 배양 이력은 일정 기간 동안 휴지 집단으로서의 유지 및 뒤이은 특정한 시간 동안 또는 분열 횟수 동안 세포가 다시 분열할 수 있게 하는 것(그에 의해 휴지기 집단에서 달성되었던 평균 멜라닌 함량을 감소시킴)을 포함한다. 멜라닌 함량은 또한 다양한 배양 배지 및/또는 배지 보충제의 사용에 의해 제어될 수 있고, 예를 들면, 배양된 RPE 중 멜라닌 축적은 단백질 키나아제 억제제 (예를 들면, H-7, W-7, H-8, 및 스타우로스포린) (Kishi et al., Cell Biol Int. 2000;24(2):79-83)의 존재시 감소되고, ATRA(all-trans retinoic acid)(10(-5) 내지 10(-7) M) 또는 TGF-beta1(1 내지 100 U/ml) (Kishi et al., Curr Eye Res. 1998 May; 17(5):483-6)의 존재 하에 증가되는 것으로 보고되었다. 멜라닌 함량은 또한 세포를 ZAG(zinc alpha-2-glycoprotein) (미국 특허 제7,803,750호 참조) 및/또는 아데노신-1 수용체 길항제, 아데노신-2 수용체 효능제, 아데노신-1 수용체 효능제, 아데노신-2 수용체 길항제, 및 아데노신-1 수용체 길항제, 아데노신-2 수용체 효능제의 조합 또는 이들의 조합(미국 특허 제5,998,423호 참조)에 의해 처리하는 것에 의해 증가될 수 있다. 전술된 문서 각각은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

대안적으로, 또는 전술된 방법에 더해, 원하는 평균 멜라닌 함량을 갖는 RPE 세포를 또한 세포 분류(cell sorting), 예를 들면, 유동세포측정기(flow cytometer)를 이용한 세포 분류를 통해 수득할 수 있다. 예를 들면, 멜라닌-함유 세포는 상승된 측부-산란(side-scattering) 및 감소된 전방 산란(forward scattering)을 포함한 그들의 광-산란 특징에 의해 검출될 수 있고; 이러한 특징은 착색의 수준에 의해 집단을 분류하고, 그에 의해 원하는 평균 멜라닌 함량을 갖는 집단을 정제하기 위해 이용될 수 있다. 각각 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된 Boissy et al., Cytometry. 1989 Nov; 10(6):779-87; Swope et al., J Invest Dermatol. 1997 Sep; 109(3):289-95.

감소된 복잡성을 갖는 RPE 세포를 수득하기 위한 인간 배아 줄기 세포 중 MHC 유전자의 조작(engineering)

인간 배아 줄기 (hES) 세포 (예를 들면, 이로부터 본 명세서에 기술된 바와 같이 RPE가 유래될 수 있다)는 인간 배아 줄기 세포의 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포의 라이브러리는 각각 인간 집단에 존재하는 하나 이상의 MHC 대립형질(allel)에 대해 반접합성(hemizygous)이거나, 동형접합성(homozygous)이거나, 또는 무효접합성(nullizygous)인 줄기 세포를 포함할 수 있고, 상기 줄기 세포의 라이브러리의 각 일원(member)은 상기 라이브러리의 나머지 일원들 대비 상이한 세트의 MHC 대립형질에 대해 반접합성이거나, 동형접합성이거나, 또는 무효접합성이다. 인간 배아 줄기 세포의 라이브러리는 인간 집단에 존재하는 모든 MHC 대립형질에 대해 반접합성이거나, 동형접합성이거나, 또는 무효접합성인 줄기 세포를 포함할 수 있다. 본 개시의 상황에서, 하나 이상의 조직접합성(histocompatibility) 항원 유전자에 대해 동형접합성인 줄기 세포는 그러한 유전자의 하나 이상(및 일부 구체예에서는, 모두)에 대해 무효접합성인 세포를 포함한다. 유전자 좌(genetic locus)에 대해 무효접합성이라는 것은 유전자가 그 유전자 좌에 대해 무효(null)(즉, 그 유전자의 모든 대립형질이 결실되거나 또는 불활성화됨)라는 것을 의미한다.

hES 세포는 세포의 MHC 복합체에서 자매 염색체의 대립형질 중 하나에 변형을 포함할 수 있다. 유전자 변형을 생성하는 다양한 방법, 예를 들면, 유전자 표적화(gene targeting)가 MHC 복합체의 유전자를 변형시키기 위해 이용될 수 있다. 또한, 세포 내의 MHC 복합체의 변형된 대립형질은 후속적으로, 자매 염색체에 동일한 대립형질이 존재하도록 동형접합성이 되도록 조작될 수 있다. 이형접합성의 상실(LOH)과 같은 방법이 MHC 복합체에서 동형접합 대립형질을 갖도록 세포를 조작하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 부모 대립형질로부터의 일 세트의 MHC 유전자 중 하나 이상의 유전자가 반접합성(hemizygous) 세포를 생성하도록 표적화될 수 있다. 무효 계통(null line)을 제조하기 위해 유전자 표적화 또는 LOH에 의해 MHC 유전자의 나머지 세트를 제거할 수 있다. 이 무효 계통은 또한 일련의 HLA 유전자(arrays of the HLA genes), 또는 개별적인 유전자를 제거(drop)하고, 그 외에는 균일한 유전적 배경을 갖는 반접합성 또는 동형접합성 뱅크를 만들기 위해 배아 세포주로 이용될 수 있다. 모든 MHC 유전자에 대해 무효접합성인 줄기 세포가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 표준 방법, 예를 들면, 유전자 표적화(gene targeting) 및/또는 이형접합성의 상실(LOH)에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 미국특허출원공개 2004/0091936, 2003/0217374 및 2003/0232430, 및 미국 가출원 60/729,173을 참조한다.

따라서, 본 개시는 감소된 MHC 복잡성을 갖는, RPE 세포의 라이브러리를 포함한, RPE 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다. 감소된 MHC 복잡성을 갖는 RPE 세포는 환자 매칭(patient matching)과 연관된 어려움을 제거할 수 있으므로, 치료적 응용을 위해 이용가능한 세포의 공급을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 이러한 세포는 MHC 복합체의 유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이 되도록 조작된 줄기 세포로부터 유래될 수 있다.

본 개시는 또한, RPE 세포(및/또는 RPE 계통(lineage) 세포)의 라이브러리로서, ES 세포의 여러 계통이 선택되고, RPE 세포로 분화되는 것인 라이브러리를 제공한다. 이 RPE 세포 및/또는 RPE 계통 세포는 세포-기반 치료법을 필요로 하는 환자를 위해 이용될 수 있다. 본 개시는 또한 각각 인간 집단에 존재하는 하나 이상의 MHC 대립형질에 대해 반접합성이거나, 동형접합성이거나, 또는 무효접합성인 RPE 세포의 라이브러리로서, 상기 RPE 세포의 라이브러리의 각 일원은 상기 라이브러리의 나머지 일원 대비 상이한 세트의 MHC 대립형질에 대해 반접합성이거나, 동형접합성이거나, 또는 무효접합성인 것인 라이브러리를 제공한다. 본 개시는 인간 집단에 존재하는 모든 MHC 대립형질에 대해 반접합성이거나, 동형접합성이거나, 또는 무효접합성인 인간 RPE 세포의 라이브러리를 제공한다.

배양 배지(Culture Medium)

세포배양물을 지지할 수 있는 배지, 예를 들면, 바이러스, 박테리아, 또는 진핵생물 세포 배양을 위한 배지가 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 배지는 EB-DM 또는 RPE-GM/MM일 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 배지는 고 영양, 단백질-불포함 배지(high nutrient, protein-free medium) 또는 고 영양, 저 단백질 배지(high nutrient, low protein medium)일 수 있다. 또한, 상기 배지는 알부민, B-27 보충제, 에탄올아민, 페투인(fetuin), 글루타민, 인슐린, 펩톤, 정제된 리포프로테인(lipoprotein) 물질, 소디움 셀레니트(sodium selenite), 트랜스페린, 비타민 A, 비타민 C, 또는 비타민 E와 같은 영양 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 부 영양, 저 단백질 배지(nutrient rich, low protein medium)는 배양에서 세포의 증식을 지지하고, 낮은 단백질 함량을 갖는 배지일 수 있다. 예를 들면, 부 영양 저 단백질 배지(nutrient rich, low protein media)는 MDBK-GM, OptiPro SFM, VP-SFM, DME, RPMI Media 1640, IDMEM, MEM, F-12 영양분 혼합물, F-10 영양분 혼합물 EGM-2, DMEM/F-12 배지, 배지 1999, 또는 MDBK-MM을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 표 1을 참조한다. 또한, 부 영양, 저 단백질 배지는 배아 줄기 세포의 성장 또는 유지를 지지하지 않는 배지일 수 있다.

저 단백질 배지(low protein medium)가 이용되는 경우, 상기 배지는 적어도 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.20%, 0.10%, 0.05%, 0.02%, 0.016%, 0.015%, 또는 0.010%의 동물-유래 단백질 함유 성분(예를 들면, 10% FBS)을 포함할 수 있다. 저 단백질 배지에 존재하는 단백질의 비율에 대한 지칭은 배지 단독에 대한 것이고, 예를 들면, B-27 보충제에 존재하는 단백질은 고려하지 않는다는 것에 유의한다. 따라서, 세포가 저 단백질 배지 및 B-27 보충제에서 배양되는 경우, 배지에 존재하는 단백질의 비율은 더 높을 수 있다.

저 단백질 또는 단백질 불포함 배지는 무혈청 B-27 보충제에 의해 보충된다. B-27 보충제의 영양 성분은 비오틴, L-카르니틴, 코르티코스테론, 에탄올아민, D±갈락토오스, 환원된 글루타티온, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신(putrescine), 레티닐 아세테이트, 셀레늄, 트리요오도-1-티로닌(T3), DL-알파-토코페롤(비타민 E), DL-알파-토코페롤 아세테이트, 우혈청 알부민, 카탈라아제, 인슐린, 수퍼옥시드 디스뮤타아제, 및 트랜스페린을 포함할 수 있다. 세포가 B-27로 보충된 단백질 불포함 배지에서 배양되는 경우, 단백질 불포함(protein free)은 B-27의 첨가 전 배지를 의미한다.

본 명세서에 기재된, 성장 인자, 작용제, 및 기타 보충제가 단독으로, 또는 배지에 포함될 수 있는 기타 인자, 작용제, 또는 보충제와 조합되어 사용될 수 있다. 인자, 작용제, 및 보충제는 즉시, 또는 세포 배양 중 임의의 시점에, 또는 그 후에 배지에 첨가될 수 있다.

배지는 또한 헤파린, 히드로코르티손, 아스코르브산, 혈청(예를 들면, 우태혈청), 또는 성장 매트릭스(growth matrix)(예를 들면, 소 각막 상피로부터의 세포외 매트릭스(extracellular matrix), 매트리겔™ (기저막 매트릭스), 또는 젤라틴), 피브로넥틴, 피브로넥틴의 단백질분해 단편(proteolytic fragment), 라미닌, 트롬보스폰딘, 아그레칸(aggrecan), 및 신데잔(and syndezan)과 같은 보충제를 포함할 수 있다.

배양 배지는 하나 이상의 인자 또는 작용제에 의해 보충될 수 있다.

사용될 수 있는 성장 인자는 예를 들면, EGF, FGF, VEGF, 및 재조합 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factor)를 포함한다. 본 개시에서 사용될 수 있는 성장 인자는 또한 6Ckine(재조합), 액티빈(activin) A, α-인터페론, 알파-인터페론, 암피레귤린(amphiregulin), 안지오게닌(angiogenin), β-내피 세포 성장 인자, 베타 셀룰린(beta cellulin), β-인터페론, 뇌 유래 신경영양 인자(brain derived neurotrophic factor), 카디오트로핀(cardiotrophin)-1, 섬모 신경영양 인자(ciliary neurotrophic factor), 사이토카인-유도 호중구 주화 인자(cytokine-induced neutrophil chemoattractant)-1, 내피 세포 성장 보충제(endothelial cell growth supplement), 에오탁신(eotaxin), 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor), 상피 호중구 활성화 펩티드(epithelial neutrophil activating peptide)-78, 에리트로포이텐(erythropoiten), 에스트로겐 수용체-α, 에스트로겐 수용체-β, 섬유모세포 성장 인자(산성/염기성, 헤파린 안정화, 재조합), FLT-3/FLK-2 리간드 (FLT-3 리간드), 감마-인터페론, 신경 아교세포계-유래 신경영양 인자(glial cell line-derived neurotrophic factor), Gly-His-Lys, 과립세포 콜로니 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor), 과립세포 대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor), GRO-alpha/MGSA, GRO-B, GRO-감마, HCC-1, 헤파린-결합 상피 성장 인자 유사 성장 인자(heparin-binding epidermal growth factor like growth factor), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor), 헤레귤린-알파(heregulin-alpha)(EGF 도메인), 인슐린 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-1/IGF-1 복합체, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 II, 2.5S 신경 성장 인자(NGF), 7S-NGF, 대식세포 염증 단백질(macrophage inflammatory protein)-1β, 대식세포 염증 단백질-2, 대식세포 염증 단백질-3α, 대식세포 염증 단백질-3β, 단핵세포 화학주성 단백질(monocyte chemotactic protein)-1, 단핵세포 화학주성 단백질-2, 단핵세포 화학주성 단백질-3, 뉴로트로핀(neurotrophin)-3, 뉴로트로핀-4, NGF-β(인간 또는 랫트 재조합), 온코스타틴(oncostatin) M(인간 또는 마우스 재조합), 뇌하수체 추출물(pituitary extract), 태반 성장 인자, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자(platelet-derived endothelial cell growth factor), 혈소판-유래 성장 인자, 플레이오트로핀(pleiotrophin), 란테스(rantes), 줄기 세포 인자, 기저 세포-유래 인자(stromal cell-derived factor) 1B/전-B 세포 성장 자극 인자(pre-B cell growth stimulating factor), 트롬보포에틴(thrombopoetin), 전환 성장 인자(transforming growth factor) 알파, 전환 성장 인자-β1, 전환 성장 인자-β2, 전환 성장 인자-β3, 전환 성장 인자-β5, 종양 괴사 인자(α 및 β), 및 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)를 포함한다.

본 개시에 따라 사용될 수 있는 작용제는 인터페론-α, 인터페론-α A/D, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-y-유도성 단백질-10, 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-15, 인터루킨-17, 각화세포 성장 인자(keratinocyte growth factor), 렙틴, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor), 대식세포 콜로니-자극 인자, 및 대식세포 염증 단백질-1α와 같은 사이토카인을 포함한다.

배양 배지는 17B-에스트라디올, 부신피질 자극 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 아드레노메둘린(adrenomedullin), 알파-멜라닌세포 자극 호르몬(melanocyte stimulating hormone), 융모막 고나도트로핀(chorionic gonadotropin), 코르티코스테로이드-결합 글로불린(corticosteroid-binding globulin), 코르티코스테론(corticosterone), 덱사메타손(dexamethasone), 에스트리올(estriol), 여포 자극 호르몬, 가스트린 1(gastrin 1), 융모막 글루카곤, 고나도트로핀, 히드로코르티손, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, L-3,3',5'-트리요오도티로닌, L-3,3',5'-트리요오도티로닌, 렙틴, 황체 호르몬(leutinizing hormone), L-티록신, 멜라토닌, MZ-4, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, PEC-60, 뇌하수체 성장 호르몬(pituitary growth hormone), 프로게스테론, 프로락틴, 세크레틴, 성호르몬 결합 글로불린(sexhormone binding globulin), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone), 티로트로핀 방출 인자(thyrotropin releasing factor), 티록신-결합 글로불린, 및 바소프레신을 포함하나, 이에 한정되지 않는 호르몬 및 호르몬 길항제로 보충될 수 있다. 배양 배지는 항-LDL 수용체 항체(anti-low density lipoprotein receptor antibody), 항-프로게스테론 수용체, 내부 항체(internal antibody), 항-알파 인터페론 수용체 사슬 2 항체(anti-alpha interferon receptor chain 2 antibody), 항-c-c 케모카인 수용체 1 항체(anti-c-c chemokine receptor1 antibody), 항-CD 118 항체, 항-CD 119 항체, 항-콜로니 자극 인자-1 항체, 항-CSF-1 수용체/c-fins 항체, 항-상피세포 성장 인자(AB-3) 항체, 항-상피세포 성장 인자 수용체 항체, 항-상피세포 성장 인자 수용체, 포스포-특이적 항체, 항-상피세포 성장 인자 (AB-1) 수용체, 항-에리트로포이에틴 수용체 항체, 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-에스트로겐 수용체, C-말단 항체, 항-에스트로겐 수용체-B 항체, 항-섬유모세포 성장 인자 수용체 항체, 항-섬유모세포 성장 인자, 염기성 항체(basic antibody), 항-감마-인터페론 수용체 사슬 항체, 항-감마-인터페론 인간 재조합 항체, 항-GFR 알파-1 C-말단 항체, 항-GFR 알파-2 C-말단 항체, 항-과립세포 콜로니-자극 인자 (AB-1) 항체, 항-과립세포 콜로니-자극 인자 수용체 항체, 항-인슐린 수용체 항체, 항-인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 항체, 항-인터루킨-6 인간 재조합 항체, 항-인터루킨-1 인간 재조합 항체, 항-인터루킨-2 인간 재조합 항체, 항-렙틴 마우스 재조합 항체, 항-신경 성장 인자 수용체 항체, 항-p60, 치킨 항체, 항-부갑상선 호르몬-유사 단백질 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 수용체 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 수용체-B 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 수용체-알파 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-레티노산 수용체-알파 항체, 항-갑상선 호르몬 핵 수용체 항체, 항-갑상선 호르몬 핵 수용체(anti-thyroid hormone nuclear receptor)-알파1/Bi 항체, 항-트랜스페린 수용체/CD71 항체, 항-전환 성장 인자-알파 항체(anti-transforming growth factor-alpha antibody), 항-전환 성장 인자-B3 항체, 항-종양 괴사 인자-알파 항체, 및 항-혈관 내피 성장 인자 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 인자들에 대한 항체로 보충될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 잠재적으로 적합한 대표적인 성장 배지가 표 1에 열거된다.

표 1. 성장 배지 조성

배지명	조성( Formulation )
MEF Growth ( MEF - GM )	500 mL IMDM 55 mL FBS
hES Growth ( hES - GM )	200 mL Knockout^®D-MEM 30 mL Knockout^®Serum Replacement 2 mL GlutaMAX^®-I 2 mL NEAA 200 ㎕ 2-머캅토에탄올 10 ng/mL bFGF 10 ng/mL LIF
EB Growth ( EB - GM )	1 L EX-CELL^®MDBK-GM 16.5 mL GlutaMAX^®-I 또는 1 L OptiPRO-SFM 20 mL GlutaMAX^®I 또는 EB-DM (실시예 4에 기재됨)
EB Formation ( EB - FM )	1 L EX-CELL^®MDBK-GM 16.5 mL GlutaMAX^®-I 20 mL B-27 Supplement 또는 1 L OptiPRO-SFM 20 mL GlutaMAX^®-I 20 mL B-27 Supplement 또는 EB-DM (실시예 4에 기재됨)
RPE Maintenance ( RPE - MM )	1 L EX-CELL^®MDBK-MM 20 mL GlutaMAX^®-I or 1 L VP-SFM 20 mL GlutaMAX^®-I or RPE-GM/MM (실시예 4에 기재됨)
RPE Growth ( RPE - GM )	500 mL EBM^®2 10 mL FBS 0.2 mL 히드로코르티손 2.0 mL rhFGF-B 0.5 mL R3-IGF-1 0.5 mL 아스코르브산 0.5 mL rhEGF 0.5 mL 헤파린 0.5 mL VEGF 또는 RPE-GM/MM (실시예 4에 기재됨)

치료 방법(Therapeutic Method)

본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 RPE 세포 및 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제가 세포-기반 치료를 위해 이용될 수 있다. 본 개시는 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 망막 변성을 수반하는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 RPE 세포는 인 비트로에서 다능성 줄기 세포로부터 유래되는 것인 방법을 제공한다. 망막 변성을 수반하는 질환은 예를 들면, 맥란막 결손, 당뇨 망막병증, 망막 위축증, 망막 박리, 망막 이형성, 망막색소변성증, 혈관무늬 망막증(석회화되고 균열(crack)될 수 있는 맥란막의 작은 틈(break)을 특징으로 하는 Knapp 선조(Knapp streaks 또는 Knapp striae)로도 지칭됨), 및 근시성 황반 변성(퇴행성 근시로도 지칭됨)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 또한 연령-관련 황반 변성(건성 또는 습성), 노스 캐롤라이나 황반 이영양증, 소르스비 안저 이영양증, 스타르가르트병, 패턴 이영양증, 베스트병, 황반병증, 디온 벌집 맥란막염, 우성 드루센, 및 방사상 드루센을 포함하나, 이에 한정되지 않는 황반 변성을 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 또한 파킨슨병(PD)을 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.

선행 문헌에 기재된 세포 이식의 공통된 특징은 낮은 이식 생존율(graft survival)이고, 예를 들면, 다수의 세포 이식 연구에서, 이식 직후(예를 들면, 제1 주 내에) 세포의 상실이 일어라는 경향이 있다. 이러한 세포의 상실은 이식된 세포의 거부 때문인 것으로 보이지 않고, 이식 부위에서 세포의 일정 비율을 유지시키지 못하는 것 때문인 것으로 보인다. 이러한 세포 유지(cell retension)의 부재는 세포가 기저 구조(underlying structure)에 결합하지 못함, 충분한 영양분의 부재, 또는 이식 부위에서의 물리적 스트레스와 같은 다수의 인자들 때문일 가능성이 가장 높아 보인다. 이러한 세포 갯수의 초기 감소(drop-off) 후, 이식 후 다양한 시점에서 세포 생존율은 연구마다 상당히 다를 수 있다. 따라서, 일부 연구는 개수의 지속적인 감소를 보여주나, 다른 연구는 이식된 세포가 안정한 개수에 도달할 수 있다는 결과를 보여준다. 그러나, 이식의 성공 고려시 중요한 인자는 세포 이식 후 생존한 이식물을 갖는 수령자(recipient)의 비율이다.

이전의 제제와 대조적으로, 본 명세서에 기재된 약제학적 제제 중 RPE 세포는 이식 후 장기간 동안 생존할 수 있다. 예를 들면, RPE 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 이상 생존할 수 있다. 추가적으로, RPE 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 이상 생존할 수 있고; 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개월 이상; 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 이상 생존할 수 있다. 또한, RPE 세포는 이식의 수령자의 수명 동안 생존할 수 있다. 추가적으로, 본 명세서에 기재된 RPE 세포의 수령자의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 이식된 RPE 세포의 생존을 보일 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 이식 수령자의 RPE 층에 성공적으로 통합(incorporate)되어, 세포의 반-연속 계통(semi-continuous line)을 형성하고 주요한 RPE 분자 마커(예를 들면, RPE65 및 베스트로핀)의 발현을 유지할 수 있다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 또한, 이식 수령자에서 맥란막에 부착되어, 안정한 RPE 층을 형성할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 실질적으로 ES 세포를 포함하지 않고, 이식 수령자는 이식 부위에서 비정상적 성장 또는 종양 형성을 보이지 않는다.

망막 변성과 연관된 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법은 본 개시의 조성물을 국소로(예를 들면, 본 개시의 약제학적 제제를 포함하는 매트릭스의 안구내 주사 또는 삽입에 의해) 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 개시의 약제학적 제제의 안구내 투여는 예를 들면, 눈의 유리체(vitreous body)로의 전달, 각막을 통한(transcorneally) 전달, 결막하(sub-conjunctival) 전달, 망막하(subretinal) 전달, 황반하(submacular)(예를 들면, 경와 황반하 주사(transfoveal submacular injection)에 의해) 전달, 공막 측부(juxtascleral) 전달, 공막 후부(posterior scleral) 전달, 및 건주하(sub-tenon) 영역으로의 전달을 포함한다. 예를 들면, 미국특허 제7,794,704호; 제7,795,025호; 제6,943,145호; 및 제6,943,153호를 참조한다.

본 개시는 또한 감소된-복잡성 배아 줄기 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포를 환자에게 투여하는 방법을 제공한다. 이 방법은: (a) 인간 RPE 세포의 투여를 포함하는 치료를 필요로 하는 환자를 확인(identify)하는 단계; (b) 상기 환자의 세포의 표면 상에 발현된 MHC 단백질을 확인하는 단계; (c) 본 개시의 RPE 세포를 제조하는 방법에 의해 제조된 감소된 MHC 복합성의 인간 RPE 세포의 라이브러리를 제공하는 단계; (d) 상기 라이브러리로부터 환자의 세포 상에 있는 MHC 단백질과 일치(match)하는 RPE 세포를 선택하는 단계; (e) 상기 환자에게 단계 (d)로부터의 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 지역 센터, 예를 들면, 병원, 클리닉, 의사의 진료실, 및 기타 의료 기관에서 수행될 수 있다. 또한, 작은 세포 개수로 보관된 경우, 환자에 대한 일치로 선택된 RPE 세포는 환자 치료 전에 확장될 수 있다.

RPE 세포는 이식 전에 배양되지 않는 RPE 세포 또는 기타 RPE 세포 제제 대비, 알파 인테그린 서브유닛 1-6 또는 9의 발현을 증가시키는 조건 하에 배양될 수 있다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 알파 인테그린 서브유닛 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 9의 발현 수준을 증가시키도록 배양될 수 있다. 본 명세서에 기재된 RPE 세포는 알파 인테그린 서브유닛 1-6의 발현을 촉진하는 조건 하에 배양될 수 있다. 예를 들면, RPE 세포는 망간 및 활성화 단일클론 항체(mAb) TS2/16을 포함하나, 이에 한정되지 않는 인테그린 활성화제(integrin-activating agent)와 함께 배양될 수 있다. Afshari, et al. Brain (2010) 133(2): 448-464를 참조한다.

특정한 치료 계획, 투여 경로, 및 보조 요법(adjuvant therapy)이 특정한 질환, 질환의 중증도, 및 환자의 전반적 건강에 근거하여 맞춤화될 수 있다. RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제의 투여는 환자의 질환에서 증상의 중증도를 감소시키고 및/또는 추가적인 변성을 예방하기에 효과적일 수 있다. 예를 들면, RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제의 투여는 환자의 시력을 향상시킬 수 있다. 추가적으로, 특정한 구체에에서, RPE 세포의 투여는 시력 상실 또는 기타 증상을 완전히 회복시키는데 효과적일 수 있다. 또한, RPE 세포 투여는 내생(endogenous) RPE 층에 대한 손상의 증상을 치료할 수 있다.

RPE 세포의 약제학적 제제(pharmaceutical preparation)

RPE 세포는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제화될 수 있다. 예를 들면, RPE 세포는 단독으로 또는 약제학적 제제의 성분으로 투여될 수 있다. 해당 화합물은 약제에서의 사용을 위한 편리한 방식으로 투여를 위해 제제화될 수 있다. 투여에 적합한 약제학적 제제는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 무균 등장성 수성 또는 비수성 용액(예를 들면, BSS(balanced salt solution)), 분산액(dispersion), 현탁액, 또는 에멀젼, 또는 사용 전에 무균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는, 항산화제, 완충제, 박테리아 발육 저지제(bacteriostat), 용질, 또는 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있는, 무균 분말과 조합된 RPE 세포를 포함할 수 있다. 대표적인 약제학적 제제는 ALCON^® BSS PLUS^® (각 mL 당, 염화나트륨 7.14 mg, 염화칼륨 0.38 mg, 염화칼슘 이수화물 0.154 mg, 염화마그네슘 육수화물 0.2 mg, 제2 인산나트륨(dibasic sodium phosphate) 0.42 mg, 탄산수소나트륨 2.1 mg, 덱스트로오스 0.92 mg, 글루타티온 디술피드(산화된 글루타티온) 0.184 mg, (pH를 약 7.4로 조정하기 위한) 물 중 염산 및/또는 수산화나트륨을 포함하는 평형 염 용액(balanced salt solution))와 조합된 RPE 세포를 포함한다.

본 개시의 대표적 조성물은 인간 환자를 치료하기 위한 용도에서 사용하기에 적합한 제제, 예를 들면, 발열원-불포함(pyrogen-free) 또는 필수적으로 발열원-불포함, 및 병원체-불포함(pathogen-free)일 수 있다. 투여되는 경우, 본 개시에서 사용하기 위한 약제학적 제제는 발열원-불포함, 병원체-불포함, 생리학적으로 허용가능한 제형일 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 RPE 세포를 포함하는 제제는 현탁액, 겔, 콜로이드, 슬러리, 또는 혼합물로 이식될 수 있다. 또한, 상기 제제는 바람직하게 망막 또는 맥란막 손상 부위로의 전달을 위해 유리액(vitreous humor)으로 점성 제형으로 캡슐화되거나 또는 주사될 수 있다. 또한, 주사시에, 동결보존 RPE 세포는 망막하 주사에 의한 투여를 위해 원하는 오스몰 농도 및 농도를 달성하기 위해 상업적으로 이용가능한 평형 염 용액을 이용하여 재현탁될 수 있다. 상기 제제는 질병으로 완전히 상실되지 않은 주심 황반(pericentral macula)의 영역에 투여될 수 있고, 이는 투여된 세포의 부착 및/또는 생존을 촉진할 수 있다.

본 개시의 조성물은 Stemgent's Stemolecule Y-27632와 같은 ROCK(rho-associated protein kinase)의 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 대표적인 조성물은 RPE 및 ROCK 억제제를 포함할 수 있고, 이들은 환자로의 투여 후 RPE 생존 및/또는 생착(engraftment)을 촉진하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.

본 개시의 RPE 세포는 안구내 주사에 의해 약학적으로 허용가능한 안과 제제(ophthalmic formulation)로 전달될 수 있다. 상기 제제를 유리체내(intravitreal) 주사에 의해 투여하는 경우, 예를 들면, 용액은 최소 부피가 전달될 수 있도록 농축될 수 있다. 주사를 위한 농도는 본 명세서에 기재된 인자들에 따라, 유효하고, 무독성인 양일 수 있다. 환자의 치료를 위한 RPE 세포의 약제학적 제제는 적어도 약 10⁴세포/mL의 용량으로 제제화될 수 있다. 환자의 치료를 위한 RPE 세포의 약제학적 제제는 적어도 약 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 또는 10¹⁰개 세포/mL의 용량으로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 상기 RPE 세포는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 중에 제제화될 수 있다.

본 명세서에 기재된 RPE 세포의 약제학적 제제는 적어도 약 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 6,000; 7,000; 8,000; 또는 9,000개 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 약제학적 제제는 적어도 약 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 9x10⁴, 1x10⁵, 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 또는 9x10¹⁰개 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 약제학적 제제는 적어도 약 1x10²-1x10³, 1x10²-1x10⁴, 1x10⁴-1x10⁵, 또는 1x10³-1x10⁶개 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 약제학적 제제는 적어도 약 10,000, 20,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 또는 200,000개 RPE 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, RPE 세포의 약제학적 제제는 적어도 약 50-200 ㎕ 중에 적어도 약 20,000-200,000개 RPE 세포를 포함할 수 있다. 또한, RPE 세포의 약제학적 제제는 150 ㎕의 부피 중 약 50,000개 RPE 세포, 150 ㎕의 부피 중 약 200,000개 RPE 세포, 또는 약 150 ㎕ 이상의 부피 중 적어도 약 180,000개 RPE 세포를 포함할 수 있다.

전술된 약제학적 제제 및 조성물에서, RPE 세포의 개수 또는 RPE 세포의 농도는 생 세포를 계수하고, 비-생(non-viable) 세포를 제외시키는 것에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 비-생 세포는 생체 염료(vital dye)(예를 들면, 트리판 블루)의 배제(exclusion) 실패에 의해, 또는 기능 분석(예를 들면, 배양 기질에 부착하는 능력, 식세포 작용, 등)을 이용하여 검출될 수 있다. 추가적으로, RPE 세포의 개수 또는 RPE 세포의 농도는 하나 이상의 RPE 세포 마커를 발현하는 세포를 계수하고 및/또는 RPE가 아닌 세포 종류를 나타내는 하나 이상의 마커를 발현하는 세포를 배제시키는 것에 의해 결정될 수 있다.

RPE 세포는 세포가 눈의 영향받은 영역, 예를 들면, 전안방(anterior chamber), 후안방(posterior chamber), 유리체, 수양액(aqueous humor), 유리액(vitreous humor), 각막, 홍채/모양체(iris/ciliary), 수정체, 맥란막, 망막, 공막, 맥란막위 공간(suprachoridal space), 결막, 결막하 공간(subconjunctival space), 공막외 공간(episcleral space), 각막내 공간(intracorneal space), 각막외 공간(epicorneal space), 평면부(pars plana), 수술적으로-유도된 무혈관 영역(surgically-induced avascular region), 또는 황반을 통과할 수 있게 하기에 충분한 기간 동안 제제를 안구 표면과 접촉된 상태로 유지시킬 수 있도록, 약제학적으로 허용가능한 안과용 비히클 중에 전달을 위해 제제화될 수 있다.

RPE 세포는 세포의 쉬트(sheet)에 담길 수 있다. 예를 들면, RPE 세포를 포함하는 세포의 쉬트는 세포의 온전한 쉬트를 방출시킬 수 있는 기질(substrate), 예를 들면, 열감응성(thermoresponsive) 폴리머, 예를 들면, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (PNIPAAm)-그래프트된 표면상에서 RPE 세포를 배양하는 것에 의해 제조될 수 있고, 상기 열감응성 폴리머에 배양 온도에서 세포가 부착되고 증식하며, 온도 전이(shift) 시(예를 들면, LCST(lower critical solution temperature) 미만까지 냉각시키는 것에 의해), 표면 특징이 변화되어, 세포의 배양된 쉬트를 방출시킨다(각각, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, da Silva et al., Trends Biotechnol. 2007 Dec;25(12):577-83; Hsiue et al., Transplantation. 2006 Feb 15:81(3):473-6; Ide, T. et al. (2006); Biomaterials 27, 607-614, Sumide, T. et al. (2005), FASEB J. 20, 392-394; Nishida, K. et al. (2004), Transplantation 77, 379-385; and Nishida,. et al. (2004), N. Engl. J. Med. 351, 1187-1196 참조). 세포의 쉬트가 이식을 위해 적합한 기질, 예를 들면, 숙주 개체 내로 이식된 경우, 인 비보에서 용해될 수 있는 기질, 예를 들면, 이식에 적합한 기질 상에서 세포를 배양하는 것에 의해 제조되거나, 또는 또 다른 기질(예를 들면, 열감응성 폴리머)로부터 이식에 적합한 기질 상으로 세포를 방출하는 것에 의해 제조된 기질에 부착될 수 있다. 이식을 위해 잠재적으로 적합한 대표적인 기질은 젤라틴을 포함할 수 있다(전술된 Hsiue et al 참조). 이식을 위해 적합할 수 있는 대안적인 기질은 피브린-기반 매트릭스 및 기타를 포함한다. 세포의 쉬트는 망막 변성의 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서 이용될 수 있다. RPE 세포의 쉬트는 필요로 하는 개체의 안구로의 도입을 위해 제제화될 수 있다. 예를 들면, 세포의 쉬트는 중심와하 막절제술(subfoveal membranectomy)에 의해 필요로 하는 안구로 도입되거나, 또는 중심와하 막절제술 후 이식을 위한 약제의 제조를 위해 이용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여되는 제제의 부피는 투여 방식, RPE 세포의 수, 환자의 연령 및 체중, 및 치료 대상 질환의 종류 및 중증도와 같은 인자에 의존적일 수 있다. 주사에 의해 투여되는 경우, 본 개시의 RPE 세포의 약제학적 제제의 부피는 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 또는 5 mL일 수 있다. 상기 부피는 적어도 약 1-2 mL일 수 있다. 예를 들면, 주사에 의해 투여되는 경우, 본 개시의 RPE 세포의 약제학적 제제의 부피는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45.46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200 ㎕(마이크로리터)일 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 제제의 부피는 적어도 약 10-50, 20-50, 25-50, 또는 1-200 ㎕일 수 있다. 본 개시의 제제의 부피는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 ㎕, 또는 그 이상일 수 있다.

예를 들면, 상기 제제는 ㎕당 적어도 약 1x10³, 2x10³, 3x10³, 4x10³, 5x10³, 6x10³, 7x10³, 8x10³, 9x10³, 1x10⁴, 2x10⁴, 3x10⁴, 4x10⁴, 5x10⁴, 6x10⁴, 7x10⁴, 8x10⁴, 또는 9x10⁴개 RPE 세포를 포함할 수 있다. 상기 제제는 ㎕당 2000개의 RPE 세포, 예를 들면, 50 ㎕당 100,000개 RPE 세포, 또는 90 ㎕당 180,000개 RPE 세포를 포함할 수 있다.

망막 변성을 치료하는 방법은 면역 억제제의 투여를 더 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 면역 억제제는 ALG(anti-lymphocyte globulin) 다중클론 항체, ATG(anti-thymocyte globulin) 다중클론 항체, 아자티오프린, 바실릭시맙(BASILIXIMAB)® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 사이클로스포린 (사이클로스포린 A), 다클리주맙(DACLIZUMAB)® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 에베롤리무스, 마이코페놀산, 리툭시맙(RITUXIMAB)®(항-CD20 항체), 시롤리무스, 및 타크롤리무스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 면역 억제제는 적어도 약 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/kg으로 투여될 수 있다. 면역 억제제가 사용되는 경우, 이들은 전신으로 또는 국소로 투여될 수 있고, 이들은 RPE 세포의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 면역억제 요법(immunosuppressive therapy)은 RPE 세포의 투여 후 수주, 수개월, 수년, 또는 무한정 지속될 수 있다. 예를 들면, 환자는 RPE 세포의 투여 후 6주 동안 5 mg/kg 사이클로스포린을 투여받을 수 있다.

망막 변성을 치료하는 방법은 RPE 세포의 단일 투여량의 투여를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 치료 방법은 RPE 세포가 일정한 기간 동안 복수회 투여되는 것인 치료 코스(course of therapy)를 포함할 수 있다. 대표적인 치료 코스는 주별, 격주별(biweekly), 월별, 분기별, 반기별(biannually), 또는 연별(yearly) 치료를 포함할 수 있다. 대안적으로, 치료는 단계적으로 진행될 수 있고, 이에 의해, 복수 투여량이 초기에 투여되고(예를 들면, 제1 주 동안 일일 투여량), 뒤이어 보다 적고 낮은 빈도의 투여량이 요구된다.

안구내 주사에 의해 투여되는 경우, RPE 세포는 환자의 일생 동안 1회 이상 정기적으로 전달될 수 있다. 예를 들면, RPE 세포는 1년에 1회, 6 내지 12개월당 1회, 3 내지 6개월당 1회, 1 내지 3개월당 1회, 또는 1 내지 4주당 1회 전달될 수 있다. 대안적으로, 특정한 질환 또는 장애에 대해 보다 빈번한 투여가 요구될 수 있다. 임플란트 또는 장치에 의해 투여되는 경우, RPE 세포는 특정한 환자 및 치료 대상 장애 또는 질환에 대해 필요에 따라, 1회, 또는 환자의 일생 동안 정기적으로 1회 이상 투여될 수 있다. 마찬가지로, 시간의 경과에 따라 변하는 치료 계획(therapeutic regimen)이 고려된다. 예를 들면, 처음에 보다 빈번한 치료(예를 들면, 일 1회 또는 주 1회 치료)가 필요할 수 있다. 시간의 경과에 따라, 환자의 질환이 개선되면서, 덜 빈번한 치료가 요구되거나 또는 심지어 추가적인 치료가 요구되지 않을 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법은 개체에서 망막 전도(electroretinogram) 반응, 시운동력 역치(optomotor acuity threshold), 또는 광밀도(luminance) 역치를 측정하는 것에 의해 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 눈에서 세포의 면역원성 또는 이동(migration)을 모니터링하는 것에 의해 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다.

RPE 세포는 망막 변성을 치료하기 위한 약제의 제조에서 이용될 수 있다. 본 개시는 또한 실명의 치료에서 RPE 세포를 포함하는 제제의 용도를 포함한다. 예를 들면, RPE 세포를 포함하는 제제는 광수용체 손상 및 실명을 초래하는 다수의 시력-변형 질환(vision-altering ailment), 예를 들면, 당뇨 망막병증, 황반변성(연령-관련 황반변성, 예를 들면, 습성 연령-관련 황반 변성 및 건성 연령-관련 황반 변성 포함), 망막색소 변성증, 및 스타르가르트병(황반 안저)과 연관된 망막 변성을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 상기 제제는 광수용체 손상 및 실명을 초래하는 다수의 시력-변형 질환, 예를 들면, 당뇨망막병증, 황반 변성(연령-관련 황반 변성 포함), 망막색소변성증, 및 스타르가르트병(황반 안저)과 연관된 망막 변성을 치료하기 위해 망막에 투여될 수 있는, 적어도 약 5,000-500,000개 RPE 세포(예를 들면, 100,00개 RPE 세포)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 RPE 세포는 인간 RPE 세포일 수 있다. 그러나, 인간 세포는 인간 환자에서, 및 동물 모델 또는 동물 환자에서 이용될 수 있다는 것에 유의한다. 예를 들면, 인간 세포는 망막 변성의 마우스, 랫트, 고양이, 개, 또는 인간이 아닌 영장류 모델에서 테스트될 수 있다. 추가적으로, 인간 세포는 필요로 하는 동물을 치료하기 위해, 예를 들면, 수의학에서 치료적으로 이용될 수 있다.

투여 방식

약제학적 제제는 투여 경로에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 제제화될 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 눈의 망막하 공간에 투여되도록 제제화될 수 있다. RPE 세포를 포함하는 제제는 동일한 환자에서 한쪽 눈에 또는 양안 모두에 투여될 수 있다. 양안으로의 투여는 순차적이거나 또는 동시적일 수 있다. 예를 들면, RPE 세포를 포함하는 제제는 현탁액, 용액, 슬러리, 겔, 또는 콜로이드로 제제화될 수 있다.

본 개시의 RPE 세포는 주사에 의해(예를 들면, 유리체내 주사), 또는 장치 또는 임플란트의 일부로서(예를 들면, 임플란트), 국소로 투여될 수 있다. 전술된 바와 같이, RPE 세포는 다양한 가능한 배열(arrangement)을 가질 수 있고, 예를 들면, 개별적인 세포, 덩어리(clump), 무리(cluster), 또는 이들의 조합일 수 있고, 이들은 수성 담체, 겔, 매트릭스, 폴리머, 등에 담길 수 있다. 예를 들면, 제제는 눈의 망막하 공간으로의 주사에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 세포는 유리체 절제술을 이용하여 망막하 공간으로 이식될 수 있다. 추가적으로, 주사 시에, RPE 세포는 망막하 주사에 의한 투여를 위해 원하는 오스몰 농도 및 농도를 달성하기 위해 상업적으로 이용가능한 평형 염 용액(예를 들면, Alcon BSS PLUS^®)을 이용하여 재현탁될 수 있다.

선택적으로, RPE 세포는 평면부 유리체 절제술(pars plana vitrectomy), 예를 들면, 3 포트 평면부 유리체 절제술을 포함하는 방법에 의해 투여될 수 있다. 상기 방법은 작은 망막절개(small retinotomy)를 포함할 수 있다. 세포 투여 전에,망막하 수포(subretinal bleb)가 예를 들면, 염수(saline) 또는 다른 적절한 유체의 주사에 의해 형성될 수 있고(전-수포(pre-bleb)"), 이는 그 후, 세포 투여 전에 제거될 수 있다. 그러나, 세포는 또한 전-수포 형성 없이 투여될 수 있다. 세포는 측두부 중심와 위치(temporal foveal position)에서 수포로 투여될 수 있다. 예를 들면, 수포는 선택적으로 혈관궁(arcade blood vessel) 내에서 연장될 수 있다. 수포는 중심 황반와(central macula fovea)를 분리하지 않도록 배치될 수 있다.

투여 방법에 따라, RPE 세포는 완충, 전해질 평형 수용액(buffered and electrolyte balanced aqueous solution), 윤활 폴리머를 포함하는 완충 전해질 평형 수용액, 미네랄 오일 또는 석유-기반 연고, 기타 오일, 리포좀, 사이클로덱스트린, 지속 방출 폴리머 또는 겔에 첨가될 수 있다.

RPE 세포에 의한 사용을 위한 매트릭스

본 명세서에 기재된 방법은 본 개시의 RPE 세포를 임플란트 또는 장치로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 장치는 생분해성 폴리머 매트릭스 내에 분산된 활성제를 포함하고, 상기 활성제의 입자의 약 75% 이상은 약 10 ㎛ 미만의 직경을 갖는 것인 눈의 질병을 치료하기 위한 생체흡수성(bioerodible) 임플란트이다. 생체흡수성 임플란트는 안구 영역에서의 이식을 위한 크기를 가질 수 있다. 안구 영역은 전안방, 후안방, 유리체강(vitreous cavity), 맥란막, 맥란막위 공간, 결막, 결막하 공간, 공막외 공간, 각막내 공간, 각막외 공간, 공막, 평면부(pars plana), 수술적으로-유도된 무혈관 영역, 황반, 및 망막 중 하나 이상일 수 있다. 생분해성 폴리머는 예를 들면, 폴리(락트-코-글리콜)산 (PLGA) 공중합체, 생분해성 폴리(DL-락트-코-글리콜산) 필름, 또는 PLLA/PLGA 폴리머 기질일 수 있다. 상기 폴리머 중 락트산 대 글리콜산 단량체의 비율은 약 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 중량 퍼센트이고, 보다 바람직하게는 약 50/50 이다. PLGA 공중합체는 생체흡수성 임플란트의 중량 기준 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 내지 약 90 퍼센트일 수 있다. PLGA 공중합체는 생체흡수성 임플란트의 중량 기준 약 30 내지 약 50 퍼센트, 바람직하게는 약 40 퍼센트일 수 있다. RPE 세포는 폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜산), 50:50 PDLGA, 85:15 PDLGA, 및 INION GTR® 생분해성 막(생체적합성 폴리머의 혼합물)과 같은 생체적합성 폴리머와 함께 이식될 수 있다. 미국특허 제6,331,313호; 제7,462,471호; 및 제7,625,582호 참조. 또한, Hutala, et al. (2007) "In vitro biocompatibility of degradable biopolymers in cell line cultures from various ocular tissues: Direct contact studies." Journal of Biomedical Materials Research 83A(2): 407-413; Lu, et al. (1998) J Biomater Sci Polym Ed 9: 1187-205; 및 Tomita, et al. (2005) Stem Cells 23: 1579-88 참조.

또 다른 양태에서, 본 개시는 막에 배치된(situated) RPE를 포함하는 조성물, 및 이를 망막의 질병, 장애, 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 상기 막은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, U.S. PGPub. No. 20110236464에 기재된 막일 수 있다. 상기 막은 실질적으로 비-생분해성이고 다공성일 수 있고, 세공은 직경이 약 0.2㎛ 내지 0.5㎛일 수 있다. 예를 들면, 세공 직경은 0.3 ㎛ 내지 0.45㎛일 수 있다. 비-생분해성 막의 이용은 이 막이 눈으로의 이식 후에 세포를 지지하도록, 예를 들면, 신체로의 삽입 후에 5년 이상, 10년 이상, 또는 15년 이상 유지된다는 것을 보장할 수 있다.

세공 밀도(pore density)는 cm^2당 약 1 x 10^7 내지 3 x 10^8개의 세공, 예를 들면, cm^2당 5 x 10^7 내지 1 x 10^8개의 세공일 수 있다. 이 밀도는 원하는 투과도(permeability) 수준을 가능하게 할 수 있고, 또한 혈관생성(vascularization)을 가능하게 할 수 있다. 구체적으로, 세공의 크기 및 밀도는 막의 일 측면으로부터 다른 측면으로 영양분의 이동을 가능하게 하고, 또한 막을 통한, 예를 들면, 이식 후 혈관형성을 가능하게 할 수 있다. 폴리머 본체(polymer body)는 풍부한 맥란막 상(rich choroidal bed)으로부터 혈관형성을 수용할 수 있다. 이는 눈의 외부에 있는 풍부한 혈관상에서 확인되었으나(Cassell et al, 2002; Patrick et al, 1999; Saxena et al 1999, Peter et al 1998) 다공성이 충분한 경우에만 일어날 수 있다(enger et al, 1990).

예를 들면, 막 수리 전도도(membrane hydraulic conductance)는 50 x 10^-10 m sec^-1 Pa^-1보다 높을 수 있다. 구체적으로, 막의 막 수리 전도도는 약 33mL/min/cm^2일 수 있다. 이는 801.21 x 10^-10 m sec^-1 Pa^-1과 동일하고, 이는 어린 황반 사체 맥란막(young macular cadaveric Bruch's membrane)의 수리 전도도의 8배이다. 이러한 과잉 전도도는 인공 막은 수동적 과정에 전적으로 의존할 수 있기 때문에 잠재적으로 유용하다. 영양분 확산의 측면에서 위에 놓인(overlying) 세포의 요구를 충족시킬 수 있을 뿐 아니라, 바람직하게는, RPE 층의 기저부(basal side)로부터의 유체 이동에 대해 장애가 아니고, 그렇지 않은 경우, RPE가 폴리머 표면으로부터 분리될 수 있다. 이러한 예상과 일치하게, 노년층에서 맥란막의 감소된 수리 전도도가 AMD에서 색소 상피 분리를 유발하는 것으로 추정(hypothesize)되었다(Bird & Marshall, 1986).

바람직하게는, 막은 감마선 조사(gamma radiation), 에틸렌 옥시드, 오토클래이빙(autocalving), 또는 UV 멸균에 의해 손상 없이 멸균될 수 있다.

바람직하게는, 막은 초음파 밀봉(ultrasonic sealing), 무선 주파수 밀봉(radio frequency sealing) 또는 인서트 성형(insert molding)에 의해 밀봉될 수 있다. 이는 다른 층이 막에 부착될 수 있게 하고, 예를 들면, 약제학적 또는 코팅 층이 상기 막에 부착될 수 있게 한다. 예를 들면, 전달을 보조하기 위해 막에 강성(rigidity)을 제공하기 위해 PLGA와 같은 보다 견고한 생분해성 층을 부착시키기를 원할 수 있다. 대안적으로, 약리학적 또는 생물학적 작용제를 포함하는 층 또는 다른 세포를 지지하는 층이 부착될 수 있다.

막은 바람직하게는 약 11 ㎛의 최대 두께를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 막 두께는 9 ㎛ 내지 11 ㎛이다. 막의 두께는 영양분의 확산을 가능하게 하고, 혈관형성을 가능하게 하며, 또한, 막이 용이하게 눈에 삽입될 수 있게 하도록 선택될 수 있다.

따라서, RPE는 세포의 성장을 지지하는 막 상에 제공되거나 또는 그 위에서 배양될 수 있고, 상기 막은 실질적으로 비-생분해성이고, 다공성이며, 약 11 ㎛의 최대 두께를 갖는다. 상기 막은 바람직하게는 실질적으로 편평하고(planar) 그의 가장 작은 치수는 바람직하게는 약 11 ㎛ 미만이다. 상기 막은 치수에서 두께가 다양할 수 있으나, 바람직하게는 9 ㎛ 내지 11 ㎛ 두께이다.

상기 막은 약 1.5mg/cm^2의 최대 중량을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 막의 중량은 1.0 mg/cm^2 내지 1.4 mg/cm^2이다. 상기 막의 최소 인장 강도(tensile strength)는 수술 동안 적절히 충분한 강도를 제공하도록, 바람직하게는 100 바(bar) 이상이다. 최대 인장 강도는 바람직하게는 300 바이고, 역시, 수술 동안 막이 용이하게 취급될 수 있게 한다. 막의 파열 강도(burst strength)는 바람직하게는 10 psi 이상이다.

바람직하게는, 막은 친수성이다. 이는 막에 우수한 습윤 능력(wetting capability)를 줄 수 있고, 세포 및 기타 원하는 코팅의 용이한 부착을 가능하게 한다.

상기 막은 바람직하게는 생리학적으로 허용가능한 pH, 예를 들면, 4 내지 8의 pH를 갖는다.

막은 바람직하게는 하나 이상의 면에 코팅을 포함한다. 코팅은 바람직하게는 단백질 또는 당단백질, 예를 들면, 라미닌, 매트리겔™, 콜라겐, 피브로넥틴 및/또는 PLGA 폴리(락트-코-글리콜산)이다. 코팅은 또한 코팅 성분에 결합된, 약리학적 또는 생물학적 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 코팅은 신경영양제(neurotrophic agent), 항-염증제, 또는 항혈관신생제를 포함할 수 있다.

구체적으로, 코팅은 바람직하게는 라미닌, 특히, 라미닌-1, 또는 그의 단편, 예를 들면, IgVAV를 포함한다. 구체적으로, 코팅은 다른 단백질 또는 당단백질보다 더 많은 라미닌-1을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 코팅은 30% 이상, 또는 40% 이상의 라미닌, 예를 들면, 라미닌-1을 포함할 수 있다. 코팅은 약 40-45㎍/cm^2의 막 상의 라미닌-1 농도를 갖도록 적용될 수 있다.

따라서, RPE는 세포의 성장을 지지하는 막 상에 제공되거나 또는 배양될 수 있고, 상기 막은 하나 이상의 면에 라미닌-1을 포함하는 코팅을 갖는, 실질적으로 비-생분해성이고 다공성인 지지층(support layer)을 포함한다.

막은 친수성 폴리머로 제조될 수 있다. 또한, 폴리머 상에 UV 광을 비추는 것에 의해 친수성이 된 소수성 폴리머가 이용될 수 있다. 대표적인 폴리머는 폴리에스테르, 예를 들면, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리부틸렌 테레프탈레이트; 폴리우레탄 및 폴리 우레아-우레탄, 특히, 폴리카보네이트 및 폴리실록산을 포함하는 것들, 및 폴리에스테르 기반 또는 폴리에테르 기반인 것들; 폴리아미드, 예를 들면, 나일론; 폴리에테르-에스테르, 예를 들면, 심파텍스(Sympatex); 폴리카보네이트, 예를 들면, 마크롤론(Makrolon); 폴리아크릴레이트, 예를 들면, 퍼스펙스(Perspex); 폴리(테트라플루오로에텐)(PTEE); 폴리실록산; 폴리올레핀, 예를 들면, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌; 및 Dupont의 브랜드 명인 델린(Delrin)으로 널리 알려진 폴리옥시메틸렌(POM)을 포함한다. 막이 폴리에틸렌 테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌 테레프탈레이트로 제조되는 것이 특히 바람직하다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 막은 폴리에스테르로 제조된다.

막은 본 개시의 RPE 세포의 층을 성장시키기 위해 이용될 수 있다. 상기 막은 바람직하게는 막 상에 세포의 층을 포함할 수 있다. 상기 세포는 막 및 세포의 의도된 용도에 따라 선택된 세포일 수 있다.

막 및 세포의 층은 바람직하게는 길이 및 폭이 바람직하게는 3mm x 5mm 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 막 및 세포의 층은 4mm x 6mm 이상일 수 있다.

막 및 세포의 층은 필요로 하는 환자의 눈으로, 예를 들면, 연령-관련 황반 변성, 망막 열공, 황반 이영양증, 맥란막 위축(choroidemia), 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amarosis), 스타르가르트병, 또는 기타 망막의 질병 또는 질환의 치료에서 이식될 수 있다.

스크리닝 분석법(Screening Assay)

본 개시는 RPE 세포 성숙도를 조절(modulate)하는 작용제를 확인하기 위한 스크니링 방법을 제공한다. 예를 들면, 인간 ES 세포로부터 분화된 RPE 세포가 RPE 성숙을 촉진하는 작용제를 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다. 확인된 작용제는 치료 계획(treatment regimen)의 일부로, 단독으로, 또는 RPE 세포와 조합되어 이용될 수 있다. 대안적으로, 확인된 작용제는 인 비트로에서 분화된 RPE 세포의 생존을 개선시키기 위해 배양 방법의 일부로 이용될 수 있다.

RPE 세포는 제약 회사, 화학 회사, 또는 생물공학 회사, 병원 또는 학술 또는 연구 기관과 같은 환경에서 연구 도구로서 이용될 수 있다. 이러한 용도는 예를 들면, 인 비트로 또는 인 비보에서 RPE 생존을 촉진하기 위해 이용될 수 있는 작용제, 또는 RPE 성숙, 생존, 및/또는 생착을 촉진하기 위해 이용될 수 있는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 분석법에서 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포의 용도를 포함한다. 확인된 작용제는 인 비트로에서 또는 동물 모델에서, 예를 들면, 그들의 잠재적 단독 사용 또는 RPE 세포와 조합된 사용을 평가하기 위해 연구될 수 있다.

본 개시는 RPE 세포를 제공하는 단계, 상기 RPE 세포를 작용제와 접촉시키는 단계, 성숙도(maturity)의 징후에 대해 상기 RPE 세포를 평가하는 단계, 및 상기 작용제가 RPE 세포가 성숙도의 징후를 보이게 하는 경우, RPE 성숙을 촉진하는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는, RPE 성숙을 촉진하는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 성숙도의 징후는 본 명세서에서 검토된 바와 같은, 착색 수준, 유전자 발현 수준, 및 형태일 수 있다.

상업적 응용 및 방법

본 개시의 특정한 양태는 상업적 양에 도달하게 하는 RPE 세포의 생산에 관한 것이다. RPE 세포가 대규모로 생산되고, 필요한 경우, 보관되고, 병원, 임상의, 또는 기타 의료 기관에 공급될 수 있다.

따라서, 본 개시의 일부 양태는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생산된 RPE 세포의 생산, 보관, 및 유통 방법에 관한 것이다. RPE 생산 후에, RPE 세포를 회수(harvest)하고, 정제하고, 선택적으로, 환자의 치료 전에 보관할 수 있다. RPE 세포는 선택적으로 환자 특이적이거나, 또는 HLA 또는 기타 면역학적 프로파일(immunologic profile)에 근거하여 특이적으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 환자가 적응증, 예를 들면, 당뇨 망막병증, 황반 변성(연령-관련 황반 변성 포함), 망막색소 변성증, 망막 위축증, 망막 박리, 망막 이형성, 및 스타르가르트병(황반안저), 혈관무늬 망막증, 또는 근시성 황반 변성을 나타내는 경우, RPE 세포를 적시에 주문하고 공급할 수 있다. 따라서, 본 개시는 상업적 규모로 세포를 수득하기 위해 RPE 세포를 생산하는 방법, 상기 방법으로부터 유래된 RPE 세포를 포함하는 세포 제제, 및 병원 및 임상의에게 RPE 세포를 제공하는(즉, 생산하고, 선택적으로 보관하고, 및 판매하는) 방법에 관한 것이다. 분화된 RPE 세포 또는 성숙 분화 RPE 세포의 생산이 상업적 용도를 위해 확대될 수 있다.

본 개시는 또한, 판매을 위해 제제를 유통시키기 위한 유통 시스템(distribution system)을 구축하는 단계를 포함하거나 또는 약제학적 제제를 판매하기 위한 영업 그룹(sales group)을 구축하는 단계를 포함할 수 있는, 제약 사업을 수행하는 방법을 제공한다.

본 개시는 병원, 의료 센터, 및 임상의에게 RPE 세포를 제공하는 방법으로서, 이에 의해, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 RPE 세포를 보관하고, 병원, 의료 센터, 또는 임상의가 필요시 주문하고, RPE 세포 요법을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것인 방법을 제공한다. 병원, 의료 센터, 또는 임상의는 환자 특이적 데이터에 근거하여 RPE 세포를 주문하고, 환자의 사양(specification)에 따라 RPE 세포를 생성하고, 뒤이어 주문을 한 병원 또는 임상의에게 공급된다. 예를 들면, 특정한 RPE 세포 제제가 환자에게 적합한 것으로 선택된 후, 환자의 치료를 위해 적합한 양까지 확장된다.

본 개시의 또 다른 양태는 일치하는(matched) 세포를 잠재적 환자 수령자에게 제공할 수 있는 RPE 세포의 라이브러리에 관한 것이다. 따라서, 본 개시는 하나 이상의 조직적합성 항원에 대해 동형접합인 RPE 세포 제제를 제공하는 단계를 포함하는, 제약 사업을 수행하는 방법으로서, 세포는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 확장될 수 있는 RPE 세포의 라이브러리를 포함하는 세포 은행으로부터 선택되고, 각 RPE 세포 제제는 인간 집단에 존재하는 하나 이상의 MHC 대립형질에 대해 반접합성이거나 동형접합성이며, 상기 RPE 세포의 은행은 상기 세포의 은행 중 나머지 일원들 대비 상이한 세트의 MHC 대립형질에 대해 각각 반접합성이거나 동형접합성인 세포를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 전술된 바와 같이, 유전자 표적화 또는 이형접합성의 상실(loss of heterozygosity)이 RPE 세포를 유도하기 위해 이용되는 반접합성 또는 동형접합성 MHC 대립형질 줄기 세포를 생성하기 위해 이용될 수 있다.

본 개시는 또한, 환자 또는 조직적합성 공여자(histocompatible donor)로부터 인간 ES 세포(예를 들면, 유도 다능성(iPS) 세포, 또는 체세포 핵 이식에 의해 제조된 ES 세포, 또는 기타 재프로그래밍 방법에 의해 제조된 ES 세포)를 수득하거나 생성하고, 그 후, 인간 ES 세포로부터 RPE 세포를 생성하고 확장시키는 방법을 포함한다. 이러한 RPE 세포는 보관될 수 있다. 또한, 이러한 RPE 세포는 ES 세포를 제공한 환자, 또는 그 환자의 친척, 또는 조직적합성 개체를 치료하기 위해 이용될 수 있다.

본 개시는 인간 RPE 세포가 잘 정의되고 재현가능한 조건 하에서 인간 ES 세포로부터 신뢰성 있게 분화되고 확장될 수 있고, 망막 변성 질환을 가진 환자를 위한 세포의 무한한 소스를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 세포의 농도는 이용가능성(availability)에 의해 한정되지 않으나, 개체의 정확한 임상적 요구로 적정될 수 있을 것이다. 환자의 일생 동안 동일한 세포 집단의 반복된 주입 또는 이식이 의사에 의해 필요하다고 인정되는 경우, 이루어질 수 있다. 또한, RPE 세포가 유래될 수 있는 일치하는(matching) 또는 감소된 복잡성의 HLA hES의 은행을 생성하는 능력은 면역억제성 약물 및/또는 면역조절성(immunomodulatory) 프로토콜에 대한 요구를 잠재적으로 감소시키거나 또는 제거할 수 있다.

도 1. hESC MA09로부터 생성된 RPE의 특성규명(characterization). a. 배상체의 분화 배양에서 형성된 RPE의 착색 패치(pigmented patch)를 보여주는 6-웰 플레이트, b-h, 해동되고 제제화된 RPE에서 분자 마커의 평가. MITF 및 PAX6 (c-d)을 신선하게 제제화된 세포의 밤샘 배양물(overnight culture)에서 평가하고, 베스트로핀/PAX6 및 ZO-1 면역염색(immunostaining)을 3주령 배양물에서 수행하였다. b. 중등도의 착색(medium pigmentation)을 가진 융합된 자갈 단층(confluent cobblestone monolayer)을 보여주는 제제화 후 3주령 RPE의 HMC 현미경 사진(microphotograph). c-합쳐진(merged) MITF/PAX6 (MITF-원본에서 레드, PAX6-원본에서 그린), d. MITF/PAX6에 상응하는 DAP1; e. 합쳐진 베스트로핀/PAX6, f. 상응하는 DAP1; g. ZO-1, h.상응하는 DAPI. c-h에서 거의 100% 세포가 평가된 마커에 대해 양성이라는 것에 주목한다. 확대율, x400 (b-h). i. 기준(reference) RPE 로트(각 그룹의 좌측 패널, 원본에서 블루) 대비, 해동된 임상적 RPE(각 그룹의 우측 패널, 원본에서 그린)에서 RPE 마커의 상향조절 및 hESC 마커의 하향 조절을 보여주는 q-PCR. (좌측부터 우측으로 차례대로) 표시된 유전자는: 베스트로핀, Pax-6, MITF, RPE-65, NANOG, OCT-4, 및 SOX-2. j. 37℃ 및 4℃ (대조군)에서 hES-RPE에 의한 PhRodo 바이오입자의 식세포 작용을 보여주는 FACS. 미처리 세포(원본에서 흑색 선; 가장 좌측의 곡선) 및 4℃ 대조군 세포(원본에서 적색 선; 곡선의 좌측 부분은 미처리 세포 곡선의 우측으로 약간 상승되고, 곡선의 우측 부분은 미처리 세포 곡선의 우측 부분과 중첩됨), 및 37℃ 처리 세포 (원본에서 청색 선; 가장 우측의 곡선)가 표시된다. k. 임상적 RPE 로트의 정상 여성(46 XX) 핵형.
도 2. 9개월 후, hESC-MA09로부터 생성된 RPE의 생존 및 NIH III 마우스 눈으로의 통합. 절편은 항-인간 미토콘드리아 (a, 원본에서 적색), 및 항-인간 베스트로핀(b, 원본에서 녹색)으로 염색됨. 동일한 세포 (c: a 및 b가 합쳐짐)에서 인간 미토콘드리아 및 베스트로핀 염색의 정확한 동시 국재화(colocalization) 및 마우스 RPE(f: a, b, c, e 합쳐짐)에서 염색의 부재에 주목한다. 명시야 상(bright field image) 상의 프레임(e)이 인간 RPE의 형태를 보여주기 위해 "d"에서 확대된다. 확대율 200x(a-c, e, f), d는 추가로 x4.5 확대된다.
도 3. 상이한 착색 정도를 갖는 RPE의 부착 및 성장의 차이. 현미경 사진은 보다 엷게(lighter) 착색된 (a-c) 로트 및 보다 진하게(darker) 착색된 (d-f) 로트의 부착 및 거동을 보여준다. g는 플레이팅 후 연속된 3일 동안 웰 당 세포의 총 수를 보여주는, 보다 진한 로트(각 그룹의 좌측 패널) 및 보다 엷은 로트(각 그룹의 우측 패널)에 대한 RPE의 성장 속도를 보여준다. a 및 d는 플레이팅 후 21시간 차 총 세포 집단을 보여주고, b 및 e는 부유 세포(floating cell)의 제거 후 a 및 d에서와 동일한 배양물을 보여주며, c 및 f는 플레이팅 후 3일 경과시 동일한 배양물을 보여준다. 대다수의 세포는 보다 엷게 착색된 로트(a, b, g)에서 해동 후 21시간 차에 부착했고, 보다 진하게 착색된 로트에서는 소수의 세포만이 부착되었으며(d, e, g, 화살표), 대부분의 세포는 부유 상태였다는 것에 주목한다. 배양물에서 3일 후에, 보다 엷게 착색된 로트(c)는 더 많은 수의 세포를 가졌고, 융합된 단층(confluent monolayer)가 형성되었고, 반면에, 보다 진하게 착색된 로트는 여전히 융합-미만(under-confluent)이었다. 확대율, x200.
도 4. hESC-유래 RPE 이식 부위의 이미지. SMD 환자의 좌측 황반의 수술 전 및 수술 후의 컬러 안저 사진 (a-c). 직사각형 내부의 영역은 수술 이식 부위의 경계를 이분하고 수술 주사(surgical injection)에 포함되지 않은 황반 위축증에 해당한다. a - 널리 퍼진 RPE 및 감각신경 황반 위축증(neurosensory macular atrophy)의 기준시점(baseline) 황반 컬러 이미지. b- hESC-RPE 이식 후 1주차 컬러 황반 이미지. 기준시점 RPE 위축증의 영역에서 경미한 착색(mild pigmentation)이 가장 명확하다는 것에 주목한다. 이 착색은 6주 차에 증가되었다 (c). 패널 d 및 e는 SD-OCT(spectral domain ocular coherence tomograph) 및 등록된 흑백 사진 (Hiedelberg Engineering)을 보여준다. 패널 e에 표시된 단면도(cross sectional view)는 패널 d에서 화살표에 의해 표시된 수평선(원본에서 밝은 녹색)에 해당한다. 패널 e에서 파선 원(원본에서 적색)은 약화된(compromised) 원래의 RPE 층 상의 hESC-RPE 세포 정착(settling) 또는 부착으로 보이는 것을 강조한다.
도 5. AMD 환자의 플루오레세인 혈관조영술(fluorescein angiography) 이미지. 상이한 시간 간격에 누출의 증거는 없다. A: 기준시점 초기 상(baseline early phase), B: 기준시점 후기 상(baseline late phase), C: 4주차 초기 상, D: 4주차 후기 상, E: 8주차 초기 상, F: 8주차 후기 상, (선택된 이미지는 이식 영역을 나타내기 위해 최소로 분산됨(decentered inferiorly)).
도 6. 스타르가르트병 환자의 플루오레세인 혈관조영술 이미지. 상이한 시간 간격에 누출의 증거는 없다. A: 기준시점 초기 상, B: 기준시점 후기 상, C: 4주차 초기 상, D: 4주차 후기 상, E: 8주차 초기 상, F: 8주차 후기 상, (선택된 이미지는 이식 영역을 나타내기 위해 최소로 분산됨).
도 7: 상이한 시간 간격에서의 스타르가르트병 환자의 OCT 이미지. 상이한 시간 간격의 이미지에서 부종 또는 망막하액(subretinal fluid)의 증거는 관찰되지 않았다. (선택된 OCT는 이식의 영역을 나타낸다). 패널 A: 기준(baseline), B: 1주, C: 4주, D: 8주.
도 8. AMD 환자의 세극등 이미지(slit lamp image). 패널 A 및 B: 수술 후 1주. 전안부 염증(anterior segment inflammation) 또는 각막 부종의 증거는 관찰되지 않는다.
도 9. 스타르가르트병 환자의 세극등 이미지. 패널 A 및 B: 수술 후 1주. 전안부 염증 또는 각막 부종의 증거는 관찰되지 않는다.
도 10. AMD 환자에게 수행된 Goldmann 시야계(Visual field): 패널 A: 기준시점, 패널 B: 6주. 약간 더 작은 중심 암점(central scotoma)이 관찰된다.
도 11. 스타르가르트병 환자에게 수행된 Goldmann 시야계: 패널 A: 기준시점, 패널 B: 6주. 암점의 최소 축소(minimal diminution)가 관찰된다.
도 12. 상이한 배지를 이용하여 제조된 RPE 세포의 두 로트에 대한 식세포 작용 분석 결과. RPE를 MDBK 배지(패널 a) 또는 EB-DM 및 RPE-GM/MM (패널 B)을 이용하여 제조했다. 형광 바이오입자 없이 인큐베이션된 세포("미처리(untreated)"), 4℃에서 형광 바이오입자와 함께 인큐베이션된 음성 대조군 세포("4℃"), 및 37℃에서 형광 바이오입자와 함께 인큐베이션된 세포("37℃")에 대한 FACS 분석으로부터의 결과가 막대그래프로 제시된다("미처리(untreated)").
도 13. 스타르가르트 황반 이영양증을 가진 환자에서 hESC-RPE 이식 부위의 이미지. 환자의 좌측 황반의 수술전 및 수술후 컬러 안저 촬영(a-c). 직사각형 내부의 영역은 수술 이식 부위의 경계를 이분하고 수술 주사(surgical injection)에 포함되지 않은 황반 위축증에 해당한다. (a) 널리 퍼진 RPE 및 감각신경 황반 위축증의 기준시점 황반 컬러 이미지. (b) hESC-RPE 이식 후 1주차 컬러 황반 이미지. 기준시점 RPE 위축증의 영역에서 경미한 착색(mild pigmentation)이 가장 명확하다는 것에 주목한다. 이 착색은 6주 차에 증가되었다(c). (d-g) 기준시점 (d) 및 이식 후 3개월 차(f)의 컬러 안저 촬영사진 및 SD-OCT 이미지. 컬러 이미지는 기준시점부터 3개월차까지 RPE의 수준에서 증가되는 착색을 보여준다. 등록된 SD-OCT 이미지(e, g)는 RPE의 수준에서 증가되는 착색, 및 3개월 차(화살표), 원래의 RPE가 없는 노출된(bare) 맥란막의 영역에 인접한 정상적인 단층 RPE 생착 및 생존을 보여준다.
hESC=인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cells). RPE=망막 색소 상피(tinal pigment epithelium). SD-OCT=spectral domain ocular coherence tomography.
도 14. SMD 환자에 대한, 미처리 눈("Fellow eye")과 RPE 세포가 주사된 눈("수술된 눈(Operated eye)")에서 스타르가르트 황반 이영양증을 가진 환자에서 hESC-RPE 이식 후 시력 변화의 표 요약. 수술된 눈은 ETDRS 및 BCVA에 의해 검출가능한 개선을 보였고, 미처리 눈에서 시력의 검출된 변화는 없었다. hESC=인간 배아 줄기 세포. RPE=망막 색소 상피. BCVA=best corrected visual acuity. ETDRS=Early Treatment Diabetic Retinopathy Study visual acuity chart.
도 15는 각각 hESC 소스로부터 유래된 50,000개의 RPE 세포로 치료된, 2명의 추가적인 스타르가르트병 환자에 대해 망막, 시신경 유두(optic disc), 황반, 및 후극(posterior pole)을 포함하는, 두 개의 안저 사진을 보여준다. 각 사진은 RPE 세포를 포함하는 용액의 주사 후 형성된 수포의 영역과 주사 부위를 표시한다.
도 16 및 17 (두 명의 상이한 추가적인 SMD 환자가 3개의 안저 사진을 보여주고, 각각 각 환자에 대해 표시된 시점에 촬영된 것이다(즉, 기준시점, 1개월, 및 2개월 또는 3개월차)은 주사 수포(injection bleb) 내에서 착색 RPE 세포의 증가된 패치를 갖는 영역의 형성을 보여주고, 이는 새로운 RPE 층을 갖는 망막의 영역의 생착 및 재표피화(resurfacing)를 시사한다.
도 18은 도 16 및 도 17의 상부 패널에 표시된 환자의 처리된("주사된(injected)") 눈과 미처리("미주사(uninjected)") 눈에서 측정된 시력을 보여준다. 수직 축은 ETDRS(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study) 점수를 나타내고, 수평 축은 수술 후 경과 일수를 나타낸다.
도 19. 가시광 형미경 사진(visible light migrograph)은 배아 파괴 없이 생성된 hESC로부터 제조된 RPE 배양물의 예상되는 착색 및 형태를 보여준다. 상단의 세 개의 패널(A, B, C)은 3개의 상이한 인간 iPS(hiPS) 세포주로부터 제조된 RPE를 보여준다. 하단의 세 개의 패널(D, E, F)은 생검된 할구로부터 생성된 hES 세포로부터 제조된 RPE를 보여주고(D30469 및 NED7로 지정된 세포주), 나머지 배아는 생존 상태로 유지되고 동결보존되었다.
도 20. 도 4에서 보다 초기 시점에 표시된 동일한 SMD 환자에서 장기적 RPE 생착(engraftment). 기준시점(A) 및 RPE 주사 후 1년차에 촬영된 안저 사진은 착색된 세포의 존재를 보여주고, 주사 후 1년 이상 지속된 RPE 세포의 장기 생착을 나타낸다.
도 21. 치료 후 1년까지의 시점에 대한 AMD 환자의 ETDRS/BCVA 점수-주변부(Peripheral).
도 22. 치료 후 1년까지의 시점에 대한 AMD 환자의 ETDRS/BCVA 점수-중심부(Central).

실시예

본 발명이 일반적으로 설명되었고, 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이며, 실시예는 본 발명의 특정 양태 및 구체예의 예시 목적으로만 포함되고, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

결과가 제시된 실시예 및/또는 추가적인 실험 결과에 대한 추가 정보가 본 출원의 청구항 직전에 포함된 첨부된 사본(manuscript)에 포함된다.

실시예 1

방법

hESC 마스터 세포 은행(master cell bank)의 생성

이 연구에서 사용된 hESC 세포주는 완전한 고지 동의하에 수득되고 ACT(Advanced Cell Technology)의 윤리 자문 위원회 및 임상시험 심사 위원회(Ethics Advisory Board and Institutional Review Board)를 준수하여 사용된, 미사용 IVF(in vitro fertilization) 배아로부터 유래된, 이전에 기술된 MA09였다(22). MA09 종균 스톡(seed stock)을 해동시키고, 현재의 GMP를 이용하여 유사분열-불활성화(mitotically-inactivated) 마우스 배아 섬유모세포(MEF)에서 4회의 연속 계대(serial passage)를 통해 확장시켰다. 임상적 hESC 마스터 세포 은행(hESC-MCB)을 동결보존하고, 정상 여성(46, XX) 핵형을 갖고, 박테리아 및 마이코플라스마 오염, 및 인간, 소, 돼지, 및 마우스 바이러스가 없다는 것을 확인했다. PCR 분석은 CTRP5, EVLV4, RPE-65, VMD2, 및 ABCA4를 포함한, 황반 변성과 연관된 유전자의 변화 또는 돌연변이를 보이지 않았다(하기의 표 3).

망막 색소 상피의 제조

hESC-MCB의 바이알을 해동시키고, 미토마이신 C-처리 MEF 상에서 3 계대 동안 확장시켰다. hESC를 동물 세포와 공동-배양하였기 때문에, 분화된 파생물(derivative)을 이종이식(xenotransplantation) 산물로 분류하고, 공여 동물 및 산물 처리, 테스트, 및 기록보존(archiving), 및 환자, 모니터링 및 등록에 관한 FDA 가이드라인에 따랐다(하기 실시예 2에서 더 설명됨). hESC 확장 후, 세포를 순차적으로 유도하여 배상체를 형성시키고, 뒤이어 세포 과성장(outgrowh) 및 착색된 RPE 패치로의 국소화된 분화가 이루어졌다. 이 실시예에서 사용되는 RPE의 제조는 하기 실시예 4에서 더 설명된다. 착색된 패치를 콜라게나아제로 단리시키고, 정제 및 트립신 처리 후에, 분리된 세포를 접종하고, 융합(confluence)까지 증식시키고, 총 3회의 연속 계대(serial passage) 동안 재분화되도록 유도했다.

계대 2 RPE를 동결보존하고, 임상적 용도를 위해 세포를 제제화하기 위한 출발 물질로 작용하였다.

전임상(preclinical) 연구

인간 ESC-유래 RPE 세포를 이전에 기술된 바와 같이(8), NIH III 면역-누드(immune-nude) 마우스(종양형성 및 생체분배(biodistribution) 연구) 및 이영양성 RCS 랫트 및 ELOV4 마우스(효능 연구)에 망막하로 주사했다. 주사된 눈과 기타 기관에서 인간 세포의 검출은 인간 Alu Y DNA 서열을 증폭하기 위해 설계된 DNA Q-PCR 및 인간 미토콘드리아 및 인간 베스트로핀에 대한 파라핀 절편의 면역염색(immunostaining)에 의해 수행하였다(실시예 2에서 더 설명됨).

세포 특성 규명 및 안전성 테스트

RPE 세포를 제조-과정 테스트(in-process testing) 및 해동 후 수행된 테스트, 최종 산물 제제, 및 인 비트로에서 이식된 세포의 진행(fate)을 시뮬레이션하기 위한 성숙까지의 배양을 포함한 다양한 시점에 안전성을 평가하고 다수의 RPE-특이적 속성에 대해 규명했다. 잠재적인 박테리아, 마이코플라스마, 마우스 바이러스(murine virus), 및 잔류 마우스 DNA(residual murine DNA)에 대한 안전성 평가를 WuXi Apptec, Inc. St. Paul, MN에 의한 표준 프로토콜에 따라 수행했다. 핵형분석(karyotying)을 위한 세포유전학 분석, 세포 계통 확인을 위한 DNA 지문분석(fingerprinting), 및 FISH(fluorescence in situ hybridization)를 CellLines Genetics, Madison, WI에 의해 수행했다. Cape Cod Associates, Inc, East Falmouth, MA에 의해 임상적 주사를 위한 최종 제품으로 제제화된 동결보존 RPE에 대해 내독소(endotoxin) 테스트를 수행했다. 표준 방법을 이용하여 정량적 면역조직학적 염색을 수행하고, 양성 염색된 세포의 비율을 조사된 DAPI 염색 핵의 개수까지 정규화시켰다. RPE 순도 및 분화 정도의 평가는 베스트로핀, Pax6, ZO-1 및/또는 MITF 염색된 세포의 비율에 근거했다. 다능성 마커의 부재를 확인하기 위한 스크리닝은 OCT-4 및 알칼리 포스파타아제에 대한 염색에 의해 수행했다. PhRodo™ (Invitrogen) 형광 바이오입자에 노출된 RPE 배양물의 정량적 FACS(fluorescence activated cell sorting) 분석에 의해 식세포 작용(효능 분석)을 평가했다. RPE-특이적 유전자(RPE-65, PAX-6, MITF, 베스트로핀)의 상향 조절 및 hESC-특이적 유전자(OCT-4, NANOG, SOX-2)의 하향 조절을 확인하기 위해 정량적 역전사(q-RT) PCR 분석을 수행했다. 공지된 세포 수를 갖는 NaOH 추출 펠릿에서 세포당 멜라닌 함량을 분광분석법에 의해 측정했다(실시예 2에서 더 설명됨).

세포 제제 및 주사

동결보존된 MA09-RPE의 바이알을 해동시키고, 원심분리에 의해 3회 세척하고, 2 x10³ 생 세포/㎕ BSS PLUS^® (Alcon)의 밀도로 재현탁시켰다. 제제화된 RPE의 적합한 부피를 담은 바이알 및 2-8 ℃의 BSS PLUS^®의 적절한 부피를 담은 쌍을 이루는(paireD) 바이알을 OR로 전달하였다.

주사 직전에, 두 개의 바이알을 1 mL 시린지에서 재구성시켜 원하는 수의 RPE의 전달(각 환자의 눈의 망막하 공간으로의 50,000개의 생 RPE 세포의 전달)을 초래할 로딩 세포 밀도를 수득했다. 의도된 용량의 정확한 전달을 보장하기 위해, 혼합, 로딩(loading), 및 캐뉼라를 통한 전달 동안 일어나는 생 RPE의 예상되는 상실을 상쇄시키기 위해 로딩 세포 밀도를 증가시켰다. 이러한 생 세포 상실이 하기 실시예 3에 기재되며 사용된 캐뉼라에 의존적인 것으로 확인했다. 이러한 실시예에서, MEDONE POLYTIP® Cannula 25/38 (0.12mm (38g) x5mm 팁을 갖는 0.50mm (25g) x 28mm 캐뉼라)을 사용했고, 로딩 세포 밀도는 336 +/- 40개 생 세포/㎕ (N=6)의 예상되는 전달을 수득하기 위해 444개 생 세포/㎕여서, 각 환자의 망막하 공간으로의 150 ㎕의 부피 중 50,400개의 생 RPE의 예상된 전달을 가져왔다.

환자 선택

말기 단계 질환(end stage disease), 중심부 시각 상실(central vision loss), 기타 중대한 안과 질환의 부재, 암 불포함 의료 이력, 현재의 암 스크리닝, 전신성 면역억제를 위한 금기(contraindication)의 부재, 모니터링되는 마취 관리 하에 유리체망막 수술 절차(vitreoretinal surgical procedure)를 수행하는 능력 및 hESC 유래 이식 조직을 포함하는 인간 임상 시험에서 최초로(as a first) 참여하기 위한 심리적 적합성을 포함한, 다수의 포함 및 배제 기준(하기의 표 7 및 표 8)에 근거하여 환자를 선택했다.

이식 및 근거(TRANSPLANTATION AND RATIONALE)

시신경으로부터 앞쪽으로 유리체 기저부(vitreous base)의 후방 경계까지의 후방 유리체의 분리의 수술적 유도(surgical induction)을 포함하는 유리체 절제술(pars plana vitrectomy)을 수행했다. 150 ㎕ 부피 중 5 x10⁴ hESC-RPE 세포의 황반하 주사를 질병에 완전히 상실되지 않은 주심 황반(pericentral macula)의 미리 선택된 영역 내로 전달하였다. 이식물 통합(transplant integration)의 기회 및 광수용체 세포 구제(photoreceptor cell rescue)의 가능성을 최적화하기 위해, 약화되었으나(compromised), 원형의 RPE 및 그 위에 놓인(overlying) 광수용체의 존재에 근거하여 이식 부위를 세심하게 선택했다. 완전히 위축된 중심 황반 판토해부학적 복합체(completely atrophic central macular pathoanotomic complex) 내부에서 이식물 부착은 일어나지 않을 것이고, 줄기 세포 기반 재생 이식물 전략의 궁극적 치료 표적일 수 있는, 변성의 보다 초기 단계에 있는 중심 황반 상태(central macular status)처럼 보이지 않는다.

면역억제 계획(immunosuppression regimen)은 수술 시술 1주 전 저-용량 타크롤리무스 (표적 혈액 수준 3-7 ng/mL) 및 마이코페놀레이트(mycophemolate) 모페틸(0.25g-2g 경구/일 범위의 MMF)을 포함하고, 6주의 기간 동안 지속했다. 6주 차에, 상기 계획은 타크롤리무스의 중단 및 추가적인 6주 동안 MMF의 지속을 요구한다.

결과

RPE의 특성규명

제어된 hESC 분화는 거의 100% 순수한 RPE를 초래했다(도 1). 착색된 패치(pigmented patch)의 단일(9.6 cm2) 6-웰 플레이트(도 1a)는 약 1.5 x10⁸ RPE 세포를 생성했다(예를 들면, 환자당 3 x10⁶ 세포까지의 용량으로 50명의 환자를 치료하기에 충분한 양). 세포들은 전형적인 RPE 거동을 보였고, 증식 동안(트립신 처리(trypsinization) 후) 그들의 착색된 자갈 형태를 상실했다; 융합(confluence)이 재확립되면, 이들은 다각형의 장방형 착색된 상피(polygonal cuboidal pigmented epithelium)의 단층으로 재분화되었다. Q-PCR은 다능성의 마커(Oct-4, NANOG, 및 SOX2)가 유의성 있게 하향조절되고, RPE 마커 RPE65, 베스트로핀, Pax6, MITF가 고 수준으로 발현되었다는 것을 보여준다(도 1b-f 및 표 5). 성숙 배양물의 면역 염색은 분화된 RPE의 후기 마커(late marker)인 베스트로핀이 회수(harvest) 전에 세포의 대다수에서 막 방식(membrane fashion)으로 구조화(organize)되었다는 것을 보여주었다; 모든 세포 (>99%)는 베스트로핀 및/또는 PAX6 (보다 성숙한 세포에서 PAX6는 더 약해지거나 또는 사라짐) 및 밀착 연접(tight junction)의 성분인 ZO-1(도시되지 않음)에 대해 양성이었다. 동결보존 후에, 세포의 바이알을 해동시키고, 이식을 위해 제제화했다. 망막 마커 Pax6 및/또는 MITF(착색 세포의 마커)에 대한 염색은 100% RPE 순도를 확인했다 (도 1c). 제제화된 세포를 더 테스트하기 위해, 이들을 2 내지 3주 동안 RPE 형태가 확립될 때까지 성장 및 성숙을 가능하게 하기 위해 배양했다. Pax6/베스트로핀(도 1e) 및 ZO-1(도 1g) 면역염색은 회수-전 배양물과 유사했고 효능 분석은 세포의 >85%가 바이오입자의 단편을 식균(phagocytize)했다는 것을 보여주었다 (도 1j).

안전성 연구

hESC를 동물 세포 및 산물에 노출시켰기 때문에, MCB 및 RPE를 동물 및 인간 병원체에 대해 광범위하게 테스트했다. 세포를 모든 단계에서 동물 및 인간 바이러스 병원체를 포함한 미생물 오염물을 포함하지 않는 것으로 확인했다(하기의 표 3). 최종 RPE 산물은 정상 여성(46, XX) 핵형(도 1k)이고, DNA 지문 프로파일은 hESC-계통 MA09와 일치했다. RPE 제조 과정이 다능성 세포에 대한 비-지지적(non-supportive) 조건 하에 수행되었으나, 최종 RPE 산물 중 어떠한 오염 hESC의 존재를 배제시키기 위해 고 민감도 분석을 수행했다. Oct-4 및 알칼리 포스파타아제에 대해 염색된 2/9백만개 세포 RPE 시료(P1/P2)의 검사는 다능성 세포의 부재를 보여주었다. NIH-III 마우스에서 수행된 종양 형성(tumorigenicity), 생체내 분포(biodistribution), 및 스파이킹(spiking) 연구는 어떠한 동물에서도 유해한 이슈나 안전성 이슈를 보이지 않았다. 추가적으로, 0.01%, 0.1%, 또는 1% 미분화 hES 세포로 스파이킹된 50,000-100,000개 RPE 세포가 주사된 동물에서 종양은 관찰되지 않았다. 인간 RPE 세포의 생존이 주사 후 3개월까지 동물의 100%의 눈에서 확인되었고, 9개월 차에 동물의 92%에서 확인되었다(하기 표 6). 인간 RPE는 동물의 일생 동안 생존했고 마우스 RPE 층에 통합되었다; 형태학적으로 숙주 RPE 세포와 거의 구별되지 않으나(도 2), 이들은 면역염색 및 전형적인 기저측면(baso-lateral) 방식으로 발현된 베스트로핀에 의해 식별될 수 있다(도 2b). Ki-67 염색은 이식 후 3개월까지 낮은 수준의 증식을 보여주었으나, 9개월 차에 Ki-67 양성 세포는 발견되지 않았고, 이는 hESC-유래 RPE가 성숙한 휴지 단층(mature quiescent monolayer)을 형성했다는 것을 나타낸다.

분화의 단계가 세포 부착 및 생존율에 영향을 미친다

이식된 세포의 맥란막으로의 부착 및 그들의 뒤이은 생존 및 숙주 RPE 층으로의 통합이 이 치료 전략의 성공에 중대한 것으로 생각된다. hESC 기술의 구별되는 특징은 분화의 정도가 인 비트로에서 제어될 수 있다는 것이다. RPE 분화의 정도는 착색의 수준을 포함한, 일련의(array)조절된(modulated) 유전형 및 표현형 발현에서 분명하다. 유사한 조건 하에 유지되었으나, 상이한 시점에 회수되고 동결보존된 세포는 다양한 수준의 착색을 보인다. 도 3은 분명히 상이한 수준의 착색에서 회수된 동결보존 RPE의 두 개의 대표적인 로트를 보여준다(각각 보다 엷게 착색된 로트(Lighter Lot)와 보다 진하가 착색된 로트(Darker Lot)에 대해, 멜라닌 함량은 4.8 ± 0.3 SD pg/세포 및 10.4 ± 0.9 SD pg/세포였다). 두 개의 RPE 로트로부터의 세포를 임상 이식을 위한 프로토콜을 이용하여 처리하고 제제화했다. 주사 캐뉼라를 통한 압출 후에, 세포를 젤라틴-코팅 조직 배양 플레이트에 접종하고, 부착 및 후속 성장에 대해 모니터링했다. 보다 엷은 착색 로트로부터의 RPE 세포는 밤샘 배양물에서 최소 수의 부유 세포(floating cell)을 보였고; 세포의 대부분은 부착되고 퍼져서, 성장의 이 단계에 대한 전형적인 RPE 거동 및 형태를 보였다(도 3a). 배양 3일 후에, RPE 세포의 수는 접종된 4.0 x10⁴개로부터 10.6 x10⁴개 세포까지 증가했다(도 3c 및 도 1g). 대조적으로, 보다 진하게 착색된 RPE는 다수의 부유 세포를 보였고; 세포의 낮은 비율만이 부착하고 생존했으며, 배양 3일 후에 유의성 있게 감소된 수의 세포(보다 엷게 착색된 로트에서 관찰된 [9.0 x10³]의 1/10 미만)가 관찰되었다 (도 3f 및 도 3g). 이러한 결과는 RPE 분화의 단계와 인 비트로에서 부착하고 생존하는 능력 간의 강한 상관관계를 시사한다. 현재의 임상 연구에서 사용된 RPE 로트는 4.1 pg/세포의 멜라닌 함량을 가졌고 보다 엷게 착색된 로트의 부착 및 성장과 유사한 수준의 부착 및 성장을 보였다. 동결-해동 사이클, 해동-후 세척, 원심분리, 및 제제화, 및 주사 캐뉼라를 통한 압출과 연관된 스트레스가 엷게 착색된 세포와 진하게 착색된 세포 간의 관찰된 차이를 부분적으로 설명할 수 있다.

임상적 결과

SMD 환자는 손 동작(HM)의 기준시점(baseline) BCVA(best corrected visual acuity)를 가진 26세의 백인 여성이고, ETDRS(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study) 시력 차트 상의 어떠한 문자도 읽을 수 없었다. 이식 후 어떤 시점에도 안구내 염증 또는 과다증식의 징후는 검출되지 않았다. 임상적으로 검출가능한 염증의 부재는 세극등 바이오현미경 촬영(slit lamp biomicroscopic photography), 안저 촬영(fundus photography), IVFA, 및 SD-OCT에 의해 확증되었다(실시예 2와 도 8 및 도 9에서 더 설명됨). RPE의 수준에서 임상적으로 증가된 착색이 수술 후 1주 차부터 시작하여 관찰되었고, 이는 수술 이식 부위의 외부에 퍼진 것으로 나타난다 (도 4). Goldmann 시야계는 기준시점부터 이식 후 2개월까지 개선되었다(수술전 및 수술후 시야계가 도 10 및 도 11에 표시된다). 2주 차에, BCVA는 CF(counting fingers)(1개의 ETDRS 문자)였고, 이는 연구 기간 동안 지속적으로 개선되었다(1 개월 및 2 개월에 5개의 ETDRS 문자[BCVA 20/800])(표 2). 이 환자는 높이 신뢰할 수 있었고, 수년 동안 그래픽 아티스트로 일하고 있었다. 그녀는 주관적으로 다른 눈(fellow eye)에는 변화 없이, 수술된 눈으로터 개선된 색각 및 개선된 대비(contrast) 및 암 적응(dark adaptation)을 보고했다.

표 2. 수술된 눈에서 hESC-RPE 이식 후 시각의 변화

건성 AMD	BCVA ^*	ETDRS (문자의 #) ^**	스타르가르트병	BCVA	ETDRS (문자의 #)
기준시점	20/500	21	기준시점	손 동작(HM)	0
1 주	20/320	21	1 주	손가락 세기(CF)	0
2 주	20/200	33	2 주	손가락 세기	1
3 주	20/200	32	3 주	손가락 세기	3
4 주	20/250	30	4 주	20/800	5
6 주	20/250	28	6 주	20/800	5
8 주	20/320	25	8 주	20/800	5

* BCVA = Best Corrected Visual Acuity

** ETDRS = Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) 시력 차트

AMD 환자는 기준시점에 21개의 ETDRS 문자의 BCVA (20/500)를 가진 77세의 백인 여성이었다. 면역억제 계획에 대한 중등도의 비-순응(moderate non-compliance)에도 불구하고, 이식 후 어떤 시점에도 안구내 염증 및 과다증식의 징후는 검출되지 않았다. 임상적으로 검출가능한 염증의 부재는 세극등 바이오현미경 촬영, 안저 촬영, IVFA, 및 SD-OCT에 의해 확증되었다(실시예 2와 도 8 및 도 9에서 더 설명됨). OCT 이미지가 도 4 및 도 7에 표시된다. 2주 차에, ETDRS BCVA는 33개의 문자였다(20/200). 6주 차까지, BCVA는 28개의 ETDRS 문자였고(20/320), 8주까지 안정적으로 유지되었다. Goldmann 시야계에 의해 측정된 중심 암점(central scotoma)은 기준시점 대비 8주 차에 크기가 약간 감소했다.

검토

인간 배아 줄기 세포의 치료 용도는 어려운 번역 과제를 부과한다. 이 보고는 hESC-유래 세포가 인간 환자에 안전하게 이식될 수 있다는 것을 시사하는 최초의 임상적 증거를 제공한다. 현재의 연구에서, hESC로부터 생성된 RPE 세포의 저 용량(5 x10⁴ 세포)이 상이한 형태의 황반 변성-건성 AMD 및 SMD, 각각 선진국에서 성인 실명 및 청소년(juvenile) 실명의 주요 원인-을 갖는 두 명의 환자의 눈에 이식되었다.

세포가 맥란막에 부착되는 가능성을 높이기 위해, 황반 복합체(macular complex)(광수용체, 맥란막 및 RPE)가 여전히 존재하고 잠재적으로 생존가능한 황반하(submacular) 주사 부위를 선택하여, 이식된 세포가 원래의 RPE와 통합되고, 잠재적으로 약화된 황반주위 조직(peri-macular tissue)을 구제할 것이라는 예상 가능성을 증가시켰다. 두 환자는 모두 이식을 잘 견뎠고, 이 보고의 작성 시점에 수술후 염증, 거부 또는 종양 형성의 징후는 없었다. 임상 및 실험실 발견은 이식된 RPE 세포가 부착되고 통합되어 약화된 원래의 RPE에 영향을 미치기 시작했다는 것을 시사한다.

진행 중인 환자의 모니터링 및 평가가 이식된 hESC-RPE가 감소된 면역원성을 갖는지 여부, 그들이 장기적으로 면역억제의 부재시 거부를 일으킬 수 있는지 여부, 및 관찰된 시력 증가(visual gain)이 지속될 것인지 여부를 결정할 수 있다. 면역 반응은 있다면, 면역억제 및/또는 내성(tolerizing) 계획을 포함한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 통해 관리될 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 보다 많은 수의 RPE의 투여를 통해 보다 큰 시력 개선이 이루어질 수 있는 것으로 예상된다. 또한, RPE 세포의 투여는 AMD, SMD 등을 포함한 망막 변성의 질환과 연관된 시력 상실을 둔화시키거나 또는 중지시킬 것으로 예상된다.

일차 RPE 세포의 온전한(intact) 쉬트 및 현탁액의 이식이 이전에 시도되었으나(11-19), 성체 기관 공여자로부터 유래된 RPE는 표준 배양 조건을 이용한 멜라닌 생합성을 위해 요구되는 유전자를 발현하지 못하는 것을 포함하여, 그들의 증식 능력(23) 및 인 비트로에서 분화하는 능력이 제한된다(24). 임상적으로, AMD 환자의 망막하 공간으로 생착된 성체 RPE의 쉬트는 시각 기능을 개선시키지 못했다(25). 출생 전 및 출생 후 조직으로부터 유래된 RPE는 성공적으로 분리되고 인 비트로에서 성장하고 완전히 분화된 RPE를 시사하는 속성으로 성숙하도록 유도되었으나(26-28), 그러한 소스(source)는 매우 제한되고, 품질 및 확장(expansion) 능력에 대해 가변적이다. 성체 및 태아 조직과 대조적으로, hESC의 특징은 이들이 노화를 겪지 않으면서, 무기한으로 증식할 수 있는 능력을 가져서, 분화를 위한 출발 물질로서, "젊은(youthfrl)" 세포의 실질적으로 무제한의 소스를 공급한다는 것이다. hESC로부터 수득된 자손을 이용하는 또 다른 예상되는 장점은 인 비트로 분화의 단계가 이식 후 생존 및 기능성(functionality)을 최대화하도록 제어될 수 있다는 것이다. 실제로, 본 명세서에 제시된 데이터는 RPE 성숙도 및 착색의 정도가 인 비트로에서 세포의 후속 부착 및 성장에 크게 영향을 미친다는 것을 보여준다.

이 연구에서 사용된 RPE를 위한 출발 물질은 제어된 조건 하에 다량의 다능성 줄기 세포를 신뢰성 있게 생산하도록 최적화된 절차를 이용하여 생성된 잘-규명된 hESC 마스터 세포 은행이었다. RPE 분화 절차가 hESC 생존의 지지를 허용하지 않으나, 광범위한 전임상 안전성 연구는 이식된 hESC-RPE가 동물의 일생 동안 이소성 조직 형성 또는 종양을 유발하지 않았다는 것을 확인했다. 백만 개 이상의 세포 중 1개 미만의 미분화 hES 세포를 검출할 수 있는 면역형광-기반 분석법은 본 연구에서 사용된 RPE의 임상적 로트가 검출가능한 다능성 세포를 갖지 않는다는 것을 확인했고, 이는 인 비보 스파이킹 연구(in vivo spiking study)에서 종양을 유발하는 것으로 확인된 hESC의 용량보다 10⁵(five orders of magnitude) 더 낮은 검출 수준을 나타낸다. hESC-MCB의 생성 및 RPE 세포의 각 로트의 제조는 일차 마우스 배아 섬유모세포 피더 층 상에서의 증식을 포함했다. 따라서, hESC-RPE는 이종 이식(xenotransplantation) 산물로 분류되고, 세포에 마우스 병원체가 없다는 것을 보장하기 위해 FDA 이종이식 가이드라인에 의해 지시된 모든 테스트 및 모니터링을 거쳤다. RPE는 또한 미생물 오염물 및 바이러스의 부재를 확인하기 위해 광범위한 일련의 안전성 테스트를 거쳤고, 식세포 작용 능력, 유전자 발현, 형태학적 평가, 및 RPE-특이적 마커에 대한 면역조직화학적 염색을 포함한, 다양한 RPE-특이적 속성에 의해 규명(characterize)되었다. 이 임상 시험의 개시 전에, hESC-RPE의 이영양증 동물(dystrophic animal)의 이식은 세포가 용량 의존적 방식으로 광수용체 및 시각 기능을 구제할 수 있다는 것을 보여주었다.

현재의 연구는 진행된 병기의 SMD 및 건성-AMD를 가진 환자에서 hESC-RPE의 안전성 및 내성(tolerability)을 테스트하도록 설계된다. 현재까지, 이 세포들은 비정상적 증식, 기형종 형성, 이식 거부, 또는 기타 원치않는 병리적 반응 없이, 두 환자 모두로 이식된 것으로 보인다. 지속적인 추적 및 추가 연구가 명시된다. 그러나, 궁극적인 치료 목표는 질병 과정의 보다 조기에 환자를 치료하여, 잠재적으로 광수용체 및 중심 시각 구제(central visual rescue)의 가능성을 높이는 것일 것이다.

실시예 2

이 실시예는 실시예 1과 관련된 추가적인 정보 및 방법을 제공한다.

임상적 hESC 마스터 세포 은행(hESC-MCB)(이로부터 실시예 1에서 사용된 세포가 제조됨)의 특징이 표 3에 표시된다.

표 3. MA09 hESC 마스터 세포 은행의 특성규명(characterization)

테스트	MCB 를 위한 테스트 방법	hESC MCB
무균성(Sterility)	USP <71> 접종 방법 (WuXi SOP 30744)	음성
마이코플라스마	Hoechst 염색을 이용한 간접 배양 및 직접 배양 (WuXi SOP 30055)	음성
레트로바이러스:	레트로바이러스의 검출을 위한 Mus dunni와 PG-4 (S⁺L^-) 세포의 공동 배양(WuXi SOP 30201)	음성
	PCR-기반 바이러스 역 전사효소 검출 (WuXi SOP 30357)	음성
	세포 형태의 초미세구조(ultrastructural) 전자현미경 관찰 및 바이러스 입자의 검출 (WuXi SOP 30610)	음성
세포에 대한 바이러스의 인 비트로 검출	MRC-5, VERO, NIH3T3 및 HeLa 세포와의 인큐베이션 (WuXi SOP 37000E) - 세포변성(cytopathic) 효과	음성
	- 혈구흡착반응(haemadsorption)	음성
	- 혈구응집반응(haemagglutination)	음성
불현성(inapparent) 바이러스의 인 비보 검출	유체(suckling) 및 성체 마우스로의 접종 (WuXi SOP 30194)	음성
	기니어 피그로의 접종	음성
	암탉 발육란(embryonated hen eggs)으로의 접종 - 요낭 및 난황낭 경로	음성
MVM(Minute virus of mice)	qPCR에 의한 MVM DNA의 검출 (WuXi SOP 30910)	음성
마우스 항체 생산	19종의 바이러스, LDHEV 및 LCMV에 대한 접종된 마우스의 항체 역가 (WuXi SOP 30001)	음성
XC 플라크(plaque) 분석	마우스 동종지향성(ectotropic) 바이러스의 인 비트로 검출 (연장된 지속 기간) (WuXi SOP 30024)	음성
소 바이러스	외래성(adventitious) 소 바이러스의 검출 (WuXi SOP 30236)	음성
돼지 바이러스	외래성 돼지 바이러스의 검출 (WuXi SOP 30129)	음성
B형 간염 바이러스	qPCR에 의한 HBV DNA의 검출 (WuXi SOP 32827)	음성
C형 간염 바이러스	qPCR에 의한 HCV RNA의 검출 (WuXi SOP 30730)	음성
헤르페스 심플렉스 6A 및 6B	qPCR에 의한 인간 HSV6A 및 HSV6B DNA의 검출 (WuXi SOP 30863)	음성
HIV(Human immunodeficiency virus) 타입 1	qPCR에 의한 HIV-1 DNA의 검출 (WuXi SOP 30768)	음성
HIV 타입 2	qPCR에 의한 HIV-2 DNA의 검출 (WuXi SOP 30798)	음성
HTLV(Human T-cell lymphotropic virus) 타입 1	qPCR에 의한 HTLV-1 DNA의 검출 (WuXi SOP 32491)	음성
HTLV 타입 2	qPCR에 의한 HTLV-2 DNA의 검출 (WuXi SOP 32492)	음성
hCMV(Human cyto-megalovirus)	qPCR에 의한 hCMV DNA의 검출 (WuXi SOP 30705)	음성
hEBV(Human Epstein Barr virus)	qPCR에 의한 hEBV DNA의 검출 (WuXi SOP 30713)	음성
인간 파보바이러스(parvovirus) B19	qPCR에 의한 인간 파보바이러스 B19 DNA의 검출 (WuXi SOP 30761)	음성
DNA 지문분석	STR(short tandem repeat) 프로파일 (CLG SOP 401)	예상된 패턴에 일치함
G-밴딩(banding)에 의한 핵형	20개의 G-밴딩(banded) 중기 세포의 세포 유전학 분석 (CLG SOP 100)	46, 정상 여성
FISH 분석	12번 및 17번 염색체에 대한 FISH에 의해 200개의 간기(interphase) 핵은 분석함 (CLG SOP 201)	정상 신호 패턴
hES 특이적 마커의 발현	hESC 마커 OCT -4, REX -1, NANOG 및 SOX -2 에 대한 qPCR(ACT Quality SOP-0022)	대조군 기준 은행 값의 1 log₁₀ 이내
망막 변성 유전자 돌연변이의 부재	PCR 및 서열분석에 의한 ABCA4 , ELOVL4 , VMD2 , RPE-65 및 CTRP5 유전자의 돌연변이형에 대한 스크리닝 (Ophthalmic Molecular Diagnostic Laboratory at the University of California)	돌연변이가 검출되지 않음
형태	세포 및 콜로니의 현미경 관찰 (ACT BR-009A)	hESC 형태와 일치함

마우스 배아 섬유모세포 (EF) 마스터 세포 은행

2003년 4월 산업 가이던스(Guidence for Industry) "Source Animal, Product, Preclinical, and Clinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans" 및 "Points to Consider on Xenogeneic Cell Therapy Medicinal Products" (EMEA/CHMP/CPWP/83508/2009)에 따라, MA09-hRPE 세포는 이 인간 세포가 인간 세포가 아닌 (마우스) 세포와 체외에서(ex vivo) 접촉했었기 때문에, 이종이식(xenotransplantation) 산물로 정의된다. Charles River Laboratories (Kingston Facility, Stoneridge, NY, USA)의 육종 콜로니(breeding colony)를 MEF 세포의 소스로 사용하였다. 이 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Care International) 공인 시설은 집중적인 건강 모니터링 하에 있는 장벽 실(barrier room)에 CD-1, SPC(Specific Pathogen Free)의 폐쇄 콜로니(closed colony)를 수용한다. 공여 동물을 교미시키고(time-mate) 임신 동안 분리시켰다. 희생 전 교미 후 21일 차에, 수의사가 모든 마우스를 대상으로 신체 건강 검진을 실시했다; 동물들을 안락사시키고, 백혈구와 혈장 제제(leukocyte and plasma preparation)를 기록보존하고 Charles River Laboratories, Wilmington, MA에 의한 마우스 병원체에 대한 혈청학적 검사 및 위해 각 공여 마우스로부터 혈액을 수집했다. 면허가 있는 수의 병리학자가 각 공여 동물의 사체 및 자궁에 대한 부검 및 각각의 한배에서 태어난 동물들(litter)로부터의 배아에 대한 부검을 실시했다. 각 동물로부터의 기관을 혈장 및 동결보존 백혈구와 함께 30년 이상 동안 기록보존(archive)했다(EMEA/CHMP/CPWP/83508/2009에 의해 요구되는 바와 같이). MEF를 단리하고, 전술된 바와 같은 배양물(Klimanskaya and McMahon, 2005)을 P1에서 동결시키고, P2에 미토마이신(Mitomycin) C 불활성화 후에 이용했다. 마우스 바이러스 및 기타 병원체를 도입할 위험을 최소화하기 위해, MEF를 WuXi AppTec, Inc에 의해 테스트하고 규명했다. hESC-MCB의 제조에서 사용된 로트 MEF-08 및 hRPE 임상 로트의 테스트에 대한 사양(specification) 및 결과가 표 4에 제시된다.

표 4. MEF 마스터 세포 은행의 특성 규명

테스트	방법	사양( Specification )	로트 MEF -08
무균성	USP - 접종 방법 (WuXi SOP 30744)	음성	음성
마이코플라스마	Hoechst 염색을 이용한 간접 배양 및 직접 배양 (WuXi SOP 30055)	음성	음성
레트로바이러스:	레트로바이러스의 검출을 위한 Mus dunni와 PG-4 (S⁺L^-) 세포의 공동 배양 (WuXi SOP 30201)	음성	음성
	PCR-기반 바이러스 역 전사효소 검출 (WuXi SOP 30357)	음성	음성
	세포 형태의 초미세구조 전자현미경 관찰 및 바이러스 입자의 검출 (WuXi SOP 30610)	음성	음성
세포에 대한 바이러스의 인 비트로 검출	MRC-5, VERO, 및 NIH3T3 세포와의 인큐베이션 (WuXi SOP C30177) - 세포변성 효과	음성	음성
	- 혈구흡착반응	음성	음성
	- 혈구응집반응	음성	음성
불현성 바이러스의 인 비보 검출	유체 및 성체 마우스로의 접종 (WuXi SOP 30194)	음성	음성
	기니어 피그로의 접종	음성	음성
	암탉 발육란으로의 접종 - 요낭 및 난황낭 경로	음성	음성
MVM(Minute virus of mice)	qPCR에 의한 MVM DNA의 검출 (WuXi SOP 30910)	음성	음성
마우스 항체 생산	19종의 바이러스, LDHEV(lactate dehydrogenase elevating virus) 및 LCMV(lymphocytic choriomeningitis virus)에 대한 접종된 마우스의 항체 역가 (LCMV) (WuXi SOP 30001)	음성	음성
인 비트로 종양형성	소프트 아가(soft agar)에서의 콜로니 형성 (WuXi SOP 30006)	음성	음성
세포 계통 ID 테스트	동종효소 전기영동 이동성 프로파일 (WuXi SOP 30330)	마우스 동종효소(isoenzyme)	마우스 세포의 대표적인 동종효소 패턴
XC 플라크 분석	마우스 동종지향성 바이러스의 인 비트로 검출 (연장된 지속 기간) (WuXi SOP 30024)	보고 결과	양성: 동종지향성 MuLV 검출¹
MEF 성능 검증(qualification)	MEF가 배양물에서 MA-09 hES 세포의 성장 및 속성을 지지하는 능력의 테스트 (ACT SOP QCS-0004)	대조군 MEF에 유사함	통과

¹마우스 세포주는 내재적으로 감염성 마우스 레트로바이러스를 생성할 수 있고, MEF에 의해 생산된 MuLV(murine leukaemia) 비리온은 비-감염성(non-infectious)이고, 인간 세포에 대해 복제 불능(replication incompetent)이라는 것을 나타내는 증거가 제시되었다(Amit et al 2004).

인간 DNA를 위한 DNA Q-PCR

마우스 조직에서 인간 DNA 함량의 검출은 150,000 개의 마우스 세포당 1개의 인간 세포의 민감도를 갖는, Alu Y 서열에 대한 Taqman 분석법을 이용하여, AltheaDX, Inc., San Diego, CA에 의해 수행되었다.

표 5. RPE 세포 특성 규명 및 안전성 테스트

테스트	사양( Specification )	로트 0211-B1A
무균성	음성	음성
마이코플라스마	음성	음성
세포 밀도(cell density)	1-2 백만개 생 세포/mL (희석 후)	2 x 10⁶개 생 세포/mL
세포 생존력(viability)	최종 회수: > 85%	99%
	해동-후: >70%	95%
형태	융합된, 자갈 상피(cobblestone epithelium), 중등도 착색(medium pigmentation)	통과
핵형	46, XX, 정상	46, XX, 정상
DNA 지문분석	hESC MCB와 일치함	일치
BEST -1 RPE -65 PAX6 MITF:에 대한 hRPE mRNA	hESC 대비 최소 1 log₁₀ 상향-조절	BEST-1 3.81 RPE-6 1.32 PAX6 2.80 MITF 2.89
OCT -4 NANOG SOX -2:에 대한 hESC mRNA	hESC 대비 하향 조절 (log₁₀): OCT -4 ≤ -2.13 NANOG ≤ -1.95 SOX -2 ≤-0.63	OCT-4 -3.18 NANOG -2.49 SOX-2 -2.07
베스트로핀 염색에 의한 성숙도(maturity)	> 70% 염색	71%
면역염색에 의한 순도	> 95% PAX6 및/또는 MITF	100%
	> 95% PAX6 및/또는 베스트로핀	100%
	> 95% ZO-1	100%
hESC 단백질 마커	조사된 9백만개의 세포 중 OCT-4 및 AP에 의한 2개 미만의(< 2) 세포 염색	0
잔류(residual) 마우스 DNA	음성	음성
MAP에 의한 마우스 바이러스	음성	음성
Mus dunni 공동-배양에 의한 레트로바이러스	음성	음성
동종지향성 마우스 바이러스	음성	음성
내독소	< 0.50 EU/mL	0.312 EU/mL
식세포 작용에 의한 효능(potency)	양성	양성

세포의 면역염색(Immunostaining of Cells)

4-웰 또는 6-웰 플레이트 중 세포를 10분 동안 PBS 중 2% 파라포름알데히드 (Electron Microscopy Sciences)로 고정시키고, PBS 중 0.1% NP-40 대체물(substitute)(Sigma) 중에서 10분 동안 침투성(permeabilization)을 위해 인큐베이션하고, PBS 중 10% 염소 혈청으로 1시간 이상 동안 블록킹(block)시키고, 일차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포를 0.1% Tween/PBS로 3 x 15분 세척하고, 실온(RT)에서 1시간 동안 이차 항체와 인큐베이션시키고, 전술된 바와 같이 세척하고, DAPI를 갖는 Vectashield(Vector laboratories, Burlingame, CA)를 이용하여 올렸다(mount). 염색된 세포를 도립 형광 현미경(inverted fluorescence microscope)(Nikon)을 이용하여 관찰했다. 사용된 항체는 다음과 같았다: 베스트로핀 (Novus Biologicals), Pax6 (Covance), MITF (Abeam), ZO-1-FITC (Invitrogen), Oct-4 (Santa Cruz Biotechnologies), 항-마우스-Alexa594 (lnvitrogen), 항-토끼-FITC (Jackson Immunoresearch), 항-마우스-Alexa-488 (Invitrogen), 항-토끼-Alexa-594 (Invitrogen). 알칼리 포스파타아제 활성은 Vector blue 키트(Vector Laboratories)를 이용하여 검출했다.

마우스 조직 절편의 면역염색

탈파라핀(deparaffinized) 절편을 항원 회복(antigen retrieval)(베스트로핀 및 인간 미토콘드리아)을 위해 스티머(steamer) 중 0.1M 시트레이트 완충액(pH 6.0)에서 40분 동안, 또는 Ki67을 위해 압력 쿠커(pressure cooker)에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 전술된 바와 같이, 항체 염색을 수행하였으나, Vector (Burlingame, CA)로부터의 키트를 이용하여 내생 비오틴을 블록킹시킨 후 일부 경우에 비오틴-접합 이차 항체를 사용했다. 사용된 항체는 항-베스트로핀(Abeam, rabbit), 항-인간 미토콘드리아(마우스, Spring Bioscience), 항-ki67 (토끼, Abeam)이었다. 이차 항체는 항-마우스 비오틴, 항-마우스-Cy3 (Jackson Immunoresearch), 항-토끼-Alexa488 (Invitrogen)이었고, 스트렙타비딘-Cy3은 Jackson Immunoresearch로부터 수득했다. hESC에 의해 형성된 마우스 기형종(teratoma)의 절편을 항-인간 미토콘드리아 및 Ki67을 위한 양성 대조군으로 이용하고, 고정되고 파라핀에 포매된 hRPE 펠릿의 절편을 베스트로핀을 위한 양성 대조군으로 이용했다. 음성 대조군은 마우스 토끼 및 마우스 IgG (Novus Biologicals)였다.

q-RT-PCR

Qiagen의 RNeasy RNA 단리 키트를 이용하여 세포 혼합물로부터 RNA를 추출하여, 시료당 30 ㎕ RNA의 최종 부피를 얻었다. 그 후, Qiagen의 Quantitect cDNA 합성 키트를 이용하여 10 ㎕의 RNA로부터 cDNA를 합성하여, 최종 부피 20 ㎕의 cDNA를 수득했다. 그 후, 1 ㎕의 cDNA를 3개의 재현물(triplicate replicates)로 상대적 유전자 발현에 대해 테스트하고, 각 시료에 존재하는 베타 액틴 신호로 정규화시켰다. 제조사의 비교를 위한 Ct 상대적 정량을 위해 권장된 사이클 조건에 따라 Life Technologies의 TaqMan 유전자 발현 분석법 및 소프트웨어 버전 2.1을 갖는 Applied Biosystems StepOne Plus를 이용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행했다. hES 마커: Nanog, OCT4 및 SOX2와 hRPE 마커: RPE-65, PAX-6, ITF 및 베스트로핀에 대한 qRT-PCR 분석을 제로 설정 포인트(zero set point)로 작용한 100% hES 세포 시료에서 관찰된 발현의 수준으로 정규화시켰다(RQ = 상대적 정량(Relative Quantitation)). 상대적 유전자 발현을 3개의 재현물에서 분석하고, 각 시료에 존재하는 베타 액틴 신호로 정규화시켰다. 데이터는 3개의 재현물에 대한 평균+/-SD로 표현된다.

식세포 작용 분석(Phagocytosis Assay)

세포내 식포(phagosome)의 감소된 pH 환경에 내재화되는 경우 형광을 내는 pHrodo™ 대장균 형광 바이오입자(bioparticle)(Invitrogen)를 이용한 FACS-기반 분석법에 의해 식세포 작용을 평가한다. 제조사의 설명서에 따라 바이오입자를 제조했다. 융합된 RPE를 CO₂-독립적 배지(Invitrogen) 중에서 4-웰 플레이트의 1개의 웰당 50-200㎕ 바이오 입자와 37℃에서 16-20 시간 동안 인큐베이션시켰다. 음성 대조군 플레이트는 4℃에서 인큐베이션시켰다. 현미경 하에서 세포를 조사하고, 트립신 처리하여 회수하고 FACS에 의해 분석하여 C6 Flow Cytometer 상에서 10,000건의 이벤트를 계수하였다.

멜라닌 결정

RPE 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 160 X G에서 원심분리하고, 혈구계수기 세포 계수를 위해 시료를 채취했다. 펠릿을 1N NaOH에 재현탁시키고, 80℃까지 10분 동안 가열하고, 볼텍싱하고, 5 내지 180 ㎍/mL 범위의 합성 멜라닌(Sigma Cat# 8631) 표준 곡선 대비 475 nm에서 흡광도를 측정했다. 시료를 3배수로(triplicate)로 평가하고 데이터를 추출된 총 세포 수로 정규화시켰다.

표 6. NIH-III 마우스의 망막하 공간에서 RPE의 생존율

하기 표 6의 데이터는 3개의 연구로부터 합쳐졌다: 1) 100,000개의 hES-RPE를 눈에 주사하고, 동물을 4, 12, 및 40주에 희생시킨 것인 종양형성(tumorigenicity) 연구, 2) 0.01%, 0.1%, 및 1%의 다능성 hES 세포가 스파이킹된 100,000개의 hES-RPE를 눈에 주사하고, 동물을 2개월 및 9개월에 희생시킨 것인 스파이킹(spiking) 연구, 및 3) 50,000개 및 100,000개의 hES-RPE를 눈에 주사하고, 동물을 1, 3, 및 9개월에 희생시킨 것인 조직 분포(tissue distribution) 연구. 이 표는 인간 DNA에 대한 전 눈(whole eye)의 Q-PCR 및 인간 미토콘드리아에 대한 파라핀 절편의 면역염색에 의해 수득된 데이터를 포함한다.

생존 시간 (주)	동물의 총 수	눈에서 인간 세포가 확인된 동물의 수	눈에 생존한 인간 세포를 갖는 동물의% Eye
4	26	26	100%
8	19	19	100%
12	28	28	100%
36-40	52	48	92%

표 7. AMD 연구를 위한 포함/배제 기준

포함( INCLUSION ) 기준

·55세 초과의 성인 남성 또는 여성.
·환자는 합리적으로 치료 후 4년 이상 생존을 예상할 수 있을 정도로 충분히 우수한 건강 상태에 있어야 함.
·　중심와를 포함하는 지도상 위축증(geographic atrophy)(the Age-Related eye Disease Study [AREDS]에서 정의된 바와 같음)의 >250microns의 하나 이상의 영역의 증거를 갖는 진행된 건성 AMD와 일치하는 임상적 소견.
·생체현미경검사, OCT, 및 FA에 의해 관찰된 RPE의 약화(attenuation) 또는 상실로 정의된 GA.
·현재 또는 이전의 맥란막 혈관신생의 증거 부재
·이식물을 받은 눈의 시력이 20/400 이하(no better than 20/400)일 것임.
·이식물을 받지 않은 눈의 시력이 20/400 이상(no worse than 20/400)일 것임.
·진행된 건성 AMD와 일치하는 전기생리학적 소견(electrophysiological findings)
·유리체 절제술 및 망막하 주사를 받기에 의학적으로 적절함.
·필요한 경우, 전신 마취 또는 각성 진정(waking sedation)을 위해 의학적으로 적절함.
·　배아 줄기세포주의 이식을 위해 의학적으로 적절함:

정상 범위에서 약간 벗어나는 측정값(laboratory value)은 임상적 유의성을 결정하기 위해 Medical Monitor and Investigators에 의해 검토될 것임. 임상적으로 유의하지 않은 것으로 결정되는 경우, 그 환자는 본 연구에 등록될 수 있음.
· 　혈청 화학(Normal serum chemistry) (순차적 멀티-채널 분석기 20 [SMA-20]) 및 혈액학 (CBC(complete blood count), PT(prothrombin time), 및 aPTT(activated partial thromboplastin time]) 스크리닝 테스트 정상. (주의: 배제 기준(exclusion criteria)에서 구체적으로 표시된 이상(abnormalities)은 예외로 함)
· 약물 남용에 대한 소변 스크린 음성.
· HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B), HCV(hepatitis C) 혈청학적 검사 음성.
· 악성 종양(malignancy) 이력 부재(성공적으로 치료된(절제된) 기저세포암[피부암] 또는 성공적으로 치료된 피부의 편평세포 암은 예외로 함).
· 최근 6개월 내 암 스크리닝 음성:
· 완전한 이력 및 신체 검사(history & physical examination);
· 악성 병변에 대한 피부과학적 스크리닝 검사;
· 대변 잠혈 반응 검사 음성 & 최근 7년 내 대장내시경 음성;
· 흉부 x-선(CXR) 음성;
· CBC & 수기 감별(manual differential) 정상;
· 요검사(U/A) 음성;
· 갑상선 검사 정상;
· 남성인 경우, 고환 검사 정상; DRE(digital rectal examination) 및 PSA(prostate specific antigen) 정상;
· 여성인 경우, 파파니콜로 도말표본(Papanicolaou smear)에 의한 골반 검사 정상; 및
· 여성인 경우, 임상적 유방 검사 정상 및, 유방 조영상(mammogram) 음성.

·여성이고, 가임기인 경우, 연구 동안 2개의 유효한 형태의 피임법을 사용할 용의가 있음.
·남성인 경우, 연구 동안 배리어(barrier) 및 살정자성 피임약을 사용할 용이가 있음.
·모든 미래의 혈액, 혈액 성분 또는 조직 공여를 미룰 용의가 있음.
·사전 동의을 이해하고 서명할 용의가 있음.

배제( Exclusion ) 기준
·　　　 활성 또는 비활성 CNV의 존재.
·　　　　망막이영양증, 망막색소변성증, 맥란막염, 중심성 망맥락막염, 당뇨망막병증, 또는 AMD가 아닌 기타 망막 혈관 또는 변성 질환의 존재 또는 이력.
·　　　시각 신경병증의 이력.
·　 AMD가 아닌 다른 원인에 의한 황반 위축증(macular atrophy).
·　　 연구 대상 눈에 녹내장 시각 신경병증, 비제어 IOP의 존재, 또는 IOP를 제어하기 위한 둘 이상의 작용제(아세토졸라미드, 베타 차단제, 알파-1-효능제, 안티프로스타글란딘, 탄산 탈수소효소 억제제(anhydrous carnonic inhibitor) 의 사용.
·　　 1년 내에 외과적 추출을 필요로 할 것으로 보이는 충분한 중증도의 백내장.
·　　　연구 대상 눈에서 망막 박리 치료의 이력.
·　　　-8 디옵터보다 높은 축성 근시
·　　　28 mm보다 긴 안축장 길이.
·　　　악성 종양의 이력 (성공적으로 치료된(절제된) 기저세포암[피부암] 또는 성공적으로 치료된 피부의 편평세포 암은 예외로 함).
·　　　최근 12개월 내에 심근경색증의 이력.
·　　　당뇨병의 이력.
·　　　사전 동의 과정에 참가하고 적절하게 평가를 완료할 환자의 능력에 영향을 미칠 수 있는 인지 손상 또는 치매의 이력.
·　　　면역결핍증.
·　　　간헐적, 또는 저용량 코르티코스테로이드가 아닌, 현재의 면역억제 치료법.
·　　　알라닌 트랜스아미나아제/아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (ALT/AST)가 정상 또는 공지된 간 질환의 상한의 1.5배보다 높음( >1.5 times) .
·　　　크레아틴 수준 >1.3 mg/dL에 의해 정의된 신기능 부전.
·　　　연구 개시 시, 10gm/dL 미만의 헤모글로빈 농도, 100k/mm³ 미만의 혈소판 수 또는 1000/mm³ 미만의 절대 호중구수.
·　　　HPV(Hepatitis B), HCV(Hepatitis C), 또는 HIV에 의한 감염의 혈청학적 증거.
·　　　다른 임상 시험에 참여 중임.
·　　　최근 6개월 내에 안구 또는 전신 투여에 의한 임상 시험에 참여함.
·　　　기타 시력을 위협하는 안 질환(sight-threatening ocular disease).
·　　 망막혈관 질환의 이력(약화된 혈액-망막 장벽).
·　　 녹내장.
·　 포도막염 또는 기타 안구내 염증 질환.
·　　 중대한 렌즈 불투명성 또는 기타 매체 불투명성(media opacity).
·　　　최근 3개월 내 접안 렌즈(ocular lens) 제거.
·　　　최근 3개월 내 연구 대상 눈에서 안과 수술
·　　　여성의 경우, 임신 또는 수유.
·　　　조사자의 판단에 따라, 환자가 프로토콜을 준수하는 능력을 방해하고, 환자의 안전을 약화시키거나 또는 연구 결과의 해석을 방해할 기타 질환.

표 8. SMD 연구를 위한 포함/배제 기준

포함 기준

·　　 18세 초과의 성인 남성 또는 여성.
·　　진행된 SMD의 임상적 진단.
　·　　알려진 경우, 환자의 유전형이 의료 기록에 기록될 것이고, 알려지지 않은 경우, 환자는 유전형 분석을 위한 시료의 제공을 허용할 것임. SMD와 일치하는 임상적 소견.
· 이식을 받을 눈의 시력은 손 동작(hand movement)보다 더 좋지 않을 것임.
·　　이식물을 받지 않은 눈의 시력은 ETDRS(Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study) 24개의 문자(20/320)보다 더 좋지 않을 것임.
· 표준 시야 검사에서 주변 시야 수축(peripheral visual field constriction)이 기록됨.
· SMD와 일치하는 전기생리학적 소견.
· 유리체 절제술 및 망막하 주사를 받기에 의학적으로 적절함.
· 필요한 경우, 전신 마취 또는 각성 진정(waking sedation)을 받기에 의학적으로 적절함.
· 배아 줄기세포주의 이식을 위해 의학적으로 적절함:
· 　 혈청 화학(Normal serum chemistry) (순차적 멀티-채널 분석기 20 [SMA-20]) 및 혈액학 (CBC(complete blood count), PT(prothrombin time), 및 aPTT(activated partial thromboplastin time]) 스크리닝 테스트 정상.
· 약물 남용에 대한 소변 스크린 음성.
· 　 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B), HCV(hepatitis C) 혈청학적 검사 음성.
· 악성 종양 이력 부재.
· 최근 6개월 내 암 스크리닝 음성:
· 완전한 이력 및 신체 검사;
· 악성 병변에 대한 피부과학적 스크리닝 검사;
· 대변 잠혈 반응 검사 음성 & 50세 이상인 경우, 최근 7년 내 대장내시경 음성;
· 　　　　 흉부 x-선(CXR) 음성;
· 　　　 CBC & 수기 감별(manual differential) 정상;
· 　　　 요검사(U/A) 음성;
· 　　 갑상선 검사 정상;
· 　　　 남성인 경우, 고환 검사 정상; 40세 이상인 경우,　DRE(digital rectal examination) 및 PSA(prostate specific antigen) 정상;
· 　　　 여성인 경우, 파파니콜로 도말표본에 의한 골반 검사 정상; 및
· 　　 여성인 경우, 임상적 유방 검사 정상 및 40세 이상인 경우, 유방 조영상 음성.

· 여성이고, 가임기인 경우, 연구 동안 2개의 유효한 형태의 피임법을 사용할 용의가 있음.
· 남성인 경우, 연구 동안 배리어(barrier) 및 살정자성 피임약을 사용할 용이가 있음.
· 모든 미래의 혈액, 혈액 성분 또는 조직 공여를 미룰 용의가 있음.
· 사전 동의을 이해하고 서명할 용의가 있음

배제 기준
· 악성 종양의 이력.
·　　최근 12개월 내에 심근경색증의 이력.
·　 당뇨병의 이력.
·　　면역결핍증.
·　　간헐적, 또는 저용량 코르티코스테로이드가 아닌, 현재의 면역억제 치료법.
·　 HPV(Hepatitis B), HCV(Hepatitis C), 또는 HIV에 의한 감염의 혈청학적 증거.
·　　다른 임상 시험에 참여 중임.
·　　최근 6개월 내에 안구 또는 전신 투여에 의한 임상 시험에 참여함.
·　　기타 시력을 위협하는 안 질환(sight-threatening ocular disease).
·　　만성 안과 약물 치료(chronic ocular medications).
·　　망막혈관 질환의 이력(약화된 혈액-망막 장벽).
·　　녹내장.
·　　포도막염 또는 기타 안구내 염증 질환.
·　　중대한 렌즈 불투명성 또는 기타 매체 불투명성.
·　　최근 3개월 내 접안 렌즈(ocular lens) 제거.
·　　여성의 경우, 임신 또는 수유.
·　　조사자의 판단에 따라, 환자가 프로토콜을 준수하는 능력을 방해하고, 환자의 안전을 약화시키거나 또는 연구 결과의 해석을 방해할 기타 질환.

실시예 3

정확한 용량 전달을 보장하기 위한 세포 밀도의 조정

본 연구는 생 RPE의 전달에 대한 로딩(loading) 및 주사 과정의 단계들의 영향의 결정을 설명한다. 구체적으로, 이 실시예에서, 로딩 및 주사 과정은 생 세포의 일부 상실을 초래하고, 이 상실은 용이하게 측정될 수 있고(전달 프로토콜에 따라, 예를 들면, 사용된 특정한 주사 캐뉼라에 따라 다를 수 있고), 이 상실은 세포의 농도를 증가시켜, 예상되는 수의 세포의 전달을 가능하게 하는 것에 의해 해소될 수 있다는 것을 확인하였다. 추가적으로, 세포 접종(cell seeding) 및 성장은 로딩 및 두 개의 캐뉼라를 통한 압출 후 유의성 있게 불리하게 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.

이 연구는 하기를 포함하는 전체 로딩 및 주사 과정을 포함했다: (1) 주사될 원하는 세포의 밀도를 수득하기 위해 2000개 생 세포/㎕의 농축된 최종 산물 RPE 세포로의 차가운 BSS-Plus의 최종 첨가. (2) 1 ml 주사 시린지 (BD LUER-LOK ™에 부착된 18g 평활 충진 니들(blunt fill needle) (BD)을 이용한 RPE 세포와 BSS-Plus의 부드러운 혼합. (3) 충진된 시린지로부터 주사 캐뉼라를 통한 150 ㎕의 제제화된 RPE 세포의 압출.

얼음 상에서 Alcon BSS BSS-Plus(R) 중 RPE 세포의 유지는 세포가 1000 세포/㎕ 이상의 농도로 제제화된 경우, 4시간에 걸쳐 일정한 것으로 입증되었다. 이러한 조건 하에서, 생 세포 수의 검출가능한 상실은 없다. 세포 온전성(integrity)을 보장하기 위해, 정확한 부피의 RPE 최종 산물 세포가 2000개 생 세포/㎕로 수술실로 전달될 것이다. RPE 세포의 각 튜브는 주사 직전에 상기 세포에 첨가되고 혼합될 정확한 부피의 차가운 BSS-Plus를 담은 제2 튜브를 동반할 것이다. 미리 분주된 RPE 세포 및 BSS-Plus는 멸균 미량원심분리기(microcentrifuge) 튜브로 2 내지 8℃에서 OR로 전달될 것이다.

연구 1- MEDONE POLYTIP(R) Cannula 23/38

의도된 임상적 RPE 로트에 특징이 유사한 RPE 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이, 해동시키고, 처리하고, 차가운 BSS-Plus 중에 제제화시켰다. 총 410만개의 생 세포를 해동 및 제제화 후에 회수했다. 출발시 생존력(starting viability)은 91%였고, 해동 및 제제화 후 회수된 세포의 수는 이 로트에 대해 전형적이었다. 세포를 차가운 BSS-Plus 중 표시된 출발 농도까지 희석하고 얼음 상에 보관하였다. 그 후, 세포를 1 ml 주사 시린지 (BD LUER-LOK ™에 부착된 18g 평활 충진 니들(BD)을 이용하여 온건하게 분쇄시켰다(triturate). 약 200 ㎕의 세포를 충진 니들을 통해 시린지로 전달했다. 충진 니들을 제거하고 MEDONE POLYTIP(R) Cannula 23/38을 세포를 담은 시린지에 부착시켰다. 시린지의 플런저를 가볍게 두드려서 150 ㎕의 세포를 주사 캐뉼라를 통해 투여했다. 총 주사 시간은 2 내지 3분이었다. 세포를 멸균 튜브에 수집하고 생 세포 수에 대해 평가했다.

연구 1은 로딩되고 MedOne 캐뉼라를 통해 압출된 RPE 세포가 테스트된 세포 밀도 범위(295 내지 1144 생 세포/㎕)에 걸쳐 전달된 세포 밀도의 예측가능한 감소를 초래한다는 것을 보여주었다. 생 세포 밀도의 평균 감소는 22.8 +/- 7.0%이었다 (N=6). 결과가 하기 표 9에 표시된다.

표 9. MEDONE POLYTIP (R) Cannula 23/38을 통한 전달 후 생 세포의 상실. 전달된 세포의 퍼센트의 평균 감소는 22.8 +/- 7.0% 생 세포/㎕였다(N=6).

출발 세포/ ㎕	압출된 세포/ ㎕	로딩 및 캐뉼라 후 감소%
1144	883	23
830	615	26
668	495	26
532	440	18
335	296	12
295	199	32

주사 캐뉼라를 통해 전달된 세포의 수의 감소가 295 내지 1144개 생 세포/㎕ 범위의 테스트된 모든 세포 밀도에서 관찰되었다. 세포 밀도의 퍼센트 감소는 일반적으로 테스트된 범위에 걸쳐 일정한 것으로 보인다. 테스트된 두 개의 최저 밀도(199 및 296)에서 관찰된 퍼센트 감소는 보다 가변적이고, 아마도 세포 계수의 정확도는 이러한 더 낮은 세포 밀도라는 것을 반영한다.

MedOne 캐뉼라를 통해 압출된 세포, 제제화되었으나, 캐뉼라를 통해 압출되지 않은 대조군 세포를 원심분리하고, PE 성장 배지에 재현탁시키고, 젤라틴 코팅된 전체 영역 96-웰 플레이트(gelatin-coated full area 96-well plate)에 웰당 10,000개의 세포로 접종하였다. 비교를 위해, 동일한 세포 제제의 소량(portion)씩 로딩하고 Synergetics 캐뉼라(39ga Rigid Micro Injection Cannula, Angled)를 통해 통과시키고 전술된 바와 같이 처리하고 접종했다. 접종 후 4일 차에, 세포를 트립신처리(trypsinize)하고 계수했다. 하기 표 10은 3회의 세포 계수에 대한 평균 세포 수 +/- SD를 보여준다.

표 10. 로딩 및 캐뉼라를 통한 압출 후 세포 접종 및 성장.

배양 4일 후 세포 수 (세포는 웰당 10,000개의 세포로 접종됨)
대조군 세포	20533 +/- 3085 (N=3)
Synergetics 압출	21047 +/- 1702 (N=3)
MedOne 압출	24460 +/- 5207 (N=3)

둘 중 하나의 캐뉼라를 통해 압출된 세포의 후속 접종 및 성장은 캐뉼라를 통해 압출되지 않은 대조군 세포와 유사했다.

연구 2- Synergetics, Inc. Injection Cannula, Angled, 39g

의도된 임상적 RPE 로트에 특징이 유사한 로트로부터의 RPE 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이, 해동시키고, 처리하고, 차가운 BSS-Plus 중에 제제화시켰다. 총 260만개의 생 세포를 해동 및 제제화 후에 회수했다. 출발시 생존력은 97%였고, 해동 및 제제화 후 회수된 세포의 수는 이 로트에 대해 전형적이었다. 세포를 차가운 BSS-Plus 중 375개 생 세포/㎕의 출발 농도까지 희석하고 얼음 상에 보관하였다. 그 후, 세포를 1 ml 주사 시린지 (BD LUER-LOK ™)에 부착된 18g 평활 충진 니들(BD)을 이용하여 온건하게 분쇄시켰다. 약 200 ㎕의 세포를 충진 니들을 통해 시린지로 전달했다. 충진 니들을 제거하고 Synergetics, Inc. 39ga Rigid Micro Injection Cannula, Angled를 세포를 담은 시린지에 부착시켰다. 시린지의 플런저를 가볍게 두드려서 150 ㎕의 세포를 주사 캐뉼라를 통해 투여했다. 총 주사 시간은 2 내지 3분이었다. 세포를 멸균 튜브에 수집하고 생 세포 수에 대해 평가했다. 일련의 8회 주사를 통해, 전달된 평균 생 세포는 238 +/- 25개 생 세포/㎕이거나, 또는 본 연구에서 최저 세포 용량에 대해 의도된 전달보다 약 100개의 생 세포가 더 적었다(눈당 50,000개의 세포).

따라서, 연구 2는 로딩되고 Synergetics 캐뉼라를 통해 압출된 RPE 세포가 최저의 의도된 세포 용량에서의 예측가능한 상실을 초래했다는 것을 보여준다(375개 생 세포/㎕의 로딩 밀도를 테스트함). 생 세포 밀도의 평균 감소는 38.4 +/-6.8%였다(N=8). 로딩 세포 밀도를 예상되는 상실을 보완하기 위해 증가시킬 수 있고, 따라서, 생 RPE의 의도된 수의 정확한 전달을 보장한다(예를 들면, 본 연구에서와 같이, 50,000개 세포/눈).

연구 3- MedOne POLYTIP(R) Cannula 23/38 및 Synergetics 39ga Rigid Micro Injection Cannula, Angled

연구 3은 전술된 실시예 1에서 환자 투여를 위해 사용된 RPE 로트로 수행했다. 이 연구에서, RPE 세포를 시린지로의 로딩 및 MedOne 캐뉼라를 통한 주사에서 예상되는 상실을 보완하기 위해 용량에서 전달까지(dose-to-delivery) 세포 밀도보다 25% 더 높은 수준으로 로딩시켰다. 동일한 25% 보완된 로딩 밀도를 Synergetics 캐뉼라를 테스트하기 위해 이용했다.

낮은 표적 용량보다 25% 더 높게 제제화된 세포로 로딩된 경우(333개 세포/㎕를 전달하기 위한 444개 생 세포/㎕), MedOne 캐뉼라는 336 +/- 40개 생 세포/㎕를 전달했다. 마찬가지로, 표적 용량보다 5% 더 높게 제제화된 세포로 로딩된 경우(1,333개 세포/㎕를 전달하기 위한 1776개 생 세포/㎕), MedOne 캐뉼라는 1433 +/- 187개 생 세포/㎕를 전달했다. Synergetics 캐뉼라를 이용한 최저 세포 용량 주사에 대한 결과는 100개 생 세포/㎕의 로딩 세포 밀도의 추가적인 증가가 낮은 밀도에서 표적 용량을 달성할 것이라는 것을 확인했다.

8개의 바이알(총 1600만 개의 세포)을 해동시키고 전술된 바와 같이 처리하고(3회의 원심분리), 모든 처리는 실온에서 수행했다. 수율은 95% 생존력에서 378만개의 세포였다(23.6% 회수율, 이전의 해동과 유사함). 세포를 차가운 BSS-Plus 중 200만개 생 세포/mL(2,000개의 생 세포/㎕)의 보관 및 수송 밀도까지 재현탁시키고 그 후, 얼음 상에서 유지시켰다. BSS-Plus 중 저온-보관(cold-storage) 동안 세포 생존을 촉진하기 위해 1백만 개 세포/mL보다 더 높은 세포 밀도를 선택했다. 총 177,600개의 생 세포를 포함하는 89 ㎕의 분량(alquot) 21개를 최종 산물 폐쇄 미세원심분리기 튜브로 분주했다.

시린지 로딩 및 캐뉼라를 통한 압출 시 최종 희석이 수행될 때까지 세포 분량(cell aliquot)을 얼음 상에 보관하였다. 저 용량 전달(50,000개 생 RPE/눈)을 위해, 차가운 BSS-Plus 311 ㎕를 세포를 담은 튜브에 분주하여 총 부피를 400 @ 444개 세포/㎕가 되게 했다. 이 밀도는 충전 니들에 의한 혼합, 시린지 로딩, 및 MedOne 캐뉼라를 통한 전달시 일어나는 예상되는 상실을 보완하기 위해 333개 세포/㎕의 의도된 전달 밀도보다 25% 더 높다.

고 용량 전달(200,000개 생 RPE/눈)을 위해, 두 개의 89 ㎕ 세포의 분량을 하나의 튜브로 합치고(pool)(356,000개 세포) 차가운 BSS-Plus 22 ㎕를 세포를 담은 튜브로 분주하여 최종 부피가 200 ㎕ @1,776개 세포/㎕가 되게 하였다. 이 밀도는 충전 니들에 의한 혼합, 시린지 로딩, 및 MedOne 캐뉼라를 통한 전달시 일어나는 예상되는 상실을 보완하기 위해 1,333개 세포/㎕의 의도된 전달 밀도보다 25% 더 높다.

희석된 세포를 담은 미세원심분리기 튜브의 캡을 덮고, 혼합을 촉진하기 위해 한 손가락으로 가볍게 두드렸다(tap). 평활 충진 니들(90 ㎕의 공 용적)을 1 mL BD 시린지에 부착시키고, 시린지와의 접촉을 최소화하도록 주의하면서, 세포를 평활 충진 니들에서 1 내지 2회 온건하게 분쇄시켰다. 시린지를 약 200 ㎕의 세포로 충진시켰다. 평활 니들을 제거하고 주사 캐뉼라(MedOne 38g 또는 Synergenic 39g)를 부착시켰다. 약 150 ㎕의 세포를 미세원심분리기 튜브로 분주했다. 각각의 분주된 분량을 트리판 블루 배제(exclusion)에 의해 세포 밀도 및 생존력에 대해 평가했다. 이 결과가 하기 표 11 및 12에 요약된다.

표 11. 재구성 및 MedOne 캐뉼라를 통한 전달의 RPE 세포 수 및 생존력에 대한 효과.

MedOne 캐뉼라
로딩 밀도 생 세포/㎕	표적 밀도 생 세포/㎕	전달된 평균 밀도 생 세포/㎕	퍼센트 생존력
444	333	336 +/- 40 (N=6)	95.2 +/- 3.2 (N=5)
1776	1333	1443 +/- 187 (N=3)	94.3 +/- 5.1 (N=3)

표 12. 재구성 및 Synergetics 캐뉼라를 통한 전달의 RPE 세포 수 및 생존력에 대한 효과.

Synergetics 캐뉼라
로딩 밀도 생 세포/㎕	표적 밀도 생 세포/㎕	전달된 평균 밀도 생 세포/㎕	퍼센트 생존력
444	333	232 +/- 238 (N=3)	89.0 +/- 9.6 (N=3)
1776	1333	1296 (N=1)	89 (N=1)

초기 로딩 밀도를 표적 용량보다 25% 증가시키는 것은 로딩 및 MedOne 캐뉼라를 통한 압출시 일어나는 세포 밀도의 상실을 효과적으로 보완했다. 투여될 최저 용량에서, MedOne 캐뉼라는 333개 생 세포/㎕의 표적화된 전달을 위해 336 +/-40 생 세포/㎕(N=6)의 평균 세포 밀도를 전달했다. 전달될 최고 세포 밀도(1333개 생 세포/㎕)에서, MedOne 캐뉼라는 1433 +/- 187개 생 세포/㎕를 전달했다(N=3).

MedOne 또는 Synergetics 캐뉼라를 통한 최저 용량 전달 후, 세포를 RPE 성장 배지에서 희석하고, 원심분리하고, 웰당 40,000개 세포로 젤라틴-코팅 전체-영역 96 웰 플레이트에 접종했다. 캐뉼라를 통해 압출된 세포와 동일한 튜브로부터 취해진 캐뉼라 주사되지 않은 대조군 세포를 동일한 방식으로 처리하고 접종했다. 접종 후 24 시간 경과시, 모든 세포는 부착했고, 테스트된 어느 조건 하에서도 세포 사망을 나타내는 부유 세포나, 손상된 접종 효율은 관찰되지 않았다.

MedOne 캐뉼라, Synergetics 캐뉼라를 통해 압출된 세포, 및 제제화되었으나, 어느 캐뉼라를 통해서도 압출되지 않은 대조군 세포를 원심분리하고, RPE 성장 배지에 재현탁하고, 웰당 40,000개 세포로 젤라틴-코팅 전체-영역 96 웰 플레이트에 접종했다. 접종 후 3일 차에, 세포를 트립신 처리하고, 계수했다. 하기의 표 13은 평균 세포 수 +/- SD를 표시한다. 이 결과는 후속 접종 및 성장이 캐뉼라를 통한 압출에 의해 부정적으로 영향받지 않았다는 것을 보여준다. 대조군 및 MedOne 캐뉼라-주사된 세포를 배양물로의 접종 후 2일 차에 현미경으로 조사했고 활발하게 분열되는 세포와 함께 전형적인 RPE 형태를 보였다. 대조군과 캐뉼라-주사된 세포 간에 차이는 관찰되지 않았다.

표 13. 로딩 및 캐뉼라를 통한 압출 후 세포 접종 및 성장.

배양 3일 후 세포 수 (세포는 웰당 40,000개의 세포로 접종됨)
대조군 세포	86117 +/ 3301 (N=3)
Synergetics 압출	98300 +/- 4554 (N=5)
MedOne 압출	82960 +/- 9368 (N=3)

요약하면, 차가운 BSS-Plus 중 RPE 세포는 1000개 세포/㎕보다 높은 농도에서 보다 안정하기 때문에, 최종 산물은 최종 산물 폐쇄 미세원심분리기 튜브에 2000개 세포/㎕로 차가운 BSS-Plus에 재현탁될 수 있어서, 캐뉼라가 150 ㎕ 부피 중 300,000개 세포 까지의 용량으로 로딩될 수 있게 한다. GMP 클린 룸에서 처리한 후, 2-8℃에서 두 개의 미세원심분리기 튜브가 수술실로 전달될 수 있다: 하나의 바이알은 2000개 생 세포/㎕로 정확한 부피의 RPE 세포를 담고 하나의 바이알은 세포의 밀도를 주사될 밀도(즉, 로딩 및 캐뉼라를 통한 압출 동안 생 세포의 상실을 고려한 밀도, 예를 들면, MedOne 캐뉼라에 의한 생 세포의 상실을 고려하기 위해 최종 표적화 용량보다 25%보다 더 높은 밀도)로 만들기 위해 세포에 첨가될 정확한 부피의 차가운 BSS-Plus를 담는다. 1,000개 세포/㎕보다 높거나 2,000개 세포/㎕보다 높은 농도가 캐뉼라에 로딩되는 경우, 희석 단계가 생략될 수 있고, 대신에, 세포는 원하는 농도로 차가운 BSS-Plus 중에 수술실로 전달될 수 있다.

MedOne 캐뉼라에 맞춤화된 제제화 로딩 밀도 및 상응하는 용량이 표 14에 표시된다. 유사한 맞춤화(customization)가 Synergetics 캐뉼라 또는 다른 캐뉼라 또는 전달 시스템에 대해 용이하게 결정될 수 있다.

표 14. 혼합, 로딩, 및 MedOne 캐뉼라에 의한 전달 동안 생 세포의 상실을 고려한, 생 RPE의 표적 용량을 전달하기 위해 이용된 로딩 세포 밀도.

로딩 밀도 생 세포/㎕	표적 밀도 생 세포/㎕	주사 부피	용량 생 세포
444	333	150 ㎕	50,000
888	666	150 ㎕	100,000
1333	999	150 ㎕	150,000
1776	1333	150 ㎕	200,000

실시예 4

ES 세포로부터의 RPE 분화

이 실시예는 hESC로부터 RPE의 분화를 설명한다. 결과적으로 수득된 RPE를 실시예 1에 기재된 연구에서 사용했다.

EB-DM(Embryoid Body Differentiation Medium)은 글루타맥스(Glutamax)로 보충된 Knockout™ DMEM, 비필수 아미노산, 2-머캅토에탄올, 및 Knockout™ Serum Replacement로 구성되고, 배상체 형성의 개시부터 착색된 패치가 회수되고, 분리될 때까지, 즉, 배상체 형성, 성장(outgrowth), 및 뒤이은 착색된 패치 형성 동안 사용되었다. EB-DM의 각 배치(batch)는 250 mL Knockout™ DMEM, 3 mL Glutamax-I, 3 ml 비필수 아미노산, 0.3 mL 2-머캅토에탄올 및 38 mL Knockout™ Serum Replacement로 구성된다.

RPE-GM/MM(RPE Growth/Maintenance Medium)은 일부분(one part)의 EB-DM (전 단락에서 기술된 바와 같은 EM-DM) 및 일 부분의 DMEM (고 글루코오스), FBS 및 Glutamax로 구성되었다. 이 배지는 착색된 패치로부터 RPE 세포의 유도(derivation) 후, 및 0 계대(passage)부터 2 계대까지의 후속 RPE 성장 및 유지 부터 최종 벌크 산물 회수까지 동안 사용했다. 각 배치의 RPE-GM/MM은 100 mL EB-DM, 90 mL DMEM 고 글루코오스, 10 mL 우태혈청 (FBS) (Hyclone), 및 1 mL Glutamax-I으로 구성되었다.

이 배지에서 유도되고 배양된 RPE 세포는 RPE의 분자 마커, 베스트로핀, CRALBP, RPE65, 및 PEDF를 발현하고, 식세포 작용을 할 수 있었고, RCS 랫트에서 시각 기능을 구제했다.

전술된 배지를 이용하여 생성된 RPE 로트는 형태학적 평가, 면역조직화학적 염색 및 RPE 유전자의 상향 조절 및 hES 세포 유전자 발현의 하향 조절에 대한 q-RT-PCR을 포함하는 모든 제조과정 품질 테스트(in-process quality testing)를 통과했다. 수율 및 세포 순도는 MDBK-GM 및 MDBK-MM 배지(Sigma Aldrich), OptiPRO-SFM, 또는 VP-SFM을 이용하여 이전에 제조된 RPE 세포와 비슷하다.

배상체 형성시부터 착색된 패치의 회수 시점까지 (MDBK-GM 또는 OptiPRO-SFM 대신) EM-DM을 이용하여 RPE의 로트를 제조했다. 착색된 패치의 회수 및 트립신 처리 후, 계대 0, RPE 세포를 뒤이어 RPE-GM(앞서 정의된 바와 같은 EGM-2 배지)에 접종하고 그 후, MDBK-MM 또는 VP-SFM 대신에, RPE Growth/Maintenance Media로 교체했다.

대안적으로, RPE를 직접 RPE-GM/MM에 접종하고, 계대의 전체 지속 기간 동안 성장 및 분화될 수 있게 할 수 있다. 적절한 수준의 분화가 관찰된 후, 계대 0 RPE 세포를 회수하고, 계대 2에서 벌크 산물의 최종 수집 및 동결보존시까지 이 배지에서 2회 더 분열(split)시켰다.

하기 데이터는 배상체 형성 시부터 착색된 패치의 회수 시점까지 EB-DM에서 유지한 RPE의 5개의 서브로트(sublot)에 대한 제조 과정 테스트의 요약을 보여준다. 이때, 착색된 패치를 상이한 일자에 상이한 웰로부터 회수하고, 트립신 처리하고, 계대 0 RPE로 접종했다. 로트 B1A, B2A 및 B2B를 융합(confluent)될 때까지 EGM-2 배지에 접종했고, 뒤이어 계대 0, 1, 및 2 동안 분화를 촉진하기 위해 RPE Grwoth/Maintenance Media로 교체했다. 로트 B3B 및 B3A를 계대의 전체 지속기간 동안 RPE-GM/MM에서만 유지된 것인 계대 1 또는 2를 제외하고는 동일하게 처리했다. 따라서, 모든 로트를 융합(confluence)에 도달한 후 적절한 수준의 분화가 관찰될 때까지 RPE-GM/MM에서 유지시켰다. 계대 2의 종료 후에, RPE 세포를 벌크 산물로 동결보존했다. 초기 성장기 동안 EGM-2에서 유지되고, 뒤이어 RPE-GM/MM으로 교체하거나 여러 계대의 전체 지속 기간 동안 RPE Growth/Maintenance Media에서 유지시킨 로트는 EGM-2 배지에서 관찰된 약간 더 빠른 성장 속도를 제외하고는 유사했다. 모든 로트는 계대 0, 1, 및 2에 형태학적 평가를 통과했고, 전형적인 상피, 자갈 형태 및 중등도의 착색을 포함한 사양(specification)을 통과했다. RPE 마커 발현은 하기의 일차 항체를 이용하여 간접적 면역형광(indirect immunofluorescence)에 의해 검출했다 (희석은 약 1:100 내지 1:1000이었고, 각 항체 배치에 대해 경험적으로 결정했다): 베스트로핀-마우스 단일클론; Novus Biologicals (# NB 300-164); PAX6-Covance, 토끼 다중클론(PRB-278P); ZO-1-Invitrogen; 마우스 단일클론(339100); ZO-1-Invitrogen; 토끼 다중클론 (61-7300); ZO-1-FITC-Invitrogen; 마우스 단일클론(339111); MITF-마우스 단일클론, Abeam (ab3201).

이차 항체는 블록킹 용액 중 1:500 희석율(또는 표시된 바와 같은 다른 희석율)로 사용했고 하기와 같았다: Alexa Fluor 488 항-마우스, Invitrogen # A 11001; Alexa Fluor 488 항-토끼, Invitrogen # A11008; Alexa Fluor 594 항-마우스, Invitrogen # A11032; Alexa Fluor 594 항-토끼, Invitrogen # A11012; 염소 항-마우스 Cy3-접합 (Jackson Immunoresearch Cat. # 115-165-146), 1:200으로 사용함.

PAX6와 MITF의 조합; 베스트로핀과 PAX6의 조합; 및 ZO-1 단독에 의해 순도를 평가하기 위해 RPE 마커의 면역염색을 수행했다.

면역염색은 RPE 세포의 제조 동안 4개의 시점에 수행했다: (1) 계대 1의 회수 및 계대 2의 접종 전에, RPE를 베스트로핀, PAX6 및 ZO-1에 대해 염색했다; (2) 계대 2의 회수 및 동결보존 전에, RPE를 베스트로핀, PAX6 및 ZO-1에 대해 염색했다; (3) 실시예 1에 기재된 바와 같이, RPE 벌크 산물을 해동시키고 제제화하고, BSS-Plus에 1,000개 생 세포/㎕로 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 RPE-GM으로 희석시키고, 1000 RPM으로 원심분리하고, 재-현탁시키고, 웰 당 100,000-300,000개 세포로 젤라틴 코팅된 4-웰 플레이트에 접종하고, 1 내지 2일 동안 인큐베이션하고 MITF 및 PAX6으로 염색했다; (4) 실시예 1에 기재된 바와 같이, RPE 벌크 산물을 해동시키고 제제화하고, BSS-Plus에 1,000개 생 세포/㎕로 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 RPE-GM으로 희석시키고, 1000 RPM으로 원심분리하고, 재-현탁시키고, 웰 당 50,000-200,000개 세포로 젤라틴 코팅된 4-웰 플레이트에 접종하고, 염색 전에 융합에 도달할 때까지 유지시켰다. 이때, 배양물을 RPE-MM으로 전환시키고, 중등도의 착색 및 자갈 형태가 관찰될 때까지 유지하고, 배양물을 PAX6, 베스트로핀 및 ZO-1에 대해 염색했다. 요약하면, 세포를 Ca2+, Mg2+(Gibco # 14190)를 포함하지 않는 PBS로 2 내지 3회 세정하고, 2% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시키고, PBS로 2회 세정하고, PBS 중 0.1% NP-40 Substitute 용액(Sigma # 74388)과 15분 동안 인큐베이션하고, PBS로 2회 세정하고, 30분 내지 밤새, 블록킹 용액 (10% Normal Goat Serum (Jackson Immunoresearch # 005-000-121), PBS 중 2%의 작업 농도(working concentration)(새로 만들거나 또는 동결된 분량)로 준비된 16% 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences #15710))과 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포를 블록킹 용액 중 일차 항체(상이한 종으로부터의 일차 항체를 이용하여, 웰 당 최대 2종의 항체)와 인큐베이션시키고, 실온에서 1 내지 2시간 인큐베이션시키거나 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션시키고, PBS로 세정하고, PBS-Tween 용액(Ca2+, Mg2+(Gibco # 14190)를 포함하지 않고 0.5% Tween-20 (Sigma # P7949)을 포함하는 PBS)으로, 교반하면서(각 세척당 10-15 분) 3회 세척했다. 그 후, 시료를 이차 항체와 인큐베이션시키고, 일차 항체의 경우에서와 같이 세척했다. 마지막 세척의 제거 후에, DAPI를 포함하는 Vectashield를 1 내지 2 방울(drop) 첨가하고, 도립 형광 현미경에서 세포를 조사하고 계수했다. 최소 1000개의 핵을 포함하는, 모든 채널에서 20x 확대율로 3 내지 6개의 무작위 필드(field)의 사진을 촬영했다. 사진을 합치고(merge) 이미지를 어느 세포가 베스트로핀 및 PAX6에 대해 음성, 또는 PAX6 및 MITF에 대해 음성인지, 또는 ZO-1DP 대해 음성인지의 가시화를 가능하게 하기 위해 필요한 경우 조정했다. 예상되는 염색 패턴이 관찰되는 경우, 예를 들면, 핵에 국소화된 PAX6, 다각형 패턴으로 원형질 막에 국소화된 베스트로핀(세포의 주변부에 명확한 선으로 국소화된 베스트로핀 염색을 보임), 다각형 패턴으로 세포의 경계를 이루는(outlining) 밀착 연접에 존재하는 ZO-1 염색, 및 핵에 한정되어 검출된 MITF 염색이 관찰되는 경우, 세포를 주어진 마커에 대해 양성인 것으로 계수했다. 합쳐진 이미지에서 양성 세포를 계수하고, 합쳐지지 않은 DAPI-염색 이미지로부터 핵을 계수하여 총 세포수를 결정하는 것에 의해 각 마커 또는 마커 조합에 대해 양성인 세포의 비율을 결정했다.

표 15. hES 세포로부터 분화된 RPE 세포에 의해 발현된 RPE 마커. RPE 마커를 간접적인 면역형광 염색에 의해 검출했다.

	계대(Passage) 1 마커			계대 2 마커
로트	ZO-1	베스트로핀	PAX6 및/또는 베스트로핀	ZO-1	베스트로핀	PAX6 및/또는 베스트로핀
B1A	100%	81%	100%	100%	81%	100%
B2A	100%	90%	100%	100%	82%	100%
B2B	100%	86%	100%	100%	89%	100%
B3A	100%	98%	100%	100%	81%	100%
B3B	100%	88%	100%	100%	99%	100%
사양	>/=95%	>/=70%	>/=95%	>/=95%	>/=70%	>/=95%

추가적으로, mRNA 발현을 실시예 1에 기재된 바와 같이 q-RT-PCR에 의해 검출했다. 각 로트로부터의 결과가 표 16에 표시되고, 예상대로, RPE 유전자가 상향 조절되고, ES 세포 유전자는 하향 조절된다는 것을 보여준다.

표 16. hES 세포로부터 분화된 RPE 세포에서 RPE 유전자의 상향-조절 및 ES 세포 유전자의 하향 조절.

J	계대 2 (log 상향 조절)				계대 2 (하향-조절)
로트	베스트로핀	PAX6	MITF	RPE-65	NANOG	OCT-4	SOX2
B1A	3.4	1.9	2.06	3.02	-2.78	-3.29	-2.68
B2A	4.2	1.79	2.5	1.6	-2.53	-2.89	-2.72
B2B	3.5	2.33	2.82	1.54	-2.08	-3.24	-1.86
B3A	3.39	2.34	2.77	1.55	-2.54	-2.89	-1.85
B3B	3.73	1.96	2.48	3.25	-2.76	-3.33	-4.01
사양	>1	>1	>1	>1	<-1.95	<-2.13	<-0.63

전술된 배지 조성(RPE-GM/MM 및 EB-DM)을 이용하여 제조된 RPE, 및 다른 배지(MDBK-GM 및 MDBK-MM)를 이용하여 이전에 제조된, 동결보존 RPE 세포를 식세포 작용 능력에 대해 테스트했다. 이 연구에서, 동결보존 RPE를 해동시키고 RPE Growth/Maintenance Media에 접종했다. 배상체 형성 및 착색된 패치 형성 동안 EB-DM을 사용하고, RPE 성숙 동안 RPE-GM/MM을 사용하여 생성된 현재의 로트로부터의 RPE 세포를 트립신 처리하고, 마찬가지로 RPE-GM/MM에 접종했다. 두 배양물 모두 융합까지 성장시키고, RPE-GM/MM에서 분화할 때까지 유지시키고, 그 후, RPE 세포의 식포의 산성 환경에 내재화되면 형광을 내는 형광 바이오입자(Invitrogen Cat. No. P35361)를 식균하는 능력에 대해 테스트했다. 식세포 작용을 가능하게 하기 위해 세포를 37℃에서 형광 바이오입자와 인큐베이션하거나, 또는 음성 대조군으로서 4℃에서 인큐베이션시켰다. 37℃에서 인큐베이션시킨 세포에 대해 FACS에 의해 형광 강도의 이동(shift)이 검출되어(도 12), 바이오입자의 식세포 작용을 나타냈다. 피크의 통계적 통합(statistical integration)은 각 로트와 인큐베이션 온도에 대해 식세포 작용 양성 세포의 비율을 산출한다.

표 17. MDBK 배지(MDBK-GM 및 MDBK-MM) 또는 EB-DM 및 RPE-GM/MM을 이용하여 제조된 RPE 세포에 의한 식세포 작용. 식세포 작용은 산성 식포 환경에서 형광성이 되는 입자와 세포를 인큐베이션하는 것에 의해 검출했다. FACS에 의해 검출된, 식세포 작용 양성 세포의 비율이 37℃ 또는 4℃ (음성 대조군)에서 인큐베이션된 세포에 대해, 표시된다. EB-DM 및 RPE-GM/MM에서 제조된 세포는 MDBK 배지에서 제조된 세포에 비해 우수하여, 이 배지 조성의 적합성(suitability)을 더 확인했다.

	MDBK 배지	EB-DM 및 RPE-GM/MM
4 ℃	8%	18%
37 ℃	64%	77%

이 결과는 RPE-GM/MM에서 유지된 RPE 세포의 두 로트 모두에서 높은 비율의 세포에서 식세포 작용을 보여주고, RPE 세포 성장 및 성숙을 위해 RPE-GM/MM을 사용하는 것의 적합성을 또한 입증한다.

실시예 5

RPE 유도(derivation)를 위한 추가적인 예시적 방법

이 실시예에서 배아 파괴 없이 제조된 추가적인 hESC 계통, 구체적으로, 생검된 할구로부터 제조된 hES 세포, iPS 세포(구체적으로, 비통합성 에피좀 벡터(nonintegrating episomal vector)를 이용하여 제조된 iPS 세포) 및 NED("no embryo destruction")로부터 분화된 RPE를 제조하는 방법으로서, 상기 할구가 유래된 배아는 생존가능한 상태로 남고, 뒤이어 동결보존되는 것인 방법을 이용했다. NED 세포는 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, Chung et al. (Cell Stem Cell. 2008 Feb 7;2(2): 113-7)에 기재된 바와 같이 제조했다.

hESC를 mTESR-1 배지 (Stem Cell Technologies, Inc.) 상에서 제조사의 설명에 따라 희석된 Matrigel™에서 증식시켰다. 이전에 기술된 바와 같이(Klimanskaya et al., Cell Stem Cells 6:21 7-245 (2004), 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨), 배상체("EB") 또는 다층 hESC 배양물로부터 RPE를 제조했다; 현탁 배양 후에, EB를 RPE 회수 전에 성장(outgrowth)을 위해 플레이팅했다. 그러나, EB 형성이 Matrigel™ 상에서 배양된 hESC로부터 덜 효율적이고, 세포는 보다 낮은 비율의 성공적 응집(aggregation) 및 감소된 생존력을 보이는 것으로 관찰되었다. EB 형성 효율성을 향상시키기 위해 하기의 프로토콜 변형을 이용했다.

hESC를 그들이 정상적으로 계대되는 시간 이상으로 성장할 수 있게 하여, 콜로니가 "더 두꺼워(thicker)"졌고, 즉, 약간 융기되고(raised) 및/또는 다층화되었다. EB 형성을 위해, hESC를 기계적 긁기(mechanical scraping), 콜라게나아제 I, 아큐타아제(accutase), 콜라게나아제와 아큐타아제 또는 콜라게나아제 및 뒤이은 아큐타아제 처리, EDTA-기반 분리(dissociation) 완충액을 이용하여, 단일 세포 현탁액으로 분리되게 하지 않으면서 분리시켰다. 이 방법은 hESC 콜로니가 단일 세포로 분리되지 않으면서 해제(lift)될 수 있게 했다. 트립신(통상적인 사용 조건 하에서 쉽게 단일 세포 현탁액을 제조하는 경향이 있음)은 이용하지 않았다.

그 후, 분리된 hESC를 초-저 부착 플레이트(ultra-low attachment plate)에서 배양하여 EB 형성을 가능하게 했다. 선택적으로, 다른 방법, 예를 들면, 현적(hanging drop)이 EB 형성을 위해 이용될 수 있다. 통상적으로, 6-웰 디쉬의 1 내지 3개의 웰로부터의 hESC를 2 내지 7 ml의 배양 배지에서 저 부착성 플레이트(low-adherence plate)의 1 내지 2개의 웰에서 배양했다. 세포를 EB 배지(넉아웃 고 글루코오스(knockout high glucose) DMEM, 1% 비-필수 아미노산 용액, 2 mM GlutaMAX I, 0.1 mM 베타-머캅토에탄올, 및 13%의 Serum Replacement (SR, Invitrogen))에서 배양했다. EB 배지에서 배양의 최초 2 내지 3일 동안 EB가 형성되면서, EB 배지를 10 마이크로몰(microMolar) Stemgent's Stemolecule Y-27632, ROCK(rho-associated protein kinase) 억제제로 보충했다(참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, Watanabe et al., Nat Biotechnol. 2007 Jun;25(6):681-6 참조). ROCK 억제제의 사용은 세포 생존력을, 특히, EDTA 또는 효소에 의한 분리(enzymatic dissociation)을 이용하여 수득된 hES 세포에 대해 세포 생존력을 향상시켰다. ROCK 억제제의 사용은 기계적으로 긁어낸 hESC에 대해서는 선택적이었고, 이들은 그 사용 없이도 잘 생존했다.

EB 형성 후 7 내지 12일에, EB를 성장(outgrowth)을 위해 젤라틴 코팅 플레이트에 플레이팅했다. RPE는 상피 형태(자갈 외형) 및 착색에 의해 용이하게 식별되었다.

또한, 세포를 피더 세포 대신 세포를 Matrigel(TM) 상에서 배양한 것을 제외하고는 본질적으로 이전에 기술된 바와 같이(Klimanskaya et al., 2004, supra), Matrigel™ 상에서 배양한 hESC의 다층 배양물로부터 RPE를 제조했다. 요약하면, hESC 콜로니가 다층이 될 때까지(약 10 내지 14일의 배양), hESC를 mTESR-1 배지에서 Matrigel™ 상에서 성장할 수 있게 했고, 다층이 되었을 때, 배양 배지를 (전술된 바와 같은) EB 배지로 교체했다. ROCK 억제제를 선택적으로 배양 배지에 포함시켰으나, 효율적인 RPE 형성 및 회수를 위해 필요하지는 않았다. RPE는 상피 형태(자갈 외형) 및 착색에 의해 용이하게 식별되었다. 배지를 착색된 RPE 세포가 관찰될 때까지(통상적으로 4 내지 5주 내) 1 내지 2일마다 배지를 교체했다.

결과적으로 수득된 EB 또는 다층 배양물은 육안으로 볼 수 있는 보다 진한 영역을 포함하는 "점무늬(freckled)" 외관을 보였다. 현미경 관찰은 보다 진한 영역은 그들의 특징적인 착색 및 자갈, 상피 형태에 의해 식별될 수 있는 RPE 세포로 이루어졌다는 것을 확인했다. 결과적으로 수득된 RPE 세포 배양물이 도 19에 표시된다. hESC로부터의 분화 후에, RPE 세포를 기계적 또는 효소에 의한 분리에 의해 단리했다.

실시예 6

RPE 이식 방법

건성 연령-관련 황반 변성(AMD) 및 스타르가르트 황반 이영양증(SMD) 환자로 의 세포 이식을 위해 하기 방법을 이용했다.

수술 직전에 환자에게 코르티코스테로이드를 투여하지 않았다. 수술은 외과의의 재량으로, 각성 진정(walking sedation)을 동반하거나 동반하지 않은 전신 또는 국소 마취 하에 수행했다.

이식을 위한 세포를 액체 질소 보관 시스템(약 -140℃)의 기체상(vapor phase)에 보관된 동결된 현탁액으로 제공했다. 세포를 투여를 위해 제제화하기 위해, 바이알을 액체 질소 냉동고로부터 꺼내어, 37℃ 수조에 넣고, 해동될 때까지 일정하게 1 내지 2 분동안 교반시켰다. 그 후, 바이알에 70% 이소프로판올을 분무하고 건조시켰다. 각 바이알의 내용물(동결 시, 백만개의 세포를 포함하는 동결보존 배지 1 ml)을 50 mL 원추형 튜브로 옮기고 40 ml의 무혈청 DMEM으로 세정했다. 세포를 원심분리하고, 각 펠릿을 40 mL BSS-PLUS에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 다시 원심분리하고, 둘 이상의 동결 바이알(cryovial)을 해동시킨 경우, 펠릿을 함께 합쳤다. 부피를 BSS PLUS 중 10 mL의 최종 부피가 되게 하고, 세번 째로 원심분리했다. 상층액을 완전히 흡인하고 세포를 해동된 세포 1 mL에 대해 약 150 ㎕ BSS PLUS의 최종 부피가 되게 했다(보다 농축된 현탁액이 요구되는 경우, 더 낮은 부피가 이용될 수 있다). 시료를 채취하고 생 세포 계수를 수행했다. 총 생 세포 수를 결정하고, ㎕ 당 2,000개 생 세포와 같은 표적 생 세포 농도를 얻기 위해 적절한 부피의 BSS-PLUS를 첨가했다. 제제화된 산물의 적절한 부피를 0.5 mL 멸균 미세원심분리기 튜브로 옮기고, 보존(archiving), 생존력 결정, 그람 염색, 및 무균성(sterility) 테스틀 위해 시료를 채취했다. 정확한 부피의 BSS-Plus를 담은 쌍을 이루는(paired) 0.5 mL 멸균 미세원심분리기 튜브를 또한 준비하고 표지를 붙였다. 쌍을 이룬 바이알을 수술실에서 최종 혼합 및 이식 전에 2 내지 8℃에서 4시간 이하로 보관되게 하였다.

환자에게 표준 3 포트 평면부 유리체 절제술(3 port pars plana vitrectomy)을 시술했다. 작은 망막절개(small retinotomy)를 하고, 작은 망막내 시신경 박리(neurosensory retinal detachment)가 일어날 때까지 유리체절제술 장비(vitrectomy machine)를 통한 유체 주입 시스템을 이용하여 BSS-Plus의 망막하 공간으로의 주입을 수행했다. 외과의는 수포(bleb)가 측두부 중심와 위치(temporal foveal position)에 형성되도록 했다. 수포는 선택적으로 혈관궁(arcade blood vessel) 내에서 연장될 수 있으나, 중심 황반와(central macula fovea)를 분리시키지 않았다. 수포가 중심 황반(central macula)을 향해 연장되는 것으로 관찰되는 경우, 외과의는 중단하고 위치에 관한 동일한 원칙을 준수하면서, 또 다른 망막절개를 수행할 옵션을 가졌다. 그 후, 망막하로 주입된 BSS Plus를 제거했다.

미리-로딩된 캐뉼라를 도입하고 세포를 150 ㎕의 부피로 약 1분에 걸쳐 형성된 공간 내로 주입했다. 정확한 캐뉼라 배치(positioning)를 보장하기 위해 직접 관찰(direct viewing)에 의한 모니터링을 수행했다. 수포의 정확한 위치는 수술후 소견이 정확히 수포의 위치와 상관관계를 가질 수 있도록 사진 또는 (바람직하게는) 비디오에 의해 수술 현미경(operating microscope)을 통해 기록했다.

150 ㎕의 BSS-Plus 중 원하는 수포(예를 들면, 50,000, 100,000, 150,000, 또는 200,000개)의 hESC-유래 RPE 세포를 포함하는 현탁액을 이식했다. 세포를 약 1분에 걸쳐 주입했다. 캐률라를 환류를 피하기 위해 추가적인 1분 동안 그 위치에 유지시켰다. 외과의의 재량으로, 예를 들면, 망막절개가 확대되는 경우, 공기-유체 교환(air-fluid exchange)을 선택적으로 수행했다. 그 후, 표준 시술을 이용하여 절개를 봉합했다. 그 후, 환자가 마취로부터 회복되었으나, 6시간 동안 반듯이 누운 자세를 유지시켰다.

시술 후 48시간 동안 코르티코스테로이드의 투여를 허용하지 않았다. 필요한 경우, 수술-후 불편을 관리하기 위해, 국소 또는 전신성 비-스테로이드 항-염증제를 사용할 수 있게 했다.

실시예 7

동결보존 RPE 세포 제제의 안정성

이 실시예는 동결보존 RPE 세포가 방출 기준(release criteria)를 통과하고 동결 후 6개월 및 12개월 시점에 테스트된 경우, 사용을 위해 적합하게 남아있었다는 것을 보여준다. 이에 근거하여, 동결보존 RPE는 동결보존 후 12개월 동안 그들의 기능 및 산물 속성을 유지한다는 것이 입증된다. 동결보존 RPE 세포는 동결 후 수년 동안(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년, 또는 그 이상) 이식을 위해 적합한 상태로 남을 것으로 예상된다.

실시예 4에 기재된 바와 같이, 동결보존 RPE 시료를 제조하고, 동결보존 배지(90% FBS 및 10% DMSO)에서 액체 질소로 동결시키고, 액체 질소 보관 시스템의 기체상(vapor phase)에서 보관했다(약 -140℃). 6개월 또는 12개월의 보관 후에, 실시예 6에 기재된 바와 같이, 동결보존 세포를 해동시키고, 세척했다(요약하면, 37℃ 수조에서 해동시키고, 용기의 외부를 70% 에탄올로 세척하고, 동결보존 배지를 제거하기 위해 세포를 세척했다). 해동 후, 세포를 산물 안정성을 확인하기 위한 테스트에 적용했다. 하기 표 18에 기재된 바와 같이, 방출 기준 각각을 통과했다.

표 18. 동결보존 RPE 세포의 안정성. 세포는 6 또는 12개월 동안 동결보존됨

테스트 설명	방법	사양( Specification )	결과 (6 mo .)	결과 (12 mo .)
핵형	G-밴딩	정상 46 XX (해동, 제제화, 및 배양 후)	통과	통과
FISH	FISH	정상 FISH 신호 (12 및 17)	통과	통과
효능	형광 입자를 이용한 식세포 작용 분석	RPE 세포에 의한 형광 입자의 내재화가 FACS 분석에 의해 검출되고, 37℃에서 입자와 함께 배양된 세포의 경우 형광 피크의 이동이 있음 (해동, 제제화, 및 배양 후)	통과	통과
세포 수	트리판 블루 배제	회수(recovery) 보고 (해동 및 제제화 후)	32.6%	29%
생존력	트리판 블루 배제	70% 이상 (해동 및 제제화 후)	95%	97%
무균성	침지(Immersion) 방법 (USP/21 CFR 610.12)	음성 (해동된 바이알)	음성	음성
형태	형태학적 평가	인정가능한 자갈 형태, 입방형(cubiodal) 세포 (해동, 제제화, 및 배양 후)	통과	통과
순도	RPE 마커의 면역 염색	95% 이상이 베스트로핀 및/또는 Pax6에 대해 양성 95% 이상이 ZO-1에 대해 양성 (해동, 제제화, 및 배양 후)	97% 베스트로핀+ 100% Pax6+ 100% ZO-1+	96% 베스트로핀+ 100% Pax6+ 100% ZO-1+

실시예 8

제제화된 RPE 세포의 안정성

이 실시예는 2-6℃에서 유지되는 경우, 해동 및 투여를 위한 제제화 후 4시간 이상 동안 RPE 세포가 사용을 위해 적합한 상태로 유지된다는 것을 보여준다.

실시예 6에 기재된 바와 같이, 동별보존 세포를 해동시키고, 제제화하고, 최종 산물 용기(개스킷(gasket)이 있는 0.5 mL 멸균 미세원심분리기 튜브)에서 2-8℃로 보관했다. 표 19는 제제화 시 및 저온 보관 4시간 후에 테스트된 이 두 개의 로트에 대해 트리판 블루 배제에 의해 평가된 평균 퍼센트 생존력 ± SD를 보여준다(로트당 3개의 최종 제제).

표 19. 임상 제품 중 RPE 세포의 최초 및 4-시간 생존력

	0-시간 생존력 (%)	4-시간 생존력 (%)
로트 A (N=3)	82.7 ± 6.7	82.3 ± 1.5
로트 B (N=3)	84.3 ± 1.5	85.3 ± 4.1

이 데이터는 제제화된 RPE 세포가 제조 후 4시간까지 세포 생존력을 유지한다는 것을 보여주었다.

추가적인 실험에서, RPE 세포 최종 산물을 2,000개 생 세포/㎕로 제제화하고 MedOne REF 3233 POLYTIP^R Cannula 23/38을 통한 압출 전에 다양한 시간 동안 저온에서 보관했다. 이 연구에서(데이터는 표 20에 표시됨), 전술된 바와 같이, RPE 세포 로트(임상적 사용을 위한 벌크-산물 방출 테스트를 통과했음)를 해동하고 처리했다. 세포를 BSS-Plus 중 2,000개 생 세포/㎕의 밀도로 재현탁시키고 보관하고, 그 후, 얼음 상에서 유지시켰다. BSS-Plus 중 저온-보관 동안 세포 생존을 촉진하기 위해 1,000개 생 세포/㎕보다 더 큰 세포 밀도를 선택했다. 이때, 총 177,600개의 생 세포를 포함하는 89 ㎕의 분량(alquot) 21개를 최종 산물 폐쇄 미세원심분리기 튜브로 분주했다. 시린지 로딩 및 캐뉼라를 통한 압출 시 최종 희석이 수행될 때까지 세포 분량을 얼음 상에 보관하였다. 저 용량 전달을 위해, 차가운 BSS-Plus 311 ㎕를 세포를 담은 튜브에 분주하여 최종 부피를 400㎕ @ 444개 세포/㎕가 되게 했다. 이 밀도는 충진 니들에 의한 혼합, 시린지 로딩, 및 MedOne 캐뉼라를 통한 전달시 일어나는 예상되는 상실을 보완하기 위해 333개 세포/㎕의 의도된 전달 밀도보다 25% 더 높다.

고 용량 전달을 위해, 두 개의 89 ㎕, 세포의 분량을 하나의 튜브로 합치고(pool)(356,000개 세포) 차가운 BSS-Plus 22 ㎕를 세포를 담은 튜브로 분주하여 최종 부피가 400 ㎕ @1,776개 세포/㎕가 되게 하였다. 이 밀도는 충진 니들에 의한 혼합, 시린지 로딩, 및 MedOne 캐뉼라를 통한 전달시 일어나는 예상되는 상실을 보완하기 위해 1,333개 세포/㎕의 의도된 전달 밀도보다 25% 더 높다.

희석된 세포를 담은 미세원심분리기 튜브의 캡을 덮고, 혼합을 촉진하기 위해 한 손가락으로 가볍게 두드렸다. 평활 충진 니들(90 ㎕의 공 용적)을 1 mL BD 시린지에 부착시키고, 시린지와의 접촉을 최소화하도록 주의하면서, 평활 충진 니들에서 1 내지 2회 온건하게 분쇄시켰다. 시린지를 약 200 ㎕의 세포로 충진시켰다. 평활 니들을 제거하고 MedOne 38g 주사 캐뉼라를 부착시켰다. 약 150 ㎕의 세포를 미세원심분리기 튜브로 분주했다. 각각의 분주된 분량을 트리판 블루 배제에 의해 세포 밀도 및 생존력에 대해 평가했다. 제제화 후 시간은 2,000 생 세포/㎕로 차가운 BSS-Plus에 세포를 재현탁시킨 때로부터 경과된 분이다. 표시된 농도에서 전달된 세포에 대해 이 데이터가 표 20에 제시된다.

표 20. 제제화 후 보관된, 캐뉼라-전달 RPE 세포의 생존력

저 용량 (444개 생 세포/㎕로 제제화됨: 표적 333개 생 세포/㎕)
제제화 후 경과 시간(분)	전달된 세포 밀도 (생 세포/㎕)	% 생존력
22	331	99
85	346	97
91	374	91
187	363	ND
193	339	93
207	260	96

평균 336 +/- 40 (N=6)
중간 용량 (1561개 생 세포/㎕로 제제화됨: 표적 1172개 생 세포/㎕)
제제화 후 경과 시간(분)	전달된 세포 밀도 (생 세포/㎕)	% 생존력
248	1178	90

고 용량 (1776개 생 세포/㎕로 제제화됨: 표적 1333개 생 세포/㎕)
제제화 후 경과 시간(분)	전달된 세포 밀도 (생 세포/㎕)	% 생존력
48	1308	100
176	1648	93
293	1343	90

평균 1433 +/- 187 (N=3)

데이터는 주사 캐뉼라를 통해 압출된 최종 산물 RPE 세포의 생 세포 수는 테스트된 시간 동안 저온에서 보관되는 경우 감소하지 않는다는 것을 보여준다. 제제화 후 240분(4 시간)을 초과한 시간에 관찰된 생 세포 밀도는 4시간 이상의 종료 시간(expiration time)을 지지한다. 이 연구에서, BSS-Plus 중 RPE 세포를 최종 산물 폐쇄물(final product closure)로 얼음 상에서 보관했다. 얼음 상에서 보관된 미세원심분리기 튜브 중 BSS-Plus의 온도를 뒤이어 보정된(calibrated) 프로브를 이용하여 측정하고 3℃로 확인하였다.

추가 실험은 최대 6시간 동안 제제화된 RPE 세포의 생존력을 테스트했다. 제제화시(0 시간) 및 저온 보관(2-8℃)에서의 4시간 및 6시간 후 생존력을 평가했다. GMP 제조에 대해 기술된 바와 같은 절차, 방법, 및 재료를 이용하여, 이 연구에서 사용된 RPE 로트를 제조하고 동결보존했다.

실시예 6에 기재된 절차를 따라서, RPE 세포의 동결보존된 바이알을 해동시키고 제제화했다. 제제화시(0 시간) 및 저온 보관(2-8℃)에서의 4시간 및 6시간 후 생 세포 수에 대해 세포를 평가했다. 또한, 후속 순도 및 효능 평가를 위해 0, 4, 및 6시간차 세포를 접종하고 배양했다. 접종된 각 시점(0, 4 및 6 시간)에 대해, MITF 및 PAX6 면역염색에 의해 순도를 평가하고, FACS 분석에 의해, 형광 입자의 식세포 작용을 평가했다.

생 세포 밀도는 혈구 계수기에서 트리판 블루를 배제시키는 세포를 계수하는 것에 의해 결정했다. 데이터는 4개의 혈구 계수기 챔버에서 수행된 평균 +/- SD를 나타낸다. 결과가 하기 표 21에 표시된다.

표 21. 제제화 후 2 내지 8℃에서 보관된 세포의 생존력

실험 # 1
	생 세포/㎕	생존력
0 시간	2590 +/- 332	86%
4 시간	2850 +/- 148	79%
6 시간	2875 +/- 145	89%
실험 # 2
	생 세포/㎕	생존력
0 시간	1700 +/- 78	88%
4 시간	1680 +/- 123	82%
6 시간	1550 +/- 248	85%

제제화된 세포가 보관된 GMP 보관 냉장고에 대한 온도 판독은 온도가 실험 내내 6℃로 유지되었다는 것을 확인했다.

2,590/㎕ 및 1,700/㎕의 0 시간차 출발 생 세포 밀도는 일부 임상적 제제에 대해 표적화된 2,000 생 세포/㎕와 동일한 범주이다(bracket). 저온 보관에서 6시간까지 테스트된 출발 세포 밀도의 범위에 걸쳐 생 세포 수의 감소가 관찰되지 않았다.

실시예 9

이 실시예는 두 명의 추가적인 스타르카르트병 환자에 대한 초기 치료 결과를 제공한다. 이 두 명의 환자는 각각 실시예 6에 기재된 RPE 이식 방법을 이용하여 (실시예 1에 기재된 바와 같이) hESC 소스로부터 유래된 50,000개 RPE 세포로 치료되었다. 두 명의 스타르가르트병 환자에 대한 망막, 시신경 유두, 및 후극을 포함한, 안저 사진은 주사 부위 및 RPE 세포를 포함하는 용액의 주사시 형성된 수포(bleb)의 영역을 나타낸다 (도. 15).

추가적인 안저 사진은 두 명의 SMD 환자에 대한 주사 수포 내의 착색된 RPE 세포의 증가되는 패치를 갖는 영역의 구축을 보여준다(도 16 및 17). 이 결과는 망막의 영역의 생착 및 새로운 RPE 층에 의한 표면처리(resurfacing)를 시사한다.

도 16에 도시된 바와 같이, 환자의 치료된 눈에서 시력을 측정했다. 수직 축은 ETDRS(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study) 점수를 나타내고, 수평 축은 수술 후 경과 일수를 나타낸다.

이러한 결과는 치료 후 3개월 이상 동안 RPE 세포의 안정한 생착이 지속된다는 것을 나타낸다. 치료된 눈의 시력은 치료 후 14일 차에 기준시점(baseline) 수준까지 복귀되었고, 표시된 최종 시점에 84일까지 기준시점 수준 이상으로 유지되었다.

실시예 10

1년 환자 평가

실시예 1에 전술된 바와 같이, RPE 치료 후 1년의 기간 동안 AMD 환자와 SMD 환자를 평가했다.

SMD 환자의 눈의 안저 촬영은 수술 후 1년 차에 치료된 눈에서 착색 세포(pigmented cell)의 존재를 보였다 (도 20B). 대조적으로, 착색 세포는 치료 전 기준 시점에 검출가능하지 않았다 (도 20A). 이러한 결과는 치료 후 1년 이상 동안 지속된 RPE의 장기간 생착(engraftment)을 나타낸다.

AMD 환자에 대해, Peripheral ETDRS/BVCA Score가 도 21에 그래프로 예시된다. 21의 최초 기준 값(initial baseline value)으로부터, 환자의 Peripheral ERTDS-BVCA Score는 수술 후 1일 차 및 3일 차에 0까지 감소되었으나, 수술 후 7일 차에 적어도 기준시점 수준까지 회복되었고 그 후, 기준시점보다 높은 수준으로 유지되었다. 수술 후 1년 차에, 환자의 Peripheral ERTDS-BVCA Score는 34였다.

SMD 환자의 경우, 치료 1년 후, Central ETDRS/BVCA Score는 15였다. 주변부 점수(peripheral score)가 도 22에 예시된다. 0의 최초 기준시점 값으로부터, 수술 후 2주 차에, 환자의 Peripheral ERTDS-BVCA Score는 1까지 증가되었고, 그 후, 치료 후 1년까지 15의 값까지 지속적으로 증가하였다.

이러한 결과는 치료 후 1년 이상 동안 지속된, RPE 세포의 투여로부터 초래된, AMD 및 SMD 환자에서의 시각의 개선을 나타낸다.

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모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각 개별적인 간행물, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도까지 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 2007년 10월 12일자로 제출된 미국 임시출원 60/998,766, 2007년 10월 12일자로 제출된 60/998,668, 2008년 1월 2일자로 제출된 61/009,908, 및 2008년 1월 2일자로 제출된 61/009,911, 전술된 출원 각각의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, WO 2009/051671의 개시는 이에 의해 그 전체가 참조에 의해 포함된다.

당업자는 통상적인 실험을 이용하여, 본 명세서에 기재된 발명의 특정한 구체예의 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 하기의 청구항에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

복수 개의 망막 색소 상피(RPE) 세포, 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 복수 개의 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만인 것인 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 RPE 세포는 현탁액, 겔, 콜로이드, 매트릭스, 기질(substrate), 스캐폴드(scaffold), 또는 이식물(graft)에 담긴 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 약 290 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 또는 약 300 mOsm/kg 내지 310 mOsm/kg 또는 약 305 mOsm/kg의 오스몰 농도(osmolality)를 갖는 멸균 용액을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 평형 염 용액(balanced salt solution)을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 평형 염 용액은 각 mL 당, 염화나트륨 7.14 mg, 염화칼륨 0.38 mg, 염화칼슘 이수화물 0.154 mg, 염화마그네슘 육수화물 0.2 mg, 제2인산나트륨(dibasic sodium phosphate) 0.42 mg, 중탄산나트륨 2.1 mg, 덱스트로오스 0.92 mg, 글루타티온 디술피드(glutathione disulfide)(산화 글루타티온) 0.184 mg, 및 (pH를 약 7.4까지 조정하기 위한) 물 중 염산 및/또는 수산화나트륨을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 필수적으로 이들로 구성되는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 부피는 약 100 ㎕ 내지 1000 ㎕이거나, 또는 약 150 ㎕ 이상인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 1,000개 내지 lx10⁹개의 생(viable) RPE 세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 333개 생 RPE 세포/㎕ 내지 약 2,000개 생 RPE 세포/㎕, 약 444개 생 RPE 세포/㎕ 내지 약 1766개 생 RPE 세포/㎕, 약 333개 생 RPE 세포/㎕, 약 444개 생 RPE 세포/㎕, 약 666개 생 RPE 세포/㎕, 약 888개 생 RPE 세포/㎕, 약 999개 생 RPE 세포/㎕, 또는 약 1,333개 생 RPE 세포/㎕을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중 RPE 세포의 농도는 충분히 높아서, 상기 RPE 세포의 약 30% 이하가 60분 내에 생존력을 상실하고, 선택적으로 상기 RPE 세포의 약 10% 이하가 4시간 내에 생존력을 상실하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 RPE 세포의 농도는 약 1,000개 세포/㎕ 이상, 약 2,000개 세포/㎕ 이상, 약 1,000-10,000개 세포/㎕, 또는 약 2,000-5,000개 세포/㎕인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0.0001% 미만의 RPE 세포가 아닌 세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 5 pg/세포 미만, 4 pg/세포 미만, 3 pg/세포 미만, 2 pg/세포 미만, 및 0.1 pg/세포 이상, 및 선택적으로 0.5 pg/세포 또는 1 pg/세포 이상; 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-7 pg/세포, 0.5-6 pg/세포, 또는 1-5 pg/세포인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중 세포의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상은 베스트로핀(bestrophin)+인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+ 및/또는 MITF+인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+ 및/또는 베스트로핀+인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 ZO-1+인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중 세포의 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상은 PAX6+ 및 베스트로핀+인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중 세포의 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물에서 백만 개의 세포 당 약 1개 이하의 세포 및 선택적으로 9백만 개의 세포 당 2개 이하의 세포가 OCT-4와 알칼리 포스파타아제 (AP) 발현 모두에 대해 양성인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 니들 또는 주사 캐뉼라(injection cannula)는 상기 RPE 세포의 적어도 일부를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 20에 있어서, 상기 니들 또는 주사 캐뉼라 내로의 로딩(loading)시 상기 RPE 세포의 농도는 약 400개 생 세포/㎕ 내지 약 2,000개 생 세포/㎕인 것인 약제학적 조성물.
청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 니들 또는 주사 캐뉼라로부터 전달될 생 RPE 세포의 농도는 약 333개 생 세포/㎕ 내지 약 1,333개 생 세포/㎕ 또는 약 444개 생 세포/㎕ 내지 약 1,766 생 세포/㎕인 것인 약제학적 조성물.
청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 니들 또는 주사 캐뉼라의 직경은 약 0.3 mm 내지 약 0.9 mm인 것인 약제학적 조성물.
청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 니들 또는 주사 캐뉼라의 직경은 약 0.5 mm 내지 약 0.6 mm인 것인 약제학적 조성물.
청구항 20 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 니들 또는 주사 캐뉼라는 약 0.09 mm 내지 약 0.15 mm의 직경을 갖는 팁(tip)을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 20 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캐뉼라는 MEDONE POLYTIP^® Cannula 25/38g (0.12mm (38g) x 5mm 팁을 갖는 0.50mm (25g) x 28mm 캐뉼라) 또는 Synergetics Angled 39g Injection Cannula인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 동결보존되고 해동된 RPE 세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 인간 세포인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 혈관신생 억제제를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 29에 있어서, 상기 하나 이상의 혈관신생 억제제는: 페가타닙 소디움(pegaptanib sodium); 아플리베르셉트(aflibercept); 베바시라닙(bevasiranib); 라파마이신(rapamycin); AGN-745; 비탈라닙(vitalanib); 파조파닙(pazopanib); NT-502; NT-503; PLG101; CPD791; 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편; 베바시주맙(bevacizumab); 라니비주맙(ranibizumab); 항-VEGFR1 항체; 항-VEGFR2 항체; 항-VEGFR3 항체; IMC-1121(B); IMC-18F1; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap(Aflibercept); AZD-2171 (Cediranib); 티로신 키나아제 억제제(TKI); VEGFR-1 및/또는 VEGFR-2를 억제하는 TKI; 소라페닙(sorafenib) (Nexavar); SU5416(Semaxinib); SU11248/수니티닙(Sunitinib)(Sutent); 반데타닙(Vandetanib)(ZD6474); Ly317615 (Enzastaurin); 항-알파5베타l 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편; 볼로시키맙(volociximab); 3-(2-{1-알킬-5-[(피리딘-2-일아미노)-메틸]-피롤리딘-3-일옥시}-아세틸아미노)-2-(알킬-아미노)-프로피온산; (S)-2-[(2,4,6-트리메틸페닐)술포닐]아미노-3-[7-벤질옥시카르보닐-8-(2-피리디닐아미노메틸)-1-옥사-2,7-디아자스피로-(4,4)-논-2-엔-3-일]카르보닐아미노 프로피온산; EMD478761; 또는 RC*D(ThioP)C*(Arg-Cys-Asp-Thioproline-Cys (아스테리스크는 시스테인 잔기를 통한 디술피드 결합에 의한 고리화를 나타냄); 2-메톡시에스트라디올; 알파V베타3 억제제; 안지오포이에틴 2; 혈관신생 억제 스테로이드(angiostatic steroid) 및 헤파린; 안지오스타틴(angiostatin); 안지오스타틴-관련 분자(angiostatin-related molecule); 항-카텝신 S 항체; 항트롬빈 III 단편; 칼레티쿨린(calreticulin); 칸스타틴(canstatin); 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole); 연골-유래 혈관신생 억제 인자(Cartilage-Derived Angiogenesis Inhibitory Factor); CDAI; CM101; CXCL10; 엔도스타틴(endostatin); IFN-α; IFN-β; IFN-γ; IL-12; IL-18; IL-4; 리노미드(linomide); 마스핀(maspin); 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제; Meth-1; Meth-2; 오스테오폰틴(osteopontin); 페가프타닙(pegaptanib); 혈소판 인자-4(platelet factor-4); 프로락틴(prolactin); 프롤리페린-관련 단백질(proliferin-related protein); 프로트롬빈 (kringle domain-2); 레스틴(restin); 가용성 NRP-1; 가용성 VEGFR-1; SPARC; SU5416; 수라민(suramin); 테코갈란(tecogalan); 테트라티오몰리브데이트(tetrathiomolybdate); 탈리도마이드(thalidomide); 레날리도마이드(lenalidomide); 트롬보스폰딘(thrombospondin); TIMP; TNP-470; TSP-1; TSP-2; 바소스타틴(vasostatin); VEGFR 길항제; VEGI; 볼록시키맙(Volociximab) (M200); 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린(anastellin); 렌바티닙(Lenvatinib)(E7080); 모테사닙(Motesanib)(AMG706); 파조파닙(Pazopanib) (Votrient); VEGF의 억제제; VEGFR1의 억제제; VEGFR2의 억제제; 알파5베타1 인테그린의 억제제; VEGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 및/또는 알파5베타1 인테그린의 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 소형 분자, 화합물(chemical) 및/또는 핵산 억제제; IL-6 길항제; 항-IL-6 항체; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고; 선택적으로, 증식성(혈관신생) 안구 질환(proliferative (neovascular) eye disease)을 예방 또는 치료하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 유전적으로 조작된(genetically engineered) 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 다능성 세포로부터 제조되는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 유전적으로 조작된 다능성 세포로부터 제조되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 31 또는 33에 있어서, 상기 유전적 조작은 상기 RPE 세포에 의한, 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자의 제조를 가져오는 것인 약제학적 조성물.
청구항 34에 있어서, 상기 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자는: 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린(anastellin); 특이적 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-VEGF 수용체 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-알파5베타1 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 34 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈관신생을 억제하는 인자의 제조는 RPE-특이적 프로모터에 의해 조절되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 36에 있어서, 상기 RPE-특이적 프로모터는 RPE65 프로모터, 카텝신 D 근위 프로모터(Cathepsin D Proximal Promoter), 및 VMD2 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 32 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 OCT-4, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-80을 포함하는 하나 이상의 마커에 대해 양성인 것인 약제학적 조성물.
청구항 32 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 세포는 배양물에서 착색 상피 세포(pigmented epithelial cell)가 나타나기에 충분한 시간 동안 다층 집단(multilayer population) 또는 배상체(embryoid body)에서 배양된 인간 다능성 세포인 것인 약제학적 조성물.
청구항 39에 있어서, 상기 배양물에 착색 상피 세포가 나타나기에 충분한 시간은 약 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 5주 이상, 약 6주 이상, 또는 약 7주 이상, 약 8주 이상을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 39 또는 40에 있어서, 상기 다층 집단 또는 배상체는 DMEM을 포함하는 배지에서 배양되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 41에 있어서, 상기 배지는 EB-DM을 포함하거나, 필수적으로 그로 구성되거나 또는 그로 구성되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 39 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색 상피 세포는 단리되고 배양되어, RPF 세포의 집단을 생성하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 43에 있어서, 상기 단리는 세포 또는 세포의 덩어리(clump)를 효소에 의해(enzymaticall), 화학적으로, 또는 물리적으로 배양물로부터 분리하는 단계, 및 착색 상피 세포, 또는 착색 상피 세포를 포함하는 세포의 덩어리를 선택하는 단계를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 39 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배상체는 현탁 배양되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 39 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배상체는 부착 배양물(adherent culture)로 배양되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 46에 있어서, 상기 부착 배양물로 배양된 배상체는 착색 상피 세포를 포함하는 하나 이상의 외향 성장물(outgrowth)을 생성하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 32 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 감소된 HLA 항원 복잡성을 갖는 것인 약제학적 조성물.
청구항 32 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, RPE 형성 전에, 상기 다능성 세포는 매트릭스 상에서 배양되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 49에 있어서, 상기 매트릭스는 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴(entactin), 콜라겐, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 콜라겐 VIII, 헤파란 술페이트, 매트리겔(Matrigel)™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제(soluble preparation)), CellStart, 인간 기저막(basement membrane) 추출물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 49에 있어서, 상기 매트릭스는 매트리겔™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제)을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적인 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커를 갖지 않는 세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 52에 있어서, 상기 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커는 OCT-4, NANOG, Rex-1, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-80을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하나 이상의 RPE 세포 마커에 대해 양성인 것인 약제학적 조성물.
청구항 54에 있어서, 상기 하나 이상의 RPE 세포 마커는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀(Bestrophin), MITF, Otx2, PAX2, PAX6, ZO-1, 및/또는 티로시나아제인 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 상기 평균 멜라닌 함량을 얻기 위해 충분한 시간 동안 RPE 세포를 휴지기 세포(quiescent cell)로 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 상기 RPE 세포의 50% 이상에서 베스트로핀 발현을 달성하기에 충분한 시간 동안 RPE 세포를 휴지기 세포로 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 마우스 배아 피더 세포(mouse embryonic feeder cell, MEF) 및 인간 배아 줄기 세포(hES)가 실질적으로 없는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛의 발현을 증가시키는 조건 하에서 상기 RPE 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 약제학적 조성물.
청구항 59에 있어서, 상기 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛은 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛 1, 알파 인테그린 서브유닛 2, 알파 인테그린 서브유닛 3, 알파 인테그린 서브유닛 4, 알파 인테그린 서브유닛 5, 알파 인테그린 서브유닛 6, 또는 알파 인테그린 서브유닛 9를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 59 또는 60에 있어서, 상기 조건은 망간(manganese)으로의 노출, 항-CD29 항체로의 노출, 단일클론 항체 HUTS-21로의 노출, 단일클론 항체 mAb TS2/16으로의 노출, 및/또는 상기 RPE 세포를 약 4 계대(passage) 이상 동안 계대시키는 것을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 표 5에 기재된 기준 중 하나 이상을 충족시키는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 GMP(Good Manufacturing Practices)에 따라 제조되는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 면역 억제제 또는 면역 내성제(immune tolerizing agent)를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
청구항 64에 있어서, 상기 면역 억제제 또는 면역 내성제는 중간엽 줄기 세포, ALG(anti-lymphocyte globulin) 다중클론 항체, ATG(anti-thymocyte globulin) 다중클론 항체, 아자티오프린(azathioprine), 바실릭시맙(BASILIXIMAB)® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), 다클리주맙(DACLIZUMAB)® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 에베롤리무스(everolimus), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 리툭시맙(RITUXIMAB)®(항-CD20 항체), 시롤리무스(sirolimus), 타크롤리무스(tacrolimus), 및 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 중 하나 이상을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
선행하는 항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물 및 복수 개의 RPE 세포를 원하는 표적 농도까지 희석시키기에 충분한 부피로 약제학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 별개의 용기를 포함하는 키트.
청구항 66에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제의 부피는 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제의 전체 부피를 상기 복수 개의 RPE 세포 전체와 합치면 상기 원하는 표적 농도를 갖는 복수 개의 RPE 세포를 얻게 하는 것인 키트.
청구항 66 및 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제의 온도는 약 0 내지 10℃, 선택적으로 약 2 내지 8℃인 것인 키트.
청구항 66 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수 개의 RPE 세포 또는 상기 복수 개의 RPE 세포를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 담체의 온도는 약 0 내지 10℃, 선택적으로 약 2 내지 8℃인 것인 키트.
청구항 66 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 면역 억제제 또는 면역 내성제를 더 포함하는 것인 키트.
청구항 70에 있어서, 상기 면역 억제제 또는 면역 내성제는 중간엽 줄기 세포, ALG(anti-lymphocyte globulin) 다중클론 항체, ATG(anti-thymocyte globulin) 다중클론 항체, 아자티오프린, 바실릭시맙(BASILIXIMAB) (항-IL-2Rα 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), 다클리주맙(DACLIZUMAB)®(항-IL-2Rα 수용체 항체), 에베롤리무스, 마이코페놀산, 리툭시맙(RITUXIMAB)®(항-CD20 항체), 시롤리무스, 타크롤리무스, 및 마이코페놀레이트 모페틸 중 하나 이상을 포함하는 것인 키트.
청구항 66 내지 71 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 혈관신생 억제제를 더 포함하는 것인 키트.
청구항 72에 있어서, 상기 하나 이상의 혈관신생 억제제는 페가타닙 소디움; 아플리베르셉트; 베바시라닙; 라파마이신; AGN-745; 비탈라닙; 파조파닙; NT-502; NT-503; PLG101; CPD791; 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편; 베바시주맙; 라니비주맙; 항-VEGFR1 항체; 항-VEGFR2 항체; 항-VEGFR3 항체; IMC-1121(B); IMC-18F1; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap(Aflibercept); AZD-2171(Cediranib); 티로신 키나아제 억제제(TKI); VEGFR-1 및/또는 VEGFR-2를 억제하는 TKI; 소라페닙(Nexavar); SU5416(Semaxinib); SU11248/수니티닙(Sutent); 반데타닙(ZD6474); Ly317615(Enzastaurin); 항-알파5베타l 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편; 볼로시키맙; 3-(2-{1-알킬-5-[(피리딘-2-일아미노)-메틸]-피롤리딘-3-일옥시}-아세틸아미노)-2-(알킬-아미노)-프로피온산; (S)-2-[(2,4,6-트리메틸페닐)술포닐]아미노-3-[7-벤질옥시카르보닐-8-(2-피리디닐아미노메틸)-1-옥사-2,7-디아자스피로-(4,4)-논-2-엔-3-일]카르보닐아미노 프로피온산; EMD478761; 또는 RC*D(ThioP)C*(Arg-Cys-Asp-Thioproline-Cys (아스테리스크는 시스테인 잔기를 통한 디술피드 결합에 의한 고리화를 나타냄); 2-메톡시에스트라디올; 알파V베타3 억제제; 안지오포이에틴 2; 혈관신생 억제 스테로이드 및 헤파린; 안지오스타틴; 안지오스타틴-관련 분자; 항-카텝신 S 항체; 항트롬빈 III 단편; 칼레티쿨린; 칸스타틴; 카르복시아미도트리아졸; 연골-유래 혈관신생 억제 인자; CDAI; CM101; CXCL10; 엔도스타틴; IFN-α; IFN-β; IFN-γ; IL-12; IL-18; IL-4; 리노미드; 마스핀; 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제; Meth-1; Meth-2; 오스테오폰틴; 페가프타닙; 혈소판 인자-4; 프로락틴; 프롤리페린-관련 단백질; 프로트롬빈(kringle domain-2); 레스틴; 가용성 NRP-1; 가용성 VEGFR-1; SPARC; SU5416; 수라민; 테코갈란; 테트라티오몰리브데이트; 탈리도마이드; 레날리도마이드; 트롬보스폰딘; TIMP; TNP-470; TSP-1; TSP-2; 바소스타틴; VEGFR 길항제; VEGI; 볼록시키맙(M200); 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린; 렌바티닙(E7080); 모테사닙(AMG706); 파조파닙(Votrient); VEGF의 억제제; VEGFR1의 억제제; VEGFR2의 억제제; 알파5베타1 인테그린의 억제제; VEGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 및/또는 알파5베타1 인테그린의 펩티드, 펩티도미메틱, 소형 분자, 화합물 및/또는 핵산 억제제; IL-6 길항제; 항-IL-6 항체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고; 선택적으로, 증식성(혈관신생) 안구 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 키트.
동결시, 해동 후 회수된 RPE 세포가 약 60% 이상의 접종 효율(seeding frequency)를 갖게 하는 평균 성숙도 수준(maturity level)을 갖는 복수 개의 동결보존 망막 색소 상피(RPE) 세포를 포함하는 동결보존(cryopreserved) 조성물.
청구항 74에 있어서, 상기 접종 효율은 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 또는 75에 있어서, 상기 평균 성숙도 수준은 상기 복수 개의 동결보존 RPE 세포를 대표하는 세포 집단의 평균 멜라닌 함량을 측정하는 것에 의해 결정되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 76 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수 개의 동결보존 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만인 것인 동결보존 조성물.
복수 개의 동결보존 망막 색소 상피(RPE) 세포를 포함하는 동결보존 조성물로서, 상기 복수 개의 동결보존 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 동결보존 배지(cryopreservation medium)에 담겨 있는 것인 동결보존 조성물.
청구항 79에 있어서, 상기 동결보존 배지는 DMSO(디메틸 술폭시드), 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 2-메틸-2,4-펜탄디올(MPD), 프로필렌 글리콜, 및 수크로오스 중 하나 이상을 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 79 내지 80 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 배지는 약 5% 내지 약 50%의 DMSO 및 약 30% 내지 약 95%의 혈청을 포함하고, 상기 혈청은 선택적으로 우태혈청(FBS)인 것인 동결보존 조성물.
청구항 79에 있어서, 상기 동결보존 배지는 약 90% FBS 및 약 10% DMSO를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 78 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 해동 후 회수되는 RPE 세포는 약 60% 이상의 접종 효율을 갖는 것인 동결보존 조성물.
청구항 83에 있어서, 상기 접종 효율은 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 84 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물은 동결시 약 5,000개 내지 약 1x10⁸개의 생 RPE 세포를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 85 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물은 동결시 약 200,000개 내지 약 10,000,000개, 약 20,000개 내지 약 50,000,000개, 약 250,000개 내지 약 5,000,000개, 약 500,000개 내지 약 4,000,000개, 또는 약 1,000,000개 내지 약 4,000,000개의 생 RPE 세포를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 86 중 어느 한 항에 있어서, 동결 후 약 3, 6, 9, 또는 12개월 이상 경과 시점에, 해동 후 회수된 RPE 세포는 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상의 접종 효율을 갖는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 87 중 어느 한 항에 있어서, 해동 후 살아있는 세포의 85% 이상은 해동 후 2 내지 8℃에서 최대 1시간, 최대 2시간, 최대 3시간, 최대 4시간, 최대 5시간, 또는 최대 6시간 동안 보관시 살아있는 상태로 유지되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물은 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0.0001% 미만의 RPE 세포가 아닌 세포를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포의 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 5 pg/세포 미만, 4 pg/세포 미만, 3 pg/세포 미만, 2 pg/세포 미만, 및 0.1 pg/세포 이상, 및 선택적으로 0.5 pg/세포 또는 1 pg/세포 이상; 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-7 pg/세포, 0.5-6 pg/세포, 또는 1-5 pg/세포인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 90 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물 중 세포의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상은 베스트로핀+인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 91 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+ 및/또는 MITF+인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 92 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+ 및/또는 베스트로핀+인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물 중 세포의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 ZO-1+인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 94 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물 중 세포의 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상은 PAX6+ 및 베스트로핀+인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 95 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물 중 세포의 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상은 PAX6+인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 조성물 중 백만 개의 세포당 약 1개 이하의 세포 및 선택적으로 9백만 개의 세포당 2개 이하의 세포가 OCT-4 및 알칼리 포스파타아제(AP) 발현 모두에 대해 양성인 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 97 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 혈관신생 억제제를 더 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 98에 있어서, 상기 하나 이상의 혈관신생 억제제는: 상기 하나 이상의 혈관신생 억제제는 페가타닙 소디움; 아플리베르셉트; 베바시라닙; 라파마이신; AGN-745; 비탈라닙; 파조파닙; NT-502; NT-503; PLG101; CPD791; 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편; 베바시주맙; 라니비주맙; 항-VEGFR1 항체; 항-VEGFR2 항체; 항-VEGFR3 항체; IMC-1121(B); IMC-18F1; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap(Aflibercept); AZD-2171(Cediranib); 티로신 키나아제 억제제(TKI); VEGFR-1 및/또는 VEGFR-2를 억제하는 TKI; 소라페닙(Nexavar); SU5416(Semaxinib); SU11248/수니티닙(Sutent); 반데타닙(ZD6474); Ly317615(Enzastaurin); 항-알파5베타l 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편; 볼로시키맙; 3-(2-{1-알킬-5-[(피리딘-2-일아미노)-메틸]-피롤리딘-3-일옥시}-아세틸아미노)-2-(알킬-아미노)-프로피온산; (S)-2-[(2,4,6-트리메틸페닐)술포닐]아미노-3-[7-벤질옥시카르보닐-8-(2-피리디닐아미노메틸)-1-옥사-2,7-디아자스피로-(4,4)-논-2-엔-3-일]카르보닐아미노 프로피온산; EMD478761; 또는 RC*D(ThioP)C*(Arg-Cys-Asp-Thioproline-Cys (아스테리스크는 시스테인 잔기를 통한 디술피드 결합에 의한 고리화를 나타냄); 2-메톡시에스트라디올; 알파V베타3 억제제; 안지오포이에틴 2; 혈관신생 억제 스테로이드 및 헤파린; 안지오스타틴; 안지오스타틴-관련 분자; 항-카텝신 S 항체; 항트롬빈 III 단편; 칼레티쿨린; 칸스타틴; 카르복시아미도트리아졸; 연골-유래 혈관신생 억제 인자; CDAI; CM101; CXCL10; 엔도스타틴; IFN-α; IFN-β; IFN-γ; IL-12; IL-18; IL-4; 리노미드; 마스핀; 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제; Meth-1; Meth-2; 오스테오폰틴; 페가프타닙; 혈소판 인자-4; 프로락틴; 프롤리페린-관련 단백질; 프로트롬빈(kringle domain-2); 레스틴; 가용성 NRP-1; 가용성 VEGFR-1; SPARC; SU5416; 수라민; 테코갈란; 테트라티오몰리브데이트; 탈리도마이드; 레날리도마이드; 트롬보스폰딘; TIMP; TNP-470; TSP-1; TSP-2; 바소스타틴; VEGFR 길항제; VEGI; 볼록시키맙(M200); 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린; 렌바티닙(E7080); 모테사닙(AMG706); 파조파닙(Votrient); VEGF의 억제제; VEGFR1의 억제제; VEGFR2의 억제제; 알파5베타1 인테그린의 억제제; VEGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 및/또는 알파5베타1 인테그린의 펩티드, 펩티도미메틱, 소형 분자, 화합물 및/또는 핵산 억제제; IL-6 길항제; 항-IL-6 항체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고; 선택적으로, 증식성(혈관신생) 안구 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 99 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 유전적으로 조작된 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 100 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 다능성 세포로부터 제조되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 101 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 유전적으로 조작된 다능성 세포로부터 제조되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 101 또는 102에 있어서, 상기 RPE 세포에 의한, 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자의 제조를 가져오는 것인 동결보존 조성물.
청구항 103에 있어서, 상기 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자는: 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린; 특이적 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-VEGF 수용체 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-알파5베타1 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 103 내지 104 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈관신생을 억제하는 인자의 제조는 RPE-특이적 프로모터에 의해 조절되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 105에 있어서, 상기 RPE-특이적 프로모터는 RPE65 프로모터, 카텝신 D 근위 프로모터, 및 VMD2 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 101 내지 106 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 OCT-4, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-80을 포함하는 하나 이상의 마커에 대해 양성인 것인 동결보존 조성물.
청구항 101 내지 107 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 세포는 배양물에서 착색 상피 세포가 나타나기에 충분한 시간 동안 다층 집단 또는 배상체에서 배양된 인간 다능성 세포인 것인 동결보존 조성물.
청구항 108에 있어서, 상기 배양물에 착색 상피 세포가 나타나기에 충분한 시간은 약 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 5주 이상, 약 6주 이상, 또는 약 7주 이상, 약 8주 이상을 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 108 또는 109에 있어서, 상기 다층 집단 또는 배상체는 DMEM을 포함하는 배지에서 배양되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 110에 있어서, 상기 배지는 EB-DM을 포함하거나, 필수적으로 그로 구성되거나 또는 그로 구성되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 108 내지 111 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색 상피 세포는 단리되고 배양되어, RPE 세포의 집단을 생성하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 112에 있어서, 상기 단리는 세포 또는 세포의 덩어리를 효소에 의해, 화학적으로, 또는 물리적으로 배양물로부터 단리하는 단계, 및 착색 상피 세포, 또는 착색 상피 세포를 포함하는 세포의 덩어리를 선택하는 단계를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 108 내지 113 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배상체는 현탁 배양되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 108 내지 114 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배상체는 부착 배양물로 배양되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 115에 있어서, 상기 부착 배양물로 배양된 배상체는 착색 상피 세포를 포함하는 하나 이상의 외향 성장물을 생성하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 108 내지 116 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 감소된 HLA 항원 복잡성(antigen complexity)을 갖는 것인 동결보존 조성물.
청구항 108 내지 117 중 어느 한 항에 있어서, RPE 형성 전에, 상기 다능성 세포는 매트릭스 상에서 배양되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 118에 있어서, 상기 매트릭스는 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 콜라겐, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 콜라겐 VIII, 헤파란 술페이트, 매트리겔(Matrigel)™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제), CellStart, 인간 기저막 추출물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 118에 있어서, 상기 매트릭스는 매트리겔™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제)을 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 120 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커의 실질적인 발현을 갖지 않는 세포를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 121에 있어서, 상기 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커는 OCT-4, NANOG, Rex-1, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-80을 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 122 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하나 이상의 RPE 세포 마커에 대해 양성인 것인 동결보존 조성물.
청구항 123에 있어서, 상기 하나 이상의 RPE 세포 마커는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MITF, Otx2, PAX2, PAX6, ZO-1, 및/또는 티로시나아제를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 124 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 상기 평균 멜라닌 함량을 얻기 위해 충분한 시간 동안 RPE 세포를 휴지기 세포로 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 125 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 상기 RPE 세포의 50% 이상에서 베스트로핀 발현을 달성하기에 충분한 시간 동안 RPE 세포를 휴지기 세포로 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 126 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 마우스 배아 피더 세포(mouse embryonic feeder cell, MEF) 및 인간 배아 줄기 세포(hES)가 실질적으로 없는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 127 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛의 발현을 증가시키는 조건 하에서 상기 RPE 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 128에 있어서, 상기 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛은 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛 1, 알파 인테그린 서브유닛 2, 알파 인테그린 서브유닛 3, 알파 인테그린 서브유닛 4, 알파 인테그린 서브유닛 5, 알파 인테그린 서브유닛 6, 또는 알파 인테그린 서브유닛 9를 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 128 또는 129에 있어서, 상기 조건은 망간으로의 노출, 항-CD29 항체로의 노출, 단일클론 항체 HUTS-21로의 노출, 단일클론 항체 mAb TS2/16으로의 노출, 및/또는 상기 RPE 세포를 약 4 계대 이상 동안 계대시키는 것을 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 130 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 표 5에 기재된 기준 중 하나 이상을 충족시키는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 131 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 GMP(Good Manufacturing Practices)에 따라 제조되는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 132 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 면역 억제제 또는 면역 내성제를 더 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 133에 있어서, 상기 면역 억제제 또는 면역 내성제는 중간엽 줄기 세포, ALG(anti-lymphocyte globulin) 다중클론 항체, ATG(anti-thymocyte globulin) 다중클론 항체, 아자티오프린, 바실릭시맙® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), 다클리주맙® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 에베롤리무스, 마이코페놀산, 리툭시맙®(항-CD20 항체), 시롤리무스, 타크롤리무스, 및 마이코페놀레이트 모페틸 중 하나 이상을 포함하는 것인 동결보존 조성물.
청구항 74 내지 134 중 어느 한 항의 조성물 및 복수 개의 RPE 세포를 원하는 표적 농도까지 희석시키기에 충분한 부피의 약제학적으로 허용가능한 희석제를 담은 별개의 용기를 포함하는 키트.
청구항 135에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제의 부피는 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제의 전체 부피를 상기 복수 개의 RPE 세포 전체와 합치면 상기 원하는 표적 농도를 갖는 복수 개의 RPE 세포를 얻게 하는 것인 키트.
청구항 135 내지 136 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 면역 억제제 또는 면역 내성제를 더 포함하는 것인 키트.
청구항 137에 있어서, 상기 면역 억제제 또는 면역 내성제는 중간엽 줄기 세포, ALG(anti-lymphocyte globulin) 다중클론 항체, ATG(anti-thymocyte globulin) 다중클론 항체, 아자티오프린, 바실릭시맙® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), 다클리주맙® (항-IL-2Rα 수용체 항체), 에베롤리무스, 마이코페놀산, 리툭시맙®(항-CD20 항체), 시롤리무스, 타크롤리무스, 및 마이코페몰레이트 모페틸 중 하나 이상을 포함하는 것인 키트.
청구항 135 내지 138 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포 전에, 그와 동시에, 그 후에, 및/또는 그와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여되는 하나 이상의 혈관신생 억제제를 더 포함하는 것인 키트.
청구항 139에 있어서, 상기 하나 이상의 혈관신생 억제제는: 상기 하나 이상의 혈관신생 억제제는 페가타닙 소디움; 아플리베르셉트; 베바시라닙; 라파마이신; AGN-745; 비탈라닙; 파조파닙; NT-502; NT-503; PLG101; CPD791; 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편; 베바시주맙; 라니비주맙; 항-VEGFR1 항체; 항-VEGFR2 항체; 항-VEGFR3 항체; IMC-1121(B); IMC-18F1; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap(Aflibercept); AZD-2171(Cediranib); 티로신 키나아제 억제제(TKI); VEGFR-1 및/또는 VEGFR-2를 억제하는 TKI; 소라페닙(Nexavar); SU5416(Semaxinib); SU11248/수니티닙(Sutent); 반데타닙(ZD6474); Ly317615(Enzastaurin); 항-알파5베타l 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편; 볼로시키맙; 3-(2-{1-알킬-5-[(피리딘-2-일아미노)-메틸]-피롤리딘-3-일옥시}-아세틸아미노)-2-(알킬-아미노)-프로피온산; (S)-2-[(2,4,6-트리메틸페닐)술포닐]아미노-3-[7-벤질옥시카르보닐-8-(2-피리디닐아미노메틸)-1-옥사-2,7-디아자스피로-(4,4)-논-2-엔-3-일]카르보닐아미노 프로피온산; EMD478761; 또는 RC*D(ThioP)C*(Arg-Cys-Asp-Thioproline-Cys (아스테리스크는 시스테인 잔기를 통한 디술피드 결합에 의한 고리화를 나타냄); 2-메톡시에스트라디올; 알파V베타3 억제제; 안지오포이에틴 2; 혈관신생 억제 스테로이드 및 헤파린; 안지오스타틴; 안지오스타틴-관련 분자; 항-카텝신 S 항체; 항트롬빈 III 단편; 칼레티쿨린; 칸스타틴; 카르복시아미도트리아졸; 연골-유래 혈관신생 억제 인자; CDAI; CM101; CXCL10; 엔도스타틴; IFN-α; IFN-β; IFN-γ; IL-12; IL-18; IL-4; 리노미드; 마스핀; 매트릭스 메탈로프로테이나아제 억제제; Meth-1; Meth-2; 오스테오폰틴; 페가프타닙; 혈소판 인자-4; 프로락틴; 프롤리페린-관련 단백질; 프로트롬빈(kringle domain-2); 레스틴; 가용성 NRP-1; 가용성 VEGFR-1; SPARC; SU5416; 수라민; 테코갈란; 테트라티오몰리브데이트; 탈리도마이드; 레날리도마이드; 트롬보스폰딘; TIMP; TNP-470; TSP-1; TSP-2; 바소스타틴; VEGFR 길항제; VEGI; 볼록시키맙(M200); 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린; 렌바티닙(E7080); 모테사닙(AMG706); 파조파닙(Votrient); VEGF의 억제제; VEGFR1의 억제제; VEGFR2의 억제제; 알파5베타1 인테그린의 억제제; VEGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 및/또는 알파5베타1 인테그린의 펩티드, 펩티도미메틱, 소형 분자, 화합물 및/또는 핵산 억제제; IL-6 길항제; 항-IL-6 항체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고; 선택적으로, 증식성(혈관신생) 안구 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 키트.
하기를 포함하는, 약제학적 제제에서 사용하기 위한 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법:
(a) RPE 세포를 부착 조건(adherent condition) 하에 배양하여, 자갈(cobblestone) 형태를 갖는 착색 RPE 세포의 실질적으로 단층 배양물을 형성하는 단계; 및
(b) 상기 배양물로부터 동결보존 또는 약제학적 제제를 위한 RPE 세포를 선택하고 단리하는 단계로서, 단리 시, 착색 RPE 세포의 단리된 집단은 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 갖는 것인 단계.
청구항 141에 있어서, 10⁶개 이상의 RPE 세포가 동결보존 또는 약제학적 제제를 위해 단리되는 것인 방법.
청구항 141 또는 142에 있어서, 상기 RPE 세포는 다능성 줄기 세포로부터 제조되고, 상기 다능성 줄기 세포는 선택적으로 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 iPS 세포인 것인 방법.
청구항 141 내지 143 중 어느 한 항에 있어서, 평균 멜라닌 함량은 가장 많이 착색된 단리 RPE 세포의 5 퍼센트와 가장 적게 착색된 단리 RPE 세포의 5 퍼센트를 제외한 세포 집단에 대해 결정되는 것인 방법.
청구항 141 내지 155 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 5 pg/세포 미만, 4 pg/세포 미만, 3 pg/세포 미만, 2 pg/세포 미만, 및 0.1 pg/세포 이상, 및 선택적으로 0.5 pg/세포 또는 1 pg/세포 이상; 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-7 pg/세포, 0.5-6 pg/세포, 또는 1-5 pg/세포인 것인 방법.
하기를 포함하는 약제학적 제제에서 사용하기 위한 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법:
(a) RPE 세포를 부착 조건 하에 배양하여, 자갈 형태를 갖는 착색 RPE 세포의 실질적으로 단층 배양물을 형성하는 단계;
(b) RPE 세포가 8 pg/세포보다 높은 평균 멜라닌 함량에 도달하기 전에 1회 이상 RPE 세포를 계대(passage)시키는 단계; 및
(c) 선택적으로, 1회 이상의 계대 후에, 동결보존 또는 약제학적 제제를 위해 RPE 세포를 수집(harvest)하는 단계로서, 수집 시, 상기 RPE 세포는 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 갖는 것인 단계.
하기를 포함하는, 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법:
(a) 다능성 줄기 세포를 배양하여 배상체(EB)를 형성하거나, 또는 다능성 줄기 세포를 배양하여 다층 집단을 형성하는 단계로서, 상기 다능성 줄기 세포는 선택적으로 인간 배아 줄기 세포이거나 인간 iPS 세포인 것인 단계;
(b) 세포질에 분산된 갈색 색소를 포함하는 착색 세포의 출현을 위한 충분한 시간 동안, 세포의 다층 집단 또는 EB를 배양하는 단계; 및
(c) (b)의 착색 세포를 단리하고 배양하여 8 pg/세포 미만의 평균 착색(pigmentation) 수준을 갖는 RPE 세포를 포함하는 배양된 집단을 생성하는 단계.
청구항 147에 있어서, 단계 (b)는 상기 배상체를 배양하여 부착성 배양물을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 147에 있어서, 단계 (a)는 다능성 세포의 배양물이 더 증식하게 하여, 그에 의해 다층 집단을 형성할 수 있게 하는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 147 내지 149 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 상기 다능성 세포를 저-부착성 기질(low-adherent substrate) 상에서 배양하거나 또는 상기 다능성 세포를 현적(hanging drop) 방법을 이용하여 배양하여, 상기 다능성 세포로부터 배상체를 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 147 내지 150 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 세포는 유도 다능성 줄기(iPS) 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 산후(postpartum) 줄기 세포, 다분화능(multipotent) 줄기 세포, 또는 배아 생식 세포(embryonic germ cell)인 것인 방법.
청구항 147 내지 150 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 인간 ES 세포이거나 또는 인간 iPS 세포인 것인 방법.
청구항 147 내지 152 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 유전적으로 조작된 것인 방법.
청구항 153에 있어서, 상기 유전적 조작은 상기 RPE 세포에 의한, 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자의 제조를 가져오는 것인 방법.
청구항 154에 있어서, 상기 혈관신생을 억제하는 하나 이상의 인자는: 피브로넥틴 단편 또는 도메인; 아나스텔린; 특이적 항-VEGF 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-VEGF 수용체 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; 특이적 항-알파5베타1 인테그린 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 도메인; VEGF의 단편 또는 도메인; VEGFR 수용체의 단편 또는 도메인; VEGF-Trap; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 것인 방법.
청구항 147 내지 155 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 배상체가 형성되고 및/또는 단계 (c)에서 착색 세포가 배양되는 배양 배지는 DMEM을 포함하는 것인 방법.
청구항 147 내지 155 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 배상체가 형성되고 및/또는 단계 (c)에서 착색 세포가 배양되는 배지는 EB-DM을 포함하거나, 그로 필수적으로 구성되거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
청구항 147 내지 156 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 착색 세포가 배양되는 배지는 EB-DM을 포함하는 것인 방법.
청구항 147 내지 155 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 착색 상피 세포가 배양되는 배지는 RPE-GM/MM을 포함하거나, 그로 필수적으로 구성되거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
청구항 147 내지 159 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 배양의 지속 시간은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 이상이거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 이상인 것인 방법.
청구항 147 내지 160 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a), (b), 또는 (c)에서 사용되는 배양 배지는 EB-DM, RPE-GM/MM, MDBK-GM, OptiPro SFM, VP-SFM, EGM-2, 또는 MDBK-MM인 것인 방법.
청구항 147 내지 161 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 배양물을 트립신, 콜라게나아제, 디스파아제(dispase), 파파인, 콜라게나아제와 디스파아제의 혼합물, 및 콜라게나아제와 트립신의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 효소와 접촉시키는 단계를 포함하거나, 또는 배양물의 기계적 파쇄(mechanical disruption) 또는 단리를 포함하거나, 또는 배양물을 EDTA 또는 EGTA와 접촉시켜, 상기 착색 세포의 배양 기질(culture substrate)로의 부착을 파괴시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 147 내지 162 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 감소된 HLA 항원 복잡성을 갖는 것인 방법.
청구항 147 내지 163 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커의 실질적인 발현이 없는 것인 방법.
청구항 164에 있어서, 상기 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커는 OCT-4, NANOG, Rex-1, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, DPPA-2, 및/또는 DPPA-4를 포함하는 것인 방법.
청구항 147 내지 165 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하나 이상의 RPE 세포 마커에 대해 양성인 것인 방법.
청구항 166에 있어서, 상기 하나 이상의 RPE 세포 마커는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MITF, Otx2, PAX2, PAX6, 또는 티로시나아제이거나, 또는 선택적으로 PAX6 및 베스트로핀인 것인 방법.
청구항 147 내지 167 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포를 알파 인테그린 서브유닛 발현을 증가시키는 조건 하에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 168에 있어서, 상기 알파 인테그린 서브유닛은 1-6 또는 9인 것인 방법.
청구항 168 또는 169에 있어서, 상기 조건은 망간으로의 노출, CD29에 대한 항체로의 노출, 또는 상기 RPE 세포를 약 4 계대 이상 계대배양시키는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 170에 있어서, 상기 CD29에 대한 항체는 단일클론 항체이고, 선택적으로 HUTS-21 또는 TS2/16인 것인 방법.
청구항 147 내지 171 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포의 강화 배양물(enriched culture)을 증식시키기 위해 사용되는 배양 배지는 미분화 다능성 줄기 세포의 성장 또는 유지를 지지하지 않는 것인 방법.
청구항 147 내지 172 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 표 5에 기재된 기준 중 하나 이상을 준수하는 것인 방법.
청구항 147 내지 173 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 GMP(Good Manufacturing Practices)에 따라 수행되는 것인 방법.
청구항 147 내지 174 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EB는 ROCK(rho-associated protein kinase) 억제제의 존재 하에 형성되는 것인 방법.
청구항 175에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 Y-27632인 것인 방법.
청구항 175 또는 176에 있어서, 상기 RPE 형성 전에, 상기 다능성 세포는 매트리겔™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제) 상에서 배양되는 것인 방법.
인간 망막 색소 상피(RPE) 세포의 강화 집단(enriched population)을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 인간 배아 줄기(hES) 세포의 다층 집단을 제공하는 단계;
(b) 상기 hES 세포의 다층 집단을 추정적(putative) 인간 RPE 세포의 출현을 위한 충분한 시간 동안, 상기 hES 세포의 미분화 상태를 유지하지 않는 조건 하에 배양하는 단계로서, 상기 추정적 인간 RPE 세포는 그들의 세포질 내에 분산된 갈색 색소를 포함하는 것인 단계;
(c) 단계 (b)의 배양물로부터 하나 이상의 상기 추정적 인간 RPE 세포를 선택하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득된 상기 인간 RPE 세포를 배양하여 베스트로핀+ 이고 특징적인 자갈, 다각형, 상피-유사 외관(cobblestone, polygonal, epithelial-like appearance)을 갖고, 그들의 세포질 내에 분산된 갈색 색소를 포함하는 세포를 함유하는 배양물을 형성하여, 인간 RPE 세포의 강화 집단을 생성하는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
인간 망막 색소 상피(RPE) 세포의 강화 집단을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 인간 배아 줄기(hES) 세포의 배양물을 제공하는 단계;
(b) hES 세포를 배양하여 하나 이상의 배상체를 생성시키는 단계;
(c) 상기 하나 이상의 배상체를 상기 하나 이상의 배상체 중 하나 이상 내에 추정적 인간 RPE 세포의 출현을 위한 충분한 시간 동안 배양하여 그에 의해 추정적 인간 RPE 세포를 포함하는 하나 이상의 배상체가 형성되는 것인 단계로서, 상기 추정적 인간 RPE 세포는 그들의 세포질 내에 분산된 갈색 색소를 포함하는 것인 단계;
(d) 단계 (c)의 배양물로부터 추정적 인간 RPE 세포를 포함하는 상기 하나 이상의 배상체 중 하나 이상을 선택하고 분리시켜 인간 RPE 세포를 수득하는 단계; 및
(e) 단계 (d)에서 수득된 상기 인간 RPE 세포를 배양하여 베스트로핀+ 이고 특징적인 자갈, 다각형, 상피-유사 외관을 갖고, 그들의 세포질 내에 분산된 갈색 색소를 포함하는 세포를 함유하는 배양물을 형성하여, 인간 RPE 세포의 강화 집단을 생성하는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 178 또는 179에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양은 외부에서 첨가된 FGF를 포함하지 않는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 180에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양은 외부에서 첨가된 LIF를 포함하지 않는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 181에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양은 외부에서 첨가된 PLASMANATE® (탄산나트륨으로 완충되고, 0.005 M 소디움 카프릴레이트 및 0.004 M 아세틸트립토판으로 안정화된 100 mL 당 5g의 혈장 단백질을 포함하고, 상기 혈장 단백질은 약 88% 정상 인간 알부민, 12% 알파 및 베타 글로불린, 및 1% 이하의 감마 글로불린을 포함하며, 소디움 145 mEq/L, 포타슘 0.25 mEq/L, 및 클로라이드 100 mEq/L을 포함하는 수용액)를 포함하지 않는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
청구항 178 내지 183 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 배양 지속시간은 약 6주인 것인 방법.
청구항 178 내지 183 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 배양 지속시간은 약 4주 내지 약 5주, 약 7주 내지 약 4개월, 약 3개월 내지 약 5개월, 또는 약 6주 내지 약 8주인 것인 방법.
청구항 178 내지 183 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 배양 지속시간은 약 3개월 내지 약 5개월인 것인 방법.
청구항 178 내지 185 중 어느 한 항에 있어서, 결과적으로 수득된 RPE 세포의 배양물은 베스트로핀+, CRALBP+, PEDF+, 및 RPE65+인 RPE 세포를 포함하는 것인 방법.
청구항 186에 있어서, 결과적으로 수득된 RPE 세포의 배양물은 Oct4 및 Sox2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 ES 세포 마커의 부재를 갖는 것인 방법.
청구항 178 내지 187 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 전에, 상기 hES 세포는 외부에서 첨가된 FGF의 존재 하에 배양되는 것인 방법.
청구항 178 내지 188 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 전에, 상기 hES 세포는 외부에서 첨가된 FGF 및 LIF의 존재 하에 배양되는 것인 방법.
청구항 178 내지 188 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 전에, 상기 hES 세포는 외부에서 첨가된 FGF, PLASMANATE® (탄산나트륨으로 완충되고, 0.005 M 소디움 카프릴레이트 및 0.004 M 아세틸트립토판으로 안정화된 100 mL 당 5g의 혈장 단백질을 포함하고, 상기 혈장 단백질은 약 88% 정상 인간 알부민, 12% 알파 및 베타 글로불린, 및 1% 이하의 감마 글로불린을 포함하며, 소디움 145 mEq/L, 포타슘 0.25 mEq/L, 및 클로라이드 100 mEq/L을 포함하는 수용액) 및 섬유모세포 피더 층(fibroblast feeder layer)의 존재 하에 배양되는 것인 방법.
청구항 178 내지 190 중 어느 한 항에 있어서, 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 포함하는 RPE 세포의 집단을 생성하는 것인 방법.
청구항 191에 있어서, 상기 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 5 pg/세포 미만, 4 pg/세포 미만, 3 pg/세포 미만, 2 pg/세포 미만, 및 0.1 pg/세포 이상, 및 선택적으로 0.5 pg/세포 또는 1 pg/세포 이상; 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-7 pg/세포, 0.5-6 pg/세포, 또는 1-5 pg/세포인 것인 방법.
청구항 191 또는 192에 있어서, 상기 RPE 세포를 상기 멜라닌 함량을 수득하기에 충분한 시간 동안 휴지기 세포로 유지시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 178 내지 193 중 어느 한 항에 있어서, RPE 형성 전에, 상기 다능성 세포는 매트릭스 상에서 배양되는 것인 방법.
청구항 194에 있어서, 상기 매트릭스는 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴(entactin), 콜라겐, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 콜라겐 VIII, 헤파란 술페이트, 매트리겔(Matrigel)™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제(soluble preparation)), CellStart, 인간 기저막(basement membrane) 추출물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
청구항 194에 있어서, 상기 매트릭스는 매트리겔™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제)을 포함하는 것인 방법.
청구항 179 내지 196 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EB는 ROCK(rho-associated protein kinase) 억제제의 존재 하에 형성되는 것인 방법.
청구항 197에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 Y-27632인 것인 방법.
청구항 197 또는 198에 있어서, 상기 RPE 형성 전에, 상기 다능성 세포는 매트리겔™((EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터의 가용성 제제) 상에서 배양되는 것인 방법.
청구항 178 내지 199 중 어느 한 항에 있어서, 결과적으로 수득된 RPE 세포의 배양물은 Pax6+인 RPE 세포를 포함하는 것인 방법.
청구항 178 내지 200 중 어느 한 항에 있어서, 결과적으로 수득된 RPE 세포의 배양물은 Pax6-인 RPE 세포를 포함하는 것인 방법.
청구항 178 내지 201 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 RPE 세포를 포함하는, 약제학적 제제.
망막 변성(retinal degradation)의 치료를 위해 적합한 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제로서, 상기 RPE 세포는 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 포함하고, 상기 RPE 세포는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 것인 약제학적 제제:
이식 후 약 1개월 이상 동안 그들의 표현형 유지,
약 1개월 이상 동안 배양에서 그들의 표현형 유지,
이식 후 숙주로의 통합(integrate),
이식 후 실질적으로 증식하지 않음,
식세포 활성(phagocytositic)을 가짐,
비타민 A의 전달, 대사, 또는 저장,
이식 후, 망막과 맥란막 간 철의 수송,
이식 후 맥란막(Bruch's membrane)으로의 부착,
이식 후, 미광 흡수,
알파 인테그린 서브유닛의 상승된 발현,
공여된(donated) 인간 조직으로부터 유래된 RPE 세포보다 긴 평균 텔로미어 길이,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 배양에서의 더 긴 복제 수명(replicative lifespan),
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 높은 하나 이상의 알파 인테그린 서브유닛의 발현,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 A2E 함량,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 리포푸신(lipofuscin) 함량,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 축적된 자외선 손상, 또는
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 많은 수의 식포(phagosome).
망막 변성의 치료를 위해 적합한 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제로서, 상기 RPE 세포는 8 pg/세포 미만의 평균 멜라닌 함량을 포함하고, 상기 RPE 세포는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 것인 약제학적 제제:
이식 후 맥란막으로의 부착,
이식 후, 미광 흡수,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE 세포보다 긴 평균 텔로미어 길이,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 배양에서의 더 긴 복제 수명,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 A2E 함량,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 리포푸신 함량,
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 낮은 축적된 자외선 손상, 또는
공여된 인간 조직으로부터 유래된 RPE보다 더 많은 수의 식포.
청구항 202 내지 204 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평균 멜라닌 함량은 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 5 pg/세포 미만, 4 pg/세포 미만, 3 pg/세포 미만, 2 pg/세포 미만, 및 0.1 pg/세포 이상, 및 선택적으로 0.5 pg/세포 또는 1 pg/세포 이상; 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-7 pg/세포, 0.5-6 pg/세포, 또는 1-5 pg/세포인 것인 약제학적 제제.
해동된, 청구항 74 내지 134 중 어느 한 항에 따른 동결보존 RPE 세포 또는 청구항 135 내지 140 중 어느 한 항에 따른 키트에 담긴 동결보존 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제로서, 상기 RPE 세포는 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 구성된 것인 약제학적 제제.
청구항 1 내지 73 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 키트의 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제.
청구항 202 내지 207 중 어느 한 항에 있어서, 망막 변성을 치료하기 위해 사용되는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 208 중 어느 한 항에 있어서, 필요로 하는 환자에서 스타르가르트병(Stargardt's disease), 건성 또는 습성 연령-관련 황반 변성(dry or wet age-related macular degeneration)(AMD), 맥란막 결손(choroideremia), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa), 망막 박리(retinal detachment), 망막 이형성(retinal dysplasia), 망막 위축증(retinal atrophy), 혈관무늬 망막증(Angioid streaks), 또는 근시성 황반 변성(Myopic Macular Degeneration)에 의한 망막 변성을 예방 또는 치료하기 위한 유효량의 RPE 세포를 포함하는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 209 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 현탁액, 겔, 또는 콜로이드와 같은, 주사가능한 제형으로 이식을 위해 제제화되는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 210 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 매트릭스, 기질, 스카폴드, 또는 이식물에 의한 이식을 위해 제제화되는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 211 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 안구의 망막하 공간으로의 투여를 위해 제제화되는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 212 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 10³-10⁹개 이상의 RPE 세포, 약 10,000 내지 약 10⁶ 개의 RPE 세포, 약 25,000 내지 약 400,000개의 RPE 세포, 또는 약 50,000 내지 약 200,000개의 RPE 세포를 포함하는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 213 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커의 실질적 발현이 없는 것인 약제학적 제제.
청구항 214에 있어서, 상기 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커는 OCT-4, NANOG, Rex-1, 알칼리 포스파타아제, Sox2, TDGF-1, DPPA-2, 및/또는 DPPA-4를 포함하는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 215 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 상기 하나 이상의 RPE 세포 마커에 대해 양성인 것인 약제학적 제제.
청구항 216에 있어서, 상기 하나 이상의 RPE 세포 마커는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MITF, Otx2, PAX2, PAX6, 또는 티로시나아제를 포함하는 것인 약제학적 제제.
청구상 202 내지 217 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RTE 세포는 증가된 알파 인테그린 서브유닛 발현을 보이는 것인 약제학적 제제.
청구항 208에 있어서, 상기 알파 인테그린 서브유닛은 알파 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 9인 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 219 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RTF 세포는 표 5에 기재된 기준 중 하나 이상을 준수하는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 220 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 75% 이상의 RPE 세포를 포함하는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 221 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 바이러스, 박테리아, 및/또는 균류 오염이 실질적으로 없는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 222 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 제제화되는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 223 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 안구로의 투여를 위해 제제화되는 것인 약제학적 제제.
청구항 224에 있어서, 상기 제제는 망막하 공간(sub-retinal space)로의 투여를 위해 제제화되는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 225 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 이식시 망막 내로 통합될 수 있는 기능성 RPE 세포인 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 226 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 및 인간 배아 줄기 세포(hES)를 실질적으로 포함하지 않는 것인 약제학적 제제.
청구항 202 내지 227 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 GMP(Good Manufacturing Practices)에 따른 것인 약제학적 제제.
청구항 1 내지 140 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 키트의 RPE 세포를 포함하는 약제학적 제제, 청구항 202 내지 228 중 어느 한 항에 따른 약제학적 제제, 또는 청구항 147 내지 201 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 RPE 세포를 RPE 세포의 이식이 치료적으로 유용한 것인 망막 변성 질환 또는 기타 질환을 치료하기에 유효한 양으로 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, RPE 세포의 이식이 치료적으로 유용한 것인 망막 변성 질환 또는 기타 질환을 치료하는 방법.
청구항 229에 있어서, 상기 망막 변성 질환은 맥란막 결손, 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 연령-관련 황반 변성(건성 또는 습성), 망막 박리, 망막색소 변성증, 스타르가르트병, 혈관무늬 망막증, 또는 근시성 황반 변성을 포함하는 것인 방법.
청구항 229 또는 230에 있어서, 상기 투여하는 단계는 필요로 하는 안구로의 상기 RPE 세포의 안구내 투여를 포함하는 것인 방법.
청구항 231에 있어서, 상기 안구내 투여는 상기 RPE 세포의 망막하 공간으로의 주사를 포함하는 것인 방법.
청구항 232에 있어서, 상기 안구내 투여는 수용액, 선택적으로 등장액 및/또는 염수(saline solution)의 망막하 공간으로의 주사에 의한 전-수포(pre-bleb)의 형성, 및 상기 RPE 세포의 상기 수용액과 동일한 망막하 공간으로의 투여 전 상기 수용액의 제거를 포함하는 것인 방법.
청구항 232 또는 233에 있어서, 상기 주사는 니들 또는 주사 캐뉼라를 통해 이루어지는 것인 방법.
청구항 234에 있어서, 상기 니들 또는 주사 캐뉼라의 직경은 약 0.3 mm 내지 0.9 mm 또는 약 0.5 내지 약 0.6 mm인 것인 방법.
청구항 234 내지 235 중 어느 한 항에 있어서, 상기 니들 또는 주사 캐뉼라는 약 0.09 mm 내지 약 0.15 mm의 직경을 갖는 팁을 포함하는 것인 방법.
청구항 234 내지 236 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캐뉼라는 MEDONE POLYTIP^® Cannula 25/38g (0.12mm (38g) x 5mm 팁을 갖는 0.50mm (25g) x 28mm 캐뉼라)인 것인 방법.
청구항 229 내지 237 중 어느 한 항에 있어서, 치료의 유효성(effectiveness)은 세극등 바이오현미경 촬영(slit lamp biomicroscopic photography), 안저 촬영(fundus photography), IVFA, 및 SD-OCT, 및 BCVA(best corrected visual acuity) 중 하나 이상에 의해 시각적 결과(visual outcome)를 결정하는 것에 의해 평가되는 것인 방법.
청구항 229 내지 238 중 어느 한 항에 있어서, BCVA(best corrected visual acuity)의 개선 및/또는 ETDRS(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study) 시력 차트에서 판독가능한 문자의 증가를 가져오는 것인 방법.
청구항 239에 있어서, 상기 망막 변성 질환은 건성 AMD 또는 스타르가르트병인 것인 방법.
청구항 229 내지 240 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막 변성 질환을 치료하기에 유효한 양은 약 20,000-200,000개의 RPE 세포, 약 20,000-500,000개의 RPE 세포, 약 20,000-2,000,000개의 RPE 세포, 또는 약 20,000개 이상의 RPE 세포인 것인 방법.
청구항 241에 있어서, 상기 망막 변성 질환을 치료하기에 유효한 양은 약 20,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 200,000, 또는 500,000개 이상의 RPE 세포인 것인 방법.
청구항 229 내지 242 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 전에 또는 그와 동시에 코르티코스테로이드를 투여받지 않는 것인 방법.
청구항 229 내지 242 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 전 3, 6, 12, 24, 48, 72, 또는 96 시간 이상 내에, 또는 상기 RPE 세포의 투여와 동시에 코르티코스테로이드를 투여받지 않는 것인 방법.
청구항 229 내지 244 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 전 1시간 이상 내에 또는 상기 RPE 세포의 투여 직전에 또는 그와 동시에 코르티코스테로이드를 투여받지 않는 것인 방법.
청구항 229 내지 245 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 후 적어도 12, 24, 48, 72, 또는 96 시간 내에 코르티코스테로이드를 투여받지 않는 것인 방법.
청구항 229 내지 245 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 상기 RPE 세포의 투여 후 적어도 48 시간 내에 코르티코스테로이드를 투여받지 않는 것인 방법.
청구항 229 내지 247 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 혈관신생 억제제, 항산화제, 항산화제 보조인자(antioxidant cofactor), 증가된 항산화 활성에 기여하는 기타 인자, 황반 크산토필(macular xanthophyll), 장쇄 오메가-3 지방산, 아밀로이드 억제제, CNTF 효능제(agonist), RPE65의 억제제, A2E 및/또는 리포푸신 축적을 표적화하는 인자, 광수용체 기능 및/또는 대사의 하향조절제(downregulator) 또는 억제제, α2-아드레날린 수용체 효능제, 선택적 세레토닌1A 효능제, C-5를 표적화하는 인자, 막 공격 복합체(membrane attack complex)(C5b-9) 및 기타 드루센(Drusen) 성분, 면역 억제제, 및 리포푸신의 축적을 예방 또는 치료하는 작용제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제와 조합되어 환자에게 투여되는 것인 방법.
청구항 248에 있어서, 상기 하나 이상의 작용제는 상기 RPE 세포의 제제와 동시에, 그 전에, 및/또는 그 후에 상기 환자에게 투여되는 것인 방법.
RPE 세포의 이식이 치료적으로 유용한 것인 망막 변성 질환 또는 기타 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 청구항 1 내지 140 또는 202 내지 228 중 어느 한 항에 따른 조성물, 키트, 또는 약제학적 제제의 용도.
청구항 250에 있어서, 상기 망막 변성 질환은 맥란막 결손, 당뇨 망막병증, 건성 연령-관련 황반 변성, 습성 연령-관련 황반 변성, 망막 박리, 망막색소 변성증, 스타르가르트병, 혈관무늬 망막증, 또는 근시성 황반 변성을 포함하는 것인 용도.
청구항 147 내지 201 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 OCT-4, 알칼리 포스파타아제, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및 TRA-1-80으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 것인 방법.
청구항 1 내지 140 또는 202 내지 228 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하기 특징 중 하나 이상을 보이는 것인 조성물, 키트, 또는 약제학적 제제:
다른 소스(source)로부터 수득된 RPE 세포의 복제 수명보다 긴 복제 수명;
hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 텔로미어 길이(또는 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 집단의 평균)의 30% 이상, 또는 hESC 및/또는 인간 iPS 세포의 텔로미어 길이의 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 퍼센트 이상인 평균 텔로미어 길이;
4 kb보다 길거나, 또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 심지어 13 kb, 또는 10 kb 또는 그보다 더 긴 평균 TRF(terminal restriction fragment) 길이;
성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 리포푸신 함량의 50 퍼센트 미만, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 리포푸신 함량의 40, 30, 20, 또는 10 퍼센트 미만인 평균 리포푸신 함량;
성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E) 함량의 50% 미만, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 A2E 함량의 40, 30, 20, 또는 10 퍼센트 미만인 평균 A2E 함량;
10⁵ (100,000)개의 세포당 50 ng 미만인 평균 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E) 함량;
성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수에 대한 POS(photoreceptor outer segment)의 식세포 작용 속도보다 50 퍼센트 이상 더 크거나, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포에 대한 POS의 식세포 작용의 속도보다 75, 100, 150, 또는 200 퍼센트 이상 더 큰 POS의 식세포 작용 속도;
24시간 후 POS(photoreceptor outer segment)의 총 농도의 20 퍼센트 이상, 또는 24시간 후 POS의 총 농도의 25, 30, 25, 40, 또는 50 퍼센트 이상인 POS의 식세포 작용의 속도;
성체 숙주로부터 단리된 RPE 세포 대비 축적된 산화적 스트레스 및/또는 DNA 손상의 감소된 수준;
성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 평균 프로테오솜(proteasome) 활성보다 50 퍼센트 이상 더 높거나, 또는 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 평균 프로테오솜 활성보다 60, 70, 80, 90 또는 100 퍼센트 이상 더 높은 평균 프로테오솜 활성;
성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수에 대한 유비퀴틴 접합체(ubiquitin conjugate)의 평균 축적의 50 퍼센트 미만이거나 또는 성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수의 유비퀴틴 접합체의 평균 축적의 40, 30, 20, 또는 10 퍼센트 미만인 유비퀴틴 접합체의 평균 축적.
청구항 1 내지 140 또는 202 내지 228 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포는 하기 특징 중 하나 이상을 보이는 것인 조성물, 키트, 또는 약제학적 제제:
다른 소스로부터 수득된 RPE 세포의 복제 수명보다 긴 복제 수명;
성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 리포푸신 함량의 50% 미만, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 리포푸신 함량의 40, 30, 20, 또는 10 퍼센트 미만의 평균 리포푸신 함량;
성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E) 함량의 50% 미만, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 수의 RPE 세포의 평균 A2E 함량의 40, 30, 20, 또는 10 퍼센트 미만인 평균 A2E 함량;
10⁵ (100,000)개의 세포당 50 ng 미만인 평균 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E) 함량;
성체 안구로부터 단리된 RPE 세포의 동일한 수에 대한 POS(photoreceptor outer segment)의 식세포 작용 속도보다 50 퍼센트 이상 더 크거나, 또는 성체 안구로부터 단리된 동일한 갯수의 RPE 세포에 대한 POS의 식세포 작용의 속도보다 75, 100, 150, 또는 200 퍼센트 이상 더 큰 POS의 식세포 작용 속도; 또는
성체 숙주로부터 단리된 RPE 세포 대비 축적된 산화적 스트레스 및/또는 DNA 손상의 감소된 수준.