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JP2018516539A - 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体−細胞毒性薬物複合体ならびにそれらの医薬用途 - Google Patents

抗ｃ−Ｍｅｔ抗体および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体−細胞毒性薬物複合体ならびにそれらの医薬用途 Download PDF

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JP2018516539A JP2017553320A JP2017553320A JP2018516539A JP 2018516539 A JP2018516539 A JP 2018516539A JP 2017553320 A JP2017553320 A JP 2017553320A JP 2017553320 A JP2017553320 A JP 2017553320A JP 2018516539 A JP2018516539 A JP 2018516539A
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antigen
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リュウ、ジアジエン
ジャン、リエンシャン
タオ、ウェイカン
フー、ヤユエン
ジャン、リン
マ、ドン
ツェイ、ドンビン
ワン、ヤリ
シュ、ジエンヤン
リアン、ジンドン
ジャン、イン
ジアン、グェイヤン
チユ、ジュンジュアン
スン、ヅヨン
ジャ、ジピン
ウェイ、ジンピン
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Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
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Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

抗体または抗原結合フラグメントがキメラ抗体またはヒト化抗体である、抗c-Met抗体または抗原結合フラグメントおよび抗c-Met抗体−細胞毒性薬物複合体を提供する。また、がんの治療に利用される、ヒト化抗c-Met抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗体−細胞毒性薬物複合体またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む医薬組成物を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、抗c-Met抗体またはその抗原結合フラグメント、抗c-Met抗体のCDR領域を含むキメラ抗体またはヒト化抗体、および抗c-Met抗体−細胞毒性薬物複合体、ならびにそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和化合物、ならびにそれらを含む医薬組成物、ならびに抗がん剤としてのそれらの用途に関する。具体的には、本発明は、ヒト化抗c-Met抗体および抗c-Met抗体−細胞毒性薬物複合体またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物、ならびにc-Met介在性の疾患または疾病の治療のための薬物の製造のためのそれらの使用に関する。
近年、分子生物学および腫瘍薬理学の研究により、チロシンキナーゼ（Protein Tyrosine Kinase、PTK）に関連する細胞シグナル伝達経路は、腫瘍の形成と発育に極めて重要な役割を果たしており、癌原遺伝子および癌遺伝子産物の50％超が、チロシンキナーゼ活性を有することが示された。c-Met癌原遺伝子は、PTKファミリーのRonサブファミリーに属し、コードされたc-Metタンパク質は、肝細胞増殖因子／分散因子（Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor、HGF/SF）に対する高親和性受容体である。HGF/c-Metシグナル経路は、血管新生および腫瘍増殖プロセスに密接に関連している。その持続した活性化は、細胞の発がんまたはがん細胞増殖もしくはがん細胞の過形成の重要な原因である。この経路の阻害は、腫瘍標的治療の新たな手段になっている。
c-Met癌原遺伝子は、ヒト7番染色体長腕（7q31）に位置し、120 kbを超えるサイズであり、約150 kDの分子量を持つc-Metタンパク質前駆体をコードしており、部分的な糖鎖付加により170 kDの糖タンパク質を生成する。この糖タンパク質は、さらにαサブユニット（50 kDa）とβサブユニット（(140 kDa）に切断され、これらがジスルフィドにより結合し、成熟したc-Metタンパク質受容体を形成する。このヘテロ二量体には2本の鎖があり、β鎖は細胞外ドメイン、膜貫通領域（膜伸展フラグメントとも呼ばれる）、および細胞内ドメイン（細胞内チロシンキナーゼ結合部位を含む）を有する。α鎖は細胞外部分のみを持つが、高度にグリコシル化され、ジスルフィド結合によりβ鎖に結合している。二つのサブユニットの細胞外領域は、対応するリガンドの認識部位であり、細胞内ドメインはチロシンキナーゼ活性を有する。
c-Met活性化機構は3種類に分けられる。一つ目はHGF活性化機構に依存し、二つ目はHGF活性化機構に依存せず、三つ目は、例えば、ヒアルロン酸表面受容体CD44、接着およびRONシグナル伝達経路など、他の膜経路を介する。最も一般的なものの一つは、HGF活性化機構に依存するものである。HGFのN末端はc-Metに結合し、β鎖上のTyr1234およびTyr1235の二量体化および自己リン酸化を促進し、C末端付近のTyr1349およびTyr1356の自己リン酸化は、多数のリンカータンパク質に対する結合部位を生成し、次に、P13K/Akt、Ras/Mapk、c-SrcおよびSTAT3/5-介在性の下流シグナル活性化を誘導し、細胞生存および活動（P13K/Akt経路に密接に関係）、腫瘍転移および細胞増殖（主にRas/Mapkが介在する）などの異なる細胞反応を引き起こす。さらに、c-Metと他の膜受容体とのクロストークは、腫瘍形成と転移を促進することが知られている。c-Metは腫瘍形成と転移に至る多くの経路の交差点であるので、c-Metを標的とすることにより、多くの経路に同時に干渉することが比較的容易に実現され、c-Metは、抗腫瘍形成および転移治療に対して期待できる標的となっている。
抗体薬物複合体（antibody drug conjugate、ADC）は、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを、安定的な化学リンカーを用いて生物学的に活性な細胞毒素に結合させることにより形成され、腫瘍細胞または高発現された抗原に対する抗体の特異的結合活性および細胞毒素の高効率を十分に利用し、正常細胞への毒性副作用を回避する。これは、従来型の化学療法薬と比較した場合、抗体薬物複合体は腫瘍細胞に精密に結合し、正常細胞への影響を少なくすることができることを意味する。
ADCは三つの部分：抗体（標的指向化）、リンカーおよび毒素で構成される。これらの中で、優れた標的（抗体部分）は、ADC薬物の特異性を決定し、これには、特異的な標的結合だけではなく効率的なエンドサイトーシスも含まれる。
c-Metキナーゼ標的に対し、3種類の主要な阻害剤：HGFおよびc-Metの生物学的拮抗剤、HGFおよびc-Met抗体、ならびに小分子c-Met阻害剤がある。現存する臨床結果では、HGFまたはc-Metを直接標的にする抗体、またはc-Metの小分子阻害剤は最良ではないことが示される。c-Metに対するADCは、腫瘍治療に対して最も効果的な方法である可能がある。現在のところ、c-MetのADC薬物の臨床研究はない。
本発明は、第一に、抗c-Met抗体ADC薬物を開示する。この薬物は、本発明の抗c-Met抗体の抗体依存性細胞増殖抑制作用を保持するだけではなく、潜在的な細胞毒性薬物の効果も増大させる。毒素の腫瘍細胞内への標的遊離のために、有効性の増加に伴って薬物の毒性副作用が増大することはない。本発明は、ヒトc-Metに特異的に結合するヒト化抗体およびキメラ抗体を提供する。このヒト化抗体およびキメラ抗体は、高い親和性、高い有効性、エンドサイトーシス、優れた安定性、およびc-Metアゴニスト活性のないことなどによって特徴づけられる。これらの優れた特性に基づき、本発明は、ヒトc-Metに特異的に結合し、抗体依存性細胞増殖抑制を保持し、さらに、潜在的な細胞毒性薬物の効果と治療される疾患の範囲を増大させる抗体−細胞毒性薬物複合体またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を提供する。また、標的腫瘍細胞中への毒素の遊離（本発明の抗c-Met抗体のエンドサイトーシス）のために、有効性の増加に伴って薬物の毒性副作用が増大することはない。
本発明は、以下の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのCDR領域を含む、c-Metに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
重鎖可変領域HCDR配列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7およびSEQ ID NO：8、および、
軽鎖可変領域LCDR配列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：11
本発明の好ましい実施態様では、抗体の重鎖可変領域が、下記の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのHCDR領域配列を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7およびSEQ ID NO：8
本発明の好ましい実施態様では、抗体の軽鎖可変領域が、下記の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのLCDR領域配列を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：11
本発明の好ましい実施態様では、抗体が、SEQ ID NO：6（HCDR1）、SEQ ID NO：7（HCDR2）およびSEQ ID NO：8（HCDR3）からなる群より選ばれる重鎖可変領域配列またはその変異配列、ならびにSEQ ID NO：9（LCDR1）、SEQ ID NO：10（LCDR2）およびSEQ ID NO：11（LCDR3）からなる群より選ばれる軽鎖可変領域配列またはその変異配列を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、CDR領域の変異配列が、抗体活性を最適化する1〜3個のアミノ酸変異を有する配列であり、HCDR2領域の変異配列は、好ましくはSEQ ID NO：12である、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、c-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス抗体またはそのフラグメントである、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、マウス抗体の重鎖可変領域配列がSEQ ID NO：4で示される、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、マウス抗体の軽鎖可変領域配列がSEQ ID NO：5で示される、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、マウス抗体の重鎖可変領域配列がSEQ ID NO：4で示され、マウス抗体の軽鎖可変領域配列がSEQ ID NO：5で示される、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、抗体の重鎖可変領域が、マウスIgG1またはその変異体、マウスIgG2またはその変異体、マウスIgG3またはその変異体、またはマウスIgG4またはその変異体に由来する重鎖FR領域をさらに含む、上記のマウス抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、マウスIgG1またはその変異体、マウスIgG2またはその変異体、マウスIgG3またはその変異体、またはマウスIgG4またはその変異体に由来する重鎖定常領域をさらに含む、上記のマウス抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、抗体の軽鎖可変領域が、マウスκ鎖またはその変異体もしくはマウスλ鎖またはその変異体に由来するFR領域をさらに含む、上記のマウス抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、マウスκ鎖またはその変異体もしくはマウスλ鎖またはその変異体に由来する軽鎖定常領域をさらに含む、上記のマウス抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、キメラ抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントである、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体重鎖可変領域が、ヒトIgG1またはその変異体、IgG2またはその変異体、IgG3またはその変異体、またはIgG4またはその変異体に由来する重鎖FR領域をさらに含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体重鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系列重鎖の、好ましくは、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV 3-33*01のFR1、FR2、FR3およびFR4領域のフレームワーク配列を含むヒト生殖細胞系列重鎖IGHV 3-33*01に由来する重鎖FR配列、またはその変異配列、好ましくは、変異配列が0〜10個のアミノ酸の逆突然変異を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体が、SEQ ID NO：13〜15で示される重鎖可変領域配列またはそれらの変異体を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体軽鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系列軽鎖の、好ましくは、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV085またはIGKV4-1*01のFR1、FR2、FR3およびFR4領域のフレームワーク配列を含むヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV085またはIGKV4-1*01に由来する軽鎖FR領域、またはその変異配列、好ましくは、変異配列が0〜10個のアミノ酸の逆突然変異を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体が、SEQ ID NO：16〜18から選ばれる軽鎖可変領域配列またはそれらの変異体を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体が、SEQ ID NO：13〜15から選ばれる重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：16〜18から選ばれる軽鎖可変領域配列を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選ばれる重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列との組み合わせを含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される：
（ａ）SEQ ID NO：13の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：16の軽鎖可変領域配列、
（ｂ）SEQ ID NO：14の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：17の軽鎖可変領域配列、または、
（ｃ）SEQ ID NO：15の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：18の軽鎖可変領域配列。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体の重鎖定常領域が、ヒトIgG1もしくはその変異体、ヒトIgG2もしくはその変異体、ヒトIgG3もしくはその変異体、またはヒトIgG4もしくはその変異体に由来する定常領域、好ましくは、ヒトIgG1もしくはその変異体、ヒトIgG2もしくはその変異体、またはヒトIgG4もしくはその変異体に由来する定常領域、最も好ましくは、ヒトIgG2またはその変異体に由来する定常領域を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、SEQ ID NO：23〜25またはSEQ ID NO：23〜25に対して少なくとも90％の同一性を有する配列から選ばれる全長の重鎖配列を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体の軽鎖可変領域が、ヒトκもしくはλ鎖またはそれらの変異体から選ばれる軽鎖FR領域をさらに含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体の軽鎖定常領域が、ヒトκもしくはλ鎖またはそれらの変異体から選ばれる定常領域を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、SEQ ID NO：26〜28またはSEQ ID NO：26〜28に対して少なくとも90％の同一性を有する配列から選ばれる全長の軽鎖配列を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、SEQ ID NO：23〜25から選ばれる全長の重鎖配列またはSEQ ID NO：26〜28から選ばれる全長の軽鎖配列を含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様では、ヒト化抗体が、Ab-9〜Ab-11のいずれかから選ばれる全長の軽鎖配列と全長の重鎖配列との組み合わせを含む、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される：
Ab-9：SEQ ID NO：23の重鎖配列およびSEQ ID NO：26の軽鎖配列、
Ab-10：SEQ ID NO：24の重鎖配列およびSEQ ID NO：27の軽鎖配列、または、
Ab-11：SEQ ID NO：25の重鎖配列およびSEQ ID NO：28の軽鎖配列。
本発明の好ましい実施態様では、抗原結合フラグメントがFab、Fv、scFvまたはF(ab’)2である、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明は、さらに、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメント、および発現前駆体産物をコードするDNA分子を提供する。
本発明は、さらに、上記のDNA分子を含む発現ベクターを提供する。
本発明は、さらに、上記の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明の好ましい一実施態様では、宿主細胞が好ましくは哺乳類細胞であり、より好ましくはCHO細胞である、上記の宿主細胞が提供される。
本発明は、さらに、上記のc-Met抗体またはその抗原結合フラグメント、および1種以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、さらに、疾患または疾病が、好ましくはがんであり、より好ましくはc-Metを発現するがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、肺がん、腸がん、腎がん、メラノーマおよび非小細胞肺がんから選ばれ、最も好ましくは胃がんおよび非小細胞肺がんである、c-Met介在性の疾患または疾病の治療のための薬剤の製造における、本発明によるc-Met抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは本発明による医薬組成物の使用を提供する。
本発明は、さらに、本発明によるc-Met抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは本発明による医薬組成物の治療的有効量を、それらが必要な患者に投与することを含む、c-Met介在性の疾患または疾病を治療または予防するための方法を提供する。ここで、疾患または疾病は、好ましくはがんであり、より好ましくはc-Metを発現するがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、肺がん、腸がん、腎がん、メラノーマおよび非小細胞肺がんから選ばれ、最も好ましくは胃がんおよび非小細胞肺がんである。
本発明は、さらに、式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を提供する。
Ab-[(L2)t-L1-D)]y （I）
ここで、
Dは薬物ユニットであり；
L1およびL2はリンカーユニットであり；
tは0または1であり、好ましくは1であり；
yは1〜8の範囲で変動し、好ましくは2〜5であり、yは小数であってもよく；
Abは、c-Metに特異的に結合する上記の抗体またはその抗原結合フラグメントである。
本発明の好ましい実施態様では、-L2-が式（-L2-）として示される化合物である、本発明の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
,
ここで、
X1は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
X2は、アルキル基、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基からなる群より選ばれ；
mは0〜5であり、好ましくは1〜3であり；
Sは硫黄原子である。
本発明の好ましい実施態様では、Dの薬物ユニットが、毒素、化学療法薬、抗生物質、放射性同位元素および核酸分解酵素から選ばれる細胞毒である、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、Dの薬物ユニットが式（D）の構造、もしくはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマーもしくはこれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
ここで、
R1〜R7は、それぞれ水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
R8〜R11は、それぞれ水素原子、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より任意に選ばれ、好ましくは、R8〜R11の少なくとも1つは、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ、残りのR8〜R11は水素原子であり；
または、R8〜R11のいずれかの2つはシクロアルキル基を形成し、残りの2つは、それぞれ水素原子、アルキル基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
R12〜R13は、それぞれ水素原子、アルキル基およびハロゲン基からなる群より選ばれ；
R14はアリール基およびヘテロアリール基より選ばれ、アリール基またはヘテロアリール基は、さらに水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれる置換基により任意に置換され；
R15は、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基、シクロアルキル基およびCOOR17から選ばれ；
R16は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基から選ばれ；
R17は、水素原子、アルキル基およびアルコキシ基から選ばれる。
本発明の好ましい実施態様では、L2は、Val-Cit、MC、PABおよびMC-PABから選ばれるリンカーであり、好ましくはMCである、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、Dはマイタンシノイドアルカロイドであり、好ましくはDM1、DM3およびDM4より選ばれ、より好ましくはDM1である、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、L2は、N-サクシニミジル4-（2-ピリジルチオ）吉草酸エステル（SPP）、N-サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル（SMCC）およびN-サクシニミジル（4-ヨード-アセチル）アミノ安息香酸エステル（SIAB）からなる群より選ばれ、好ましくはSPPまたはSMCCである、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、Dはカンプトテシンアルカロイドであり、好ましくはCPT、10-ヒドロキシ-CPT、CPT-11（イリノテカン）、SN-38およびトポテカンから選ばれ、より好ましくはSN-38である、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、前記リンカーL2が、Val-Cit、MC、PABおよびMC-PABから選ばれる構造、好ましくはMCまたはMC-vc-PABである、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が、式（II）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物に含まれて提供される。
ここで、
R2〜R16は式（D）で定義され；
Ab、t、y、L1、L2は式（I）で定義される。
本発明の好ましい実施態様では、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が、式（III）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物に含まれて提供される。
ここで、
R2〜R16は式（D）で定義され；
Ab、t、y、L1、L2は式（I）で定義され；
nは3〜6であり、好ましくは5である。
本発明の好ましい実施態様では、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が、式（IV）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物に含まれて提供される。
ここで、
R2〜R16は式（D）で定義され；
Ab、yは式（I）で定義され；
nは式（III）で定義され；
X1、X2、mは式L2で定義される。
本発明の好ましい実施態様では、本発明による式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が、式（V）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物に含まれて提供される。
ここで、
Ab、D、yは式（I）で定義され；
nは式（III）で定義され；
X1、X2、mは式L2で定義される。
本発明による抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物は、以下を含むがこれらに限定されない。
ここで、Ab-9、Ab-10およびAb-11は上記にように定義され、yは1〜8であり、好ましくは2〜5である。yには1〜8の幅があり、好ましくは1〜4である。
本発明は、さらに、式（V）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体の製造方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
一般式（Ab-L2）の化合物を、有機溶媒中で一般式（L1-D）の化合物と反応させ、一般式（V）の化合物を得る。前記有機溶媒は、好ましくはアセトニトリルまたはエタノールである。
ここで、
Abは、本発明のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
X1は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
X2は、アルキル基、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基からなる群より選ばれ；
Xは0〜5、好ましくは1〜3であり；
mは0〜5、好ましくは1〜3である。
本発明の好ましい実施態様では、生体外または生体内で細胞障害活性を有する、本発明による抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が提供される。
本発明は、さらに、本発明によるc-Met抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗体−細胞毒性薬物複合体もしくはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物の治療的有効量、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本発明は、さらに、c-Met介在性の疾患または疾病の治療のための薬物の製造における、本発明によるc-Met抗体もしくはその抗原結合フラグメント、もしくは本発明による抗体−細胞毒性薬物複合体もしくはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物、または本発明によるこれらと同一物を含む医薬組成物の使用に関する。ここで、前記疾患または疾病は、好ましくはがんであり、より好ましくはc-Metを発現するがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、肺がん、腸がん、腎がん、メラノーマおよび非小細胞肺がんから選ばれるがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、非小細胞肺がんおよび腎がんである。
本発明は、さらに、c-Met介在性の疾患または疾病を治療または予防するための方法に関し、該方法は、本発明によるc-Met抗体もしくはその抗原結合フラグメント、もしくは抗体−細胞毒性薬物複合体もしくはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物、またはこれらと同一物を含む医薬組成物の治療的有効量を、それらが必要な患者に投与することを含む。ここで、前記疾患または疾病は、好ましくはがんであり、より好ましくはc-Metを発現するがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、肺がん、腸がん、腎がん、メラノーマおよび非小細胞肺がんから選ばれるがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、非小細胞肺がんおよび腎がんである。
本発明の抗c-Met抗体およびADC分子の腫瘍抑制作用を示す図である。結果より、ADC新分子は、結合した毒素により腫瘍の完全抑制を達成することができるが、抗体単独では、このような完全抑制を達成することができないことが示される。また結果より、本発明において、毒素の結合はADC分子のT1/2に影響を与えず、また本発明のADC薬物は、マウスにおいてインビボ毒性を示さないことが示される。
〔用語〕
本発明をより理解しやすくするため、専門技術および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の場所で具体的に定義される場合を除き、本明細書で使用される他のすべての専門用語および科学用語は、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により一般に理解されるものと同じ意味を持つ。
本明細書で用いられるアミノ酸の1文字記号および3文字記号は、J. Biol. Chem., (1968) 243, p3558で記述されている通りである。
「c-Met」もしくは「c-Metポリペプチド」または「c-Met受容体」の用語は、細胞増殖因子（HGF）に結合する受容体チロシンキナーゼを指す。本発明では、マウスc-Met（m-c-Met）またはサルc-Met（cyno-c-Met）というように具体的に特定しない限り、c-Metの用語は、通常、ヒトc-Met（h-c-Met）を指す。本発明において使用されるヒト、マウスおよびカニクイザルc-Metは、GenBankから得られるヌクレオチド配列またはポリペプチド配列によりコードされる。例えば、ヒトペプチドは、GenBank登録番号NM_000245で与えられるヌクレオチド配列によりコードされ、または、ヒトタンパク質もしくはその細胞外ドメインは、GenBank登録番号NP_000236で与えられるポリペプチド配列によりコードされた。最初の一本鎖前駆体タンパク質は翻訳後に切断され、αおよびβサブユニットを生成する。これらはジスルフィド結合により結合され、成熟した受容体を形成する。受容体チロシンキナーゼc-Metは、例えば、胚形成に関連している組織再生の遊走、浸潤および形態形成の過程を含む細胞過程に関わる。
「c-Met関連疾患または疾病」の用語は、有害なc-Met発現もしくはc-Met発現の欠乏、c-Metの有害な調節もしくは調節の欠如、または有害な活性もしくは活性の欠如から生じた、あらゆる疾患、疾病または病気を指すか、または、c-Met発現または活性の調節により、制御、治療または治癒され得るあらゆる疾患、疾病または病気を指す。例えば、HGF/c-Met経路の活性化は、ほとんどのがん患者、またはc-Met経路に関連した変化により、実際に疾患が活発になっている患者で予期される。アップレギュレーションは、例えば、HGFおよび／またはc-Metの過剰発現、またはc-Met変異の恒常的活性化などの異なるメカニズムに起因している。c-Met関連疾患または疾病には、増殖性疾患または疾病および炎症性疾患または疾病などが含まれるが、これらに限定されない。増殖性疾患には、例えば、胃がん、食道がん、乳頭状腎細胞がんを含む腎がん、肺がん、神経膠腫、頭頸部がん、上皮がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳がん、膵がん、結腸直腸がん、消化器がん、腸がん、性器がん、膀胱がん、メラノーマ、前立腺がんおよび当業者に周知の他の腫瘍を含むがんが含まれるが、これらに限定されない。炎症性疾患には、リステリア細菌に起因する感染を含む細菌感染が含まれるが、これらに限定されない。
本発明における「抗体」は、免疫グロブリン、すなわち、鎖間ジスルフィド結合により結合された2本の相同的な重鎖と2本相同的な軽鎖により形成された4本のペプチド鎖構造を指す。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成と配列を示し、そのため、異なる種類の抗原性を示す。したがって免疫グロブリンは、5種のカテゴリーに分けることができ、免疫グロブリンアイソタイプ、すなわちIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEと称される。これらの対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸組成および重鎖ジスルフィド結合の数と位置により、免疫グロブリンは異なるサブカテゴリーに分類することができ、例えばIgGは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域に基づき、κまたはλ鎖に分類することができる。これら5カテゴリーの中のIgの各カテゴリーは、κまたはλ鎖を含む。
抗体重鎖および軽鎖のN末端では、約110残基のアミノ酸が主に変動し、これは可変領域（V領域）として知られている。C末端のアミノ酸配列は比較的安定しており、これは定常領域（C領域）として知られている。可変領域は、3個の超可変領域（HVR）および4個の比較的保存された配列を持つFR領域（FR）を含む。3個の超可変領域は抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（CDR）としても知られる。各軽鎖可変領域（LCVR）および各重鎖可変領域（HCVR）は、３個のCDR領域および４個のFR領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4の順序で配置されている。3個の軽鎖CDR領域は、LCDR1、LCDR2およびLCDR3と呼ばれ、3個の重鎖CDR領域は、HCDR1、HCDR2 およびHCDR3と呼ばれる。本明細書の抗体または抗原結合フラグメントのLCVRおよびHCVR領域におけるCDR領域アミノ酸残基の数と位置は、周知のKabat番号付け基準（LCDR1〜3、HCDE2〜3）に対応するか、またはKabatおよびChothia番号付け基準（HCDR1）に対応する。
本発明における「マウス抗体」の用語は、この領域の知識と技術に従ってマウスから調製した抗ヒトc-Metモノクローナル抗体を指す。調製中、試験対象にc-Met抗原を注射し、次に、所望の配列または機能的特徴を持つ抗体を発現するハイブリドーマを単離した。本発明の好ましい実施態様では、マウスc-Met抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ鎖、λ鎖またはこれらの変異体の軽鎖定常領域をさらに含むか、または、マウスIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4重鎖定常領域またはこれらの変異体をさらに含む。
「キメラ抗体」の用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に融合することにより得られた抗体を指す。キメラ抗体は、マウス抗体誘導免疫反応を軽減することができる。キメラ抗体を確立するため、特異的なマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に確立し、可変領域遺伝子をそのマウスハイブリドーマからクローニングし、次に、組換え発現のためにヒト抗体の定常領域遺伝子にクローニングする。
ヒト化CDR移植抗体としても知られる「ヒト化抗体」の用語は、マウスCDR配列をヒト抗体可変領域のフレームワーク上に移植することにより作り出した抗体を指し、ヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系列抗体フレームワークの異なる型の配列を含む。ヒト化抗体は、多くのマウス成分を持っているキメラ抗体により誘導される強い免疫抗体反応を回避する。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を取り扱う公共のDNAデータベース、または出版された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ウェブサイトwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseで入手可能）およびKabat, EA他、1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版で見つけることができる。本発明の好ましい実施態様では、c-Metヒト化抗体のマウスCDR配列は、SEQ ID NO：6、7、8、9、10および11から選ばれる。ヒト抗体可変領域フレームワークが設計され、選択されるが、前記抗体軽鎖可変領域の軽鎖FR領域配列は、ヒト生殖細胞系列軽鎖配列に由来し、好ましくは、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV085およびIGKV 4-1*01のFR1、FR2、FR3およびFR4領域を含む、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV085またはIGKV 4-1*01から選ばれる。前記抗体重鎖可変領域の重鎖FR領域配列は、ヒト生殖細胞系列重鎖配列に由来し、好ましくは、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV 3-33*01のFR1、FR2、FR3およびFR4領域を含む、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV 3-33*01から選ばれる。免疫原性の低下によって起こる活性低下を避けるために、ヒト抗体可変領域に最小限の逆突然変異を導入し、活性を維持することができる。
当業者に入手可能なヒト化抗体を製造する方法が複数ある。例えば、ヒト化抗体は、c-Metに特異的に結合する親抗体（例えば、マウス抗体またはハイブリドーマにより産生される抗体）のHCVRおよびLCVRをコードする核酸配列を得ることにより、および、そのようにコードする核酸配列を、選択されたヒト・フレームワークをコードする核酸配列上に移植することにより製造することができる。任意に、CDR領域をフレームワーク領域上に移植する前に、CDRにおける特定の位置において1個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換するための、無作為または特定の位置における変異誘発により、CDR領域を最適化してもよい。もう一つの方法として、当業者に入手できる方法を用いて、ヒト・フレームワーク領域へ挿入した後、CDR領域を最適化することができる。好ましくは、「ヒト化抗体」は、該抗体がヒト細胞で産生されるかどうかにかかわらず、親抗体（すなわち、非ヒト抗体、好ましくはマウスモノクローナル抗体）が起源であるか、または親抗体に由来するCDRを有するが、フレームワークおよび定常領域は、存在する範囲で（または、その主要部分もしくは基本部分が、少なくとも約90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％または99％である）、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン領域（例えばthe International ImMunoGeneTicsデータベースを参照のこと）またはその組換え型もしくは変異型中に存在する核酸によりコードされる。好ましくは、ヒト化抗体の少なくとも2個、3個、4個、5個または6個のCDRは、ヒト化抗体が由来する非ヒト親抗体のCDRから最適化され、ELISAアッセイなどのスクリーニングアッセイにより同定される所望の特性、例えば、改良された特異性、親和性または中和作用を生み出す。好ましくは、本発明の抗体における最適化されたCDRは、親抗体に存在するCDRと比較して、少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。親抗体のCDRと比較した場合、本発明のヒト化抗体のCDRにおけるアミノ酸置換（本明細書の実施例６を参照のこと）は、抗体の不安定性の可能性を下げ（例えば、CDRからAsn残基の除去）、またはヒト被験者に投与した場合、抗体の免疫原性の可能性を下げる（例えばIMMUNOFILTERTM技術により予測した場合）。
CDRをコードする配列が、選択されたヒト・フレームワークをコードする配列上に移植された後、得られたヒト化可変重鎖および可変軽鎖配列をコードするDNA配列が発現され、c-Metに結合するヒト化抗体を産生する。ヒト化HCVRおよびLCVRは、全抗c-Met抗体分子の一部分、すなわちヒト定常領域配列を有する融合タンパク質として発現される。しかしながら、HCVRおよびLCVR配列は、ヒト抗c-Met scFvを産生するように定常配列なしでも発現される。
用いることのできるマウス抗体のヒト化に関わる方法をさらに記述する文献には、例えば、Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869, 1991およびWinterと共同実験者の方法［Jones et al., Nature, 321:522 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)］が含まれる。
本発明における「抗原結合フラグメント」は、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、抗原結合活性を有するF(ab’)2フラグメント、およびヒトc-Metと結合する FvフラグメントscFvフラグメントを指し、本発明で記述される抗体の1個以上のCDR領域を含み、SEQ ID NO：3〜SEQ ID NO：8からなる群より選ばれる。Fvフラグメントは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および定常領域を持たないすべての抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。一般的に、Fv抗体は、VHおよびVLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。また、単鎖抗体または単鎖Fv (scFv)と名付けられるポリペプチド鎖を形成するように、二つの抗体の可変領域を結合するため、異なるリンカーを用いることができる。またscFvは、二重特異性抗体を構築するため、抗EGFR抗体などの他の抗体と共に用いることができる。本発明における「c-Metとの結合」の用語は、ヒトc-Metと相互作用することができるということを意味する。本発明における「抗原結合部位」の用語は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントにより認識される、抗原の不連続の３次元空間部位を指す。本明細書において、「ADCC」すなわち抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性の用語は、Fc受容体を発現している細胞が、抗体のFcセグメントを認識することにより、抗体で覆われた標的細胞を死滅させることを指す。抗体のADCCエフェクター機能は、IgGのFcセグメントを修飾することにより低減または除去することができる。修飾とは、IgG1におけるN297A、L234AおよびL235Aから選ばれる変異；IgG2/4キメラ；IgG４におけるF235EまたはL234A/E235A変異などの抗体重鎖定常領域の変異を指す。
本発明において記述される融合タンパク質は、組換えDNA技術を用いて2個の遺伝子を共発現させることにより得られるタンパク質産物である。組換えc-Met細胞外ドメインFc融合タンパク質は、組換えDNA技術を用いて、c-Met細胞外ドメインとヒト抗体Fcフラグメントを共発現することにより得られる。c-Met細胞外ドメインは、c-Metの細胞膜外側の部分を指す。
本発明の改変抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法を用いて調製および精製することができる。例えば、重鎖（SEQ ID NO：4）および軽鎖（SEQ ID NO：5）をコードするcDNA配列はクローニングし、pEE6.4発現ベクター（Lonza Biologics）に組み換えることができる。次に、組換え免疫グロブリン発現ベクターは、CHO細胞に安定的に遺伝子導入する。当業者に周知のより推奨される方法であるが、哺乳類発現系は、一般的にFC領域中の高度に保存されたN末端でグリコシル化された抗体を作ることができる。安定クローンは、ヒトc-Metに特異的に結合する抗体の発現を介して得ることができる。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体産生に用いる血清不含培養液で増やされる。抗体が分泌される培養液は、従来技術により精製される。例えば、培養液は、適合する緩衝液で平衡化されたプロテインAまたはGセファロースFFカラムに好適に添加される。カラムは、非特異的な結合成分を除去するために洗浄される。結合した抗体は、pH勾配により溶出され、SDS-PAGEで抗体フラグメントを検出した後、収集される。抗体は濾過し、一般的な方法により濃縮される。可溶性凝集物や多量体は、分子篩またはイオン交換を含むカラム技術により効率的に除去される。得られた産物は直ちに凍結し（例えば−70℃）、または凍結乾燥される。
本発明における「抗体」の用語は、モノクローナル抗体を指す。本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」または「mAb」の用語は、単一細胞株に由来するひとつのクローンにより分泌される抗体を指す。細胞株は、真核生物、原核生物またはファージクローン細胞株に限定されない。モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（CDR移植等）または本技術分野で容易に知られる他の技術による組み換えにより得ることができる。
動物、ヒト、実験被験者、細胞、組織、臓器または体液に適用される「投与」および「処理」は、外因的な薬物、治療薬、診断剤または組成物を、動物、ヒト、被験者、細胞、組織、臓器または体液と接触させることを指す。「投与」および「処理」は、例えば、治療学的、薬物動態学的、診断学的研究または実験方法を指す。細胞の処理は、薬物を細胞と接触させる、および薬物を液体と接触させる（ここでは液体は細胞と接触している）ということを含む。
「治療」は、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療剤を、内用または外用で、薬物が治療効果を有することが知られたひとつ以上の疾患症状を有する患者に投与することを意味する。一般に、治療剤は、治療を受ける患者または集団において、ひとつ以上の疾患症状を緩和するのに有効な量が投与され、かかる症状の進展を、臨床的に測定可能な程度に軽減または抑制する。特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療剤の量（「治療的有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢および体重などの要因、および患者において所望の反応を導き出す薬物の能力により変動する。疾患症状が軽減されたかどうかは、医師または他の熟練したヘルスケア提供者により、その症状の重症度または進行状態を評価するために一般的に用いられる臨床的測定により評価することができる。本発明の実施態様（例えば治療方法または製品）では、対象の疾患症状を緩和することについて、すべての患者で効果があるわけではないが、統計学的に相当数の患者については、スチューデントt-検定、カイ二乗検定、マンホイットニーU検定、クラスカル・ワリス検定（H-検定）、ヨンキー・テラプストラ検定およびウイルコクソン検定などのこの技術分野で周知の統計的検定により判定すれば、対象の疾患症状を緩和するはずである。
「保守修飾」または「保守置換または代替」は、タンパク質中のアミノ酸を、類似の特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格構造および強剛性など）を持つ他のアミノ酸で置き換えることを指し、そのような変更は、しばしばタンパク質の生物活性を変えることなく行われる。当業者であれば、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単独のアミノ酸置換では、生物活性は実質的には変わらないことを認識している（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., 224頁、第4版）。さらに、構造的または機能的に類似のアミノ酸の置換が生物活性を破壊する可能性は低い。
明細書および特許請求の範囲で用いられる、「基本的に・・からなる」の用語またはその変形表示は、列挙された要素または要素群、および、任意に、列挙された要素と類似するまたは相違する性質の他の要素であって、特定された投薬計画、方法または組成物の基本的または新規な特性を実質的に変化させない要素を包含することを示す。なんら制限することのない実施例として、基本的に、列挙されたアミノ酸配列からなる結合化合物は、結合化合物の特性に実質的に影響しない1個以上のアミノ酸を包含してもよい。
「有効量」は、疾患の症状または兆候を、改善または抑制するのに十分な量を包含する。また有効量は、診断を可能にする、または容易にするのに十分な量を意味する。特定の患者または獣医学被験者に対する有効量は、治療される疾患、患者の一般的健康状態、投与経路と用量および副作用の重大性などの要因によって変動する。有効量は、顕著な副作用または毒性効果を回避できる最大用量または投薬計画でもあり得る。
「外因性」は、状況に応じて、生物、細胞または人体の外側で産生される物質を指す。「内因性」は、状況に応じて、生物、細胞または人体の内側で産生される物質を指す。
「相同性」は、2本のポリヌクレオチド配列間または2本のポリペプチド間の配列類似性を指す。2本の比較される配列の両方とも、ある位置が同一の塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、例えば、二つのDNA分子のそれぞれのある位置がアデニンで占められている場合、分子は、その位置で相同性がある。二つの配列間の相同性の百分率は、一致または二つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の数により割った後で、100を掛けた関数である。例えば、二つの配列を最適に整列させた場合に、10個の位置のうち6個が一致または相同している場合、二つの配列は60％の相同性がある。一般に二つの配列が整列された場合、比較が行われ、最大百分率相同性が与えられる。
「任意の」または「任意に」は、後に続く事象または状態が必ずしも起こらないことを意味し、この記述は、事象または状態が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意に1〜3個の抗体重鎖可変領域」は、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしも必要ではないことを意味する。
「医薬組成物」は、1種以上の本発明による化合物またはそれらの生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグおよびその他の化学的成分、ならびに生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤などの付加的な成分を含む混合物を指す。医薬組成物は、生物体への薬物投与を促進し、活性成分の吸収を容易にし、それにより生物活性を発揮させることを目的としている。
通常の医薬組成物の製造は、中国薬局方で見ることができる。
「担体」の用語は、本発明の薬物に適用され、薬物が人体に取り込まれる様式を変えることができ、また体内分布を変え、薬物の放出速度および標的臓器への薬物送達を調節するシステムを指す。薬物の担体からの放出およびターゲティングシステムは、薬物の分解および損失を少なくし、副作用を低減し、また生物学的利用率を改善することができる。例えば、担体として使用された高分子界面活性剤は、その独特な両親媒性構造のため自己集合し、様々な形態で凝集体を形成する。好ましい例として、ミセル、乳剤、ゲル、液晶、小胞などが挙げられる。これらの凝集体は、薬物分子を封入する能力を有するだけではなく、良好な膜透過性を示し、優れた薬物担体として使用することができる。
「希釈剤」の用語は、賦形剤とも呼ばれ、その主目的は、錠剤重量と体積を増加させることである。希釈剤の添加は、一定の体積を確保するだけではなく、主成分の用量偏差を小さくし、薬物の圧縮成形性を改善する。薬物錠剤が油性成分を含む場合、油性物を吸収するために吸収剤を添加する必要があり、錠剤形成を容易にする「乾燥」状態が維持される。
「薬学的に許容される塩」の用語は、本発明のリガンド−細胞毒性薬物複合体の塩形態を指し、この塩は安全で有効であり、哺乳動物において所望のインビボ生物活性を有する。本発明の抗体−薬物複合体化合物は少なくとも1個のアミノ基を含み、これにより抗体−薬物複合体化合物は、酸と塩を形成することができる。
「溶媒和化合物」の用語は、本発明のリガンド−薬物複合体と1以上の溶媒分子とから形成される薬学的に許容される溶媒和化合物を指す。
「リガンド」の用語は、標的細胞関連抗原または受容体を認識し、結合することのできる高分子化合物である。リガンドの役割は、薬物をリガンドが結合する標的細胞集団に送達することである。リガンドには、タンパク質性のホルモン、レクチン、増殖因子、抗体および細胞に結合することができる他の分子が含まれるが、これらに限定されない。
治療剤は、抗体もしくは抗体フラグメント、またはその細断片などの結合部分と分けて、同時に、または連続して投与される分子または原子であり、疾患の治療に有用である。治療剤の実例には、抗体、抗体フラグメント、複合体、薬物、細胞毒性剤、アポトーシス剤、毒素、ヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼを含む）、ホルモン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光増感剤または染料、放射性同位元素または放射性核種、オリゴヌクレオチド、干渉RNA、ペプチド、血管新生阻害剤、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質またはペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
複合体は、上記の、治療剤に結合した抗体成分または他のターゲティング部分である。本明細書では、「複合体」と「免疫複合体」の用語は、置き換え可能に用いられる。
本明細書で用いられる「細胞毒性剤」は、細胞機能を阻害もしくは抑制し、および／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。
「毒素」は、細胞生育または増殖に悪影響を及ぼす物質を指す。
「化学療法剤」は、がんを治療するために使用される化学的化合物を指す。この定義には、がんの増殖を促進するホルモンの効果を調節する、減じる、阻止する、または阻害する抗ホルモン剤も含まれ、化学療法剤は、全身性または全身治療の形式にある。
アウリスタチン（auristatin）は、比較的容易に形成される化学構造を有する全合成薬物であり、物理的特性および製薬特性の最適化が容易である。抗体複合体に用いられるアウリスタチン誘導体には、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）およびモノメチルアウリスタチンF（MMAF）が含まれ、MMAEは、天然のチューブリンポリメラーゼ阻害剤であるドラスタチン-10（dolastatin-10）に由来する合成ペンタペプチドであり、C末端に2-アミノ-1-フェニルプロピル-1-オールを付け加えて合成される。種々のヒト腫瘍細胞株に対するMMAEの阻害活性は、1ナノモル未満である。MMAE自身の細胞毒性活性を低下させるために、MMAFの場合、ドラスタチン-10のフェニルアラニンがC末端に導入される。構造中にカルボキシル基を導入したことに起因して、MMAFは細胞膜を通過する能力に乏しく、したがって、細胞に対する生物活性は顕著に減少する。しかしながら細胞に対する阻害活性は、抗体への複合体化の後には大幅に増加する（US7750116）。
「チューブリン阻害剤」の用語は、チューブリンの重合を阻害または促進することにより抗腫瘍効果を発揮する化合物の種類を指し、結果として細胞の有糸分裂過程を阻害する。非限定的な例として、メイタンシノイド、カリケアミシン類、サキサン類、ビンクリスチン、コルヒチンおよびドラスタチン類／アウリスタチン類が挙げられ、好ましくはメイタンシノイドまたはドラスタチン類／アウリスタチン類が挙げられ、より好ましくは式D1またはDMの化合物が挙げられる。
CPTはカンプトテシンに対する頭字語であり、本願においては、CPTは、カンプトテシン自身またはカンプトテシンの類縁体もしくは誘導体を指すものとして用いられる。表示された数字およびA〜Eの文字を付けられた環を有するカンプトテシンとその誘導体の構造を、下記式で提供する。
「細胞内代謝物」の用語は、抗体−薬物複合体（ADC）の細胞内代謝過程または反応により生成された化合物を指す。代謝過程または反応は、ADCのペプチドリンカーのタンパク質分解的切断などの酵素的過程であってもよく、ヒドラゾン、エステルまたはアミドなどの官能基の加水分解であってもよい。細胞内代謝物には、細胞に入った後、拡散した後、摂取された後、または輸送された後に、細胞内切断を受けた抗体および遊離薬物が含まれるが、これらに限定されない。
「細胞内切断的」および「細胞内切断」の用語は、抗体−薬物複合体（ADC）の細胞内代謝過程または反応を指し、ここでは、薬物部分（D）と抗体（Ab）との間の共有結合性の連結が切断され（すなわち、リンカーが切断され）、抗体から遊離薬物の細胞内分離がもたらされる。したがって、ADCから切断されたモジュールが細胞内代謝物である。
「生物学的利用率」は、患者に投与された薬物の所定量の全身性の利用能（すなわち血液／血漿レベル）を指す。生物学的利用率は、投与量から、体循環を達成するために薬物に必要とされる時間（速度）および総量（程度）を示す絶対項である。
「細胞毒性活性」の用語は、抗体−薬物複合体または抗体−薬物複合体の細胞内代謝物による、細胞を死滅させる作用、細胞静止作用または細胞増殖抑制作用を指す。細胞毒性活性はIC50値として表され、これは、半数の細胞が生存する場合の単位体積当たりの濃度（モルまたは重量）である。
「アルキル基」の用語は、直鎖または分枝鎖の飽和脂肪族炭化水素基を指し、1〜20個の炭素原子を含む。好ましくは1〜20個の炭素原子を持つアルキル基であり、より好ましくは1〜10個の炭素原子を持つアルキル基であり、最も好ましくは1〜6個の炭素原子を持つアルキル基である。代表例として、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、n-ペンチル基、1,1-ジメチルプロピル基、1,2-ジメチルプロピル基、2,2-ジメチルプロピル基、1-エチルプロピル基、2-メチルブチル基、3-メチルブチル基、n-ヘキシル基、2,2-ジエチルヘキシル基、およびこれらの種々の分枝異性体が挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基は置換されていてもよく、非置換でもよい。置換されている場合、置換基は利用できる結合点で置換してもよく、また置換基は、好ましくは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルオキシ基、アルキルチオール基、アルキルアミノ基、ハロゲン基、チオール基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、複素環アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、複素環アルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基およびオキソ基からなる群より独立して選ばれる1以上の基である。
「シクロアルキル基」は、飽和または部分的に不飽和の単環または多環の炭化水素基を指す。シクロアルキル基は3〜20個の炭素原子を有し、好ましくは3〜12個の炭素原子を有し、より好ましくは3〜10個の炭素原子を有し、最も好ましくは3〜8個の炭素原子を有する。単環シクロアルキル基の代表例として、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキサジエニル基、シクロヘプチル基、シクロヘプタトリエニル基、シクロオプチル基等が挙げられるが、これらに限定されない。多環シクロアルキル基は、スピロ環、縮合環または架橋環を有するシクロアルキル基を含む。
「ヘテロシクリル基」の用語は、飽和または部分的に不飽和の単環または多環の炭化水素置換基を指し、3〜20個の環原子を有する。ここで、1個以上の環原子は、N、OおよびS(O)m（mは、0と2の間の整数である。）からなる群より選ばれるヘテロ原子であるが、環において-O-O-、-O-S-または-S-S-は除外され、また残りの環原子は炭素原子である。1〜４個の原子がヘテロ原子である、3〜12個の環原子が好ましく、3〜10個の環原子がより好ましい。単環ヘテロシクリル基の代表例として、ピロリジニル基、ピペリジル基、モルフォリニル基、チオモルフォリニル基、ホモピペラジニル基等が挙げられるが、これらに限定されない。多環ヘテロシクリル基は、スピロ環、縮合環または架橋環を有するヘテロシクリル基を含む。
前記ヘテロシクリル環は、アリール環、ヘテロアリール環またはシクロアルキル環に縮合してもよく、ここで、親構造に結合した環は、ヘテロシクリル基である。代表例は以下の群に含まれるが、これらに限定されない。
ヘテロシクリル基は、任意に置換され、または置換されていない。置換されている場合、置換基は、好ましくは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルスルホ基、アルキルアミノ基、ハロゲン基、チオール基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、複素環アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基およびオキソ基からなる群より独立して選ばれる1以上の基である。
「アリール基」の用語は、共役π電子系を有する6〜14員環で、すべてが炭素の単環または縮合多環（すなわち、環は隣接する炭素原子対を共有する）を指す。アリール基は、好ましくはフェニル基およびナフチル基などの6〜10員環であり、好ましくはフェニル基である。アリール環は、ヘテロアリール環、ヘテロシクリル環またはシクロアルキル環と縮合してもよく、親構造に結合した環はアリール環である。代表例は以下の群に含まれるが、これらに限定されない。

アリール基は置換されていてもよく、非置換でもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン基、チオール基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基およびヘテロシクロアルキルチオ基からなる群より独立して選ばれる1以上の基である。
「ヘテロアリール基」の用語は、1〜4個のヘテロ原子および5〜14個の環状原子を有する複素芳香族系を指し、ヘテロ原子は、O、SおよびNからなる群より選ばれる。ヘテロアリール基は、好ましくは５〜10員であり、より好ましくはフリル基、チエニル基、ピリジニル基、ピロリル基、N-アルキルピロリル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、イミダゾリル基、テトラゾリル基などの5または6員である。ヘテロアリール環は、アリール環、ヘテロシクリル環またはシクロアルキル環と縮合してもよく、親構造に結合した環はヘテロアリール環である。代表例は以下の群に含まれるが、これらに限定されない。
ヘテロアリール基は、任意に置換され、または置換されていない。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン基、チオール基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基およびヘテロシクロアルキルチオ基からなる群より独立して選ばれる1以上の基である。
「アルコキシ基」の用語は、-O-（アルキル）基および-O-（非置換シクロアルキル）基の両方を指し、アルキル基は上記されている。アルコキシ基の代表例には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基およびシクロヘキシルオキシ基が含まれるが、これらに限定されない。アルコキシ基は、任意に置換され、または置換されていない。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルスルホ基、アルキルアミノ基、ハロゲン基、チオール基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、複素環アルコキシ基、シクロアルキルチオ基および複素環アルキルチオ基からなる群より独立して選ばれる1以上の基である。
「結合」の用語は、“＿”として表示される共有結合を指す。
「ヒドロキシ基」の用語は、-OH基を指す。
「ハロゲン基」の用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を指す。
「アミノ基」の用語は、-NH2基を指す。
「シアノ基」の用語は、-CN基を指す。
「ニトロ基」の用語は、-NO2基を指す。
「オキソ基」の用語は、=O基を指す。
「任意の」または「任意に」の用語は、続いて記載されている事象または状態が必ずしも起こらないことを意味し、この記述は、事象または状態が生じる場合と生じない場合を含む。例えば「アルキル基で任意に置換された複素環基」は、アルキル基は必ずしも存在しないことを意味し、この記述は、複素環基がアルキル基で置換されている場合と、複素環基がアルキル基で置換されていない場合とを含む。
「置換された」は、基の中の1個以上の水素原子が、好ましくは5個以下、より好ましくは1〜3個の水素原子が、それぞれ独立して対応する数の置換基で置換されることを指す。置換基は可能性のある化学的位置にのみ存在することは明らかである。当業者であれば、実験または理論による過度の試みを行うことなく、置換が可能であるのか不可能であるのか決定することができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基またはヒドロキシ基と不飽和結合を有する炭素原子（アルケンなど）との間の結合は、不安定である可能性がある。
「リンカー」は、抗体を薬物モジュールに共有結合させる共有結合鎖または原子鎖を含む化学モジュールを指す。種々の実施態様において、リンカーには、アルキルジイル、アリレン、ヘテロアリレンなどの2価基、−(CR2) nO (CR2) n−などのユニット、ヒドロカルビルオキシ繰り返しユニット（例えば、ポリエチレンアミノ、PEG、ポリメチレンオキシ）およびアミノアルキル（例えば、ポリビニルアミノ、Jeffamine（登録商標））など、またコハク酸エステル、スクシンイミド、ビスグリコール酸エステル、マロン酸エステルおよびカプロアミドを含むジエステルおよびアミドが含まれる。
〔略称〕
（リンカーユニット）
MC = 6-マレイミド-カプロイル
Val-Citまたは「vc」= バリン−シトルリン（プロテアーゼで切断可能なリンカーの代表的なジペプチド）
シトルリン = 2-アミノ-5-ウレイドペンタン酸
PAB = パラアミノベンジルオキシカルボニル（「自壊性」リンカーユニット例）
Me-Val-Cit = N-メチル−バリン−シトルリン（リンカーペプチド結合は、カテプシンBによる切断を防止するために修飾してある。）
MC(PEG)6-OH = マレイミド−カプロイルポリエチレングリコール（これは抗体のシステインに結合させることができる。）
SPP = N-サクシニミジル4-（2-ピリジルチオ）吉草酸
SPDP = N-サクシニミジル3-（2-ピリジルチオ）プロピオン酸
SMCC = サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸
IT = イミノスルファン
（細胞毒性薬物）
MMAE = モノメチルアウランタチン（aurantatin）E（MW 718）
MMAF = アウランタチンE（MMAE）の変体であり、該薬物（MW 731.5）のC末端にフェニルアラニンを有する。
MMAF-DMAEA = MMAFのC末端にアミドによりフェニルアラニンが結合したDMAEA（ジメチルアミノエチルアミン）（MW 801.5）
MMAF-TEG = MMAFのフェニルアラニンがテトラエチレングリコールによりエステル化されたもの。
MMAF-NtBu = MMAFのC末端に結合したアミドとしてのN- tert-ブチル体
DM1 = N (2’)-脱アセチル-N (2’)-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)‐マイチアン（maytian）
DM3 = N (2’)-脱アセチル-N2-(4-メルカプト-1-オキソペンチル)‐マイチアン
DM4 = N (2’)-脱アセチル-N2-(4-メルカプト-4-メチル-1-オキソペンチル)‐マイチアン
また本発明は、本発明のいずれかの抗c-Met抗体もしくは1種以上の細胞毒性薬物と結合したエンドサイトーシス活性を示す他のc-Met抗体（例えばLY-2875358）、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む抗体−細胞毒性薬物複合体（「抗体−薬物複合体」または「ADC」と置き換え可能である）を提供する。ここで細胞毒性薬物には、例として、化学療法剤、薬物、増殖抑制剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒素またはそのフラグメント）または放射性同位元素（すなわち放射性発光複合体）が含まれる。
ある実施態様において、抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物は、抗c-Met抗体および化学療法薬または他の毒素を含む。細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物の製造に使用することができる抗体−化学療法薬は、本明細書に記載されている（上記）。本明細書に記載されている酵素活性毒素およびそのフラグメントも使用される。
ある実施態様において、抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物は、抗c-Met抗体および1種以上の小分子の毒素を含む。かかる毒素には、カンプトテシン誘導体、カリチアマイシン、マイタンシノイド、ドラスタチン、オリコチン（oricotine）、トリコテシンおよびCC1065、ならびにこれらの薬物の細胞毒性フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
代表的なリンカーL2には、6-マレイミドカプロイル（「MC」）、マレイミドプロピオニル（「MP」）、バリン−シトルリン（「val-cit」または「vc」）、アラニン−フェニルアラニン（「ala-phe」）、パラアミノベンジルオキシカルボニル（「PAB」）、N-サクシニミジル4-（2-ピリジルチオ）吉草酸（「SPP」）、N-サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸（「SMCC」）、およびN-サクシニミジル(4-ヨード-アセチル) アミノ安息香酸（「SIAB」）が含まれる。種々のリンカーが当該技術分野で周知であり、以下に記載される。
リンカーは、細胞内で薬物の遊離を容易にする「切断可能なリンカー」である。例えば、酸不安定なリンカー（例えばヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えばペプチダーゼ感受性）のリンカー、光不安定なリンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chariら、 Cancer Research 52：127〜131 (1992)；米国特許No. 5,208,020）がある。
ある実施態様において、リンカーは、抗体を他のリンカーまたは薬物モジュールに結合する「延伸（ストレッチャー）ユニット」である。代表的なストレッチャーユニットは以下に示される（波線は、抗体が共有結合する部位を示す。）。
ある実施態様において、リンカーユニットはアミノ酸ユニットである。その一実施態様において、アミノ酸ユニットは、プロテアーゼがリンカーを切断するようにし、それにより、リソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼへの暴露後、抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物からの薬物遊離を促進する。Doroninaら、(2003) Nat. Biotechnol. 21：778-784の実施例を参照できる。アミノ酸ユニットの代表例には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドおよびペンタペプチド」が含まれるが、これらに限定されない。ジペプチドの代表例には、バリン−シトルリン（(VCまたはval-cit）、アラニン−フェニルアラニン（AFまたはala-phe）、フェニルアラニン−リジン（FKまたはphe-lys）またはN-メチル−バリン−シトルリン（Me-val-cit）が含まれる。トリペプチドの代表例には、グリシン−バリン−シトルリン（gly-val-cit）およびグリシン−グリシン−グリシン（gly-gly-gly）が含まれる。アミノ酸ユニットは、天然に存在するアミノ酸残基ならびに微量アミノ酸およびシトルリン等の非天然アミノ酸類縁体を含む。アミノ酸ユニットは、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンB、CおよびD、または血漿プロテアーゼ等の特異的な酵素による酵素的切断に対する選択性のために設計され、最適化される。
ある実施態様において、リンカーは、抗体を（直接的に、または延伸ユニットおよび／またはアミノ酸ユニットを介して）薬物分子に結合する「スペーサー」ユニットである。スペーサーユニットは、「自壊性」または「非自壊性」である。「非自壊性」スペーサーユニットは、ADCの酵素的切断（タンパク質加水分解）後に、薬物モジュールに結合しているスペーサーユニットが残っているスペーサーユニットの一部または全部を指す。非自壊性スペーサーユニットの例として、グリシンスペーサーユニットおよびグリシン−グリシンスペーサーユニットが挙げられるが、これらに限定されない。配列特異的酵素切断に感受性の、他のペプチドスペーサーの組み合わせも考えられる。例えば、グリシン−グリシンスペーサーユニットを含むADCの腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断は、ADCの残りからADCのグリシン−グリシン薬物モジュールの遊離をもたらす。その一実施態様において、グリシン−グリシン−薬物モジュールは、次に腫瘍細胞における別の加水分解ステップに置かれ、その結果、グリシン−グリシンスペーサーユニットが薬物モジュールから切断される。
「自壊性」スペーサーユニットは、別の加水分解ステップなしで薬物モジュールが遊離するようにする。ある実施態様において、リンカーのスペーサーユニットはパラアミノベンジルユニットを含む。その一実施態様において、パラアミノベンジルアルコールは、アミド結合によってアミノ酸ユニットに結合し、その結果、ベンジルアルコールと細胞毒性薬物との間にカルバミン酸、メチルカルバミン酸または炭酸を形成する。例えば、Hamannら、(2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15：1087〜1103を参照できる。一実施態様において、スペーサーユニットはパラアミノベンジルオキシカルボニル（PAB）である。
本発明の代表的なリンカーユニットは以下の通りです。
延伸部、スペーサーおよびアミノ酸ユニットを含むリンカーは、US 2005-0238649 A1などの本技術分野で周知の方法により合成することができる。
〔代表的な薬物モジュール〕
（マイタンシンおよびマイタンシノイドアルカロイド）
ある実施態様において、抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物は、1種以上のマイタンシノイド分子に結合した本発明の抗体を含む。マイタンシノイドは、チューブリンの多量体化を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、最初は東アフリカの灌木であるMaytian木（Maytenus serrata）から単離された（米国特許No.3,896,111）。その後、ある微生物が、マイタンシノールおよびC-3アデホビルなどのマイタンシノイドアルカロイドを産生することが見出された（米国特許No.4,151,042）。
マイタンシノイド薬物モジュールは、抗体−薬物複合体において魅力のある薬物モジュールである。その理由は、マイタンシノイド薬物モジュールが、(i) 発酵または発酵産物から比較的容易に化学的に修飾または誘導体化されること；(ii) 非ジスルフィドリンカーを介して抗体に結合するのに適した官能基で容易に誘導体化されること；(iii) 血漿中で安定であること；および(iv) 種々の腫瘍細胞株に対して有効であることである。
マイタンシノイドアルカロイド薬物モジュールとしての使用に適したマイタンシン化合物は、当技術分野で周知であり、既知の方法によって天然物から単離することができ、または遺伝子工学技術を用いて製造することができる（Yuら、(2002) PNAS 99：7968〜7973を参照のこと）。マイタンシノールおよびマイタンシノール類縁体も、既知の方法によって製造することができる。
マイタンシノイドアルカロイド薬物モジュールの代表的な実施態様には、本明細書に記載されるように、DM1、DM3および DM4が含まれる。
（アウリスタチンおよびドラスタチン）
ある実施態様において、抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物は、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチド類縁体もしくは誘導体（例えばアウリスタチン）に結合した本発明の抗体を含む（米国特許No. 5,635,483；5,780,588）。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管動力学、GTP加水分解および核もしくは細胞分裂を阻害し（Woykeら、(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12)：3580〜3584）、抗がん活性（米国特許No. 5,663,149）および抗真菌活性（Pettitら、(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42：2961〜2965）を有する。ドラスタチンまたはアウリスタチン薬物モジュールは、ペプチド薬物モジュールのN（アミノ）末端またはC（カルボキシ）末端を介して抗体に結合する（WO02/088172）。
アウリスタチンの実施例には、N末端結合モノメチルアウリスタチン薬物モジュールDEおよびDFが含まれ、これらはSenterらにより開示されいる（Proceedings of the American Association for CancerResearch, 45巻、要旨番号623、2004年3月28日）。その開示内容のすべては、参考として本願明細書に明確に組み込まれる。ペプチド薬モジュールは、以下の一般式DEおよびDFから選択される。
ここで、DEおよびDFの波線は、抗体または抗体リンカーの共有結合部位を示し、各部位はそれぞれ独立している。
R2は、HおよびC1〜C8ヒドロカルビル基から選ばれ；
R3は、H、C1〜C8ヒドロカルビル基、C3〜C8炭素環基、アリール基、C1〜C8ヒドロカルビル基〜アリール基、C1〜C8ヒドロカルビル基〜(C3〜C8炭素環基)、C3〜C8複素環基およびC1〜C8ヒドロカルビル基〜(C3〜C8複素環基)からなる群より選ばれ；
R4は、H、C1〜C8ヒドロカルビル基、C3〜C8炭素環基、アリール基、C1〜C8ヒドロカルビル基〜アリール基、C1〜C8ヒドロカルビル基〜(C3〜C8炭素環基)、C3〜C8複素環基およびC1〜C8ヒドロカルビル基〜(C3〜C8複素環基)からなる群より選ばれ；
R5は、Hおよびメチル基から選ばれ；
または、R4およびR5は、式-(CRaRb)n-の炭素環を形成し、Ra およびRbはそれぞれ独立して、H、C1〜C8ヒドロカルビル基およびC3〜C8炭素環基からなる群より選ばれ、nは2、3、4、5および6から選ばれ；
R6は、HおよびC1〜C8ヒドロカルビル基から選ばれ；
R7は、H、C1〜C8ヒドロカルビル基、C3〜C8炭素環基、アリール基、C1〜C8ヒドロカルビル基〜アリール基、C1〜C8ヒドロカルビル基〜(C3〜C8炭素環基)、C3〜C8複素環基およびC1〜C8ヒドロカルビル基〜(C3〜C8複素環基)からなる群より選ばれ；
各R8は、独立して、H、OH、C1〜C8ヒドロカルビル基、C3〜C8炭素環基およびO-(C1〜C8ヒドロカルビル基) からなる群より選ばれ；
R9は、HおよびC1〜C8ヒドロカルビル基から選ばれ；
R10は、アリール基およびC3〜C8炭素環基から選ばれ；
Zは、O、S、NHおよびNR12から選ばれ、R12はC1〜C8ヒドロカルビル基であり；
R11は、H、C1〜C20ヒドロカルビル基、アリール基、C3〜C8炭素環基、-(R13O)m-R14および-(R13O)m-CH(R15)2からなる群より選ばれ；
mは、1〜1000から選ばれる整数であり；
R13は、C2〜C8ヒドロカルビル基であり；
R14は、C1〜C8ヒドロカルビル基であり；
R15は、独立して、H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3Hおよび-(CH2)n-SO3- C1〜C8ヒドロカルビル基からなる群より選ばれ；
R16は、独立して、H、C1〜C8ヒドロカルビル基および-(CH2)n-COOHからなる群より選ばれ；
R18は、-C(R8)2-C(R8)2-アリール基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3〜C8炭素環基)および-C(R8)2-C(R8)2-(C3〜C8炭素環基)から選ばれ；および、
nは、0〜6から選ばれる整数である。
式DEのアウリスタチンの実施例として、MMAEが例示される。ここで、波線は、リンカー（L）が抗体‐薬物複合体に共有結合していることを示す。
式DFのアウリスタチンの実施例として、MMAFが例示される。ここで、波線は、リンカー（L）が抗体‐薬物複合体に共有結合していることを示す（US2005/0238649およびDoroninaら、(2006) Bioconjugate Chem. 17：114〜124を参照のこと）。
他の薬物モジュールは、以下から選ばれるMMAF誘導体を含む。ここで、波線は、リンカー（L）が抗体‐薬物複合体に共有結合していることを示す。
一形態において、親水性基がR11で薬物モジュールに結合する。ここで該親水性基には、上記の通りトリエチレングリコールエステル（TEG）が含まれるが、これに限定されない。特定の理論に限定されることなく、親水性基は、薬物モジュールの細胞内移行および不凝塊形成に寄与する。一般式ＩのADCの実施例の例示には、アウリスタチン／ドラスタチンまたはこれらの誘導体が含まれ、これはUS2005-0238649A1およびDoroninaら（Bioconjugate Chem.17：114〜124, 2006）に記載されており、参考として本願明細書に明確に組み込まれる。MMAEまたはMMAFを含む一般式ＩのADCおよび種々のリンカーの実施例の例示は、以下の構造および略号を持つ（ここで、「Ab」は抗体であり；pは1〜約8の範囲にあり；「Val-Cit」はバリン−シトルリンジペプチドであり；「S」はイオウ原子である。）。
Ab-リンカー1-MC-vc-PAB-MMAE

通常は、ペプチド系薬物モジュールは、2種以上のアミノ酸および／またはペプチドフラグメント間でペプチド結合を形成して製造することができる。かかるペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の技術分野で周知の液相合成法（E. SchroderとK.Lubke、The Peptides、第1巻、76〜136頁、1965、Academic Pressを参照のこと）に従って製造することができる。アウリスタチン／ドラスタチン薬物モジュールは、以下の文献に従って製造することができる： US2005-0238649A1；米国特許No.5635483；米国特許No.5780588；Pettitら、(1989) J. Am. Chem. Soc. 111：5463〜5465；Pettitら、(1998) Anti-Cancer Drug Design 13：243〜277；Pettit, G. R.ら、Synthesis, 1996, 719〜725；Pettitら、(1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15：859〜863；およびDoronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7)：778〜784。
具体的には、MMAFおよびその誘導体など、一般式DFのアウリスタチン／ドラスタチン薬物モジュールは、US2005-0238649A1およびDoroninaら、(2006) Bioconjugate Chem. 17：114〜124に記載された方法に従って製造することができる。MMAEおよびその誘導体など、一般式DEのアウリスタチン／ドラスタチン薬物モジュールは、Doroninaら、(2003) Nat. Biotech. 21：778〜784に記載された方法に従って製造することができる。MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAFおよびMC-vc-PAB-MMAEの薬物リンカーモジュールは、Doroninaら、(2003) Nat. Biotech. 21：778〜784および米国特許出願No. US2005/0238649A1などに記載された従来の方法により、好都合に合成することができ、次に、対象の抗体に結合させる。
〔薬物搭載〕
薬物搭載（loading）は、yにより表現され、これは、式Ｉの分子における抗体あたりの薬物モジュールの平均個数である。薬物搭載は、抗体あたり1〜20の薬物モジュール（D）の範囲である。式ＩのADCは、（1〜20）の範囲にある薬物モジュールに結合した抗体の集合を含む。カップリング反応により得られたADC調製物における抗体あたりの薬物モジュールの平均個数は、質量分析、ELISA測定およびHPLCなどの従来法により特性を明らかにすることができる。yに関するADCの定量的分布も測定することができる。ある場合には、他の薬物を搭載したADCから、ある一定のp値を有する均一 なADCが単離され、精製され、特性が明らかにされた。これは、逆相HPLCまたは電気泳動などの方法により成し遂げることができる。
ある抗体薬物複合体について、yは、抗体上の結合部位の個数により制限される。例えば、上記の実施例による実施態様にようにシステインチオールが結合している場合、抗体は１個だけ、もしくはいくつかのシステインチオール基を持つか、またはリンカーに結合することのできる１個以上の反応性チオール基を持つ。ある実施態様において、y > 5など、薬物搭載量が多くなれば、凝集、不溶性、毒性、または、ある一定の抗体薬物複合体の細胞透過性の減少の原因となる。ある実施態様では、本発明のADCの薬物搭載は、1〜約8；2〜約6；約3〜約5；約3〜約4；約3.1〜約3.9；約3.2〜約3.8；約3.2〜約3.7；約3.2〜約3.6；約3.3〜約3.8；または約3.3〜約3.7の範囲である。事実、あるADCについては、各抗体薬物モジュールの最適比は8未満であり、約2〜約5であることが示されている。US2005-0238649A1を参照し、その内容は参考として本明細書に組み入れられる。
ある実施態様では、理論的最大値未満である薬物モジュールは、カップリング反応により抗体に結合される。抗体は、例えば、以下で議論するように、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含んでもよい。最も反応性のあるリジン基だけが、アミン反応性リンカー試薬と反応することができる。一般に、抗体は、薬物モジュールに結合することのできる遊離および反応性システインチオール基を多数含むわけではない。事実、抗体中のシステインチオール基の大部分は、ジスルフィド架橋の形態で存在する。ある実施態様では、抗体は、反応性システインチオール基を生成する部分的または完全な還元条件下で、ジチオスレイトール（DTT）またはトリカルボニルエチルホスフィン（TCEP）などの還元剤で還元される。ある実施態様では、抗体は、リジンまたはシステインなどの反応性求核基に暴露することにより、変性条件下に置かれる。
ADCの薬物搭載（薬物／抗体比、DAR）は、様々な方法により制御することができる。例えば、(i) 薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬のモル過剰を制限すること；(ii) カップリング反応の時間および温度の制限すること；(iii) システインチオールの修飾を制限すること、または還元条件を制限すること；(iv) 組換え技術により抗体のアミノ酸配列を改変し、リンカー−薬物結合の個数および／または位置を制御するために、システイン残基の個数および位置を変えること（本発明およびWO2006/034488（参考として本願明細書に全体が組み込まれる）に記載されるのと同様に製造されたthioMabまたはthe thioFab）により制御することができる。
1個以上の求核基が薬物−リンカー中間体またはリンカーと反応し、得られた産物である後続の薬物モジュール試薬が、抗体の分布に結合した1個以上の薬物モジュールを持つADC化合物混合物であると理解されるべきである。抗体あたりの薬物の平均個数は、混合物から、抗体特異的および薬物特異的抗体を含むELISA測定により算出することができる。混合物中の様々なADC分子は、質量分析により同定することができ、また、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーHPLCにより分離することができる。ある実施態様では、単一の搭載値を有する均一なADCは、カップリング混合物より、電気泳動またはクロマトグラフィーにより単離することができる。
〔抗体−細胞毒性薬物複合体またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物の製造法〕
一般式ＩのADCは、当業者には周知の有機化学的な反応、条件および試薬を用いて、いくつかの経路で製造することができる。これには、(1) 抗体の求核基を二価のリンカー試薬と共有結合を介して反応させ、Ab-Lを形成させた後、薬物モジュールDと反応させること；および(2) 薬物モジュールの求核基を二価のリンカー試薬と共有結合を介して反応させ、D-Lを形成させた後、抗体の求核基と反応させることが含まれる。後者を用いて式ＩのADCを製造する例となる方法は、US2005-0238649A1に記載されており、参考として本願明細書に明示的に組み込まれる。
抗体の求核基には、(i) N末端アミノ基；(ii) リジン等の側鎖アミノ基；(iii) システイン等の側鎖チオール基；および(iv) グリコシル化抗体中の糖鎖のヒドロキシル基またはアミノ基が含まれるが、これらに限定されない。アミン、チオールおよびヒドロキシル基は求核性であり、リンカーモジュール上の求電子基と反応することができ、共有結合を形成する。リンカー試薬には、(i) NHSエステル、HOBtエステル、ハロギ酸エステル、酸ハロゲン化物等の活性エステル；(ii) ハロアセトアミド等のヒドロカルビル基およびハロゲン化ベンジル；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル基およびマレイミド基が含まれる。ある抗体は、システイン架橋であり、還元できる鎖間ジスルフィド結合を持つ。抗体は、DTT（ジチオスレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（TCEP）等の還元剤による処理により、完全にまたは部分的に還元され、リンカーとのカップリング反応性を与える。各システイン架橋は、理論的には2個の反応性チオール求核基を形成する。別法として、スルフヒドリル基がリジン残基の修飾を経て、抗体中に導入される。例えば、リジン残基と2-イミンスルファン（トラウト試薬）を反応させると、アミンがチオールへ変換される。
本発明の抗体−薬物複合体は、抗体上の求電子基（アルデヒドまたはケトンカルボニル基等）と薬物上のリンカーまたは求核基との間の反応により製造することができる。リンカー上の有用な求核基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ基、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸およびアリールヒドラジドが含まれるが、これらに限定されない。一実施態様において、グリコシル化抗体の糖鎖は、例えば、過ヨウ素酸オキシダントにより酸化され、リンカーまたは薬物モジュールのアミン基と反応することができるアルデヒド基またはケトン基を形成する。得られるイミンシッフ塩基は、安定な結合を形成するか、または、例えば水素化ホウ素試薬により還元され、安定アミン結合を形成する。一実施態様おいて、グリコシル化抗体の糖質部分とガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムとの反応は、抗体中にカルボニル基（アルデヒド基またはケト基）を生成し、これらは薬物上の適切な基と反応する（Hermanson、Bioconjugate Techniques）。他の実施態様では、N末端セリンまたはスレオニン残基を含む抗体は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し、一級アミノ酸でアルデヒドの形成をもたらす（GeogheganとStroh、(1992) Bioconjugate Chem. 3：138〜146；US5362852）。かかるアルデヒドは、薬物モジュールまたはリンカー求核試薬と反応することができる。
薬物モジュール上の求核基には、アミン、チオール基、ヒドロキシ基、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸およびアリールヒドラジドが含まれるが、これらに限定されない。これらは、リンカーモジュール上の求電子基と反応することができ、共有結合を形成する。また、リンカー試薬には、(i) NHSエステル、HOBtエステル、ハロギ酸エステルおよび酸ハロゲン化物等の活性エステル；(ii) ハロアセトアミド等のヒドロカルビル基およびハロゲン化ベンジル；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル基およびマレイミド基が含まれる。
本発明の化合物は、以下の架橋結合試薬により製造されたADCを明確に射程に入れるが、これらに限定されない。架橋結合試薬は、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、シリホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、スルホ-SMPBおよびSVSB（サクシニミジル−(4-ビニルスルホン) 安息香酸）であり、市販されている（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A,・2003〜2004応用マニュアルと製品カタログ（2003-2004 Applications Handbook and Catalog、467〜498頁など）。
抗体および細胞毒性薬物を含む抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物は、N-サクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸（SPDP）、サクシニミジル-4-( N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸（SMCC）、アミノスルファン（IT）、イミダート（ジメチルアジパミドHCl、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（パラアジドベンソイル）ヘキサメチレンジアミン等）、ビスジアゾ誘導体（ビス（パラジアゾベンゾイル）‐エチレンジアミン等）、ジイソチオシアナート（トルエン2,6-ジイソシアナート等）および二重活性フッ素化合物（1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等）等の種々の二機能性タンパク質カップリング試薬を用いても製造することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら、Science 238：1098 (1987)に記載されるように製造することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナートベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合させる例となるキレート剤である。WO 94/11026を参照する。
別法として、抗体および細胞毒性薬物を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成により製造することができる。組換えDNA分子は、複合体の抗体および細胞毒性部分をコードする領域をそれぞれ含み、相互に隣接しており、リンカーペプチドをコードする領域により分けられている。該リンカーペプチドは、複合体の所望の特性を損なわない。
さらに別の実施態様において、抗体は、腫瘍の前ターゲティングのために、「受容体」（ストレプトアビジン等）に結合させ、抗体−受容体複合体を患者に投与し、続いて、血液循環から未結合複合体を除去する捕捉剤を使用する。次に、細胞毒性薬物（放射性ヌクレオチド等）を結合させた「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。以下の実施例は、説明を目的として提供するのみであり、本発明の範囲を制限することは意図されない。
以下、本発明は、実施例を参照してさらに記述されるが、そこへ本発明の範囲が制限されるわけではない。
本発明の実施例において、具体的な条件が記載されていない場合、実験は、通常、従来の条件下で実施するか、または、材料もしくは製品の製造者により提示される条件下で実施した。Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら、Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NYを参照する。試薬の出所が具体的に与えられていない場合、その試薬は市販されている。
〔抗原抗体のクローン発現〕
本発明で用いられる抗体（軽鎖および重鎖）および抗原は、この技術分野で周知の重複伸長PCR法により作成する。重複伸長PCRにより得られたDNAフラグメントは、HindIII/BstBIを用いて発現ベクターpEE6.4（Lonza Biologics）に挿入し、293F細胞（Invitrogen、カタログ番号R790-07）に発現させた。得られた組換えタンパク質は、免疫またはスクリーニングのために使用した。c-Met遺伝子鋳型は、origene社から得る（商品コードRC217003）。クローニングし、発現させるDNA配列は以下の通りである。
ヒトc-Met細胞外領域（ECD）およびマウスFc領域融合タンパク質（ヒトc-Met ECD-mFc）DNA配列：
ヒトc-Met細胞外Sema領域およびFlag-Hisタグ（ヒトc-Met Sema-Flis）DNA配列：
ヒトc-Met ECD hisタグ（ヒトc-Met ECD-His）組換えタンパク質DNA配列：
〔抗原抗体結合実験（ELISA）〕
本実験は、インビトロでc-Met抗原に対するc-Met抗体（ハイブリドーマの上清または組み換え発現させたモノクローナル抗体）の親和性を測定するため、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を使用する。
実験手順：抗原（ヒトc-Met-His、実施例１）をコーティング緩衝液（PBS：Hyclone、カタログ番号SH30256.01B）で2 μg/mLに希釈し、これを96ウェルプレート（Costar 9018、カタログ番号03113024）に100 μL／ウェルで添加し、4℃で一晩インキュベートした。翌日、96ウェルプレートを室温に戻し、洗浄緩衝液（PBS＋0.05％ツイーン20（Sigma、カタログ番号P1379））で3回洗浄した。ブロッキング緩衝液（PBS＋0.05％BSA（Roche、カタログ番号738328））を200 μL／ウェルで加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。試験対象の抗c-Met抗体を96ウェルプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ブロッキング緩衝液（10000倍希釈）で希釈した二次抗体（ヤギ抗マウスIgG(H＋L)( HRP)（Thermo、番号31432）を、96ウェルプレートに100 μL／ウェルで添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。次にプレートを3回洗浄し、TMB発色基質（eBioscience REF：00-4201-56）を96ウェルプレートに100 μL／ウェルで添加した。停止液2N H2SO4を96ウェルプレートに100 μL／ウェルで添加し、プレートリーダーにより450 nmでプレートを読み取った。
〔抗ヒトc-Metのマウスモノクローナル抗体細胞株の産生〕
本発明は、マウスの免疫、膵臓細胞の融合およびハイブリドーマのスクリーニングにより、マウス抗ヒトc-Metモノクローナル細胞株を得る。この方法は、この分野で周知である。組換え発現された抗原（ヒトc-Met ECD-mFc、ヒトc-Met Sema-flis、実施例１を参照のこと）をPBS（Hyclone、カタログ番号SH30256.01B）で1 mg/mLに希釈し、フロイントアジュバント（初回免疫はフロイント完全アジュバントで行い、他の追加免疫はフロイント不完全アジュバントで行った。）で乳化して、Balb/Cマウスに、各マウスに100 μgの抗原を接種するように皮下注射し（5マウス／群）、追加免疫は2週間ごとに行った。最初の追加免疫から、各追加免疫後7〜10日の間にマウス血清を採取し、その力価をELISAにより測定した（方法は実施例２にある。）。
免疫後、血清力価が1：105より高いマウスを細胞融合のために選抜した。マウスB細胞およびミエローマ細胞（SP2/0、ATCC番号：CRL-1581TM）をそれぞれ無菌状態で準備し、数を数えた。この2種の細胞は、B細胞：SP2/0が1：4の比率で混合し、次に遠心分離した（1500 r/min、7分間）。上清を捨て、1 mLの50％ポリエチレングリコール（供給元：SIGMA、カタログ番号RNBB306）を加えた。次に、1 mLの血清不含RPMI1640（供給元：GIBCO、カタログ番号C22400）を用いて停止し、10分間遠心分離した。その後、上清を捨てた。沈渣を、ハイブリドーマ細胞成長因子（供給元：Roche、カタログ番号1363735001）、血清（供給元：GIBCO、カタログ番号C20270）およびHAT（供給元：Invitrogen、カタログ番号21060-017）を含むRPMI1640に再懸濁した。B細胞は、プレートに、105／ウェルおよび各ウェル100 μLで蒔いた。プレートは、細胞インキュベーターで37℃に置いた。3日後、ハイブリドーマ細胞成長因子、血清およびHAT（供給元：Invitrogen、カタログ番号11067-030）を含む 100 μLのRPMI1640を各ウェルに加えた。2〜4日後、各ウェルは、ハイブリドーマ細胞成長因子、血清およびHATを含む150 μLのRPMI1640に置き換えた。翌日、陽性クローンはELISAにより検出した（実施例２の方法を参照のこと）。結果は表１に示される。
〔胃がん細胞MKN45の増殖に対する抗ヒトc-Metモノクローナル抗体の抑制作用〕
上記のクローンを選択し、さらに培養してモノクローンを得た。ELISAによる結合活性の検証後、培養のためにモノクローンを選択し、得られた上清を細胞生存率アッセイに供した。本試験原理によれば、本発明の抗ヒトc-Met抗体は、ヒト胃がん細胞MKN45の表面に発現するc-Metのリン酸化を抑制し、MNK45細胞の増殖を抑制することができる。
ヒト胃がん細胞（MKN45、JCRB、JCRB0254、P11）を、1×105細胞／mLで96ウェル細胞培養プレート（costar、カタログ番号3799）に50 μL／ウェルで添加した。培養液は、RPMI1640培養液（GIBCO、カタログ番号11835）＋10％FBS（GIBCO、10099141）である。試験対象の抗ヒトc-Met抗体を50 μL／ウェルで添加し、インキュベーター（製造者：三洋、機器番号：TINC035）で37℃、5日間培養した。CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Promega、G7573）を使用し、細胞の増殖を、使用説明書に従って検出した。プレートは、プレートリーダー（PerkinElmer、TREA001-RDA-IBA100）で読み取った。細胞の増殖率は、次の式を用いて算出した。
％細胞増殖 =（1−実験群における細胞の読み取り／未処理群における細胞の読み取り）×100％
結果を表２に示す。
〔抗c-Met抗体配列クローニング〕
実施例４から得られた良好な生存率を示す単一細胞株Ab-5を、cDNA配列クローニングのために選択した。Mabを組換え発現させ、種々の活性試験に供した。抗体遺伝子の重鎖および軽鎖の可変領域を逆転写PCRによって増幅し、配列決定によってモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖配列を得るためにベクターに連結した。まず、RNA精製キット（Qiagen社、No.74134、この手順については使用説明書を参照のこと）を使用して、実施例４から活性単一細胞株の全細胞RNAを抽出した。次に、cDNA単鎖を、cDNA合成キット（Invitrogen社、No.18080-051）により、すなわちOligo-dTプライマーcDNA逆転写により調製した。生成物を鋳型として供し、抗体重鎖および軽鎖の可変領域配列をPCR法により合成した。PCR産物はTAベクターpMD-18Tにクローニングし、次いで配列決定した。得られた抗体の重鎖および軽鎖配列を発現ベクターに別々にクローニングし（実施例１を参照のこと）、モノクローナル抗体を組換え発現させ、その活動を証明した(実施例２および４を参照のこと)。続いてヒト化を行った。
本発明のマウスハイブリドーマ細胞モノクローナル抗体Ab-5の配列：
重鎖可変領域：
軽鎖可変領域：
抗ヒトc-Met抗体のVH/VL CDRのアミノ酸残基が決定され、、Kabat番号付け体系により注釈を付ける。
本発明のマウス起源のCDR配列は、表３に示される。
〔抗c-Met抗体のヒト化〕
実施例５から得られたマウス起源の抗c-Metモノクローナル抗体重鎖および軽鎖配列は、相同性についての抗体データベースに対して整列させ、次にヒト化抗体モデルを確立した。モデルに応じて、最適なヒト化c-Metモノクローナル抗体を、復帰変異に従って、本発明の好ましい分子として選択した。得られたマウス候補分子と類似した相同性を示す結晶構造を、マウスFab結晶構造モデル(例えば、PDBデータベース)の公開データベースから選択し、また高解像度（例えば2.5 Å未満）を有するFab結晶構造を選択し、マウスFabモデルを確立した。本発明のマウス抗体重鎖および軽鎖配列をモデルの配列に対して整列させ、一貫した配列が維持され、次に本発明のマウス抗体の構造モデルを得ることができた。一貫性のないアミノ酸は、復帰変異の可能性がある部位であり得る。Swiss-pdbビューアソフトウェアを使用して、マウス抗体構造モデルを実行し、エネルギーを最適化した（最小化）。復帰変異を、モデルのCDR以外の異なるアミノ酸部位で行い、得られたヒト化抗体をヒト化する前のものに対して整列させ、活性を検出した。良好な活性を有するヒト化抗体が維持された。次に、グリコシル化、脱アミノ化、酸化部位など回避することを含めて、CDR領域をさらに最適化した。最適化されたヒト化抗c-Met抗体のCDR領域を表４に示す。
ヒト化重鎖および軽鎖配列の可変領域を以下に示す。
１．重鎖可変領域
２．軽鎖可変領域
ヒト化重鎖および軽鎖配列は、IgG Fc領域とともに組み換えて、本発明のヒト化抗c-Metモノクローナル抗体を得る。用いたFc配列は、以下の配列から任意に選んだ。
重鎖定常領域：
軽鎖定常領域：
上記の抗体を、それぞれ遺伝子クローニングおよび組換え発現によりクローニングし、発現させ、精製した。
最高の活性を保持するヒト化抗体Ab-9、Ab-10およびAb-11は、最終的にELISA（実施例２）およびインビトロ結合活性アッセイ（実施例７）により選択した。配列を以下に示す。
Ab‐9ヒト化抗体：
重鎖：
軽鎖：

Ab‐10ヒト化抗体：
重鎖：
軽鎖：
Ab-11ヒト化抗体：
重鎖：
軽鎖：
〔抗c-Metヒト化抗体のインビトロ結合活性の測定〕
本発明のヒト化抗体を、インビトロ活性についてELISA（実施例２）により測定した。また、c-Metを過剰発現している細胞株MKN45との結合、およびc-Met抗原に対する親和性（ビアコア測定）についても測定した。結果を表５および表６に示す。
FACS法を用いて、c-Metヒト化抗体とc-Metを過剰発現している細胞株MKN45との結合活性を測定した。
MKN45細胞（JCRB、カタログ番号JCRB0254）を、10％（v/v）ウシ胎仔血清（FBS、GIBCO、カタログ番号10099-141）およびペニシリン／ストレプトマイシン溶液（GIBCO、カタログ番号15070-063）を含むRPMI1640培養液（GIBCO、カタログ番号11835-030）に再懸濁し、10000,000細胞／mLとした。2 mLの再懸濁したMKN45細胞を、150,000細胞／ウェルで96ウェルマイクロタイタープレート（Corning、カタログ番号3799）に加えた。8濃度のc-Met抗体（20 μg/mLから開始する5倍勾配希釈）を対応するウェルに加え、最終容量を100 μLとし、プレートを4℃で1時間インキュベートした。FACS緩衝液（2.5％（v/v）FBS（Hyclone、カタログ番号SH30256.01B））を添加した。これを4℃、1300 rpmで4分間遠心分離した後、上清を捨てた。この手順は3回繰り返した。100 μLの二次抗体（1：200希釈した蛍光標識ヤギ抗マウス二次抗体、Biolegend、カタログ番号405307；1：30した蛍光標識抗ヒト二次抗体、Biolegend、カタログ番号409304）を各ウェルに添加し、プレートを4℃で1時間インキュベートした。FACS緩衝液を添加し、4℃、1300 rpmで4分間遠心分離した後、上清を捨てた。この手順は3回繰り返した。200 μLのFACS緩衝液を再懸濁した細胞に加えてサンプルを調製し、フローサイトメトリー（BD FACS Array）により測定した。
c-Met抗原Sema-Hisに対するc-Met抗体の親和性は、本発明においては表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。
抗マウスIgG抗体（GE Life Sciences、カタログ番号BR-1008-38）または抗ヒトIgG抗体（GE Life Sciences、カタログ番号BR-1008-39）は、酢酸ナトリウム溶液pH5.0（GE Healthcare、カタログ番号BR-1003-51）により、それぞれ30 μg/mLおよび50 μg/mLに希釈した。アミノカップリングキット（GE Life Sciences、カタログ番号BR100050）をCM5チップ（GE Life Sciences、カタログ番号BR-1000-12）の試験チャンネルおよび対照チャンネル上に固定化し、カップリングレベルを15000RUで設定した。ランニング緩衝液PBS（Hyclone、カタログ番号SH30256.01B）＋0.05％P20（GE Life Sciences、カタログ番号BR-1000-54）を用いて、c-Met抗体を1.5 μg/mLに希釈した。抗原Sema-Hisをランニング緩衝液で200 nMに希釈した後、同じ緩衝液で0.78 nMになるまで1：2希釈で希釈した。希釈した抗体は、30 μL/mLの速度で1分間試験チャンネルを通過し、抗原は、同じ速度で3分間試験チャンネルおよび対照チャンネルを通過した。10分間の解離後、流速を10 μL／分に調節し、再生緩衝液を3分間試験チャンネルおよび対照チャンネルに通過させた。データは、二重演繹後、BiaEvaluation 4.1によりフィットさせた。フィッティングモデルは1：1ラングミュアモデルである。
上記の結果はヒト化抗体と抗原との結合活性が0.13〜8 nM以内であることを示す。結果は、用いた測定方法に依存して変化し得る。結果は、ヒト化抗c-Met抗体が、ヒト化前の親抗体の結合活性を維持することを示す。
〔抗c-Metヒト化抗体のインビトロ機能と細胞活性評価〕
本発明の抗体の機能を測定するため、c-Metリガンド（肝細胞増殖因子、HGF）とc-Metとの間の結合を阻害する試験、および細胞増殖の阻害試験（実施例４）を、実施例７の抗体を評価するために実施した。
HGFとc-Metとの結合は、c-Met分子のチロシンリン酸化およびc-Metシグナル伝達経路の活性化をもたらす。HGFと受容体c-Metタンパク質との結合を阻害する（すなわち、IC50）際の、本発明の抗c-Met抗体の活性を、ELISAによって測定する。
c-Met ECD-mFc（実施例１）をPBS（Hyclone、カタログ番号SH30256.01B）で希釈し、終濃度2 μg/mLとした後、96ウェルELISAプレート（Costar、カタログ番号2592）を、c-Met ECD-mFcにより室温で一晩コートした。プレートは、プレート洗浄機（供給者：BioTex、Model：ELX405、S/N：251504）上で、PBST（PBS＋0.05％ツイーン20、Simga、カタログ番号P1379）により3回洗浄し、300 μLのブロッキング溶液PBS＋1％BSA（Roche、カタログ番号738328）を96ウェルプレートに添加し、プレートは37℃で60分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した後、ブロック溶液で希釈した抗体50 μLを96ウェルプレートに添加し、プレートは37℃で90分間インキュベートした。ブロック溶液で終濃度20 ng/mLに希釈したヒトHGF（Sino Biological、カタログ番号10463-HNAS）50μlを、c-Met抗体を含む96ウェルプレートに添加し、プレートを室温で120分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した後、ブロッキング溶液で終濃度100 ng/mLに希釈したビオチン標識抗HGF抗体（R&D、カタログ番号BAF294）100 μLを96ウェルプレートに添加し、90分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した後、ブロック溶液で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ebioscience、カタログ番号18-4100-51）100 μLを96ウェルプレートに添加し、30分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した後、100 μLの基質(ebioscience、カタログ番号00-4201-56)をプレートに添加し、室温で10分間インキュベートした。100 μLの停止液（2N H2SO4）を添加し、データは450 nmでマイクロプレートリーダー（供給者：Moleculer Devices、モデルMNR0643；Equip ID：TMRP001）により読み取った。データ分析は、SoftMax Pro v5によって行った。結果を表7に示す。
上記の結果は、本発明のヒト化抗体が抗原との結合活性を保持するだけでなく、抗原とリガンドとの間の結合も阻害することを示す。それはまた、がん細胞の成長活性の阻害を示す。
〔抗c-Metヒト化抗体のアゴニスト活性評価〕
抗c-Met抗体はHGF/c-Met結合を阻害し、c-Metシグナルを活性化する可能性がある。これは、c-Met抗体がアゴニスト活性を有することを意味する。 抗c-Metのアゴニスト活性は、本発明においては望ましくない。
本発明の抗体がアゴニスト活性を有するかどうかを検出するため、c-Metリン酸化、転移性ヒト透明腎細胞がん（caki-1）の増殖、およびヒト肺がんH441細胞遊走を含む3つの実験を行い、測定と評価を行った。
HGFのc-Metへの結合は、c-Met分子およびc-Metシグナル伝達経路のチロシンリン酸化を活性化する。したがって、HGFによるc-Metの活性化をアゴニスト試験の陽性対照として用い、ヒト肺がん細胞株A459を使用してc-Metチロシン残基1349のリン酸化誘導を評価した。
A549細胞を、ハムF12K、2 mMグルタミン（Invitrogen、カタログ番号21127-022）および10％（v/v）FBS（GIBCO、カタログ番号10099141）を含む溶液中に懸濁させた。0.2 mLの細胞懸濁液を採取し、96ウェルプレート（Corning、カタログ番号3599）に添加した。細胞濃度は60000細胞／ウェルであった。このプレートを5％CO2、37℃で24時間インキュベートした。24時間後、96ウェルプレート中の培養液を捨て、100 μLの低血清培養液（ハムF12K＋2 mMグルタミン＋0.5％FBS）を加えた。 細胞は、5％CO2、37℃で6時間飢餓下に置いた。抗体を、上記の低血清培養液を用いて終濃度20 μg/mLまで希釈した。陽性対照におけるHGF濃度は200 ng/mLであり、37℃で15分間インキュベートした。培養液を捨てた後、50 μLの細胞溶解液（10 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA）、50 nM NaF、1％（v/v）トリトンX100、プロテアーゼ阻害剤（Roche、カタログ番号05892791001）、ホスファターゼ阻害剤カクテルII（Sigm、カタログ番号P5726）およびホスファターゼ阻害剤カクテルIII（Sigma、カタログ番号P0044）をプレートに添加した。 細胞を溶解後、c-Metチロシンリン酸化をELISAにより測定した。c-Met捕獲抗体（CST、カタログ番号3148s）を、PBSで1：1000に希釈し、次に96ウェルELISAプレート（costar、カタログ番号9018）にウェル当たり100 μLで添加した。プレートは4℃で一晩インキュベートした。プレートをTBS-Tで3回洗浄し、300 μLのブロッキング溶液（TBS-T＋2％（w/v）BSA）を添加し、プレートを1時間インキュベートした。プレートをTBS-Tで3回洗浄した。75 μLの細胞ブロッキング溶液および25 μLの細胞溶解液を加え、プレートを4℃で一晩インキュベートした。このプレートをTBS-Tで3回洗浄し、pY1349 c-Met抗体（cell signal、カタログ番号3133）をブロッキング溶液で1：1000希釈して、ウェル当たり100 μLを添加した。 室温で2時間インキュベートした後、プレートをTBS-Tで4回洗浄した。HRP標識ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（cell signaling、カタログ番号7074）をブロッキング溶液により1：12000希釈し、ウェル当たり100 μLを添加して室温で1時間インキュベートした。プレートをTBS-Tで5回洗浄し、100 μL のTMB（ebioscience、カタログ番号TMB, 004201）を各ウェルに添加し、次に100 μL の停止液（2N H2SO4）を添加した。データは、450 nmでマイクロプレートリーダー（供給者：Moleculer Devices、Model：MNR0643；Equip ID：TMRP001）により読み取った。データ分析は、SoftMax Pro v5によって行った。結果を表８に示す。
Caki-1細胞は肝細胞増殖因子受容体c-Metを発現し、HGFはc-Metを結合してCaki-1細胞増殖を刺激することができる。したがって、本発明のヒト化抗c-Met抗体とHGFの両方がCaki-1細胞を刺激するので、抗c-Met抗体のアゴニスト活性を評価することができた。
Caki-1細胞（上海中国科学院、TCHu135、P12）を、96ウェル培養プレート（costar、カタログ番号3799）に1000個／ウェルで添加した。培養液はマッコイ5A（invitrogen、カタログ番号16600）＋10％FBS（GIBCO、10099141）であり、条件は37℃で24時間であった。その後、細胞を24時間飢餓させた（細胞飢餓のための培養液は、マッコイ5Aおよび0.5％FBSである。）。飢餓させた後、希釈勾配をつけた抗c-Met抗体（最高濃度は20 μg/mLである。）および陽性対照で5日間処理し、細胞増殖を細胞増殖アッセイキット（CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイ、Promega、G7573）により測定した。プレートは、プレートリーダー（製造者：PerkinElmer、装置番号：TREA001-RDA-IBA100）により読み取った。細胞の増殖百分率を算出した：増殖％ = 試験群の細胞から得られた読み取り値／未処理の細胞から得られた読み取り値×100。結果は、この抗体がCaki-1細胞の増殖に影響を及ぼさないことを示す。データは表8に示す。
抗c-Met抗体がアゴニスト活性を有する場合、細胞の遊走能は影響を受ける可能性がある。本発明では、c-Metを発現するH441細胞株を用いて、c-Met抗体が細胞遊走に影響を及ぼす能力を評価する。
H441細胞（ATCC、カタログ番号HTB-174）を、10％（v/v）FBS（GIBCO、カタログ番号10099-141）およびペニシリン‐ストレプトマイシン（GIBCO、カタログ番号15070-063）を含むRPMI1640培養液（GIBCO、カタログ番号11835-030）に再懸濁し、500,000細胞／mLとした。再懸濁したH441細胞を、1 mL／ウェルで12ウェル培養プレート（Costar、カタログ番号3513）に加え、５％CO2、37℃で3日間培養した。細胞をPBSで2回洗浄し、0.5％FBSを含むRPMI1640培養液に加えて、５％CO2、37℃で16時間培養した。各ウェルの底部を5 mLのチップで引っ掻き、低濃度FBSを含む培養液でプレートを1回洗浄し、次いで、低濃度血清を含む1 mLのRPMI1640培養液を加えた。倒立顕微鏡下でプレートにマーキングし、無作為に選択された引っ掻き領域について、4×倍率で写真を撮影した。この時間を出発点とした。細胞を、10 μg/mlのc-Met抗体またはHGF対照（200 ng/mL）で、5％CO2、37℃で16時間処理した。その後、マーキングされた引っ掻き領域を倒立顕微鏡下で4倍の倍率で撮影し、この時間を遊走後の時間とした。細胞遊走の割合は、出発点に対する移動距離を、出発点に対する試験群の移動距離で割ったものとして測定し、次いで100を乗じる。結果を表８に示す。
*：抗体濃度は20 μg/mLであり、HGF（200 ng/mL）によるc-Metリン酸化の活性化を100％として設定した。
#：抗体濃度は20 μg/mLであり、HGF（200 ng/mL）により影響を受けたH441遊走％を100％として設定した。
上記の結果から、ヒト化抗体は、低い（c-Metリン酸化、H441遊走実験結果）またはアゴニスト活性を示さない（Caki-1増殖の刺激は、20 μg/mLの抗体では観察されなかった）。
〔抗c-Met抗体のインビボ薬理学的評価〕
抗体の抗腫瘍活性を評価するために、BALB/cヌードマウスにおける皮下異種移植片により得られたヒト胃がんMKN45細胞モデルを測定に用いた。
MKN45細胞をRPMI-1640培養液（10％FBS）で単層培養し、培養環境を5％CO2で37℃とした。 対数相中に細胞を数え、集めた。細胞をPBSで適切な濃度に再懸濁し、3×106細胞の0.1 mLをマウス（雌性BALB/cヌードマウス、10週齢、22〜28 g、上海SLAC実験動物、ライセンス番号2007000548777、環境：SPFグレード）右翼皮下に接種した。腫瘍の平均体積が114 mm3に達したとき、体重を計量し、腫瘍の体積を測定し、次いでマウスを群分けし、投与した。対照群はPBSで処理し、抗体治療群は本発明の抗体5 mg/kgで処理し、これらの頻度は週に1回、時間当たり2回であった。腫瘍の体積および重量を週に2回測定し、25日目に実験を終了した。腫瘍サイズの計算式：腫瘍容積（mm3）= 0.5×（腫瘍長径×腫瘍短径2）。阻害率の計算式：阻害率 = (V0-VT)／V0×100％、V0およびVTは、それぞれ実験の開始時および終了時の腫瘍の体積である。
結果は、抗体Ab-9およびAb-10の阻害率が、それぞれ56％および64％であることを示す。 実験中でのマウスの重量に明らかな変化はなかった（22〜24 g）。この結果は、ヒト化抗c-Met抗体が、インビボin vivoで腫瘍の成長を阻害できることを示す。
〔抗c-Met抗体のエンドサイトーシス〕
本発明の抗体は、ヒトc-Metに結合することができ、非常に良好なインビトロ活性を有し、インビボで腫瘍活動を阻害する。加えてこの抗体は、アゴニスト活性を有さないか、またはアゴニスト活性があっても非常に弱い。この抗体が、ヒトc-Metに結合すると、ヒトc-Metと共に細胞内に取り込まれるかどうかを検出するために、c-Metを発現するヒト胃がん細胞MKN45（JCRB、カタログ番号JCRB0254）を評価に用いた。
MKN45細胞を、10％（v/v）FBS（GIBCO、カタログ番号10099-141）およびペニシリン-ストレプトマイシン（GIBCO、カタログ番号15070-063）を含むRPMI1640培養液（GIBCO、カタログ番号11835-030）で10000,000細胞／mLになるよう再懸濁した。2 mLの再懸濁されたMKN45細胞を、250,000細胞／ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートに加え、10 μg/mLのc-Met抗体を対応するウェルに加え、最終容量を100 μLとし、プレートを4℃で1時間インキュベートした。FACS緩衝液（2.5％ウシ胎仔血清；Hyclone、カタログ番号SH30256.01Bを含むリン酸塩緩衝液）を加え、4℃、1300 rpmで4分間遠心分離し、上清を捨てた。この手順を3回繰り返した。100 μLの二次抗体溶液（蛍光標識ヤギ抗マウス二次抗体、1：200希釈、Biolegend、カタログ番号405307；蛍光標識抗ヒト二次抗体、1：30希釈、Biolegend、カタログ番号409304）を各ウェルに添加した。プレートは4℃で1時間インキュベートした。FACS緩衝液を加え、4℃、1300 rpmで4分間遠心分離し、上清を捨てた。この手順を3回繰り返した。完全な細胞培養液（10％FBSを含むRPMI1640培養液）を添加し、37℃、5％CO2で0、0.5、1、2および4時間インキュベートした。5 μLの7-AAD（Biolegend、カタログ番号420403）を各ウェルのFACS緩衝液100 μLに添加し、4℃で30分間インキュベートした。FACS緩衝液を加え、4℃、1300 rpmで4分間遠心分離し、上清を捨てた。この手順を3回繰り返した。200 μLのストリッピング緩衝液（0.05Mグリシン、pH3.0； 0.1M NaCl、1：1（v/v）で混合）を各ウェルに加えた。細胞は再懸濁し、室温で7分間インキュベートした。細胞を室温で1300 rpm、4分間遠心分離し、上清を捨てた。200 μLの中和洗浄緩衝液（0.15Mトリヒドロキシメチルアミノメタン、pH7.4）を各ウェルに添加し、細胞を再懸濁して、室温で1300 rpm、4分間遠心分離し、上清を捨てた。200 μLのFACS緩衝液を添加し、細胞を再懸濁させた。サンプルを調製し、フローサイトメトリー（BD FACS Calibur）により検出した。結果を表9に示す。
c-Met抗体のエンドサイトーシス％ = （種々の時間ポイントでの蛍光強度−時間0での平均蛍光強度）／時間0での平均蛍光強度
*対照群：実験誤差は−4.9％〜3.6％であり、エンドサイトーシスはないと見なされる。
表９は、本発明の抗体が、アゴニスト活性を示すことなく良好なエンドサイトーシス作用を有することを示す。標的細胞に結合すれば、抗体および受容体の両方が、迅速に標的細胞に取り込まれ、２〜4時間以内に最大値に達した。
〔抗c-Met抗体の生物物理学的安定性の解析〕
グリコシル化および脱アモノ化ならびに安定性のような、本発明の抗体の生物物理学的安定性を評価するため、LC-MS解析を用いて抗c-Met抗体を評価した。
グリコシル化の分析のために、重鎖および軽鎖の分子量をLC-MSにより測定した。脱アミノ化は、LC-MSにより、４℃で長期間（少なくとも3ヵ月）または40℃で21日間の加速条件下で分析した。種々の条件下で処理したサンプルを採取し、pH7.2 Tris-HClで2 mg/mLに希釈し、10 mM TCEPおよび6 M尿素（AMRESCO、カタログ番号0378）3に添加し、次にサンプルを7℃で20分間インキュベートした。終濃度20 mMのIAA（Sigma-Aldrich、カタログ番号I1149）を添加し、スルフヒドリル基を保護するため暗所で15分間インキュベートしてした。pHをpH7.2 Tris-HClにより調節し、プロテアーゼ（Sigma-Aldrich、カタログ番号T6567）を10：1（タンパク質：酵素）の重量比で添加した。サンプルを37℃で25分間インキュベートした後、終濃度0.1％のギ酸（Fluca、カタログ番号94318）を加えて反応を終了させた。サンプルを遠心分離し、LC-MSにより分析した。脱アミノ化の存在は、BiopharmaLynxを用いて分析した。抽出イオンクロマトグラム（EIC）図は、脱アミノ化部位および修飾産物を含む天然ペプチドを検索した後、親イオンを抽出することによって、LC-MSデータから得た。積分によりピーク面積を求め、脱アミノ化剥離および酸化の割合を算出した。結果を表10に示す。
*：重鎖はすべてグリコシル化を含み、分子量は予想通りであった。
#：脱アミノ化分子の割合（％）。0.66〜1.0％は検出背景内にある。
上記の結果は、本発明の抗体が安定であり、良好な物理的特性を有することを示す。
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素MC-MMAF〕
本発明の抗c-Met抗体は、アゴニスト活性なしに受容体結合の阻害活性を有し、標的細胞におけるエンドサイトーシス活性および物理的安定性を示す。これらの特性は、本発明の抗体を、c-Metを発現したがんの治療のために毒素と結合させた場合、ADC薬の製造に特に適したものにする。結合過程を以下に示す。
（手順１）
チオ酢酸S-(3カルボニルプロピル)エステル（0.7 mg、5.3 μmol）を、0.9 mLアセトニトリル溶液に溶解した。上記で調製したチオ酢酸S-(3カルボニルプロピル)エステルのアセトニトリル溶液を、Ab-10モノクローナル抗体を含む酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液pH4.3（10.35 mg/mL、9.0 mL、0.97 mmol）に添加し、1.0 mLの水素化ホウ素ナトリウム水溶液（14.1 mg、224 μmol）を、25℃で2時間振り混ぜながら加えた。反応終了時に、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）により脱塩および精製を行い、生成物1b溶液を回収し、次の反応のために直接10 mg/mLに濃縮した。
（手順２）
0.35 mLの2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液を、25℃で30分間振り混ぜながら、11.0 mLの1b溶液に添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行い、標記生成物Ab-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液を回収した（6.17 mg/mL、14.7 mL）。
（手順３）
MC-MMAF（1.1 mg、1.2 μmol；PCT特許WO2005081711に掲載された方法により調製された。）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-1のPBS緩衝液溶液（3.7 mg/mL、4.7 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.2 (MAb＋0D)、149278.1 (MAb＋1D)、150308.1 (MAb＋2D)、151314.1 (MAb＋3D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.7である。
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素MC-VC-PAB-MMAE〕
MC-VC-PAB-MMAE（1.6 mg、1.2 μmol；PCT特許WO2004010957に開示された方法により調製された。）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-2のPBS緩衝液溶液（3.6 mg/mL、4.8 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148118.4 (MAb＋0D)、149509.2 (MAb＋1D)、150903.1 (MAb＋2D)、152290.4 (MAb＋3D)、153680.7 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.8である。
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素MC-VC-PAB-MMAF〕
MC-VC-PAB- MMAF（1.6 mg、1.2 μmol；PCT特許WO2005081711に開示された方法により調製された。）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-3のPBS緩衝液溶液（3.5 mg/mL、4.9 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.1 (MAb＋0D)、149525.3 (MAb＋1D)、150930.7 (MAb＋2D)、152335.2 (MAb＋3D)、153739.8 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.6である。
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素MC-MMAE〕
MC-MMAE（1.2 mg、1.2 μmol；特許出願US7/750/116B1に開示された方法により調製された。）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-4のPBS緩衝液溶液（3.4 mg/mL、5.0 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：48118.6 (MAb＋0D)、149104.3 (MAb＋1D)、150090.1 (MAb＋2D)、151075.8 (MAb＋3D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.6である。
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素MC-MMAE〕
（手順１）
チオ酢酸S-(3カルボニルプロピル)エステル（0.7 mg、5.3 μmol）を、0.9 mLアセトニトリル溶液に溶解した。上記で調製したチオ酢酸S-(3カルボニルプロピル)エステルのアセトニトリル溶液を、Ab-9モノクローナル抗体を含む酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液pH4.3（10.85 mg/mL、9.0 mL、0.976 mmol）に添加し、1.0 mLの水素化ホウ素ナトリウム水溶液（14.1 mg、224 μmol）を、25℃で2時間振り混ぜながら加えた。反応終了時に、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）により脱塩および精製を行い、生成物5b溶液を回収し、次の反応のために直接10 mg/mLに濃縮した。
（手順２）
0.35 mLの2.0 M塩酸ヒドロキシルアミン溶液を、25℃で30分間振り混ぜながら、11.0 mLの5b溶液に添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行い、標記生成物Ab-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液を回収した（6.2 mg/mL、15.0 mL）。
（手順３）
MC-MMAE（1.1 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.2 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-5のPBS緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150530.9 (MAb＋0D)、151915.7 (MAb＋1D)、153333.6 (MAb＋2D)、154763.4 (MAb＋3D)、156271.9 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.5である。
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素MC-MMAF〕
MC-MMAF（1.1 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.17 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-6のPBS緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150537.8 (MAb＋0D)、152087.9 (MAb＋1D)、153486.5 (MAb＋2D)、154911.7 (MAb＋3D)、156499.9 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.7である。
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素MC-VC-PAB-MMAF〕
MC-VC-PAB-MMAF（1.6 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.2 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-7のPBS緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150537.8 (MAb＋0D)、152087.9 (MAb＋1D)、153486.5 (MAb＋2D)、154911.7 (MAb＋3D)、156499.9 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.8である。
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素MC-VC-PAB-MMAE〕
MC-VC-PAB-MMAE（1.6 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.2 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-8のPBS緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150508.6 (MAb＋0D)、151903.6 (MAb＋1D)、153314.5 (MAb＋2D)、154747.8 (MAb＋3D)、156039.5 (MAb＋4D)。毒素：抗体比率（DAR）は解析により算出し、平均値はy = 1.6である。
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素SMCC-DM1〕
（手順１）
SMCC（サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル；1.65 mg、4.94 μmol、Shanghai Hanhong Biochemical Companyから購入、バッチ番号BH-4857-111203）を0.9 mLアセトニトリル溶液に溶解した。上記で調製したSMCCのアセトニトリル溶液を、Ab-10モノクローナル抗体を含むpH 6.5 PBS緩衝液（10.15 mg/mL、9.0 mL、0.62 mmol）に、25℃で2時間振り混ぜながら添加した。反応後、脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）により行った。生成物9b溶液を回収し、次の反応のために10 mg/mL（8.3mg/mL、11 mL）に濃縮した。
（手順２）
3.0 mgのL-DM1のエタノール溶液（3.0 mg L-DM1／1.1 mgエタノール）（Journal of Medicinal Chemistry. 2006, 49, 4392-4408に掲載された既知の方法により調製された。）を、25℃で4時間振り混ぜながら、9b溶液（11 mL）に添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。生成物ADC-9溶液を回収し（6.3 mg/mL、14.0 mL）、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.6 (MAb＋0D)、149078.1 (MAb＋1D)、149836.4 (MAb＋2D)、150593.7 (MAb＋3D)、151552.5 (MAb＋4D)。
平均値はy = 2.3である。
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素SMCC-DM1〕
（手順１）
SMCC（サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル；1.65 mg、4.94 μmol）を0.9 mLアセトニトリル溶液に溶解した。上記で調製したSMCCのアセトニトリル溶液を、Ab-9モノクローナル抗体を含むpH 6.5 PBS緩衝液（10.15 mg/mL、9.0 mL、0.62 mmol）に、25℃で2時間振り混ぜながら添加した。反応後、脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH6.5）により行った。生成物10b溶液を回収し、次の反応のために10 mg/mL（8.3mg/mL、11 mL）に濃縮した。
（手順２）
3.0 mgのL-DM1のエタノール溶液（3.0 mg L-DM1／1.1 mgエタノール）を、25℃で4時間振り混ぜながら、9b溶液（11.0 mL）に添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。生成物ADC-10溶液を回収し（6.3 mg/mL、14.0 mL）、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150534.2 (MAb＋0D)、151492.6 (MAb＋1D)、152451.7 (MAb＋2D)、153409.7 (MAb＋3D)、154368.1 (MAb＋4D)。
平均値はy = 2.2である。
〔抗c-Met抗体Ab-9結合毒素SN-38〕
MC-VC-PAB-SN-38（1.3 mg、1.2 μmol）を、0.3 mLのアセトニトリルに溶解し、25℃で4時間振り混ぜながら、3.0 mLのAb-9モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン5c溶液（6.2 mg/mL）に添加した。次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-11のPBS緩衝液溶液（3.7 mg/mL、4.5 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150537.1 (MAb＋0D)、151786.6 (MAb＋1D)、152948.6 (MAb＋2D)、154161.7 (MAb＋3D)、155365.9 (MAb＋4D)、156477.8 (MAb＋5D)。
平均値はy = 2.6である。
〔抗c-Met抗体Ab-10結合毒素〕
１．毒素の調製
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブチルアミド) ブチルアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2- アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸
（手順１）
(S)-tert-ブチル-2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸
(S)-2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸12a（400 mg、2.18 mmol、「Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354(17), 3327〜3332」に記載された既知の方法に従って調製された。）を、tert-酢酸ブチル10 mLに溶解した。過塩素酸（300 mg（70％）、3.3 mmol）を加え、室温で16時間撹拌した。反応後、6 mLの水を添加し、溶液を分離した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（5 mL）で洗浄した。水相を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えてpH 8に調整した後、ジクロロメタン（5 mL×3）で抽出し、有機相を合わせた。次に、この反応混合物を水（3 mL）および飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL）で連続的に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液は減圧下で濃縮した。粗生成物(S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル) プロパン酸12bを得た（390 mg、黄色、油状）。これは精製せずに直ちに次の反応に供した。
（手順２）
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(t-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1- カルボニルプロピル-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-カルボニルプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸
(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオン酸12e（100 mg、0.334 mmol）を、ジクロロメタンとジメチルホルムアミドとの混液（v/v = 5：1）6 mLに溶解した。次に、粗生成物(S)-tert-ブチル2- アミノ-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸12b（80 mg、0.334 mmol）を加え、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.29 mL、1.67 mmol）およびヘキサフルオロリン酸2-(7-アザベンゾトリアゾール)-N, N, N’, N’ -テトラメチルウロニウム（152.3 mg、0.40 mmol）をその混合物に添加した。この混合物をアルゴン雰囲気下、室温で1時間撹拌した。反応後、10 mLの水を加え、撹拌した。ジクロロメタンの層を飽和塩化ナトリウム溶液（10 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、溶出剤系Bを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標記生成物(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(t-ブトキシ)-3-(2-フルオロフェニル)-1- カルボニルプロピル-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-カルボニルプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸12c（173 mg、清澄液）を得た。収率は99.5％である。
MS m/z (ESI)：521.2 [M+1]
（手順３）
(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S),-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸
(1S,3S,5S)-tert-ブチル-((1R, 2R)-3-(((S)-1-(t-ブトキシ)-3(2-フルオロフェニル)-1-カルボニルプロピル-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-カルボニルプロピル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸12c（173 mg、0.33 mmol）を2 mLのジオキサンに溶解し、5.6 M塩化水素ジオキサン溶液（0.21 mL、1.16 mmol）を加えた。この混合液をアルゴン雰囲気下、室温で1時間撹拌し、0℃冷蔵庫に12時間入れた。反応後、反応混合物を減圧下で濃縮し、5 mLのジクロロメタンを加えて反応混合液を希釈した。10 mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、混合物を10分間撹拌した。生成物を分離し、水相をジクロロメタン（5 mL×3）により抽出した。ジクロロメタン層を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（10 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,2S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3 -イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸12d（77 mg、黄色液体）を得た。これは精製せずに直ちに次の反応に供した。
MS m/z (ESI)：421.2 [M+1]
（手順４）
(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリカルボニル-2-オキソ-4,7,10-トリアザテトラデシル-14-アシル)-2-アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸
(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,2S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン- 3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸12d（77 mg、0.183 mmol）および(5S,8S,11S,12R)-11-((S)- sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)- 5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリカルボニル-2-オキソ-4,7,10-トリアザテトラデシル-14-カルボン酸12i（116.8 mg、0.183 mmol、特許出願WO2013072813に公開された方法により調製された。）を、ジクロロメタンとジメチルホルムアミドとの混液（v/v = 5：1）6 mLに溶解した。N,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.16 mL、0.915 mmol）およびヘキサフルオロリン酸2-(7-アザベンゾトリアゾール)-N, N, N’, N’ -テトラメチルウロニウム（84 mg、0.22 mmol）をその混合物に添加した。この混合物をアルゴン雰囲気下、室温で1時間撹拌した。反応後、10 mLの水を加え、撹拌した。ジクロロメタンの層を飽和塩化ナトリウム溶液（10 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、溶出剤系Bを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標記生成物(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリカルボニル-2-オキソ-4,7,10-トリアザテトラデシル-14-アシル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸12e（190.5 mg、黄色粘性液）を、収率100％で得た。
MS m/z (ESI)：1040.6 [M+1]
（手順５）
(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸
(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリカルボニル-2-オキソ-4,7,10-トリアザテトラデシル-14-アシル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸12e (190.5 mg、0.183 mmol)を1.5 mLのジクロロメタンに溶解し、2 mLのジエチルアミンを加えた。この混合物をアルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。反応後、反応混合物を減圧下で濃縮し、標記粗生成物(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸12f（150 mg、黄色粘性物）を得た。生成物は精製せずに次の反応に直接供した。
MS m/z (ESI)：818.5 [M+1]
（手順６）
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メトキシプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸
粗生成物(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-
((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸12f（150 mg、0.183 mmol）を1 mLのジオキサンに溶解し、そこへ3 mLの5.6 M 塩化水素ジオキサンを加えた。この混合物をアルゴン雰囲気下、室温で12時間撹拌した。反応後、反応混合物を減圧下でエーテル溶媒とともに濃縮した。残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メトキシプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸12g（28 mg、白色粉末）を、収率20％で得た。
MS m/z (ESI)：762.7 [M+1]
２．毒素中間体の調製
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジカルボニル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メトキシプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸12g（25 mg、0.033 mmol）を3 mLのジクロロメタンに溶解し、そこへN,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.029 mL、0.164 mmol）を加えた。反応系はアルゴン雰囲気下に置き、6-(2,5-ジカルボニル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロライド4b（11.3 mg、0.049 mmol）のジクロロメタン溶液を、氷浴中で混合物に滴下し、反応を室温で3時間行った。反応後、5 mLの水を添加し、混合物は20分間撹拌した。混合物は層が形成されるまで静置し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製し、標記生成物(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジカルボニル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸を得た。収率は22.4％である。
MS m/z (ESI)：955.4 [M+1]
３．抗体−毒素複合体の調製
化合物12h（1.2 mg、1.2 μmol）を0.3 mLのアセトニトリルに溶解した。Ab-10モノクローナル抗体−プロピルメルカプタン1c溶液（6.17 mg/mL）を25℃で4時間振り混ぜながら添加し、次いで脱塩および精製を、セファデックスG25ゲルカラム（溶出相：0.05 M PBS溶液、pH 6.5）で行った。標記生成物ADC-12のPBS緩衝液溶液（3.3 mg/mL、5.0 mL）は、無菌条件下で0.2 μmフィルターを通した濾過によって得られ、4℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.6 (MAb＋0D)、149150.5 (MAb＋1D)、150221.1 (MAb＋2D)、151265.1 (MAb＋3D)、152314.3 (MAb＋4D)。
平均値：y = 1.6
抗c-Met抗体毒素複合体（ADC）分子試験例
試験例１
〔抗c-Met抗体毒素複合体（ADC）分子の安定性評価〕
本発明のADC分子またはエンドサイトーシス作用を有する他のc-Met抗体−毒素複合体（例えば、LY-2875358-ADC）の毒素中間体および毒素を、PBS、ヒトおよびサルの血漿中の遊離毒素の安定性について評価した。
実施例の化合物ADC-1およびADC-12の毒素中間体および毒素を、PBS、ヒトまたはサルの血漿（Suzhou Xishan Zhongke Pharmaceutical Research and Development有限公司、動物生産免許番号：SCXK (Su) 2012〜0009）で500 μg/mLに希釈し、サンプルを37℃で7日間インキュベートした。遊離毒素および毒素中間体の濃度は、第0、3および7日で測定した。20 μLの内部対照（カンプトテシン、Shanghai Ronghe Pharmaceutical Technology Development有限公司、バッチ番号090107、100 ng/mL）および150 μLのアセトニトリルを、薬物を含む50 μLのヒトもしくはサルの血漿またはPBSサンプルに添加し、サンプルを3分間振盪し、15000 rpmで10分間遠心分離した。80 μLの上清を採取し、80 μLの0.2％ギ酸と混合した後、10 μLのサンプルを注入用に取った。標準曲線法は以下のように行った：50 μLのブランクのヒト、サルまたはPBSサンプルを、それぞれ50 μLの希釈標準溶液に加えた；20 μLの内部対照（カンプトテシン、100 ng/mL）および100 μLのアセトニトリルを加え、サンプルを3分間振盪した後、15000 rpmで10分間遠心分離した；80 μLの上清を採取し、80 μLの0.2％ギ酸と混合した；10 μLのサンプルを注入用に取った。
Shimadzu LC-30AD超高速液体クロマトグラフィーシステム（島津）、UPLC-MS/MS質量分析計API4000三重四重極タンデム質量分析計（AB SCIEX）を、以下のクロマトグラフィー条件設定カラム：Waters XBridge（登録商標）BEH300 C18（100 mm×4.6 mm、内径3.5 mm）と共に使用した。移動相は0.2％ギ酸−アセトニトリル（勾配溶出）であった。結果を表１１および表１２に示した。
*：試験値は、サンプル中の遊離毒素の百分率である。0.01〜0.19％は、検知バックグラウンドの範囲内にある。ND：不検出、検出不可能
ND：不検出、検出不可能
上記の結果は、本発明のADC-1およびADC-12の毒素中間体および毒素が、種々の溶媒（PBS、ヒト血漿、サル血漿など）中で安定であることを示す。分解生成物、遊離毒素および毒素中間体（毒素リンカー）は、37℃で0日、3日および7日間インキュベーションした後で検出されなかった。
試験例２
〔抗c-Met抗体毒素複合体（ADC）のインビトロでの活性評価〕
本発明のADC-1およびADC-12のインビトロ活性を、FACS（c-Met陽性細胞との結合活性の検出）およびエンドサイトーシス（実施例１１を参照）によって評価した。結果を表１３に示す。
*：データを1時間でのエンドサイトーシス比率として表した。
上記の結果は、毒素と結合した本発明の抗体が、依然として抗体の結合活性およびエンドサイトーシス活性を維持することを示す。
試験例３
〔抗c-Met抗体毒素複合体（ADC）の細胞毒性試験〕
細胞に対する本発明のADC分子の毒性作用を評価するため、ATP毒性試験を行った。ATPは生細胞の代謝の指標であり、ATPの検出は、細胞に対する分子の毒性の影響を反映する。
HepG2細胞（中国科学院細胞バンク、カタログ番号TCHu72）を、10％FBSを含むEMEM完全培地で培養し、MKN45細胞を、10％FBSを含むRPMI1640完全培地で培養した。2〜3 mLのトリプシンを添加することにより2〜3分間消化を行い、消化が完了したときに、10〜15 mLの完全培地を加えて、消化した細胞を溶出した。細胞は、1000 rpmで3分間遠心分離した。上清を捨てた後、10〜20 mLの完全培地を加えて細胞を再懸濁させ、単一細胞懸濁液を得た。細胞密度は4×104細胞／mLに調節した。上記の細胞懸濁液0.1 mLを、96ウェル細胞培養プレートのそれぞれのウェルに添加し、5％CO2、37℃のインキュベーター中で培養した。24時間後、培養液を除去し、2％FBSを含むEMEM培養液または2％FBSを含むRPMI1640培養液90 μLを各ウェルに添加した。試験サンプル（実施例13の化合物および毒素）はPBSで希釈して異なる濃度勾配を作成し、そのサンプルの10 μLを各ウェルに添加した。プレートは、5％CO2、37℃のインキュベーター中で72時間培養した。検出は、CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイキット（Promega、カタログ番号G7571）の使用説明書に従って行った。化学発光はマイクロプレートリーダー（VICTOR 3、PerkinElmer）によって測定し、結果をGraphPad Prism（バージョン5.0）ソフトウェアによって分析した。結果を表１４に示した。
ND：活性は検出されなかった。NA：該当なし。
考察：上記の結果は、c-Met陽性細胞MKN45に対するADC-1およびADC-12の細胞毒性が同じであることを示す（IC50はそれぞれ0.51 nMおよび0.59 nM）。しかしながら、c-Met陽性細胞に対する各毒素部分の細胞毒性効果は異なり、これら2つのADCの間には93倍の相違（79.4／0.85）が存在する。
本発明のADC-1およびADC-12は、c-Met陰性HepG2細胞に対して細胞毒性作用を有さず、これはADC化合物が特定の標的効果を有することを示す。しかし、c-Met陰性HepG2細胞に対する各毒素部分の細胞毒性効果は異なり、これら2つのADCの間には82倍の相違（400.8／4.88）が存在する。(400.8/4.88)。
これらの結果は、ADC-1およびADC-12が特異的標的効果を有し、非特異的細胞（正常細胞）に毒性作用を及ぼすことなく、c-Met陽性細胞の増殖を阻害することができることを示す。ADC-1とADC-12との相違は、標的細胞に対するADC-1およびADC-12の遊離毒素の毒性と非標的細胞に対する毒性が異なることである。
c-Met陽性細胞およびc-Met陰性HepG2細胞に対するADC-12の毒素部分の細胞毒性は、ADC-1のそれよりそれぞれ93倍および82倍低い。したがって、分子が標的細胞に到達する場合、ADC-12の非特異的毒性作用は、遊離毒素が放出される場合、ADC-1のそれよりも弱い。そのため、毒性副作用が小さく、安全性に優れる。
試験例４
〔腫瘍細胞に対する抗c-Met抗体毒素複合体（ADC）分子の増殖抑制作用〕
これらの結果は、ADC-1（実施例13）がc-Metを発現する腫瘍標的細胞を特異的に死滅させることができることを示す。腫瘍細胞に対する毒性作用である増殖抑制作用を検出するため、本発明の分子を種々の腫瘍細胞について試験し、また細胞増殖に対するサンプルの抑制作用をCCK法により測定し、本発明のADC分子のインビトロ細胞活性をIC50値に従って評価した。
使用した細胞および対応する培養液を以下の表１５に示す。細胞増殖は、Cell Counting Kit（同人化学、カタログ番号CK04)を使用して）（使用説明書に従って）測定した。
2〜3 mLのトリプシンを添加することにより2〜3分間消化を行い、消化が完了したときに、10〜15 mLの完全培地を加えて、消化した細胞を溶出した。細胞は、1000 rpmで3分間遠心分離した。上清を捨てた後、10〜20 mLの完全培地を加えて細胞を再懸濁させ、単一細胞懸濁液を得た。細胞密度は4×104細胞／mLに調節した。上記の細胞懸濁液0.1 mLを、96ウェル細胞培養プレートのそれぞれのウェルに添加し、5％CO2、37℃のインキュベーター中で培養した。24時間後、培養液を除去し、2％FBSを含む培養液90 μLを各ウェルに添加した。試験サンプルはPBSで希釈して異なる濃度勾配を作成し、そのサンプルの10 μLを各ウェルに添加した。プレートは、5％CO2、37℃のインキュベーター中で72時間培養した。24時間後、培地を除去し、2%FBSを含む培地の90μlを各ウェルに添加し、試験試料を種々の濃度の勾配をPBSで希釈し、試料の10μlを各ウェルに添加し、該プレートを5%CO2、37℃で72時間培養器中で培養した。10 μLのCCK8をそれぞれのウェルに添加し、インキュベーター中で2時間インキュベートした。OD450をマイクロプレートリーダー（VICTOR3、PerkinElmer）で測定し、GraphPad Prism（version 5.0）ソフトウェアを用いて分析した。結果を表１６に示す。
表１６の結果は、本発明の抗c-Met抗体が、胃がん細胞株MKN45およびSUNに対して
比較的良好な活性を有することを示す。しかしながら、肺がん細胞のようなc-Met発現が低い、またはc-Met発現のない他の腫瘍細胞に関しては、活性は非常に弱いか、または活性がない。本発明のADC-1は、さらに毒素を有するため、胃がん細胞株MKN45およびSUNを含むc-Metを発現している腫瘍細胞にたいして、特に、c-Met抗体がまったく効果を示さない、または非常に弱い効果しかない肺がん、膵がんおよび腎細胞がんに対して優れた活性を有する。
試験例５
〔抗c-Met抗体毒素複合体（ADC）分子のインビボでの有効性の評価〕
１．試験目的
本発明のc-Met抗体およびADC分子の抗腫瘍効果をより良く評価するため、実施例１０の方法を用いて抗体Ab-10およびADC-1の並列比較実験を行った。実施例１０とは異なって、この試験は、単一用量の投与によって行った。この実験は、腫瘍抑制作用が回復傾向を示すまでに終了する。
２．試験対象抗体
Ab-10（5 mg/kg）、ストック溶液（2.18 mg/mL）をPBSで希釈して終濃度0.5mg/mLとした。
Ab-10（10 mg/kg）、ストック溶液（2.18 mg/mL）をPBSで希釈して終濃度1 mg/mLとした。
Ab-10（30 mg/kg）、ストック溶液（2.18 mg/mL）をPBSで希釈して終濃度3 mg/mLとした。
ADC-1（2.5 mg/kg）、ストック溶液（10 mg/mL）をPBSで希釈して終濃度0.25 mg/mLとした。
ADC-1（5 mg/kg）、ストック溶液（10 mg/mL）をPBSで希釈して終濃度0.5 mg/mLとした。
ADC-1（10 mg/kg）、ストック溶液（10 mg/mL）をPBSで希釈して終濃度1 mg/mLとした。
すべての動物に尾静脈注射により投与し、投与量は0.2 ml／マウスであった。
３．試験手順
ヌードマウスの右肋骨の皮下に、MKN-45細胞（1×106／マウス）を接種した。腫瘍の平均体積が（150.19＋8.44）mm3に達したとき、動物を異なる投与群に無作為に分け、各群8匹のマウスとした。具体的な投与計画を表１７に示す。
マウスの腫瘍体積および体重を週に2回測定し、データを記録した。
エクセル統計ソフトウェア：平均値はavgとして計算され；SDはSTDEVとして計算され；SEMはSTDEV/SQRTとして計算され；異なる群間のP値はTTESTとして計算される。
腫瘍体積（V）は、次のように計算される: V = 1/2×L長×L短 2
腫瘍抑制率（%）= （V0−VT）／V0＊100％
ここで、V0およびVTは、それぞれ、実験の開始時および実験の終了時における腫瘍体積を表す。
４．結果
**p<0.01 * p<0.05
結論：本発明の抗体およびADC化合物は、MKN-45異種移植腫瘍を有するヌードマウスに対して明確は効果を持つ。
本発明のADC-12のインビボ有効性を評価するため、ADC-1およびADC-12を同一の上記試験方法により同時に比較した。同一用量は3 mg/kgであり、単一用量の投与である。結果を表１８に示す。
上記結果は、ADC-1およびADC-12の腫瘍抑制率は、第11日では同等であるが、ADC-1の効果は15日後に低下した（第21日で27.1％）。一方、ADC-12の抗腫瘍効果は、第11日のレベルで維持された（50.4％）。
試験例６
〔ヒト肺がんNCI-H1993の皮下腫瘍異種移植片を有するヌードマウスに対するADC-12の作用〕
１．試験目的
ヒト肺がんNCI-H1993の皮下腫瘍異種移植片を有するヌードマウスに対するADC-12およびAb-10抗体溶液の有効性の評価と比較
２．薬物調製
ADC-12を注射水に溶かして20 mg/mLとし、分注し、−80℃の冷凍庫中で保管した。サンプルは、使用前に0.1％BSAを含む通常の生理食塩水で希釈し、対応する濃度にした。Ab-10のストック濃度は16.3 mg/mLであり、0.1％BSAを含む通常の生理食塩水で希釈した後、分注し、−80℃の冷凍庫中で保管した。
３．実験動物
BALB/cAヌードマウス、6〜7週齢、雌性は、Shanghai Ling Chang Biological Technology有限公司より購入した。生産免許番号：SCXK (Shanghai) 2013-0018；動物証明書番号2013001814303；飼育環境：SPFグレード。
４．試験手順
ヌードマウスの皮下に、ヒト肺がん細胞NCI-H1993を接種した。腫瘍体積が100〜150 mm3に達したとき、動物を無作為に群分けした（D0）。投与計画と用量は表１９に示す。マウスの腫瘍体積および体重を週に2回測定し、データを記録した。腫瘍体積（V）は、次のように計算される:
V = 1/2×a×b2、ここでaおよびbは、それぞれ長さと幅を表す。
T/C（％）=（T−T0）／(C−C0)×100、ここでTおよびCは、実験の終了時における腫瘍体積を表す。T0およびC0は、実験の開始時における腫瘍体積を表す。
５．結果
ADC-12は抗c-Met抗体−毒素複合体である。ADC-12（1、3、10 mg/kg、IV、D0）は、ヌードマウスにおいて、c-Metを過剰発現しているヒト肺がんNCI-H1993の皮下異種移植腫瘍の増殖を用量依存性に抑制した。腫瘍抑制率は、それぞれ45％、63％、124%であり、10 mg/kg投与群のマウスでは、7匹／10匹が部分的な腫瘍消退を示した（D21）。Ab-10抗体ストック溶液はADC-12の調製に用いた抗体であり、Ab-10抗体（30 mg/kg、IV、週2回を6回）の腫瘍抑制率は、NCI-H1993について42％であった。担がんマウスは上記薬物に対して良好な耐容性を示し、体重減少などの症状は観察されなかった。比較により、NCI-H1993に対するADC-12の効果は、Ab-10抗体ストック溶液の効果より明らかに強力である。
D0：初回投与時；P値、溶媒との比較；**P<0.01、Ab-10抗体溶液の30 mg/kg群との比較；
スチューデントt-検定を用いた。実験開始時のマウス数：n=10
結論：ADC-12（1、3、10 mg/kg、IV、D0）は、ヌードマウスにおいて、c-Metを過剰発現しているヒト肺がんNCI-H1993の皮下異種移植腫瘍の増殖を用量依存性に抑制し、部分的な腫瘍消退をもたらした。Ab-10抗体ストック溶液（30 mg/kg、IV、週2回を6回）も、NCI-H1993に対して効果があった。NCI-H1993に対するADC-12の効果は、Ab-10抗体ストック溶液の効果より明らかに強力である。担がんマウスは上記薬物に対して良好な耐容性を示した。

Claims (42)

  1. 以下の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのCDR領域を含む、c-Metに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
    抗体の重鎖可変領域HCDR配列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7またはSEQ ID NO：8、および、
    抗体の軽鎖可変領域LCDR配列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10またはSEQ ID NO：11
  2. 抗体の重鎖可変領域が、下記の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのHCDR領域配列を含む、請求項１に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
    SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7およびSEQ ID NO：8
  3. 抗体の軽鎖可変領域が、下記の配列またはその変異配列から選ばれる少なくとも1つのLCDR領域配列を含む、請求項１に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
    SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：11
  4. 抗体が、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7およびSEQ ID NO：8の配列として示される重鎖可変領域配列またはその変異配列、ならびにSEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：11の配列として示される軽鎖可変領域配列またはその変異配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. CDR領域の変異配列が、抗体活性を最適化する1〜3個のアミノ酸変異を有する配列であり、HCDR2領域の変異配列は、好ましくはSEQ ID NO：12である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. c-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. マウス抗体の重鎖可変領域配列がSEQ ID NO：4として示される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. マウス抗体の軽鎖可変領域配列がSEQ ID NO：5として示される、請求項６に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. マウス抗体の重鎖可変領域配列がSEQ ID NO：4として示され、マウス抗体の軽鎖可変領域配列がSEQ ID NO：5として示される、請求項６〜８のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 抗体またはその抗原結合フラグメントが、キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. ヒト化抗体重鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系列重鎖の、好ましくは、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV 3-33*01に由来する重鎖FR領域を含み、該重鎖FR領域が、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV 3-33*01のFR1、FR2、FR3およびFR4領域のフレームワーク配列またはその変異配列を含む、請求項１０に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  12. ヒト化抗体が、SEQ ID NO：13〜15から選ばれる重鎖可変領域配列またはそれらの変異体を含む、請求項１１に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  13. ヒト化抗体軽鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系列軽鎖配列に、好ましくは、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV085またはIGKV4-1*01に由来する軽鎖FR領域を含み、該軽鎖FR領域は、ヒト生殖細胞系列軽鎖IGKV085またはIGKV4-1*01のFR1、FR2、FR3およびFR4領域のフレームワーク配列またはそれらの変異配列を含み、好ましくは、変異配列が0〜10個のアミノ酸の逆突然変異を含む、請求項１０に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  14. ヒト化抗体が、SEQ ID NO：16〜18から選ばれる軽鎖可変領域配列またはそれらの変異体を含む、請求項１３に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  15. ヒト化抗体が、SEQ ID NO：13〜15から選ばれる重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：16〜18から選ばれる軽鎖可変領域配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  16. （ａ）〜（ｃ）のいずれかから選ばれる重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列との組み合わせを含む、請求項１〜５および１０〜１５のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
    （ａ）SEQ ID NO：13の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：16の軽鎖可変領域配列、
    （ｂ）SEQ ID NO：14の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：17の軽鎖可変領域配列、または、
    （ｃ）SEQ ID NO：15の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：18の軽鎖可変領域配列。
  17. ヒト化抗体の重鎖定常領域が、ヒトIgG1もしくはその変異体、ヒトIgG2もしくはその変異体、ヒトIgG3もしくはその変異体、またはヒトIgG4もしくはその変異体に由来する定常領域、好ましくは、ヒトIgG1もしくはその変異体、ヒトIgG2もしくはその変異体、またはヒトIgG4もしくはその変異体に由来する定常領域、最も好ましくは、ヒトIgG2またはその変異体に由来する定常領域を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  18. SEQ ID NO：23〜25またはSEQ ID NO：23〜25に対して少なくとも90％の同一性を有する配列から選ばれる全長の重鎖配列を含む、請求項１７に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  19. ヒト化抗体の軽鎖定常領域が、ヒトκもしくはλ鎖またはそれらの変異体から選ばれる定常領域を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  20. SEQ ID NO：26〜28またはSEQ ID NO：26〜28に対して少なくとも90％の同一性を有する配列から選ばれる全長の軽鎖配列を含む、請求項１９に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  21. ヒト化抗体が、以下のいずれかから選ばれる全長の軽鎖配列と全長の重鎖配列との組み合わせを含む、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
    Ab-9：SEQ ID NO：23の重鎖配列およびSEQ ID NO：26の軽鎖配列、
    Ab-10：SEQ ID NO：24の重鎖配列およびSEQ ID NO：27の軽鎖配列、または、
    Ab-11：SEQ ID NO：25の重鎖配列およびSEQ ID NO：28の軽鎖配列。
  22. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするDNA分子。
  23. 請求項２２に記載のDNA分子を含む発現ベクター。
  24. 宿主細胞が、好ましくは哺乳類細胞であり、好ましくはCHO細胞である、請求項２３に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
  25. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の、c-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、および1種以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
  26. Dは薬物ユニットであり；
    L1およびL2はリンカーユニットであり；
    tは0または1であり、好ましくは1であり；
    yは1〜8の範囲で変動し、好ましくは2〜5であり；
    Abは、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである；
    式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
    Ab-[(L2)t-L1-D)]y （I）
  27. -L2-は式（-L2-）として示され、
    ,
    X1は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
    X2は、アルキル基、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基からなる群より選ばれ；
    mは0〜5であり、好ましくは1〜3であり；
    Sは硫黄原子である；
    請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  28. Dの薬物ユニットが、毒素、化学療法薬、抗生物質、放射性同位元素および核酸分解酵素から選ばれる細胞毒である、請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  29. Dが式（D）として示され、もしくはその互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマーもしくはこれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩であり、
    R1〜R7は、それぞれ水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
    R8〜R11は、それぞれ水素原子、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より任意に選ばれ、好ましくは、R8〜R11の少なくとも1つは、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ、残りのR8〜R11は水素原子であり；
    または、R8〜R11のいずれかの2つはシクロアルキル基を形成し、残りの2つは、それぞれ水素原子、アルキル基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
    R12〜R13は、それぞれ水素原子、アルキル基およびハロゲン基からなる群より選ばれ；
    R14はアリール基およびヘテロアリール基より選ばれ、アリール基またはヘテロアリール基は、さらに水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれる置換基により任意に置換され；
    R15は、ハロゲン基、アルケニル基、アルキル基、シクロアルキル基およびCOOR17から選ばれ；
    R16は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基から選ばれ；
    R17は、水素原子、アルキル基およびアルコキシ基から選ばれる；
    請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  30. L2が、Val-Cit、MC、PABおよびMC-PABから選ばれるリンカーであり、好ましくはMCである、請求項２９に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  31. Dがマイタンシノイドアルカロイドであり、好ましくはDM1、DM3またはDM4であり、より好ましくはDM1である、請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  32. L2が、N-サクシニミジル4-（2-ピリジルチオ）吉草酸エステル（SPP）、N-サクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル（SMCC）およびN-サクシニミジル（4-ヨード-アセチル）アミノ安息香酸エステル（SIAB）からなる群より選ばれ、好ましくはSPPまたはSMCCである、請求項３１に記載の抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  33. Dはカンプトテシンアルカロイドであり、好ましくはCPT、10-ヒドロキシ-CPT、CPT-11（イリノテカン）、SN-38およびトポテカンから選ばれ、より好ましくはSN-38である、請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  34. 前記リンカーL2が、Val-Cit、MC、PABおよびMC-PABから選ばれる構造、好ましくはMCまたはMC-vc-PABの構造を含む、請求項３３に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  35. R2〜R16は請求項２７で定義され；
    Ab、t、y、L1、L2は請求項２４で定義され；
    請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む、式（II）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  36. R2〜R16は請求項２７で定義され；
    Ab、t、y、L1、L2は請求項２４で定義され；
    nは3〜6であり、好ましくは5であり；
    請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む、式（III）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  37. R2〜R16は請求項２７で定義され；
    Ab、yは請求項２４で定義され；
    nは請求項３４で定義され；
    X1、X2、mは請求項２５で定義され；
    請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む、式（IV）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  38. Ab、D、yは請求項２４で定義され；
    nは請求項３４で定義され；
    X1、X2、mは請求項２５ｓｗ定義され；
    請求項２６に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む、式（V）で表される薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  39. 抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物が以下からなる群より選ばれ、Ab-9、Ab-10およびAb-11は請求項２１で定義され、yは1〜8であり、好ましくは2〜5である、請求項２６〜３８のいずれか１項に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物。
  40. 請求項３８に記載の、式（V）で表される複合体薬物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物の製造方法であって、以下の工程を含む方法。
    一般式（Ab-L2）の化合物を、有機溶媒中で一般式（L1-D）の化合物と反応させ、一般式（V）の化合物を得る；前記有機溶媒は、好ましくはアセトニトリルまたはエタノールであり；
    Abは、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
    X1は、水素原子、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基およびシクロアルキル基からなる群より選ばれ；
    X2は、アルキル基、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基からなる群より選ばれ；
    Xは0〜5、好ましくは1〜3であり；
    mは0〜5、好ましくは1〜3である。
  41. 請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物、および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
  42. c-Met介在性の疾患または疾病の治療のための薬物の製造における以下のいずれかの使用；
    すなわち、
    請求項１〜２１のいずれか１項に記載のc-Met受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、もしくは請求項２５に記載の医薬組成物、もしくは請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の式（I）で表される抗体−細胞毒性薬物複合体もしくはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物、または請求項４１に記載の医薬組成物、である；
    ここで、前記疾患または疾病は、好ましくはがんであり、より好ましくはc-Metを発現するがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、肺がん、腸がん、腎がん、メラノーマおよび非小細胞肺がんから選ばれるがんであり、最も好ましくは胃がん、膵がん、非小細胞肺がんおよび腎がんである。

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