JP2018526659A

JP2018526659A - 電気化学的検出方法によるアレルゲン検出装置

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Publication number: JP2018526659A
Application number: JP2018530460A
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Inventors: ティキュイム
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Abstract

本発明による電気化学センサは、血液内のバックグラウンドによる感度低下を防止して、セロトニンの電流値を正確に測定することができ、アレルギーの診断を効率よく行うことができる。【選択図】図４

Description

本発明は、セロトニンの酸化反応が起きる作業電極、及び電圧が印加される基準電極とを含み、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定して、セロトニンの有無又は濃度を確認する電気化学センサにおいて、前記作業電極は、（−）電荷を帯びるコート層を含み、コート層の静電気力で（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制するセロトニン検出用電気化学センサ、及びこれを含む電気化学的検出方法によるアレルゲン検出装置に関する。また、本発明は、前記センサで分離された生体サンプルを処理するステップと、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定するステップとを含むアレルゲン確認方法に関する。

アレルギーとは、免疫システムの誤作動で、通常の人間には別に影響しない物質が、特定の人間に、蕁麻疹、かゆみ、鼻水、及び咳などの異常過敏反応を起こすことを意味する。アレルギーを起こす物質としては、食品、大気、花粉、カビ、ほこり、動物など、非常に様々である。一方、アレルギー反応による症状としては、かゆみ症、咳などの軽い症状が殆どであるが、ひどい場合、喘息、発作、及びショックによる死亡に至ることがあり、その反応が非常に短時間に生じることがあって、アレルギー反応の可否を予め診断することが重要である。

アレルギー物質が人体に入ると、免疫クロブリンE（Immuno Globulin E）というIgE抗体が生成されるが、アレルギー体質の人間は、正常人と比較して、該IgE抗体が多く生産されるため、血液内のIgE抗体濃度が正常人よりも高く検出される。

従来のアレルギー検査には、プリック（prick）テストがあり、近年の診断方法としては、血清中のIgE抗体濃度（以下、‘IgE量’又は‘IgE抗体値’）量を測定する方法が用いられている。プリックテストは、スポイトを用いて、抗原物質を腕に落として針で刺した後に、痕の有無でアレルギー反応を調査するテストである。IgE量の測定方法は、血液検査の一種で、血液内のIgE量の程度によって、抗原物質に対するアレルギー反応を調査するテストであって、放射性免疫測定法、非放射性免疫測定法、MAST（multiple antigen stimultaneous test）、及び放射性アイソトープを用いたRAST（Radioimmunosorbent test）などが用いられている。しかし、プリックテストの場合、過敏反応によるショック可能性があるため、人間によっては非常に危険な方法に分類され、IgE量の測定方法は、操作が煩雑であり、特殊な技術と装置を要し、最終診断まで時間とコストが多くかかるという不都合がある。

in vivoにおけるIgE量を測定するアレルゲン診断法とは異なり、血中メディエーター（Mediator）を検出すると、安全且つ正確にアレルゲンの検査結果を迅速に判明することができる。

メディエーター検出法は、アレルギー反応が起きるときに検出されるケミカルメディエーター（chemical mediator）を検出することで、アレルゲンを特定する方法である。ケミカルメディエーターには、アレルゲンによりIgE抗体の架橋反応を起こして、好塩基球、肥満細胞から脱顆粒されるpreformed mediatorと、その反応によって生成されるnewly generated mediatorとがある。Preformed mediatorには、ヒスタミン（histamine）、セロトニン（serotonin）、キマーゼ（Chymase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）、N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（N-acetyl-β-D-glucosaminidase）などが挙げられる。Newly generated mediatorとしては、プロスタグランジン（prostaglandin）、ロイコトリエン（leukotriene）、トロンボキサン（thromboxane）などがある。

アレルギー患者の全血に複数種類のアレルゲンを添加する時に検出されるケミカルメディエーター中に、セロトニンを電気化学的に測定することで、アレルギー患者がどのアレルゲンに対するアレルギー反応を起こすかを提供するPOCTアレルゲン検出装置の提供が可能である。

本発明者は、IgE量を測定するアレルゲン診断法の不都合を克服するために、アレルギー反応によって生成される血液内のセロトニンを、電気化学的検出により選択的に測定するアレルゲン検出装置を開発して、迅速且つ便利にアレルギーを診断する方法を提供したことがある（大韓民国公開特許公報第１０−２００７−０１１７２３９号）。

本発明者は、従来の電気化学センサにおいて、血液内のセロトニンの電気化学的検出によりアレルゲンを診断した結果が、IgE量を基に診断した結果と相関性が低くなっている問題点を確認し、これを解決しようと鋭意研究した結果、（−）電荷を帯びるコート層を含む作業電極が備えられたセンサを用いる場合、アレルギー診断の正確度を高めることを確認し、本発明を完成した。

本発明の１つの目的は、セロトニンの酸化反応が起きる作業電極と、電圧が印加される基準電極とを含み、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定して、セロトニンの有無又は濃度を確認する電気化学センサにおいて、前記作業電極は、（−）電荷を帯びるコート層を含み、コート層の静電気力で、（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制するセロトニン検出用電気化学センサを提供することである。

本発明の他の目的は、セロトニンの酸化電位の印加時にセロトニンの酸化反応が起きる作業電極と、電圧が印加される基準電極とを含むセロトニン測定用ストリップにおいて、前記作業電極は、静電気力で（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制するように、（−）電荷を帯びるコート層を含むセロトニン検出用ストリップを提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記ストリップを１つ以上備えるセロトニン検出用センサを提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記センサを備えるセロトニン測定キットを提供することである。

また、本発明の他の目的は、分離された生体サンプルを、前記センサで処理するステップと、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定するステップとを含むアレルゲン確認方法を提供することである。

本発明によるセンサは、サンプル内に存在する（−）電荷を帯びる妨害物質によるバックグラウンドを減少することができるので、アレルギーの診断において、高い正確度を得ることができる。

図１ａは、作業電極をナフィオンでコートしない従来のセロトニン測定用電気化学センサを示す模式図である。図１ｂは、セロトニンの電流値を測定する方法を示す電気化学センサの概念図である。図２は、セロトニンの酸化反応式、及びセロトニンの循環電圧電流曲線（cyclic voltammogram）において、電流ピークを示すグラフである。図３は、ナフィオンでコートされた作業電極を含むセンサ（Ａ）と、ナフィオンでコートされない作業電極とを含むセンサ（Ｂ）におけるアスコルビン酸由来循環電圧電流曲線（cyclic voltammogram）である。図４は、ナフィオンでコートされた作業電極を含むセンサにおいて、アスコルビン酸とセロトニンが共に存在する場合の循環電圧電流曲線（cyclic voltammogram）である。図５は、ナフィオンでコートされた作業電極を含むセンサ（Ａ）と、ナフィオンでコートされない作業電極とを含むセンサ（Ｂ）におけるバックグラウンド減少効果を確認した血液の循環電圧電流曲線（cyclic voltammogram）である。図６は、IgE抗体値によって、アレルギー陽性反応を示す血液及び陰性反応を示す血液に対して、ナフィオンでコートされた作業電極を含むセンサにおいて、セロトニン酸化電位の印加時に流れる酸化電流値を示すグラフである。

本発明の第１の様態は、セロトニンの酸化反応が起きる作業電極と、電圧が印加される基準電極とを含み、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定して、セロトニンの有無又は濃度を確認する電気化学センサにおいて、前記作業電極は、（−）電荷を帯びるコート層を含み、コート層の静電気力で、（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制するセロトニン検出用電気化学センサを提供する。

また、本発明の第２の様態は、セロトニンの酸化電位の印加時に、セロトニンの酸化反応が起きる作業電極と、電圧が印加される基準電極とを含むセロトニン測定用ストリップにおいて、前記作業電極は、静電気力で（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制するように、（−）電荷を帯びるコート層を含むセロトニン検出用ストリップを提供する。

また、本発明の第３の様態は、本発明の第２の様態によるストリップを１つ以上備えるセロトニン検出用センサを提供する。

また、本発明の第４の様態は、本発明の第１の様態によるセンサを備えるセロトニン測定キットを提供する。

また、本発明の第５の様態は、本発明の第１の様態によるセンサで分離された生体サンプルを処理するステップと、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定するステップとを含むアレルゲン確認方法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

セロトニンの酸化反応が起きる作業電極と、電圧が印加される基準電極とを含み、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定する電気化学センサにおいて、血液内のセロトニンの電気化学的検出によりアレルゲンを診断した結果、IgE量によって診断した結果との相関性を得られなかった。

本発明者は、その原因として、電気化学的検出において、生体試薬の電極活性種の影響によって、バックグラウンドの上昇及び感度低下の問題が生じることを確認した。すなわち、血液内に高濃度で存在するアスコルビン酸、尿素、及び尿酸などが、セロトニンを電気化学的に検出することに当たり、妨害物質として働くことを確認した。

これに対して本発明者は、感度の低下が生じなく、正確度が高く且つ便利にアレルギーを診断する装置を開発するために、アスコルビン酸、尿酸などの妨害物質は、（−）で帯電しているので、（−）固定電荷を有する高分子膜を通過することが不可であることを応用して、セロトニンの酸化反応が起きる作業電極に、（−）電荷を帯びるコート層を導入したところ、バックグラウンドが減少すると共に、アレルギーの診断が可能であることを確認し、本発明を完成することに至った。

“アレルギー誘発物質”又は“アレルゲン”は、通常の人間には別に影響しない物質が、特定の人間に、蕁麻疹、かゆみ、鼻水、及び咳などの異常過敏反応を起こす原因物質である。アレルギー誘発物質の種類としては、花粉、埃、食べ物、ウイルス、ダニ、薬物などがあり、花粉の場合も、白樺、楢柏、芝、及び蕁麻疹ヨモギの花粉など、非常に多様である。本発明では、アレルギー反応が起き、血液内のセロトニンの濃度を増加させるものであれば、アレルギー誘発物質の種類に制限はない。

“セロトニン”は、５-ヒドロキシトリプタミン（５-Hydroxytryptamine;５HT）の構造を有し、Ｃ_１０Ｈ_１２Ｎ_２０の分子式からなる生理活性アミンの一種であって、アレルギー反応によって、肥満細胞から分泌されるケミカルメディエーター（chemical mediator）である。

アレルギーの原因となる抗原（アレルゲン）が最初に体内に侵入すると、体内にIgE抗体が生成され、前記生成されたIgE抗体は、肥満細胞の表面受容体（high-affinity receptor for IgE、FcεRI）と結合する。その後、同一の抗原が反復的に体内に侵入して、肥満細胞表面に位置したIgE-高親和性受容体に前記抗原が結合すると、肥満細胞は、活性化信号を開始することになり、最終的に顆粒内ケミカルメディエーターであるセロトニンなどの分泌を誘導して、アレルギー反応を起こすことになる。

セロトニンの酸化反応は、０.２Ｖ〜０.４Ｖ、具体的に０.３Ｖ〜０.４Ｖで起きる。

０〜１.０Ｖ範囲の循環電圧電流法（Cyclic Voltammetry）により、セロトニンの電極反応を測定したところ、０.３Ｖで電流ピークが現れ始めた（図２）。前記ピークは、０.３Ｖでセロトニンの酸化反応が起き、セロトニンから放出された電子によって現れるものであって、０.３Ｖの酸化電位を用いる場合、セロトニンを測定することができ、アレルギー反応の診断可能性を確認した。

本発明は、血液内に高濃度で存在する電極活性種であるアスコルビン酸及び／又は、尿素及び／又は尿酸の影響によって、作業電極でセロトニンの酸化反応時に、バックグラウンドの上昇及び感度低下の問題を解決するために、前記作業電極は、静電気力で（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制するために、（−）電荷を帯びるコート層を含む。（−）電荷を帯びる高分子を含有するコート層は、（−）電荷の静電気力によって、同一の電荷である（−）電荷を有するイオン、例えば、アスコルビン酸、尿素、又は尿酸だけでなく、（−）電荷を帯びる電極活性種の接近は抑制しながら、電荷を帯びないか、中性であるか、反対電荷である（＋）電荷を有するイオンの接近を許容する。

そこで、前記（−）電荷を帯びるコート層は、サンプルとの接触時、（−）電荷を帯びる高分子を含有するものであると、その材質の種類及びコーティング方式を問うことはない。

例えば、前記コート層は、陽電荷イオン交換高分子を含有する。前記高分子の非制限的な例としては、陽電荷イオン交換樹脂があるが、（−）電荷を帯びる物質又は陽電荷イオン交換高分子として、センサをコートすることができる物質であれば制限なく、コート層の材料として使用可能である。前記高分子は、スルホン酸基（−ＳＯ_３ ⁻）、カルボキシ酸基（−ＣＯＯ⁻）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、及びヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む。

非制限的な例として、前記陽電荷イオン交換高分子には、スルホン化テトラフルオロエチレン基盤フッ素-共重合体（sulfonated tetrafluoroethylene based fluoropolymer-copolymer）がある。

ナフィオン（nafion）は、イオン交換の性質を有する物質であって、“スルホン化テトラフルオロエチレン基盤フッ素-共重合体（sulfonated tetrafluoroethylene based fluoropolymer-copolymer）”の一種である。

本発明の一実施例において、（−）電荷を帯びる物質でコートされた作業電極を含むセンサと、コートされない作業電極を含むセンサとを用いて、アスコルビン酸のサイクリックボルタンメトリー（cyclic voltammetry）を施した。その結果、（−）電荷を帯びる物質でコートされた作業電極を含むセンサでは、アスコルビン酸由来の電流値が示されないことに対して、コートされない作業電極を含むセンサでは、４００〜６００ｍＶ範囲でアスコルビン酸由来の電流値が示された（図３）。これにより、作業電極が（−）電荷を帯びるコート層を含む場合、アスコルビン酸のように（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制して、セロトニンの電流値を測定することに当たり、感度が向上することを確認した。

また、アスコルビン酸とセロトニンがサンプル内に共に存在する場合、（−）電荷を帯びる物質でコートされた作業電極を含むセンサを用いて、セロトニンのピーク電流を測定した結果、（−）電荷を帯びる物質でコートされない作業電極を含むセンサとは異なり、セロトニンを測定する３５０ｍＶでは電流値が示されると共に、アスコルビン酸によるバックグラウンドのピークは、現れなかった（図４）。結果として、前記センサは、感度が低下することなく、セロトニンを測定可能であることを確認した。

例えば、前記コート層は、（−）電荷を帯びる高分子又は陽電荷イオン交換高分子を、０.００１〜９９.９重量％、具体的に、０．０１〜９５重量％で含む。

例えば、前記コート層は、セロトニンが作業電極に直接接触できるように、気孔又はパターンが形成されるものである。例えば、作業電極の電極パターンとコート層パターンが一部又は全部重畳することなく、交番して形成されてもよく、電極パターンに相応して、その上にコート層のパターンが形成されてもよい。

本発明の作業電極は、セロトニンの酸化反応が起きる電極である。

作業電極材料の非制限的な例としては、それぞれ独立して、銅、白金、銀、金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、及びイリジウムなどの金属、カーボン、ＧａＡｓ、ＣｄＳ、Ｉｎ_２Ｏ_３のような半導体など、又はそれぞれの材料に表面処理を施した材料が挙げられる。もっとも望ましくは、金電極である。作業電極及び基準電極は、印刷回路基板の形態であってもよい。

一方、電位の基準として、標準水素電極の電位を便宜上０Ｖとし、一般に、カロメル（calomel）電極、銀-塩化銀電極などの単極電位が、基準電極として使用可能である。基準電極は、一定の電位を維持可能なＡｇ／ＡｇＣｌ電極、又は類似基準電極として使用可能な電極が望ましい。

本発明による電気化学センサは、作業電極と基準電極の他に、電流変化を測定する対照電極をさらに含むことができる。

本発明により、セロトニンの酸化電位の印加時にセロトニンの酸化反応が起きる作業電極と、電圧が印加される基準電極と、選択的に電流変化を測定する対照電極とは、ストリップ上に形成される。前記ストリップは、一回又は複数回の使用後、分離交換される。

本発明のストリップは、各電極と、各電極を測定装備と連結する電気連結線とから構成される。前記電極を除く残りの部分は、絶縁物質を用いて、絶縁層を形成させる。

本発明によるセンサはそれぞれ、作業電極と基準電極の電極対を備えるストリップを２つ以上設けて、２以上のアレルギー反応を診断することができる。

本発明によるストリップは、非伝導絶縁物質からなる支持体上に、それぞれの電極が構成されるのが望ましい。このような支持体は、２０〜６０ミクロンの厚さで製造されるのが望ましく、より望ましくは、３０ミクロンである。

前記非伝導絶縁物質からなる支持体の材料は、いずれの絶縁体も使用可能であるが、同時に大量に製造するためには、ある程度の柔軟性と支持体としての剛性を持つものが望ましい。一般に、支持体の表面は、非常に均一に形成されているのが望ましい。均一でない表面は、大量生産において、各センサストリップ間の電極表面積の不均一性の原因となり、結果として、センサ出力信号の不均一性を招く。

最も均一の表面を有する物質は、半導体製造に用いられるシリコンウエハが挙げられる。次は、透明で加工性が容易な石英ガラス基板や一般のガラス基板を使用することができる。一方、一般の音楽用コンパクトディスクは、その用途の特性上、表面が非常に均一に形成され、平坦度も優れており、円形であって、半導体ウエハと類似した形状をしているため、別の装備を製作しなくても、半導体製造工程装備をそのまま使用可能であり、安価であり、容易に求めることができるというメリットがある。その他にも、一般のプラスチックフィルムを使用することができる。

コンパクトディスク又はプラスチックフィルム材料の例として、ポリエステル（poly ester）、ポリカーボネート（poly carbonate）、ポリスチレン（poly stylene）、ポリイミド（poly imide）、ポリビニルクロリド（poly vinyl chloride）、ポリエチレン（poly ethylene）、ポリエチレンテレフタルレート（poly ethylene telephthalate）などが使用可能である。

本発明によるストリップ上の電極は、それぞれ独立して、１４ｍｍ〜１９ｍｍの長さ、０．５ｍｍ〜２ｍｍの幅、及び２０〜１５０ミクロンの厚さが望ましく、より望ましくは、１４ｍｍの長さ、１ｍｍの幅、及び６０ミクロンの厚さである。

本発明の電極は、サンプルに直接接触する部分と、検出器に信号を伝達する部分との間を、絶縁被覆により区画するのが望ましいが、これに限定されない。

本発明において、アレルギー診断に適用される“サンプル”又は“生体サンプル”は、セロトニン含有／分泌可否、又は濃度を測定するための分析対象であり、哺乳類、望ましくは人間から分離された全血、血球、血清、血漿、骨髄液、汗、ゆばり、涙、唾、肌、粘膜などのあらゆる生体サンプルを含み、例えば血液である。前記サンプルは、特定のアレルゲンに敏感な被験者由来サンプルの場合、特定のアレルゲンと接触すると、セロトニンを分泌する成分（例えば、肥満細胞）を含む。又は、アレルゲンを処理して、セロトニン分泌を誘導した後、セロトニンの分泌に関与する細胞を一部又は全部除去したものも含む。また、前記サンプルは、アレルゲンが処理された生体サンプルでもよく、アレルゲンが処理される前の生体サンプルでもよい。

本発明によるセンサは、サンプルを収容する反応容器を備える。

反応容器は、測定サンプルなどが、作業電極と、各基準電極と、選択的に対照電極とが接触するように構成されており、液体サンプルが導入されると、電極間が通電されて回路が形成される。測定サンプルが液体ではない場合は、水などの溶媒で溶解した後に、反応容器に導入することができる。

反応容器の形状は、サンプル及び測定試薬を維持し、サンプルの導入後に電極間を通電させることができる構造であり、作業電極と、各基準電極と、選択的に対照電極とを収容可能なサイズの容器であれば良い。反応容器の材料は、ろ過紙などの繊維集合体、不織布、多孔質材料、ゲルなど、電気的に不活性及び／又はサンプルや電極に対しても不活性であると、制限なく使用可能である。その中でも、ポリ塩化ビニル、ポリイミド、ゼラチン、ガラス繊維などが挙げられる。

反応容器には、測定試薬として、ｐＨ緩衝試薬が含まれる。また、反応容器内に電気化学的測定を妨げる妨害成分を除去するために、妨害除去試薬を含む。

反応容器にサンプルを導入すると、作業電極と基準電極と選択的に対照電極とは、サンプルにより、通電する。

反応容器は、サンプルをその内部に吸収して保持することができ、一回使用後、捨てるように設けられる。反応容器内には、不織布が入っているのが望ましい。

前記反応容器内には、アレルギー誘発物質が収容又はコートされる。これは、反応容器内に導入されたサンプルとアレルギー誘発物質とを反応させるためのことであって、収容又はコートの形態、アレルギー誘発物質の濃度は、サンプルによって、変更される。

本発明による電気化学センサは、１つの反応容器を有してもよく、互いに異なるアレルゲンに対するアレルギー反応を測定するために、２以上の反応容器を備えることもできる。さらには、各反応容器には、互いに異なるアレルゲンが収容又はコートされている。

また、作業電極と基準電極と選択的に対照電極の電極対は、それぞれ区別された反応容器に収容され、各反応容器に、同一又は異なるアレルギー源のそれぞれ、又はこの混合物を処理することができるだけでなく、各反応容器にアレルギー源が収容／コートされる。

例えば、本発明による電気化学センサは、第１のアレルギー源に対するセロトニンを測定するための第１の作動電極と第１の基準電極、そして、第２のアレルギー源に対するセロトニンを測定するための第２の作動電極と第２の基準電極、第ｎのアレルギー源に対するセロトニンを測定するための第ｎの作動電極と第ｎの基準電極（ｎは、１以上の整数）を備え、各電極対は電流計に接続されて、これらの２つの電極対の間に発生する電流を測定することができる。そこで、同時に複数のアレルギー源に対して、アレルギー反応検査を行うことができる。

一方、前記センサは、基準電極に電位を印加する自動電位調節装置を含む。前記自動電位調節装置は、０〜１．０Ｖの範囲の電位を自動に調節することができる。本発明のセンサは、セロトニンの酸化反応が起きることに必要な電位の印かが要求されるので、前記自動電位調節装置により、セロトニンの酸化反応が起きる電圧、例えば０．３Ｖを含むように、０〜１．０Ｖの間で電位を自動に調節するのが望ましい。

また、本発明のセンサは、セロトニンの酸化反応が起きる電位の印加時に測定された電流値を表示する表示部をさらに備える。

本発明のアレルゲン確認方法は、分離された生体サンプルを、前記センサ、前記ストリップ、又は前記キットで処理する第１のステップと、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定する第２のステップを含む。

例えば、前記方法は、第２のステップで測定した結果において、３００〜４００ｍＶ、具体的に３５０ｍＶでピーク電流が現れる場合、前記サンプルに対するアレルゲンとして判断する第３のステップを更に含む。

実施例
以下、実施例及び実験例により、本発明の構成及び効果をより詳しく説明する。これらの実施例及び実験例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例及び実験例によって限定されることではない。

参照例１：セロトニンの酸化反応による電流の測定
まず、セロトニンを検出するために、１μｇ／ｍｌのセロトニンが添加された血液に対して、図１ａに示している装置を用いて、電気化学的検出方法を行った。セロトニンについて、０〜１．０Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌまで単位時間当りの一定の速度（１０ｍＶ／ｍｉｎ）で電極反応を調査したところ、図２のような一般形態の循環電圧電流曲線（Cyclic voltammogram）が導出された。特に、０．３Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌでピーク値が得られたことは、放出された電子が伝達されて、電気化学的に酸化反応が起きたことを意味する。よって、この時の電流値を測定することで、セロトニン濃度の定量が可能である。すなわち、セロトニンの濃度を定量的に測定するためには、濃度に対する電流値との相関関係を導出することで可能である。このような測定は、図１ｂの器具を用いて行うことができる。

具体的に、基準電極に電位を印加する電圧印加装置１と、電圧が印加される基準電極６とを備えたセンサに、サンプル７を滴下する場合、サンプルとアレルゲンの反応によりセロトニンが発生すると、作業電極４でセロトニンの酸化反応が起き、これによる電流変化を対照電極５で測定し、測定された結果が記録計２に表示される。

実施例１：ナフィオンでコートされた作業電極を備える電気化学センサ

図１ａに示している、大韓民国公開特許公報第１０−２００７−０１１７２３９号
に記載されたセロトニン測定用電気化学センサの作業電極（Ｂ）を、ナフィオンでコートした。具体的に、５重量％のナフィオン溶液５ｍｌを電極表面に滴下した後、１時間の間、室温で乾燥させ、作業電極がナフィオンでコートされた作業電極（Ａ）を備えた電気化学センサを製造した。

実施例２：アスコルビン酸のサイクリックボルタンメトリー

実施例１によって、ナフィオンでコートされた作業電極（Ａ）と、ナフィオンでコートされない作業電極（Ｂ）のそれぞれを含むセンサを用いて、１００ｍｇ／ｍｌ濃度のアスコルビン酸が添加された０.１Ｍのリン酸バッファー溶液に対して、アスコルビン酸のサイクリックボルタンメトリー（cyclic voltammetry）を施して、電流電位曲線を得た（図３）。その結果、ナフィオンコートをしない電極（Ｂ）を用いる場合、アスコルビン酸によるバックグラウンドの増大が認められたことに対して、ナフィオンコート電極（Ａ）を用いる場合、アスコルビン酸によるバックグラウンドの増加、及びアスコルビン酸由来の電流値の増加が認められなかった。

実施例３：アスコルビン酸及びセロトニンのサイクリックボルタンメトリー

サンプル（全血）に、アスコルビン酸及びセロトニンをそれぞれ、１００ｍｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、実施例１により、ナフィオンでコートされた作業電極（Ａ）を用いて、前記全血に対して、サイクリックボルタンメトリー（cyclic Voltammetry）を施した。その結果、３５０ｍＶ付近に、セロトニン由来のピーク電流が認められた（図４）。

実施例４: 全血のサイクリックボルタンメトリー

ナフィオンコートをしない電極（Ｂ）を用いて、セロトニンが存在しない全血に対して、サイクリックボルタンメトリー（cyclic voltammetry）を施した結果、高いバックグラウンドが認められた（図５）。それに対して、実施例１によってナフィオンコートをした電極（Ａ）を用いた結果は、バックグラウンドが減少していることが認められた（図５）。

以上の結果から、ナフィオンコート電極を用いることで、全血中の電極妨害物質の抑制が可能であり、セロトニンの選択的な検出が可能となり、アレルギー反応の高感度で安定した検出、定量化が可能であるとことが確認できた。

実施例５: IgE抗体値と電気化学的検出値の相関関係の確認

アレルギー反応によるセロトニン測定において、実施例１によるナフィオンコート電極を用いて、アレルゲンに対する特異性を確認しようとした。

まず、検査機関でIgE抗体値（血中IgE濃度）を測定することで、松アレルゲンとダニアレルゲンに対して、陽性として診断を受けた患者の全血に対して、実施例１による電極（Ａ）を備える電気化学センサで、アレルギー反応の電気化学的検出を施した。その結果、アレルゲン添加の４０分後に、松アレルゲンの場合の電流値は、３８.６ｎＡ、ダニアレルゲンの場合の電流値は、１３０.３ｎＡであった。

また、IgE抗体値により、松アレルゲンに対して陰性であるが、ダニアレルゲンに対しては、陽性である人間の全血をサンプルとして、電気化学的検出を施した。その結果、松アレルゲンに対しては、０.６ｎＡを示したが、ダニアレルゲンに対しては、８６.８ｎＡを示した。

一方、松アレルゲン、ダニアレルゲンに対して、陰性として診断を受けた人間の全血に対してはそれぞれ、０.７ｎＡ、０.４ｎＡを示した。

このように、ナフィオンコート電極を装着したセンサを用いたアレルギー反応の電気化学的検出は、松アレルゲンとダニアレルゲンに対して、IgE抗体値と相関性があるので、アレルゲンの選択的検出が可能であるということが分かる。

前記結果により、IgE抗体値が高い場合、セロトニンの電流値が高く、IgE抗体値が低い場合、セロトニンの電流値が低くなっていることを確認した。さらに、IgE抗体値による診断結果と、ナフィオンでコートされた作業電極を含むセンサを用いて測定した血液内のセロトニンの電流値による診断結果とが同様であることを確認した。これは、IgE抗体値を測定しなくても、（−）電荷を帯びる高分子でコートされた作業電極を含むセンサを用いて、アレルギー反応の可否を確認できることを示している。

実施例６: 電気化学的検出値の再現性の確認

ナフィオンでコートされた作業電極を含むセンサを用いて、セロトニンのピーク電流を測定することに当たり、測定されるピーク電流の値が一定になっているかを下記のように調べた。具体的に、IgE抗体値の測定により、松アレルゲンに対して、陽性の実験者と陰性の実験者の全血について、実施例１のナフィオンでコートされた作業電極（Ａ）を含むセンサを用いて、電気化学的測定をそれぞれ５回施し、測定値の再現性を確認した。

測定結果、IgE抗体値によって、アレルギー陽性反応を示す血液の場合、８０ｎＡ以上の電流ピークを示しており、５回測定の結果値の誤差はいずれも、１ｎＡの範囲内で示されている。また、IgE抗体値により、アレルギー陰性反応を示す血液の場合も、５回測定の結果値の誤差はいずれも、１ｎＡの範囲内で示されている（図６）。これにより、アレルギー反応の電気化学的検出により得られた測定値の再現性が高いことを確認した。

実施例７: 臨床実験によるIgE抗体値と電気化学的検出値の相関関係の確認

２０〜３０代の１５人を対象として臨床実験を行い、ダニアレルゲンに対して電気化学的検出方式（実施例１のナフィオンでコートされた作業電極（Ａ）を含むセンサを用いて測定）による電流値と、検査機関で測定したＩｇＥ抗体値とを比較し、その結果を表２に示した。

Ａグループの場合、電気化学的検出方式による電流値による診断結果と、IgE抗体値による診断結果とがいずれも、陽性で一致した。

Ｂグループの場合、電気化学的検出方式による電流値による診断結果と、IgE抗体値による診断結果、そして症状がいずれも、陰性で一致した。

Ｃグループは、IgE抗体値は、陰性を示す０.３４以下であることに対して、電気化学的検出方式による電流値は、陽性反応を示しており、さらには、患者で陽性反応による症状が見出されて、疑似症状（±pseudopositive symptoms）と表現した。

そこで、グループＡ〜Ｃまでの結果により、アレルゲンの電気化学的な検出方式による診断を行うことに当たり、本発明による検出方式は、非常に有効であることが分かった。

以上の説明から、本発明が属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施され得ることを理解されるだろう。これに関して、以上で記述した実施例は、全ての面で例示に過ぎず、限定的ではないことと理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そして、その等価概念から導出される全ての変更又は変形した形態が本発明の範囲に含まれることと解析されるべきである。

１電圧印加装置
２記録計
３微細電極
４作業電極
５対照電極
６基準電極
７サンプル

Claims

セロトニンの酸化反応が起きる作業電極と、電圧が印加される基準電極とを含み、セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定して、セロトニンの有無又は濃度を確認する電気化学センサにおいて、
前記作業電極は、（−）電荷を帯びるコート層を含み、コート層の静電気力で、（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制することを特徴とするセロトニン検出用電気化学センサ。
前記セロトニンの酸化反応は、０．３〜０．４Ｖで起きることを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
前記コート層は、陽電荷イオン交換高分子を含有することを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
前記陽電荷イオン交換高分子は、スルホン化テトラフルオロエチレン基盤フッ素−共重合体（sulfonated tetrafluoroethylene based fluoropolymer-copolymer）であることを特徴とする請求項３に記載のセンサ。
前記コート層は、セロトニンが作業電極に接触できるように気孔又はパターンが形成されたことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
前記妨害物質は、アスコルビン酸、尿素、及び尿酸を含む群より選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
前記作業電極及び基準電極は、金（Ａｕ）又は炭素（Ｃ）からなることを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
電流変化を測定する対照電極を含むことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
サンプルを収容する反応容器を備え、
反応容器にサンプルが導入されると、作業電極と基準電極が通電して、回路が形成されることを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
前記反応容器は、アレルギー誘発物質が収容又はコートされていることを特徴とする請求項９に記載のセンサ。
前記センサは、基準電極に所望する電位の電圧を印加する自動電位調節装置を含むことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
前記自動電位調節装置は、０〜１．０Ｖの電位範囲内で自動に調節することを特徴とする請求項１１に記載のセンサ。
更に、セロトニンの酸化反応が起きる電位の印加時に測定された電流値を表示する表示部を備えることを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
セロトニンの酸化電位の印加時にセロトニンの酸化反応が起きる作業電極と、電圧が印加される基準電極とを含むセロトニン測定用ストリップにおいて、
前記作業電極は、静電気力で（−）電荷を帯びる妨害物質の接近を抑制するように、（−）電荷を帯びるコート層を含むことを特徴とするセロトニン検出用ストリップ。
前記ストリップは、分離交換され、一回又は複数の使用が可能であることを特徴とする請求項１４に記載のセロトニン検出用ストリップ。
請求項１４又は請求項１５に記載のストリップを１つ以上備えることを特徴とするセロトニン検出用センサ。
請求項１乃至請求項１３のいずれか一項に記載のセンサを備えることを特徴とするセロトニン測定キット。
分離された生体サンプルを、請求項１乃至請求項１３のいずれか一項に記載のセンサで処理するステップと、
セロトニンの酸化電位の印加時に流れる酸化電流を測定するステップとを含むことを特徴とするアレルゲン確認方法。